Verfahren zur Herstellung von Peptiden
Für die Herstellung von Peptiden sind verschiedene Methoden angegeben worden. Eine detaillierte Zusammenstellung findet sich in folgenden Aufsätzen: J. S. Fruton, Advances in Protein Chemistry 5, 1 (1949); Th. Wieland, Angew. Chemie 63, 7 (1951) und 65, 507 (1954).
Bei der Synthese, welche von Aminosäuren oder niedrigen Peptiden ausgeht, wird gewöhnlich von einer vorübergehenden Blockierung der einen oder der beiden reaktionsfähigen Gruppen des Moleküls Gebrauch gemacht, um identische Produkte zu erhalten. Bei diesen Reaktionen wird die Aminogruppe des ersten Reaktionspartners oft geschützt und die Carboxylgruppe wird in eine reaktivere Form gebracht, so dass sie mit der freien Aminogruppe der zweiten Komponente reagieren kann, deren Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung geschützt ist.
Zur vorübergehenden Blockierung der Aminogruppe wird häufig die Umwandlung der Aminosäure oder des Peptids in eine Carbobenzyloxyverbindung durchgeführt, was den Vorteil hat, dass die freie Aminogruppe auf einem milden Weg, beispielsweise durch Reduktion, wieder hergestellt werden kann. Bei N-acylierten Verbindungen kann die Aminogruppe nur mit Hilfe eines Hydrolysierungsmittels in Freiheit gesetzt werden, wobei man darauf achten muss, dass keine Peptidbindung zerstört wird.
Von den bekannten Verfahren zur Herstellung einer Peptidbindung seien folgende erwähnt: Die Methode von Curtius, bei welcher die Carboxylgruppe der ersten Reaktionskomponente in die saure Azidgruppe umgewandelt wird, die mit einer freien Aminogruppe der zweiten Reaktionskomponente reagieren kann; ferner die Methode von G. W. An- derson, beschrieben in J. Am. Chem. Soc. 74, 5309 (1952), bei welcher man von Tetraäthylpyrophosphit als Wasserbindunsgmfttel Gebrauch macht; schliesslich die Methode von Emil Fischer, in welcher die Aminosäure in das entsprechende Säurechlorid umgewandelt wird, zum Beispiel mit Phosphorpentachlorid oder Thionylchlorid.
Vor kurzem ist eine weitere Methode für die Herstellung von Peptidbindungen durch J. C. Sheehan und G. P. Hess in J. Am. Chem. Soc. 77, 1067 (1955) veröffentlicht worden. Bei dieser Methode wird von Dicyclohexylcarbodiimid mit der Formel C,H,,-N=C=N-C,H,, Gebrauch gemacht, einem Reaktionsmittel, welches in vielen Fällen so wirkt, wie wenn es ein starkes Dehydratisierungsmittel wäre. Es ist fähig, eine Nacylierte Aminosäure mit einem Aminosäureester zu kuppeln.
Als Nebenprodukt entsteht dabei das Harnstoffderivat der Formel
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Es wurde nun gefunden, dass man in sehr einfacher Weise eine ähnliche Peptidbindung erzielen kann, wenn man eine Aminosäure oder ein Peptid, dessen Aminogruppe blockiert ist, mit einer Aminosäure oder einem Peptid, bei welchem die Carboxylgruppe blockiert ist, in Gegenwart eines Äthinyläthers zur Reaktion bringt, wobei der Äthinyläther durch Aufnahme von Wasser, das bei der Reaktion gebildet wird, in einen Essigsäureester übergeführt wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Peptiden ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Aminosäure oder ein niedrigermolekulares Peptid, welche bzw. welches eine freie Carboxylgruppe und eine blockierte Aminogruppe enthält, mit einer Aminosäure oder einem niedrigermolekularen Peptid, die bzw. das eine freie Aminogruppe und eine blok kierte Carboxylgruppe enthält, in Gegenwart eines Äthinyläthers zur Reaktion gebracht wird.
