Verfahren zur Herstellung von Peptiden
Für die Herstellung von Peptiden sind verschiedene Methoden angegeben worden. Eine detaillierte Zusammenstellung findet sich in folgenden Aufsätzen: J. S. Fruton, Advances in Protein Chemistry 5, 1 (1949); Th. Wieland, Angew. Chemie 63, 7 (1951) und 65, 507 (1954).
Bei der Synthese, welche von Aminosäuren oder niedrigen Peptiden ausgeht, wird gewöhnlich von einer vorübergehenden Blockierung der einen oder der beiden reaktionsfähigen Gruppen des Moleküls Gebrauch gemacht, um identische Produkte zu erhalten. Bei diesen Reaktionen wird die Aminogruppe des ersten Reaktionspartners oft geschützt und die Carboxylgruppe wird in eine reaktivere Form gebracht, so dass sie mit der freien Aminogruppe der zweiten Komponente reagieren kann, deren Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung geschützt ist.
Zur vorübergehenden Blockierung der Aminogruppe wird häufig die Umwandlung der Aminosäure oder des Peptids in eine Carbobenzyloxyverbindung durchgeführt, was den Vorteil hat, dass die freie Aminogruppe auf einem milden Weg, beispielsweise durch Reduktion, wieder hergestellt werden kann. Bei N-acylierten Verbindungen kann die Aminogruppe nur mit Hilfe eines Hydrolysierungsmittels in Freiheit gesetzt werden, wobei man darauf achten muss, dass keine Peptidbindung zerstört wird.
Von den bekannten Verfahren zur Herstellung einer Peptidbindung seien folgende erwähnt: Die Methode von Curtius, bei welcher die Carboxylgruppe der ersten Reaktionskomponente in die saure Azidgruppe umgewandelt wird, die mit einer freien Aminogruppe der zweiten Reaktionskomponente reagieren kann; ferner die Methode von G. W. An- derson, beschrieben in J. Am. Chem. Soc. 74, 5309 (1952), bei welcher man von Tetraäthylpyrophosphit als Wasserbindunsgmfttel Gebrauch macht; schliesslich die Methode von Emil Fischer, in welcher die Aminosäure in das entsprechende Säurechlorid umgewandelt wird, zum Beispiel mit Phosphorpentachlorid oder Thionylchlorid.
Vor kurzem ist eine weitere Methode für die Herstellung von Peptidbindungen durch J. C. Sheehan und G. P. Hess in J. Am. Chem. Soc. 77, 1067 (1955) veröffentlicht worden. Bei dieser Methode wird von Dicyclohexylcarbodiimid mit der Formel C,H,,-N=C=N-C,H,, Gebrauch gemacht, einem Reaktionsmittel, welches in vielen Fällen so wirkt, wie wenn es ein starkes Dehydratisierungsmittel wäre. Es ist fähig, eine Nacylierte Aminosäure mit einem Aminosäureester zu kuppeln.
Als Nebenprodukt entsteht dabei das Harnstoffderivat der Formel
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Es wurde nun gefunden, dass man in sehr einfacher Weise eine ähnliche Peptidbindung erzielen kann, wenn man eine Aminosäure oder ein Peptid, dessen Aminogruppe blockiert ist, mit einer Aminosäure oder einem Peptid, bei welchem die Carboxylgruppe blockiert ist, in Gegenwart eines Äthinyläthers zur Reaktion bringt, wobei der Äthinyläther durch Aufnahme von Wasser, das bei der Reaktion gebildet wird, in einen Essigsäureester übergeführt wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Peptiden ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Aminosäure oder ein niedrigermolekulares Peptid, welche bzw. welches eine freie Carboxylgruppe und eine blockierte Aminogruppe enthält, mit einer Aminosäure oder einem niedrigermolekularen Peptid, die bzw. das eine freie Aminogruppe und eine blok kierte Carboxylgruppe enthält, in Gegenwart eines Äthinyläthers zur Reaktion gebracht wird.
Dieses Verfahren hat den grossen Vorteil, dass die Reaktion bereits bei Raumtemperatur vor sich geht und dass die Trennung des gebildeten Peptids vom Reaktionsgemisch ausserordentlich einfach ist. Man braucht nur den flüchtigen Essigsäureester abzudestillieren, um das Peptid in reiner Form zu erhalten. Die Ausbeuten an Peptiden sind gut. Ein besonderer Vorteil der Methode ist fernerhin, dass die Hydroxylgruppe der Hydroxyaminosäuren Tyrosin, Serin und Threonin nicht geschützt zu werden braucht.
