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Verfahren zur Herstellung von ss-Peltatinglucosid Es wurde gefunden, dass man aus Podo- lrhyllum peltatum neben Podophyllotoxinglu- eosid das bisher unbekannte ss-Peltatinglu- eosid gewinnen kann, indem man die durch Extraktion mit einem chlorierten Kohlenwasserstoff von der Harzfraktion befreite Droge mit einem wasserlösliehen Alkohol auszieht, den Extrakt konzentriert und dann mit Wasser verdünnt, diese Lösung zur Auft.rennung des Cerbstoff-Glueosid-Koniplexes mit Gerbstoff-fällenden Mitteln behandelt, die Fällung abtrennt,
die zurückbleibende Lösung vom or ganisehen Lösungsmittel weitgehend befreit und mit Wasser verdünnt, die wässerige Lösung zur Entfernung von Begleitstoffen mit einem mit Wasser nicht misehbaren Lösungsmittel extrahiert, dann die Glueoside mit einem mit Wasser nicht misehbaren Lösungsmittel, das höchstens 10% eines wasserlösliehen Alkohols enthält, aus- schüttelt, das in die organische Phase übergegangene,
vorwiegend Podophyllotoxinglu- eosid und ss-Peltatinglucosid enthaltende (Tlueosid-(Temisch nach Abdestil.lieren des Lösungsmittels in fester Form gewinnt und daraus, zum Beispiel mittels ehemiseh-physi- kalischer Methoden, das ss-Peltatinglucosid isoliert.
Zur Isolierung des ss-Peltatirrglueosids aus dem Cl.ieosidgemiseli eignen sieh vor allem ehroniatographische Verfahren. Als besonders geeignet erwies sieh zum Beispiel eine Verteilung zwischen Wasser und mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln in einer Säule, die als Trägermasse ein Material enthält, das Wasser festzuhalten vermag, wie zum Beispiel Silicagel, Diatomitstein, Kieselgur oder Cellit (eingetragene Marke).
Wird eine solche Säule nach dem Aufbringen der Substanz in fester oder in gelöster Form, mit Hilfe von mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, wie chlorierten Kohlenwasserstoffen, niederen Estern usw., gegebenenfalls unter Zusatz von kleinen Mengen eines niederen wasserlöslichen Alkohols (etwa 0,5 bis 5 %), entwickelt, so treten aus der Säule zuerst. Fraktionen aus, welche das Podophyl- lotoxinglucosid enthalten.
Durch weitere Ent- wicklung des Chromatogramms, vorteilhaft mit dem gleichen Lösungsmittel, werden dann anschliessend Fraktionen erhalten, welche das neue ss-Pe'ltatinglucosid enthalten. Überwiegt in den zur Verteilung verwendeten Fraktionen das Podophyllotoxinglucosid, so erhält man, bevor das ss-Peltatinglncosid einheitlich aus der Säule austritt, einige Fraktionen, welche neben dem neuen Glucosid auch noch Podo- phyllotoxinglucosid enthalten. Da die physi- kalisch-chemischen Eigenschaften der -beiden Glucoside sehr ähnlich sind, so bereitet selbst die Trennung in einer Säule einige Schwierigkeiten.
Um das neue Glucosid völlig frei von Podophyllotoxinglucosid zu erhalten, muss deshalb die Fraktionierung in. einer Säule
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eventuell mit den angereicherten Präparaten wiederholt werden. Die Trennung der beiden Glucoside nach dem erwähnten Prinzip gelingt aber nicht nur in einer Säulenanordnung, sondern kann zum Beispiel auch durch Verteilen zwischen den oben angegebenen Lösungsmitteln mit Hilfe eines Craig-Apparates oder mit einer genügenden Anzahl von Scheidetrichtern nach dem Gegenstromprinzip bewerkstelligt werden.
Eine weitere Möglichkeit zur Reindär- stellung des neuen Glueosids besteht darin, dass niaü die etwas verschiedene Alkali-Emp- findlichkeit der beiden Glucoside ausnützt.
Behandelt man zum Beispiel das Glucosid- gemisch mit Ammoniak oder mit einer andern schwach alkalisch reagierenden Substanz in wässeriger oder alkoholischer Lösung bei Zimmertemperatur oder während kurzer Zeit i in der Wärme, so wird das Podophyllotoxin- ghicosid praktisch quantitativ in das schwerlösliche, leicht kristallisierende Pikropodo- phyllinglucosid umgelagert und kann dann leicht durch seine Unlöslichkeit in Wasser abgetrennt werden. Zur weiteren Reinigung können die so erhaltenen Präparate des ss- Peltatinglucosids, wie oben beschrieben, der Verteilungschromatographie unterworfen werden.