Dieses Verfahren hat den grossen Vorteil, dass die Reaktion bereits bei Raumtemperatur vor sich geht und dass die Trennung des gebildeten Peptids vom Reaktionsgemisch ausserordentlich einfach ist. Man braucht nur den flüchtigen Essigsäureester abzudestillieren, um das Peptid in reiner Form zu erhalten. Die Ausbeuten an Peptiden sind gut. Ein besonderer Vorteil der Methode ist fernerhin, dass die Hydroxylgruppe der Hydroxyaminosäuren Tyrosin, Serin und Threonin nicht geschützt zu werden braucht.
Vorzugsweise wird ein Äthinyläther verwendet, der von einem aliphatischen Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht abgeleitet ist, wie Methanol, Sitha- nol, Propanol, Isopropanol, einem Butanol und Amylalkohol. Das Methoxyacetylen, welches die grösste Flüchtigkeit besitzt (Siedepunkt 220 C), wird bevorzugt benutzt.
Die Reaktion wird zweckmässigerweise zwischen etwa 20 und 600 C ausgeführt. Als Ausgangsprodukt sind besonders diejenigen -Aminosäuren oder Peptide geeignet, bei welchen die Aminogruppe durch die Carbobenzyloxygruppe (Cbz) geschützt ist. Im allgemeinen lassen sich diese Cbz-Verbindungen in einfacher Weise herstellen. Ferner kann die Cbz-Gruppe auf verschiedene Weise abgespalten werden, beispielsweise durch Reduktion, durch Behandlung mit HBr in Eisessig, mit Na in flüssigem Ammoniak und mit PH4J. Ausserdem kann man Acylgruppen, insbesondere die leicht abspaltbaren Acylgruppen, welche von Wieland in seiner Arbeit erwähnt werden, die Sulfonylgruppe, die Phthaloylgruppe und auch die Benzylgruppe und die Triphenylmethylgruppe für die zeitweise Blockierung der NH-Gruppe benutzen.
Die Carboxylgruppe der zweiten Reaktionskomponente wird vorzugsweise durch Veresterung mit einem niedrigen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Butanol oder Benzylalkohol, blockiert.
Zweckmässigerweise verwendet man einen geringen Überschuss an Acetylenäther. Nach der Vollendung der Reaktion können die blockierte Aminogruppe und die Carboxylgruppe des gebildeten Peptids nach irgendeinem an sich bekannten Verfahren in Freiheit gesetzt werden.
Als Beispiele für Reaktionskomponenten, die sich zu der Synthese eignen, seien genannt: N-Cbz-L-leuzin und Glycinäthylester, N-Cbz-S-benzylcystein und Glycinmethylester, N-Cbz-L-glutaminsäure-a-äthylester und S-benzyl-L-cysteinyl-glycinäthylester, Tosyl L-isoleucin und L-Alaninmethylester, N,N-Dibencylglycin und DL-Serinäthylester, N-Cbz-glycin und Glycinäthylester, N-Cbz-glycin und L-Phenylalaninbenzylester, N-Phthaloyl-L-alanin und L-Prolinbenzylester, N-Trityl-DL-alanin und Tryptophanmethylester.
Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung kann man höhere Peptide herstellen. Zu diesem Zweck wird die N-schützende Gruppe aus dem erhaltenen Kupplungsprodukt abgespalten, so dass eine freie NH2-Gruppe entsteht, und diese Gruppe wird wieder mit einer neuen N-acylaminosäure in Gegenwart eines Äthinyläthers nach folgendem Reaktionsschema gekuppelt:
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R stellt eine Gruppe dar, welche die NH2-Gruppe blockiert, zum Beispiel eine Cbz-, Acyl- oder Sulfonylgruppe. Rt, R2 und R3 sind Seitenketten der Aminosäuren und R4 und R5 können eine Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe bedeuten.
Es ist auch möglich, zuerst den Rest, der an die Carboxylgruppe R4 gebunden ist, abzuspalten, zum Beispiel eine Benzylgruppe mit Hilfe von katalytischer Reduktion und eine Methoxy- oder Äthoxygruppe durch vorsichtige alkalische Hydrolyse, und das erhaltene Produkt mit einer neuen Aminosäure oder einem Peptidester gemäss folgendem Reaktionsschema umzusetzen:
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Bei den Reaktionen, die in Gegenwart von ethinyl; äther ausgeführt werden, tritt keine Racemisierung der optisch aktiven Reaktionskomponenten ein.