Vorzugsweise wird ein Äthinyläther verwendet, der von einem aliphatischen Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht abgeleitet ist, wie Methanol, Sitha- nol, Propanol, Isopropanol, einem Butanol und Amylalkohol. Das Methoxyacetylen, welches die grösste Flüchtigkeit besitzt (Siedepunkt 220 C), wird bevorzugt benutzt.
Die Reaktion wird zweckmässigerweise zwischen etwa 20 und 600 C ausgeführt. Als Ausgangsprodukt sind besonders diejenigen -Aminosäuren oder Peptide geeignet, bei welchen die Aminogruppe durch die Carbobenzyloxygruppe (Cbz) geschützt ist. Im allgemeinen lassen sich diese Cbz-Verbindungen in einfacher Weise herstellen. Ferner kann die Cbz-Gruppe auf verschiedene Weise abgespalten werden, beispielsweise durch Reduktion, durch Behandlung mit HBr in Eisessig, mit Na in flüssigem Ammoniak und mit PH4J. Ausserdem kann man Acylgruppen, insbesondere die leicht abspaltbaren Acylgruppen, welche von Wieland in seiner Arbeit erwähnt werden, die Sulfonylgruppe, die Phthaloylgruppe und auch die Benzylgruppe und die Triphenylmethylgruppe für die zeitweise Blockierung der NH-Gruppe benutzen.
Die Carboxylgruppe der zweiten Reaktionskomponente wird vorzugsweise durch Veresterung mit einem niedrigen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Butanol oder Benzylalkohol, blockiert.
Zweckmässigerweise verwendet man einen geringen Überschuss an Acetylenäther. Nach der Vollendung der Reaktion können die blockierte Aminogruppe und die Carboxylgruppe des gebildeten Peptids nach irgendeinem an sich bekannten Verfahren in Freiheit gesetzt werden.
Als Beispiele für Reaktionskomponenten, die sich zu der Synthese eignen, seien genannt: N-Cbz-L-leuzin und Glycinäthylester, N-Cbz-S-benzylcystein und Glycinmethylester, N-Cbz-L-glutaminsäure-a-äthylester und S-benzyl-L-cysteinyl-glycinäthylester, Tosyl L-isoleucin und L-Alaninmethylester, N,N-Dibencylglycin und DL-Serinäthylester, N-Cbz-glycin und Glycinäthylester, N-Cbz-glycin und L-Phenylalaninbenzylester, N-Phthaloyl-L-alanin und L-Prolinbenzylester, N-Trityl-DL-alanin und Tryptophanmethylester.
Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung kann man höhere Peptide herstellen. Zu diesem Zweck wird die N-schützende Gruppe aus dem erhaltenen Kupplungsprodukt abgespalten, so dass eine freie NH2-Gruppe entsteht, und diese Gruppe wird wieder mit einer neuen N-acylaminosäure in Gegenwart eines Äthinyläthers nach folgendem Reaktionsschema gekuppelt:
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R stellt eine Gruppe dar, welche die NH2-Gruppe blockiert, zum Beispiel eine Cbz-, Acyl- oder Sulfonylgruppe. Rt, R2 und R3 sind Seitenketten der Aminosäuren und R4 und R5 können eine Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe bedeuten.
Es ist auch möglich, zuerst den Rest, der an die Carboxylgruppe R4 gebunden ist, abzuspalten, zum Beispiel eine Benzylgruppe mit Hilfe von katalytischer Reduktion und eine Methoxy- oder Äthoxygruppe durch vorsichtige alkalische Hydrolyse, und das erhaltene Produkt mit einer neuen Aminosäure oder einem Peptidester gemäss folgendem Reaktionsschema umzusetzen:
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Bei den Reaktionen, die in Gegenwart von ethinyl; äther ausgeführt werden, tritt keine Racemisierung der optisch aktiven Reaktionskomponenten ein.
Das Verfahren gemäss der Erfindung wird vorzugsweise folgendermassen ausgeführt: Man stellt eine innige Mischung von beispielsweise einer N-Cbzmonoamino-monocarboxylsäure und einem Ester einer Monoamino-monocarboxylsäure in äquimolekularen Mengen in Anwesenheit oder Abwesenheit eines Lösungsmittels her. Als Lösungsmittel kann man eine indifferente Flüssigkeit benutzen, wie Äther, Dichlormethan, Äthylacetat, Dioxan und Nitromethan. Zu dem Gemisch wird ein Überschuss an Athinyläther, mindestens 1 Mol pro Mol N-Cbz-aminosäure, hin zugefügt. Die Reaktion tritt in kurzer Zeit unter Hitzeentwicklung ein. Man kann sie auch durch Erhitzen auf dem Wasserbad einleiten.