Das bisher unbekannte P-Peltatinglucosid hat die Zusammensetzung CzeH3,013 und schmilzt bei 156 bis 159 . Es besitzt in Me- thanollösung einen Drehwert von [a] D = -123 und in Pyridinlösung [a]D = -167 . Das Ghicosid löst sich leicht in Alkohol und ist auch in Wasser gut. löslich. Es wird leicht mit ss-Glucosidase enzymatisch gespalten Dabei entstehen als Spaltstücke f-Peltatin und D-Glucose.
Das neue Glueosid zeichnet sich ebenso wie das Podophyllotoxinglucosid gegenüber den bis jetzt bekannten zuckerfreien Wirkstoffen aus der Podophyllum-Droge durch seine Löslichkeit in Wasser und ganz besonders s durch eine bessere Verträglichkeit und geringere Toxizität aus. Es soll therapeutische Verwendung als Antimitotikum finden und dient als Zwischenprodukt für die Her@tt,l- hing von P)-Peltatin und seinen Derivaten.
Beispiel 1 Getrocknete Rhizome von Podophyllum peltatum L. werden fein gemahlen und dann mehrmals bei gewöhnlicher Temperatur mit Chloroform extrahiert. Das so vorgereinigte Pflanzenmaterial wird nun mit Methanol ausgezogen, worauf man die vereinigten ,"elli gefärbten Auszüge auf etwa einen Drittel konzentriert und dann mit, dem #-n-leielien V olumenr Wasser versetzt.
Die wässerig-methano- lische Lösung wird nun zur Auftrennung des Gerbstoff-Glueosid=liomplexes mit. einer konzentrierten wässerigen Lösung von Bleiacetat, solange eine Fällung entsteht, versetzt. Nach dem Abfiltrieren des entstandenen. Niederschlags befreit man die Lösung durch Konzentrieren im Vakuum möglichst vollständig vom ll:etlianol, verdünnt sie mit etwas Wasser und schüttelt sie mehrmals mit etwas reinem Chloroform aus.
Diese Chloroformauszüge enthalten neben harzigen Begleit- stoffen auch schon kleine Mengen Podo- phyllotoxinglucosid. Die wässerige Restlösung wird anschliessend mehrmals mit Clilorofoi-n i, dein 10 /n Alkohol zugesetzt. sind, ausgeschüttelt, worauf man die vereinigten, fast farblosen Chloroformauszüge eindampft, den Eindampfrüekstand mit Äther wäscht und trocknet.
Dieses C'lucosidgeniiseh wird zur Isolierung des ss-Peltatin""lneosids in einer Säule aus pulverisiertem Diatomitstein (eine Art Ilieselgur) chromatographiert. Das Ghieosicl- gemisch wird in wenig lIetlianol gelöst auf die Säule gegossen. Anschliessend wird die Säule mit nassem Essigester entwickelt. Nach einigen Vorfraktionen, die noch gefärbte und etwas harzige Anteile enthalten, treten Fraktionen aus der Säule, welche das Podophyllo- toxinglueosid enthalten.
Entwickelt man die Säule weiter mit dem. gleichen Lösungsmittel, so tritt unmittelbar nachdem die Hauptmenge des Podophyllotoxinglueosids aus der Säule ausgewaschen ist, das f-Pelta- tinglucosid aus. Aus der (zewiehtskurve des
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('liromatogramins geht dieser Trennungsvorgang meistens deutlich hervor;
sollte er nicht -in den beiden Maxima für die beiden Glu- eoside klar ersichtlich sein, so können die I>odophyllotoxinglucosidhaltigen Fraktionen zum Beispiel durch Überführung dieses (lliieosid,3 in das fast unlösliche und kristallisierte Pikropodophyllinglueosid mit Hilfe von Ammoniak erkannt werden.
Die das neue Glucosid enthaltenden Fraktionen werden eingedampft und zum Beispiel noch (lareh Umfällen aus Aeeton-Äther gereinigt. hin solches Präparat ist einheitlich, wenn e5 bei der Ammoniakbehandlung keine was- serunlösliehen Anteile mehr liefert. Es besitzt dann die oben erwähnten Eigenschaften des ss-Peltatinglucosids.