Das Verfahren gemäss der Erfindung wird vorzugsweise folgendermassen ausgeführt: Man stellt eine innige Mischung von beispielsweise einer N-Cbzmonoamino-monocarboxylsäure und einem Ester einer Monoamino-monocarboxylsäure in äquimolekularen Mengen in Anwesenheit oder Abwesenheit eines Lösungsmittels her. Als Lösungsmittel kann man eine indifferente Flüssigkeit benutzen, wie Äther, Dichlormethan, Äthylacetat, Dioxan und Nitromethan. Zu dem Gemisch wird ein Überschuss an Athinyläther, mindestens 1 Mol pro Mol N-Cbz-aminosäure, hin zugefügt. Die Reaktion tritt in kurzer Zeit unter Hitzeentwicklung ein. Man kann sie auch durch Erhitzen auf dem Wasserbad einleiten.
Das Reaktionsprodukt wird mit einer eiskalten Lösung von Kaliumcarbonat gewaschen, um die noch vorhandene N-Cbzaminosäure zu lösen, dann wird mit einer eiskalten Lösung von 0,5 N-Salzsäure nachgewaschen, um den noch vorhandenen Aminosäureester zu entfernen, und schliesslich wird mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat entfernt man das Lösungsmittel durch Verdampfung, wobei der Peptidester kristallisiert.
Der erhaltene Ester kann nun entweder nach dem oben angegebenen Verfahren weiterbehandelt oder in das freie Peptid übergeführt werden.
Bei der Synthese der Peptide, bei welcher man von Diaminomonocarbonsäure ausgeht, kann man beispielsweise Dicarbobenzyloxyderivate benutzen und dann so vorgehen, wie es oben beschrieben ist.
Für die Herstellung von Cysteinpeptiden wird die SH-Gruppe des Cysteins vorzugsweise mit Hilfe einer Benzylgruppe geschützt. Es muss hervorgehoben werden, dass die Athinyläther auch zur Bildung von Säureamiden benutzt werden können, die sich von N-acylaminosäuren ableiten, und zwar durch Umsetzung einer Mischung von N-acylaminosäure mit einem primären oder sekundären Amin in Gegenwart von Acetylenäther. In entsprechender Weise kann ein Ester aus einer N-acylaminosäure und einem Alkohol hergestellt werden. Die gebildeten Amide und Ester können beim vorliegenden Syntheseverfahren benutzt werden.
Als Lösungsmittel für die Ausführung der Reaktion wird vorzugsweise Äthylacetat benutzt, in welchem viele N-acyl- oder N-carbobenzyloxyaminosäuren und ebenso die Peptide löslich sind.
Es wurde ferner festgestellt, dass die Synthese gemäss der Erfindung besonders vereinfacht werden kann, wenn man von dem salzsauren Salz von Aminosäureestern oder Peptidestern als zweite Reaktionskomponente ausgeht. In diesem Fall können äquivalente Mengen der Aminosäure oder des Peptids, bei welchen der Stickstoff beispielsweise durch die Cbz Gruppe blockiert ist, und die Aminosäureester oder die Hydrochloride der Peptidester in Alkohol gelöst werden, worauf man einen Überschuss an Acetylen äther hinzufügt und das Reaktionsgemisch in einem geschlossenen Gefäss während 3 Stunden auf etwa 50 bis 800 C erhitzt.
Man entfernt dann den Über- schuss an Äthinyläther im Vakuum, setzt eine kleine Menge an Lösungsmittel, zum Beispiel Äthylacetat, hinzu und wäscht nacheinander, und zwar je zweimal, mit Wasser, 1 N-Salzsäure, Wasser, Kaliumcarbonatlösung und nochmals mit Wasser. Die Lösung wird schliesslich getrocknet und eingedampft, wobei der Peptidester auskristallisiert. Diese Arbeitsweise bietet einen grossen Vorteil, da es nicht notwendig ist, die freie Aminosäure oder aus dem salzsauren Salz den Peptidester herzustellen, was einen Zeitverlust bedeutet und manchmal Schwierigkeiten bietet.