Das Reaktionsprodukt wird mit einer eiskalten Lösung von Kaliumcarbonat gewaschen, um die noch vorhandene N-Cbzaminosäure zu lösen, dann wird mit einer eiskalten Lösung von 0,5 N-Salzsäure nachgewaschen, um den noch vorhandenen Aminosäureester zu entfernen, und schliesslich wird mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat entfernt man das Lösungsmittel durch Verdampfung, wobei der Peptidester kristallisiert.
Der erhaltene Ester kann nun entweder nach dem oben angegebenen Verfahren weiterbehandelt oder in das freie Peptid übergeführt werden.
Bei der Synthese der Peptide, bei welcher man von Diaminomonocarbonsäure ausgeht, kann man beispielsweise Dicarbobenzyloxyderivate benutzen und dann so vorgehen, wie es oben beschrieben ist.
Für die Herstellung von Cysteinpeptiden wird die SH-Gruppe des Cysteins vorzugsweise mit Hilfe einer Benzylgruppe geschützt. Es muss hervorgehoben werden, dass die Athinyläther auch zur Bildung von Säureamiden benutzt werden können, die sich von N-acylaminosäuren ableiten, und zwar durch Umsetzung einer Mischung von N-acylaminosäure mit einem primären oder sekundären Amin in Gegenwart von Acetylenäther. In entsprechender Weise kann ein Ester aus einer N-acylaminosäure und einem Alkohol hergestellt werden. Die gebildeten Amide und Ester können beim vorliegenden Syntheseverfahren benutzt werden.
Als Lösungsmittel für die Ausführung der Reaktion wird vorzugsweise Äthylacetat benutzt, in welchem viele N-acyl- oder N-carbobenzyloxyaminosäuren und ebenso die Peptide löslich sind.
Es wurde ferner festgestellt, dass die Synthese gemäss der Erfindung besonders vereinfacht werden kann, wenn man von dem salzsauren Salz von Aminosäureestern oder Peptidestern als zweite Reaktionskomponente ausgeht. In diesem Fall können äquivalente Mengen der Aminosäure oder des Peptids, bei welchen der Stickstoff beispielsweise durch die Cbz Gruppe blockiert ist, und die Aminosäureester oder die Hydrochloride der Peptidester in Alkohol gelöst werden, worauf man einen Überschuss an Acetylen äther hinzufügt und das Reaktionsgemisch in einem geschlossenen Gefäss während 3 Stunden auf etwa 50 bis 800 C erhitzt.
Man entfernt dann den Über- schuss an Äthinyläther im Vakuum, setzt eine kleine Menge an Lösungsmittel, zum Beispiel Äthylacetat, hinzu und wäscht nacheinander, und zwar je zweimal, mit Wasser, 1 N-Salzsäure, Wasser, Kaliumcarbonatlösung und nochmals mit Wasser. Die Lösung wird schliesslich getrocknet und eingedampft, wobei der Peptidester auskristallisiert. Diese Arbeitsweise bietet einen grossen Vorteil, da es nicht notwendig ist, die freie Aminosäure oder aus dem salzsauren Salz den Peptidester herzustellen, was einen Zeitverlust bedeutet und manchmal Schwierigkeiten bietet.
Als Beispiele für salzsaure Salze von Aminosäureestern oder Peptidestern, welche als zweite Reaktionskomponente benutzt werden können, seien genannt: die salzsauren Salze von Glycinäthylester, Glycinmethylester, S-benzyl- L-cysteinyl- glycinäthylester, L-Alaninmethylester, D-Leucinmethylester, DL-Serin äthylester, L-Phenylalaninbenzylester, L-Alaninäthylester, L-Leucinäthylester, L-Prolinbenzylester, Tryptophanmethylester.
