DE1217392B

DE1217392B - Process for the production of oligo-peptides

Info

Publication number: DE1217392B
Application number: DENDAT1217392D
Authority: DE
Inventors: Münster Dr. Fritz Micheel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1964-03-28
Publication date: 1966-05-26

Description

Verfahren zur Herstellung von Oligo-Peptiden Die aus zwei oder mehreren gleichen oder verschiedenen a-Aminosäuren aufgebauten, als Oligo-Peptide bezeichneten Verbindungen sind bekanntlich vielfach biologisch wirksam und werden mit zunehmender Bedeutung für therapeutische Zwecke verwendet, z. B. Hypertensine zur Blutdrucksteigerung; Tyrocidine als Antibiotica; Vasopressine (antidiuretisch und blutdrucksteigernd); Fungicide,- Oxytocin (uteruswirksam). Es besteht deshalb großes Interesse an Verfahren, nach denen sich solche Peptide in geeigneter Weise herstellen lassen. Hierfür bieten sich in erster Linie die entsprechenden a-Aminosäuren selbst an. Da die von diesen ausgehenden Synthesen an sich einer N-Acylierung gleichkommen, sollten sie prinzipiell nach allen Methoden durchgeführt werden können, nach denen an ein Stickstoffatom einer Aminosäure ein Acylrest einer anderen Aminosäure angelageit werden kann. Wegen der Konstitution des a-Aminosäuremoleküls und seines dadurch bedingten relativ elektroneutralen Zustandes läßt sich die Anlagerung jedoch nur unter Energieaufwand durchführen oder mit einer Aminosäure, deren Carboxyl-C-Atom mit einem Elektronen anziehenden Substituenten aktiviert ist. Derartige Substituenten, die bereits flür die Peptid-Synthese eingesetzt worden sind, sind beispielsweise die Reste: - 0 Alkyl, - 0C6H5, - S - Alkyl, - S CrH5, - 0 - C(OR) # CH2, - p-Nitrophenyl, - 0 - CH2 - CN, - N..u - 0 - CO - 0 - Alkvl u. a. Um mit dieser Methode zu befriedigenden Ergebnissen zu kommen, ist es zusätzlich zweckmäßig, die in der acylierenden Aminosäure vorhandene freie Aminogruppe durch einen Rest zu schützen, der nach der Synthese unter schonenden Bedingungen wieder abgespalten werden kann. Als besonders vorteilhaft hat sich hier der Carbobenzoxyrest (Cbzo) C6H5 - CH20C0 - erwiesen, der z. B. durch Hydrierung oder mit Bromwasserstoff in Eisessig in der Kälte aus dem Molekül wieder entfernt werden kann. Andere bekannte Schutzgruppen für das a-Stickstoffatom sind z. B. die Phthalylgruppe, Trityl-, Formyl-, p-Toluolsulfonyl-, Trifluor-acetyl-, tert.-Butoxy-carbonylgruppe.Process for the preparation of oligo-peptides The compounds called oligo-peptides composed of two or more identical or different α-amino acids are known to be biologically active in many ways and are used with increasing importance for therapeutic purposes, e.g. B. Hypertensins to increase blood pressure; Tyrocidine as antibiotics; Vasopressins (antidiuretic and antihypertensive); Fungicides, - Oxytocin (affects uterus). There is therefore great interest in methods by which such peptides can be prepared in a suitable manner. The corresponding a-amino acids themselves are primarily suitable for this purpose. Since the syntheses proceeding from these are in themselves equivalent to an N-acylation, they should in principle be able to be carried out by all methods according to which an acyl residue of another amino acid can be attached to a nitrogen atom of one amino acid. Because of the constitution of the a-amino acid molecule and its relatively electroneutral state caused by it, the addition can only be carried out with the expenditure of energy or with an amino acid whose carboxyl carbon atom is activated with an electron-attracting substituent. Such substituents that have already been used for the peptide synthesis are, for example, the radicals: - 0 alkyl, - 0C6H5, - S - alkyl, - S CrH5, - 0 - C (OR) # CH2, - p-nitrophenyl, - 0 - CH2 - CN, - N..u - 0 - CO - 0 - Alkvl, etc. In order to achieve satisfactory results with this method, it is also advisable to protect the free amino group present in the acylating amino acid with a residue, which can be split off again under mild conditions after the synthesis. The carbobenzoxy radical (Cbzo) C6H5 - CH20C0 - has proven to be particularly advantageous here. B. can be removed from the molecule again in the cold by hydrogenation or with hydrogen bromide in glacial acetic acid. Other known protecting groups for the a-nitrogen atom are e.g. B. the phthalyl group, trityl, formyl, p-toluenesulfonyl, trifluoro-acetyl, tert-butoxycarbonyl group.

