BRPI9915679B1 - Composições e métodos para aumentar a mineralização óssea - Google Patents

Composições e métodos para aumentar a mineralização óssea Download PDF

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Abstract

"composições e métodos para aumentar a mineralização óssea". a presente invenção refere-se a uma nova classe de proteínas. são também revelados ensaios para selecionar moléculas para aumentar a mineralização óssea e metodos para utilizar tais moléculas.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA AUMENTAR A MINERALIZAÇÃO ÓSSEA (51) Int.CI.: C12N 15/12; C07K 14/51; C07K 14/495; C12N 15/63; C12N 5/10; C07K 16/22; C12Q 1/68; C12N 15/62; A61K 38/18; A61P 19/10; G01N 33/53; A01K 67/027 (30) Prioridade Unionista: 27/11/1998 US 60/110.283 (73) Titular(es): UCB PHARMA SA (72) Inventor(es): MARY E. BRUNKOW; DAVID J. GALAS; BRIAN KOVACEVICH; JOHN T. MULLIGAN; BRYAN W. PAEPER; JEFFREY VAN NESS; DAVID G. WINKLER
COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA AUMENTAR MINERALIZAÇÃO ÓSSEA < #*'
Figure BRPI9915679B1_D0001
CAMPO TÉCNICO
A presente invenção refere-se genericamente a produtos farmacêuticos e processos e, mais especificamente, a processos e composições apropriados para aumentar o teor mineral de osso. Tais composições e processos podem ser utilizados para tratamento de uma ampla variedade de condições, incluindo, por exemplo, osteopenia, osteoporose, fraturas e outras desordens nas quais baixa densidade mineral de osso são um marco da doença.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Duas ou três fases distintas de mudanças de massa de osso ocorrem durante a vida de um indivíduo (ver Riggs, West J. Med. 154:63-77, 1991}. A primeira fase ocorre em ambos homens e mulheres, e procede para obtenção de uma massa óssea de pico. A primeira fase é obtida através de crescimento linear das placas de crescimento endocondral, e crescimento radical devido a uma taxa de aposição periosteal. A segunda fase começa ao redor da idade de 30 para osso trabecular (ossos planos tais como vértebras e pélvis) e cerca de idade de 40 para osso cortical (por exemplo, ossos longos encontrados nos membros) e continua para idade velha. Esta fase é caracterizada por lenta perda óssea, e ocorre em ambos, homens e mulheres. Em mulheres, uma terceira fase de perda óssea também ocorre, mais provavelmente devido a deficiências de estrogênio pósmenopausa. Durante esta fase sozinha, mulheres podem perder
I
Figure BRPI9915679B1_D0002
10% adicionais de massa óssea a partir de osso cortical e 25% a partir do compartimento trabecular (ver Riggs, supra).
Perda de teor mineral ósseo pode ser causada por uma ampla variedade de condições, e pode resultar em significantes problemas médicos. Por exemplo, osteoporose é uma doença debilitante em humanos caracterizada ppr acentuadas diminuições em massa óssea de esqueleto e densidade mineral, deterioração estrutural de osso incluindo degradação de micro-arquitetura de osso e correspondentes aumentos em fragilidade de osso e suscetibilidade a fratura em indivíduos afligidos. Osteoporose em humanos é precedida por osteopenia clínica (densidade mineral óssea que é maior que um desvio padrão mas menos que 2,5 desvios padrões abaixo do valor médio para osso adulto jovem), uma condição encontrada em aproximadamente 25 milhões de pessoas nos Estados Unidos. Outros 7-8 milhões de pacientes nos Estados Unidos foram diagnosticados com osteoporose clínica (definida como teor mineral ósseo maior que 2,5 desvios padrões abaixo daquele de osso adulto jovem maduro). Osteoporose é uma das doenças mais caras para o sistema de saúde, custando dezenas de bilhões de dólares anualmente nos Estados Unidos. Em adição a custos relacionados com saúde, cuidados residenciais de longo termo e dias de trabalho perdidos adicionam-se a custos financeiros e sociais desta doença. No mundo inteiro aproximadamente 75 milhões de pessoas estão em risco de osteoporose.
A freqüência de osteoporose na população humana aumenta com a idade, e entre Caucasianos é predominante em mulheres (que compreendem 80% da reunião de pacientes de osteoporose nos Estados Unidos). A aumentada fragilidade e suscetibilidade para fratura de osso esqueletal no idoso é agravada pelo maior risco de quedas acidentais nesta
população. Mais de 1,5 milhões de fraturas ósseas
relacionadas com osteoporose são reportadas nos Estados
Unidos cada ano. Quadris, punhos, e vértebras fraturadas
tabaco estão entre os danos mais comuns associados com osteoporose. Fraturas de quadris em particular são extremamente desconfortáveis e caras para o paciente, e para mulheres correlacionam-se com altas taxas de mortalidade e morbidez.
Embora osteoporose tenha sido definida como um aumento no risco de fratura devido a diminuída massa óssea, nenhum dos tratamentos presentemente disponíveis para desordens do esqueleto pode aumentar substancialmente a densidade de ossos de adultos. Existe uma forte percepção entre todos os médicos de que são necessárias drogas que possam aumentar densidade óssea em adultos, particularmente nos ossos de punho, coluna vertebral e quadril que estão em risco de osteopenia e osteoporose.
Estratégias correntes para a prevenção de osteoporose podem oferecer alguns benefícios para indivíduos mas não podem assegurar resolução da doença. Estas estratégias incluem atividade moderação de atividade física (particularmente em atividade transportando peso) com o início de idade avançada, incluindo adequado cálcio na dieta, e evitar consumo de produtos contendo álcool ou pacientes apresentando osteopenia ou
Para
Figure BRPI9915679B1_D0003
osteoporose clínica, todas as drogas e estratégias terapêuticas correntes são direcionadas para reduzir ainda perda de massa óssea através de inibição de processo de absorção óssea, um componente natural do processo de remodelagem óssea que ocorre constitutivamente.
Por exemplo, estrogênio está agora sendo prescrito para retardar perda óssea. Existe, entretanto, alguma controvérsia sobre se existe qualquer benefício de longo termo para pacientes e se há qualquer efeito em pacientes acima de 75 anos de idade. Além disso, uso de estrogênio é acreditado aumentar o risco de câncer de mama e endometrial.
Altas doses de cálcio de dieta, com ou sem vitamina D também foram sugeridas para mulheres pósmenopausa. Entretanto, altas doses de cálcio frequentemente podem ter desagradáveis efeitos colaterais gastrointestinais, e níveis de cálcio de soro e urina têm de sçr continuamente monitorados (ver Khosla and Riggs, Mayo Clin.Proc. 70:978-982, 1995).
Outras terapias que foram sugeridas incluem calcitonina, bis-fosfonatos, esteróides anabólicos e fluoreto de sódio. Tais terapias entretanto, têm indesejáveis efeitos colaterais (por exemplo, calcitonina e esteróides podem causar náusea e provocar uma reação imune, bis-fosfonatos e fluoreto de sódio podem inibir reparo de fraturas, embora densidade óssea aumente modestamente) que podem evitar seu uso (ver Khosla and Riggs, supra).
Nenhuma estratégia terapêutica praticada atualmente envolve uma droga que estimula ou aperfeiçoa o crescimento de nova massa óssea. A presente invenção provê composições e processos que- podem ser utilizadas para aumentar mineralização óssea, e assim podem ser utilizados para tratamento de uma ampla variedade de condições onde é desejado aumentar-se massa óssea. Ainda, a presente invenção provê outras vantagens relacionadas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Como notado acima, a presente invenção provê uma nova classe ou família de proteínas-ligação beta-TGF, assim como ensaios para seleção de compostos que aumentam teor mineral ósseo e densidade mineral óssea, compostos que aumentam teor mineral ósseo e densidade mineral óssea e processos para utilização de tais compostos no tratamento ou prevenção de uma ampla variedade de condições.
Dentro de um aspecto da presente invenção, são providas moléculas de ácido nucléico isoladas, onde as ditas moléculas de ácido nucléico são selecionadas do grupo consistindo em: (a) uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo sequências ID Nos. 1, 5, 7, 9, 11, 13, ou 15, ou uma sua seqüência complementar; (b) uma molécula de ácido nucléico isolada que hibridiza especificamente para a molécula de ácido nucléico de (a) sob condições de alta rigorosidade, e (c) um ácido nucléico isolado que codifica uma proteína-ligante beta-TGF de acordo com (a) ou (b) . Dentro de aspectos relacionados da presente invenção, moléculas de ácido nucléico isoladas são providas baseadas em hibridização a somente uma porção de uma das seqüências identificadas acima (por exemplo, para (a) hibridização pode • · · ·
5Á
Figure BRPI9915679B1_D0004
·ser uma sonda de pelo menos 20, 25, 50 ou 100 nucleotídeos selecionados de nucleotídeos 156 a 539 ou 555 a 687 de seqüência ID No. 1) Como deve ser facilmente evidente, a rigorosidade necessária ser utilizada para hibridização pode variar baseado no tamanho da sonda. Por exemplo, para uma sonda de 25-mer condições de alta rigorosidade podem incluir: Tris 60mM, pH 8,0, EDTA 2mM, 5x Denhardt's, 6x SSC, N-lauril sarcosina 0,1% (peso/volume), NP-40 (nonidet P-40) 0,5% (peso/volume) por toda a noite a 45°C, seguido por duas lavagens com 0,2x SSC/SDS 0,1% a 45-50 graus. Para uma sonda de 100-mer sob condições de baixa rigorosidade, condições apropriadas podem incluir o seguinte: 5x SSPE, 5x
Denhardt's, e SDS 0,5% por toda a noite em 42-50 graus, seguido por duas lavagens com 2x SSPE (ou 2x SSC)/SDS 0,1% a
42-50 graus.
Dentro de aspectos relacionados da presente invenção, moléculas de ácido nucléico isoladas são providas as quais têm homologia a seqüências ID Nos. 1, 5, 7, 9, 11, 13, ou 15, em um nível de 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95% ou
98% de homologia utilizando um algoritmo de Wilbur-Lipman. Exemplos representativos de tais moléculas isoladas incluem, por exemplo, moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteíúa compreendendo seqüência ID Nos. 2, 6, 10, 12, 14, ou 16, ou têm homologia a estas seqüências em um nível de
50%, 60%, 75%, 80%, 90% ou 98% de nível de homologia utilizando um algoritmo de Lipman-Pearson.
Moléculas de ácido nucléico isoladas são tipicamente de menos que lOOkb em tamanho, e, dentro de t · * * • · c « certas realizações, menos que 50kb, 25kb, lOkb, ou mesmo 5kb em tamanho. Ainda, moléculas de ácido nucléico isoladas, dentro de outras realizações, não existem em uma biblioteca de outras moléculas de ácidos nucléicos nãorelacionadas (por exemplo, um subclone BAC tal como descrito em GenBank Accession No. AC003098 e EMB No. AQ171546). Entretanto, moléculas de ácido nucléico isoladas podem ser encontradas em bibliotecas de moléculas relacionadas (por exemplo, para embaralhamento, tal como é descrito nas patentes Norte-Americana 5.837.458; 5.830.721; e 5.811.238). Finalmente, moléculas de ácido nucléico isoladas como aqui descritas não incluem moléculas de ácido nucléico que codificam Dan, Cerbberus, Gremlin ou SCGF (patente NorteAmericana 5.780.263).
São também providos pela presente invenção vetores de clonagem que contêm as moléculas de ácido nucléico notadas acima, e vetores de expressão que compreendem um promotor (por exemplo, uma seqüência reguladora) operavelmente ligado a uma das moléculas de ácido nucléico notadas acima. Exemplos representativos de promotores apropriados incluem promotores específicos de tecido, e promotores baseados - viral (por exemplo, promotores baseados - CMV tais como CMV I-E, promotor inicial SV40 e MuLV LTR). Vetores de expressão também podem ser baseados, ou derivados de vírus (por exemplo, um vetor viral) . Exemplos representativos de vetores virais incluem vetores virais de herpes simplex, vetores adenovirais, vetores virais associados a adenovírus e vetores retroviraís. São
5Μ também providas células hospedeiras contendo ou compreendendo qualquer um dos vetores notados acima (incluindo, por exemplo, células hospedeiras de origem humana, macacos, cães, rato ou camundongo).
Dentro de outros aspectos da presente invenção, processos de produção de proteínas-ligantes beta-TGF são providos, compreendendo a etapa de cultura de célula hospedeira mencionada anteriormente contendo vetor sob condições e por um tempo suficiente para produzir a proteína-ligante beta-TGF. Ainda dentro de realizações, a proteína produzida através deste processo pode ser ainda purificada (por exemplo, por cromatografia de coluna, purificação de afinidade, e semelhantes). Portanto, proteínas isoladas que são codificadas pelas moléculas de ácido nucléico notadas acima (por exemplo, seqüência ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, ou 16) podem ser facilmente produzidas dada a exposição do presente pedido de patente.
Também deve ser notado que as proteínas mencionadas anteriormente, ou seus fragmentos podem ser produzidas como proteínas de fusão. Por exemplo, dentro de um aspecto proteínas de fusão são providas compreendendo um primeiro segmento de polipeptídio compreendendo uma proteína-ligante beta-TGF codificada por uma molécula de ácido nucléico como descrito acima, ou uma sua porção de pelo menos 10, 20, 30, 50, ou 100 aminoácidos em comprimento, e um segundo segmento de polipeptídio compreendendo uma proteína-ligante não-beta-TGF. Dentro de certas realizações, o segunda polipeptídio pode ser um
Figure BRPI9915679B1_D0005
• -Í
Figure BRPI9915679B1_D0006
· • t ·*· rótulo apropriado para purificação ou reconhecimento (por exemplo, um polipeptídio compreendendo resíduos de aminoácidos aniônicos múltiplos - ver patente NorteAmericana 4.851.341), um marcador (por exemplo, proteína fluorescente verde, ou fosfatase alcalina), ou uma molécula tóxica (por exemplo, ricina).
Dentro de um outro aspecto da presente invenção, são providos anticorpos que são capazes de ligação específica da classe descrita acima de proteínas-ligantes beta-TGF (por exemplo, BEER humano). Dentro de várias realizações, o anticorpo pode ser um anticorpo policlonal (por exemplo, de origem humana ou murina) . Ainda dentro de realizações, o anticorpo é um fragmento de um anticorpo que retém as características de ligação de um anticorpo integral (por exemplo, um fragmento F(ab')2/ F(ab)2, Fab', Fab, ou Fv, ou mesmo um CDR) . São também providos hibridomas e outras células que são capazes de produzirem ou expressarem os anticorpos mencionados anteriormente.
Dentro de aspectos relacionados da invenção, são providos processos detectando uma proteína-ligante beta-TGF, compreendendo as etapas de incubação de um anticorpo como descrito acima sob condições e por um tempo suficientes para permitir que o dito anticorpo se ligue a uma proteínaligante beta-TGF, e detectando a ligação. Dentro de várias realizações o anticorpo pode ser ligado a um suporte sólido para facilitar lavagem ou separação, e/ou rotulado (por exemplo, com um marcador selecionado do grupo consistindo em enzimas, proteínas fluorescentes e radioisótopos).
Dentro de outros aspectos da presente invenção, oligonucleotídeos isolados são providos os quais hibridizam a uma molécula de ácido nucléico de acordo com seqüência ID NOs. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 18 ou o complemento para a mesma, sob condições de alta rigorosidade. Ainda dentro de realizações, o oligonucleotídeo pode ser encontrado na seqüência que codifica seqüência ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16. Dentro de certas realizações, o oligonucleotídeo é pelo menos 15, 20, 30, 50, ou 100 nucleotídeos em comprimento. Ainda dentro de realizações, o oligonucleotídeo é rotulado com uma outra molécula (por exemplo, uma enzima, molécula fluorescente, ou radioisótopo). São também providos primers que são capazes de amplificação específica de toda ou uma porção das moléculas de ácido nucléico que codificam proteínas-ligantes beta-TGF. Como aqui utilizado, o termo amplificando especificamente deve ser entendido referir-se a primers que amplificam as proteínas-ligantes beta-TGF mencionadas anteriormente, e não outras proteínas-ligantes beta-TGF tais como Dan, Cerberus, Gremlin ou SCGF (patente Norte-Americana 5.780.263).
Dentro de aspectos relacionados da presente invenção, são providos processos para deteção de uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína-ligante beta-TGF, compreendendo as etapas de incubação de um oligonucleotídeo como descrito acima sob condições de alta rigorosidade, e deteção de hibridização do dito oligonucleotídeo. Dentro de certas realizações, o
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oligonucleotídeo pode ser rotulado e/ou ligado a um suporte sólido.
Dentro de outros aspectos da presente invenção, ribozimas são providas as quais são capazes de clivar ARN que codifica uma das proteinas-ligantes beta-TGF mencionadas acima (por exemplo, seqüência ID Nos. 2, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16) . Tais ribozimas podem ser compostas por ADN, ARN (incluindo ácidos 2'-0-metil ribonucléicos), análogos de ácido nucléico (por exemplo, ácidos nucléicos tendo ligações fósforotioato) ou suas misturas. São também providas moléculas de ácido nucléico (por exemplo, ADN ou ADNc) que codificam estas ribozimas, e vetores que são capazes de expressar ou produzir as ribozimas. Exemplos representativos de vetores incluem plasmideos, retrotransposons, cosmideos, e vetores baseados-virais (por exemplo, vetores virais gerados pelo menos em parte de um retrovírus, adenovirus, ou, vírus associado-adeno). São também providas células hospedeiras (por exemplo, células humanas, de cão, rato ou camundongo) que contêm estes vetores. Em certas realizações, a célula hospedeira pode ser estavelmente transformada com o vetor.
Ainda dentro de aspectos da invenção, são providos processos para produção de ribozimas tanto sinteticamente, como através de transcrição in vitro ou in vivo. Ainda dentro de realizações, as ribozimas assim produzidas podem ser ainda purificadas e/ou formuladas em composições farmacêuticas (por exemplo, a ribozima ou molécula de ácido nucléico codificando a ribozima junto com um carreador ou
5£ diluente farmaceuticamente aceitável). Similarmente, os oligonucleotídeos anti-sentidos e anticorpos ou outras moléculas selecionadas aqui descritas podem ser formuladas em composições farmacêuticas.
Dentro de outros aspectos da presente invenção, oligonucleotídeos anti-sentido são providos compreendendo uma molécula de ácido nucléico que hibridiza a uma molécula de ácido nucléico de acordo com a seqüência ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, ou 15, o seu complemento, e onde o dito oligonucleotídeo inibe a expressão de proteína-ligante betaTGF como aqui descrita (por exemplo, BEER humano). Dentro de várias realizações, o oligonucleotídeo é de 15, 20, 25, 30, 35, 40ou 50 nucleotídeos em comprimento. Preferivelmente, o oligonucleotídeo é de menos que 100, 75 ou 60 nucleotídeos em comprimento. Como deve ser facilmente evidente, o oligonucleotídeo pode ser compreendido por um ou mais análogos de ácido nucléico, ácidos ribonucléicos, ou ácidos desoxirribonucléicos. Ainda, o oligonucleotídeo pode ser modificado através de uma ou mais ligações, incluindo por exemplo, ligação covalente tal como ligação fósforotioato, uma ligação fosfotriéster, uma ligação metil fosfonato, uma ligação metileno(metil imino), uma ligação morfolino, uma ligação amida, uma ligação poliamida, uma ligação interaçúcar alquila de cadeia curta, uma ligação inter-açúcar ciclo alquila, uma ligação inter-açúcar heteroatômica de cadeia curta, e uma ligação inter-açúcar heterocíclica. Um exemplo representativo de um oligonucleotídeo quimérico é provido na patente Norte-Americana 5.989.912.
Dentro de ainda outro aspecto da presente invenção, são providos processos para aumento de mineralização óssea, compreendendo introdução em um animal de sangue quente de uma quantidade efetiva da ribozima como descrita acima. Dentro de aspectos relacionados, tais processos compreendem a etapa de introdução em um paciente de uma quantidade efetiva da molécula de ácido nucléico ou vetor como aqui descrito que é capaz de produzir a desejada ribozima, sob condições favorecendo transcrição da molécula de ácido nucléico para produzir a ribozima.
Dentro de outros aspectos da invenção animais nãohumanos, transgênicos são providos. Dentro de uma realização um animal transgênico é provido cujas células germes e células somáticas contêm uma molécula de ácido nucléico codificando uma proteína-ligante beta-TGF como descrita acima que está operavelmente ligada a um promotor efetivo para a expressão do gene, o gene sendo introduzido no anima, ou um ancestral do animal, em um estágio embriogênico, com a condição de que o dito animal não é um humano. Dentro de outras realizações, animais finais transgênicos são providos, compreendendo um animal cujas células germe e células somáticas compreendem uma interrupção de pelo menos um alelo de uma molécula de ácido nucléico endógeno que hibridiza a uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína ligante-TGF como aqui descrita, onde a interrupção evita transcrição de ARN mensageiro a partir do dito alelo como comparado a um animal sem a interrupção, com a condição de que o animal não é um humano. Dentro de várias ·· 3· · . 3 : : :
GO realizações, a interrupção é uma supressão, substituição ou inserção de ácido nucléico. Dentro de outras realizações o animal transgênico é um camundongo, rato, ovelha, porco ou cão.
Dentro ainda de aspectos da invenção, são providos kits para a deteção de expressão de gene de proteína-ligante beta-TGF, compreendendo um recipiente que compreende uma molécula de ácido nucléico, onde a molécula de ácido nucléico é selecionada do grupo consistindo em (a) uma molécula de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotideos de SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, ou 15; (b) uma molécula de ácido nucléico compreendendo o complemento da seqüência de nucleotideos de (a); (c) uma molécula de ácido nucléico que é um fragmento de (a) ou (b) de pelo menos 15,20, 30, 50, 75, ou 100 nucleotideos em comprimento. São também providos kits para a deteção de uma proteina-ligante beta-TGF que compreende um recipiente que compreende um dos anticorpos de proteina-ligante beta-TGF aqui descritos.
Por exemplo, dentro de um aspecto da presente invenção são providos processos para determinação de se uma molécula selecionada é capaz de aumentar teor mineral ósseo, compreendendo as etapas de (a) mistura de uma ou mais moléculas candidatas com proteina-ligante-beta-TGF codificada pela molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1 e um membro selecionado da família beta-TGF de proteínas (por exemplo, BMP 5 ou 6), (b) determinando se a molécula candidata altera a sinalização do membro de
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família-beta-TGF, ou altera a ligação da proteína-ligante beta-TGF ao membro de família beta-TGF. Dentro de certas realizações, a molécula altera a habilidade de beta-TGF para funcionar como um regulador positivo de diferenciação de célula mesenquimal. Dentro deste aspecto da presente invenção, a molécula(s) candidata pode alterar sinalização ou ligação através de, por exemplo, tanto diminuição (por exemplo, inibição), como aumento (por exemplo, aperfeiçoamento) de sinalização ou ligação.
Ainda dentro de outro aspecto, são providos processos para determinação de se uma molécula selecionada é capaz de aumentar teor mineral ósseo, compreendendo a etapa de determinação de se uma molécula selecionada inibe a ligação de proteina-ligante beta-TGF a osso, ou um seu análogo. Exemplos representativos de osso ou seus análogos incluem hidróxi apatita e amostras de osso humano primário obtidas via biópsia.
Dentro de certas realizações dos processos recitados acima, a molécula selecionada está contida em uma mistura de moléculas e os processos ainda podem compreender a etapa de isolamento de uma ou mais moléculas que são funcionais dentro do ensaio. Ainda dentro de outras realizações, família beta-TGF de proteínas é ligada a um suporte sólido e a ligação de proteína-ligante beta-TGF é medida ou proteína-ligante beta-TGF é ligada a um suporte sólido e a ligação de proteínas beta-TGF são medidas.
Utilizando processos tais como aqueles descritos acima, uma ampla variedade de moléculas pode ser ensaiada / : 7: Γ: :* ·: Q V ; ; ». ·· . · · ·· v/otz para sua habilidade em aumentar teor mineral ósseo através de inibição de ligação da proteina-ligante beta-TGF à família beta-TGF de proteínas. Exemplos representativos de tais moléculas incluem proteínas ou peptídeos, moléculas orgânicas e moléculas de ácido nucléico.
Dentro de outros aspectos relacionados da invenção, são providos processos para aumento de teor mineral ósseo em uma animal de sangue quente, compreendendo a etapa de administração a um animal de sangue quente de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma molécula identificada a partir dos ensaios aqui recitados. Dentro de um outro aspecto, são providos processos para aumento de teor mineral ósseo em um animal de sangue quente, compreendendo a etapa de administração a um animal de sangue quente uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma molécula que inibe a ligação da proteina-ligante beta-TGF à super-família beta-TGF de proteínas, incluindo proteínas morfogênicas de osso (BMPs). Exemplos representativos de moléculas apropriadas incluem moléculas anti - sentido, ribozimas, genes ribozima, e anticorpos (por exemplo, um anticorpo humanizado) que reconhece especificamente e altera a atividade da proteina-ligante beta-TGF.
Dentro de um outro aspecto da presente invenção, são providos processos para aumento de teor mineral ósseo em um animal de sangue quente, compreendendo as etapas de (a) introdução nas células que são endereçadas para o osso um vetor que direciona a expressão de uma molécula que inibe a ligação da proteina-ligante beta-TGF à família beta-TGF de
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• · · · • · · · ·· ·· • · ·· ·· ··· ·· ··· · • · · · ! ·· ·· · · · proteínas e proteínas morfogênicas de osso (BMPs), e (b) administração de células contendo vetor a um animal de sangue quente. Como aqui utilizado, deve ser entendido que células endereçadas para osso se elas localizam-se dentro da matriz de osso após administração periférica. Dentro de uma realização, tais processos ainda compreendem, antes da etapa de introdução, isolamento de células a partir da medula de osso que é endereçada ao osso. Ainda dentro de uma realização, as células que endereçam para osso são selecionadas do grupo consistindo em células CD34+ e osteoblastos.
Dentro de outros aspectos da presente invenção, são providas moléculas (preferivelmente isoladas) que inibem a ligação da proteína-ligante beta-TGF à super família betaTGF de proteínas.
Ainda dentro de realizações, as moléculas podem ser providas como uma composição, e ainda podem compreender um inibidor de ressorção óssea. Exemplos representativos de tais inibidores incluem calcitonina, estrogênio, um bisfosfonato, um fator de crescimento tendo atividade antiressortiva e tamoxifen.
Exemplos representativos de moléculas que podem ser utilizadas nos contextos terapêuticos mencionados anteriormente incluem, por exemplo, ribozimas, genes ribozima, moléculas anti-sentido, e/ou anticorpos (por exemplo, anticorpos humanizados). Tais moléculas podem dependendo de sua seleção, ser usadas para alterar, antagonizar, ou agonizar a sinalização ou ligação de um * * *
V · · membro de família de proteína-ligante beta-TGF como aqui descrito.
Dentro de várias realizações da invenção, as moléculas e processos descritos acima de tratamento ou prevenção podem ser utilizados em condições tais como osteoporose, osteomalasia, doença periodontal, escorbuto, doença de Cushing, fratura óssea e condições devidas a imobilização de membro e utilização de esteróide.
Estes e outros aspectos da presente invenção tornar-se-ão evidentes com referência à seguinte descrição detalhada e desenhos apostos. Em adição, várias referências são aqui mostradas as quais descrevem em mais detalhes certos procedimentos ou composições (por exemplo,plasmídeos, etc) e são por isso aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 é uma ilustração esquemática comparando a seqüência de aminoácidos de Dan humana; Gremlin humana; Cerberus humana e Beer humano. Setas indicam a cadeia principal cisteína.
A Figura 2 resume os resultados obtidos de localização e delinação de uma variedade de tecidos humanos para a expressão de um gene proteína-ligante beta-TGF, especificamente, o gene Beer Humano. Um procedimento de Reação de Cadeia Polimerase-Transcrição Reversa (RT-PCR) semi-quantitativo foi usado para amplificar uma porção do gene a partir de ADNc de primeira-fita sintetizado de ARN total (descrito em mais detalhes em Exemplo 2A).
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A Figura 3 resume os resultados obtidos de hibridização in situ de ARN de seções de embrião de camundongo, usando-se uma sonda ARNc que é complementar ao transcrito Beer de camundongo (descrito em mais detalhes no
Exemplo 2B) . 0 painel A é uma seção transversa de 10.5 dpc embrião. O painel B é uma seção sagital de 12.5 dpc embrião e painéis C e D são seções sagitais de 15.5 dpc embrião.
A Figura 4 ilustra, através de análise western blot, a especificidade de três diferentes anticorpos policlonais para seus respectivos antigenos (descritos em mais detalhes no Exemplo 4). A Figura 4A mostra reatividade especifica de um anticorpo anti-Beer H. para antigeno Beer
H., mas não Dan H. ou Gremlin Η. A Figura 4B mostra reatividade de um anticorpo anti-Gremlin H. para antigeno
Gremlin H., mas não Beer H. ou Dan Η. A Figura 4C mostra reatividade de um anticorpo anti-Dan H. para Dan H., mas não
Beer H. ou Gremlin H.
A Figura 5 ilustra, através de análise western blot, a seletividade da proteina-ligante beta-TGF, Beer, para BMP-5 e BMP-6, mas não BMP-4 (descrita em mais detalhes no Exemplo 5).
A Figura 6 demonstra que a interação iônica entre a proteina-ligante beta-TGF, Beer, e BMP-5 tem uma constante de dissociação na faixa de 15-30nM.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições
Antes de mostrar a invenção em detalhes, pode ser valioso para seu entendimento mostrar definições de certos ££ termos e listar e definir as abreviações que serão usadas a seguir.
Molécula deve ser entendido incluir proteínas ou peptídeos (por exemplo, anticorpos, parceiros ligantes recombinantes, peptídeos com uma desejada afinidade ligante), ácidos nucléicos (por exemplo, ADN, ARN,moléculas de ácido nucléico quiméricas, e análogos de ácidos nucléicos tais como PNA); e compostos orgânicos ou inorgânicos.
beta-TGF deve ser entendido incluir qualquer membro conhecido ou novo da super-família beta-TGF, que também inclui proteínas morfogênicas de osso (BMPs).
receptor beta-TGF deve ser entendido referir-se ao receptor específico para um membro particular da superfamília beta-TGF (incluindo proteínas morfogênicas de osso (BMPs) ) .
proteína-ligante beta-TGF deve ser entendido referir-se a uma proteína com específica afinidade ligante para um particular membro ou subconjunto de membros da super-família beta-TGF (incluindo proteínas morfogênicas de osso (BMPs)). Exemplos específicos de proteínas-ligantes beta-TGF incluem proteínas codificadas por seqüência ID Nos. 1, 5, 7, 9, 11, 13, e 15.
Inibição de ligação da proteina-llgante beta-TGF à família beta-TGF de proteínas e proteínas morfogênicas de osso (BMPs) deve ser entendido referir-se a moléculas que permitem a ativação de proteínas beta-TGF ou morfogênicas de osso (BMPs) , ou permitem a ligação de membros da família beta-TGF incluindo proteínas morfogênicas de osso (BMPs) a
F! í μ μ iü o anticorpos monoclonais foram transferidas de cadeias variáveis pesadas e leves da imunoglobulina murina em um domínio variável humano.
Como aqui usado, um fragmento de anticorpo é uma porção de um anticorpo tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, e semelhantes. Independente da estrutura, um fragmento de anticorpo liga-se com o mesmo antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto. Por exemplo, um fragmento de anticorpo monoclonal proteína-ligante beta-TGF liga-se com io um epítopo de proteína-ligante beta-TGF.
O termo fragmento de anticorpo também inclui qualquer proteína sintética ou engenheirada geneticamente que atua como um anticorpo através de ligação a um antígeno específico para formar um complexo. Por exemplo, fragmentos de anticorpos incluem fragmentos isolados consistindo na região variável de cadeia leve, fragmentos Fv consistindo nas regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, moléculas de polipeptídeo de cadeia simples recombinante onde regiões variáveis leves e pesadas são conectadas por um ligador peptídeo (proteínas sFv), e unidades de reconhecimento mínimas consistindo nos resíduos de aminoácidos que imitam a região hiper-variável.
Um rótulo detectável é uma molécula ou átomo que pode ser conjugada a uma metade anticorpo para produzir uma molécula útil para diagnóstico. Exemplos de rótulos detectáveis incluem quelantes, agentes fotoativos, radioisótopos, agentes fluorescentes, íons paramagnéticos, enzimas e outras metades marcadoras.
io
Como aqui usado, um conjugado imuno é uma molécula compreendendo um anticorpo proteína-ligante antibeta-TGF, ou um fragmento de anticorpo, e um rótulo detectável. Um conjugado imuno tem grosseiramente a mesma, ou somente levemente reduzida, habilidade para ligar proteina-ligante beta-TGF após conjugação como antes conjugação.
Abreviações: TGF-beta - fator beta de crescimento transformante; TGF-bBP - proteína-ligante fator-beta de crescimento transformante (uma TGF-bBP representativa é designada H.Beer); BMP - proteína morfogênica de osso; PCR - reação de cadeia polimerase; RT-PCR - processo PCR onde ARN é primeiro transcrito em AND na primeira etapa usando transcriptase reversa (RT); ADNc - qualquer ADN obtido por cópia de uma seqüência de ARN em forma ADN.
Como notado acima, a presente invenção provê uma nova classe de proteínas-ligantes TGF-beta, assim como processos e composições para aumento de teor mineral ósseo em animais de sangue quente. Em resumo, as presentes invenções são baseadas na inesperada verificação de que uma mutação no gene que codifica um novo membro da família de proteína-ligante TGF-beta resulta em uma rara condição (scleroteosis) caracterizada por teores minerais ósseos que são um a quatro vezes maiores que em indivíduos normais. Assim, como discutido em mais detalhes abaixo esta descoberta conduziu ao desenvolvimento de ensaios que podem ser utilizados para selecionar moléculas que inibem a ligação da proteína-ligante TGF-beta à família TGF-beta de u
proteínas e proteínas morfogênicas de osso (BMPs), e processos de utilização de tais moléculas para aumento de teor mineral ósseo de animais de sangue quente (incluindo, por exemplo, humanos).
Discussão da Doença Conhecida Como Sclerosteosis
Sclerosteosis é um termo que foi aplicado por Hansen (1967)(Hansen, H.G., Sklerosteose.In: Opitz,H.;
Schmid, F., Handbuch der Kinderheilkunde. Berlin: Springer (pub.) 6 1967. Pp. 351-355) a uma desordem similar a hiperrostose corticalis generalizada de van Buchem mas possivelmente diferindo em aparência radiológica das alterações ósseas e na presença de sindactilia cutânea assimétrica dos dedos indicadores e médio em muitos casos.
Sclerosteosis é agora conhecida ser uma desordem semi-dominante autossômica que é caracterizada por lesões escleróticas amplamente disseminadas do osso no adulto. A condição é progressiva. Sclerosteosis também tem um aspecto desenvolvimental que é associada com sindactilia (dois ou mais dedos são fundidos juntos). A síndrome de sclerosteosis está associada com grande estatura e muitos indivíduos afetados obtêm uma altura de seis pés ou mais. O teor mineral ósseo de homozigotos pode ser 1 a 6 vezes acima de indivíduos normais e densidade mineral óssea pode ser 1 a 4 vezes acima de valores normais (por exemplo, a partir de irmãos não-afetados).
A síndrome de sclerosteosis ocorre primariamente em Afrikaaners de descendentes Holandeses na África do Sul. Aproximadamente 1/140 indivíduos na população Afrikaaner são · · · · * · · «
Figure BRPI9915679B1_D0009
··· ·· ··· · • · · · · • · · · · · · . : : ; ? ·· todas as outras partes do esqueleto existe uma generalizada e difusa esclerose. Áreas corticais dos ossos longos são grandemente espessadas resultando em um substancial aumento em resistência de osso. Conexões trabeculares são aumentadas em espessura o que por sua vez aumenta a resistência do osso trabecular. Ossos escleróticos aparecem incomumente opacos a raios-x.
Como descrito em mais detalhes no Exemplo 1, a rara mutação genética que é responsável pela síndrome
Sclerosteosis foi localizada na região de cromossoma 17 humano que codifica um novo membro da família de proteínaligante TGF-beta (um exemplo representativo da qual é designada H.Beer). Como descrito em mais detalhes abaixo, baseado nesta verificação, o mecanismo de mineralização óssea é mais inteiramente entendido, permitindo o desenvolvimento de ensaios para moléculas que aumentam mineralização óssea, e uso de tais moléculas para aumentar teor mineral ósseo, e em tratamento ou prevenção de um amplo número de doenças.