Die Reaktion wird vorzugsweise durch Kochen in Athylacetat unter Rückfluss ausgeführt
Beispiel I N-Cbz-L-leucylglycinäthylester Äquimolekulare Mengen von Glycinäthylester und N-Cbz-L-leucin werden mit Methoxyacetylen (1,3 Mol pro Mol Glycinester) gemischt. Die Mischung wird am Rückfluss 3 Stunden lang in einem Wasserbad von 500 C erhitzt. Es bildet sich eine homogene Lösung. Diese Lösung wird abgekühlt, man fügt Äther hinzu und die Mischung wird nacheinander mit eiskalter Kallumearbonaflösung, Wasser, eiskalter 0,5 N-Salzsäure und Wasser gewaschen.
Darauf wird die Lösung über Natriumsulfat getrocknet. Der Äther wird langsam verdampft und das Peptid kristallisiert aus. Die Kristalle werden abgesaugt und mit ein wenig eiskaltem Äther gewaschen.
Der Schmelzpunkt dieses Peptidesters liegt bei 102 bis 104" C. Ausbeute etwa 95 010.
Beispiel 2
N-Cbz-S-benzylcysteinyl-glycinäthylester
Eine Mischung von N-Cbz-S-benzylcystein, Glycinäthylester und Äthoxyacetylen im Molverhältnis 1:1:2 wird in Athylacetat gelöst und 3 Stunden lang bei 600 C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird nacheinander mit 2 N-Salzsäure, Wasser, 2 N-Sodalösung und nochmals mit Wasser gewaschen. Man trocknet dann das Gemisch über Natriumsulfat und verdampft das Lösungsmittel unter vermindertem Druck. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther umkri stallisiert. Die Ausbeute beträgt etwa 80 /o. Der Schmelzpunkt dieses Peptids liegt bei 98" C. (a)2,0 - 26,50 C (in Eisessig, C = 6). Ausbeute etwa 90 /o.
Beispiel 3 (N-Cbz-y-L-glutamyl)-S-benzyl-L-cysteinyl-glycindiäthylester (= N-Cbz-S-benzyl-glutathiondiäthylester)
In einem grossen Überschuss von Methoxyacetylen wird eine Mischung von äquimolekularen Mengen von S-Benzyl-L-cysteinyl-glycinäthylester und N-Cbz-Lglutaminsäure-a-äthylester unter Rückfluss erhitzt.
Nach 2 Stunden wird die Mischung abgekühlt und mit Äthylacetat verdünnt. Sie wird nacheinander mit 2 N-Salzsäure, Wasser, einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung und wieder mit Wasser gewaschen.
Die Lösung wird dann über Natriumsulfat getrocknet und auf ein kleines Volumen eingeengt. Durch Zusatz von etwas Petroläther wird die Kristallisation des Tripeptids hervorgerufen. Das Produkt wird aus verdünntem Alkohol umkristallisiert. Man erhält eine Ausbeute von 70e/o. Der Schmelzpunkt beträgt 1500 C.
Beispiel 4
Tosyl-L-isoleucyl-glycinäthylester
1,45 g Tosyl-L-isoleucin (Schmelzpunkt 135 C), 2,2 g Glycinäthylester und 2 ml Methoxyacetylen werden 5 Stunden lang unter Zusatz von 10 ml Äther am Rückfluss gekocht. Der leicht gelb gefärbte Niederschlag wird abfiltriert und mit kalter Sodalösung gerührt. Er wird dann mit Wasser gewaschen und aus Alkohol umkristallisiert. Die Ausbeute beträgt 600/0. Der Schmelzpunkt liegt bei 158 bis 159" C.
Beispiel 5 N-(N',N'-dibenzylglycyl)-DL-serin
Eine Lösung von äquimolekularen Mengen von N,N-dibenzylglycin und DL-Serinäthylester in Dimethylformamid wird 3 Stunden lang mit 1,5 Mol Methoxyacetylen erhitzt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft und der gebildete Rückstand in Äthanol gelöst. Man fügt alkoholisches Alkali hinzu (1 Äquivalent pro Mol Serinäthylester). Nach zehn Minuten langem Kochen wird das Gemisch im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Wasser aufgenommen, die Lösung filtriert und dann mit Essigsäure angesäuert. Es scheidet sich eine ölige Substanz aus, die in Chloroform aufgenommen wird. Nach der Extraktion des Chloroforms mit heisser Salzsäure und Abkühlung der verbleibenden Lösung scheidet sich ein kristalliner Niederschlag des Chlorhydrats der gewünschten Substanz aus. Die Ausbeute beträgt 60 O/o.
Der Schmelzpunkt liegt bei 1650 C (Zersetzung).