Es wurde nun gefunden, daß man zur Herstellung von Oligo-Peptiden durch Acylieren von Aminosäuren oder deren Estern bzw. von Peptiden mit freier Aminogruppe mittels einer an der Carboxylgruppe- aktivierten Aminosäure, die am a-Stickstoffatom einen abspaltbaren Rest trägt, vorteilhaft eine Aminosäure verwenden kann, die an der Carboxylgruppe durch den o-Sulfobenzoesäureimidrest der Formel aktiviert worden ist, und die Umsetzung in Gegenwart von Kaliumbiearbonat oder Pyridin durchführt, die als säurebindendes Mittel dienen.It has now been found that for the preparation of oligo-peptides by acylating amino acids or their esters or peptides with free amino groups by means of an amino acid activated on the carboxyl group which has a cleavable residue on the a nitrogen atom, an amino acid is advantageously used can, which is attached to the carboxyl group by the o-sulfobenzoimide radical of the formula has been activated, and the reaction is carried out in the presence of potassium carbonate or pyridine, which serve as acid-binding agents.

Dieses neue Verfahren zeichnet sich gegenüber den bisher gebräuchlichen durch erhebliche Vorteile aus. Es läßt sich unter sehr milden Bedingungen durchführen, ergibt sehr hohe Ausbeuten und setzt nicht voraus, daß - wie bisher im allgemeinen erforderlich - auch die zu kondensierende Aminosäure am Carboxyl, beispielsweise durch eine Estergruppe geschützt wird. Die vielfach bei der Peptidbildung beobachtete Racemisierung tritt nicht ein. Das bei der Kondensation frei werdende Saccharin läßt sich aus dem Reaktionsgemisch auf Grund seiner größeren Azidität leicht von den gebildeten Peptiden abtrennen.This new process is characterized by considerable advantages compared to the previously used ones. It can be carried out under very mild conditions, gives very high yields and does not require that - as has generally been required up to now - the amino acid to be condensed is also protected on the carboxyl, for example by an ester group. The racemization often observed in peptide formation does not occur. The saccharin released during the condensation can easily be separated from the peptides formed from the reaction mixture because of its greater acidity.