Super-Família TGF-beta
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A super-família fator-beta de crescimento transformante (TGF-beta) contem uma variedade de fatores de crescimento que compartilham elementos de seqüência comuns e motivos estruturais (em ambos níveis secundário e terciário). Esta família de proteína é conhecida exercer um amplo espectro de respostas biológicas sobre uma grande variedade de tipos de células. Muitas delas têm funções importantes durante o desenvolvimento embrional em formação estão ósseo ·» •4k
Í5 ϊ·. · ♦ · · · • ? · »····· · • · · ♦ · ♦ · · · ·· · ·· ·· · • · · · · · • · ·· ·· ··· de padrão e especificação de tecido; em adultos elas envolvidas, por exemplo, em cura de ferimento e reparo e remodelagem óssea, e na modulação do sistema imune. Em adição às três TGF-betas, a super-família inclui as 5 proteínas morfogênicas de osso (BMPs), activinas, inibinas, fatores de crescimento e diferenciação (DFs), e fatores neurotróficos derivados gliais (GDNFs). Classificação primária é estabelecida através de características de seqüência genérica que armazena uma específica proteína em 10 uma sub-família genérica. Adicional estratificação dentro da sub-família é possivelmente devida a conservação de seqüência mais estrita entre membros do menor grupo. Em certos exemplos,tais como com BMP-5, BMP-6 e BMP-7, esta pode ser tão alta como 75 porcento de homologia de 15 aminoácidos entre membros do menor grupo. Este nível de identidade permite uma simples seqüência representativa ilustrar os elementos bioquímicos chaves do subgrupo que separa a mesma de outros membros da família maior.
TGF-beta sinaliza através de indução de formação 20 de complexos hetero-oligoméricos de receptores tipo I e tipo
II. A estrutura cristal de TGF-beta2 foi determinada. A dobra genérica do monômero TGF-beta2 contem uma estrutura semelhante a laço de cisteína, compacta, estável, formada por três pontes dissulfeto. Dimerização, estabilizada por 25 uma ponte dissulfeto, é anti-paralela.
Membros da família TGF-beta iniciam sua ação celular através de ligação a receptores com intrínseca atividade serina/treonina cinase. Esta família de receptores : 1 j :‘5 «·’«·* ’·’ • · ·· ··* ·!· *,· ·,· $ e#· consiste em duas subfamílias, representadas receptores tipo I e tipo II. Cada membro da família TGF-beta liga-se a uma combinação característica de receptores tipo I e tipo II, ambos os quais são necessários para sinalização. No modelo atual para ativação de receptor TGF-beta, TGF-beta primeiro liga-se a receptor tipo II (TbR-II), que ocorre na membrana de célula em uma forma oligomérica com cinase ativada. A seguir, o receptor tipo I (TbR-1), que não pode ligar ligante na ausência de TbR-II, é recrutado no complexo. TbRío II então fosforila TbR-1 predominantemente em um domínio rico em resíduos glicina e serina (domínio GS) na região de juxtamembrana, e pelo que ativa TbR-I.
Assim sete receptores tipo I e cinco receptores tipo II foram identificados.
Proteínas Morfogênicas de Osso (BMPs) São Proteínas Reguladoras
Chaves Em Determinação de Densidade Mineral Óssea em Humanos
Um maior avanço no entendimento de formação de osso foi a identificação das proteínas morfogênicas de osso (BMPs), também conhecidas como proteínas osteogênicas (Ops), que regulam diferenciação de cartilagem e osso in vivo. BMPs/Ops induzem diferenciação óssea endocondral através de uma cascata de eventos que inclui formação de cartilagem, hipertrofia e calcificação da cartilagem, invasão vascular, diferenciação de osteoblastos, e formação de osso. Como descrito acima, as BMPs/Ops (BMP 2-14, e proteína osteogênica 1 e -2, OP-1 e OP-2) são membros da superfamília TGF-beta. A surpreendente conservação evolucionária entre membros de subfamília BMP/OP sugere que eles são
Ή críticos no desenvolvimento e função normais de animais. Além disso, a presença de múltiplas formas de BMPs/Ops elqva uma importante questão sobre a relevância biológica desta aparente redundância. Em adição a condrogênese e osteogênese pós-fetal, as BMPs/Ops desempenham múltiplos papéis em esqueletogênese (incluindo o desenvolvimento de tecidos craniofaciais e dentais) e em desenvolvimento embríogênico e organogênese de órgãos parenquimatosos, incluindo o rim. É agora entendido que natureza baseia-se em mecanismos moleculares comuns (e poucos) talhados para provimento de emergência de tecidos e órgãos especializados. A superfamília BMP/OP é um exemplo elegante de parcimônia de natureza em programação de múltiplas funções especializadas dispondo isoformas moleculares com menor variação em motivos de aminoácidos dentro de regiões carbóxi-terminal altamente conservadas.
Antagonismo BMP
As sub-famílias BMP e Activina são sujeitas a significante regulação pós-translacional. Existe um intrincado sistema de controle extracelular, pelo que um antagonista de alta afinidade é sintetizado e exportado, e subseqüentemente complexa seletivamente com BMPs ou activinas para interromper sua atividade biológica (W.C.Smith (1999) TIG 15(1)3-6). Um número destes antagonistas naturais foram identificados, e baseado em divergência de seqüência parecem ter evoluído independentemente devido à falta de conservação de seqüência primária. Não há trabalho estrutural até agora sobre esta
Figure BRPI9915679B1_D0011
classe de proteínas. Estudos destes antagonistas acentuaram uma distinta preferência para interação e neutralização de BMP-2 e BMP-4. Além disso, o mecanismo de inibição parece diferir para os diferentes antagonistas (S. Iemura et al.
(1998) Proc Natl Acad Sei USA 95 9337-9342).
Novas proteinas-ligantes TGF-beta
1. Antecedente re: proteinas-ligantes TGF-beta Como notado acima, a presente invenção provê uma nova classe de proteinas-ligantes TGF-beta que possuem um io palanque cisteína aproximadamente idêntico (dissulfeto) quando comparada a DAN humana, Gremlin humana e Cerberus humana, e SCGF (patente Norte-Americana 5.780.263) mas quase nenhuma homologia no nível de nucleotídeo (para informação antecedente, ver genericamente Hsu, D.R., Economides, A.N.,
Wang, X., Eimon, P.M., Harland, R.M., The Xenopus Dorsalizing Factor Gremlin Identifies a Novel Family of Secreted Proteins that antagonize BMP Activities, Molecular Cell 1:673-683, 1998).
Um exemplo representativo da nova classe de proteínas ligantes TGF-beta é mostrado em seqüência ID Nos. 1, 5, 9, 11, 13, e 15. Membros representativos desta classe de proteínas ligantes também devem ser entendidos incluírem variantes da proteína-ligante TGF-beta (por exemplo, seqüência ID Nos. 5 e 7) . Como aqui utilizado, um gene variante proteína-ligante TGF-beta refere-se a moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídio tendo uma seqüência de aminoácidos que é uma modificação de SEQ ID NOs: 2, 10, 12, 14 ou 16. Tais variantes incluem
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polimorfismos ocorrendo naturalmente ou variantes alélicas de genes de proteína-ligante TGF-beta, assim como genes sintéticos que contêm substituições de aminoácidos conservativas destas seqüências de aminoácidos. Formas variantes adicionais de um gene proteína-ligante TGF-beta são moléculas de ácido nucléico que contêm inserções ou supressões das seqüências de nucleotídeos ali descritas. Genes variantes de proteína-ligante TGF-beta podem ser identificados por determinação de se os genes hibridizam com uma molécula de ácido nucléico tendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 1, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15 sob condições rigorosas. Em adição, genes variantes de proteínaligante TGF-beta devem codificar uma proteína tendo uma cadeia principal cisteína.
Como uma alternativa, genes variantes proteínaligante TGF-beta podem ser identificados por comparação de seqüência. Como aqui usado, duas seqüências de aminoácidos têm 100% de identidade de seqüência de aminoácidos se os resíduos de aminoácidos das duas seqüências de aminoácidos são idênticas quando alinhadas para máxima correspondência. Similarmente, duas seqüências de nucleotídeos têm 100% de identidade de seqüência de nucleotídeos se os resíduos de nucleotídeos das duas seqüências de nucleotídeos são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima. Comparações de seqüência podem ser realizadas usando-se programas de software padrões tais como aqueles incluídos no conjunto de computação de bio-informática LASERGENE, que é produzido por DNASTAR (Madison, Wisconsin). Outros processos para comparação de duas seqüências de nucleotídeos ou aminoácidos através de determinação de ótimo alinhamento são bem conhecidos por aqueles versados na técnica(ver, por exemplo, Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al. (eds.), Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins in Methods in Gene Biotechnology, páginas 123-151 (CRC Press, Inc. 1997), e Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)).
Uma proteína-ligante TGF-beta variante deve ter pelo menos 50% de identidade de aminoácidos a SEQ ID Nos. 2, 6, 10, 12, 14 ou 16 e preferivelmente, maior que 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade. Alternativamente, variantes de proteína-ligante TGF-beta podem ser identificadas tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência de nucleotídeos a SEQ ID Nos: 1, 5, 9, 11,13 ou
15. Além disso, a presente invenção contempla variantes de gene de proteína-ligante TGF-beta tendo mais que 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% de identidade a SEQ ID NO:1.Independente do processo particular usado para identificar um gene variante proteína-ligante TGF-beta ou proteína-ligante TGF-beta variante, uma proteína-ligante TGF-beta variante ou um polipeptídio codificado por um gene de proteína-ligante TGFbeta variante pode ser funcionalmente caracterizado através de, por exemplo, sua habilidade em ligar e/ou inibir a sinalização de um membro selecionado da família TGF-beta de proteínas, ou através de sua habilidade para ligar ······ ··· ·· ··· · • · · · · J · ·· · · · · · especificamente a um antiçorpo de prote2ncê-l2gsm.te,.âÃ.tá-TG5Fbeta.
A presente invenção inclui fragmentos funcionais de genes de proteína-ligante TGF-beta. Dentro do contexto desta invenção, um fragmento funcional de um gene de proteína-ligante TGF-beta refere-se a uma molécula de ácido nucléico que codifica uma porção de um polipeptídio de proteína-ligante TGF-beta que tanto (1) possui a atividade função notada acima, como (2) liga-se especificamente com um ío anticorpo proteína-ligante anti-TGF-beta. Por exemplo, um fragmento funcional de um gene de proteína-ligante TGF-beta aqui descrito compreende uma porção da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID Nos: 1, 5, 9, 11, 13 ou 15.
2. Isolamento do gene de proteína-ligante TGF-beta
Moléculas de ADN codificando um gene de proteínaligante podem ser obtidas através de seleção de um ADNc humano ou biblioteca genômica usando sondas de polinucleotídeos baseadas em, por exemplo, SEQ ID N0:l.
Por exemplo, a primeira etapa na preparação de uma biblioteca de ADNc é isolar ARN usando-se processos bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Em geral, técnicas de isolamento de ARN têm de prover um processo para ruptura de células, um meio de inibir degradação direcionada-RNase de ARN,e um processo de separação de ARN de ADN, proteína e contaminantes polissacarídeos. Por exemplo, ARN total pode ser isolado através de congelamento de tecido em nitrogênio líquido, trituração de tecido congelado com um almofariz e pistilo para lisar as células, £2, | · · · ·· ·* ·* <>· extração de tecido triturado com : uma.’· .fedltt^ãó ..‘de fenol/clorofórmio para remoção de proteínas, e separação de ARN das impurezas restantes através de precipitação seletiva com cloreto de lítio (ver, por exemplo, Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, páginas 4-1 a 4-6 (John Wiley & Sons 1995) [Ausubel (1995)]; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, páginas 33-41 (CRC Press, Inc., 1997)[Wu(1997)]).
Alternativamente, ARN total pode ser isolado através de extração de tecido triturado com isotiocianato de guanidinium, extraindo com solventes orgânicos, e separando ARN de contaminantes usando centrifugação diferencial (ver, por exemplo, Ausubel (1995) nas páginas 4-a a 4-6; Wu (1997) nas páginas 33-41).
De modo a construir-se uma biblioteca de ADNc, poli (A) +ARN tem de ser isolado de uma preparação de ARN total. Poli (A) +ARN pode ser isolado de ARN total usando-se a técnica padrão de cromatografia de oligo(dT)-celulose (ver, por exemplo, Ausubel (1995) nas páginas 4-11 a 4-12).
Moléculas de ADNc de fita dupla são sintetizadas de poli(A) +ARN usando-se técnicas bem conhecidas (ver, por exemplo, Wu(1997) nas páginas 41-46). Além disso, kits comercialmente disponíveis podem ser usados para sintetizar moléculas de ADNc de fita dupla. Por exemplo, tais kits são disponíveis de Life Technologies, Inc. (Gaitherburg, Maryland), CLONTECH Laboratories, Inc. (Paio Alto, Califórnia), Promega Corporation (Madison, Wisconsin) e Stratagene Cloning Systems (LaJolla, Califórnia).
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* I ! ’ ! ί. ·· «* · · • ····· ···· ··
Α abordagem básica para obtertçãd dê ·ό1©-η’@*3*·ά& ADNc proteína-ligante TGF-beta pode ser modificada através de construção de uma biblioteca de ADNc subtraída que é enriquecida em moléculas ADNc específicas proteína-ligante TGF. Técnicas para construção de bibliotecas subtraídas são bem conhecidas por aqueles versados (ver, por exemplo, Sargent, Isolation of Diferentially Expressed Genes em Meth. Enzymol. 152:423, 1987, e Wu et al. (eds.), Construction and Screening of Subtracted and Complete Expression cDNA Libraries in Methods in Gene Biotechnology, páginas 29-65 (CRC Press, Inc. 1997)).
Vários vetores de clonagem são apropriados para a construção de uma biblioteca de ADNc. Por exemplo, uma biblioteca de ADNc pode ser preparada em um vetor derivado de bacteriófago, tal como um vetor ÀgtlO (ver, por exemplo, Huynh et al., Constructing and Screening cDNA Libraries em XgtlO e Xgtll in DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glover (ed.), página 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) nas páginas 47-52).
Alternativamente, moléculas de ADNc de fita dupla podem ser inseridas em um vetor plasmídeo, tal como um vetor pBluescript (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, Califórnia), um LambdaGEM-4 (Promega Corp.; Madison, Wisconsin) ou outros vetores comercialmente disponíveis. Vetores de clonagem apropriados também podem ser obtidos de American Type Culture Collection (Rockville, Maryland).
De modo a amplificar-se as moléculas de ADNc clonadas, a biblioteca de ADNc é inserida em um hospedeiro £4
Figure BRPI9915679B1_D0014
Figure BRPI9915679B1_D0015
procariótico, usando-se técnicas padrdesí »Fo«* ·®·χβ&ρ1ό, «tuna biblioteca de ADNc pode ser introduzida em células DH5 de E.coli competentes, que podem ser obtidas de Life Technologies, Inc., (Gaithersburg, Maryland).
Uma biblioteca de ADN genômico humano pode ser preparada por meios bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ausubel (1995) nas páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) nas páginas 307-327). ADN genômico pode ser isolado por lise de tecido com o detergente Sarkosyl, digerindo o lisato com proteinase K, limpando debris insolúveis do lisato por centrifugação, precipitando ácido nucléico do lisato usandose isopropanol, e purificando ADN re-suspenso sobre um gradiente de densidade de cloreto de césio.
Fragmentos de ADN que são apropriados para a produção de uma biblioteca genômica podem ser obtidos pelo cisalhamento randômico de ADN genômico ou através de digestão parcial de ADN genômico com endonucleases de restrição. Fragmentos de ADN genômico podem ser inseridos em um vetor, tal como um bacteriófago ou vetor cosmídeo, de acordo com técnicas convencionais, tal como o uso de digestão com enzima de restrição para prover terminais apropriados, o uso de tratamento com fosfatase alcalina para evitar indesejável ligação de moléculas de ADN, e ligação com ligases apropriadas. Técnicas para tal manipulação são bem conhecidas (ver, por exemplo, Ausubel (1995) nas páginas 5-1 a 5-6; Wu(1997) nas páginas 307-327).
Moléculas de ácido nucléico que codificam um gene de proteína-ligante TGF-beta também podem ser obtidas • · · · · (•Pcà) · • « · · · ·· ·· · · · · · | · · · •cbia*-prÍHpêrs usando-se a reação de cadeia polimeráse oligonucleotídeos tendo seqüências de nucleotídeos que são baseadas nas seqüências de nucleotídeos do gene proteínaligante TGF-beta humano, como aqui descrito. Processos genéricos para seleção de bibliotecas com PCR são providos, por exemplo, por Yu et al., Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries, em Methods in Molecular Biology, Vol. 15:PCR Protocols: Current Methods and
Applications, White (ed.), páginas 211-215 (Humana Press, Inc. 1993). Além disso, técnicas para uso de PCR para isolar genes relacionados são descritas por exemplo, em Preston, Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications , White(ed.), páginas 317337 (Humana Press, Inc. 1993).
Alternativamente, bibliotecas genômicas humanas podem ser obtidas de fontes comerciais tais como Research Genetics (Huntsville, AL) o American Type Culture Collection (Rockville, Maryland).
Uma biblioteca contendo ADNc ou clones genômicos pode ser selecionada com uma ou mais sondas polinucleotídeos baseadas em SEQ ID N0:l, usando-se processos padrões (ver, por exemplo, Ausubel (1995) nas páginas 6-1 a 6-11).
Anticorpos proteína-ligante anti-TGF-beta, produzidos como descrito abaixo, também podem ser usados para isolamento de seqüências de ADN que codificam genes de proteína-ligante TGF-beta a partir de bibliotecas de ADNc.
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Por exemplo, os anticorpos podem ser usados’ paru ’s*e’leçãef’ de bibliotecas de expressão de Xgtll, ou os anticorpos podem ser usados para seleção imuno seguindo seleção e tradução de hibrido (ver, por exemplo, Ausubel (1995) nas páginas 6-12 a
6-16; Margolis et al., Screening λ expression libraries with antibody and protein probes in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al.(eds.), páginas 1-14 (Oxford University Press 1995)).
A seqüência de um ADNc de proteína-ligante TGF10 beta ou fragmento genômico de proteína-ligante TGF-beta pode ser determinada usando-se processos padrões. Além disso, a identificação de fragmentos genômicos contendo um promotor de proteína-ligante TGF-beta ou elemento regulador pode ser obtida usando-se técnicas bem estabelecidas, tal como análise de supressão (ver, genericamente Ausubel (1995)).
Como uma alternativa, um gene de proteína-ligante
TGF-beta pode ser obtido através de síntese de moléculas de ADN priming mutuamente oligonucleotídeos longos e as seqüências de nucleotídeos aqui descritas (ver, por exemplo,
Ausubel (1995) nas páginas 8-8 a 8-9) . Técnicas estabelecidas usando-se a reação de cadeia polimerase proporcionam a habilidade para sintetizar moléculas de ADN de pelo menos duas quilobases em comprimento (Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131, 1993; Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266, 1993; Dillon et al., Use of the
Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White • ··· ·· ·· ·<······ ··· • <7 · · · · · ··
Jed.), páginas 263-268, (Humana :PrêssI ·· 'inc*.’·’:1993) ; Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299, 1995).
3. Produção de genes de proteina-ligante TGF-beta Moléculas de ácido nucléico codificando genes de proteina-ligante TGF-beta variantes podem ser obtidos através de seleção de vários ADNc ou bibliotecas genômicas com sondas polinucleotídeos tendo seqüências de nucleotídeos baseadas em SEQ ID N0:l, 5, 9, 11, 13 ou 15, usando-se procedimentos descritos acima. Variantes de gene de proteina-ligante TGF-beta também podem ser construídas sinteticamente. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico pode ser imaginada que codifique um polipeptídio tendo uma alteração de aminoácido conservativa, comparada com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID Nos;2, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16. Ou seja, variantes podem ser obtidas as quais contêm uma ou mais substituições de aminoácidos de SEQ ID Nos: 2,
6, 8, 10, 12, 14 ou 16, onde um alquil aminoácido é
substituto para um alquil aminoácido em uma seqüência de
aminoácidos de proteina-ligante TGF- -beta, um aminoácido
aromático é substituto para um aminoácido aromático em uma seqüência de aminoácidos de proteina-ligante TGF-beta, um aminoácido contendo enxofre é substituto para um aminoácido contendo enxofre em uma seqüência de aminoácidos de proteina-ligante TGF-beta, um aminoácido contendo hidróxi é substituto parra um aminoácido contendo hidróxi em uma seqüência de aminoácido de proteina-ligante TGF-beta, um aminoácido ácido é substituto para um aminoácido ácido em uma seqüência de aminoácido de proteina-ligante TGF-beta, um i i ·.······ · aminoácido básico é substituto para um amínõáóídô bá’si£o m uma seqüência de aminoácidos de proteína-ligante TGF-beta, ou um aminoácido monocarboxílico dibásico é substituto para um aminoácido monocarboxílico dibásico em uma seqüência de aminoácidos de proteína-ligante TGF-beta.
Entre os aminoácidos comuns, por exemplo, uma substituição de aminoácido conservativa é ilustrada por uma susbtituição entre aminoácidos dentro de cada um dos seguintes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (2) fenil alanina, tirosina e triptofano, (3) serina e treonina, (4) aspartato e glutamato, (5) glutamina e asparagina, e (6) lisina, arginina e histidina. Realizando tais substituições, é importante , onde possível, manter a cadeia cisteína esboçada na Figura 1.
Alterações de aminoácidos conservativas em um gene de proteína-ligante TGF-beta podem ser introduzidas através de substituição de nucleotídeos para os nucleotídeos recitados em SEQ ID NO: 1. Tais variantes aminoácidos conservativas podem ser obtidas, por exemplo, por mutagênese direcionada-oligonucleotídeo, mutagênese exploração-ligante, mutagênese usando a reação de cadeia polimerase, e semelhantes (ver Ausubel (1995) nas páginas 810 a 8-22; e McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)). A habilidade funcional de tais variantes pode ser determinada usando-se um processo padrão, tal como o ensaio aqui descrito. Alternativamente, um polipeptídio proteína-ligante TGF-beta pode ser '······ · · · · ··«· · ·· ·· * · · ·· ·· · · · · · ·· • V · ······· · identificado através da habilidade enriigat •és’pfedif*ídam’ênte anticorpos proteína-ligante anti-TGF-beta.
Análises de supressão de rotina de moléculas de ácido nucléico podem ser realizadas para obter-se 5 fragmentos funcionais de uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídio de proteína-ligante TGF-beta. Como uma ilustração, moléculas de ADN tendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1 podem ser digeridas com Bal31 nuclease para obter-se uma série de supressões aninhadas. Os 10 fragmentos são então inseridos em vetores de expressão em quadro de leitura próprio, e os polipeptídios expressos são isolados e testados para atividade, ou para a habilidade em ligar-se a anticorpos proteína-ligante anti-TGF-beta. Uma alternativa para digestão com exonuclease é usar mutagênese 15 direcionada-oligonucleotídeo para introdução de supressões ou códons de interrupção para especificar produção de um desejado fragmento. Alternativamente, particulares fragmentos de um gene proteína-ligante TGF-beta podem ser sintetizados usando-se a reação de cadeia polimerase.
Técnicas padrões para análise funcional de proteínas são descritas, por exemplo, em Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113, 1993; Content et al.,
Expression and Preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon in Biological 25 Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.),páginas 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, The EGF Receptor, in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al., (eds.) páginas (eds ·· «· · · • · • ·
S· · » » • · · • · ··
169-199 (Academic Press 1985); Coumailleãu’·et 81/, U·’ #iol. Chem. 270:29270, 1995; Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291, 1995; Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol.
50:1295, 1995; e Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1,
1996.
A presente invenção também, contempla fragmentos funcionais de um gene proteina-ligante TGF-beta que tem mudanças de aminoácidos conservativas.
O gene variante de proteina-ligante TGF-beta pode lo ser identificado nas bases de estrutura através de determinação de nivel de identiclade com seqüências de nucleotideos e aminoácidos de SEQ ID Nos: 1, 5, 9, 11, 13, ou, 15 e 2, 6, 10, 12, 14, ou 16, como discutido acima. Uma abordagem alternativa para identificação de um gene variante nas bases de estrutura é determinar se uma molécula de ácido nucléico codificando um potencial gene proteina-ligante TGFbeta variante pode hibridizar sob condições rigorosas para uma molécula de ácido nucléico tendo a seqüência de nucleotideos de SEQ ID Nos: 1, 5, 9, 11, 13, ou 15 ou uma sua porção de pelo menos 15 ou 20 nucleotideos em comprimento. Como uma ilustração de condições de hibridização rigorosas, uma molécula de ácido nucléico tendo uma seqüência de proteina-ligante TGF-beta variante pode ligar com um fragmento de uma molécula de ácido nucléico tendo uma seqüência de SEQ ID NO:1 em um tampão contendo,por exemplo, SxSSPE (lxSSPE=cloreto de sódio 180mM, fosfato de sódio lOmM, EDTA lmM (pH 7,7), 5x solução de Denhardt (lOOxDenhardt = albumina de soro bovino 2% (peso / volume), ··· ·· ··· · • · · · · ·· ·· · · · • · · · ·· » · · · · · • ·· » · · * I · · · «· ·· • ·
Ficoll 2% (peso/volume), poliviftil* ” p‘ir’fôl*id’ona * 2% (peso/volume) e SDS 0,5% incubada por toda a noite a 5560°C. Lavagens pós-hibridização em alta rigorosidade são tipicamente realizadas em 0,5xSSC (lxSSC = cloreto do sódio 5 150mM, citrato de tri-sódio 15mM) ou em 0,5xSSPE a 55-60°C.
Independente da particular seqüência de núcleotídeos de um gene de proteína-ligante TGF-beta variante, o gene codifica um polipeptídio que pode ser caracterizado por sua atividade funcional, ou pela habilidade para ligar 10 especificamente a um anticorpo proteína-ligante anti-TGFbeta. Mais especificamente, genes proteína-ligante TGF-beta variantes codificam polipeptídios que exibem pelo menos 50%, e preferivelmente, mais que 60, 70, 80 ou 90%, da atividade de polipeptídios codificados pelo gene de proteína-ligante 15 TGF-beta humano aqui descrito.
4. Produção de proteína-ligante TGF-beta em células cultivadas
Para expressão de um gene de proteína-ligante TGFbeta, uma molécula de ácido nucléico codificando o polipeptídio tem de ser operavelmente ligada a seqüências reguladoras que controlam expressão transcricional em um vetor de expressão e então introduzidas em uma célula hospedeira. Em adição a seqüências reguladoras transcricionais, tais como promotores e aperfeiçoadores, vetores de expressão podem incluir seqüências reguladoras translacionais e um gene marcador que é apropriado para seleção de células que transportam o vetor de expressão.
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Vetores de expressão que ’sãò *‘apropriados 'para produção de uma proteína estranha em células eucarióticas tipicamente contêm (1) elementos de ADN procariótico codificando uma origem de replicação bacterial e um marcador 5 de resistência a antibiótico para prover crescimento e seleção do vetor de expressão em um hospedeiro bacterial; (2) elementos de ADN eucariótico que controlam iniciação de transcrição, tal como um promotor, e (3) elementos de ADN que controlam o processamento de transcritos, tais como uma 10 seqüência de poliadenilação/término de transcrição.
Proteínas-ligantes TGF-beta da presente invenção são preferivelmente expressas em células de mamíferos. Exemplos de células hospedeiras de mamíferos incluem células de rim de macaco verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), 15 células de rim embriônico humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de rim de filhote de hamster (BHK-21; ATCC CRL 8544), células de rim canino (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovário de hamster chinês (CHO-K1; ATCC CCL61), células de pituitária de rato (GH1; ATCC CCL82), células HeLaS3 (ATCCC 20 CCL2.2), células de hepatoma de rato (H-4-II-E; ATCC CRL
1548); células de rim de macaco transformadas-SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) e células embriônicas murina (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).
Para um hospedeiro mamífero, os sinais reguladores 25 transcricionais e translacionais podem ser derivados de fontes virais, tais como adenovírus, vírus de papiloma bovino, vírus de símio, ou semelhantes,onde os sinais reguladores estão associados com um particular gene que tem ·* ··· <·· ··:
• · : ·,ί : ·.: <· . ·ϊ um alto nível de expressão. sêqüências*” reguladoras transcricionais e translacionais também podem ser obtidas de genes mamíferos, tais como genes actina, colágeno, miosina, e metalotioneína.
seqüências reguladoras transcricionais incluem uma região promotora suficiente para direcionar a iniciação de síntese de ARN.Promotores eucarióticos apropriados incluem o promotor do gene metalotioneína I de camundongo [Hamer et al., J.Molec. Appl. Genet. 1:273, 1982], o promotor TK de vírus Herpes [McKnight, Cell 31:355, 1982], o promotor inicial SV-40 [Benoist et al., Nature 290:304, 1981], o promotor vírus sarcoma de Rous [Gorman et al., Proc. Nat'l acad. Sei. USA 79:6777, 1982], o promotor citomegalovírus [Foecking et al., Gene 45:101, 1980], e promotor vírus de tumor mamário de camundongo (ver, genericamente, Etcheverry, Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture, in Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 163-181 (John Wiley & Sons,
Inc. 1996)).
Alternativamente, um promotor procariótico, tal como o promotor bacteriófago T3 ARN polimerase, pode ser usado para controlar expressão de gene de proteína-ligante TGF-beta em células de mamífero se o promotor procariótico é regulado por um promotor eucariótico (Zhou et al., Mol.
Cell. Biol. 10:4529, 1990; Kaufman et al., Nucl. Acids. Res. 19:4485, 1991).
Genes de proteína-ligante TGF-beta também podem ser expressos em células bacteriais, de levedura, de inseto
J « ·►** ·· ♦·* · · * ** ou plantas. Promotores apropriados que podem ser usados para expressão de polipeptídios proteína-ligante TGF-beta em um hospedeiro procariótico são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem promotores capazes de reconhecerem T4, T3, Sp6 e T7 polimerases, os promotores Pr e PL de bacteriófago lambda, os promotores trp, recA, choque térmico, lacUV5,tac, lpp-lacSpr, phoA e lacZ de E.coli, promotores de B.subtilis,os promotores dos bacteriófagos de Bacillus, promo9tores Streptomyces, o promotor int de bacteriófago lambda, o promotor bla de pBR322, e o promotor CAT do gene cloranfenicol acetil transferase. Promotores procarióticos foram revistos por Glick, J.Ind. Microbiol. 1:277, 1987, Watson et al., Molecular Biology of the Gene,
4th ed. (Benjamin Cummins 1987), e por Ausubel et al. (1995).
Hospedeiros procarióticos preferidos incluem E.coli e Bacillus subtilus. Linhagens apropriadas de E.coli incluem BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I,DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, 0M105, JM109, JM110, K38, RRI, Y1088,
Y1089, CSH18, ER1451, e ER1647 (ver, por exemplo, Brown (Ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Linhagens apropriadas de Bacillus subtilus incluem BR151, YB886, MI119,MI120 e B170 (ver, por exemplo, Hardy,
Bacillus Cloning Methods, in DNA Cloning: A Practical Approch, Glover (Ed.)(IRL Press 1985)).
Processos para expressão de proteínas em hospedeiros procarióticos são bem conhecidos por aqueles f « ·*· *· **· ·_ 5.5 . . ?. ·.· ·.· · ·.· versados na técnica (ver, por exemplo, Williams et al., Expression of foreign proteins in E.coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonalantibodies in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995); Ward et al., Genetic Manipulation and Expression of Antibodies em Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995); e Georgiou, Expression of proteins in Bactéria, in Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).
sistema de baculovírus provê um meio eficiente para introduzir genes proteína-ligante TGF-beta clonados em células de insetos. Vetores de expressão apropriados são baseados no vírus poliedrose nuclear múltipla Autographa californica (AcMNPV), e contem promotores bem conhecidos tais como promotor proteína de choque térmico (hsp) de Drosophila 70, promotor gene inicial - imediato vírus de poliedrose nuclear (ie-1) de Autographa californica e o promotor 39K inicial retardado, promotor plO baculovírus, e o promotor metalotioneína de Drosophila. Células hospedeiras de inseto apropriadas incluem linhas de células derivadas de IPLB-Sf-21, uma linha de célula ovariana pupal de Spodoptera frugiperda, tal como Sf9 (ATCC CRL 1711), SÍ21AE, e Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), assim como células Schneider-2 de Drosophila. Técnicas estabelecidas para produção de proteínas recombinantes em sistemas baculovírus são providas por Bailey et al., Manipulation of Baculovírus
Vectors em ··.: >.·: ΰ ή ?'. ·.7 ΰ ϊ ·ί *5 ’ · ί · ϊ · · • ί,;··.··» · · ··
Methods in Molecular Éiology, Volume 7:Gene
Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), páginas 147-168 (The Humana Press, Inc., 1991), por Patel et al., The baculovirus expression system in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al., (eds.),páginas 205-244 (Oxford University Press 1995), por Ausubel (1995) nas páginas 16-37 a 16-57, por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc., 1995), e por Lucknow, Insect Cell Expression Technology in Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al., (eds.), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996).
Promotores para expressão em levedura incluem promotores de GALl (galactose), PGK (fosfoglicerato cinase), ADH (álcool desidrogenase), AOX1 (álcool oxidase), HIS4 (histidino desidrogenase), e semelhantes. Muitos vetores de clonagem de levedura foram desenhados e são facilmente disponíveis. Estes vetores incluem vetores baseados em Yip, tais como vetores Yip5, YRp, tais como YRpl7, vetores Yep tais como Yepl3 e vetores YCp tal como YCpl9. Aquele versado na técnica apreciará que existe uma ampla variedade de vetores apropriados para expressão em células de levedura.
Vetores de expressão também podem ser introduzidos em protoplastos de plantas, tecidos de plantas intactos, ou células de plantas isoladas. Processos genéricos de cultura de tecidos de planta são providos, por exemplo, por Miki et al., Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants,
Μ • · · · · células hospedeiras vetor de expressão em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,
Glicket al. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993).
Um vetor de expressão pode ser introduzido em células hospedeiras usando-se uma variedade de técnicas 5 padrões incluindo transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada com lipossoma, liberação mediada com microprojétil, eletroporação, e semelhantes. Preferivelmente, as células transfectadas são selecionadas e propagadas para provimento de recombinantes que compreendem o estavelmente integrado no genoma hospedeiro. Técnicas para introdução de vetores e células eucarióticas e técnicas para seleção de tais transformantes estáveis usando-se um marcador selecionável dominante são descritas, por exemplo, por Ausubel (1995) e por Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991). Processos para introdução de vetores de expressão em células bacteriais, de levedura, de inseto, e planta também são providos por Ausubel (1995).
Processos genéricos para expressão e recuperação de proteína estranha produzida por um sistema de células de mamífero são providos através de, por exemplo, Etcheverry, Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture em Protein Engineering: Principies and Practice,
Cleland et al. (eds.),páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Técnicas padrões para recuperação de proteína produzida por um sistema bacteríal são providas por exemplo, em Grisshammeret al., Purification of over-produced proteins
9g * * * *Tvi from E.coli cells em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2 Edition, Glover et al. (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995). Processos estabelecidos para isolamento de proteínas recombinantes a partir de um sistema de baculovírus são descritos por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc., 1995).
Figure BRPI9915679B1_D0017
Mais genericamente, proteína-ligante TGF-beta pode ser isolada através de técnicas padrões, tais como ío cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca de íons, HPLC e semelhantes. Adicionais variações em isolamento e purificação de proteína-ligante TGF-beta podem ser criadas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, anticorpos proteína15 ligante anti-TGF-beta, obtidos como descrito abaixo, podem ser usados para isolar grandes quantidades de proteína por purificação de imunoafinidade.
5. Produção de anticorpos para proteínasligantes TGF-beta
Anticorpos para proteína-ligante TGF-beta podem ser obtidos, por exemplo, usando-se o produto de um vetor de expressão como um antígeno. Anticorpos proteína-ligante anti-TGF-beta particularmente úteis ligam-se especificamente com proteína-ligante TGF-beta de seqüência ID Nos.
2, 6, 10, 12, 14, ou 16, mas não a outras proteínas-ligantes
TGF-beta tais como Dan, Cerberus, SCGF, ou Gremlin. Anticorpos da presente invenção (incluindo seus fragmentos e derivados) podem ser policlonais ou, especialmente um
Figure BRPI9915679B1_D0018
·· · · · · ··· ·· ··· · ίί !?!····· · ··· • · ·«········ ··· ·· · ····· ···· ·· • · · ······» · • · ·· ·· ··· · · * anticorpo monoclonal. 0 anticorpo pode pertencer a qualquer classe de imunoglobulina, e pode ser, por exemplo, uma IgG, por exemplo, anticorpo IgGi, IgG2, lgG3, IgG4; igE; IgM; ou IgA. Ele pode ser de origem animal, por exemplo, mamífero, ou pode ser, por exemplo, um anticorpo murina, rato, humano ou outro primata. Onde desejado o anticorpo pode ser g.m anticorpo internalizante.
Anticorpos policlonais para proteína-ligante TGFbeta recombinante podem ser preparados usando-se processos ío bem conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Green et al., Production of Polyclonal Antisera em Immunochemical Protocols (Manson, ed.), páginas 1-5 (Humana Press 1992); Williams et al., Expression of foreign proteins in E.coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies, em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.),página 15 (Oxford University Press 1995)). Embora anticorpos policlonais sejam tipicamente elevados em animais tais como ratos, camundongos, coelhos, cabras, ou ovelha, um anticorpo proteína-ligante anti-TGF-beta da presente invenção também pode ser derivado de um anticorpo de primata sub-humano. Técnicas genéricas para elevação de anticorpos diagnóstico e terapeuticamente úteis em babuínos podem ser encontradas, por exemplo, em Goldenburg et al., publicação de patente internacional No. WO 91/11465(1991), e, Losman et al., Int.