Als Beispiele für salzsaure Salze von Aminosäureestern oder Peptidestern, welche als zweite Reaktionskomponente benutzt werden können, seien genannt: die salzsauren Salze von Glycinäthylester, Glycinmethylester, S-benzyl- L-cysteinyl- glycinäthylester, L-Alaninmethylester, D-Leucinmethylester, DL-Serin äthylester, L-Phenylalaninbenzylester, L-Alaninäthylester, L-Leucinäthylester, L-Prolinbenzylester, Tryptophanmethylester.
Die Reaktion wird vorzugsweise durch Kochen in Athylacetat unter Rückfluss ausgeführt
Beispiel I N-Cbz-L-leucylglycinäthylester Äquimolekulare Mengen von Glycinäthylester und N-Cbz-L-leucin werden mit Methoxyacetylen (1,3 Mol pro Mol Glycinester) gemischt. Die Mischung wird am Rückfluss 3 Stunden lang in einem Wasserbad von 500 C erhitzt. Es bildet sich eine homogene Lösung. Diese Lösung wird abgekühlt, man fügt Äther hinzu und die Mischung wird nacheinander mit eiskalter Kallumearbonaflösung, Wasser, eiskalter 0,5 N-Salzsäure und Wasser gewaschen.
Darauf wird die Lösung über Natriumsulfat getrocknet. Der Äther wird langsam verdampft und das Peptid kristallisiert aus. Die Kristalle werden abgesaugt und mit ein wenig eiskaltem Äther gewaschen.
Der Schmelzpunkt dieses Peptidesters liegt bei 102 bis 104" C. Ausbeute etwa 95 010.
Beispiel 2
N-Cbz-S-benzylcysteinyl-glycinäthylester
Eine Mischung von N-Cbz-S-benzylcystein, Glycinäthylester und Äthoxyacetylen im Molverhältnis 1:1:2 wird in Athylacetat gelöst und 3 Stunden lang bei 600 C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird nacheinander mit 2 N-Salzsäure, Wasser, 2 N-Sodalösung und nochmals mit Wasser gewaschen. Man trocknet dann das Gemisch über Natriumsulfat und verdampft das Lösungsmittel unter vermindertem Druck. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther umkri stallisiert. Die Ausbeute beträgt etwa 80 /o. Der Schmelzpunkt dieses Peptids liegt bei 98" C. (a)2,0 - 26,50 C (in Eisessig, C = 6). Ausbeute etwa 90 /o.
Beispiel 3 (N-Cbz-y-L-glutamyl)-S-benzyl-L-cysteinyl-glycindiäthylester (= N-Cbz-S-benzyl-glutathiondiäthylester)
In einem grossen Überschuss von Methoxyacetylen wird eine Mischung von äquimolekularen Mengen von S-Benzyl-L-cysteinyl-glycinäthylester und N-Cbz-Lglutaminsäure-a-äthylester unter Rückfluss erhitzt.
Nach 2 Stunden wird die Mischung abgekühlt und mit Äthylacetat verdünnt. Sie wird nacheinander mit 2 N-Salzsäure, Wasser, einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung und wieder mit Wasser gewaschen.
Die Lösung wird dann über Natriumsulfat getrocknet und auf ein kleines Volumen eingeengt. Durch Zusatz von etwas Petroläther wird die Kristallisation des Tripeptids hervorgerufen. Das Produkt wird aus verdünntem Alkohol umkristallisiert. Man erhält eine Ausbeute von 70e/o. Der Schmelzpunkt beträgt 1500 C.
Beispiel 4
Tosyl-L-isoleucyl-glycinäthylester
1,45 g Tosyl-L-isoleucin (Schmelzpunkt 135 C), 2,2 g Glycinäthylester und 2 ml Methoxyacetylen werden 5 Stunden lang unter Zusatz von 10 ml Äther am Rückfluss gekocht. Der leicht gelb gefärbte Niederschlag wird abfiltriert und mit kalter Sodalösung gerührt. Er wird dann mit Wasser gewaschen und aus Alkohol umkristallisiert. Die Ausbeute beträgt 600/0. Der Schmelzpunkt liegt bei 158 bis 159" C.