Die Darstellung der als Ausgangsmaterial dienenden Saccharinderivate kann beispielsweise erfolgen aus der an der Aminogruppe durch den Cbzo-Rest geschützten Aminosäure und Pseudosaccharinchlorid in Methylenchlorid bei O'C. Während der Reaktion kommt es zu einer Umlagerung: Das nach vorstehendem Schema in Methylenchlorid bei O'C erhaltene N-Cbzo-glycyl-saccharin entsteht in einer Ausbeute von 82()/o der Theorie. Je nach der zur Herstellung des Saccharinderivates verwendeten Aminosäure bzw. des Peptides wird man das geeignete Lösungsmittel und die Saccharinkonzentration wählen. Eine andere Methode zur Darstellung der Saccharinderivate besteht in der Umsetzung einer an der Aminogruppe geschützten Aminosäure mit Saccharin in Gegenwart von Dicy,clohexyl-carbodiimid als wasserabspaltendem Mittel. Hierbei hat es sich als günstig erwiesen, Saccharin und Dicyclohexyl-carbodiimid im überschuß zu verwenden, da diese langsam ein nicht weiterreagierendes Additionsprodukt bilden. Als geeignet erwies sich ein 50%iger Uberschuß. Die Saccharinderivate von N-Cbzo-glycin, Phthalyl-L-leucin.und Di-ebzo-L-tyrosin entstehen so in 91, 88 bzw. 78% Ausbeute. Das als Nebenproduktentstehende Additionsprodukt aus Saccharin und Dicyclohexylcarbodiimid kann mit Hilfe geeigneter Lösungsmittelgemische leicht aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden, z. B. Methanol sowie einer Mischung aus gleichen Teilen Tetrachloräthan und Diäthyläther. Eine weitere Methode zur Darstellung dieser Saccharinderivate besteht darin, die am Stickstoff geschützte Aminosäure zusammen mit Saccharin in Gegenwart von Thionylchlorid und Imidazol, Triäthylamin oder einem anderen- tertiären Amin umzusetzen. Die erfindungsgemäße Umsetzung zum Peptid erfolgt dann beispielsweise nach dem folgenden Schema: B e i s p i e 1 e 1. Darstellung von Cbzo-glycyl-L-leucin a) Herstellung des Ausgangsmaterials 2,02 g (0,01 Mol) Pseudosaccharinchlorid werden in 20 ml Methylenchlorid gelöst und unter Eiskühlung und starkem Rühren innerhalb von 35 Minuten eine Lösung von 2,09 g (0,01 Mol) N-Cbzoglycin und 0,89 ml (0,011 Mol) Pyridin in 15 ml Methylenchlorid zugetropft. Die Lösung wird noch 30 Minuten bei O'C und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann zur Trockene gedampft. Der Rückstand wird mit 20 ml eiskaltem, absolutem Methanol versetzt und der sich bildende Niederschlag abfiltriert. Die Substanz wird nach dem Trocknen umkristallisiert aus 8 ml einer Mischung von gleichen Teilen Acetonitril und Benzol. Gewaschen wird mit eiskaltem Methanol.The saccharin derivatives used as starting material can be prepared, for example, from the amino acid protected on the amino group by the Cbzo radical and pseudosaccharin chloride in methylene chloride at O'C. A rearrangement occurs during the reaction: The N-Cbzo-glycyl-saccharin obtained in methylene chloride at O'C according to the above scheme is obtained in a yield of 82% of theory. Depending on the amino acid or peptide used to produce the saccharin derivative, the appropriate solvent and the saccharin concentration will be selected. Another method for the preparation of the saccharin derivatives consists in the reaction of an amino acid protected on the amino group with saccharin in the presence of dicy, clohexyl-carbodiimide as a dehydrating agent. It has proven advantageous to use excess saccharin and dicyclohexylcarbodiimide, since these slowly form an addition product which does not react further. A 50% excess proved to be suitable. The saccharin derivatives of N-Cbzo-glycine, phthalyl-L-leucine and di-ebzo-L-tyrosine are produced in 91, 88 and 78% yield, respectively. The addition product of saccharin and dicyclohexylcarbodiimide formed as by-products can easily be removed from the reaction mixture with the aid of suitable solvent mixtures, e.g. B. methanol and a mixture of equal parts of tetrachloroethane and diethyl ether. Another method of preparing these saccharin derivatives is to react the nitrogen-protected amino acid together with saccharin in the presence of thionyl chloride and imidazole, triethylamine or another tertiary amine. The inventive conversion to the peptide then takes place, for example, according to the following scheme: B eis p ie 1 e 1. Preparation of Cbzo-glycyl-L-leucine a) Preparation of the starting material 2.02 g (0.01 mol) of pseudosaccharin chloride are dissolved in 20 ml of methylene chloride and with ice cooling and vigorous stirring within 35 minutes A solution of 2.09 g (0.01 mol) of N-Cbzoglycine and 0.89 ml (0.011 mol) of pyridine in 15 ml of methylene chloride was added dropwise. The solution is stirred for a further 30 minutes at O'C and 2 hours at room temperature and then evaporated to dryness. The residue is mixed with 20 ml of ice-cold, absolute methanol and the precipitate that forms is filtered off. After drying, the substance is recrystallized from 8 ml of a mixture of equal parts of acetonitrile and benzene. It is washed with ice-cold methanol.

Ausbeute: 2,84 g N-Cbzo-glycyl-saccharin. Schmp.: 156 bis 158'C (Zersetzung korrigiert). Die Mutterlauge wird zur Trockene gedampft, der Rückstand mit Methanol gewaschen und wie oben umkristallisiert.Yield: 2.84 g of N-Cbzo-glycyl-saccharin. M.p .: 156 to 158 ° C (decomposition corrected). The mother liquor is evaporated to dryness, the residue is washed with methanol and recrystallized as above.

Ausbeute: 220 mg.Yield: 220 mg.

Schmp.: 156 bis 158'C (Zersetzung, korrigiert). Zusammen beträgt die Ausbeute 3,06 g (82% der Theorie).M.p .: 156 to 158 ° C (decomposition, corrected). The combined yield is 3.06 g (82% of theory).

b) Verfahren der Erfindung 3,75 g (0,01 Mol) N-Cbzo-glycyl-saecharin, 1,31 g (0,01 MOI) L-Leucin und 2,5 g (0,025 Mol) KHCO3 werden in 25 ml einer eiskalten Mischung von Tetrahydrofuran-Wasser 1 : 1 gelöst bzw. suspendiert. Der Ansatz wird so lange unter Eiskühlung gerührt, bis praktisch alles in Lösung gegangen ist (4 Stunden), und danach noch 3 Stunden bei Raumtemperatur gerÜhrt. Dann werden 15,5 ml 1 n-HCI zugegeben. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockene gedampft, der Rückstand mit 25 ml Wasser kurz auf dem Dampfbad erhitzt und nach dem Abkühlen auf O'C der sich bildende Niederschlag abfiltriert. Die Substanz wird zur Reinigung in 4 ml Dimethylformamid aufgelöst und danach 8 ml Wasser zugegeben. Es bildet- sich zunächst ein sirupöser Niederschlag, der allmählich kristallin wird. Man gibt nach und nach noch weitere 8 ml Wasser hinzu und filtriert nach Abkühlen auf 0' ab. b) Method of the invention 3.75 g (0.01 mol) N-Cbzo-glycyl-saecharine, 1.31 g (0.01 MOI) L-leucine and 2.5 g (0.025 mol) KHCO3 are in 25 ml an ice-cold mixture of tetrahydrofuran-water 1: 1 dissolved or suspended. The batch is stirred with ice cooling until practically everything has gone into solution (4 hours), and then stirred for a further 3 hours at room temperature. Then, 15.5 ml of 1N-HCl was added. The solution is evaporated to dryness in vacuo, the residue is briefly heated on the steam bath with 25 ml of water and, after cooling to O'C, the precipitate that forms is filtered off. For purification, the substance is dissolved in 4 ml of dimethylformamide and then 8 ml of water are added. First a syrupy precipitate forms, which gradually becomes crystalline. A further 8 ml of water are gradually added and, after cooling to 0 ', filtered off.