J. Câncer 46:310, 1990.
O anticorpo deve compreender pelo menos um domínio de região variável. O domínio de região variável pode ser de
Aoo
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Figure BRPI9915679B1_D0020
qualquer tamanho ou composição de aminoácido e genericamente compreenderá pelo menos uma seqüência de aminoácidos hipervariável responsável por ligação de antígeno embutido em uma seqüência esqueleto. Em termos gerais o domínio de região variável (V) pode ser qualquer arranjo apropriado de domínios variáveis de cadeia leve (VL) e/ou pesada (VH) de imunoglobulina. Assim, por exemplo, o domínio de região V pode ser monomérico e ser um domínio VH ou VL onde estes são capazes de independentemente ligarem antígeno com aceitável afinidade. Alternativamente, o domínio de região V pode ser dimérico e conter VH-VH, VH-VL, ou VL-VL, dímeros onde as cadeias VH e VL estão não-covalentemente associadas (daqui por diante abreviadas como Fv) . Onde desejado, entretanto, as cadeias podem ser covalentemente acopladas tanto diretamente, por exemplo, via uma ligação dissulfeto entre os dois domínios variáveis, ou através de um ligador, por exemplo, um ligador peptídeo, para formar um domínio de cadeia simples (daqui por diante abreviado como scFv) .
O domínio de região variável pode ser qualquer domínio variável ocorrendo naturalmente ou uma sua versão engenheirada. Por versão engenheirada é pretendido um domínio de região variável que foi criado usando-se técnicas de engenharia de ADN recombinante. Tais versões engenheiradas incluem aquelas criadas, por exemplo, de regiões variáveis de anticorpo natural através de inserções, supressões ou alterações nas ou para as seqüências de aminoácidos dos anticorpos naturais. Exemplos particulares deste tipo incluem aqueles domínio de região variável :·· .·· ··: .·. JjDÍL um CDR e opcionalmente um partir de um anticorpo o o variável a partir de um engenheirados contendo pelo menos ou mais aminoácidos de armadura a restante do domínio de região segundo anticorpo.
O domínio de região variável pode ser covalentemente ligado em um aminoácido C-terminal a pelo menos um outro domínio de anticorpo ou um seu fragmento. Assim, por exemplo, onde um domínio VH está presente no domínio de região variável este pode estar ligado a um domínio CH1 imunoglobulina ou um seu fragmento. Similarmente um domínio VL pode estar ligado a um domínio Ck ou um seu fragmento. Desta maneira, por exemplo, o anticorpo pode ser um fragmento Fab onde o domínio ligante antígeno contem domínios VH e VL associados covalentemente ligados em seus terminais-C a um domínio CHI e CK, respectivamente. O domínio CHI pode ser ainda estendido com aminoácidos, por exemplo, para provimento de um domínio de região articulação como encontrado em um fragmento Fab', ou para prover ainda domínios, tal como anticorpo CH2 e domínios CH3.
Uma outra forma de um fragmento de anticorpo é um peptídeo codificando uma região determinante de complementaridade (CDR). peptídeos CDR (unidades de reconhecimento mínimo) podem ser obtidos através de construção de genes codificando a CDR de um anticorpo de interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, através do uso de reação de cadeia polimerase para sintetizar a região variável a partir de ARN de células produzindo anticorpos (ver, por exemplo, Larrick et al.,
Methods: A
Figure BRPI9915679B1_D0021
Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; CourtenayLuck, Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies, em Monoclonal Antibodies: Production , Engineering and Clinicai Application, Ritter et al., (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995); e Ward et al., Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, em Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch et al., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).
Anticorpos para uso na invenção podem ser em geral monoclonais (preparados através de processos convencionais de imunização e fusão de célula) ou no caso de fragmentos, derivados dos mesmos usando-se quaisquer técnicas químicas padrões, por exemplo, redução ou divagem enzimática e/ou digestão, por exemplo, através de tratamento com pepsina.
Mais especificamente, anticorpos proteína-ligante anti-TGF-beta monoclonais, podem ser gerados utilizando-se uma variedade de técnicas. Anticorpos monoclonais de roedores para antígenos específicos podem ser obtidos através de processos conhecidos por aqueles versados na técnica(ver, por exemplo, Kohler et al., Nature 256:495, 1975; e Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991)[Coliga]; Picksley et al., Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)).
Em resumo, anticorpos monoclonais podem ser obtidos através de injeção de camundongos com uma composição
Figure BRPI9915679B1_D0022
• * ·« *· ·'»· · ” · ,» compreendendo um produto gene de proteína-ligante TGF-beta, verificando-se a presença de produção de anticorpos através de remoção de uma amostra de soro, removendo o baço para obter-se linfócitos-B , fundindo os linfócitos-B com células mieloma para produção de hibridomas, clonando os hibridomas, selecionando clones positivos que produzem anticorpos para o antígeno, cultivando os clones que produzem anticorpos para o antígeno, e isolando os anticorpos das culturas de hibridoma.
Em adição, um anticorpo de proteína-ligante antiTGF-beta da presente invenção pode ser derivado de um anticorpo monoclonal humano. Anticorpos monoclonais humanos são obtidos de camundongo transgênico que foi engenheirado para produzir anticorpos humanos específicos em resposta a desafio antigênico. Nesta técnica, elementos do locus de cadeia leve e pesada humana são introduzidos em linhagens de camundongos derivadas de linhas de células tronco embriônicas que contêm interrupções alvejadas dos loci de cadeia leve e cadeia pesada endógenos. 0 camundongo transgênico pode sintetizar anticorpos humanos específicos para antígenos humanos, e o camundongo pode ser usado para produzir hibridomas secretando-anticorpo humano. Processos para obtenção de anticorpos humanos a partir de camundongo transgênico são descritos, por exemplo, por Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et 1., Nature 368:856, 1994; e Taylor et al., Int.lmmun. 6:579,1994.
Anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados a partir das culturas de hibridoma através de
Figure BRPI9915679B1_D0023
uma variedade de técnicas bem estabelecidas.Tais técnicas de isolamento incluem cromatografia de afinidade com Protein-A Sepharose, cromatografia de exclusão-tamanho, e cromatografia troca-íon (ver, por exemplo, Coligan nas páginas 2.7.1-2.7.12 e páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al.,Purification of Immunoglobulin G (IgG),in Methode in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)).
Para usos particulares, pode ser desejável preparar-se fragmentos de anticorpos de proteína-ligante anti-TGF-beta. Tais fragmentos de anticorpos podem ser obtidos, por exemplo, através de hidrólise proteolítica do anticorpo. Fragmentos de anticorpos podem ser obtidos através de digestão com pepsina ou papaína de anticorpos integrais através de processos convencionais. Como uma ilustração, fragmentos de anticorpos podem ser produzidos através de divagem enzimática de anticorpos com pepsina para prover um fragmento 5S representado F(ab')2. Este fragmento pode ser ainda clivado usando-se um agente redutor tiol para produzir fragmentos monovalentes Fab' 3.5S. Opcionalmente, a reação de divagem pode ser realizada usando-se um grupo de bloqueio para os grupos sulfidrila que resultam da divagem de ligações dissulfeto. Como um alternativa, uma divagem enzimática usando pepsina produz dois fragmentos Fab monovalentes e um fragmento Fc diretamente. Estes processos são descritos, por exemplo, por Goldenbrg, patente Norte-Americana 4.331.647, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230, 1960, Porter, Biochem.
h£>5
J.73:119, 1959, Edelman et al., enr JKnjzyirtólogy 1:422 (Academic Press 1967), e por Coligan em páginas 2.8.12.8.10 e 2.10.-2.10.4.
Outros processos de clivagem de anticorpos, tais como separação de cadeias pesadas para formar fragmentos de cadeia leve - pesada monovalente, ainda clivagem de fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas também podem ser usadas, tanto quanto os fragmentos ligam-se ao antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.
Alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo recombinante ou engenheirado obtido através do uso de técnicas de ADN recombinante envolvendo a manipulação e re-expressão de ADN codificando regiões constantes e/ou variáveis de anticorpo. Tal ADN & conhecido e/ou é facilmente disponível de bibliotecas de ADN incluindo, por exemplo, bibliotecas fago-anticorpo (ver Chiswell, DJ e McCafferty, J.Tibtech. 10 80-84(1992))ou onde desejado pode ser sintetizado. Procedimentos d química e/ou biologia molecular padrões podem ser usados para seqüenciar-se e manipular-se o ADN, por exemplo, para introdução de códons para criar-se resíduos cisteína, para modificar, adicionar ou suprimir outros aminoácidos ou domínios como desejado.
A partir daqui, um ou mais vetores de expressão replicáveis contendo o ADN podem ser preparados e usados para transformar uma apropriada linha de célula, por exemplo, uma linha de célula não-produtora de mieloma, tal como uma linha NSO de camundongo ou uma linha bacterial, por exemplo, E.coli, onde produção do :*an£i.íb£|>ç·. ofcfct?e^· De modo a obter-se eficiente transcrição e tradução, a seqüência de ADN em cada vetor deve incluir apropriadas seqüências reguladoras, particularmente uma seqüência promotor e líder operavelmente ligada à seqüência domínio variável. Processos particulares para produção de anticorpos desta maneira são genericamente bem conhecidos e rotineiramente usados. Por exemplo, procedimentos de biologia molecular básicos são descritos por Maniatis et al io (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1989); seqüenciamento de ADN pode ser realizado como descrito em Sanger et al (PNAS 74, 5463, (1977)) e o handbook de seqüenciamento Amersham International plc; e a mutagênese de sítio direcionado pode ser realizada de acordo com o processo de Kramer et al (Nucl. Acids. Res. 12, 9441, (1984)) e o handbook Anglian Biotechnology Ltd. Adicionalmente, existem numerosas publicações, detalhando técnicas apropriadas para a preparação de anticorpos através de manipulação de DNA, criação de vetores de expressão e transformação de células apropriadas, por exemplo, como revisto por Mountain A e Adair, JR em Biotechnology and Genetic Engineeríng Reviews (ed. Tombs, MP, 10, Chapter 1, 1992, Intercept, Andover, UK) e no pedido de patente WO91/09967.
Onde desejado, o anticorpo de acordo com a invenção pode ter uma ou mais moléculas efetoras ou repórter ligadas ao mesmo e a invenção estende-se a tais proteínas modificadas. As moléculas efetoras ou repórteres podem ser io# ·· · · · * ··· ·· ··· · ·········· · ··· ligadas ao anticorpo através de quâlqúej;· cíàçfei·? ‘J-:a;texál de aminoácido disponível, aminoácido terminal ou, onde presente grupo funcional carboidrato localizado no anticorpo, sempre contanto é claro que isto não afete adversamente as propriedades ligantes e eventual utilidade da molécula. Grupos funcionais particulares incluem, por exemplo, qualquer grupo livre amino, imino, tiol, hidroxila, carboxila ou aldeído. Ligação do anticorpo e a molécula(s) efetora e/ou repórter pode ser obtida via tais grupos e um grupo funcional apropriado nas moléculas efetoras ou repórteres. A ligação pode ser direta ou indireta, através de grupos de espaçamento ou de formação de ponte.
Moléculas efetoras incluem, por exemplo, agentes antineoplásticos, toxinas (tais como toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteríal ou de planta e seus fragmentos, por exemplo, ricina e seus fragmento) proteínas biologicamente ativas, por exemplo enzimas, ácidos nucléicos e seus fragmentos, por exemplo, DNA, RNA e seus fragmentos, polímeros ocorrendo naturalmente e sintéticos, por exemplo, polímeros polissacarídeos e polialquileno tais como poli (etileno glicol) e seus derivados, rádionuclidos, particularmente rádioiodeto e metais quelados. Grupos repórteres apropriados incluem metais quelados, compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados por espectroscopia NMR ou ESR.
Agentes antineoplásticos particulares incluem agentes citotóxicos e citostáticos, por exemplo, agentes alquilantes, tais como mostardas de nitrogênio (por exemplo,
ÁO?
I · · · ·· ·# ·β β· · · • · · · · ···· ·· chlorambucil, melphalan, mechlorethâmiíne·/ ••cyblVphôêphdmide, ou mostarda fosforamida, cisplatin;
uracila) e seus derivados, trietileno trietileno tíofosforamida, busulphan ou antimetabólitos, tais como methotrexate, fluorouracil, floxuridine, cytarabine, mercaptopurina, tioguanina, ácido flúor acético ou ácido flúor cítrico, antibióticos, tais como bleomycins (por exemplo, sulfato de bleomycin), doxorubicin, daunorubicin, mitomycins (por exemplo, mitomycin C) , actinomycins (por exemplo, dactinomycin), plicamycin, calichaemicin e seus derivados ou esperamicin e seus derivados; inibidores mitóticos, tais como etoposide, vincristine ou vinblastine e seus derivados; alcalóides, tais como ellipticine; polióis tais como taxicin-I ou taxivcin-II; hormônios, tais como androgenos (por exemplo, dromostanolone ou testolactone), progestins (por exemplo, acetato de megestrol ou acetato de medróxiprogesterone), estrogênios (por exemplo, dimetil stilbestrol difosfato, fosfato de poliestradiol ou fosfato de estramustine) ou antiestrogênios (por exemplo, tamoxifen); antraquinonas, tais como mitoxantrone, uréias, tais como hidróxiuréia; hidrazinas, tais como procarbazine; ou imidazóis, tais como dacarbazine.
Grupos efetores partícularmente úteis são calichaemicin e seus derivados (ver, por exemplo, patentes de África do Sul Nos. 85/8794,88/8127 e 90/2839).
Metais quelados incluem quelatos de metais di- ou tri-positivos tendo um número de coordenação de 2 a 8 inclusive. Exemplos particulares de tais metais incluem
103 í · · * *· 188Re, 58Co, 60' tecnécio (Tc) , rênio (Re), cobalto· (<?o)> ••ceforé •(Cju)y’ ouro (Au) , prata (Ag), chumbo (Pb), bismuto (Bi), índio (In), gálio (Ga),ítrio (Y), térbio (Tb), gadolínio (Gd), e escândio (Sc). Em geral o metal é preferivelmente um radionuclido. Radionuclidos particulares incluem 99mTc,
Pb, 206Bi,
99nirp^, IB^Rg 207bí,
CO, 67Cu, 195Au, 199Au, 110Ag, 203t 111In, 67Ga, 68Ga, 88Y, 90Y, 160Tb, 153Gd e 47Sc.
O metal quelado pode ser, por exemplo, um dos tipos acima de metal quelado com qualquer agente quelante polidentado apropriado, por exemplo, poliaminas acíclicas ou cíclicas, poliéteres(por exemplo, éteres corora e seus derivados);poliamidas; porfirinas; e derivados carboxílicos.
Em geral, o tipo de agente quelante dependerá do metal em uso. Um grupo particularmente útil de agentes quelantes em conjugados de acordo com a invenção, entretanto, são poliaminas acíclicas e cíclicas, especialmente ácidos poliamino carboxílicos, por exemplo, ácido dietileno triamino penta acético e seus derivados, e aminas macrocíclicas, por exemplo, derivados tri-aza e tetra -aza (por exemplo como descrito no pedido de patente internacional WO 92/22583); e poliamidas, especialmente desferrioxamina e seus derivados.
Assim, por exemplo, quando é desejado usar-se um grupo tiol no anticorpo como o ponto de ligação isto pode ser obtido através de reação com um grupo reativo tiol presente na molécula efetora ou repórter. Exemplos de tais grupos incluem um ácido ou éster halocarboxílico, por exemplo, iodoacetamida, uma imida, por exemplo, maleimida,
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- ί. Ο t t , f ♦ »· -- · ·
-- * ·„·»· · · » » ·' € » *·*(,··· + uma vinil sulfona, ou um dissúlfbtô.” &stes‘ 'e “outros procedimentos de ligação são genericamente e mais particularmente descritos nos pedidos de patentes WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/091195 e WO 89/01476.
5 Ensaios Para Seleção de Moléculas Que Aumentam Densidade Óssea
Como discutido acima, a presente invenção provê processos para seleção e/ou isolamento de compostos que são capazes de aumentar densidade óssea. Por exemplo, dentro de um aspecto da presente invenção são providos processos para determinação de se uma molécula selecionada é capaz de aumentar teor mineral ósseo, compreendendo as etapas de (a) mistura de uma molécula selecionada com proteína ligante beta-TGF e um membro selecionado da família TGF-beta de proteínas, (b) determinação de se as moléculas selecionadas estimulam sinalização pela família TGF-beta de proteínas, ou inibem a ligação da proteína ligante TGF-beta à família TGFbeta de proteínas. Dentro de certas realizações, a molécula aperfeiçoa a habilidade de TGF-beta para funcionar como um regulador positivo de diferenciação de célula mesenquimal.
Dentro de outros aspectos da invenção, são providos processos para determinação de se uma molécula selecionada é capaz de aumentar teor mineral ósseo, compreendendo as etapas de (a) exposição de uma molécula selecionada a células que expressam proteina-ligante TGF25 beta e (b) determinação de se a expressão (ou atividade) de proteina-ligante TGF-beta a partir das ditas células expostas diminui, e daí determinando se o composto é capaz de aumentar teor mineral ósseo. Dentro de uma realização, as
111
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células são selecionadas do grupo consistindo no osso humano normal não-transformado ou transformado espontaneamente de biópsias de osso e osteoblastos de osso paríetal de rato. Tais processos podem ser realizados em uma ampla variedade de formatos de ensaios, incluindo, por exemplo, imunoeletroforese contra-corrente (CIEP), ensaios radioimunes, precipitações radioimunes, ensaios imuno-sorventes ligadosenzima (ELISA) , ensaios Dot Blot, ensaios de Inibição ou Competição, e ensaios de sanduíche (ver patentes NorteAmericanas Nos.4.376.110 e 4.486.530; ver também Antibodies: A Laboratory Manual, supra).
Realizações representativas de tais ensaios são providas abaixo nos Exemplos 5 e 6. Em resumo, um membro de família da super-família TGF-beta ou uma proteína-ligante TGF-beta é primeiro ligado a uma fase sólida, seguida por adição de uma molécula candidata. 0 membro de família rotulado da super-família TGF-beta ou uma proteína-ligante TGF-beta é então adicionado ao ensaio, a fase sólida lavada, e a quantidade de membro de super-família TGF-beta ligado ou rotulado ou proteína-ligante TGF-beta sobre o suporte sólido determinada. Moléculas que são apropriadas para uso em aumento de teor mineral ósseo como aqui descrito são aquelas moléculas que diminuem a ligação de proteína-ligante TGFbeta a um membro ou membros da super-família TGF-beta em uma maneira estatisticamente significante. Obviamente, ensaios apropriados para uso dentro da presente invenção não devem ser limitados às realizações descritas dentro dos Exemplos 2 e 3. Em particular, numerosos parâmetros podem ser
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alterados, tal como através de ligação de TGF-beta a uma fase sólida, ou através de eliminação de uma fase sólida inteiramente.
Dentro de outros aspectos da invenção, são providos processos para determinação de se uma molécula selecionada é capaz de aumentar teor mineral ósseo, compreendendo as etapas de (a) exposição de uma molécula selecionada a células que expressam TGF-beta e (b) determinação de se a atividade de TGF-beta a partir das ditas células expostas é alterada, e daí determinando se o composto é capaz de aumentar teor mineral ósseo. Similar aos processos descritos acima, uma ampla variedade de processos pode ser utilizada para avaliar as mudanças de expressão de proteína-ligante TGF-beta devido a um composto teste selecionado.
Por exemplo, dentro de um aspecto da presente invenção, são providos processos para determinação de se uma molécula selecionada é capaz de aumentar teor mineral ósseo, compreendendo as etapas de (a) mistura de uma molécula selecionada com proteína-ligante TGF-beta e um membro selecionado da família TGF-beta de proteínas, (b) determinação de se a molécula selecionada regula ascendentemente a sinalização da família TGF-beta de proteínas, ou inibe a ligação da proteína-ligante TGF-beta à família TGF-beta de proteínas. Dentro de certas realizações, a molécula aperfeiçoa a habilidade de TGF-beta funcionar como um regulador positivo de diferenciação de célula mesenquimal.
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Similar aos processos descritos acima, uma ampla variedade de processos podem ser utilizados para avaliar estimulação de TGF-beta devido a um composto teste selecionado. Um tal processo representativo é provido abaixo no Exemplo 6 (ver também Durham et al., Endo 136:1374-1380).
Ainda dentro de outros aspectos da presente invenção, são providos processos para determinação de se uma molécula selecionada é capaz de aumentar teor mineral ósseo, compreendendo a etapa de determinação de se uma molécula selecionada inibe a ligação de proteína-ligante TGF-beta a osso, ou um seu análogo. Como utilizado aqui, deve ser entendido que osso ou seus análogos referem-se a hidróxiapatita, ou uma superfície composta por uma forma pulverizada de osso, osso triturado ou osso intacto. Similar aos processos descritos acima, uma ampla variedade de processos pode ser utilizada para avaliar a inibição de localização de proteína-ligante TGF-beta para matriz óssea. Um tal processo representativo é provido abaixo no Exemplo
7.
Deve ser notado que os processos aqui recitados podem se referir à análise de uma molécula teste individual, que a presente invenção não deve ser assim limitada. Em particular, a molécula selecionada pode estar contida dentro de uma mistura de compostos. Portanto, os processos recitados ainda podem compreender a etapa de isolamento de uma molécula que inibe a ligação de proteína-ligante TGFbeta a 'um membro da família TGF-beta.
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Moléculas Candidatas
Uma ampla variedade de moléculas pode ser ensaiada para sua habilidade em inibir a ligação de proteína-ligante TGF-beta a um membro de família TGF-beta. Exemplos representativos que são discutidos em mais detalhes abaixo incluem moléculas orgânicas, proteínas ou peptídeos, e moléculas de ácido nucléico. Embora deva ser evidente a partir da discussão abaixo que as moléculas candidatas aqui descritas podem ser utilizadas nos ensaios aqui descritos, também deve ser facilmente aparente que tais moléculas também podem ser utilizadas em uma variedade de combinações diagnósticos e terapêuticos.
1. Moléculas Orgânicas
Numerosas moléculas orgânicas podem ser ensaiadas para sua habilidade em inibir a ligação de proteína-ligante TGF-beta a um membro de família TGF-beta.
Por exemplo, dentro de uma realização da invenção moléculas orgânicas apropriadas podem ser selecionadas de tanto uma biblioteca química, onde compostos químicos são ensaiados individualmente, como de bibliotecas químicas combinatoriais onde múltiplos compostos são ensaiados de uma vez, então desenrolados para determinar e isolar os compostos mais ativos.
Exemplos representativos de tais bibliotecas químicas combinatoriais incluem aqueles descritos por Agrafiotis et al., System and method of automatically generating Chemical compounds with desired properties, Patente Norte-Americana N° 5.463.564; Armstrong, R.W.,
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Synthesis of combinatorial arrays of organic compounds through the use of multiple component combinatorial array syntheses, WO 95/02566; Baldwin, J.J. et al., Sulfonamide derivatives and their use, WO 95/24186; Baldwinr J.J. et al., Combinatorial dihydrobenzopiran library, WO 95/30642; Brenner, S., New kit for preparing combinatorial libraries, WO 95/16918; Chenera, B, et al., Preparation of library of resin-bound aromatic carbocyclic compounds, WO 95/16712; Ellman, J.A. Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support, Patente Norte-Americana N° 5.288.514; Felder, E. et al., Novel combinatorial compound libraries, WO 95/16209; Lerner, R. et al., Encoded combinatorial Chemical libraries, WO 93/20242; Pavia, M.R. et al., A method for preparing and selecting pharmaceutically useful non-peptide compounds from a structurally diverse universal library, WO 95/04266; Summerton, J.E. and D.D. Weller, Morpholinosubunit combinatorial library and method, Patente NorteAmericana N° 5.506.337; Holmes, C., Methods for the Solid Phase Synthesis of Thiazolidinones, Metathiazanones, and Derivatives thereof, WO 06/00248; Phillips, G.B. and G.P.Wei, Solid-phase Synthesis of Benzimidazoles, Tet.Letters 37:4887-90, 1996; Ruhland, B. et al., Solidsupported Combinatorial Synthesis of Structurally Diverse βLactams, J.Amer.Chem.Soc.111:253-4, 1996; Look, G.C. et al., The Identification of Cycloxygenase-1 Inhibitors from 4-Thiazolidinone Combinatorial Libraries, Bioorg and Med Chem.Letters 6:707-12, 1996.
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2. Proteínas e peptídeos
Uma ampla faixa de proteínas e peptídeos da mesma maneira podem ser utilizados como moléculas candidatas para inibidores da ligação de proteína-ligante TGF-beta a um membro de família TGF-beta.
a. Bibliotecas de peptídeos Combinatoriais
Moléculas de peptídeos que são inibidores putativos da ligação de proteína-ligante TGF-beta a um membro de família TGF-beta podem ser obtidas através da seleção de bibliotecas de peptídeo combinatoriais. Tais bibliotecas podem ser preparadas por alguém versado na técnica (ver, por exemplo, patentes Norte-Americanas 4.528.266 e 4.359.535, e WO 92/15679, WO 92/15677, WO 90/07862, WO 90/02809, ou adquiridas de fontes comercialmente disponíveis (por exemplo, New England Biolabs Ph.D Phage Display Peptide Library Kit).
b. Anticorpos
Anticorpos que inibem a ligação de proteínaligante TGF-beta a um membro de família TGF-beta podem ser facilmente preparados dada a exposição aqui provida. Dentro do contexto da presente invenção, anticorpos são entendidos incluírem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos anti-idiotípicos, fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, F(ab')2> regiões variáveis Fv, ou regiões determinantes de complementaridade). Como discuti acima, anticorpos são entendidos serem específicos contra proteínaligante TGF-beta, ou contra um membro de família TGF-beta específico, se eles ligam com uma Ka maior que ou igual a
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107M-1, preferivelmente maior que ou igual a 108M-1, e não ligam a outras proteínas-ligantes TGF-beta, ou, ligam com um Ka de menos que ou iguala 106M-1. Além disso, anticorpos da presente invenção devem bloquear ou inibir a ligação de proteina-ligante TGF-beta a um membro de família TGF-beta.
A afinidade de um anticorpo monoclonal ou parceiro ligante, assim como inibição de ligação podem ser facilmente determinadas por alguém versado na técnica (ver Scatchard, Ann. N.Y.Acad. Sci. 51:660-672, 1.949).
Em resumo, anticorpos policlonais podem ser facilmente gerados por alguém versado na técnica a partir de uma variedade de animais de sangue quente como cavalos, vacas, aves, coelhos,camundongos ou ratos). Tipicamente, a proteina-ligante TGF-beta ou seu único peptídeo de 13-20 aminoácidos (preferivelmente conjugada a hemocianina de lpa keyhol através de reticulação com glutaraldeído) é utilizada para imunizar o animal através de injeções intraperitoneal, intramuscular, intraocular, ou subcutânea, junto com um adjuvante tal como adjuvante completo ou incompleto de
Freund. Seguindo várias imunizações de reforço, amostras de soro são coletadas e testadas para reatividade para a proteína ou peptídeo. Anti-soros policlonais particularmente preferidos renderão um sinal em um destes ensaios que é pelo menos três vezes maior que o fundo. Uma vez o título do animal tenha atingido um plateau em termos de sua reatividade para a proteína, maiores quantidades de antisoros podem ser facilmente obtidas tanto por sangramentos semanais, como através de exsanguinamento do animal.
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Anticorpos monoclonais também podem ser facilmente gerados usando-se técnicas convencionais (ver patente NorteAmericana RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439 e 4.411.993 que são aqui incorporadas por referência; ver também Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.), 1980, e Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, que são aqui incorporadas por referência).
Em resumo, dentro de uma realização um animal objeto tal como um rato ou camundongo é imunizado com uma proteína-ligante TGF-beta ou sua porção como descrito acima. A proteína pode ser misturada com um adjuvante tal com, o adjuvante completo ou incompleto de Freund de modo a aumentar a resposta imuno resultante. Entre uma e três semanas após a imunização inicial o animal pode ser reimunizado com outra imunização de reforço, e testado para reatividade para a proteína utilizando ensaios descritos acima. Uma vez o animal tenha atingido um plateau em sua reatividade para a proteína injetada, ele é sacrificado, e órgãos que contêm grandes números de células B tais como o baço e nodos linfáticos são colhidos.
Células que são obtidas de animal imunizado podem ser imortalizadas através de infecção com um vírus tal como o vírus Epstein-Barr (EBV)(ver Glasky and Reading, Hybridoma 8(4):377-389, 1989). Alternativamente, dentro de uma realização preferida, as suspensões de células de nodo linfático e/ou baço colhidas são fundidas com uma célula
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mieloma apropriada de modo a criar um hibridoma que secreta anticorpo monoclonal. Linhas de mieloma apjropriadas incluem, por exemplo,NS-1 (ATCC No. TIB 18), e P3X63-Ag8.653 (ATCC No. CRL 1580).
Seguindo a fusão, as células podem ser colocadas em placas de cultura contendo um meio apropriado, tal como RPMI 1640, ou DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Médium)(JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), assim como ingredientes adicionais, tais como soro bovino fetal (FBS, isto é, de Hyclone, Logan, Utah, ou JRH Biosciences). Adicionalmente, o meio deve conter um reagente que permita seletivamente o crescimento de células mieloma e de baço fundidas tal como HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina)(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) . Após cerca de sete dias, as resultantes células fundidas ou hibridomas podem ser selecionadas de modo a determinar-se a presença de anticorpos que são reativos contra proteína-ligante TGF-beta (dependendo do antígeno usado) e que bloqueiam ou inibem a ligação de proteina-ligante TGF-beta a um membro da família
TGF-beta.
Uma ampla variedade de ensaios pode ser utilizada para determinar a presença de anticorpos que são reativos contra as proteínas da presente invenção, incluindo,por exemplo, imuno eletroforese em contra-corrente, ensaios radioimuno, precipitações radio imuno, ensaios imuno sorventes ligados enzima (ELISA), ensaios dot blot, western blots, imuno precipitação, ensaios de inibição ou competição, e ensaios de sanduíche (ver patentes Norte74
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permite alto nível de expressão de fragmentos de anticorpos monoclonais a partir de E.coli.
Similarmente, porções ou fragmentos, tais como fragmentos Fab e Fv, de anticorpos também podem ser construídos utilizando-se digestão enzimática convencional ou técnicas de ADN recombinante para incorporar as regiões variáveis de um gene que codifica um anticorpo ligando especificamente. Dentro de uma realização, os genes que codificam a região variável de um hibridoma produzindo um anticorpo monoclonal de interesse são amplificados usando-se primers nucleotídeos para a região variável. Estes primers podem ser sintetizados por alguém versado na técnica, ou podem ser adquiridos de fontes comercialmente disponíveis. Stratagene (La Jolla, Califórnia) vende primers para regiões variáveis de camundongo e humanas incluindo entre outros, primers para regiões VHa, VHbz VHcz VHd, VL e CL. estes primers podem ser utilizados para amplificar regiões variáveis de cadeia pesada ou leve, que então podem ser inseridas em vetores tais como ImmunoZap(H) ou ImmunoZap(L) (Stratagene), respectivamente. Estes vetores então podem ser introduzidos em sistemas baseados em mamífero, ou levedura, E.coli, para expressão. Utilizando-se estas técnicas, grandes quantidades de uma proteína de cadeia simples contendo uma fusão dos domínios VH e VL podem ser produzidas (ver Bird et al., Science 242:423-426, 1988). Em adição, tais técnicas podem ser utilizadas para alterar-se um anticorpo murina para um anticorpo humano, sem alteração de especificidade de ligação do anticorpo.
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Uma vez anticorpos apropriados tenham sido obtidos,.eles podem ser isolados ou purificados através de muitas técnicas bem conhecidas por aqueles versados (ver Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) . Técnicas apropriadas incluem colunas de afinidade de peptídeo ou proteína, HPLC ou RP-HPLC, purificação sobre colunas de proteína A ou proteína G, ou qualquer combinação destas técnicas.
c. Proteínas-ligantes TGF-beta mutantes
Como descrito aqui e abaixo nos Exemplos (por exemplo, Exemplos 8 e 9), versões alteradas de proteinaligante TGF-beta que competem com a habilidade de proteínaligante TGF-beta nativa para bloquear a atividade de um particular membro de família TGF-beta devem conduzir a aumentada densidade óssea. Assim, mutantes de proteínaligante TGF-beta que conduzem ao membro de família TGF-beta mas não inibem a função do membro de família TGF-beta podem satisfazer os critérios. As versões mutantes têm de competir efetivamente com as funções inibidoras endógenas de proteína-ligante TGF-beta.
d. Produção de proteínas
Embora vários genes (ou suas porções) tenham sido aqui providos, deve ser entendido que dentro do contexto da presente invenção, referência a um ou mais destes genes inclui derivados dos genes que são substancialmente similares aos genes (e, onde apropriado, as proteínas (incluindo peptídeos e polipeptídios) que são codificados « » ··· ·· ··· < · ♦· · · · · • · · υ· ·» · · ·· · · * ♦ · • » · · « ♦ · ·· ··♦ « · · ·
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pelos genes e seus derivados) . Como aqui usado, uma seqüência de nucleotídeos é julgada ser substancialmente similar se: (a) a seqüência de nucleotídeos é derivada da região codificante dos genes descritos acima e inclui, por exemplo, porções da seqüência ou variações alélicas das seqüências discutidas acima, ou alternativamente, codifica uma molécula que inibe a ligação de proteína-ligante TGFbeta a um membro da família TGF-beta, (b) a seqüência de nucleotídeos é capaz de hibridização para seqüências de nucleotídeos da presente invenção sob rigorosidade moderada, alta ou muito alta (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, NY, 1989) ; ou (c) as seqüências de ADN são degeneradas como um resultado do código genético para as seqüências de ADN definidas em (a) ou (b). Ainda, a molécula de ácido nucléico aqui mostrada inclui ambas seqüências complementares e não-complementares, contanto que as seqüências de outro modo satisfaçam os critérios aqui mostrados. Dentro do contexto da presente invenção, alta rigorosidade significa condições de hibridização padrões (por exemplo, 5XSSPE, SDS 0,5% a 65°C,ou equivalente).
A estrutura das proteínas codificadas pelas moléculas de ácido nucléico aqui descritas pode ser prevista a partir dos produtos de tradução primários usando-se a função de plotagem de hidrofobicidade de, por exemplo, P/C Gene ou Intelligenetics Suite (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia), ou de acordo com os processos descritos por Kyte and Doolittle (J.Mol.Biol. 157:105-132, 1982).
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Proteínas da presente invenção podem ser preparadas na forma de sais ácidos ou básicos, ou em forma neutra. Em adição, resíduos de aminoácidos individuais podem ser modificados por oxidação ou redução. Além disso, várias substituições, supressões ou adições podem ser feitas para as seqüências de aminoácido ou ácido nucléico,o efeito puro das quais é reter ou ainda aperfeiçoar ou diminuir a atividade biológica da proteína mutante ou tipo selvagem. Além disso, devido a degenerescência no código genético, por exemplo, pode existir considerável variação em seqüências de ácido nucléico codificando a mesma seqüência de aminoácido.
Outros derivados das proteínas aqui mostradas incluem conjugados das proteínas junto com outras proteínas ou polipeptídios. Isto pode ser realizado, por exemplo, através de síntese de proteínas de fusão N-terminal ou Ctermibal que podem ser adicionadas para facilitar purificação ou identificação de proteínas (ver patente Norte-Americana 4.851.341, ver também, Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988). Alternativamente, proteínas de fusão tais como proteína-ligante TGF-beta/Flag são construídas de modo a auxiliar na identificação, expressão e análise da proteína.
Proteínas da presente invenção podem ser construídas usando-se uma ampla variedade de técnicas aqui descritas. Ainda, mutações podem ser introduzidas em loci particulares através de oligonucleotídeos sintetizantes contendo uma seqüência mutante, flanqueada por sítios e restrição permitindo ligação a fragmentos da seqüência *»* · * ·»· <v • * ♦ • * « tf * • · v · ·* · »« • · · • A »· nativa. Seguindo ligação, a resultante reconstruída codifica um derivado tendo a desejada subtituição ou supressão de aminoácido.
Alternativamente, procedimentos de mutagênese específica - sítio (ou específica de segmento) direcionada oligonucleotídeo podem ser empregados para provimento de um gene alterado tendo códons particulares alterados de acordo com a substituição, supressão ou inserção requerida. Processos exemplares de obtenção das alterações mostradas acima são mostrados por Walder et al., (Gene 42:133, 1986);Bauer et al. (gene 37:73,1985); Craik (BioTechníques, janeiro de 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, 1981); e Sambrook et al. (supra). Derivados de supressão ou truncação de proteínas (por exemplo, uma porção extracelular solúvel) também podem ser construídos através da utilização de convenientes sítios endonuclease de restrição adjacentes à supressão desejada. Subseqüente a restrição, projeções podem ser enchidas em, e o ADN religado. Processos exemplares de obtenção das alterações mostradas acima são mostrados por Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Mutações que são feitas nas moléculas de ácido nucléico da presente invenção preferivelmente preservam o quadro de leitura das seqüências codificantes. Além disso, as mutações preferivelmente não criarão regiões complementares que possa hibridizar para produção de estruturas de ARNm secundárias, tais como laços ou grampo de seqüencia inserção, ~ » · «r* «· «
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Embora um sitio de mutação possa ser pré-determinado, não é necessário que a natureza da mutação per se seja prédeterminada. Por exemplo, de modo a selecionar-se para características ótimas de mutantes em um dado sítio, mutagênese randômica pode ser conduzida no códon alvo e os mutantes expressos selecionados para atividade biológica indicativa. Alternativamente, mutações podem ser introduzidas em loci particulares através de síntese de oligonucleotídeos contendo uma seqüência mutante, flanqueada por sítios de restrição permitindo ligação a fragmentos da seqüência nativa. Seguindo ligação, a seqüência reconstruída resultante codifica um derivado tendo a desejada inserção, substituição ou supressão de aminoácido.