Beispiel 6
N-Trityl-DL-alanyl-tryptophanmethylester
Zu einer äquimolekularen Mischung von N-Trityl-DL-alanin und Tryptophanmethylester wird eine äquimolekulare Menge von Äthoxyacetylen hinzugefügt. Nach dem Erhitzen der Mischung auf 500 C während kurzer Zeit ist die Reaktion vollendet. Das entstandene Peptid wird aus Benzol umkristallisiert.
Man erhält eine Ausbeute von 80 O/o. Der Schmelzpunkt beträgt 211 bis 213 C.
Beispiel 7 N-Cbz-glycyl-L-phenylalaninbenzylester
Eine Mischung von äquimolekularen Mengen N-Cbz-glycin und L-Phenylalaninbenzylester wird mit 1,3, Mol Methoxyacetylen und ein wenig Äthylacetat auf 600 C erhitzt. Nach Ablauf 1 Stunde fügt man weiteres Äthylacetat hinzu, und die erhaltene Mischung wird abgekühlt. Man wäscht nacheinander mit Sodalösung, Wasser, 1 N-Salzsäure und nochmals mit Wasser. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird die Lösung eingedampft. Das zurückbleibende öl wird aus Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält eine Ausbeute von 90 /o. Der Schmelzpunkt des Produktes beträgt 740 C.
Beispiel 8
N-Phthaloyl-L-alanyl-L-prolinbenzylester Äquimolekulare Mengen von N - Phthaloyl - alanin und L-Prolinbenzylester werden am Wasserbad bei einer Temperatur von 500 C in wenig Methylenchlorid mit 1,5 Äquivalenten von Methoxyacetylen 3 Stunden lang erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Äthylacetat aufgenommen, mit verdünnter Sodalösung und dann mit verdünnter Salzsäure gewaschen. Man trocknet die erhaltene Lösung über Natriumsulfat und dampft sie langsam ein. Die entstehenden Kristalle werden aus Äthylacetat-Petrol äther umkristallisiert. Sie haben einen Schmelzpunkt von 100 bis 102" C.
Beispiel 9
N-Cbz-glycyl-glycinäthylester Äquimolekulare Mengen von N-Cbz-glycin und dem salzsauren Salz von Glycinäthylester werden in Äthylalkohol gelöst. Man fügt dann einen Überschuss von Methoxyacetylen hinzu. Die Mischung wird in einem geschlossenen Kolben 3 Stunden auf 500 C erhitzt. Daraufhin wird der Uberschuss von Methoxyacetylen im Vakuum entfernt. Man fügt Äthylacetat hinzu und das Gemisch wird nacheinander gründlich mit Wasser, 1 N-Salzsäure (zweimal), nochmals mit Wasser (zweimal), einer Lösung von Kaliumcarbonat (zweimal) und schliesslich wieder mit Wasser (zweimal) gewaschen. Die Mischung wird dann über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der N-Cbzglycyl-glycinäthylester kristallisiert aus. Der Schmelzpunkt beträgt 79 bis 800 C.
Process for the production of peptides
Various methods have been given for the preparation of peptides. A detailed compilation can be found in the following articles: J. S. Fruton, Advances in Protein Chemistry 5, 1 (1949); Th. Wieland, Angew. Chemie 63, 7 (1951) and 65, 507 (1954).
Synthesis starting from amino acids or lower peptides usually involves temporarily blocking one or both of the reactive groups of the molecule in order to obtain identical products. In these reactions, the amino group of the first reactant is often protected and the carboxyl group is brought into a more reactive form so that it can react with the free amino group of the second component, the carboxyl group of which is preferably protected by esterification.
To temporarily block the amino group, the amino acid or the peptide is often converted into a carbobenzyloxy compound, which has the advantage that the free amino group can be restored in a mild way, for example by reduction. In the case of N-acylated compounds, the amino group can only be set free with the aid of a hydrolyzing agent, whereby care must be taken that no peptide bond is destroyed.
Of the known processes for producing a peptide bond, the following may be mentioned: The Curtius method, in which the carboxyl group of the first reaction component is converted into the acidic azide group which can react with a free amino group of the second reaction component; also the method of G. W. Andersson, described in J. Am. Chem. Soc. 74, 5309 (1952), in which use is made of tetraethyl pyrophosphite as a water binding agent; and finally Emil Fischer's method, in which the amino acid is converted into the corresponding acid chloride, for example with phosphorus pentachloride or thionyl chloride.