Beispiel Die methanolische Lösung von 1 g des nach dem ersten Abschnitt des Beispiels 1 erhaltenen CTlucosidgemisches, welche das foclophyllotoxinglucosicl und das ss-Peltatin- @lucosid enthält, wird nach Zugabe von 0,5 ein-' konzentriertem wässerigem Ammoniak während kurzer Zeit (1 bis 2 Stunden) ani Dampfbad erwärmt. Von einer gelegentlich auftretenden kristallinen Abseheidung wird filtriert (diese entsteht mir, wenn viel Podophyllotoxinglucosid zugegen war) und dann die Lösung eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in Wasser aufgenommen, die Lösung von unlöslichen Anteilen abgetrennt und dann zur Trockne gebracht.
Der Eindampfriiekstand wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, in einer Säule gereinigt. Das chromatographisch gereinigte Präparat ist frei von Podophyllotoxingliicosid und besitzt die oben für das ss-Peltatinglucosid angegebenen Eigenschaften.
Beispiel 3 Getrocknete Rhizome von Podophyllum peltatum werden fein gemahlen und dann mehrmals bei gewöhnlicher Temperatur mit Chloroform extrahiert. Das so vorgereinigte Pflanzenmaterial wird nun mit Methanol aiieezogrn, worauf man die vereinigten, gelb gefärbten Auszüge auf etwa einen Drittel konzentriert und dann mit dem gleichen Volumen Wasser versetzt.
Die wässerig-metha- nolische Lösung wird nun mit einer konzentrierten wässerigen Lösung von Bleiacetat, solange eine Fällung entsteht, versetzt. - Nach dem Abfiltrieren der entstandenen Fällung wird die Lösung durch Konzentrieren im Vakuum möglichst vollständig von Methanol befreit und mit etwas Wasser verdünnt und dann mehrmals mit etwas reinem Chloroform ausgeschüttelt. Diese Chloroformaus- züge enthalten neben harzigen Begleitstoffen auch schon kleine Mengen des neuen Glu- cosids. Die wässerige Restlösung wird anschliessend mehrmal mit.
Chloroform, dem 10 % Alkohol zugesetzt sind, ausgeschüttelt, worauf man die vereinigten, fast farblosen Chloroformauszüge eindampft, den Eindampfrückstand mit Äther wäscht und trocknet.
Dieses Glucosidgemisch wird in Essigester gelöst und zur Reinigung an einer Säule aus Sillicagel chromatographiert. Beim Eluieren der Säule mit Essigester, dem 1 bis .5 /a Methanol beigemischt sind, erhält man nach einer Vorfraktion, die hauptsächlich noch gefärbte, etwas harzige Anteile enthält, Fraktionen, die das Podophyllötokin- glucosid und ss-Peltatinghicosid enthalten. Dieses Glucosidgemisch wird daraus nach Eindampfen und Umfällen aus Aceton-Äther in reiner Form erhalten.
Eine konzentrierte methanolische Lösung von 1 g eines auf diese Weise erhaltenen Präparates wird auf eine Säule gebracht, welche ein Trägermaterial enthält, das durch Vermischen von gleichen Teilen Wasser und Sillicagel bereitet wurde. Durch die Säule wird eine Mischung von Chloroform und 3 o/u Äthanol filtriert. Die einzelnen Fraktionen- werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf die Glucoside geprüft und entsprechend unterteilt und gereinigt.
Beispiel 4 Die wässerige Lösung eines Glucosidprä- parates, das nach Abschnitt 1 und 2 von Beispiel 3 hergestellt wurde, wird durch Ausschütteln mit Äthylenehlorid, dem 1011/o, Iso-
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propanöl zugesetzt werden, in einer Serie von Scheidetrichtern nach dem Gegenstromprinzip aufgeteilt. Aus den entsprechenden Fraktionen, die zum Beispiel. nach den Angaben in Beispiel 1 geprüft werden, werden die einzelnen Glucoside isoliert und gereinigt..
Beispiel 5 Die bei der Verteilung nach den Beispielen 1, 3 und 4 erhaltenen Zwischenfraktionen, welche neben dem neuen ss-Peltatin- glucosid auch noch mehr oder weniger grosse Anteile von Podophyllotoxinglucosid enthalten, werden in Methanol gelöst und entsprechend Beispiel 2 mit Ammoniak behandelt. Das reine ss-Peltatinglucosid wird dann nach den dort gemachten Angaben isoliert.
Beispiel 6 Die wässerige Lösung eines Glueosidge- misches, das nach dem ersten Abschnitt des ,Beispiels 1 erhalten wurde, wird mit einem geeigneten Puffer vom PH = 7;5 versetzt. Nach kurzem Erwärmen wird die ausgefallene Pikroverbindüng des Podophyllotoxin- glucosids abfiltriert. Das Filtrat wird nach den Angaben von Beispiel 2 auf reines ss- Peltatinglucosid verarbeitet.