Moléculas de ácido nucléico que codificam proteínas da presente invenção também podem ser construídas utilizando-se técnicas de mutagênese de PCR, mutagênese química (Drinkwater and Klinedinst, PNAS 83:3402-3406, 1986), por mis-incorporação de nucleotídeo forçada (por exemplo, Liao and Wise Gene 88:107-111, 1990), ou através do uso de oligonucleotídeos randomicamente mutagenizados (Horwitz et al., Genome3:112-117, 1989).
A presente invenção também provê a manipulação e expressão dos genes descritos acima através de cultura de células hospedeiras contendo um vetor capaz de expressar os genes descritos acima. Tais vetores ou construções vetores incluem moléculas de ácido nucléico derivadas - ADNc ou sintéticas codificando a deseja da proteína, que são ·· • r ' ·
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operavelmente ligados a apropriados elementos reguladores transcricionais ou translacionais. Elementos reguladores apropriados podem ser derivados de uma variedade de fontes, incluindo genes bacteriais, de fungos, virais, de mamífero, inseto ou planta. Seleção de elementos reguladores apropriados é dependente da célula hospedeira escolhida, e pode ser facilmente realizada por alguém versado na técnica. Exemplos de elementos reguladores incluem: um promotor e aperfeiçoador transcricional ou seqüência ligante RNA polimerase, um terminador transcricional, e uma seqüência ligante ribossomal, incluinçio um sinal de início de tradução.
Moléculas de ácido nucléico que codificam quaisquer das proteínas descritas acima podem ser facilmente expressas através de uma ampla variedade de células hospedeiras procarióticas e eucarióticas, incluindo células bacteriais, mamíferas, levedura ou outros fungos, virais, de insetos ou plantas. Processos para transformação ou transfecção de tais células para expressarem ADN estranho são bem conhecidos na técnica(ver, por exemplo, Itakura et al., Patente Norte-Americana N° 4.704.362; Hinnen et al., Proc.Natl.Acad.Sei. USA. 75:1929-1933. 1978; Murray et al., Patente Norte-Americana N° 4.801.542; Upshall et al., Patente Norte-Americana N° 4.935.349; Hagen et al., Patente Norte-Americana N°4.784.950; Axel et al,, Patente NorteAmericana N° 4.399.216; Goeddel et al., Patente NorteAmericana N° 4.766.075; e Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory
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Press, 1989; para células de planta ver Czako and Marton, Plant Physiol, 104:1067-1071, 1994; e Paszkowski et al., Biotech. 24:387-392, 1992).
Células hospedeiras bacteriais apropriadas para realização da presente invenção incluem E.coli, B.subtilis, Salmonella typhimurium, e várias espécies dentro dos gêneros Pseudomonas, Streptomyces, e Staphylococcus, assim como muitas outras espécies bacteriais bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Exemplos representativos de células hospedeiras bacteriais incluem DH5a (Stratagene, LaJolla, Califórnia).
Vetores de expressão bacterial preferivelmente compreendem um promotor que funciona na célula hospedeira, um ou mais marcadores fenotípicos selecionáveis, e uma origem bacterial de replicação. Promotores representativos incluem o sistema promotor beta-lactamase (penicilinase) e lactose (ver Chang et al., Nature 275:615, 1978), o promotor T7 RNA polimerase (Studier et al., Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990), o promotor lambda (Elvin et al., Gene 87:123-126, 1990), o promotor trp (Nichols and Yanofsky, Meth. In Enzymology 101:155,1983) e o promotor tac (Russell et al., Gene 20:231, 1982). Marcadores selecionáveis representativos incluem vários marcadores antibióticos tais como genes de resistência a canamicina ou ampicilina. Muitos plasmídeos apropriados para células hospedeiras transformantes são bem conhecidos na técnica, incluindo entre outros, pBR322 (ver Bolivar et al., Gene 2:95, 1977), os plasmídeos pUC, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 (ver Messing, Meth,. In Enzymology
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101:20-77, 1983 e Vieira and Messing, Gene 19:259-268, 1982), e pNH8A, pNH16a,pNH18a, e Bluescript M13 (Stratagene, LaJolla, Califórnia).
Células hospedeiras de levedura e fungos apropriadas pra realização da presente invenção incluem entre outras, Saccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, os gêneros Pichia ou Kluyveromyces e várias espécies do gênero Aspergillus (McKnight et al., patente Norte-Americana 4.935.349). Vetores de expressão apropriados para levedura e fungos incluem, entre outros, YCp50 (ATCC No. 37419) para levedura, e o vetor de clonagem amdS pV3 (Turnbull, Bio/Technology 7:169, 1989), YRp7(Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:1035-1039, 1978), Yepl3 (Broach et al., Gene 8:121-133, 1979), pJDB249 e pJDB219 (Beggs, Nature 275:104-108, 1978) e seus derivados.
Promotores preferidos para uso em levedura incluem promotores de genes glicoliticos de levedura (Hitzeman et al., J.Biol.Chem. 255:12073-12080, 1980; Alber and Kawasaki, J.Mol. Appl. Genet. 1:419-434, 1982) ou genes álcool desidrogenase (Young et al,, em Genetic engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al. (eds.), p. 355, Plenum, New York, 1982; Ammerer, Meth.Enzymol. 101:192201, 1983). Exemplos de promotores úteis para vetores de fungos são aqueles derivados de genes glicoliticos de Aspergillus nidulans, tal como o promotor adh3 (McKnight et al., EMBO J. 4:2093-2099, 1985). As unidades de expressão também podem incluir um terminador transcricional. Um
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130 exemplo de um terminador apropriado é o terminador adh3 (McKnight et al., ibid, 1985).
Como com vetores bacteriais, os vetores levedura genericamente incluirão um marcador selecionável, gue pode ser um de qualquer número de genes que exibam um fenótipo dominante para o qual exista um ensaio fenotípico para permitir que transformantes sejam selecionados. Marcadores selecionáveis preferidos são aqueles que complementam auxotrofia de célula hospedeira, proporcionam resistência a antibiótico ou permitem uma célula utilizar específicas fontes de carbono, e incluem leu2 (Broach et al., ibid), ura3 (Botstein et al., Gene 8:17, 1979), ou his3 (Struhl et al., ibid). Um outro marcador selecionável apropriado é o gene cat, que confere resistência a cloranfenicol sobre células de levedura.
Técnicas para transformação de fungos são bem conhecidas na literatura, e foram descritas, por exemplo, por Beggs (ibid), Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929-1933,1978), Yelton et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:1740-1747,1984), e Russell (Nature 301:167-169, 1983). 0 genótipo da célula hospedeira pode conter um defeito genético que é complementado pelo marcador selecionável presente sobre o vetor de expressão. Escolha de um hospedeiro particular e marcador selecionável está bem dentro do nível de conhecimento comum na técnica.
Protocolos para a transformação de levedura também são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, transformação pode ser facilmente realizada por
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13L preparação de esferoblastos de levedura com ADN (ver Hinnen et al., PNAS USA 75:1929, 1978) ou através de tratamento com sais alcalinos tais como LiCl (ver Itoh et al., J.Bacteriology 153:163, 1983). Transformação de fungos também pode ser realizada usando-se polietileno glicol como descrito por Cullen et al. (Bio/Technology 5:369,1987).
Vetores virais incluem aqueles que compreendem um promotor que direciona a expressão de uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a deseja proteína como descrito acima. Uma ampla variedade de promotores pode ser utilizada dentro do contexto da presente invenção, incluindo, por exemplo, promotores tais como MoMLV LTR, RSV LTR, Friend MuLV LTR, promotor adenoviral (Ohno et al., Science 265:781-784, 1994), promotor / aperfeiçoador neomicina fosfotransferase, promotor parvovírus Iate (Koering et al., Hum. Gene Therap. 5:457-463, 1994), promotor Herpes TK, promotor SV40, promotor/aperfeiçoador gene metalotioneína lia, promotor inicial imediato citomegavírus e o promotor late imediato citomegalovírus. Dentro de realizações particularmente preferidas da invenção, o promotor é um promotor específico-tecido (ver por exemplo, WO 91/02805; EP 0.415.731; e WO 90/07936). Exemplos representativos de promotores específicos de tecido apropriados incluem promotor enolase específico neural, promotor fator beta de crescimento derivado de plaqueta,promotor de proteína morfogênica de osso, promotor quimaerina-alfal humano, promotor sinapsina I e promotor sinapsina II. Em adição aos promotores notados acima,outros χ · · · * promotores específicos-virais (por exemplo, promotores retrovirais (incluindo aqueles notados acima, assim como outros tais como promotores HIV), promotores específicos hepatite, herpes(por exemplo, EBV), e bactéria, de fungo, ou parasítico (por exemplo, malarial) podem ser utilizados de modo a alvejar uma célula ou tecido específico que é infectado comum vírus, bactéria, fungo ou parasita.
Células mamíferas apropriadas para realização da presente invenção incluem, entre outras COS, CHO, SaOS, osteosarcomas, KS483, MG-63,osteoblastos primários, e estroma de medula óssea humana ou de mamífero. Vetores de expressão mamíferos para uso na realização da presente invenção incluirão um promotor capaz de direcionar a transcrição de um gene clonado ou ADNc. Promotores preferidos incluem promotores virais e promotores celulares. Promotores específicos de osso incluem a proteína-sialo osso e o promotor para osteocalcina. Promotores virais incluem o promotor inicial imediato citomegalovírus (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985), promotor posterior imediato citomegalovírus, promotor SV40 (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1:854-864, 1981), MMTV LTR, RSV LTR, metalotioneína-1, adenovírus Ela. Promotores celulares incluem o promotor metalotioneína-1 de camundongo (Palmiter et al., patente Norte-Americana 4.579.821), um promotor Vk de camundongo (Bergman et al., Proc. Natl. Acad. sCi. USA 81:7041-7045, 1983; Grant et al., Nucl. Acids Res. 15:5496, 1987) e um promotor VH de camundongo (Loh et al., Cell 33:85-93, 1983). A escolha de promotor dependerá, pelo menos em parte, do
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nível de expressão desejado, do nível de expressão desejado ou a linha de célula receptora a ser transfectada.
Tais vetores de expressão também podem conter um conjunto de sítios de união de ARN localizados à jusante do promotor e montante da seqüência de ADN codificando o peptídeo ou proteína de interesse. Sítios de união de ARN preferidos podem ser obtidos de adenovírus e/ou genes imunoglobulina. Também contido nos vetores de expressão está um sinal de poliadenilação localizado à jusante da seqüência codificante de interesse. Sinais de poliadenilação apropriados incluem os sinais de poliaenilação inicial e posterior de SV40 (Kaufman and Sharp, ibid),o sinal de poliadenilação de região 5 E1B de adenovírus e o terminador de gene de hormônio de crescimento humano (DeNoto et al., Nuc. Acids. Res. 9:3719-3730,1981). Os vetores de expressão podem incluir uma seqüência líder viral não-codificante, tal como o líder tripartite Adenovírus 2, localizada entre o promotor e os sítios de união de ARN. Vetores preferidos também podem incluir seqüências aperfeiçoadoras, tal como o aperfeiçoador SV40. Vetores de expressão também podem incluir seqüências codificando o adenovírus VA RNAs. Vetores de expressão apropriados podem ser obtidos de fontes comerciais (por exemplo, Stratagene, LaJolla, Califórnia).
Construções de vetores compreendendo seqüências de ADN podem ser introduzidas em células de mamífero cultivadas através de, por exemplo, transfecção mediada com fosfato de cálcio (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham and Van
134 der Erb, Virology 52:456, 1973), eletroporação (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), ou transfecção mediada com
DEAE-dextran (Ausubel et al.,(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987).
Para identificar células que têm estavelmente integrado o ADN clonado, um marcador selecionável é genericamente introduzido ns células junto com o gene ou ADNc de interesse. Marcadores selecionáveis preferidos para uso em células mamíferas cultivadas incluem genes que conferem resistência a drogas, tais como neomicina, higromicina e methotrexate. O marcador selecionável pode ser um marcador selecionável amplificável. Marcadores selecionáveis amplif icáveis preferidos são o gene DHFR e o gene de resistência a neomicina. Marcadores selecionáveis são revistos por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Massachusetts, que é aqui incorporado por referência).
Células mamíferas contendo um vetor apropriado são deixadas crescer por um período de tempo, tipicamente 1-2 dias, para início de expressão de seqüência (s) de ADN de interesse. Seleção de droga é então aplicada para selecionar para crescimento de células que estão expressando o marcador selecionável em uma forma estável. Para células que foram transfectadas com um marcador selecionável, amplificável, a concentração de droga pode ser aumentada em uma maneira em etapas para seleção para número de cópias aumentado das seqüências clonadas, pelo que aumentando níveis de expressão. Células expressando as seqüências introduzidas
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são selecionadas e separadas para produção da proteína de interesse na forma desejada ou no nível desejado. Células que satisfazem estes critérios então podem ser clonadas e escaladas para produção.
Protocolos para a transfecção de células mamíferas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Processos representativos incluem transfecção mediada com fosfato de cálcio, eletroporação, lipofecção, transfecção mediada com fusão de protoplasto e adenoviral, retroviral (ver Sambrook et al., supra). Construções de vetor nú também podem ser tomadas por células musculares ou outras células apropriadas subseqüente a injeção no músculo de um mamífero (ou outros animais).
Numerosas células hospedeiras de insetos conhecidas na técnica também podem ser úteis dentro da presente invenção, à luz da presente especificação. Por exemplo, o uso de baculovírus como vetores para expressão de seqüências de ADN heterólogas em células de insetos foi revisto por Atkinson et al. (Pestic. Sci. 28:215-224, 1990).
Numerosas células hospedeiras de plantas conhecidas na técnica também podem ser úteis dentro da presente invenção, à luz do presente relatório descritivo. Por exemplo, o uso de Agrobacterium rhizogenes como vetores pra expressão de genes em células de plantas foi revisto por Sinkar et al. (J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987).
Dentro de aspectos relacionados da presente invenção, proteínas da presente invenção podem ser expressas em um animal transgênico cujas células germe e células » ·*· ·* «·· ·
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somáticas contêm um gene que codifica a desejada proteína e que está operavelmente ligado a um promotor efetivo para a expressão do gene. Alternativamente, em uma maneira similar animais transgênicos podem ser preparados os quais carecem do gene desejado (por exemplo, camundongo knock-out). Tais transgênicos podem ser preparados em uma variedade de animais não-humanos, incluindo camundongo, ratos, coelhos, cabras, cão, carneiro e porcos (ver Hammer et al., Nature 315:680-683, 1985,Palmiter et al., Science 222:809-814, 1983, Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 82:44384442, 1985, Palmiter and Brinster, Cell 41:343-345, 1985, e patentes Norte-Americanas 5.175.383, 5.087.571, 4.736.866, 5.387.742, 5.347.075, 5.221.778, e 5.175.384). Em resumo, um vetor de expressão, incluindo uma molécula de ácido nucléico a ser expressa junto com seqüências controle de expressão apropriadamente posicionadas, é introduzido em pró-núcleos de ovos fertilizados, por exemplo, através de microinjeção. Integração do ADN injetado é detectada por análise blot de ADN de amostras de tecido. É preferido que o ADN introduzido seja incorporado na linha germe do animal de modo que seja passado para a progênie do animal. Expressão específica de tecido pode ser obtida através o uso de um promotor específico-tecido, ou através do uso de um promotor induzível, tal como o promotor gene metalotioneína (Palmiter et al., 1983, ibid), que permite expressão regulada do transgene.
Proteínas podem ser isoladas através de, entre outros processos, cultura de sistemas hospedeiros e vetores
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apropriados para produção de produtos de tradução recombinantes da presente invenção. Sobrenadantes de tais linhas de células, ou inclusões de proteína ou células inteiras onde a proteína não é excretada no sobrenadante, então podem ser tratados através de uma variedade de procedimentos de purificação de modo a isolar-se as proteínas desejadas. Por exemplo, o sobrenadante pode ser primeiro concentrado usando-se filtros de concentração de proteína comercialmente disponíveis, tal como uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Seguindo concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação apropriada tal como, por exemplo, um anticorpo anti-proteína ligado a um suporte apropriado. Alternativamente, resinas de troca de anion ou cátion podem ser empregadas de modo a purificar-se a proteína. Ainda como uma alternativa, uma ou mais etapas de cromatografia líquida de alta performance de fase reversa (RP-HPLC) podem ser empregadas para ainda purificar-se a proteína. Outros processos de isolamento de proteína da presente invenção são bem conhecidos na técnica.
Uma proteína é julgada ser isolada dentro do contexto da presente invenção se nenhuma outra proteína (indesejada) é detectada em concordância com análises SDSPAGE seguidas por manchamento com azul Coomassie. Dentro de outras realizações, a proteína desejada pode ser isolada de modo que nenhuma outra proteína (indesejada) seja detectada em concordância com análise SDS -PAGE seguida por manchamento com prata.
3. Moléculas de ácido Nucléico
Dentro de outros aspectos da invenção, moléculas de ácido nucléico são providas as quais são capazes de inibir ligação de proteína-ligante TGF-beta a um membro da família TGF-beta. Por exemplo, dentro de uma realização moléculas de oligonucleotídeos anti-sentido são providas as quais especificamente inibem expressão de seqüências de ácido nucléico de proteína-ligante TGF-beta (ver genericamente, Hirashima et al. em Molecular Biology of
ARN:New Perspectives (M.Inouye and B.S.Dudock, eds., 1987 Academic Press, San Diego, p. 401); Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression (J.S. Cohen, ed., 1989 MacMillanPress, London); Stein and Cheng, Science 261:1004-1012, 1993; W095/10607; patente Norte-Americana
5.359.051; WO 92/06693; e EP-A2-612844). Resumidamente, tais moléculas são construídas de modo que elas sejam complementares a, e capazes de formarem pares de bases Watson-Crick com, uma região de seqüência de ARNm proteínaligante TGF-beta transcrita. O resultante ácido nucléico de fita dupla interfere com subseqüente processamento do ARNm, pelo que evitando síntese de proteína (ver Exemplo 10).
Dentro de outros aspectos da invenção, ribozimas são providas as quais são capazes de inibir a ligação de proteína-ligante TGF-beta a um membro da família TGF-beta.
Como aqui usado, ribozimas são pretendidas incluírem moléculas de ARN que cont~em seqüências anti-sentido para reconhecimento específico, e uma atividade enzimática clivante-ARN. A fita catalítica cliva um sítio específico em • · · · · ..
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um ARN alvo em concentração maior que estequiométrica. Uma ampla variedade de ribozimas pode ser utilizada dentro do contexto da presente invenção, incluindo por exemplo, a ribozima de cornífera (por exemplo, como descrita por Forster and Symon, Cell 48:211-220, 1987; Haseloff and Gerlach, Nature 328:596-600, 1988; Walbot and Bruening,
Nature 334:196, 1988; Haseloff and Gerlach, Nature 334:585,
1988); ribozima grampo de cabelo (por exemplo, como descrita por Haseloff et al., patente Norte-Americana 5.254.678, expedida em 19 de outubro de 1993 e Hempel et al., patente EP 0 360 257, publicada em 26 de março de 1990); e ribozimas baseadas em ARN ribossomal de Tetrahymena (ver Cech et al., patente Norte-Americana 4.987.071). Ribozimas da presente invenção tipicamente consistem em ARN, mas também podem ser compostas por AND, análogos de ácido nucléico (por exemplo, fosforotioatos), ou seus quiméricos(por exemplo,
ADN/ARN/ARN).
4. Rótulos
O produto gene ou qualquer uma das moléculas candidatas descritas acima e abaixo, podem ser rotulados com uma variedade de compostos, incluindo, por exemplo, moléculas fluorescentes, toxinas e radionuclidos. Exemplos representativos de moléculas fluorescentes incluem fluoresceina, proteínas Phycobili, tais como ficoeritrina, rodamina, vermelho Texas e luciferase. Exemplos representativos de toxinas incluem ricina, abin toxina de difteria, toxina de cólera, gelonina, proteína antiviral de erva-dos-crancos, tritina, toxina Shigella e exotoxina A de
Figure BRPI9915679B1_D0048
Pseudomonas. Exemplos representativos de radionuclidos incluem Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111, 1-123, 1-125, 1-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 e Bi-212. Em adição, os anticorpos descritos acima também podem ser rotulados ou conjugados a um parceiro de um par de ligação ligante. Exemplos representativos incluem avidina-biotina, e proteína-ligante riboflavina-riboflavina.
Processos para conjugação ou rotulação de moléculas aqui descritas com os rótulos representativos mostrados acima podem ser facilmente realizados por alguém versado na técnica (ver Trichothecene Antibody Conjugate, patente Norte-Americana 4.744.981; Antibody Conjugate, patente Norte-Americana 5.106.951; materiais fluorogênicos e técnicas de rotulação, patente Norte-Americana 4.018.884; proteínas rotuladas com radionuclido metal para diagnostico e terapia, patente Norte-Americana 4.897.255; e compostos quelantes radionuclidos metal para aperfeiçoada cinética de quelação, patente Norte-Americana 4.988.496; ver também Inman, Methods In Enzymology, Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B, Jakoby and Wilchek (eds.), Academic Press, New York, p.30, 1974; ver também, Wilchek and Bayer, The avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications, Anal. Biochem, 171:1-32, 1988).
Composições Farmacêuticas
Como notado acima, a presente invenção também provê uma variedade de composições farmacêuticas, compreendendo uma das moléculas descritas acima que inibe a
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Figure BRPI9915679B1_D0050
ligação de proteína-ligante TGF-beta a um membro da família TGF-beta junto com um carreador, excipientes ou diluentes farmacêutica ou fisiologicamente aceitáveis. Genericamente, tais carreadores devem ser não-tóxicos para receptores nas dosagens e concentrações empregadas. Comumente, a preparação de tais composições vincula combinação de agente terapêutico com tampões, antioxidantes tais como ácido ascórbico, polipeptídios de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos), proteínas, aminoácidos, carboidratos incluindo glucose, sucrose, ou dextrinas, agentes quelantes tais como EDTA, glutationa e outros estabilizantes e excipientes. Solução salina neutra ou solução salina mista com albumina de soro não-específica são diluentes apropriados exemplares.
Em adição, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser preparadas para administração através de uma variedade de rotas diferentes. Em adição, composições farmacêuticas da presente composição podem ser colocadas dentro de recipientes, junto com material de embalagem que provê instruções com relação ao uso de tais composições farmacêuticas. Genericamente, tais instruções incluirão uma expressão tangível descrevendo a concentração de reagente, assim como dentro de certas realizações, quantidades relativas de ingredientes excipientes ou diluentes (por exemplo, água, solução salina ou PBS) que podem ser necessárias para reconstituir a composição farmacêutica.
·· ·· ··
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Processos de Tratamento
A presente invenção também provê processos para aumentar o teor mineral e densidade mineral de osso. Em resumo, numerosas condições resultam em perda de teor mineral ósseo, incluindo, por exemplo, predisposição genética, doença, acidentes que resultam na falta de uso de osso (por exemplo, devido a fratura), compostos terapêuticos que efetuam ressorção de osso, ou que matam células de formação de osso e envelhecimento normal. Através do uso das moléculas aqui descritas que inibem a ligação de proteína-
ligante TGF-beta a um membro de família beta-TGF tais
condições podem ser tratadas ou prevenidas. Como aqui
utilizado, deve ser entendido que teor mineral ósseo foi
aumentado, se teor mineral ósseo foi aumentado em uma
maneira estatisticamente significante (por exemplo, maior que meio desvio padrão), em um sítio selecionado.
Uma ampla variedade de condições que resultam em perda de teor mineral ósseo pode ser tratada com as moléculas aqui descritas. Pacientes com tais condições podem ser identificados através de diagnóstico clínico utilizandose técnicas bem conhecidas (ver, por exemplo, Harrison's Principies of Internai Medicine, McGraw-Hill, lc.). Exemplos representativos de doenças que podem ser tratadas incluem displasias, onde há crescimento ou desenvolvimento anormal de osso. Exemplos representativos de tais condições incluem acondroplasia, disostose cleidocranial, encondromatose, displasia fibrosa, Gaucher's, raquitismos hipofosfatêmicos, Marfan's, exotoses hereditárias múltiplas, neurofibromatose,
... .. ... .
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osteogênese imperfecta, osteopetrose, osteopoiquilose, lesões escleróticas, fraturas, doença periodontal, pseudoartrose e osteomielite piogênica.
Outras condições que podem ser tratadas ou prevenidas incluem uma ampla variedade de causas de osteopenia (isto é, uma condição que causa maior que um desvio padrão de teor mineral ósseo ou densidade abaixo de teor mineral de esqueleto de pico na juventude). Exemplos representativos de tais condições incluem estados anêmicos, condições causadas por esteróides, condições causadas por heparina, desordens de medula óssea, escorbuto, má nutrição, deficiência de cálcio, osteoporose idiopática, osteopenia congenital, ou osteoporose, alcoolismo, doença crônica de fígado, senilidade, estado pós-menopausa, oligomenorréia, amenorréia, gravidez, diabetes melitus, hipertiroidismo, doença de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, imobilização ou desuso, síndrome de distrofia simpatética de reflexo, osteoporose regional transiente e osteomalacia.
Dentro de um aspecto da presente invenção, teor mineral ósseo ou densidade pode ser aumentado através de administração a um animal de sangue quente de uma quantidade efetiva de uma molécula que inibe a ligação de proteínaligante TGF-beta a um membro da família TGF-beta. Exemplos de animais de sangue quente que podem ser tratados incluem vertebrados e mamíferos, incluindo, por exemplo, cavalos, vacas, porcos, carneiro, cães, gatos, ratos e camundongos. Exemplos representativos de moléculas terapêuticas incluem • · « · * · · · ·· ·· • · ·· ·· ribozimas, genes ribozima,oligonucleotídeos anti-sentido e anticorpos (por exemplo, anticorpos humanizados).
Dentro de outros aspectos da presente invenção, são providos processos para aumento de densidade óssea, compreendendo a etapa de introdução em células que originam osso um vetor que direciona a expressão de uma molécula que inibe a ligação de proteína-ligante TGF-beta a um membro da família TGF-beta, e administrando as células contendo vetor a um animal de sangue quente. Em resumo, células que originam osso podem ser obtidas diretamente de um osso de pacientes (por exemplo, ce'lulas obtidas de medula óssea tais como CD34+, osteoblastos, osteócitos e semelhantes), de sangue periférico ou de culturas.
Um vetor que direciona a expressão de uma molécula que inibe a ligação de proteína-ligante TGF-beta a um membro da família TGF-beta é introduzido nas células. Exemplos representativos de vetores apropriados incluem vetores virais tais como vetores de herpes viral (por exemplo, patente Norte-Americana 5.288.641), vetores adenovirais (por exemplo, WO94/26914, WO93/9191; Kolls et al., PNAS
91(1):215-219, 1994; Kass-Eisler et al., PNAS 90(24):11498502, 1993; Guzman et al., Circulation 88(6):2838-48, 1993;
Guzman et al., Cir. Res. 73(6):1202-1207, 1993; Zabner et al., Cell 75(2):207-216, 1993; Li et al., Hum Gene Ther.
4(4):403-409, 1993; Caillaud et al., Eur. J. Neurosci.
5(10:1287-1291, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5(2):130134, 1993; Jaffe et al., Nat. Genet. 1(5):372-378, 1992; e
Levrero et al., Gene 101(2):195-202, 1991), vetores virais
Figure BRPI9915679B1_D0052
associados-adeno (WO 95/13365; Flotte et al., PNAS 90(22):10613-10617, 1993), vetores baculovirus, vetores parvovírus (Koering et al., Hum. Gene Therap. 5:457-463, 1994), vetores vírus pústula (Panicali and Paoletti, PNAS 79:4927-4931, 1982; e Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res.
Comm. 193(2):653-660, 1993) e retrovírus (por exemplo, EP 0 415 731; WO 90/07936; WO 91/0285, WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; patente Norte-Americana 5.219.740; WO 93/11230; WO 93/10218). Vetores virais da mesma maneira podem ser construídos os quais contêm uma mistura de diferentes elementos (por exemplo, promotores, seqüências envelope e semelhantes) a partir de diferentes vírus, ou fontes nãovirais. Dentro de várias realizações, tanto o próprio vetor viral, como uma partícula viral que contem o vetor viral pode ser utilizada nos processos e composições descritos abaixo.
Dentro de outras realizações da invenção, moléculas e ácido nucléico que codificam uma molécula que inibe a ligação de proteína-ligante TGF-beta a um membro da família TGF-beta elas próprias podem ser administradas através de uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, administração de asialoosomucoid (ASOR) conjugado com complexos poli-L-lisina ADN (Cristano et al., PNAS 92122-92126, 1993), ADN ligado a adenovírus morto (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3(2):147-154, 1992), introdução mediada com citofectina (DMRIE-DOPE, Vical, Califórnia), injeção direta de ADN (Acsadi et al., Nature 352:815-818, 1991);
ligante ADN (Wu et al., J.of Biol. Chem. 264:16985-16987,
19G
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1989); lipofecção (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989); lipossomas (Pickering et al., Circ. 89(1):13-21, 1994; e Wang et al., PNAS 84:7851-7855, 1987); bombardeio com microprojéteis (Williams et al., PNAS 88:2726-2730, 1991);e liberação direta de ácido nucléicos que codificam a própria proteína tanto sozinhos (Vile and Hart, Câncer Res. 53:3860-3864, 1993) como utilizando complexos de PEG~ácido nucléico.
Exemplos representativos de moléculas que podem ser expressas através dos vetores da presente invenção incluem ribozimas e moléculas anti-sentido, cada uma das quais são discutidas em mais detalhes acima.
Determinação de aumentado teor mineral ósseo pode ser determinada diretamente através do uso de raios-x (por exemplo, Dual Energy X-ray Absorptometry ou DEXA), ou por inferência através de marcadores de quantidade metabolizada de osso (fosfatase alcalina específica osteoblasto, osteocalcina, pró-peptídeo C' pró-colágeno tipo 1 (PICP), e fosfatase alcalina total; ver Comier, C., Curr. Opin. In Rheu. 7:243, 1995) ou marcadores de ressorção óssea e (piridinolina, desoxipiridinolina, N-telopeptídeo, hidróxi prolina urinária, fosfatases ácidas resistentes a tartarato de plasma e galactosil hidróxi lisina; ver Comier, supra). A quantidade de massa óssea também pode ser calculada a partir de pesos de corpos, ou utilizando-se outros processos (ver Guiness-Hey, Metab. Bone Dis. And Rei. Res. 5:177-181,
1984).
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Como será evidente para aqueles versados na técnica, a quantidade e freqüência de administração dependerão, é claro, de fatores tais como a natureza e seriedade da indicação sendo tratada, a resposta desejada, a condição do paciente e assim por diante. Tipicamente, as composições poçlem ser administradas através de uma variedade de técnicas, como notado acima.
Os exemplos que se seguem são oferecidos a título de ilustração, e não limitação.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1
Mapas de sclerosteosis para o braço longo de cromossoma humano 17
Figure BRPI9915679B1_D0055
Mapeamento genético do defeito responsável por sclerosteosis em humanos localizou o gene responsável por esta desordem para a região de cromossoma humano 17 que codifica um novo membro de família de proteína-ligante TGFbeta. Em sclerosteosis, osso de esqueleto mostra um substancial aumento em densidade mineral em relação àquela de indivíduos não-afligidos. Osso da cabeça também mostra super-crescimento. Pacientes de sclerosteosis são genericamente saudáveis embora eles possam exibir graus variáveis de sindactilia no nascimento e graus variáveis de compressão cranial e compressão de nervo no crânio.
Análises de ligação do defeito de gene associado com sclerosteosis foi conduzida através de aplicação de processo de mapeamento de homozigosidade a amostras de ADN coletadas de 24 famílias de South African Afrikaaner nas
101 »« w w • · * ·· ·· • · ♦ · ·· ♦ ·· ·· ··· · * · Α· ! “ ·· ·· .· ·.
quais a doença ocorreu. (Sheffield et al., 1994, Human Molecular Genetics 3:1331-1335. Identification of a BardetBiedl syndrome locus on chromossome 3 and evaluation of an efficient approach to homozygosity mapping). A população
Afrikaaner de África do Sul é geneticamente homogênea; a população é descendente de um pequeno número de fundadores que colonizaram a área vários séculos atrás, e foi isolada por barreiras geográficas e sociais desde a fundação. Sclerosteosis é rara em qualquer lugar do mundo for a da io comunidade Afrikaaner, o que sugere que uma mutação no gene estava presente na população fundadora e desde então aumentou em números junto com o aumento da população. 0 uso de mapeamento de homozigosidade é baseado na assunção de que marcadores de mapeamento de ADN adjacentes a uma mutação recessiva são prováveis de serem homozigotos em indivíduos afetados de famílias consangüíneas e populações isoladas.
Um conjunto de 371 marcadores micro-satélite (Research Genetics, Sert 6) dos cromossomas autossômicos foi selecionado para tipificar reuniões de ADN de amostras de paciente de sclerosteosis. As amostras de ADN para estas análises vieram de 29 pacientes de sclerosteosis em 24 famílias, 59 membros de família não-afetados e um conjunto de indivíduos controles não-relacionados da mesma população. As reuniões consistiram em 4-6 indivíduos, tanto indivíduos afetados, indivíduos afetados de famílias consangüíneas, parentes e irmãos, ou controles não-relacionados. Nas reuniões de indivíduos não-relacionados e na maioria das reuniões com indivíduos afetados ou membros de família
102
143 de alelos
Figure BRPI9915679B1_D0056
análises dos marcadores mostraram vários tamanhos para cada marcador. Um marcador, D17S1299, mostrou uma indicação de homozigosidade: uma banda em várias das reuniões de indivíduos afetados.
Todas as 24 famílias com sclerosteosis foram tipificadas comum total de 19marcadores na região de D17S1299 (em 17ql2-q21). Indivíduos afetados de todas famílias foram mostrados serem homozigotos nesta região, e 25 dos 29 indivíduos foram homozigotos para uma haplotipo de centro; eles tiveram o mesmo alelo entre D17S1787 e D17S930. Os outros quatro indivíduos tiveram um romossoma que ajustou-se a este haplotipo e um segundo que não. Na soma, os dados sugeriram que esta região de 3 megabases conteve a mutação de sclerosteosis. Análise de seqüência de maioria dos exons nesta região de 3 megabases identificou uma mutação não-sentido na nova seqüência codificando proteínaligante TGF-beta (mutação C>T na posição 117 de seqüência ID No. 1 resulta em um códon interrupção) . Esta mutação foi mostrada ser única para pacientes de sclerosteosis e carreadores de descendente de Afrikaaner. A identidade do gene foi ainda confirmada através da identificação de uma mutação neste intron (mutação A>T na posição +3 do intron) que resulta em impróprio processamento de ARNm em um paciente não-relacionado, simples, com sclerosteosis diagnosticada.
Especificidade de tecido de expressão de gene de proteína-ligante TGF-beta
EXEMPLO 2
103
ISO
Figure BRPI9915679B1_D0057
A. Expressão de Gene Beer Humano Através de RT-PCR:
ADNc primeira-fita foi preparado das seguintes amostras de ARN total usando-se um kit comercialmente disponível (Superscript Preamplification System for First; Strand cDNA Synthesis, Life Technologies, Rockville, MD) : cérebro humano, fígado humano, baço humano, thymus humano, placenta humana, músculo de esqueleto humano, tiróide humana, pituitária humana osteoblastos humanos (NHOst de Clonetics Corp., San Diego, CA), linha de célula osteosarcoma (Saos-2, ATCC# HTB-865), osso humano, medula óssea humana, cartilagem humana, osso de macaco vervet, saccharomyces cerevisiae, e monócitos de sangue periférico humano. Todas as amostras de ARN foram adquiridas de uma fonte comercial (Clontech, Paio Alto, CA), exceto os seguintes que foram preparados : osteoblasto humano, linha de célula de osteosarcoma humano, osso humano, cartilagem humana, e osso de macaco vervet. Estas amostras de ARN emcasa foram preparadas usando-se um kit comercialmente disponível (TRI Reagent, Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH).
PCR foi realizada sobre estas amostras, e adicionalmente sobre uma amostra genômica humana com um controle. O primer oligonucleotídeo Beer sentido teve a seqüência 5'-CCGGAGCTGGAGAACAACAAG-3' (SEQ ID NO:19). O primer oligonucleotídeo Beer anti-sentido teve a seqüência 5'-GCACTGGCCGGAGCACACC-3' (SEQ ID NO:20). Em adição, PCR foi realizada usando-se primers para o gene beta-actina humano, como um controle. O primer oligonucleotídeo beta-actina
104 s\ ; ϊ’ί ύ Λ 5À.