Recently, another method for making peptide bonds has been reported by J. C. Sheehan and G. P. Hess in J. Am. Chem. Soc. 77, 1067 (1955). This method makes use of dicyclohexylcarbodiimide with the formula C, H ,, - N = C = N-C, H ,,, a reactant which in many cases acts as if it were a strong dehydrating agent. It is able to couple an acylated amino acid with an amino acid ester.
The urea derivative of the formula is created as a by-product
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It has now been found that a similar peptide bond can be achieved in a very simple manner if an amino acid or a peptide whose amino group is blocked is reacted with an amino acid or a peptide in which the carboxyl group is blocked in the presence of an ethynyl ether brings, whereby the ethynyl ether is converted into an acetic acid ester by the absorption of water which is formed during the reaction.
The inventive method for the production of peptides is characterized in that an amino acid or a lower molecular weight peptide, which or which contains a free carboxyl group and a blocked amino group, with an amino acid or a lower molecular weight peptide, the or the one free amino group and a block contains kated carboxyl group, is reacted in the presence of an ethynyl ether.
This method has the great advantage that the reaction already takes place at room temperature and that the separation of the peptide formed from the reaction mixture is extremely simple. You only need to distill off the volatile acetic acid ester in order to obtain the peptide in pure form. The yields of peptides are good. Another particular advantage of the method is that the hydroxyl group of the hydroxy amino acids tyrosine, serine and threonine does not need to be protected.
Preferably, an ethynyl ether derived from an aliphatic low molecular weight alcohol such as methanol, sithanol, propanol, isopropanol, a butanol, and amyl alcohol is used. Methoxyacetylene, which has the greatest volatility (boiling point 220 C), is preferred.
The reaction is expediently carried out between about 20 and 600.degree. Particularly suitable starting products are those amino acids or peptides in which the amino group is protected by the carbobenzyloxy group (Cbz). In general, these Cbz compounds can be produced in a simple manner. Furthermore, the Cbz group can be split off in various ways, for example by reduction, by treatment with HBr in glacial acetic acid, with Na in liquid ammonia and with PH4J. In addition, acyl groups, especially the easily split off acyl groups mentioned by Wieland in his work, the sulfonyl group, the phthaloyl group and also the benzyl group and the triphenylmethyl group can be used to temporarily block the NH group.
The carboxyl group of the second reaction component is preferably blocked by esterification with a lower aliphatic alcohol such as methanol, ethanol, butanol or benzyl alcohol.
It is expedient to use a small excess of acetylene ether. After the completion of the reaction, the blocked amino group and the carboxyl group of the formed peptide can be released by any method known per se.
Examples of reaction components which are suitable for the synthesis are: N-Cbz-L-leucine and glycine ethyl ester, N-Cbz-S-benzylcysteine and glycine methyl ester, N-Cbz-L-glutamic acid-a-ethyl ester and S-benzyl -L-cysteinyl-glycine ethyl ester, tosyl L-isoleucine and L-alanine methyl ester, N, N-dibencylglycine and DL-serine ethyl ester, N-Cbz-glycine and glycine ethyl ester, N-Cbz-glycine and L-phenylalanine benzyl ester, N-phthaloyl-L- alanine and L-proline benzyl ester, N-trityl-DL-alanine and tryptophan methyl ester.
The process according to the invention can be used to produce higher peptides. For this purpose, the N-protecting group is split off from the coupling product obtained, so that a free NH2 group is formed, and this group is coupled again with a new N-acylamino acid in the presence of an ethynyl ether according to the following reaction scheme:
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R represents a group which blocks the NH2 group, for example a Cbz, acyl or sulfonyl group. Rt, R2 and R3 are side chains of the amino acids and R4 and R5 can represent an alkyl, aryl or aralkyl group.
It is also possible to first split off the residue bound to the carboxyl group R4, for example a benzyl group with the help of catalytic reduction and a methoxy or ethoxy group by careful alkaline hydrolysis, and the product obtained with a new amino acid or a peptide ester to be implemented according to the following reaction scheme:
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In the reactions that take place in the presence of ethynyl; are carried out ether, no racemization of the optically active reaction components occurs.
The process according to the invention is preferably carried out as follows: An intimate mixture of, for example, an N-carbon monoamino-monocarboxylic acid and an ester of a monoamino-monocarboxylic acid in equimolecular amounts in the presence or absence of a solvent is prepared. An inert liquid such as ether, dichloromethane, ethyl acetate, dioxane and nitromethane can be used as the solvent. An excess of ethynyl ether, at least 1 mole per mole of N-Cbz-amino acid, is added to the mixture. The reaction occurs in a short time with development of heat. It can also be initiated by heating on a water bath.