Ausbeute: 2,77 g (86% der Theorie) N-Cbzoglycyl-L-leucin.Yield: 2.77 g (86% of theory) of N-Cbzoglycyl-L-leucine.

Schmp.: 100 bis 101'C (korrigiert), [a]-Do = -10,10 (c = 5, Äthanol).M.p .: 100 to 101 ° C (corrected), [a] -Do = -10.10 (c = 5, ethanol).

2. Darstellung von Glycyl-L-phenylalanin a) Herstellung des Ausgangsmaterials 2,09 g (0,01 Mol) N-Cbzo-glycin, 2,75 g (0,015 Mol) Saccharin und 3,095 g (0,015 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid werden in 30 ml eiskaltem Tetrahydrofuran gelöst. Der Ansatz wird 24 Stunden bei O'C stehengelassen. Dann läßt man auf Raumtemperatur kommen und filtriert ab. Die abfiltrierte Substanz wird gründlich mit warmem Tetrahydrofuran gewaschen und das Filtrat dann zur Trockene gedampft. Der Rückstand wird mit 20 ml einer Mischung von gleichen Teilen Tetrachloräthan und Diäthyläther behandelt. Nach Abkühlen auf O'C wird der sich bildende Niederschlag abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Die Substanz wird nach dem Trocknen aus 8 ml einer Mischung von Acetonitril-Benzol 1: 1 umkristallisiert.2. Preparation of glycyl-L-phenylalanine a) Preparation of the starting material 2.09 g (0.01 mol) N-Cbzo-glycine, 2.75 g (0.015 mol) saccharine and 3.095 g (0.015 mol) dicyclohexylcarbodiimide are in 30 ml of ice-cold tetrahydrofuran dissolved. The batch is left to stand at O'C for 24 hours. Then allowed to come to room temperature and filtered off. The filtered substance is washed thoroughly with warm tetrahydrofuran and the filtrate is then evaporated to dryness. The residue is treated with 20 ml of a mixture of equal parts of tetrachloroethane and diethyl ether. After cooling to O'C, the precipitate which forms is filtered off and washed with methanol. After drying, the substance is recrystallized from 8 ml of a 1: 1 mixture of acetonitrile-benzene.

Ausbeute: 3,16 g N-Cbzo-glycyl-saccharin. Schmp.: 158 bis 160'C (Zersetzung, korrigiert). Die Mutterlauge wird zur Trockene gedampft, der Rückstand mit Methanol gewaschen und wie oben umkristallisiert.Yield: 3.16 g of N-Cbzo-glycyl-saccharin. M.p .: 158 to 160 ° C (decomposition, corrected). The mother liquor is evaporated to dryness, the residue is washed with methanol and recrystallized as above.

Ausbeute: 240 mg.Yield: 240 mg.

Schmp.: 158 bis 160'C (Zersetzung, korrigiert). Zusammen beträgt die Ausbeute 3,40g (910/0 der Theorie). b) Verfahren der Erfindung 3,75 g (0,01 Mol) N-Cbzo-glycyl-sacchann, 1,65 g (0,01 MOI) L-Phenylalanin und 2,5 g (0,025 Mol) KHCO3 werden in 30m1 einer eiskalten Mischung von Tetrahydrofuran-Wasser 1 : 1 gelöst bzw. suspendiert. Der Ansatz wird 2 Stunden bei O'C gerührt und dann -3 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend gibt man 15,5 ml 1 n-HCI hinzu und dampft im Vakuum zur Trockene. Der Rückstand wird mit 30 ml Wasser kurz auf dem Dampfbad erhitzt. Das zunächst sirupöse Produkt wird beim Abkühlen auf Raumtemperatur kristallin. Man filtriert den Niederschlag ab und wäscht gründlich mit Wasser. Umkristallisiert wird aus 10 ml 50%igem Äthanol.M.p .: 158 to 160 ° C (decomposition, corrected). The total yield is 3.40 g (910/0 of theory). b) Method of the invention 3.75 g (0.01 mol) of N-Cbzo-glycyl-sacchann, 1.65 g (0.01 MOI) of L-phenylalanine and 2.5 g (0.025 mol) of KHCO3 are in 30 ml of a ice-cold mixture of tetrahydrofuran-water 1: 1 dissolved or suspended. The batch is stirred for 2 hours at O'C and then left to stand for -3 hours at room temperature. Are then added 15.5 ml of 1N HCl are added and evaporated in vacuo to dryness. The residue is briefly heated on the steam bath with 30 ml of water. The initially syrupy product becomes crystalline on cooling to room temperature. The precipitate is filtered off and washed thoroughly with water. It is recrystallized from 10 ml of 50% ethanol.