, ζ. ,1 ·* ·»· - · sentido teve a seqüência 5'-AGGCCAACCGCGAGAAGATGA CC-3' (SEQ ID NO: 21) . O primer oligonucleotídeo beta-actina antisentido teve a seqüência 5'-GAAGT CCAGGGCGACGTAGCA-3' (SEQ ID NO:22). PCR foi realizada usando-se condições padrões de reações de 25ul, com uma temperatura de anelamento de 61 graus Celsius. Trinta e dois ciclos de PCR foram realizados com primers Beer e vinte e quatro ciclos foram realizados com os primers beta-actina.
Seguindo amplificação, 12ul de cada reação foram analisados por eletroforese com gel agarose e manchamento com brometo de etidium. Ver figura 2A.
B. Hibridização de ARN in-siiu de Seções de Embrião de Camundongo:
O ADNc Beer de camundongo de comprimento inteiro (seqüência ID No. 11) foi clonado no vetor pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) na direção sentido e anti-sentido usando-se o protocolo do fabricante. Transcritos senti e anti-sentido de ARNc rotulado com 35S-alfa-GTP foram sintetizados usando-se reagentes de transcrição in-vitro fornecidos por Ambion, Inc (Austin, TX) . Hibridização in situ foi realizada de acordo com os protocolos de Lyons et al. (J.Cell Biol. 111:2427-2436, 1990).
A sonda de ARNc Beer de camundongo detectou uma mensagem específica expressa no tubo neural, brotos de membros, vasos sanguíneos e cartilagens ossificando de embriões de camundongos desenvolvendo-se. O painel A na Figura 3 mostra expressão na crista ectodérmica (aer) de broto de membro (1), vasos sanguíneos (bv) e o tubo neural
105 • « ··
4° ventrículo do na mandíbula (ma), ♦ · ί « •
(nt). Ο painel Β mostra expressão no cérebro (4) . O painel C mostra expressão vértebra cervical (cv), osso occipital (oc), palato (pa) e um vaso sanguíneo (bv) . 0 painel D mostra expressão nas cristas (rb) e uma válvula de coração (va). O painel A é uma seção transversa de 10.5 dpc de embrião. 0 painel B é uma seção sagital de 12.5 dpc de embrião e painéis C e D são seções sagitais de 15.5 dpc de embriões.
ba = arco branquial, h = coração, te = telencéfalo (cérebro anterior) , b = cérebro, f = massa fronto-nassal, g = intestino, h = coração, j = mandíbula, lu = pulmão, ot = vesículo ótica, ao = , sc = coluna vertebral, skm = músculo do esqueleto, ns = sinus nasal, th = timo, to = língua, fl = membro dianteiro, di = diafragma
EXEMPLO 3
Expressão e Purificação de Proteína Beer Recombinante
A. Expressão em Células COS-1:
A seqüência de ADN codificando a proteína Beer humano de inteiro comprimento foi amplificada usando-se os seguintes primers oligonucleotídeos de PCR: O primer oligonucleotídeo 5' teve a seqüência 5'AAGCTTGGTACCATGCAGCTCCCAC-3' (SEQ ID NO: 23) e conteve um sítio de enzima de restrição HindIII (em negrito) seguido por 19 nucleotídeos do gene Beer iniciando 6 pares de bases antes do presumido códon de partida terminal amino (ATG). O primer oligonucleotídeo 3' teve a seqüência 5'AAGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCT TGTAGTCGTAGGCGTTCTCCAGCT-3’ (SEQ
ID NO:24) e conteve um sítio de enzima de restrição HindIII
106
153
Figure BRPI9915679B1_D0058
(em negrito) seguido por um códon interrupção complemento reverso (CTA) seguido pelo complemento reverso do epítopo FLAG (sublinhado, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) flanqueado pelo complemento reverso de nucleotídeos codificando para os 5 aminoácidos terminais carbóxi da Beer. O produto de PCR foi clonado TA (Original TA Cloning Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA) e clones individuais foram selecionados por seqüenciamento de ADN. Um clone de seqüência verificada foi então digerido por HindIII e purificado sobre um gel agarose 1,5% usando-se um reagente comercialmente disponível (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen Inc., Valencia, CA). Este fragmento foi então ligado a plasmídeo pcDNA3.1 (Invtrogen, Carlsbad, CA) tratado com fosfatase, digerido com HindIII com T4 DNA ligase. DH10B
E.coli foram transformados e revestidos sobre LB, lOOug/ml placas de ampicilina. Colônias transportando o desejado recombinante na própria orientação foram identificadas por uma seleção baseada em PCR, usando-se um primer 5' correspondente ao sítio promotor/priming T7 em pcDNA3.1 e um primer 3' com a seqüência 5'-GCACTGGCCGGAGCACACC-3' (SEQ ID NO:25) que corresponde o complemento reverso de seqüência BEER .interna. A seqüência do fragmento clonado foi confirmada por seqüenciamento de ADN.
Células COS-1 (ATCC#CRL-1650) foram usadas para transfecção. 50ug do plasmídeo de expressão pcDNA-Beer-Flag foram transfectados usando-se um kit comercialmente disponível seguindo-se protocolos fornecidos pelo fabricante (DEAE-Dextran Transfection Kit Sigma Chemical Co., St.
i
107
154
Figure BRPI9915679B1_D0059
Louis, MO) . Os meios finais seguindo transfecção foram DMEM (Life Technologies, Rockville, MD) contendo soro bovino fetal 0,1%. Após 4 dias em cultura, os meios foram removidos. Expressão de BEER recombinante foi analisada por
SDS-PAGE e Western Blot usando-se anticorpo monoclonal M2 anti-FLAG (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). Purificação de proteína BEER recombinante foi realizada usando-se uma coluna de afinidade anti-FLAG M2 (Mammalian Transient Expression System, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). O ío perfil de coluna foi analisado via SDS-PAGE e Western Blot usando-se anticorpo monoclonal anti-FLAG M2.
B. Expressão em células de inseto SF9 A seqüência de gene Beer humano foi amplificada usando-se PCR com condições padrões e os seguintes primers:
Primer sentido: 5'-GTCGTCGGATCCATGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAATGAT3' (SEQ ID NO:26)
Figure BRPI9915679B1_D0060
Primer anti-sentido: 5'-GTCGTCAAGCTTCTACTTGTCATCGTCCTTGTAGTC
GTAGGCGTTCTCCAGCTCGGC-3' (SEQ ID NO:27
O resultante ADNc conteve a região codificante de
Beer com duas modificações. O sinal de secreção N-terminal e uma etiqueta epítopo FLAG (Sigma) foram fundidos à extremidade C-terminal da inserção. Sítios de clonagem BamHI e HindIII foram adicionados e o gene foi subclonado em vetor pMelBac (Invitrogen) para transferência em um vetor de expressão baculoviral usando-se processos padrões.
Baculovírus recombinantes expressando proteína
Beer foram fabricados usando-se o kit de transfecção Bac-N108
155
Figure BRPI9915679B1_D0061
Figure BRPI9915679B1_D0062
Figure BRPI9915679B1_D0063
Blue (Invitrogen) e purificados de acordo com as instruções de fabricante.
Células SF9 (Invitrogen) foram mantidas em meios TNM_FH (Invitrogen) contendo soro fetal de bezerro 10%. Para expressão de proteína, culturas SF9 em frascos giratórios foram infectadas em uma MOI maior que 10. Amostras dos meios e células foram tomadas diariamente por cinco dias e expressão de Beer monitorada por western blotting usando-se um anticorpo monoclonal anti-FLAG M2 (Sigma) ou um anti-soro io policlonal de coelho anti-Beer.
Após cinco dias as células SF9 infectadas com baculovírus foram colhidas por centrifugação e proteína associada a célula foi extraída da pelota de célula usandose um tampão de alta extração de sal (NaCl 1,5M, Tris 50mM, pH 7,5). O extrato (20ml por 300ml de cultura) foi clarificado por centrifugação, dializado três vezes contra quatro litros de solução salina Tris (NaCl 150mM, Tris 50mM pH 7,5), e clarificado novamente por centrifugação. Esta fração de alto sal foi aplicada a Hitrap Heparin (Pharmacia;
volume de leito de 5ml), lavada extensivamente com solução salina tamponada com HEPES (HEPES 25mM 7.5, NaCl 150mM), e proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente de NaCl 150mM a NaCl 1200mM. Eluição de Beer foi observada em aproximadamente NaCl 800mM. Frações contendo Beer foram suplementadas para glicerol 10% e DTT lmM e congeladas em 80°C.
109
Figure BRPI9915679B1_D0064
Figure BRPI9915679B1_D0065
Figure BRPI9915679B1_D0066
EXEMPLO 4
Preparação e Teste de Anticorpos Policlonais para Beer,
Gremlin e Dan
A. preparação de Antigeno
As seqüências de ADN de Beer humano, Gremlin humana, e Dan humana foram amplificadas usando-se processos PCR padrões com os seguintes primers oligonucleotídeos:
H.Beer
Sentido: 5'-GACTTGGATCCCAGGGGTGGCAGGCGTTC-3' (SEQ ID NO:28)
Anti-sentido: 5'-AGCATAAGCTTÇTAGTAGGCGTTCTCCAG-3' (SEQ ID
NO:29)
H.Gremlin
Sentido: 5' -GACTTGGATCCGAAGGGAAAAAGAAAGGG-3' (SEQ ID NO: 30) Anti-sentido: 5'-AGCATAAGÇTTTTAATCCAAATCGATGGA-3' (SEQ ID
NO: 31)
H. Dan
Sentido: 5'-ACTACGAGCTCGGCCCCACCACCCATCAACAAG-3' (SEQ ID
NO:32)
Anti-sentido: 5'-ACTTAGAAGCTTTCAGTCCTCAGCCCCCTCTTCC-3' (SEQ
ID NO:33)
Em cada caso os primers listados amplificaram a inteira região codificante minus a seqüência sinal de secreção. Esta inclui sítios de restrição para subclonagem no vetor de expressão bacterial pQE-30 (Qiagen Inc.,
Valencia, CA) em sítios BamHI/HindIII para Beer e Gremlin, e sítios SacI/HindIII para Dan. PQE30 contem uma seqüência codificando para uma etiqueta 6x His na extremidade 5' da região de clonagem. As construções completadas foram
110
Figure BRPI9915679B1_D0067
Figure BRPI9915679B1_D0068
transformadas em E.coli linhagem Μ-15/pRep (Qiagen Inc) e clones individuais verificados por seqüenciamento. Expressão de proteína em Μ-15/pRep e purificação (6x His etiqueta afinidade ligando a Ni-NTA acoplada a Sephrose) foram realizadas como descrito pelo fabricante (Qiagen, The QIAexpressionist).
A proteína Beer derivada de E.coli foi recuperada em quantidade significante usando-se solubilização em guanidina 6M e dializada para 2-4M para prevenir precipitação durante estocagem. Proteína Gremlin e Dan foram recuperadas em maior quantidade com solubilização em guanidina 6M e pós-purificação concentração de guanidina de 0, 5M.
B. Produção de Teste de Anticorpos Monoclonais:
Anticorpos monoclonais para cada um dos tr~es antígenos foram produzidos em hospedeiros coelhos e galinhas usando-se protocolos padrões (R&R Antibody, Stanwood, WA; protocolo padrão para imunização de coelho e recuperação de anticorpos; Short Protocols in Molecular Biology. 2nd edition 1992. 11.37-11.41. Contribuidores Helen M. Cooper e Yvonne Paterson; anti-soros de galinha foram gerados com Strategic Biosolutions, Ramona, CA).
Anti-soros de coelho e fração Igy de ovo de galinha foram selecionados para atividade via Western blot.
Cada um dos três antígenos foi separado por PAGE e transferido para nitrocelulose 0,45um (Novex, san Diego, CA). A membrana foi cortada em tiras com cada tira contendo aproximadamente 75ng de antígeno. As tiras foram bloqueadas lll
Figure BRPI9915679B1_D0069
Figure BRPI9915679B1_D0070
II em. Blotting Grade Block 3% (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e lavadas 3x em IX solução salina tampão Tris (TBS) / 0,02% tampão TWEEN. O anticorpo primário (sangrias de préimunização, anti-soros de coelho ou IgY de ovo de galinha em diluições variando de 1:100 a 1:10 000 em tampão bloqueante) foi incubado com as tiras por uma hora com agitação suave. Uma segunda série de três lavagens IX TBS/0,02% TWEEE foi seguida por uma incubação de uma hora com o anticorpo secundário (peroxidase conjugada burro anti-coelho, Amersham Life Science, Piscataway,NJ; ou peroxidase conjugada burro anti-galinha, Jackson Immuno Research, West Grove, PA) . Um ciclo final de 3X lavagens de IX TBS/0,02% TWEEN foi realizado e as tiras foram desenvolvidas com Substrato de Lumi-Light Western Blotting (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany).
C. Teste de reatividade-cruzada de Anticorpo Seguindo o protocolo descrito na seção anterior, tiras de nitrocelulose de Beer, Gremlin ou Dan foram incubadas com diluições (1:5000 e 1:10 000) de seus respectivos anti-soros de coelho ou IgY de ovo de galinha assim como anti-soros ou Igy de ovo de galinha (diluições 1:1000 e 1:5000) fabricadas para os dois antígenos restantes. Os aumentados níveis de anticorpos não-ajustados foram realizados para detectar baixa afinidade de ligação por aqueles anticorpos que podem ser vistos somente em concentração aumentada. O protocolo e duração de desenvolvimento são os mesmos para todos os três eventos ligantes usando-se o protocolo descrito acima. Não houve reatividade25
112 ··· ·· ··· · :·. :·. .·* • · · · · · .
cruzada de antígen observada para qualquer um dos antígenos testados.
EXEMPLO 5
Interação de Beer com proteínas de super-família TGF-beta
A interação de Beer com proteínas de diferentes braços filogenéticos da super-família TGF-beta foi estudada usando-se processos de precipitação imuno. TGFbeta-1, TGFbeta-2, TGFbeta-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 e GDNF purificadas foram obtidas de fontes comerciais (R&D systems; io Minneapolis, MN) . Um protocolo representativo é como se segue. Beer parcialmente purificada foi dializada em solução salina tamponada com HEPES (HEES 25mM 7.5, NaCl 150mM). Precipitações imuno foram feitas em 300ul de tampão IP (NaCl 150mM, Tris 25mM pH 7,5, EDTA lmM, beta-mercapto etanol l,4mM, triton X 100 0,5%, glicerol 10%). 30ng de proteína BMP-5 humana recombinante (R&D systems) foram aplicados a 15ul de matriz de afinidade FLAG (Sigma; St. Louis MO)) na presença e ausência de 500ng de Beer rotulada-epítopo FLAG. As proteíns foram incubadas por 4 horas @ 4°C e então as proteínas associadas com matriz de afinidade foram lavadas 5 vezes em tampão IP (lml por lavagem). As proteínas ligadas foram eluídas da matriz de afinidade em 60 microlitros de tampão de amostra IX SDS PAGE. As proteínas foram resolvidas por SDS PAGE e BMP-5 associada Beer foi detectada por,Western blot usando-se anti-soro anti-BMP-5 (Research Diagnostics, Inc)(ver Figura 5).
113
Ensaio de Ligação Ligante BEER:
Proteína FLAG-Beer (20ng)é adicionada a lOOul de
PBS/0,2% BSA e adsorvidos em cada cavidade de placa de microtitulação de 96 cavidades previamente revestida com anticorpo monoclonal anti-FLAG (Sigma; St. Louis MO} e bloqueada com BSA 10% em PBS. Isto é conduzido em
Figure BRPI9915679B1_D0071
temperatura ambiente por 60 minutos. A solução de proteína é removida e as cavidades são lavadas para remoção de proteína não-ligada. BMP-5 é adicionada a cada cavidade em concentrações variando de ΙΟρΜ a 500nM em PBS/0,2% BSA e incubada por 2 horas em temperatura ambiente. A solução ligante é removida e a placa lavada três vezes com volumes de 200ul de PBS/0,2% BSA. Níveis de BMP-5 são então detectados usando-se anti-soros BMP-5 via ELISA (F.M.ausubel et al. (1998) Current protocols in Mol Biol. Vol 2 11.2.111.2.22). Ligação específica é calculada por subtração de ligação não-específica de ligação total e analisada pelo programa LIGAND (Munson and Podbard, Anal. Biochem., 107, p220-239, (12980).
Em uma variação deste processo, Beer é engenheirada e expressa como uma proteína de fusão Fc humana. Da mesma maneira, o ligante BMP é engenheirado e expresso como fusão Fc camundongo. Estas proteínas são incubadas juntas e o ensaio conduzido como descrito por
Mellor et al usando-se deteção de fluorescência resolvida com tempo homogênea (G.W.Mellor et al., J of Biomol Screening, 3(2) 91-99, 1998).
114 ··· ·· ··· » ·> b :*
Figure BRPI9915679B1_D0072
Ensaio de Seleção Para Inibição de Ligação de protelnaLigante TGF-beta a Membros da Família TGF-beta
EXEMPLO 6
Figure BRPI9915679B1_D0073
ensaio descrito acima é replicado com duas exceções. Primeiro, concentração de BMP é mantida fixa na Kd determinada anteriormente. Segundo, uma coleção de candidatos antagonistas é adicionada em uma concentração fixa (20uM no caso das coleções de moléculas orgânicas pequenas e luM em estudos de anticorpos). Estas moléculas candidatas (antagonistas) de ligação de proteína-ligante TGF-beta incluem compostos derivados de coleções comerciais ou internas representando diversas estruturas químicas. Estes compostos são preparados como soluções estoque em DMSO e são adicionados a cavidades de ensaio em < 1% de volume final sob as condições de ensaio padrões. Estes são incubados por 2 horas em temperatura ambiente com BMP e Beer, a solução removida e a BMP ligada é quantificada co mo descrito. Agentes gue inibem 40% da ligação de BMP observada na ausência de composto ou anticorpo são considerados antagonistas nesta interação. Estes são avaliados como potenciais inibidores baseado em estudos de titulação para determinar-se suas constantes de inibição e sua influência sobre afinidade de ligação de proteína-ligante TGF-beta. Ensaios controles de especificidade comparável também podem ser conduzidos para estabelecer-se o perfil de seletividade para o antagonista identificado através de estudos usando-se ensaios dependentes da ação ligante de BMP (por exemplo, estudo de competição receptor BMP/BMP).
115
Inibição de localização de proteína-ligante TGF-beta para matriz óssea #· - ν · · ··· ·· ··· * :·: :· ·-; Μ Ί 5 η / U 167 • · ·« »« ··· « · · *·
EXEMPLO Ί
Figure BRPI9915679B1_D0074
Avaliação de inibição de localização para matriz óssea (hidróxiapatita) é conduzida usando-se modificações para o processo de Nicolas (Nicolas, V. Calcif. Tissue Int 57:206, 1995). Em resumo, proteína-ligante TGF-beta rotulada com 125I é preparada como descrito por Nicolas (supra) . Hidróxiapatita é adicionada a cada cavidade de uma placa de io microtitulação de 96 cavidades equipada com uma membrana de filtração de polipropileno (Polyfiltronin, Weymouth, MA) . Proteína-ligante TGF-beta é adicionada a albumina 0,2% em tampão PBS. As cavidades contendo matriz são lavadas 3 vezes com este tampão. Proteína-ligante TGF-beta é eluída usando15 se NaOH 0,3M e quantificada.
Identificação de inibidor é conduzida via incubação de proteína-ligante TGF-beta com moléculas testes e aplicação de mistura à matriz como descrito acima. A matriz é lavada 3 vezes com albumina 0,2% em tampão PBS.
Proteína-ligante TGF-beta adsorvida é eluída usando-se NaOH 0,3M e quantificada. Agentes que inibem 40% da ligação de proteína-ligante TGF-beta observada na ausência de composto ou anticorpo são considerados inibidores de localização de osso. Estes inibidores são ainda caracterizados através de estudos de resposta de dose para determinar suas constantes de inibição e sua influência sobre afinidade de ligação de proteína-ligante TGF-beta.
116 » i, (. »»· ·« t i ’ i *. jv y Λ · i: » â Λ C w « ·* < · *) V c · · »- '♦ c<· · tf »
EXEMPLO 8
Construção de Proteína-ligante TGF-beta mutante
A. Mutagênese
Um ADNc de proteína-ligante TGF-beta de inteiro 5 comprimento em pBluescript SK serve como um molde para mutagênese. Em resumo, primers apropriados (ver a discussão provida acima) são utilizados para gerarem o fragmento de ADN por reação de cadeia polimerase usando-se Vent DNA polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA) . A reação de ío cadeia polimerase é corrida por 23 ciclos em tampões providos pelo fabricante usando-se uma temperatura de anelamento de 57°C. 0 produto é então exposto a duas enzimas de restrição e após isolamento usando-se eletroforese de gel agarose, ligado de volta a pRBP4-503 do qual a seqüência de ajuste foi removida por digestão enzimática. Integridade do mutante é verificada por seqüenciamento de ADN.
B. Expressão de Célula Mamífera e Isolamento de proteína-ligante TGF-beta mutante:
ADNc's de proteína-ligante TGF-beta mutantes são 20 transferidos no vetor de expressão mamífero pcDNA3.1 descrito no Exemplo 3. Após verificação de seqüência, as resultantes construções são transfectadas em células COS-1, e proteína secretada é purificada como descrito no Exemplo 3. EXEMPLO 9
MODELOS ANIMAIS-I
Geração de camundongo Transgênico Super-expressando o Gene Beer clone ~200 quilobase (kb) BACml5G5, isolado da biblioteca de ADN genômico de camundongo CITB (distribuída
117
·.' ; \IU‘| ?; f’*·:
por Research Genetics, Huntsville, AL) foi usado para determinar a seqüência completa do gene Beer de camundongo e suas regiões flanquenates 5' e 3' . Um fragmento Sall de 41kb, contendo o inteiro corpo de gene, mais ~17kb de seqüência flanqueando 5' e ~20kb de seqüência flanqueando 3' foi sub-clonado no sítio BamHI do vetor cosmídeo SuperCosI (Stratagene, LaJolla, CA) e propagado na linhagem E.coli DH10B. A partir desta construção de cosmídeo, um fragmento de restrição MluI-AvilI de 35kb (seqüência No. 6), incluindo ίο o gene Beer de camundongo inteiro, assim como 17kb e 14 kb de seqüência de flanco 5' e 3', respectivamente, foi então purificado com gel, usando-se meios convencionais, e usado para microinjeção de zigotos de camundongo (DNX Transgenics; patente Norte-Americana 4.873.191). Animais fundadores nos quais o fragmento de ADN clonado foi integrado randomicamente no genoma foram obtidos em uma freqüência de 5-30% de pupas nascidas-vivas. A presença do transgene foi avaliada através de realização de análise de Southern blot do ADN genômico extraído de uma pequena quantidade de tecido de camundongo, tal como a ponta de uma cauda. ADN foi extraído usando-se o seguinte protocolo: tecido foi digerido por toda a noite a 55°C em um tampão de lise contendo NaCl 200mM, Tris lOOmM pH 8,5, EDTA 5mM, SDS 0,2% e Proteinase K 0,5 mg/ml. No dia seguinte, o ADN foi extraído uma vez com fenol/clorofórmio (50:50), uma vez com clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e precipitado com etanol. Com re-suspen&ão em TE (Tris lOmM pH 7,5, EDTA lmM) 8-10gg de cada amostra de ADN foram digeridos com uma endonuclease de restrição, tal
118
Figure BRPI9915679B1_D0075
como EcoRI, subme-tidos a eletroforese de gel e transferidos para uma membrana de nylon carregada, tal como HuBonN+ (Amersham, Arlington Heights, IL) . 0 filtro resultante foi então hibridizado com um fragmento rotulado radioativamente de ADN derivando do locus de gene Beer de camundongo, e capaz e reconhecer um fragmento do locus de gene endógeno e um fragmento de um tamanho diferente derivando do transgene. Animais fundadores foram criados para camundongos nãotransgênicos normais para gerarem números suficientes de progênie transgênica e não-transgênica onde determinar-se os efeitos de superexpressão de gene Beer. Para estes estudos, animais em várias idades (por exemplo, 1 dia, 3 semanas, 6 semanas, 4 meses) são submetidos a um número de diferentes ensaios designados para avaliar-se formação esqueletal grossa, densidade mineral óssea, teor mineral ósseo, atividade de osteoclasto e osteoblasto, extensão de ossificação endocondral, formação de cartilagem, etc. A atividade transcricional a partir do transgene pode ser determinada por extração de ARN de vários tecidos, e usandose um ensaio RT-PCR que toma vantagem de polimorfismos de nucleotídeo simples entre a linhagem de camundongo do qual o transgene é derivado (129Sv/J) e a linhagem de camundongo usada para microinjeção de ADN [(C57BL5/J x SJL/J)F2].
MODELOS ANIMAIS-II
Interrupção do gene BEER de camundongo por recombinação homóloga
Recombinação homóloga em células tronco embriônicas (ES) pode ser usada para inativar o gene Beer de
119
AeG • · camundongo endógeno e subseqüentemente gerar*’ ahiTnátís carreando uma mutação perda-de-função. Um gene repórter, tal como o gene beta-galactosidase de E.coli, foi engenheirado no vetor alvo de modo que sua expressão é controlada pelo promotor de gene Beer endógeno e sinal de iniciação translacional. Deste modo, os padrões espaciais e temporais de expressão de gene Beer podem ser determinados em animais transportando um alelo alvejado.
vetor de alvejamento foi construído primeiro clonando-se o promotor fosfoglicerato cinase (PGK) selecionável-droga dirigindo cassete gene de resistência a neomicina (neo) de pGT-N29 (New England Biolabs, Beverly, MA) no vetor de clonagem pSP72 (Promega, Madso, WI). PCR foi usada para flanquear o cassete PGKneo com sítios bacteriófago PI loxP, que são sítios de reconhecimento para PI Cre recombinase (Hoess et al., PNAS USA 79:3398, 1982). Isto permite subseqüente remoção do marcador de resistência neo em células ES alvejadas ou animais derivados de célula ES (patente Norte-Americana 4.959.317). Os primers PCR foram compreendidos por 34 nucleotídeos (ntd) seqüência loxP, 1525 ntd complementares para as extremidades 5' e 3 do cassete PGKneo, assim como sítios e reconhecimento de enzima de restrição (BamHI no primer sentido e EcoRI no primer anti-sentido) para clonagem em pSP72. A seqüência do primer sentido foi 5'-AATCTGGATCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT CTGCAGGATTCGAGGGCCCCT-3' (SEQ ID NO:34); seqüência do primer anti-sentido foi 5'-AATCTGAATTCCACCGGTGTTAATTAAATAACTTCGT
120
ATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGATCTAGAG TCAGCTTCTGA-3'
NO:35).
··· ·· • · • · • · · .? .L ··’·’:: ’·:
(SfeQ’ ID* ’·
Figure BRPI9915679B1_D0076
A etapa seguinte foi clonar um fragmento XholHindlII de 3,6kb, contendo o gene beta-galactosidase de
E.coli e sinal de poliadenilação SV40 de pSVbeta (Clontech, Paio Alto, CA) no plasmídeo pSP72-PGKneo. O braço curto de homologia a partir do locus de gene Beer de camundongo foi gerado por amplificação de um fragmento de 2,4 kb do clone BAC 15G5. A extremidade 3' do fragmento coincidiu como sítio io de iniciação translacional do gene Beer, e o primer antisentido usado na PCR também incluiu 30 ntd complementares para a extremidade 5' do gene beta-galactosidase de modo que sua região codificante pode ser fundida ao sítio de iniciação de Beer em-quadro. A abordagem tomada para introdução de braço curto no plasmídeo pSP72~3gal-PGKneo foi linearizar o plasmídeo em m sitio à montante do gene βgal e então co-trans formar este fragmento com o produto de PCR de braço curto e selecionar plasmideos onde o produto de PCR foi integrado por recombinação homóloga. O primer sentido para a amplificação de braço curto incluiu 30 ntd complementares para o vetor pSP72 para permitir este evento de recombinação. A seqüência do primer sentido foi 5' ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGCAGCTGAAGCTTAACCACATGGTGGCT.CACAACC
AT-3' (SEQ ID NO:36) e a seqüência do primer anti-sentido foi 5'-AACGACGGCCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATGCTGCCAGGTGGAGGAGGGC
A-3' (SEQ ID NO:37).
braço longo a partir do locus de gene Beer foi gerado por amplificação de um fragmento de 6,lkb a partir de
121
I t
clone BAC 15G5 com primers que também introdúz*ém’*os*’ Sltlds ·· de enzima de restrição de incisão rara de SgrAI, Fsel, Asei e Pacl. Especificamente, a seqüência do primer sentido foi 5'-ATTACCACCGGTGACACCCGCTTCCTGACAG-3' (SEQ ID NO:38); a seqüência do primer anti-sentido foi 5'-ATTACCACCGGTGACACCCG CTTCCTGACAG-3' (SEQ ID NO:38); a seqüência do primer antisentido foi 5'-ATTACTTAATTAAACATGGCGCGCCAT
ATGGCCGGCCCCTAATTGCGGCGCATCGTTAATT-3' (SEQ ID NO:39). O produto de PCR resultante foi clonado no vetor TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) como uma etapa intermediária.
A construção alvejando gene Beer de camundongo também incluiu um segundo marcador selecionável, o gene timidina cinase de vírus I de herpes simplex (HSVTH) sob o controle de elemento de repetição terminal longo de vírus sarcoma rous (RSV LTR). Expressão deste gene torna células de mamífero sensíveis (e inviáveis) a gancyclovir; ela é por isso um meio conveniente de selecionar contra células resistentes a neomicina onde a construção integrou através de um evento não-homólogo (patente Norte-Americana 5.464.764). O cassete RSVLTR-HSVTK foi amplificado a partir de pPS1337 usando-se primers que permitem subseqüente clonagem nos sítios Fsel e Asei do plasmídeo vetor TA de braço longo. Para esta PCR, a seqüência do primer sentido foi 5'-ATTACGGCCGGCCGCAAAGGAATTCAAGA TCTGA-3' (SEQ ID NO:40); a seqüenciado primer anti-sentido foi 5'ATTACGGCGCGCCCCTCACAGGCCGCACCCAGCT-3' (SEQ ID NO:41).
A etapa final na construção do vetor alvejante envolveu clonagem de fragmento SgrAI-Asei de 8,8 kb contendo
122
ÍS3
Γ: : ·: ·. j · :·: ♦· · ·· ·· · · · · · o braço longo e gene RSVLTR-HSVTK nos sítios ‘SgrÂF’ e‘ Â’sdl ’* do plasmídeo pSP72-braço curto-pgal-PGKneo. Este vetor alvejante foi linearizado por digestão com Asei ou PacI antes de eletroporação em células ES.
EXEMPLO 10
II
Inativação de Beer Mediada Anti - Sentido oligonucleotídeos anti-sentido de 17-nucleotídeos são preparados em um formato de sobreposição, de modo que a extremidade 5' do primeiro oligonucleotídeo sobrepõe a tradução iniciando AUG do transcrito Beer, e as extremidades 5' de sucessivos oligonucleotídeos ocorrem em 5 incrementos de nucleotídeos movendo na direção 5' (até 50 nucleotídeos afastados), em relação a AUG Beer. Correspondentes oligonucleotídeos controles são designados e preparados usando-se equivalente composição de base mas redistribuídos em seqüência para inibir qualquer hibridização significante parra o ARNm codificando. Liberação de reagente para o sistema celular teste é conduzida através de liberação de lipídio catiôníco (P.L,Felgner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413, 1987). 2ug de oligonucleotídeo anti-sentido são adicionados a HOul de meios de soro reduzidos (Opti-MEM I reduced serum media; Life Technologies, Gaithersburg MD) e isto é misturado com reagente Lipofectin (6ul)(Life technologies, Gaitehersburg, MD) nos lOOul de meios de soro reduzidos. Estes são misturados, deixados complexar por 30 minutos em temperatura ambiente e a mistura é adicionada a células MC3T3E21 ou KS483 previamente semeadas. Estas células são cultivadas e o AARNm recuperado. ARNm Beer - é
123 iMO
Figure BRPI9915679B1_D0077
·····.· , : .· .. · .... ·.: ·.· :
com pnmers experimentais caracterizados monitorado usando-se RT-PCR em conjunção específicos Beer. Em adição, cavidades separadas são coletadas e níveis de proteína através de processos de western blot descritos no exemplo 4. As células são colhidas, re-suspensas em tampão de lise (Tris 50mM pH 7,5, NaCl 20mM, EDTA lmM, SDS 1%) e a proteína solúvel coletada. Este material é aplicado a 10-20% gradiente desnaturante SDS PAGE. As proteínas separadas são transferidas para nitrocelulose e western blot conduzida como acima usando-se os reagentes anticorpos escritos. Em paralelo, os oligonucleotídeos controles são adicionados a culturas idênticas e operações experimentais são repetidas. Diminuição em ARNm de Beer ou níveis e proteína são consideradas significantes se o tratamento como oligonucleotídeo anti-sentido resulta em uma mudança de 50% em qualquer exemplo comparado ao oligonucleotídeo misturado controle. Esta metodologia permite seletiva inativação de gene e subseqüente caracterização de fenótipo dos nódulos mineralizados no modelo de cultura de tecido.
• · • · ··
I
124
SEQÜÊNCIAS
Figure BRPI9915679B1_D0078
Figure BRPI9915679B1_D0079
Seqüência ID NO:1: cDNA de BEER humano (região de codificação completa mais URTs 5' e 3').