Beispiel 5 N-(N',N'-dibenzylglycyl)-DL-serin
Eine Lösung von äquimolekularen Mengen von N,N-dibenzylglycin und DL-Serinäthylester in Dimethylformamid wird 3 Stunden lang mit 1,5 Mol Methoxyacetylen erhitzt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft und der gebildete Rückstand in Äthanol gelöst. Man fügt alkoholisches Alkali hinzu (1 Äquivalent pro Mol Serinäthylester). Nach zehn Minuten langem Kochen wird das Gemisch im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Wasser aufgenommen, die Lösung filtriert und dann mit Essigsäure angesäuert. Es scheidet sich eine ölige Substanz aus, die in Chloroform aufgenommen wird. Nach der Extraktion des Chloroforms mit heisser Salzsäure und Abkühlung der verbleibenden Lösung scheidet sich ein kristalliner Niederschlag des Chlorhydrats der gewünschten Substanz aus. Die Ausbeute beträgt 60 O/o.
Der Schmelzpunkt liegt bei 1650 C (Zersetzung).
Beispiel 6
N-Trityl-DL-alanyl-tryptophanmethylester
Zu einer äquimolekularen Mischung von N-Trityl-DL-alanin und Tryptophanmethylester wird eine äquimolekulare Menge von Äthoxyacetylen hinzugefügt. Nach dem Erhitzen der Mischung auf 500 C während kurzer Zeit ist die Reaktion vollendet. Das entstandene Peptid wird aus Benzol umkristallisiert.
Man erhält eine Ausbeute von 80 O/o. Der Schmelzpunkt beträgt 211 bis 213 C.
Beispiel 7 N-Cbz-glycyl-L-phenylalaninbenzylester
Eine Mischung von äquimolekularen Mengen N-Cbz-glycin und L-Phenylalaninbenzylester wird mit 1,3, Mol Methoxyacetylen und ein wenig Äthylacetat auf 600 C erhitzt. Nach Ablauf 1 Stunde fügt man weiteres Äthylacetat hinzu, und die erhaltene Mischung wird abgekühlt. Man wäscht nacheinander mit Sodalösung, Wasser, 1 N-Salzsäure und nochmals mit Wasser. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird die Lösung eingedampft. Das zurückbleibende öl wird aus Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält eine Ausbeute von 90 /o. Der Schmelzpunkt des Produktes beträgt 740 C.
Beispiel 8
N-Phthaloyl-L-alanyl-L-prolinbenzylester Äquimolekulare Mengen von N - Phthaloyl - alanin und L-Prolinbenzylester werden am Wasserbad bei einer Temperatur von 500 C in wenig Methylenchlorid mit 1,5 Äquivalenten von Methoxyacetylen 3 Stunden lang erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Äthylacetat aufgenommen, mit verdünnter Sodalösung und dann mit verdünnter Salzsäure gewaschen. Man trocknet die erhaltene Lösung über Natriumsulfat und dampft sie langsam ein. Die entstehenden Kristalle werden aus Äthylacetat-Petrol äther umkristallisiert. Sie haben einen Schmelzpunkt von 100 bis 102" C.
Beispiel 9
N-Cbz-glycyl-glycinäthylester Äquimolekulare Mengen von N-Cbz-glycin und dem salzsauren Salz von Glycinäthylester werden in Äthylalkohol gelöst. Man fügt dann einen Überschuss von Methoxyacetylen hinzu. Die Mischung wird in einem geschlossenen Kolben 3 Stunden auf 500 C erhitzt. Daraufhin wird der Uberschuss von Methoxyacetylen im Vakuum entfernt. Man fügt Äthylacetat hinzu und das Gemisch wird nacheinander gründlich mit Wasser, 1 N-Salzsäure (zweimal), nochmals mit Wasser (zweimal), einer Lösung von Kaliumcarbonat (zweimal) und schliesslich wieder mit Wasser (zweimal) gewaschen. Die Mischung wird dann über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der N-Cbzglycyl-glycinäthylester kristallisiert aus. Der Schmelzpunkt beträgt 79 bis 800 C.