Ausbeute: 3,32 g (93 % der Theorie) cN-Cbzoglycyl-L-phenylalanin.Yield: 3.32 g (93 % of theory) of cN-Cbzoglycyl-L-phenylalanine.

Schmp.: 125 bis 126'C (korrigiert), [a]-D = +39,8' (c = 5, Athanol).M.p .: 125 to 126'C (corrected), [a] -D = +39.8 ' (c = 5, ethanol).

3,56 g (0,01 Mol) N-Cbzo-glycyl-L-phenylalanin werden in wäßrigem Methanol gelöst und in einer Schüttelbirne hydriert in Gegenwart von 0,5 g Palladium-Schwarz und 0,5 ml Eisessig. Nach Beendigung der C0p-Entwicklung wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene gedampft. Der Rückstand wird in wenig heißem Wasser gelöst und nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur Äthanol zugegeben, bis nichts mehr ausfällt. Anschließend wird abfiltriert und die Substanz mit Äthanol gewaschen. 3.56 g (0.01 mol) of N-Cbzo-glycyl-L-phenylalanine are dissolved in aqueous methanol and hydrogenated in a shaker in the presence of 0.5 g of palladium black and 0.5 ml of glacial acetic acid. After the evolution of COp has ended, the catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated to dryness in vacuo. The residue is dissolved in a little hot water and, after cooling to room temperature, ethanol is added until nothing more precipitates. It is then filtered off and the substance is washed with ethanol.

Ausbeute: 1,93 g Glycyl-L-phenylalanin (87% der Theorie). [a]-D = +42,9' (c = 2, H?0). 3. Darstellung von Cbzo-L-analyl-im-N-benzyl-L-histidin a) Herstellung des Ausgangsmaterials 2,23 g (0,01 Mol) N-Cbzo-L-alanin, 2,2 g (0,012 Mol) Saecharin und 1,5 g (0,022 Mol) Imidazol werden soweit wie möglich in 25 ml Tetrahydrofuran gelöst und unter Eiskühlung und starkem Rühren 0,8 ml (0,011 Mol) SOQ, in 10m1 Tetrahydrofuran innerhalb von 1 Stunde zugetropft. Anschließend wird noch 2 Stunden bei O'C und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das Imidazol-hydrochlorid abfiltriert und das Filtrat zur Trockene gedampft. Der meist sirupöse Rückstand wird mit 50 ml absolutem Äther gründlich durchgearbeitet, bis alles kristallin geworden ist. Man läßt noch 1 Stunde stehen, filtriert dann und wäscht mit absolutem Äther und mit Methanol. Die Substanz -wird aus 15 ml Acetonitril umkristallisiert.Yield: 1.93 g of glycyl-L-phenylalanine (87% of theory). [a] -D = +42.9 ' (c = 2, H? 0). 3. Preparation of Cbzo-L-analyl-im-N-benzyl-L-histidine a) Preparation of the starting material 2.23 g (0.01 mol) N-Cbzo-L-alanine, 2.2 g (0.012 mol) Saecharin and 1.5 g (0.022 mol) of imidazole are dissolved as far as possible in 25 ml of tetrahydrofuran and 0.8 ml (0.011 mol) of SOQ in 10 ml of tetrahydrofuran are added dropwise over the course of 1 hour, while cooling with ice and stirring vigorously. The mixture is then stirred for a further 2 hours at O'C and 3 hours at room temperature. The imidazole hydrochloride is then filtered off and the filtrate is evaporated to dryness. The mostly syrupy residue is worked through thoroughly with 50 ml of absolute ether until everything has become crystalline. You can still stand for 1 hour, then filtered and washed with absolute ether and methanol. The substance is recrystallized from 15 ml of acetonitrile.

Ausbeute: 3,87 g N-Cbzo-L-alanyl-saccharin CH3CN (90,1% der Theorie).Yield: 3.87 g of N-Cbzo-L-alanyl-saccharin CH3CN (90.1% of theory).