AGAGCCTGTGCTACTGGAAGGTGGCGTGCCCTCCTCTGGCTGGTACCATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTCGTCTGC
CTGCTGGTACACACAGCCTTCCGTGTAGTGGAGGGCCAGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAATGATGCCACGGAAATCATCCC
CGAGCTCGGAGAGTACCCCGAGCCTCCACCGGAGCTGGAGAACAACAAGACCATGAACCGGGCGGAGAACGGAGGGCGGC
CTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACTTCACCCGCTACGTGACCGAT
GGGCCGTGCCGCAGCGCCAAGCCGGTCACCGAGCTGGTGTGCTCCGGCCAGTGCGGCCCGGCGCGCCTGCTGCCCAACGC
CATCGGCCGCGGCAAGTGGTGGCGACCTAGTGGGCÇCGACTTCCGCTGCATCCCCGACCGCTACCGCGCGCAGCGCGTGC
AGCTGCTGTGTCCCGGTGGTGAGGCGCCGCGCGCGCGCAAGGTGCGCCTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACC
CGCTTCCACAACCAGTCGGAGCTCAAGGACTTCGGGACCGAGGCCGCTCGGCCGCAGAAGGGCCGGAAGCCGCGGCCCCG
CGCCCGGAGCGCCAAAGCCAACCAGGCCGAGCTGGAGAACGCCTACTAGAGCCCGCCCGCGCCCCTCCCCACCGGCGGGC
GCCCCGGCCCTGAACCCGCGCCCCACATTTCTGTCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTATATTTCATTGTAAATGCCTGC
AACCCAGGGCAGGGGGCTGAGACCTTCCAGGCCCTGAGGAATCCCGGGCGCCGGCAAGGCCCCCCTCAGCCGCCCAGCTG
AGGGGTCCCACGGGGCAGGGGAGGGAATTGAGAGTCACAGACACTGAGCCACGCAGCCCCGCCTCTGGGGCCGCCTACCT
TTGCTGGTCCCACTTCAGAGGAGGCAGAAATGGAAGCATTTTCACCGCCCTGGGGTTTTAAGGGAGCGGTGTGGGAGTGG
GAAAGTCCAGGGACTGGTTAAGAAAGTTGGATAAGATTCCCCCTTGCACCTCGCTGCCCATCAGAAAGCCTGAGGCGTGC
CCAGAGCACAAGACTGGGGGCAACTGTAGATGTGGTTTCTAGTCCTGGCTCTGCCACTAACTTGCTGTGTAACCTTGAAC
TACACAATTCTCCTTCGGGACCTCAATTTCCACTTTGTAAAATGAGGGTGGAGGTGGGAATAGGATCTCGAGGAGACTAT
TGGCATATGATTCCAAGGACTCCAGTGCCTTTTGAATGGGCAGAGGTGAGAGAGAGAGAGAGAAAGAGAGAGAATGAATG
CAGTTGCATTGATTCAGTGCCAAGGTCACTTCCAGAATTCAGAGTTGTGATGCTCTCTTCTGACAGCCAAAGATGAAAAA
CAAACAGAAAAAAAAAAGTAAAGAGTCTATTTATGGCTGACATATTTACGGCTGACAAACTCCTGGAAGAAGCTATGCTG
CTTCCCAGCCTGGCTTCCCCGGATGTTTGGCTACCTCCACCCCTCCATCTCAAAGAAATAACATCATCCATTGGGGTAGA
AAAGGAGAGGGTCCGAGGGTGGTGGGAGGGATAGAAATCACATCCGCCCCAACTTCCCAAAGAGCAGCATCCCTCCCCCG
ACCCATAGCCATGTTTTAAAGTCACCTTCCGAAGAGAAGTGAAAGGTTCAAGGACACTGGCCTTGCAGGCCCGAGGGAGC
AGCCATCACAAACTCACAGACCAGCACATCCCTTTTGAGACACCGCCTTCTGCCCACCACTCACGGACACATTTCTGCCT
AGAAAACAGCTTCTTACTGCTCTTACATGTGATGGCATATCTTACACTAAAAGAATATTATTGGGGGAAAAACTACAAGT
GCTGTACATATGCTGAGAAACTGCAGAGCATAATAGCTGCCACCCAAAAATCTTTTTGAAAATCATTTCCAGACAACCTC
125
AAU
Figure BRPI9915679B1_D0080
GGTCGTTTTTTTGGCAATTCTTCCACGTGGGACTTGTCCACAAGAATGAAAGTAGTGGTTTTTAAAGAGTTÍAGTTACAT
ATTTATTTTCTCACTTAAGTTATTTATGCAAAAGTTTTTCTTGrAGAGAATGACAATGTTAATATTGCTTTATGAATTAA
CAGTCTGTTCTTCCAGAGTCCAGAGACATTGTTAATAAAGACAATGAATCATGACCGAAAG
Seqüência ID NO:2:
Proteína BEER Humano (seqüência completa)
MQLPIALCLVCLLVHTAFRWEGQGWQAFKNDATEIIPELGEYPEPPPELENNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDVSEYSC
RELHFTRYVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVR
LVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGTEAARPQKGRKPRPRARSAKANQAELENAY ío Seqüência ID NO:3:
Proteína de BEER humano contendo mutação de Sclerosteosis não-sentido
AGAGCCTGTGCTACTGGAAGGTGGCGTGCCCTCCTCTGGCTGGTACCATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTCGTCTGC
CTGCTGGTACACACAGCCTTCCGTGTAGTGGAGGGCTAGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAATGATGCCACGGAAATCATCCC
CGAGCTCGGAGAGTACCCCGAGCCTCCACCGGAGCTGGAGAACAAÇAAGACCATGAACCGGGCGGAGAACGGAGGGCGGC
CTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACTTCACCCGCTACGTGACCGAT
GGGCCGTGCCGCAGCGCCAAGCCGGTCACCGAGCTGGTGTGCTCCGGCCAGTGCGGCCCGGCGCGCCTGCTGCCCAACGC
CATCGGCCGCGGCAAGTGGTGGCGACCTAGTGGGCCCGACTTCCGCTGCATCCCCGACCGCTACCGCGCGCAGCGCGTGC
AGCTGCTGTGTCCCGGTGGTGAGGCGCCGCGCGCGCGCAAGGTGCGCCTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACC
CGCTTCCACAACCAGTCGGAGCTCAAGGACTTCGGGACCGAGGCCGCTCGGCCGCAGAAGGGCCGGAAGCCGCGGCCCCG
0 CGCCCGGAGCGCCAAAGCCAACCAGGCCGAGCTGGAGAACGCCTACTAGAGCCCGCCCGCGCCCCTCCCCACCGGCGGGC
GCCCCGGCCCTGAACCCGCGCCCCACATTTCTGTCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTATATTTCATTGTAAATGCCTGC
AACCCAGGGCAGGGGGCTGAGACCTTCCAGGCCCTGAGGAATCCCGGGCGCCGGCAAGGCCCCCCTCAGCCCGCCAGCTG
AGGGGTCCCACGGGGCAGGGGAGGGAATTGAGAGTCACAGACACTGAGCCACGCAGCCCCGCCTCTGGGGCCGCCTACCT
TTGCTGGTCCCACTTCAGAGGAGGCAGAAATGGAAGCATTTTCACCGCCCTGGGGTTTTAAGGGAGCGGTGTGGGAGTGG
5 GftAAGTCCAGGGACTGGTTAAGAAAGTTGGATAAGATTCCCCCTTGCACCTCGCTGCCCATCAGAAAGCCTGAGGCGTGC
CCAGAGCACAAGACTGGGGGCAACTGTAGATGTGGTTTCTAGTCCTGGCTCTGCCACTAACTTGCTGTGTAACCTTGAAC
126
Figure BRPI9915679B1_D0081
113 * · · ·*·» ·· υ ‘2 2 2 · * · r* · »Χ ·2 · ·· ·ν <* · ν ’ · »<- ·’ ηϊ- ···,·· ’
TACACAATTCTCCTTCGGGACCTCAATTTCCACTTTGTAAAATGAGGGTGGAGGTGGGAATAGGATCTCGAGGÀGACTAb r ’
TGGCATATGATTCCAAGGACTCCAGTGCCTTTTGAATGGGCAGAGGTGft.GAGAGAGAGAGAGAAAGAGAGAGAATGAATG
CAGTTGCATTGATTCAGTGCCAAGGTCACTTCCAGAATTCAGAGTTGTGATGCTCTCTTCTGACAGCCAAAGATGAAAAA
CAAACAGAAAAAAAAAAGTAAAGAGTCTATTTATGGCTGACATATTTACGGCTGACAAACTCCTGGAAGAAGCTATGCTG
CTTCCCAGCCTGGCTTCCCCGGATGTTTGGCTACCTCCACCCCTCCATCTCAAAGAAATAACATCATCCATTGGGGTAGA
AAAGGAGAGGGTCCGAGGGTGGTGGGAGGGATAGAAATCACATCCGCCCCAACTTCCCAAAGAGCAGCATCCCTCCCCCG
ACCCATAGCCATGTTTTAAAGTCACCTTCCGAAGAGAAGTGAAAGGTTCAAGGACACTGGCCTTGCAGGCCCGAGGGAGC
AGCCATCACAAACTCACAGACCAGCACATCCCTTTTGAGACACCGCCTTCTGCCCACCACTCACGGACACATTTCTGCCT
AGAAAACAGCTTCTTACTGCTCTTACATGTGATGGCATATCTTACACTAAAAGAATATTATTGGGGGAAAAACTACAAGT
GCTGTACATATGCTGAGAAACTGCAGAGCATAATAGCTGCCACCCAAAAATCTTTTTGAAAATCATTTCCAGACAACCTC
TTACTTTCTGTGTAGTTTTTAATTGTTAAAAAAAAAAAGTTTTAAACAGAAGCACATGAGATATGAAAGCCTGCAGGACT
GGTCGTTTTTTTGGCAATTCTTCCACGTGGGACTTGTCCACAAGAATGAAAGTAGTGGTTTTTAAAGAGTTAAGTTACAT
ATTTATTTTCTCACTTAAGTTATTTATGCAAAAGTTTTTCTTGTAGAGAATGACAATGTTAATATTGCTTTATGAATTAA
CAGTCTGTTCTTCCAGAGTCCAGAGACATTGTTAATAAAGACAATGAATCATGACCGAAAG
Seqüência ID NO:4: Proteína de BEER humano truncada a partir de Sclerosteosis
MQLPLALC1VCLLVHTAFHJ7VEG*
I
Seqüência ID NO:5: cDNA de BEER humano codificando variante de proteína (VI01)
0 AGAGCCTGTGCTACTGGAAGGTGGCGTGCCCTCCTCTGGCTGGTACCATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTCATCTGC
CTGCTGGTACACACAGCCTTCCGTGTAGTGGAGGGCCAGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAATGATGCCACGGAAATCATCCG
CGAGCTCGGAGAGTACCCCGAGCCTCCACCGGAGCTGGAGAACAACAAGACCATGAACCGGGCGGAGAACGGAGGGCGGC
CTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACTTCACCCGCTACGTGACCGAT
GGGCCGTGCCGCAGCGCCAAGCCGGTCACCGAGCTGGTGTGCTCCGGCCAGTGCGGCCCGGCGCGCCTGCTGCCCAACGC
5 CATCGGCCGCGGCAAGTGGTGGCGACCTAGTGGGCCCGACTTCCGCTGCATCCCCGACCGCTACCGCGCGCAGCGCGTGC
AGCTGCTGTGTCCCGGTGGTGAGGCGCCGCGCGCGCGCAAGGTGCGCCTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACC
127
1^4 cgcttccacaaccagtcggagctcaaggacttcgggaccgaggccgctCggcôgcAszXgggccggaÂgccgcggccccg
CGCCCGGAGCGCGAAAGCCAACCAGGCCGAGCTGGAGAACGCCTACTAGAGCCCGCCCGCGCCCCTCCCCACCGGCGGGC
GCCCCGGCCCTGAACCCGCGCCCCACATTTCTGTCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTATATTTCATTGTAAATGCCTGC
AACCCAGGGCAGGGGGCTGAGACCTTCCAGGCCCTGAGGAATCCCGGGCGCCGGCAAGGCCCCCCTCAGCCCGCCAGCTG
AGGGGTCCCACGGGGCAGGGGAGGGAATTGAGAGTCACAGACACTGAGCCACGCAGCCCCGCCTCTGGGGCCGCCTACCT
TTGCTGGTCCCACTTCAGAGGAGGGAGAAATGGAAGCATTTTGACCGCCCTGGGGTTTTAAGGGAGCGGTGTGGGAGTGG
GAAAGTCCAGGGACTGGTTAAGAAAGTTGGATAAGATTCCCCCTTGCACCTCGCTGCCCATCAGAAAGCCTGAGGCGTGC
CCAGAGCACAAGACTGGGGGCAACTGTAGATGTGGTTTCTAGTCCTGGCTCTGCCACTAACTTGCTGTGTAACCTTGAAC
TACACAATTCTCCTTCGGGACCTCAATTTCCACTTTGTAAAATGAGGGTGGAGGTGGGAATAGGATCTCGAGGAGACTAT
TGGCATATGATTCCAAGGACTCCAGTGCCTTTTGAATGGGCAGAGGTGAGAGAGAGAGAGAGAAAGAGAGAGAATGAATG
CAGTTGCATTGATTCAGTGCCAAGGTCACTTCCAGAATTCAGAGTTGTGATGCTCTCTTCTGACAGCCAAAGATGAAAAA
CAAACAGAAAAAAAAAAGTAAAGAGTCTATTTATGGCTGACATATTTACGGCTGACAAACTCCTGGfiAGAAGCTATGCTG cttcccagcctggcttccccggatgtttggctacctccacccctccatctcaaagaaataacatcatccattggggtaga
AAAGGAGAGGGTCCGAGGGTGGTGGGAGGGATAGAAATCACATCCGCCCCAACTTCCCAAAGAGCAGCATCCCTCCCCCG
ACCCATAGCCATGTTTTAAAGTCACCTTÇCGAAGAGAAGTGAAAGGTTCAAGGAGACTGGCCTTGCAGGCCCGAGGGAGC
AGCCATCACAAACTCACAGACCAGCACATCCCTTTTGAGACACCGCCTTCTGCCCACCACTCACGGACACATTTCTGCCT
AGAAAACAGCTTCTTACTGCTCTTACATGTGATGGCATATCTTACACTAAAAGAATATTATTGGGGGAAAAACTACAAGT
GCTGTACATATGCTGAGAAACTGCAGAGCATAATAGCTGCCACCCAAAAATCTTTTTGAAAATCATTTCCAGACAACCTC
TTACTTTCTGTGTAGTTTTTAATTGTTAAAAAAAAAAAGTTTTAAACAGAAGCACATGACATATGAAAGCCTGCAGGACT
GGTCGTTTTTTTGGCAATTCTTCCACGTGGGACTTGTCCACAAGAATGAAAGTAGTGGTTTTTAAftGAGTTAAGTTACAr
ATTTATTTTCTCACTTAAGTTATTTATGCAAAAGTTTTTCTTGTAGAGAATGAGAATGTTAATATTGCTTTATGAATTAA
CAGTCTGTTCTTCCAGAGTCCAGAGACATTGTTAATAAAGACAATGAATCATGACCGAAAG
Seqüência ID NO: 6: Variante de proteína de BEER humano (V10I)
MQLPLALCLICLLVHTAFRWEGQGWQAFKNDATEIIRELGEyPEPPPELENNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDVSEYSC
RELHFTRYVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVR
LVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGTEAARPQKGRKPRPRARSAKANQAELENAY
128
Ü5
BEER
Híimand codificando
Seqüência ID NO:7: cDNA de variante de proteína (P38R)
AGAGCCTGTGCTACTGGAAGGTGGCGTGCCCTCCTCTGGCTGGTACCATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTCGTCTGC
CTGCTGGTACACACAGCCTTCCGTGTAGTGGAGGGCCAGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAATGATGCCACGGAAArCArCCG
CGAGCTCGGAGAGTACCCCGAGCCTCCACCGGAGCTGGAGAACAACAAGACCATGAACCGGGCGGAGAACGGAGGGCGGC
CTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACTTCACCCGCTACGTGACCGAT
GGGCCGTGCCGCAGCGCCAAGCCGGTCACCGAGCTGGTGTGCTCCGGCCAGTGCGGCCCGGCGCGCCTGCTGCCCAACGC
CATCGGCCGCGGCAAGTGGTGGCGACCTAGTGGGCCCGACTTCCGCTGCATCCCCGACCGCTACCGCGCGCAGCGCGTGC
AGCTGCTGTGTCCCGGTGGTGAGGCGCCGCGCGCGCGCAAGGTGCGCCTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACC
CGCTTCCACAACCAGTCGGAGCTCAAGGACTTCGGGACCGAGGCCGCTCGGCCGCAGAAGGGCCGGAAGCCGCGGCCCCG
CGCCCGGAGCGCCAAAGCCAACCAGGCCGAGCTGGAGAACGCCTACTAGAGCCCGCCCGCGCCCCTCCCCACCGGCGGGC
GCCCCGGCCCTGAACCCGCGCCCCACATTTCTGTCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTATATTTCATTGTAAATGCCTGC
AACCCAGGGCAGGGGGCTGAGACCTTCCAGGCCCTGAGGAATCCCGGGCGCCGGCAAGGCCCCCCTCAGCCCGCCAGCTG
AGGGGTCCCACGGGGCAGGGGAGGGAATTGAGAGTCACAGACACTGAGCCACGCAGCCCCGCCTCTGGGGCCGCCTACCT
TTGCTGGTCCCACTTCAGAGGAGGCAGAAATGGAAGCATTTTCACCGCCCTGGGGTTTTAAGGGAGCGGTGTGGGAGTGG
GAAAGTCCAGGGACTGGTTAAGAAAGTTGGATAAGATTCCCCCTTGCACCTCGCTGCCCATCAGAAAGCCTGAGGCGTGC
CCAGAGCACAAGACTGGGGGCAACTGTAGATGTGGTTTCTAGTCCTGGCTCTGCCACTAACTTGCTGTGTAACCTTGAAC
TACACAATTCTCCTTCGGGACCTCAATTTCCACTTTGTAAAATGAGGGTGGAGGTGGGAATAGGATCTCGAGGAGACTAT
TGGCATATGATTCCAAGGACTCCAGTGCCTTTTGAATGGGCAGAGGTGAGAGAGAGAGAGAGAAAGAGAGAGAATGAATG
CAGTTGCATTGATTCAGTGCCAAGGTCACTTCCAGAATTCAGAGTTGTGATGCTCTCTTCTGACAGCCAAAGATGAAAAA
CAAACAGAAAAAAAAAAGTAAAGAGTCTATTTATGGCTGACATATTTACGGCTGACAAACTCCTGGAAGAAGCTATGCTG
CTTCCCAGCCTGGCTTCCCCGGATGTTTGGCTACCTCCACCCCTCCATCTCAAAGAAATAACATCATCCATTGGGGIAGA
AAAGGAGAGGGTCCGAGGGTGGTGGGAGGGATAGAAATCACATCCGCCCCAACTTCCCAAAGAGCAGCATCCCTCCCCCG
ACCCATAGCCATGTTTTAAAGTCACCTTCCGAAGAGAAGTGAAAGGTTCAAGGACACTGGCCTTGCAGGCCCGAGGGAGC
AGCCATCACAAACTCACAGACCAGCACATCCCTTTTGAGACACCGCCTTCTGCCCACCACTCACGGACACATTTCTGCCT
AGAAAACAGCTTCTTACTGCTCTTACATGTGATGGCATATCTTACACTAAAAGAATATTATTGGGGGAAAAACTACAAGT
GCTGTACATATGCTGAGAAACTGCAGAGCATAATAGCTGCCACCCAAAAATCTTTTTGAAAATCATTTCCAGACAACCTC
TTACTTTCTGTGTAGTTTTTAATTGTTAAAAAAAAAAAGTTTTAAACAGAAGCACATGACATATGAAAGCCTGCAGGACT
129 ±#e
GGTCGTTTTTTTGGCAATTCTTCCACGTGGGACTTGTCCACAAGAATG?ÕV\GÍAGTGGTTTTTAAAGAGTTAAGTTACAT
ATTTATTTTCTCACTTAAGTTATTTATGCAAAAGTTTTTCTTGTAGAGAATGACAATGTTAATATTGCTTTATGAATTAA
CAGTCTGTTCTTCCAGAGTCCAGAGACATTGTTAATAAAGACAATGAATCATGACCGAAAG
Seqüência ID NO:8 5 (P38JR)
Variante de proteína de BEER humano
MQLPIALCLVCLLVHTAFRVVEGQGWQAFKNDATEIIRELGEYPEPPPELENNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDVSEYSC
RELHFTRYVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVR
LVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGTEAARPQKGRKPRPRARSAKANQAELENAY
Seqüência ID NO: 9: cDNA de BEER Vervet (região de colo dificação completa)
ATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTTGTCTGCCTGCTGGTACAGGCAGCCTTCCGTGTAGTGGAGGGCCAGGGGTGGCA
GGCCTTCAAGAATGATGCCACGGAAATCATCCCCGAGCTCGGAGAGTACCCCGAGCCTCCACCGGAGCTGGÍAGAACAACA
AGACCATGAACCGGGCGGAGAATGGAGGGCGGCCTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGC
CGAGAGCTGCACTTCACCCGCTACGTGACCGATGGGCCGTGCCGCAGCGCCAAGCCAGTCACCGAGTTGGTGTGCTCCGG
CCAGTGCGGCCCGGCACGCCTGCTGCCCAACGCCATCGGCCGCGGCAAGTGGTGGCGCCCGAGTGGGCCCGACTTCCGCT
GCATCCCCGACCGCTACCGCGCGCAGCGTGTGCAGCTGCTGTGTCCCGGTGGTGCCGCGCCGCGCGCGCGCAAGGTGCGC
CTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTGACCCGCTTCCACAACCAGTCGGAGCTCAAGGACTTCGGTCCCGAGGCCGC
TCGGCCGCAGAAGGGCCGGAAGCCGCGGCCCCGCGCCCGGGGGGCCAAAGCCAATCAGGCCGAGCTGGAGAACGCCTACT
AG
Seqüência ID NO:10: Proteína de BEER Vervet (seqüência completa)
MQLPLALCLVCLLVHAAFRWEGQGWQAFKNDATEIIPELGEYPEPPPELENNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDVSEYSC
RELHFTRYVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRGKWWRPGGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGAAPRARKVR
LVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGPEAAEPQKGRKPRPRARGAKANQAELENAY
130
114 . · · :·· .·* **
Seqüência ID NO:11: região de codificação) de
CDNA de BEER ♦ · · · 2 · · · · ·· •••J ······ · câmüncfôngo (somente
ATGCAGCCCTCACTAGCCCCGTGCCTCATCTGCCTACTTGTGCACGCTGCCTTCTGTGCTGTGGAGGGCCAGGGGTGGCA
AGCCTTCAGGAATGATGCCACAGAGGTCATCCCAGGGCTTGGAGAGTACCCCGAGCCTCCTCCTGAGAACAACCAGACCA
TGAACCGGGCGGAGAATGGAGGCAGACCTCCCCACCATCCCTATGACGCCAAAGGTGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAG
CTGCACTACACCCGCTTCCTGACAGACGGCCCATGCCGCAGCGCCAAGCCGGTCACCGAGTTGGTGTGCTCCGGCCAGTG
CGGCCCCGCGCGGCTGCTGCCCAACGCCATCGGGCGCGTGAAGTGGTGGCGCCCGAACGGACCGGATTTCCGCTGCATCC
CGGATCGCTACCGCGCGCAGCGGGTGCAGCTGCTGTGCCCCGGGGGCGCGGCGCCGCGCTCGCGCAAGGTGCGTCTGGTG
GCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACCCGCTTCCACAACCAGTCGGAGCTCAAGGACTTCGGGCCGGAGACCGCGCGGCC
GCAGAAGGGTCGCAAGCCGCGGCCCGGCGCCCGGGGAGCCAAAGCCAACCAGGCGGAGCTGGAGAACGCCTACTAGAG
Seqüência ID NO:12: Proteína de BEER de camundongo (seqüência completa)
MQPSLAPCLICLLVHAAFCAVEGQGWQAFRNDATEVIPGLGEYPEPPPENNQTMNRAENGGRPPHHPYDAKDVSEYSCRE
LHYTRFLTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFRCIPDRYRSQRVQLLCPGGAAPRSRKVRLV
ASCKCKRLTRFHNQSELKDFGPETARPQKGRKPRPGARGAKANQAELENAY
Seqüência ID NO: 13: cDNA de BEER de rato (região de codificação completa mais UTR 5')
GAGGACCGAGTGCCCTTCCTCCTTCTGGCACCATGCAGCTCTCACTAGCCCCTTGCCTTGCCTGCCTGCTTGTACATGCA
GCCTTCGTTGCTGTGGAGAGCCAGGGGTGGCAAGCCTTCAAGAATGATGCCACAGAAATCATCCCGGGACTCAGAGAGTA
0 CCCAGAGCCTCCTCAGGAACTAGAGAACAACCAGACCATGAACCGGGCCGAGAACGGAGGCAGACCCCCCCACCATCCTT
ATGACACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACTACACCCGCTTCGTGACCGACGGCCCGTGCCGCAGT
GCCAAGCCGGTCACCGAGTTGGTGTGCTCGGGCCAGTGCGGCCCCGCGCGGCTGCTGCCCAACGCCATCGGGCGCGTGAA
GTGGTGGCGCCCGAACGGACCCGACTTCCGCTGCATCCCGGATCGCTACCGCGCGCAGCGGGTGCAGCTGCTGTGCCCCG
GCGGCGCGGCGCCGCGCTCGCGCAAGGTGCGTCTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACCCGCTTCCACAACCAG
5 TCGGAGCTCAAGGACTTCGGACCTGAGACCGCGCGGCCGCAGAAGGGTCGCAAGCCGCGGCCCCGCGCCCGGGGAGCCAA
131
Γ48
Figure BRPI9915679B1_D0082
AGCCAACCAGGCGGAGCTGGAGAACGCCTACTAG
Seqüência ID NO:14: Proteína de BEER de rato (seqüência completa)
MQLSLAPCLACLLVHAAFVAVESQGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPPQELENNQTMNRAENGGRPPHHPYDTKDVSEYSC
RELHYTREVTDGPCRSAKPVTELVCS GQCGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDERCIPDRYRAQRVQLLCPGGAAPRSRKVR
LVASCKCKRLTRFHNQSELKDFPETARPQKGRKPRP-RARGAKANQAELENAY
Seqüência ID NO:15: cDNA de BEER bovino (seqüência de codificação parcial)
AGAATGATGCCACAGAAATCATCCCCGAGCTGGGCGAGTACCCCGAGCCTCTGCCAGAGCTGAACAACAAGACCATGAAC
CGGGCGGAGAACGGAGGGAGACCTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGCCTCCGAGTACAGCTGCCGGGAGCTGCA
CTTCACCCGCTACGTGACCGATGGGCCGTGCCGCAGCGCCAAGCCGGTCACCGAGCTGGTGTGCTCGGGCGAGTGCGGCC
CGGCGCGCCTGCTGCCCAACGCCATCGGCCGCGGCAAGTGGTGGCGCCCAAGCGGGCCCGACTTCCGCTGCATCCCCGAC
CGCTACCGCGCGCAGCGGGTGCAGCTGTTGTGTCCTGGCGGCGCGGCGCCGCGCGCGCGCAAGGTGCGCCTGGTGGCCTC
GTGCAAGTGCAAGCGCCTCACTCGCTTCCACAACCAGTCCGAGCTCAAGGACTTCGGGCCCGAGGCCGCGCGGCCGCAAA
CGGGCCGGAAGCTGCGGCCCCGCGCCCGGGGCACCAAAGCCAGCCGGGCCGA
Seqüência ID NO:16: Proteína de BEER bovino (seqüência parcial - faltando a seqüência de sinal e 6 últimos resíduos)
NDATEIIPELGEYPEPLPELNNKTMNRAENGGRPPHHPDETKDASEYSCRELHFTRYVTDGPCRSAKPCTELVCSGQCGP
ARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGAAPRARKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELKDPGPEAARPQT
GRKLRPRARGTKSRA
Seqüência ID NO:17: Fragmento de restrição MluI - AvilI usado para jfazer trangênico de BEER de camundongo
CGCGTTTTGGTGAGCAGCAATATTGCGCTTCGATGAGCCTTGGCGTTGAGATTGATACCTCTGCTGCACAAAAGGCAATC
GACCGAGCTGGACCAGCGCATTCGTGACACCGTCTCCTTCGAACTTATTCGCAATGGAGTGTCATTCATCAAGGACNGCC
132
143
..... .· :·· .·· ··: . · : : : *· *·· ’·’· ·* ’·:
;· · .:· ..· ·.· ··· : ··
TGATCGCAAATGGTGCTATCCACGCAGCGGCAATCGAAAACCCTCAGCCGGTGACC7\ATATCTACAACATCAGCCTTGGT
ATCCTGCGTGATGAGCCAGCGCAGAACAAGGTAACCGTCAGTGCCGATAAGTTCAAAGTTAAACCTGGTGTTFATACCAA
CATTGAAACGTTGATCGAAAACGCGCTGAAAAACGCTGCTGAATGTGCGGCGCTGGATGTCACAAAGCAAATGGCAGCAG
ACAAGAAAGCGATGGATGAACTGGCTTCCTATGTCCGCACGGCCATCATGATGGAATGTTTCCCCGGTGGTGTTATCTGG
CAGCAGTGCCGTCGATAGTATGCAATTGATAATTATTATCATTTGCGGGTCCTTTCCGGCGATCCGCCTTGTTACGGGGC
GGCGACCTCGCGGGTTTTCGCTATTTATGAAAATTTTCCGGTTTAAGGCGTTTCCGTTCTTCTTCGTCATAACTTAATGT
TTTTATTTAAAATACCCTCTGAAAAGAAAGGAAACGACAGGTGCTGAAAGCGAGCTTTTTGGCCTCTGTCGTTTCCTTTC
TCTGTTTTTGTCCGTGGAATGAACAATGGAAGTCAACAAAAAGCAGAGCTTATCGATGATAAGCGGTCAAACATGAGAAT
TCGCGGCCGCATAATACGACTCACTATAGGGATCGACGCCTACTCCCCGCGCATGAAGCGGAGGAGCTGGACTCCGCATG
CCCAGAGACGCCCCCCAACCCCCAAAGTGCCTGACCTCAGCCTCTACCAGCTCTGGCTTGGGCTTGGGCGGGGTCAAGGC
TACCACGTTCTCTTAACAGGTGGCTGGGCTGTCTCTTGGCCGCGCGTCATGTGACAGCTGCCTAGTTCTGCAGTGAGGTC
ACCGTGGAATGTCTGCCTTCGTTGCCATGGCAACGGGATGACGTTACAATCTGGGTGTGGAGCTTTTCTTGTCCGTGTCA ggaaatccaaataccctaaaataccctagaagaggaagtagctgagccaaggctttcctggcttctccagataaagtttg
ACTTAGATGGAAAAAAACAAAATGATAAAGACCCGAGCCATCTGAAAATTCCTCCTAATTGCACCACTAGGAAATGTGTA
TATTATTGAGCTCGTATGTGTTCTTATTTTAAAAAGAAAACTTTAGTCATGTTATTAATAAGAATTTCTCAGCAGTGGGA
GAGAACCAATATTAACACCAAGATAAAAGTTGGCATGATCCACATTGCAGGAAGATCCACGTTGGGTTTTCATGAATGTG aagaccccatttattaaagtcctaagctctgtttttgcacactaggaagcgatggccgggatggctgaggggctgtaagg atctttcaatgtcttacatgtgtgtttcctgtcctgcacctaggacctgctgcctagcctgcagcagagccagaggggtt
TCACATGATTAGTCTCAGACACTTGGGGGCAGGTTGCATGTACTGCATCGCTTATTTCCATACGGAGCACCTACTATGTG
0 TCAAACACCATATGGTGTTCACTCTTCAGAACGGTGGTGGTCATCATGGTGCATTTGCTGACGGTTGGATTGGTGGTAGA
GAGCTGAGATATATGGACGCACTCTTCAGCATTCTGTCAACGTGGCTGTGCATTCTTGCTCCTGAGCAAGTGGCTAAACA
GACTCACAGGGTCAGCCTCCAGCTCAGTCGCTGCATAGTCTTAGGGAACCTCTCCCAGTCCTCCCTACCTCAACTATCCA
AGAAGCCAGGGGGCTTGGCGGTCTCAGGAGCCTGCTTGCTGGGGGACAGGTTGTTGAGTTTTATCTGCAGTAGGTTGCCT
AGGCATAGTGTCAGGACTGATGGCTGCCTTGGAGAACACATCCTTTGCCCTCTATGCAAATCTGACCTTGACATGGGGGC
5 GCTGCTCAGCTGGGAGGATCAACTGCATACCTAAAGCCAAGCCTAAAGCTTCTTCGTCCACCTGAAACTCCTGGACCAAG
GGGCTTCCGGCACATCCTCTCAGGCCAGTGAGGGAGTCTGTGTGAGCTGCACTTTCCAATCTCAGGGCGTGAGAGGCAGA
GGGAGGTGGGGGCAGAGCCTTGCAGCTCTTTCCTCCCATCTGGACAGCGCTCTGGCTCAGCAGCCCATATGAGCACAGGC
ACATCCCCACCCCACCCCCACCTTTCCTGTCCTGCAGAATTTAGGCTCTGTTCACGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCAGAGG
133
Figure BRPI9915679B1_D0083
. . · · ··· *· · ί . .
’· *s :’· ·’· ·’ r : .:· ..· .·.· ··· ’·’: TATCCTCTCTTAGGTAGACAGGACTCTGCAGGAGACACTGCTTTGTAAGATACTGCAGTTT7KAATTTGGATGTTGTGAGG
GGAAAGCGAAGGGCCTCTTTGACCATTCAGTCAAGGTACCTTCTAACTCCCATCGTATTGGGGGGCTACTCTAGTGCTAG
ACATTGCAGAGAGCCTCAGAACTGTAGTTACCAGTGTGGTAGGATTGATCCTTCAGGGAGCCTGACATGTGACAGTTCCA
TTCTTCACCCAGTCACCGAACATTTATTCAGTACCTACCCCGTAACAGGCACCGTAGCAGGTACTGAGGGACGGACCACT
CAAAGAACTGACAGACCGAAGCCTTGGAATATAAACACCAAAGCATCAGGCTCTGCCAACAGAACACTCTTTAACACTCA
GGCCCTTTAACACTCAGGACCCCCACCCCCACCCCAAGCAGTTGGCACTGCTATCCACATTTTACAGAGAGGAAAAACTA
GGCACAGGACGATATAAGTGGCTTGCTTAAGCTTGTCTGCATGGTAAATGGCAGGGCTGGATTGAGACCCAGACATTCCA
ACTCTAGGGTCTATTTTTCTTTTTTCTCGTTGTTCGAATCTGGGTCTIACTGGGTAAACTCAGGCTAGCCTCACACTCAT
ATCCTTCTCCCATGGCTTACGAGTGCTAGGATTCCAGGTGTGTGCTACCATGTCTGACTCCCTGTAGCTTGTCTATACCA
TCCTCACAACATAGGAATTGTGATAGCAGCACACACACCGGAAGGAGCTGGGGAAATCCCACAGAGGGCTCCGCAGGATG
ACAGGCGAATGCCTACACAGAAGGTGGGGAAGGGAAGCAGAGGGAACAGCATGGGCGTGGGACCACAAGTCTATTTGGGG
AAGCTGCCGGTAACCGTATATGGCTGGGGTGAGGGGAGAGGTCATGAGATGAGGCAGGftAGAGCCACAGCAGGCAGCGGG tacgggctccttattgccaagaggctcggatcttcctcctcttcctccttccggggctgcctgttcattttccaccactg
CCTCCCATCCAGGTCTGTGGCTCAGGACATCACCCAGCTGCAGAAACTGGGCATCACCCACGTÇCTGAATGCTGCCGAGG
GCAGGTCCTTCATGCACGTCAACACCAGTGCTAGCTTCTACGAGGATTCTGGCATCACCTACTTGGGCATCAAGGCCAAT
GATACGCAGGAGTTCAACCTCAGTGCTTACTTTGAAAGGGCCACAGATTTCATTGACCAGGCGCTGGCCCATAAAAATGG
TAAGGAACGTACATTCCGGCACCCATGGAGCGTAAGCCCTCTGGGACCTGCTTCCTCCAAAGAGGCCCCCACTTGAAAAA
GGTTCCAGAAAGATCCCAAAATATGCCACCAACTAGGGATTAAGTGTCCTACATGTGAGCCGATGGGGGCCACTGCATAT
AGTCTGTGCCATAGACATGACAATGGATAATAATATTTCAGACAGAGAGCAGGAGTTAGGTAGCTGTGCTCCTTTCCCTT
TAATTGAGTGTGCCCATTTTTTTATTCATGTATGTGTATACATGTGTGTGCACACATGCCATAGGTTGATACTGAACACC
GTCTTCA&TCGTTCCCCACCCCACCTTATTTTTTGAGGCAGGGTCTCTTCCCTGATCCTGGGGCTCATTGGTTTATCTAG
GCTGCTGGCCAGTGAGCTCTGGAGTTCTGCTTTTCTCTACCTCCCTAGCCCTGGGACTGCAGGGGCATGTGCTGGGCCAG
GCTTTTATGTCGCGTTGGGGATCTGAACTTAGGTCCCTAGGCCTGAGCACCGTAAAGACTCTGCCACATCCCCAGCCTGT
TTGAGGAAGTGAACCATTCCCCAGAATTCCCCCAGTGGGGCTTTCCTACCCTTTTATTGGCTAGGCATTCATGAGTGGTC
ACCTCGCCAGAGGAATGAGTGGCCACGACTGGCTCAGGGTCAGCAGCCTAGAGATACTGGGTTAAGTCTTCCTGCCGCTC gctccctgcagccgcagacagaaagtaggactgaatgagagctggctagtggtcagacaggacagarggctgagagggtc
ACAGGGCAGATGTCAGCAGAGCAGACAGGTTCTCCCTCTGTGGGGGAGGGGTGGCCCACTGCAGGTGTAATTGGCCTTCT
180
TTGTGCTCCATAGAGGCTTCCTGGGTACACAGCAGCTTCCCTGTCCTGGTGATTCCCAAAGAGAACTCCCTACCACTGGA
134
Figure BRPI9915679B1_D0084
• · ·· ·· ♦·· · ·
CTTACAGAAGTTCTATTGACTGGTGTAACGGTTCAACAGCTTTGGCTCTTGGTGGACGGTGCATACTGCTGTATCAGCTC
AAGAGCTCATTCACGAATGAACACACACACACACACACACACACACACACACACAAGCTAATTTTGATATGCCTTAACTA
GCTCAGTGACTGGGCATTTCTGAACATCCCTGAAGTTAGCACACATTTCCCTCTGGTGTTCCTGGCTTAACACCTTCTAA
ATCTATATTTTATCTTTGCTGCCCTGTTACCTTCTGAGAAGCCCCTAGGGCCACTTCCCTTCGCACCTACATTGCTGGAT
GGTTTCTCTCCTGCAGCTCTTAAATCTGATCCCTCTGCCTCTGAGCCATGGGAACAGCCCAATAACTGAGTTAGACATAA
AAACGTCTCTAGCCAAAACTTCAGCTAAATTTAGACAATAAATCTTACTGGTTGTGGAATCCTTAAGATTCTTCATGACC
TCCTTCACATGGCACGAGTATGAAGCTTTATTACAATTGTTTATTGATCAAACTAACTCATAAAAAGCCAGTTGTCTTTC
ACCTGCTCAAGGAAGGAACAAAATTCATCCTTAACTGATCTGTGCACCTTGCACAATCCATACGAATATCTTAAGAGTAC
TAAGATTTTGGTTGTGAGAGTCACATGTTACAGAATGTACAGCTTTGACAAGGTGCATCCTTGGGATGCCGAAGTGACCT
GCTGTTCCAGCCCCCTACCTTCTGAGGCTGTTTTGGAAGCAATGCTCTGGAAGCAACTTTAGGAGGTAGGATGCTGGAAC
AGCGGGTCACTTCAGCATCCCGATGACGAATCCCGTCAAAGCTGTACATTCTGTAACAGACTGGGAAAGCTGCAGACTTT
AAGGCCAGGGCCCTATGGTCCCTCTTAATCCCTGTCACACCCAACCCGAGCCCTTCTCCTCCAGCCGTTCTGTGCTTCTC
ACTCTGGATAGATGGAGAACACGGCCTTGCTAGTTAAAGGAGTGAGGCTTCACCCTTCTGACATGGGAGTGGTTGGTCAT
CCTCATTCAGGGAACTCTGGGGCATTCTGCCTTTACTTCCTCTTTTTGGACTACAGGGAATATATGCTGACTTGTTTTGA
CCTTGTGTATGGGGAGACTGGATCTTTGGTCTGGAATGTTTCCTGCTAGTTTTTCCCCATCCTTTGGCAAACCCTATCTA
TATCTTACCACTAGGCATAGTGGCCCTCGTTCTGGAGCCTGCCTTCAGGCTGGTTCTCGGGGACCATGTCCCTGGTTTCT
CCCCAGCATATGGTGTTCACAGTGTTCACTGCGGGTGGTTGCTGAACAAAGCGGGGATTGCATCCCAGAGCTCCGGTGCC
TTGTGGGTACACTGCTAAGATAAAATGGATACTGGCCTCTCTCTGACCACTTGCAGAGCTCTGGTGCCTTGTGGGTACAC
TGCTAAGATAAAATGGATACTGGCCTCTCTCTATCCACTTGCAGGACTCTAGGGAACAGGAATCCATTACTGAGAAAACC
AGGGGCTAGGAGCAGGGAGGTAGCTGGGCAGCTGAAGTGCTTGGCGACTAACCAATGAATACCAGAGTTTGGATCTCTAG
AATACTCTTAAAATCTGGGTGGGCAGAGTGGCCTGCCTGTAATCCCAGAACTCGGGAGGCGGAGACAGGGAATCMCAGA
GCAAACTGGCTAACCAGAATAGCAAAACACTGAGCTCTGGGCTCTGTGAGAGATCCTGCCTTAACATATAAGAGAGAGAA
TAAAAGATTGAA.GAAGACAGTAGATGCCAATTTTAAGCCCCCACATGCACATGGACAAGTGTGCGTTTGAACACACATAT
GCACTCATGTGAACCAGGCATGCACACTCGGGCTTATCACACACATAATTTGAAAGAGAGAGTGAGAGAGGAGAGTGCAC
ATTAGAGTTCACAGGAAAGTGTGAGTGAGCACACCCATGCACACAGACATGTGTGCCAGGGAGTAGGAAAGGAGCCTGGG tttgtgtataagagggagccatcatgtgtttctaaggagggcgtgtgaaggaggcgttgtgtgggctgggactggagcat
GGTTGTAACTGAGCATGCTCCCTGTGGGAAACAGGAGGGTGGCCACCCTGCAGAGGGTCCCACTGTCCAGCGGGATCAGT
AAAAGCCCCTGCTGAGAACTTTAGGTAATAGCCAGAGAGAGAAAGGTAGGAAAGTGGGGGGACTCCCATCTCTGATGTAG
135
Figure BRPI9915679B1_D0085
; ; ..- .. ........