The reaction product is washed with an ice-cold solution of potassium carbonate in order to dissolve the N-amino acid still present, then it is washed with an ice-cold solution of 0.5 N-hydrochloric acid in order to remove the amino acid ester still present, and finally it is washed with water . After drying the solution over anhydrous sodium sulfate, the solvent is removed by evaporation, the peptide ester crystallizing.
The ester obtained can now either be further treated according to the above-mentioned process or converted into the free peptide.
In the synthesis of the peptides starting from diaminomonocarboxylic acid, one can use, for example, dicarbobenzyloxy derivatives and then proceed as described above.
For the production of cysteine peptides, the SH group of the cysteine is preferably protected with the aid of a benzyl group. It must be emphasized that the ethynyl ethers can also be used to form acid amides, which are derived from N-acylamino acids, by reacting a mixture of N-acylamino acid with a primary or secondary amine in the presence of acetylene ether. In a corresponding manner, an ester can be prepared from an N-acylamino acid and an alcohol. The amides and esters formed can be used in the present synthetic method.
Ethyl acetate, in which many N-acyl- or N-carbobenzyloxyamino acids and also the peptides are soluble, is preferably used as the solvent for carrying out the reaction.
It has also been found that the synthesis according to the invention can be particularly simplified if the hydrochloric acid salt of amino acid esters or peptide esters is used as the second reaction component. In this case, equivalent amounts of the amino acid or the peptide in which the nitrogen is blocked, for example by the Cbz group, and the amino acid esters or the hydrochlorides of the peptide esters can be dissolved in alcohol, after which an excess of acetylene ether is added and the reaction mixture in one closed vessel heated to about 50 to 800 C for 3 hours.
The excess of ethynyl ether is then removed in vacuo, a small amount of solvent, for example ethyl acetate, is added and it is washed successively, twice each, with water, 1N hydrochloric acid, water, potassium carbonate solution and again with water. The solution is finally dried and evaporated, the peptide ester crystallizing out. This procedure offers a great advantage, since it is not necessary to produce the free amino acid or the peptide ester from the hydrochloric acid salt, which means a loss of time and sometimes creates difficulties.
Examples of hydrochloric acid salts of amino acid esters or peptide esters which can be used as the second reaction component are: the hydrochloric acid salts of glycine ethyl ester, glycine methyl ester, S-benzyl-L-cysteinyl-glycine ethyl ester, L-alanine methyl ester, D-leucine methyl ester, DL-serine ethyl ester, L-phenylalanine benzyl ester, L-alanine ethyl ester, L-leucine ethyl ester, L-proline benzyl ester, tryptophan methyl ester.
The reaction is preferably carried out by refluxing in ethyl acetate
Example I N-Cbz-L-leucylglycine ethyl ester Equimolecular amounts of glycine ethyl ester and N-Cbz-L-leucine are mixed with methoxyacetylene (1.3 moles per mole of glycine ester). The mixture is heated to reflux in a 500 ° C water bath for 3 hours. A homogeneous solution is formed. This solution is cooled, ether is added, and the mixture is washed in succession with ice-cold Kalumearbona solution, water, ice-cold 0.5 N hydrochloric acid and water.
The solution is then dried over sodium sulfate. The ether is slowly evaporated and the peptide crystallizes out. The crystals are suctioned off and washed with a little ice-cold ether.
The melting point of this peptide ester is 102 to 104 "C. Yield about 95,010.
Example 2
N-Cbz-S-benzylcysteinyl-glycine ethyl ester
A mixture of N-Cbz-S-benzylcysteine, glycine ethyl ester and ethoxyacetylene in a molar ratio of 1: 1: 2 is dissolved in ethyl acetate and heated at 600 ° C. for 3 hours. The reaction mixture is washed successively with 2N hydrochloric acid, water, 2N soda solution and again with water. The mixture is then dried over sodium sulphate and the solvent is evaporated off under reduced pressure. The residue is umkri crystallized from ethyl acetate-petroleum ether. The yield is about 80%. The melting point of this peptide is 98 "C. (a) 2.0-26.50 C (in glacial acetic acid, C = 6). Yield about 90 / o.