Schmp.: 161 bis 162'C (korrigiert), [a]D- = -25,6-(c = 2, Tetrahydrofuran)., An Stelle von Imidazol kann auch eine gleiche Menge Triäthylamin oder Pyridin als säurebindendes Mittel verwendet werden. Die Ausbeute ist dann um 10 bis 150jo niedriger. b) Verfahren der Erfindung 1,23 g (0,005 Mol) im-N-Benzyl-L-histidin und 0,63 g (5/s mMol) KHCO3 werden in der Hitze in 10 ml Wasser gelöst, die Lösung rasch auf OOC abgekühlt und, bevor etwas auskristallisieren kann, 2,15 g (0,005 Mol) N-Cbzo-L-alanyl-saecharin -CH3CN sowie lOrril eiskaltes Tetrahydrofuran zugefügt. Anschließend wird der Ansatz noch 1 Stunde bei O'C und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann 7,5 ml 1 n-HCI zugegeben. Das organische Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt. Aus der hinterbleibenden Lösung kristallisiert eine Substanz aus, die nach Kühlen auf O'C abfiltriert und mit Eiswasser gewaschen wird. Nach dem Trocknen kristallisiert man aus 75 ml Essigester um und filtriert nach einigen Tagen ab.Melting point: 161 to 162'C (corrected), [a] D- = -25.6- (c = 2, tetrahydrofuran)., Instead of imidazole, an equal amount of triethylamine or pyridine can also be used as an acid-binding agent. The yield is then 10 to 150% lower. b) Process of the invention 1.23 g (0.005 mol) im-N-benzyl-L-histidine and 0.63 g (5 / s mmol) KHCO3 are dissolved in 10 ml of water while hot, the solution is rapidly cooled to OOC and, before something can crystallize out, 2.15 g (0.005 mol) of N-Cbzo-L-alanyl-saecharine -CH3CN and lOrril ice-cold tetrahydrofuran are added. The mixture is then stirred for a further 1 hour at O'C and for 2 hours at room temperature and then 7.5 ml of 1N-HCl was added. The organic solvent is removed in vacuo. A substance crystallizes out of the remaining solution, which, after cooling to O'C, is filtered off and washed with ice water. After drying, it is recrystallized from 75 ml of ethyl acetate and filtered off after a few days.

Ausbeute: 1,88 g N-Cbzo-L-alanyl-im-N-benzyl-L-histidin (83,5()/o der Theorie).Yield: 1.88 g of N-Cbzo-L-alanyl-im-N-benzyl-L-histidine (83.5% of theory).

Schmp.: 144 bis 146'C (korrigiert). 4. Darstellung von Cbzo-L-phenylalanylglycyl-L-phenylalanin a) Herstellung des Ausgangsmaterials 2,99 g (0,01 Mol) N-Cbzo-L-phenylalanin und 2,75 g (0,015 Mol) Saccharin werden in 20 ml Methylenchlorid soweit wie möglich gelöst, auf +5cC abgekühlt und eine Lösung von 3,1 g (0,015 Mol) Dicyclohexyl-carbodiimid in 10 ml Methylenchlorid zugegeben. Der Ansatz wird 20 Minuten geschüttelt und dann 36 Stunden bei +5'C stehengelassen. Dann wird der gebildete Dicyclohexyl-harnstoff abfiltriert, das Filtrat zur Trockene gedampft und dei Rückstand zur Entfernung des Additionsproduktes von Saccharin an Dicyclohexyl-carbodiimid mit 50 ml absolutem Methanol gründlich durchgearbeitet. Der Niederschlag wird nach 1 Stunde abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Umkristallisiert wird aus 15 ml Anisol. Nach Abkühlen in der Tiefkühltruhe wird abgesaugt und mit Methanol gewaschen.M.p .: 144 to 146'C (corrected). 4. Preparation of Cbzo-L-phenylalanylglycyl-L-phenylalanine a) Preparation of the starting material 2.99 g (0.01 mol) of N-Cbzo-L-phenylalanine and 2.75 g (0.015 mol) of saccharine are dissolved in 20 ml of methylene chloride Dissolved as much as possible, cooled to + 5cC and a solution of 3.1 g (0.015 mol) of dicyclohexylcarbodiimide in 10 ml of methylene chloride was added. The batch is shaken for 20 minutes and then left to stand at + 5'C for 36 hours. The dicyclohexyl urea formed is then filtered off, the filtrate is evaporated to dryness and the residue is worked through thoroughly with 50 ml of absolute methanol to remove the addition product of saccharin to dicyclohexyl carbodiimide. The precipitate is filtered off after 1 hour and washed with methanol. It is recrystallized from 15 ml of anisole. After cooling in the freezer, it is filtered off with suction and washed with methanol.