GAGGATCTGGGCAAGTAGAGGTGCGTTTGAGGTAGAAAGAGGGGTGCAGAGGAGATGCTCTTAATTCTGGGTCAGCAGTT
TCTTTCCAAATAATGCCTGTGAGGAGGTGTAGGTGGTGGCCATTCACTCACTCAGCAGA.GGGATGATGATGCCCGGTGGA
TGCTGGAAATGGCCGAGCATCAACCCTGGCTCTGGAAGAACTCCATCTTTCAGAAGGAGAGTGGATCTGTGTATGGCCAG
CGGGGTCACAGGTGCTTGGGGCCCCTGGGGGACTCCTAGCACTGGGTGRTGTTTATCGAGTGCTCTTGTGTGCCAGGCAC
TGGCCTGGGGCTTTGTTTCTGTCTCTGTTTTGTTTCGTTTTTTGAGACAGACTCTTGCTATGTATCCGTGTCAATCTTGG
AATCTCACTGCATAGCCCAGGCTGCGGAGAGAGGGGAGGGCAATAGGCCTTGTAAGCAAGCCACACTTCAGAGACTAGAC
TCCACCCTGCGAATGATGACAGGTCAGAGCTGAGTTCCGGAAGATTTTTTTTCCAGCTGCCAGGTGGAGTGTGGAGTGGC
AGCTAGCGGCAAGGGTAGAGGTCGAGCTCCCTGTGCAGGAGAAATGCAAGCAAGAGATGGCAAGCCAGTGAGTTAAGCAT
TCTGTGTGGGGAGCAGGTGGATGAAGAGAGAGGCTGGGCTTTCGCCTCTGGGGGGGGGGTGAGGGGTGGGGATGAGGTGA
GAGGAGGGCAGCTCCCTGCAGTGTGATGAGATTTTTCCTGACAGTGACCTTTGGCCTCTCCCTCCCCCACTTCCCTTCTT
TCCTTTCTTCCCACCATTGCTTTCCTTGTCCTTGAGAAATTCTGAGTTTCCACTTCACTGGTGArGCAGACGGAAACAGA
AGCCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTGTGTGTATGTGTGTGTGTGTGTTTGTGT
GTATGTGTGTCAGTGGGAATGGCTCATAGTCTGCAGGAAGGTGGGCAGGAAGGAATAAGCTGTAGGCTGAGGCAGTGTGG
GATGCAGGGAGAGAGGAGAGGAGGGATACCAGAGAAGGAAATTAAGGGAGCTACAAGAGGGCATTGTTGGGGTGTGTGTG
TGTGTGTGTTGTTTATATTTGTATTGGAAATACATTCTTTTAAAAAATACTTATCCATTTATTTATTTTTATGTGCACGT
GTGTGTGCCTGCATGAGTTCATGTGTGCCACGTGTGTGCGGGAACCCTTGGAGGCCACAAGGGGGCATCTGATCCCCTGG
AACTGGAGTTGGAGGAGGTTGTGAGTCCCCTGACATGTTTGCTGGGAACTGAACCCCGGTCCTATGCAAGAGCAGGAAGT
GCAGTTATCTGCTGAGCCATCTCTCCAGTCCTGAAATCCATTCTCTTAAAATACACGTGGCAGAGACATGATGGGATTTA
CGTATGGATTTAATGTGGCGGTCATTAAGTTCCGGCACAGGCAAGCACCTGTAAAGCCATCACCACAACCGCAACAGTGA
ATGTGACCATCACCCCCATGTTCTTGATGTCCCCTGTCCCCTCCATCCTCCATTCTCAAGCACCTCTTGCTCTGCCTCTG
TCGCTGGAGAACAGTGTGCATCTGCACACTCTTATGTCAGTGAAGTCACACAGCCTGCACCCCTTCCTGGTCTGAGTATT
TGGGTTCTGACTCTGCTATCACACACTACTGTACTGCATTCTCTCGCTCTCTTTTTTTAAACATATTTTTATTTGTTTGT
GTGTATGCACATGTGCCACATGTGTACAGATACTATGGAGGCCAGAAGAGGCCATGGCCGTCCCTGGAGCTGGAGTTACA
GGCAGCGTGTGAGCTGCCTGGTGTGGGTGCTGGGAACCAAACTTGAATCTAAAGCAAGCACTTTTAACTGCTGAGGCAGC
TCTCAGTACCCTTCTTCATTTCTCCGCCTGGGTTCCATTGTATGGACACATGTAGCTAGAATATCTTGCTTATCTAATTA
TGTACATTGTTTTGTGCTAAGAGAGAGTAATGCTCTATAGCCTGAGCTGGCCTCAACCTTGCCATCCTCCTGCCTCAGCC
TCCTCCTCCTGAGTGCTAGGATGACAGGCGAGTGGTAACTTACATGGTTTCATGTTTTGTTCAAGACTGAAGGATAACAT
TCATACAGAGAAGGTCTGGGTCACAAAGTGTGCAGTTCACTGAATGGCACAACCCGTGATCAAGAAACAAAACTCAGGGG
136
Figure BRPI9915679B1_D0086
Figure BRPI9915679B1_D0087
i ϊ
CTGGAGAGATGGCACTGACTGCTCTTCCAGAGGTCCGGAGTTCAATTCCCAGCAACCACATGGTGGCTCACAGCCATCTA
TAACGAGATCTGACGCCCTCTTCTGGTGTGTCTGAAGACAGCTACAGTGTACTCACATAAAATAAATAAATCTTTAAAAC
ACACACACACACACAATTACCACCCCAGAAAGCCCACTCCATGTTCCCTCCCACGTCTCTGCCTACAGTACTCCCAGGTT
ACCACTGTTCAGGCTTCTAACAACCTGGTTTACTTGGGCCTCTTTTCTGCTCTGTGGAGCCACACATTTGTGTGCCTCAT
ACACGTTCTTTCTAGTAAGTTGCATATTACTCTGCGTTTTTACATGTATTTATTTATTGTAGTTGTGTGTGCGTGTGGGG
CCATGCATGGCACAGTGTGTGGGGATGTCAGAGTATTGTGAACAGGGGACAGTTCTTTTCTTCAATCATGTGGGTTCÇAG
AGGTTGAACTCAGGTCATCATGTGTGGCAGCAAATGCCTTTACCCACTGAGACATCTCCATATTCTTTTTTTTTCCCCTG
AGGTGGGGGCTTGTTCCATAGCCCAAACTGGCTTTGCACTTGCAGTTCAAAGTGACTCCCTGTCTCCACCTCTTAGAGTA
TTGGAATTACGATGTGTACTACCACACCTGACTGGATCATTAATTCTTTGATGGGGGCGGGGAAGCGCACATGCTGCAGG
TGAAGGGATGACTGGACTGGACATGAGCGTGGAAGCCAGAGAACAGCTTCAGTCTAATGCTCTCCCAACTGAGCTATTTC
GGTTTGCCAGAGAACAACTTACAGAAAGTTCTCAGTGCCATGTGGATTCGGGGTTGGAGTTCAACTCATCAGCTTGACAT
TGGCTCCTCTACCCACTGAGCCTTCTCACTACTCTCTACCTAGATCATTAATTCTTTTTTAAAAAGACTTATTAGGGGGC
TGGAGAGATGGCTCAGCCGTTAAGAGCACCGAATGCCCTTCCAGAGGTCCTGAGTTCAATTCCCAGCATGCCATTGCTGG
GCAGTAGGGGGCGCAGGTGTTCAACGTGAGTAGCTGTTGCCAGTTTTCCGCGGTGGAGAACCTCTTGACACCCTGCTGTC
CCTGGTCATTCTGGGTGGGTGCATGGTGATATGCTTGTTGTATGGAAGACTTTGACTGTTACAGTGAAGTTGGGCTTCCA
CAGTTACCACGTCTCCCCTGTTTCTTGCAGGCCGGGTGCTTGTCCATTGCCGCGAGGGCTACAGCCGCTCCCCAACGCTA
GTTATCGCCTACCTCATGATGCGGCAGAAGATGGACGTCAAGTCTGCTCTGAGTACTGTGAGGCAGAATCGTGAGATCGG
CCCCAACGATGGCTTCCTGGCCCAACTCTGCCAGCTCAATGACAGACTAGCCAAGGAGGGCAAGGTGAAACTCTAGGGTG
CCCACAGCCTCTTTTGCAGAGGTCTGACTGGGAGGGCCCTGGCAGCCATGTTTAGGAAACACAGTATACCCACTCCCTGC
ACCACCAGACACGTGCCCACATCTGTCCCACTCTGGTCCTCGGGGGCCACTCCACCCTTAGGGAGCACATGAAGAAGCTC cctaagaagttctgctccttagccatcctttcctgtaatttatgtctctccctgaggtgaggttcaggtttatgtccctg
TCTGTGGCATAGATACATCTCAGTGACCCAGGGTGGGAGGGCTATCAGGGTGCATGGCCCGGGACACGGGCACTCTTCAT
GACCCCTCCCCCACCTGGGTTCTTCCTGTGTGGTCCAGAACCACGAGCCTGGTAAAGGAACTATGCAAACACAGGCCCTG
ACCTCCCCATGTCTGTTCCTGGTCCTCACAGCCCGACACGCCCTGCTGAGGCAGACGAATGACATTAAGTTCTGAAGCAG
AGTGGAGATAGATTAGTGACTAGATTTCCAAAAAGAAGGAAAAAAAAGGCTGCAITTTAAAATTATTTCCTTAGAATTAA
AGATACTACATAGGGGCCCTTGGGTAAGCAAATCCATTTTTCCCAGAGGCTATCTTGATTCTTTGGAATGTTTAAAGTGT
GCCTTGCCAGAGAGCTTACGATCTATATCTGCTGCTTCAGAGCCTTCCCTGAGGATGGCTCTGTTCCTTTGCTTGTTAGA
AGAGCGATGCCTTGGGCAGGGTTTCCCCCTTTTCAGAATACAGGGTGTAAAGTCCAGCCTATTACAAACAAACAAACAAA
137
.. » « » · ·* ·: a * ~ r « · 2 ! ·ϊ ' · 2 ·- β •ζ ;’’'··'·· ..
; ; ,γ· .· ί·· · ·
C7VAACAAACAAAGGACCTCCATTTGGAGAATTGCAAGGATTTTATCCTGAATTATAGTGTTGGTGAGTTCAAGTCATCAC
GCCAAGTGCTTGCCATCCTGGTTGCTATTCTAAGAATAATTAGGAGGAGGAACCTAGCCAATTGCAGCTCATGTCCGTGG
GTGTGTGCACGGGTGCATATGTTGGAAGGGGTGCCTGTCCCCTTGGGGACAGAAGGAAAATGAAAGGCCCCTCTGCTCAC
CCTGGCCATTTACGGGAGGCTCTGCTGGTTCCACGGTGTCTGTGCAGGATCCTGAAACTGACTCGCTGGACAGAAACGAG
ACTTGGCGGCACCATGAGAATGGAGAGAGAGAGAGCAAAGAAAGAAACAGCCTTTAAAAGAACTTTCTAAGGGTGGTTTT
TGAACCTCGCTGGACCTTGTATGTGTGCACATTTGCCAGAGATTGAACATAATCCTCTTGGGACTTCACGTTCTCATTAT
TTGTATGTCTCCGGGGTCACGCAGAGCCGTCAGCCACCACCCCAGCACCCGGCACATAGGCGTCTCATAAAAGCCCATTT
TATGAGAACCAGAGCTGTTTGAGTACCCCGTGTATAGAGAGAGTTGTTGTCGTGGGGCACCCGGATCCCAGCAGCCTGGT
TGCCTGCCTGTAGGATGTCTTACAGGAGTTTGCAGAGAAACCTTCCTTGGAGGGAAAGAAATATCAGGGATTTTTGTTGA
ATATTTCAAATTCAGCTTTAAGTGTAAGACTCAGCAGTGTTCATGGTTAAGGTAAGGAACATGCCTTTTCCAGAGCTGCT
GCAAGAGGCAGGAGAAGCAGACCTGTCTTAGGATGTCACTCCCAGGGTAAAGACCTCTGATCACAGCAGGAGCAGAGCTG
TGCAGCCTGGATGGTCATTGTCCCCTATTCTGTGTGACCACAGCAACCCTGGTCACATAGGGCTGGTCATCCTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCCCAGAATGAAGTGACCATAGCCAAGTTGTGTACCTCAGTCTTTAGTTTCCAAGCGGCT
CTCTTGCTCAATACAATGTGCATTTCAAAATAACACTGTAGAGTTGACAGAACTGGTTCATGTGTTATGAGAGAGGAAAA
GAGAGGAAAGAACAAAACAAAACAAAACACCACAAACCAAAAACATCTGGGCTAGCCAGGCATGATTGCAATGTCTACAG
GCCCAGTTCATGAGAGGCAGAGACAGGAAGACCGCCGAAAGGTCAAGGATAGCATGGTCTACGTATCGAGACTCCAGCCA
GGGCTACGGTCCCAAGATCCTAGGTTTTGGATTTTGGGCTTTGGTTTTTGAGACAGGGTTTCTCTGTGTAGCCCTGGCTG
TCCTGGAACTCGCTCTGTAGACCAGGCTGGCCTCAAACTTAGAGATCTGCCTGACTCTGCCTTTGAGGGCTGGGACGAAT
GCCACCACTGCCCAACTAAGATTCCATTAAAAAAAAAAAAAGTTCAAGATAATTAAGAGTTGCCAGCTCGTTAAAGCTAA
0 GTAGAAGCAGTCTCAGGCCTGCTGCTTGAGGCTGTTCTTGGGTTGGACCTGAAATCTGCCCCCAACAGTGTCCAAGTGCA
CATGACTTTGAGCCATCTCCAGAGAAGGAAGTGAAAATTGTGGCTCCCCAGTCGATTGGGACACAGTCTCTCTTTGTCTA
GGTAACACATGGTGACACATAGCATTGAACTCTCCACTCTGAGGGTGGGTTTCCCTCCCCCTGCCTCTTCTGGGTTGGTC
ACCCCATAGGACAGCCACAGGACAGTCACTAGCACCTACTGGAAACCTCTTTGTGGGAACATGAAGAAAGAGCCTTTGGG
AGATTCCTGGCTTTCCATTAGGGCTGAAAGTACAACGGTTCTTGGTTGGCTTTGCCTCGTGTTTATAAAACTAGCTACTA
5 TTCTTCAGGTAAAATACCGATGTTGTGGAAAAGCCAACCCCGTGGCTGCCCGTGAGTAGGGGGTGGGGTTGGGAATCCTG
GATAGTGTTCTATCCATGGAAAGTGGTGGAATAGGAATTAAGGGTGTTCCCCCCCCCCCCAACCTCTTCCTCAGACCCAG
CCACTTTCTATGACTTATAAACATCCAGGTAAAAATTACAAACATAAAAATGGTTTCTCTTCTCAATCTTCTAAAGTCTG
CCTGCCTTTTCCAGGGGTAGGTCTGTTTCTTTGCTGTTCTATTGTCTTGAGAGCACAGACTAACACTTACCAAATGAGGG
138 ±?5
AACTCTTGGCCCATACTAAGGCTCTTCTGGGCTCCAGCACTCTTAAGTTATTTTAAGAATTCTCACTTGGCCTTTAGCAC
ACCCGCCACCCCCAAGTGGGTGTGGATAATGCCATGGCCAGCAGGGGGCACTGTTGAGGCGGGTGCCTTTCCACCTTAAG
TTGCTTATAGTATTTAAGATGCTAAATGTTTTAATCAAGAGAAGCACTGATCTTATAATACGAGGATAAGAGATTTTCTC
ACAGGAAATTGTCTTÇTTTCATAATTCTTTTACAGGCTTTGTCCTGATCGTAGCATAGAGAGAATAGCTGGATATTTAACT
TGTATTCCATTTTCCTCTGCCAGCGTTAGGTTAACTCCGTAAAAAGTGATTCAGTGGACCGAAGAGGCTCAGAGGGCAGG
GGATGGTGGGGTGAGGCAGAGCACTGTCACCTGCCAGGCATGGGAGGTCCTGCCATCCGGGAGGftAAAGGAAAGTTTAGC
CTCTAGTCTACCACCAGTGTTAACGCACTCTAAAGTTGTAACCAAAATAAATGTCTTACATTACAAAGACGTCTGTTTTG
TGTTTCCTTTTGTGTGTTTGGGCTTTTTATGTGTGCTTTATAACTGCTGTGGTGGTGCTGTTGTTAGTTTTGAGGTAGGA
TCTCAGGCTGGCCTTGAACTTCTGATCGCCTGCCCCTGCCCCTGCCCCTGCCCCTGTCCCTGCCTCCAAGTGCTAGGACT
AAAAGCACATGCCACCAC^CCAGTACAGCATTTTTCTAACATTTAAAAATAATCACCTAGGGGCTGGAGAGAGGGTTCCA
GCTAAGAGTGCACACTGCTCTTGGGTAGGACCTGAGTTTAGTTCCCAGAACCTATACTGGGTGGCTCCAGGTCCAGAGGA
TCCAGGACCTCTGGCCTCCATGGGCATCTGCTCTTAGCACATACCCACATACAGATACACACATAAAAATAAAATGAAGC
CTTTAAAAACCTCCTAAAACCTAGCCCTTGGAGGTACGACTCTGGAAAGCTGGCATACTGTGTAAGTCCATCTCATGGTG
TTCTGGCTAACGTAAGACTTACAGAGACAGAAAAGAACTCAGGGTGTGCTGGGGGTTGGGATGGAGGAAGAGGGATGAGT
AGGGGGAGCACGGGGAACTTGGGCAGTGAAAATTCTTTGCAGGACACTAGAGGAGGATAAATACCAGTGATTGCACCCAC
TACTGGACAACTCCAGGGAATTATGCTGGGTGAAAAGAGAAGGCCCCAGGTATTGGCTGCATTGGCTGCATTTGCGTAAC
ATTTTTTTAAATTGAAAAGAAAAAGATGTAAATCAAGGTTAGATGAGTGGTTGCTGTGAGCTGAGAGCTGGGGTGAGTGA
GACATGTGGACAACTCCATCAAAAAGCGACAGAAAGAACGGGCTGTGGTGACAGCTACCTCTAATCTCCACCTCCGGGAG
GTGATCAAGGTTAGCCCTCAGCTAGCCTGTGGTGCATGAGACCCTGTTTCAAAAACTTTAATAAAGAAATAATGAAAAAA
0 GACATCAGGGCAGATCCTTGGGGCCAAAGGCGGACAGGCGAGTCTCGTGGTAAGGTCGTGTAGAAGCGGATGCATGAGCA
CGTGCCGCAGGCATCATGAGAGAGCCCTAGGTAAGTAAGGATGGATGTGAGTGTGTCGGCGTCGGCGCACTGCACGTCCT
GGCTGTGGTGCTGGACTGGCATCTTTGGTGAGCTGTGGAGGGGAAATGGGTAGGGAGATCATAAAATCCCTCCGAÁTTAT '
TTCAAGAACTGTCTATTACAATTATCTCAAAATATTAAAAAAAAAGAAGAATTAAAAAACAAAAAACCTATCCAGGTGTG
GTGGTGTGCACCTATAGCCACGGGCACTTGGAAAGCTGGAGCAAGAGGATGGCGAGTTTGAAGGTATCTGGGGCTGTACA
5 GCAACCGTCTGTCCCCAAACCAAACCAAACAGCAAACCCATTATGTCACACAAGAGTGTTTATAGTGAGCGGCCTCGCT
GAGAGCATGGGGTGGGGGTGGGGGTGGGGGACAGAAATATCTAAACTGCAGTCAATAGGGATCCACTGAGACCCTGGGGC
TTGACTGCAGCTTAACCTTGGGAAMGATAAGGGTTTTGTGTTGAGTAAAAGCATCGATTACTGACTTAACCTCAAftTGA
AGAAAAAGAAAAAAAGAAAACAACAAAAGCCAAACCAAGGGGCTGGTGAGATGGCTCAGTGGGTAAGAGCACCCGACTGC
139
Figure BRPI9915679B1_D0088
TCTTCCGAAGGTCCAGAGTTCAAATCCCAGCAACCACATGGTGGCTCACAACCATCTGTAACGAGATATGATGCCCTCTT
CTGGTGTGTCTGAAGACAGCTACAGTGTACTTACATATAATAAATAAATCTTAAAAAAAAftAAAAAAAAAAAAAGCCAAA
CCGAGCAAACCAGGCCCCCAAACAGAAGGCAGGCACGACGGCAGGCACCACGAGCCATCCTGTGAAAAGGCAGGGCTACC
CATGGGCCGAGGAGGGTCCAGAGAGATAGGCTGGTAAGCTCAGTTTCTCTGTATACCCTTTTTCTTGTTGACACTACTTC
AATTACAGATAAAATAACAAATAAACAAAATCTAGAGCCTGGCCACTCTCTGCTCGCTTGATTTTTCCTGTTACGTCCAG
CAGGTGGCGGAAGTGTTCCAAGGACAGATCGCATCATTAAGGTGGCCAGCATAATCTCCCATCAGCAGGTGGTGCTGTGA
GAACCATTATGGTGCTCACAGAATCCCGGGCCCAGGAGCTGCCCTCTCCCAAGTCTGGAGCAATAGGAAAGCTTTCTGGC
CCAGACAGGGTTAACAGTCCACATTCCAGAGCAGGGGAAAAGGAGACTGGAGGTCACAGACAAAAGGGCCAGCTTCTAAC
AACTTCACAGCTCTGGTAGGAGAGATAGATCACCCCCAACAATGGCCACAGCTGGTTTTGTCTGCCCCGAAGGAAACTGA
CTTAGGAAGCAGGTATCAGAGTCCCCTTCCTGAGGGGACTTCTGTCTGCCTTGTAAAGCTCTCAGAGCAGCTGCATTGAT
GTGTGGGTGACAGAAGATGAAAAGGAGGACCCAGGCAGATCGCCACAGATGGACCGGCCACTTACAAGTCGAGGCAGGTG
GCAGAGCCTTGCAGAAGCTCTGCAGGTGGACGACACTGATTCATTACCCAGTTAGGATACCACAGCGGGCTAGGCGGACC
ACAGCCTCCTTCCCAGTCTTCCTCCAGGGCTGGGGAGTCCTCCAACCTTCTGTCTCAGTGCAGCTTCCGCCAGCCCCTCC
TCCTTTTGCACCTCAGGTGTGAACCCTCCCTCCTCTCCTTCTCCCTGTGGCATGGCCCTCCTGCTACTGCAGGCTGAGCA
TTGGATTTCTTTGTGCTTAGATAGACCTGAGATGGCTTTCTGATTTATATATATATATCCATCCCTTGGATCTTACATCT
AGGACCCAGAGCTGTTTGTGATACCATAAGAGGCTGGGGAGATGATATGGTAAGAGTGCTTGCTGTACAAGCATGAAGAC
ATGAGTTCGAATCCCCAGCAACCATGTGGAAAAATAACCTTCTAACCTCAGAGTTGAGGGGAAAGGCAGGTGGATTCTGG
GGGCTTACTGGCCAGCTAGCCAGCCTAACCTAAATGTCTCAGTCAGAGATCCTGTCTCAGGGAATAACTTGGGAGAAIGA
CTGAGAAAGACACCTCCTCAGGTCTCCCATGCACCCACACAGACACACGGGGGGGGGGTAATGTAATAAGCTAAGAAATA
ATGAGGGAAATGATTTTTTGCTAAGAAATGAAATTCTGTGTTGGCCGCAAGAAGCCTGGCCAGGGAAGGAACTGCCTTTG
GCACACCAGCCTATAAGTCACCATGAGTTCCCTGGCTAAGAATCACATGTAATGGAGCCCAGGTCCCTCTTGCCTGGTGG
TTGCCTCTCCCACTGGTTTTGAAGAGAAATTCAAGAGAGATCTCCTTGGTCAGAATTGTAGGTGCTGAGCAATGTGGAGC
TGGGGTCAATGGGATTCCTTTAAAGGCATCCTTCCCAGGGCTGGGTCATACTTCAATAGTAGGGTGCTTGCACAGCAAGC
GTGAGACCCTAGGTTAGAGTCCCCAGAATCTGCCCCCAACCCCCCAAAAAGGCATCCTTCTGCCTCTGGGTGGGTGGGGG
GAGCAAACACCTTTAACTAAGACCATTAGCTGGCAGGGGTAACAAATGACCTTGGCTAGAGGAATTTGGTCAAGCTGGAT
TCCGCCTTCTGTAGAAGCCCCACTTGTTTCCTTTGTTAAGCTGGCCCACAGTTTGTTTTGAGAATGCCTGAGGGGCCCAG
GGAGCCAGACAATTAAAAGCCAAGCTCATTTTGATATCTGAAAACCACAGCCTGACTGCCCTGCCCGTGGGAGGTACTGG
GAGAGCTGGCTGTGTCCCTGCCTCACCAACGCCCCCCCCCCCAACACACACTCCTCGGGTCACCTGGGAGGTGCCAGCAG
140
184
CAATTTGGAAGTTTACTGAGCTTGAGAAGTCTTGGGAGGGCTGACGCTAAGCACACCCCTTCTCCACCCCCCCCCACCCC
ACCCCCGTGAGGAGGAGGGTGAGGAAACATGGGACCAGCCCTGCTCCAGCCCGTCCTTATTGGCTGGCATGAGGCAGAGG
GGGCTTTAAAAAGGCAACCGTATCTAGGCTGGACACTGGAGCCTGTGCTACCGAGTGCCCTCCTCCACCTGGCAGCATGC
AGCCCTCACTAGCCCCGTGCCTCATCTGCCTACTTGTGCACGCTGCCTTCTGTGCTGTGGAGGGCCAGGGGTGGCAAGCC
TTCAGGAATGATGCCACAGAGGTCATCCCAGGGcTTGGAGAGTACCCCGAGCCTCCTCCTGAGAACAACCAGACCATGAA
CCGGGCGGAGAATGGAGGCAGACCTCCCCACCATCCCTATGACGCCAAAGGTACGGGATGAAGAAGCACATTAGTGGGGG
GGGGGGTCCTGGGAGGTGACTGGGGTGGTTTTAGCATCTTCTTCAGAGGTTTGTGTGGGTGGCTAGCCTCTGCTACATCA
GGGCAGGGACACATTTGCCTGGAAGAATACTAGCACAGCATTAGAACCTGGAGGGCAGCATTGGGGGGCTGGTAGAGAGC
ACCCAAGGCAGGGTGGAGGCTGAGGTCAGCCGAAGCTGGCATTAACACGGGCATGGGCTTGTATGATGGTCCAGAGAATC
TCCTCCTAAGGATGAGGACACAGGTCAGATCTAGCTGCTGACCAGTGGGGAAGTGATATGGTGAGGCTGGATGCCAGATG
CCATCCATGGCTGTACTATATCCCACATGACCACCACATGAGGTAAAGAAGGCCCCAGCTTGAAGATGGAGAAACCGAGA
GGCTCCTGAGATAAAGTCACCTGGGAGTAAGAAGAGCTGAGACTGGAAGCTGGTTTGATCCAGATGCAAGGCAACCCTAG
ATTGGGTTTGGGTGGGAACCTGAAGCCAGGAGGAATCCCTTTAGTTCCCCCTTGCCCAGGGTCTGCTCAATGAGCCCAGA
GGGTTAGCATTAAAAGAACAGGGTTTGTAGGTGGCATGTGACATGAGGGGCAGCTGAGTGAAATGTCCCCTGTATGAGCA
CAGGTGGCACCACTTGCCCTGAGCTTGCACCCTGACCCCAGCTTTGCCTCATTCCTGAGGAGAGCAGAAACTGTGGAGGC
AGAGCCAGCACAGAGAGATGCCTGGGGTGGGGGTGGGGGTATCACGCACGGAACTAGCAGCAATGAATGGGGTGGGGTGG
CAGCTGGAGGGACACTCCAGAGAAATGACCTTGCTGGTCACCATTTGTGTGGGAGGAGAGCTCATTTTCCAGCTTGCCAC
CACATGCTGTCCCTCCTGTCTCCTAGCCAGTAAGGGATGTGGAGGAAAGGGCCACCCCAAAGGAGCATGCAATGCAGTCA
CGTTTTTGCAGAGGAAGTGCTTGACCTAAGGGCACTATTCTTGGAAAGCCCCAAAACTAGTCCTTCCCTGGGCAAACAGG
0 CCTCCCCCACATACCACCTCTGCAGGGGTGAGTAAATTAAGCCAGCCACAGAAGGGTGGGAAGGCCTACACCTCCCCCCT
GTTGTGCCCCCCCCCCCCCCGTGAAGGTGCATCCTGGCCTCTGCCCCTCTGGCTTTGGTACTGGGATTTTTTTTTTCCTT
TTATGTCATATTGATCCTGACACCATGGAACTTTTGGAGGTAGACAGGACCCACACATGGATTAGTTAAAAGCCTCCCAT
CCATCTAAGCTCATGGTAGGAGATAGAGCATGTCCAAGAGAGGAGGGCAGGCATCAGACCTAGAAGATATGGCTGGGCAT
CCAACCCAATCTCCTTCCCCGGAGAACAGACTCTAAGTCAGATCCAGCCACCCTTGAGTAACCAGCTCAAGGTACACAGA
5 ACAAGAGAGTCTGGTATACAGCAGGTGCTAAACAAATGCTTGTGGTAGCAAAAGCTATAGGTTTTGGGTCAGAACTCCGA
CCCAAGTCGCGAGTGAAGAGCGAAAGGCCCTCTACTCGCCACCGCCCCGCCCCCACCTGGGGTCCTATAACAGATCACTT
TCACCCTTGCGGGAGCCAGAGAGCCCTGGCATCCTAGGTAGCCCCCCCCGCCCCCCCCCCGCAAGCAGCCCAGCCCTGCC
TTTGGGGCAAGTTCTTTTCTCAGCCTGGACCTGTGATAATGAGGGGGTTGGACGCGCCGCCTTTGGTCGCTTTCAAGTCT
141
Figure BRPI9915679B1_D0089
Figure BRPI9915679B1_D0090
AATGAATTCTTATCCCTACCACCTGCCCTTCTACCCCGCTCCTCCACAGCAGCTGTCCTGATTTATTACCTTCAATTAAC
CTCCACTCCTTTCTCCATCTCCTGGGATACCGCCCCTGTCCCAGTGGCTGGTAAAGGAGCTTAGGAAGGACCAGAGCCAG
GTGTGGCTAGAGGCTACCAGGCAGGGCTGGGGATGAGGAGCTAAACTGGAAGAGTGTTTGGTTAGTAGGCACAAAGCCTT
GGGTGGGATCCCTAGTACCGGAGAAGTGGAGATGGGCGCTGAGAAGTTCAAGACCATCCATCCTTAACTACACAGCCAGT
TTGAGGCCAGCCTGGGCTACATAAAAACCCAATCTCAAAAGCTGCCAATTCTGATTCTGTGCCACGTAGTGCCCGATGTA
ATAGTGGATGAAGTCGTTGAATCCTGGGGCAACCTATTTTACAGATGTGGGGAAAAGCAACTTTAAGTACCCTGCCCACA
GATCACAAAGAAAGTAAGTGACAGAGCTCCAGTGTTTCATCCCTGGGTTCCAAGGACAGGGAGAGAGAAGCCAGGGTGGG
ATCTCACTGCTCCCCGGTGCCTCCTTCCTATAATCCATACAGATTCGAAAGCGCAGGGCAGGTTTGGAAAAAGAGAGAAG
GGTGGAAGGAGCAGACCAGTCTGGCCTAGGCTGCAGCCCCTCACGCATCCCTCTCTCCGCAGATGTGTCCGAGTACAGCT
GCCGCGAGCTGCACTACACCCGCTTCCTGACAGACGGCCCATGCCGCAGCGCCAAGCCGGTCACCGAGTTGGTGTGCTCC
GGCCAGTGCGGCCCCGCGCGGCTGCTGCCCAACGCCATCGGGCGCGTGAAGTGGTGGCGCCCGAACGGACCGGATTTCCG
CTGCATCCCGGATCGCTACCGCGCGCAGCGGGTGCAGCTGCTGTGCCCCGGGGGCGCGGCGCCGÇGCTCGCGCAAGGTGC
GTCTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACCCGCTTCCACAACCAGTCGGAGCTCAAGGACTTCGGGCCGGAGACC
GCGCGGCCGCAGAAGGGTCGCAAGCCGCGGCCCGGCGCCCGGGGAGCCAAAGCCAACCAGGCGGAGCTGGAGAACGCCTA
CTAGAGCGAGCCCGCGCCTATGCAGCCCCCGCGCGATCCGATTCGTTTTCAGTGTAAAGCCTGCAGCCCAGGCCAGGGGT
GCAAACTTTCCAGACCGTGTGGAGTTCCCACGCCCAGTAGAGACCGCAGGTCCTTCTGCCCGCTGCGGGGGATGGGGA.GG
GGGTGGGGTTCCCGCGGGCCAGGAGAGGAAGCTTGAGTCCCAGACTCTGCCTAGCCCCGGGTGGGATGGGGGTCTTTCTA
CCCTCGCCGGACCTATACAGGACAAGGCAGTGTTTCCACCTTAAAGGGAAGGGAGTGTGGAACGAAAGACCTGGGACTGG
TTATGGACGTACAGTAAGATCTACTCCTTCCACCCAAATGTAAAGCCTGCGTGGGCTAGATAGGGTTTCTGACCCTGACC
TGGCCACTGAGTGTGATGTTGGGCTACGTGGTTCTCTTTTGGTACGGTCTTCTTTGTAAAATAGGGACCGGAACTCTGCT
GAGATTCCAAGGATTGGGGTACCCCGTGTAGACTGGTGAGAGAGAGGAGAACAGGGGAGGGGTTAGGGGAGAGATTGTGG
TGGGCAACCGCCTAGAAGAAGCTGTTTGTTGGCTCCCAGCCTCGCCGCCTCAGAGGTTTGGCTTCCCCCACTCCTTCCTC
TCAAATCTGCCTTCAAATCCATATCTGGGATAGGGAAGGCCAGGGTCCGAGAGATGGTGGAAGGGCCAGAAATCACACTC
CTGGCCCCCCGAAGAGCAGTGTCCCGCCCCCAACTGCCTTGTCATATTGTAAAGGGATTTTCTACACAACAGTTTAAGGT
CGTTGGAGGAAACTGGGCTTGCCAGTCACCTCCCATCCTTGTCCCTTGCCAGGACACCACCTCCTGCCTGCCACCCACGG
ACACATTTCTGTCTAGAAACAGAGCGTCGTCGTGCTGTCCTCTGAGACAGCATATCTTACATTAAAAAGAATAATACGGG
GGGGGGGGGCGGAGGGCGCAAGTGTTATACATATGCTGAGAAGCTGTCAGGCGCCACAGCACCACCCACAATCTTTTTGT
AAATCATTTCCAGACACCTCTTACTTTCTGTGTAGATTTTAATTGTTAAAAGGGGAGGAGAGAGAGCGTTTGTAACAGAA
142
Figure BRPI9915679B1_D0091
Figure BRPI9915679B1_D0092
GCACATGGAGGGGGGGGTAGGGGGGTTGGGGCTGGTGAGTTTGGCGAA.CTTTCCATCTGA.GACTCATCCACAAAGACTGA
AAGCCGCGTTTTTTTTTTTAAGAGTTCAGTGACATATTTATTTTCTCATTTAAGTTATTTATGCCAACATTTTTTTCTTG
TAGAGAAAGGCAGTGTTAATATCGTTTGTGAAGCACAAGTGTGTGTGGTTTTTTGTTTTTTGTTTTTTCCCCGACCAAGA
GGCATTGTTAATAAAGACAATGAATCTCGAGCAGGAGGCTGTGGTCTTGTTTTGTCAACCACACACAATGTCTCGCCACT
GTCATCTCACTCCCTTCCCTTGGTCACAAGACCCAAACCTTGACAACACCTCCGACTGCTCTCTGGTAGCCCTTGTGGCA
ATACGTGTTTCCTTTGAAAAGTCACATTCATCCTTTCCTTTGCAAACCTGGCTCTCATTCCCCAGCTGGGTCATCGTCAT
ACCCTCACCCCAGCCTCCCTTTAGCTGACCACTCTCCACACTGTCTTCCAAAAGTGCACGTTTCACCGAGCCAGTTCCCT
GGTCCAGGTCATCCCATTGCTCCTCCTTGCTCCAGACCCTTCTCCCACAAAGATGTTCATCTCCCACTCCATCAAGCCCC
AGTGGCCCTGCGGCTATCCCTGTCTCTTCAGTTAGCTGAATCTACTTGCTGACACCACATGAATTCCTTCCCCTGTCTTA
AGGTTCATGGAACTCTTGCCTGCCCCTGAACCTTCCAGGACTGTCCCAGCGTCTGATGTGTCCTCTCTCTTGTAAAGCCC
CACCCCACTATTTGATTCCCAATTCTAGATCTTCCCTTGTTCATTCCTTCACGGGATAGTGTCTCATCTGGCCAAGTCCT
GCTTGATATTGGGATAAATGCAAAGCCAAGTACAATTGAGGACCAGTTCATCATTGGGCCAAGCTTTTTCAAAATGTGAA
TTTTACACCTATAGAAGTGTAAAAGCCTTCCAAAGCAGAGGCAATGCCTGGCTCTTCCTTCAACATCAGGGCTCCTGCTT
TATGGGTCTGGTGGGGTAGTACATTCATAAACCCAACACTAGGGGTGTGAAAGCAAGATGATTGGGAGTTCGAGGCCAAT
CTTGGCTATGAGGCCCTGTCTCAACCTCTCCTCCCTCCCTCCAGGGTTTTGTTTTGTTTTGTTTTTTTGATTTGAAACTG
CAACACTTTAAATCCAGTCAAGTGCATCTTTGCGTGAGGGGAACTCTATCCCTAATATAAGCTTCCATCTTGATTTGTGT
ATGTGCACACTGGGGGTTGAACCTGGGCCTTTGTACCTGCCGGGCAAGCTCTCTACTGCTCTAAACCCAGCCCTCACTGG
CTTTCTGTTTCAACTCCCAATGAATTCCCCTAAATGAATTATCAATATCATGTCTTTGAAAAATACCATTGAGTGCTGCT
GGTGTCCCTGTGGTTCCAGATTCCAGGAAGGACTTTTCAGGGAATCCAGGCATCCTGAAGAATGTCTTAGAGCAGGAGGC
CATGGAGACCTTGGCCAGCCCCACAAGGCAGTGTGGTGCAGAGGGTGAGGATGGAGGCAGGCTTGCAATTGAAGCTGAGA.