Example 3 (N-Cbz-y-L-glutamyl) -S-benzyl-L-cysteinyl-glycine diethyl ester (= N-Cbz-S-benzyl-glutathione diethyl ester)
In a large excess of methoxyacetylene, a mixture of equimolecular amounts of S-benzyl-L-cysteinyl-glycine ethyl ester and N-Cbz-L-glutamic acid a-ethyl ester is heated under reflux.
After 2 hours the mixture is cooled and diluted with ethyl acetate. It is washed successively with 2N hydrochloric acid, water, a saturated sodium bicarbonate solution and again with water.
The solution is then dried over sodium sulfate and concentrated to a small volume. Crystallization of the tripeptide is caused by adding some petroleum ether. The product is recrystallized from dilute alcohol. A yield of 70% is obtained. The melting point is 1500 C.
Example 4
Tosyl-L-isoleucyl-glycine ethyl ester
1.45 g of tosyl-L-isoleucine (melting point 135 ° C.), 2.2 g of glycine ethyl ester and 2 ml of methoxyacetylene are refluxed for 5 hours with the addition of 10 ml of ether. The slightly yellow colored precipitate is filtered off and stirred with cold soda solution. It is then washed with water and recrystallized from alcohol. The yield is 600/0. The melting point is 158 to 159 "C.
Example 5 N- (N ', N'-dibenzylglycyl) -DL-serine
A solution of equimolecular amounts of N, N-dibenzylglycine and DL-serine ethyl ester in dimethylformamide is heated with 1.5 mol of methoxyacetylene for 3 hours. The solvent is evaporated off in vacuo and the residue formed is dissolved in ethanol. Alcoholic alkali is added (1 equivalent per mole of serine ethyl ester). After boiling for ten minutes, the mixture is evaporated in vacuo, the residue is taken up in water, the solution is filtered and then acidified with acetic acid. An oily substance separates and is absorbed in chloroform. After extraction of the chloroform with hot hydrochloric acid and cooling of the remaining solution, a crystalline precipitate of the hydrochloride of the desired substance separates out. The yield is 60%.
The melting point is 1650 C (decomposition).
Example 6
N-trityl-DL-alanyl-tryptophan methyl ester
An equimolecular amount of ethoxyacetylene is added to an equimolecular mixture of N-trityl-DL-alanine and tryptophan methyl ester. After the mixture has been heated to 500 ° C. for a short time, the reaction is complete. The resulting peptide is recrystallized from benzene.
A yield of 80% is obtained. The melting point is 211 to 213 C.
Example 7 N-Cbz-glycyl-L-phenylalanine benzyl ester
A mixture of equimolecular amounts of N-Cbz-glycine and L-phenylalanine benzyl ester is heated to 600 ° C. with 1.3 mol of methoxyacetylene and a little ethyl acetate. After 1 hour, more ethyl acetate is added and the resulting mixture is cooled. It is washed successively with soda solution, water, 1N hydrochloric acid and again with water. After drying over sodium sulfate, the solution is evaporated. The remaining oil is recrystallized from ethyl acetate. A yield of 90% is obtained. The melting point of the product is 740 C.
Example 8
N-phthaloyl-L-alanyl-L-proline benzyl ester Equimolecular amounts of N-phthaloyl-alanine and L-proline benzyl ester are heated in a water bath at a temperature of 500 C in a little methylene chloride with 1.5 equivalents of methoxyacetylene for 3 hours. The reaction mixture is evaporated in vacuo, the residue is taken up in ethyl acetate, washed with dilute soda solution and then with dilute hydrochloric acid. The solution obtained is dried over sodium sulfate and slowly evaporated. The resulting crystals are recrystallized from ethyl acetate-petroleum ether. They have a melting point of 100 to 102 "C.
Example 9
N-Cbz-glycyl-glycine ethyl ester Equimolecular amounts of N-Cbz-glycine and the hydrochloric acid salt of glycine ethyl ester are dissolved in ethyl alcohol. An excess of methoxyacetylene is then added. The mixture is heated to 500 ° C. for 3 hours in a closed flask. The excess methoxyacetylene is then removed in vacuo. Ethyl acetate is added and the mixture is washed thoroughly successively with water, 1N hydrochloric acid (twice), again with water (twice), a solution of potassium carbonate (twice) and finally again with water (twice). The mixture is then dried over sodium sulfate and evaporated. The N-Cbzglycyl-glycine ethyl ester crystallizes out. The melting point is 79 to 800 C.