Ausbeute: 3,76 g N-Cbzo-L-phenylalanyl-saccharin (81,0% der Theorie).Yield: 3.76 g of N-Cbzo-L-phenylalanyl-saccharin (81.0% of theory).

Schmp.: 157 bis 158'C, [a]2D2= +47,0' (c = 3, Tetrahydrofuran). b) Verfahren der Erfindung Cbzo-L-phenylalanyl-saccharin und Glycyl-L-phenylalanin werden wie im Beispiel 1 flür Cbzo-glycyliAeucin beschrieben umgesetzt. Zur Isolierung extrahiert man das Peptid mit Essigester und kristallisiert aus Essigester-Petroläther um.M.p .: 157 to 158'C, [a] 2D2 = +47.0 '(c = 3, tetrahydrofuran). b) Process of the Invention Cbzo-L-phenylalanyl-saccharin and glycyl-L-phenylalanine are reacted as described in Example 1 for Cbzo-glycyli-aeucine. For isolation, the peptide is extracted with ethyl acetate and recrystallized from ethyl acetate-petroleum ether.

Ausbeute: 81% der Theorie an Cbzo-L-phenylalanyl-glycyl-L-phenylalanin. Schmp.: 148 bis 150'C (unkorrigiert). 5. Darstellung von Phthaloyl-L-leucylglycin-äthylester a) Herstellung des Ausgangsmaterials 2,60 g (0,01 Mol) N-Phthaloyl-L-leucin und 2,75 g (0,015 Mol) Saccharin werden soweit wie möglich in 20 ml Acetonitril gelöst, auf +5'C abgekühlt und eine Lösung von 3,095 g (0,015 Mol) Dicyclohexyl-carbodiimid in 10 ml Acetonitril zugegeben. Der Ansatz wird 10 Minuten geschüttelt und dann 24 Stunden bei +5'C stehengelassen. Danach wird die Temperatur auf -5'C erniedrigt, wobei der größte" Teil des als Nebenprodukt entstehenden Additionsproduktes von Saccharin an Dicyclohexylcarbodiimid ausfällt. Es wird abfiltriert und mit wenig kaltem Acetonitril gewaschen. Das Filtrat wird zur Trockene gedampft und der hinterbleibende Sirup mit 25 ml Methanol versetzt und geschüttelt. Es bildet sich ein kristalliner Niederschlag, der nach 1 Stunde abfiltriert und nach dem Trocknen aus 15 ml Toluol umkristallisiert wird.Yield: 81% of theory of Cbzo-L-phenylalanyl-glycyl-L-phenylalanine. M.p .: 148 to 150 ° C (uncorrected). 5. Preparation of phthaloyl-L-leucylglycine-ethyl ester a) Preparation of the starting material 2.60 g (0.01 mol) of N-phthaloyl-L-leucine and 2.75 g (0.015 mol) of saccharin are as far as possible in 20 ml Dissolved acetonitrile, cooled to + 5'C and added a solution of 3.095 g (0.015 mol) of dicyclohexyl carbodiimide in 10 ml of acetonitrile. The batch is shaken for 10 minutes and then left to stand at + 5'C for 24 hours. The temperature is then lowered to -5'C, the major part of the by-product of the addition product of saccharin and dicyclohexylcarbodiimide precipitating. It is filtered off and washed with a little cold acetonitrile. The filtrate is evaporated to dryness and the remaining syrup is 25 ml Methanol is added and the mixture is shaken, forming a crystalline precipitate which is filtered off after 1 hour and, after drying, is recrystallized from 15 ml of toluene.

Ausbeute: 3,76 g N-Phthaloyl-L-leucyl-saccharin (88,3% der Theorie).Yield: 3.76 g of N-phthaloyl-L-leucyl-saccharin (88.3% of theory).

Schmp.: 192 bis 195'C (korrigiert), [a]'D = +58,3' (c = 3, Tetrahydrofuran).M.p .: 192 to 195'C (corrected), [a] 'D = +58.3' (c = 3, tetrahydrofuran).

b) Verfahren der Eifindung 2,13 g (0,005 Mol) Phthaloyl-L-leucyl-saccharin und 700 mg (0,005 Mol) Glycin-äthylester-hydrochlorid werden soweit wie möglich in 20 ml Methylenchlorid gelöst und unter Eiskühlung 1,2 ml (0,015 Mol) Pyridin zugegeben. Der Ansatz wird 3 Stunden bei O'C gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wird dann mit Wasser ausgeschüttelt, dem zur Neutralisation des überschüssigen Pyridins 5,5 ml 1 n-HCI beigefügt sind. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wird zur Trockene gedampft und der sirupöse Rückstand in der Hitze in 20 ml 50%igem Methanol gelöst. Beim Abkühlen und Animpfen bildet sich ein kristalliner Niederschlag, der nach dem Abfiltrieren nochmals aus 20 ml 50()/()igem Methanol umkristallisiert wird. b) Method of finding 2.13 g (0.005 mol) of phthaloyl-L-leucyl-saccharin and 700 mg (0.005 mol) of glycine ethyl ester hydrochloride are dissolved as far as possible in 20 ml of methylene chloride and 1.2 ml (0.015 Mol) pyridine added. The batch is stirred for 3 hours at O'C and left to stand at room temperature overnight. The solution is then extracted with water to which are added to neutralize excess pyridine 5.5 ml of 1N-HCl. After drying with sodium sulfate, the mixture is evaporated to dryness and the syrupy residue is dissolved in 20 ml of 50% methanol in the heat. A crystalline precipitate forms on cooling and inoculation, which, after filtering off, is recrystallized again from 20 ml of 50 () / () strength methanol.

Ausbeute: 1,49 g N-Phthaloyl-L-leucyl-glycin-äthylester (86,3% der Theorie).Yield: 1.49 g of N-phthaloyl-L-leucyl-glycine ethyl ester (86.3% of theory).

Schmp.: 88,5 bis 89'C (korrigiert), [a]2D-' = -6,0' (c = 1, Äthanol). 6. Darstellung von Di-cbzo-x.-tyrosyl-L-glutarninsäure-benzylester a) Herstellung des Ausgangsmaterials Di-ebzo-L-tyrosyl-saccharin wird in genau gleicher Weise wie im Beispiel 5 für Phthaloyl-L-leucylsaccharin geschrieben hergestellt.M.p .: 88.5 to 89'C (corrected), [a] 2D- '= -6.0' (c = 1, ethanol). 6. Preparation of di-cbzo-x-tyrosyl-L-glutaric acid benzyl ester a) Preparation of the starting material Di-ebzo-L-tyrosyl-saccharine is prepared in exactly the same way as described in Example 5 for phthaloyl-L-leucylsaccharine.

Ausbaute: 78,0% der Theorie.Expansion: 78.0% of theory.

Schmp.: 141 bis 143'C (korrigiert), [a12D5 = +40,4' (c = 3, Tetrahydrofaran).M.p .: 141 to 143'C (corrected), [a12D5 = +40.4 ' (c = 3, tetrahydrofaran).

b) Verfahren der Erfindung 3,07 g (0,005 Mol) Di-cbzo-L-tyrosyl-saccharin, 1, 19 g (0,005 MOI) L-Glutaminsäure-y-benzylester und 1,25 g (0,0125 Mol) KHCO3 werden in einer eiskalten Mischung von 20 ml Tetrahydrofuran-Wasser 1 : 1 suspendiert. Der Ansatz wird 1,5 Stunden bei O'C und 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend werden 8 ml 1 n-HCI zugegeben und im Vakuum zur Trockene gedampft. Der Rückstand wird mit 20 ml Wasser kurz auf dem Dampfbad erhitzt. Es bildet sich ein sirupöser Niederschlag, der beim Stehen allmählich kristallin wird. Die Substanz wird abfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und zweimal aus 60%igem Athanöl umkristallisiert. b) Process of the invention 3.07 g (0.005 mol) di-cbzo-L-tyrosyl-saccharin, 1.19 g (0.005 MOI) L-glutamic acid γ-benzyl ester and 1.25 g (0.0125 mol) KHCO3 are suspended in an ice-cold mixture of 20 ml of tetrahydrofuran-water 1: 1. The batch is stirred for 1.5 hours at O'C and 1.5 hours at room temperature. Subsequently, 8 ml of 1N-HCl was added and evaporated to dryness in vacuo. The residue is briefly heated on the steam bath with 20 ml of water. A syrupy precipitate forms, which gradually becomes crystalline on standing. The substance is filtered off, washed thoroughly with water and recrystallized twice from 60% ethanol.

Ausbeute: 2,96 g Di-cbzo-L-tyrosyl-L-glutaminsäure-y-benzylester (88,5% der Theorie).Yield: 2.96 g of di-benzo-L-tyrosyl-L-glutamic acid γ-benzyl ester (88.5% of theory).

Schmp.: 113 bis 115'C (korrigiert), [al-'D-' = + 3,4' (c = 2, Tetrahydrofuran).M.p .: 113 to 115'C (corrected), [al-'D-' = + 3.4 ' (c = 2, tetrahydrofuran).

Claims

Claim: A process for the production of oligo-peptides from an amino acid or its ester with a free amino group or from peptides with a free amino group by means of an amino acid activated on the carboxyl group, the a-nitrogen atom of which is protected by a cleavable residue, characterized in that the Process with one on the carboxyl group through the o-sulfobenzoimide radical of the formula activated amino acid in the presence of potassium bicarbonate or pyridine.