CAGGGTACTCAGGATTAAAAAGCTTCCCCCAAAACAATTCCAAGATCAGTTCCTGGTACTTGCACCTGTTCAGCTATGCA
GAGCCCAGTGGGCATAGGTGAAGACACCGGTTGTACTGTCATGTACTAACTGTGCTTCAGAGCCGGCAGAGACAAATAAT
GTTATGGTGACCCCAGGGGACAGTGATTCCAGAAGGAACACAGAAGAGAGTGCTGCTAGAGGCTGCCTGAAGGAGAAGGG
GTCCCAGACTCTCTAAGCAAAGACTCCACTCACATAAAGACACAGGCTGAGCAGAGCTGGCCGTGGATGCAGGGAGCCCA
TCCACCATCCTTTAGCATGCCCTTGTATTCCCATCACATGCCAGGGATGAGGGGCATCAGAGAGTCCAAGTGATGCCCAA
ACCCAAACACACCTAGGACTTGCTTTCTGGGACAGACAGATGCAGGAGAGACTAGGTTGGGCTGTGATCCCATTACCACA
AAGAGGGAAAAAACAAAAAACAAACAAACAAACAAAAAAAAACAAAACAAAACAAAAAAAAACCCAAGGTCCAAATTGTA
GGTCAGGTTAGAGTTTATTTATGGAAAGTTATATTCTACCTCCATGGGGTCTACAAGGCTGGCGCCCATCAGAAAGAACA
143
Figure BRPI9915679B1_D0093
Figure BRPI9915679B1_D0094
AACAACAGGCTGATCTGGGAGGGGTGGTACTCTATGGCAGGGAGCACGTGTGCTTGGGGTACAGCCAGACACGGGGCTTG
TATTAATCACAGGGCTTGTATTAATAGGCTGAGAGTCAAGCAGACAGAGAGACAGAAGGAAACACACACACACACACACA
CACACACACACACACACACACATGCACACACCACTCACTTCTCACTCGAAGAGCCCCTACTTACATTCTAAGAACAAACC
ATTCCTCCTCATAAAGGAGACAAAGTTGCAGAAACCCAAAAGAGCCACAGGGTCCCCACTCTCTTTGAAATGACTTGGAC
TTGTTGCAGGGAAGACAGAGGGGTCTGCAGAGGCTTCCTGGGTGACCCAGAGCCACAGACACTGAAATCTGGTGCTGAGA
CCTGTATAAACCCTCTTCCACAGGTTCCCTGAAAGGAGCCCACATTCCCCAACCCTGTCTCCTGACCACTGAGGATGAGA
GGACTTGGGCCTTCCCCATTCTTGGAGTGCACCCTGGTTTCCCCATCTGAGGGCACATGAGGTCTCAGGTCTTGGGAAAG
TTCCACAAGTATTGAAAGTGTTCTTGTTTTGTTTGTGATTTAATTTAGGTGTATGAGTGCTTTTGCTTGAATATATGCCT
GTGTAGCATTTACAAGCCTGGTGCCTGAGGAGATCAGAAGATGGCATCAGATACCCTGGAACTGGACTTGCAGACAGTTA
TGAGCCACTGTGTGGGTGCTAGGAACAGAACCTGGATCCTCCGGAAGAGCAGACAGCCAGCGCTCTTAGCCACTAAGCCA
TCACTGAGGTTCTTTCTGTGGCTAAAGAGACAGGAGACAAAGGAGAGTTTCTTTTAGTCAATAGGACCATGAATGTTCCT
GGTAACGTGAGACTAGGGCAGGGTGATCCCCCAGTGACACCGATGGCCCTGTGTAGTTATTAGCAGCTCTAGTCTTATTC
ATTAATAAGTCCCAGTTTGGGGCAGGAGATATGTATTCCCTGCTTTGAAGTGGCTGAGGTCCAGTTATCTACTTCCAAGT
ACTTGTTTCTCTTTCTGGAGTTGGGGAAGCTCCCTGCCTGCCTGTAAATGTGTCCATTCTTCAACCTTAGACAAGArCAC
TTTCCCTGAGCAGTCAGGCCAGTCCAAAGCCCTTCAATTTAGCTTTCATAAGGAACACCCCTTTTGTTGGGTGGAGGTAG
CACTTGCCTTGAATCCCAGCATTAAGAAGGCAGAGACAGTCGGATCTCTGTGAGTTCACAGCCAGCCTGGTCTACGGAGT
GAGTTCCAAGACAGCCAGGCCTACACAGAGAAACCCTGTCTCGAAAAAAACAAAAACAAAAGAAATAAAGAAAAAGAAAA
CAAAAACGAACAAACAGAAAAACAAGCCAGAGTGTTTGTCCCCGTATTTTATTAATCATATTTTTGTCCCTTTGCCATTT
TAGACTAAAAGACTCGGGAAAGCAGGTCTCTCTCTGTTTCTCATCCGGACACACCCAGAACCAGATGTATGGAAGATGGC
TAATGTGCTGCAGTTGCACATCTGGGGCTGGGTGGATTGGTTAGATGGCATGGGCTGGGTGTGGTTACCATGACTGCAGG
AGCAAGGAGTATGTGGTGCATAGCAAACGAGGAAGTTTGCACAGAACAACACTGTGTGTACTGATGTGCAGGTATGGGCA
CATGCAAGCAGAAGCCAAGGGACAGCCTTAGGGTAGTGTTTCCACAGACCCCTCCCCCCTTTTAACATGGGCATCTCTCA
TTGGCCTGGAGCTTGCCAACTGGGCTGGGCTGGCTAGCTTGTAGGTCCCAGGGATCTGCATATCTCTGCCTCCCTAGTGC
TGGGATTACAGTCATATATGAGCACACCTGGCTTTTTTATGTGGGTTCTGGGCTTTGAACCCAGATCTGAGTGCTTGCAA
GGCAATCGGTTGAATGACTGCTTCATCTCCCCAGACCCTGGGATTCTACTTTCTATTAAAGTATTTCTATTAAATCAATG
AGCCCCTGCCCCTGCACTCAGCAGTTCTTAGGCCTGCTGAGAGTCAAGTGGGGAGTGAGAGCAAGCCTCGAGACCCCATC
AGCGAAGCAGAGGACAAAGAAATGAAAACTTGGGATTCGAGGCTCGGGATATGGAGATACAGAAAGGGTCAGGGAAGGAA
ATGAACCAGATGAATAGAGGCAGGAAGGGTAGGGCCCTGCATACATGGAACCTGGTGTACATGTTATCTGCATGGGGTTT
144
Figure BRPI9915679B1_D0095
Figure BRPI9915679B1_D0096
GCATTGCAATGGCTCTTCAGCAGGTTCACCACACTGGGAAACAGAAGCCAAAAAGAAGAGTAGGTGGTGTTGGAGTCAGA
TACTGTCAGTCATGCCTGAAGAAATGGAAGCAATTAACGATGCGCCGCAATTAGGATATTAGCTCCCTGAAGAAAGGCAA
GAAGCTGGGCTGTGGGCACTGAAGGGAGCTTTGAATGATGTCACATTCTCTGTATGCCTAGCAGGGCAGTATTGGAGACT
GAGACTTGACTTGTGTGTCCATATGATTCCTCCTTTTCCTACAGTCATCTGGGGCTCCTGAGCTTCGTCCTTGTCCAAGA
ACCTGGAGCTGGCAGTGGGCAGCTGCAGTGATAGATGTCTGCAAGAAAGATCTGAAAAGAGGGAGGAAGATGAAGGACCC
AGAGGACCACCGACCTCTGCTGCCTGACAAAGCTGCAGGACCAGTCTCTCCTACAGATGGGAGACAGAGGCGAGAGATGA
ATGGTCAGGGGAGGAGTCAGAGAAAGGAGAGGGTGAGGCAGAGACCAAAGGAGGGAAACACTTGTGCTCTACAGCTACTG
ACTGAGTACCAGCTGCGTGGCAGACAGCCAATGCCAAGGCTCGGCTGATCATGGCACCTCGTGGGACTCCTAGCCCAGTG
CTGGCAGAGGGGAGTGCTGAATGGTGCATGGTTTGGATATGATCTGAATGTGGTCCAGCCCTAGTTTCCTTCCAGTTGCT
GGGATAAAGCACCCTGACCAAAGCTACTTTTTTGTTTGTTTGTTTTGGTTTGGTTTTGTTTGGTTTTTCGAGGCAGGGTT
TCTCTGTATCACCCTAGCTGTCCTGGAACTCACTCTGTAGACCAGGCTGGCCTCGAACTCAGAAATCCCCCTGCCTCTGC
CTCCTAAGTGCTGGAATTAAAGGCCTGCGCCACCACTGCCGGCCCAAAGCTACTTTAAGAGAGAGAGAGGAATGTATAAG
TATTATAATTCCAGGTTATAGTTCATTGCTGTAGAATTGGAGTCTTCATATTCCAGGTAATCTCCCACAGACATGCCACA
AAACAACCTGTTCTACGAAATCTCTCATGGACTCCCTTCCCCAGTAATTCTAAACTGTGTCAAATCTACAAGAAATAGTG
ACAGTCACAGTCTCTAACGTTTTGGGCATGAGTCTGAAGTCTCATTGCTAAGTACTGGGAAGATGAAAACTTTACCTAGT
GTCAGCATTTGGAGCAGAGCCTTTGGGATTTGAGATGGTCTTTTGCAGAGCTCCTAATGGCTACATGGAGAGAGGGGGCC
TGGGAGAGACCCATACACCTTTTGCTGCCTTATGTCACCTGACCTGCTCCTTGGGAAGCTCTAGCAAGAAGGCCTTCCCT
GGATCACCGACCACCTTGCACCTCCAGAACTCAGAGCCAAATTAAACTTTCTTGTTACTGTCGTCAAAGCACAGTCGGTC
TGGGTTGTATCACTGTCAATGGGAAACAGACTTGCCTGGATGGATAACTTGTACATTGCArAATGTCTAGAAATGAAAAG
TCCTATAGAGAAAAAGAAAATTAGCTGGCACACAGATAGAGGCCCTGGAGGAGGCTGGCTTTGTCCTCCCCGAGGAGGTG
GCGAGTAAGGTGTAAATGTTCATGGATGTAAATGGGCCCATATATGAGGGTCTGGGGTAACAAGAAGGCCTGTGAATATA
AAGCACTGAAGGTATGTCTAGTCTGGAGAAGGTCACTACAGAGAGTTCTCCAACTCAGTGCCCATACACACACACACACA
CACACACACACACACACACACACACACACACCACAAAGAAAAAAAGGAAGAAAAATCTGAGAGCAAGTACAGTACTTAAA
ATTGTGTGATTGTGTGTGTGACTCTGATGTCACATGCTCATCTTGCCCTATGAGTTGAAAACCAAATGGCCCCTGAGAGG
CATAACAACCACACTGTTGGCTGTGTGCTCACGTTTTTCTTAAAGCGTCTGTCTGGTTTGCTGCTAGCATCAGGCAGACT
TGCAGCAGACTACATATGCTCAGCCCTGAAGTCCTTCTAGGGTGCATGTCTCTTCAGAATTTCAGAAAGTCATCTGTGGC
TCCAGGACCGCCTGCACTCTCCCTCTGCCGCGAGGCTGCAGACTCTAGGCTGGGGTGGAAGCAACGCTTACCTCTGGGAC
AAGTATAACATGTTGGCTTTTCTTTCCCTCTGTGGCTCCAACCTGGACATAAAATAGATGCAAGCTGTGTAATAAATATT
145
Figure BRPI9915679B1_D0097
Figure BRPI9915679B1_D0098
TCCTCCCGTCCACTTAGTTCTCAACAATAACTACTCTGAGAGCACTTATTAATAGGTGGCTTAGACATAAGCTTTGGCTC
ATTCCCCCACTAGCTCTTACTTCTTTAACTCTTTCAAACCATTCTGTGTCTTCCACATGGTTAGTTACCTCTCCTTCCAT
CCTGGTTCGCTTCTTCCTTCGAGTCGCCCTCAGTGTCTCTAGGTGATGCTTGTAAGATATTCTTTCTACAAAGCTGAGAG
TGGTGGCACTCTGGGAGTTCAAAGCCAGCCTGATCTACACAGCAAGCTCCAGGATATCCAGGGCAATGTTGGGAAAACCT
TTCTCAAACAAAAAGAGGGGTTCAGTTGTCAGGAGGAGACCCATGGGTTAAGAAGTCTAGACGAGCCATGGTGATGCATA
CCTTTCATCCAAGCACTTAGGAGGCAAAGAAAGGTGAAACTCTTTGACTTTGAGGCCAGCTAGGTTACATAGTGRTACCC
TGCTTAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAATTTAAAAGTCTAAAAATGCATTCTTTTAAAAA
TATGTATAAGTATTTGCCTGCACATATGTATGTATGTATGTATACCATGTGTGTGTCTGGTGCTGAAGGACTAGGCATAG
ACTCCCTAGAACTAGAGTCATAGACAGTTGTGACACTCCCCAACCCCCCACCATGTGGGTGCTTGAAGCTAAACTCCTGT
CCTTTGTAAAGCAGCAGGTGTCTATGAACCCTGAACCATCTCTCCAGTCTCCAGATGTGCATTCTCAAAGAGGAGTCCTT
CATATTTCCCTAAACTGAACATCCTTATCAGTGAGCATCCTCGAGTCACCAAAGCTACTGCAAACCCTCTTAGGGAACAT
TCACTATTCACTTCTACTTGGCTCATGAAACTTAAGTACACACACACAAACACACA.CACACACACAGAGTCATGCACTCA
CAAAAGCATGCATGTACACCATTCTTATTAGACTATGCTTTGCTAAAAGACTTTCCTAGATACTTTAAAACATCACTTCT
GCCTTTTGGTGGGCAGGTTCCAAGATTGGTACTGGCGTACTGGAAACTGAACAAGGTAGAGATCTAGAAATCACAGCAGG
TCAGAAGGGCCAGCCTGTACAAGAGAGAGTTCCACACCTTCCAGGAACACTGAGCAGGGGGCTGGGACCTTGCCTCTCAG
CCCAAGAAACTAGTGCGTTTCCTGTATGCATGCCTCTCAGAGATTCCATAAGArCTGCCTTCTGCCATAAGATCTCCTGC
ATCCAGACAAGCCTAGGGGAAGTTGACAGGCTGCCTGAGTCTCTCCCACAGGCCCCTTCTTGCCTGGCAGTATTTTTTTA
TCTGGAGGAGAGGAATCAGGGTGGGAATGATCAAATACAATTATCAAGGAAAAAGTAAAAAACATATATATATATATATT
AACTGATCTAGGGAGCTGGCTCAGCAGTTAAGAGTTCTGGCTGCCCTTGCTTCAGATCTTGCTTTGATTCCCAGCACCCA
CATGATGGCTTTCAACTGTATCTCTGCTTCCAGGGGATCCAACAGCCTCTTCTGACCTCCATAGACAAGACCTAGTCCTC
TGCAAGAGCACCAAATGCTCTTATCTGTTGATCCATCTCTCTAGCCTCATGCCAGATCATTTAAAACTACTGGACACTGT
CCCATTTTACGAAGATGTCACTGCCCAGTCATTTGCCATGAGTGGATATTTCGATTCTTTCTATGTTCTCACCCTTGCAA
TTTATAAGAAAGATATCTGCATTTGTCTCCTGAGAGAACAAAGGGTGGAGGGCTACTGAGATGGCTCTAGGGGTAAAGGT
GCTTGCCACAAAATCTGACAACTTAAGTTTGGTCTTGGAATCCACATGGTGGAGAGAGAGAAGAGATTCCCGTAAGTTGT
CCTCAAACTTCCCACACATGTGCTGTGGCTTATGTGTAACCCCAATAAGTAAAGATAGTTTTAAACACTACATAAGGTAG
GGTTTCTTCATGACCCCAAGGAATGATGCCCCTGATAGAGCTTATGCTGAAACCCCATCTCCATTGTGCCATCTGGAAAG
AGACAATTGCATCCCGGAAACAGAATCTTCATGAATGGATTAATGAGCTATTAAGAAAGTGGCTTGGTTATTGCACATGC
TGGCGGCGTAATGACCTCCACCATGATGTTATCCAGCATGAAGGTCCTCACCAGAAGTCATACAAATCTTCTTAGGCTIC
146
CAGAGTCGTGAGCAAAAAAAGCACACCTCTAAATAAATTAACTAGCCTCAGGTAGTTAACCACCGAAAATGAACCAAGGC
AGTTCTAATACAAAACCACTTCCCTTCCCTGTTCAAACCACAGTGCCCTATTATCTAAAAGATAAACTTCAAGCCAAGCT
TTTAGGTTGCCAGTATTTATGTAACAACAAGGCCCGTTGACACACATCTGTAACTCCTAGTACTGGGCCTCAGGGGCAGA
GACAGGTGGAGCCCTGGAGTTTGAATTCCAGGTTCTGTGAGAAACTCTGTCTGAAAAGACAATATGGTGAGTGACCCGGG
AGGATATCTGATATTGACTTCTGGCCAACACACAGCCATCTCTGCACATCTGTAGTTGCAAGCCTTTTGCACTAAGTTTG
GCCAGAGTCAGAGTTTGCAAGTGTTTGTGGACTGAATGCACGTGTTGCTGGTGATCTACAAAGTCACCCTCCTTCTCAAG
CTAGCAGCACTGGCTTCGGCCAGCTGCTCATTCAAGCCTCTTTGCAGAGTCATCACGGGGATGGGGGAGCAGGGCCCCTC
CCTAGAACACCAAGCCTGTGGTTGTTTATTCAGGACATTATTGAGGGCCAAGATGACAGATAACTCTATCACTTGGCCAA
CAGTCGGGTGTTGCGGTGTTAGGTTATTTCTGTGTCTGCAGAAAACAGTGCAACCTGGACAAAAGAAATAAATGATATCA
TTTTTCATTCAGGCAACTAGATTCCGTGGTACAAAAGGCTCCCTGGGGAACGAGGCCGGGACAGCGCGGCTCCTGAGTCG
CTATTTCCGTCTGTCAACTTCTCTAATCTCTTGATTTCCTCCCTCTGTCTGTTTCCTTCCTCTTGCTGGGGCCCAGTGGA
GTCTGTGTACTCACAGGGAGGAGGGTGGCAAAGCCCTGGTCCTCTACGGGCTGGGGGAAGGGGGGAAGCTGTCGGCCCAG
TGACTTTTTCCCCTTTCTCTTTTTCTTAGAAACCAGTCTCAATTTAAGATAATGAGTCTCCTCATTCACGTGTGCTCACT
ATTCATAGGGACTTATCCACCCCCGCCCTGTCAATCTGGCTAAGTAAGACAAGTCAAATTTAAAAGGGAACGTTTTTCTA
AAAATGTGGCTGGACCGTGTGCCGGCACGAAACCAGGGATGGCGGTCTAAGTTACATGCTCTCTGCCAGCCCCGGTGCCT
TTTCCTTTCGGAAAGGAGACCCGGAGGTAAAACGAAGTTGCCAACTTTTGATGATGGTGTGCGCCGGGTGACTCTTTAAA
ATGTCATCCATACCTGGGATAGGGAAGGCTCTTCAGGGAGTCATCTAGCCCTCCCTTCAGGAAAAGATTCCACTTCCGGT
TTAGTTAGCTTCCACCTGGTCCCTTATCCGCTGTCTCTGCCCACTAGTCCTCATCCATCCGGTTTCCGCCCTCATCCACC
TTGCCCTTTTAGTTCCTAGAAAGCAGCACCGTAGTCTTGGCAGGTGGGCCATTGGTCACTCCGCTACCACTGTTACGATG
GCCACCAAGGTGTCATTTAAATATGAGCTCACTGAGTCCTGCGGGATGGCTTGGTTGGTAATATGCTTGCTGCAAAATCG
TGAGAACTGGAGTTCAATTCCCAGCACATGGATGTATTTCCAGCACCTGGAAGGCAGGGAGCAGAGATCTTAAAGCTCCT
GGCCAGACAGCCCAGCCTAATTAGTAATCAGTGAGAGACCCTGTCTCAAGAAACAAGATGGAACATCAAAGGTCAACCTC
TTGTCTCCACACACACAAATACACACATGCACATACATCCACACACAGGC7\AACACATGCACACACCTGAACACCCTCCA
CAAATACATACATAAAAAAATAAATACATACACACATACATACATACACCAACATTCCCTCTCCTTAGTCTCCTGGCTAC
GCTCTTGTCACCCCCACTAAGGCTTCAACTTCTTCTATTTCTTCATCTTGACTCCTCTGTACTTTGCATGCCTTTTCCAG
CAAAGGCTTTTCTTTAAATCTCCGTCATTCATAAACTCCCTCTAAATTTCTTCCCCTGCCCTTTTCTTTCTCTCTAGGGA
GATAAAGACACACACTACAAAGTCACCGTGGGACCAGTTTATTCACCCACCCACCCCTGCTTCTGTTCATCCGGCCAGCT
AAGTAGTCCAACCTCTCTGGTGCTGTACCCTGGACCCTGGCTTCACCACAGCTCCTCCATGCTACCCAGCCCTGCAAACC
147
Figure BRPI9915679B1_D0099
Figure BRPI9915679B1_D0100
TTCAGCCTAGCCTCTGGTTCTCCAACCAGCACAGGCCCAGTCTGGCTTCTATGTCCTAGAAATCTCCTTCATTCTCTCCA
TTTCCCTCCTGAATCTACCACCTTCTTTCTCCCTTCTCCTGACCTCTAATGTCTTGGTCAAACGATTACAAGGAAGCCftA
TGAAATTAGCAGTTTGGGGTACCTCAGAGTCAGCAGGGGAGCTGGGATGAATTCACATTTCCAGGCCTTTGCTTTGCTCC
CCGGATTCTGACAGGCAGTTCCGAAGCTGAGTCCAGGAAGCTGAATTTAAAATCACACTCCAGCTGGGTTCTGAGGCAGC
CCTACCACATCAGCTGGCCCTGACTGAGCTGTGTCTGGGTGGCAGTGGTGCTGGTGGTGCTGGTGGTGCTGGTGGTGGTG
GTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGTGTGTGTGTTTTCTGCTTTTACAAAACTTTTCTAAITCTTAIACAAAG
GACAAATCTGCCTCATATAGGCAGAAAGATGACTTATGCCTATATAAGATATAAAGATGACTTTATGCCACTTATTAGCA
ATAGTTACTGTCAAAAGTAATTCTATTTATACACCCTTATACATGGTATTGCTTTTGTTGGAGACTCTAAAATCCAGATT
ATGTATTTAAAAAAAAATTCCCCAGTCCTTAAAAGGTGAAGAATGGACCCAGATAGAAGGTCA.CGGGACAAGTATGGAGT
CGGAGTGTGGAGTCCTGCÇAATGGTCTGGACAGAAGCATCCAGAGAGGGTCCAAGACAAA.TGCCTCGCCTCCTAAGGAAC
ACTGGCAGCCCTGATGAGGTACCAGAGATTGCTAAGTGGAGGAATACAGGATCAGACCCATGGAGGGGCTTAAAGCGTGA
CTGTAGCAGCCCTCCGCTGAGGGGCTCCAGGTGGGCGCCCAAGGTGCTGCAGTGGGAGCCACATGAGAGGTGATGTCTTG
GAGTCACCTCGGGTACCATTGTTTAGGGAGGTGGGGATTTGTGGTGTGGAGACAGGCAGCCTCAAGGATGCTTTTCAACA
ATGGTTGATGAGTTGGAACTAAAACAGGGGCCATCACACTGGCTCCCATAGCTCTGGGCTTGCCAGCTTCCACATCTGCC
CCCCACCCCCTGTCTGGCACCAGCTCAAGCTCTGTGATTCTACACATCCAAAAGAGGAAGAGTAGCCTACTGGGCATGCC
ACCTCTTCTGGACCATCAGGTGAGAGTGTGGCAAGCCCTAGGCTCCTGTCCAGGATGCAGGGCTGCCAGATAGGATGCTC
AGCTATCTCCTGAGCTGGAACTATTTTAGGAATAAGGATTATGCCCGCCCGGGGTTGGCCAGCACCCCAGCAGCCTGTGC
TTGCGTAAAAGCAAGTGCTGTTGA.TTTATCTAAAAACAGAGCCGTGGACCCACCCACAGGACAAGTATGTATGCATCTGT
TTCATGTATCTGAAAAGCGACACAACCATTTTTCACATCATGGCATCTTCCTAACCCCCATTCTTTTTTGTTTTGTTTTT
TTGAGACAGGGTTTCTCTGTGTAGTCCTGGCTGTCCTGGAACTCACTTTGTAGA.CCAGGCTGGCCTCGAACTCAGAAATC
CTGGGATTAAAGGTGTGTGCCACCACGCCCGGCCCTAACCCCCATTCTTAATGGTGATCCAGTGGTTGAAATTTCGGGCC
ACACACATGTCCATTAGGGATTAGCTGCTGTCTTCTGAGCTACCTGGTACAATCTTTATCCCCTGGGGCCTGGGCTCCTG
ATCCCTGACTCGGGCCCGATCAAGTCCAGTTCCTGGGCCCGATCAAGTCCAGTTCCTGGGCCCGAACAAGTCCAGTCCCT
AGCTCGATTAGCTÇATCCTGGCTCCCTGGCCTGTTCTTACTTACACTCTTCCCCTTGCTCTGGACTTGTTGCTTTCTTTA
CTCAAGTTGTCTGCCACAGTCCCTAAGCCACCTCTGTAAGACAACTAAGATAATACTTCCCTCAAGCA.CGGGAAGTCCTG
AGTCACCACACCCTCTGGAGGTGTGTGGACACATGTTCATGCGTGTGGTTGCGCTTACGTACGTGTGC
148 :·: : : ·. ·: Γ = / Ú ·· · ·· ·· · · · · · ·· _ Λ · ······· · * ······· · · · ··
Seqüência ID NO:18: Genômica de BEER humano (Este gene tem 2 exons, nas posj-ÇÕes 161-427 abd 3186-5219)
tagaggagaa gtctttgggg agggtttgct ctgagcacac ccctttccct ccctccgggg 60 120
ctgagggaaa catgggacca gccctgcccc agcctgtcct cattggctgg catgaagcag
5 agaggggctt taaaaaggcg accgtgtctc ggctggagac cagagcctgt gctactggaa 180
ggtggcgtgc cctcctctgg ctggtaccat gcagctccca ctggccctgt gtctcgtctg 240
cctgctggta cacacagcct tccgtgtagt ggagggccag gggtggcagg cgttcaagaa 300
tgatgccacg gaaatcatcc ccgagctcgg agagtacccc gagcctccac cggagctgga 360
gaacaacaag accatgaacc gggcggagaa cggagggcgg cctccccacc acccctttga 420
10 gaccaaaggt atggggtgga ggagagaatt cttagtaaaa gatcctgggg aggttttaga 480
aacttctctt tgggaggctt ggaagactgg ggtagaccca gtgaagattg ctggcctctg 540
ccagcactgg tcgaggaaca gtcttgcctg gaggtggggg aagaatggct cgctggtgca 600
gccttcaaat tcaggtgcag aggcatgagg caacagacgc tggtgagagc ccagggcagg 660
gaggacgctg gggtggtgag ggtatggcat cagggcatca gaacaggctc aggggctcag 720
15 aaaagaaaag gtttcaaaga atctcctcct gggaatatag gagccacgtc cagctgctgg 780
taccactggg aagggaacaa ggtaagggag cctcccat.cc acagaacagc acctgtgggg 840
caccggacac tctatgctgg tggtggctgt ccccaccaca cagacccaca tcatggaatc 900
cccaggaggt ga^cccccag ctcgaagggg aagaaacagg ttccaggcac tcagtaactt 960
ggtagtgaga agagctgagg tgtgaacctg gtttgatcca actgcaagat agccctggtg 1020
20 tgtggggggg tgtgggggac agatctccac aaagcagtgg ggaggaaggc cagagaggca 1080
cccctgcagt gtgcattgcc catggcctgc ccagggagct ggcacttgaa ggaatgggag 1140
ttttcggcac agttttagcc cctgacatgg gtgcagctga gtccaggccc tggaggggag 1200
agcagcatcc tctgtgcagg agtagggaca tctgtcctca gcagccaccc cagtcccaac 1260
cttgcctcat tçcaggggag ggagaaggaa gaggaaccct gggttcctgg tcaggcctgc 1320
25 acagagaagc ccaggtgaca gtgtgcatct ggctctataa ttggcaggaa tcctgaggcc 1380
atgggggcgt ctgaaatgac acttcagact aagagcttcc ctgtcctctg gccattatcc 1440
aggtggcaga gaagtccact gcccaggctc ctggacccca gccctccccg cctcacaacc 1500
tgttgggact atggggtgct aaaaagggca actgcatggg aggccagcca ggaccctccg 1560
149
tcttcaaaat ggaggacaag ggcgcctccc
tgggctccag cgactgcctg aagggctgta
tggactccca cgagaggcca cagcccctga
tctgcagagg aagtgcctgg cctaggggcg
5 tccctgggca aatgcccccc tgaccacaca
aaaccagccc acagaccaga aagcagcccc
tgtgcttgct cttcagagtg ggggtggggg
tcttaagact atttttcatt ctttcttgtc
gggtggactg gtactcacac gacgaccagc
10 accataggag acatggtcaa ggtgtgtgca
tctgcctgcc cagggagtat caccatgagg
gtgcccagca gagagccagg tcaatgtttg
agctcagggc ccctatggta ggaaagtaac
cccagcccag cctcccatgg atgctcgaac
15 ggtgctggga ccccagggaa gtggagtccg
ttttctctgg ctgggcctca gtattctcat
tgattccttt caagtctaat gaattcctgt
ccacagcagc tgccctgatt tattaccttc
gtccacccct cccaagtggc tggaaaagga
20 tgtgctgagt acttaccctg cccaggccag
ataagaagac cccagaagag aaatgataat
atatgtgcca aatggtattt tctgcattgc
ggcggcccat tttgcagaca ggaagaagag
ctgcagtgag cgatggagcc ctggtgtttg
25 cagggtgcgc aggagagctt tccaccagct
tgttcagggg caaaagcctc tggagacagg
gacgggccgg tccagggcag gggtggccag
• · · • · · · • · · · • · · • · • · · ··· · • · · ·· · · ··· · ·· ·· ·· ·· · · · • · · · · · ······· · • ··· < • · • · • · « • · • «4
cccacagctc cccttctagg caaggtcagc 1620
aggaacccaa acacaaaatg tccaccttgc 1680
ggaagccaca tgctcaaaac aaagtcatga 1740
ctattctcga aaagccgcaa aatgccccct 1800
cacattccag ccctgcagag gtgaggatgc 1860
agacgatggc agtggccaca tctcccctgc 1920
gtggccttct ctgtcccctc tctggtttgg 1980
acattggaac tatccccatg aaacctttgg 2040
tatttaaaaa gctcccaccc atctaagtcc 2100
ggggatcagg ccaggcctcg gagcccaatc 2160
cgcccattca gataacacag aacaagaaat 2220
tggcagctga acctgtaggt tttgggtcag 2280
gacagtaaaa agcagccctc agctccatcc 2340
gcagagcctc cactcttgcc ggagccaaaa 2400
gagatgcagc ccagcctttt gggcaagttc 2460
tgataatgag ggggttggac acactgcctt 2520
cctgatcacc tccccttcag tccctcgcct 2580
aattaacctc tactcctttc tccatcccct 2640
atttgggaga agccagagcc aggcagaagg 2700
ggaccctgcg gcacaagtgt ggcttaaatc 2760
aataatacat aacagccgac gctttcagct 2820
gtgtgtaatg gattaactcg caatgcttgg 2880
agaggttaag gaacttgccc aagatgacac 2940
aaccccagca gtcatttggc tccgagggga 3000
ctagagcatc tgggaccttc ctgcaataga 3060
cttggcaaaa gcagggctgg ggtggagaga 3120
gcgggcggcc accctcacgc gcgcctctct 3180
ccacagacgt gtccgagtac agctgccgcg agctgcactt cacccgctac gtgaccgatg 3240
150
Figure BRPI9915679B1_D0101
Figure BRPI9915679B1_D0102
ggccgtgccg cagcgccaag ccgtcagccg agctggtgtg ctccggccag tgcggcccgg 3300
cgcgcctgct gcccaacgcc atcggccgcg gcaagtggtg gcgacctagt gggcccgact 3360
tccgctgcat ccccgaccgc taccgcgcgc agcgcgtgca gctgctgtgt cccggtggtg 3420
aggcgccgcg cgcgcgcaag gtgcgcctgg tggcctcgtg caagtgcaag cgcctcaccc 3480
gcttccacaa ccagtcggag ctcaaggact tcgggaccga ggccgctcgg ccgcagaagg 3540
gccggaagcc gcggccccgc gcccggagcg ccaaagccaa ccaggccgag ctggagaacg 3600
cctactagag cccgcccgcg cccctcccca ccggcgggcg ccccggccct gaacccgcgc 3660
cccacatttc tgtcctctgc gcgtggtttg attgtttata tttcattgta aatgcctgca 3720
acccagggca gggggctgag accttccagg ccctgaggaa tcccgggcgc cggcaaggcc 3780
cccctcagcc cgccagctga ggggtcccac ggggcagggg agggaattga gagtcacaga 3840
cactgagcca cgcagccccg cctctggggc cgcctacctt tgctggtccc acttcagagg 3900
aggcagaaat ggaagcattt tcaccgccct ggggttttaa gggagcggtg tgggagtggg 3960
aaagtccagg gactggttaa gaaagttgga taagattccc ccttgcacct cgctgcccat 4020
cagaaagcct gaggcgtgcc cagagcacaa gactgggggc aactgtagat gtggtttcta 4080
gtcctggctc tgccactaac ttgctgtgta accttgaact acacaattct ccttcgggac 4140
ctcaatttcc actttgtaaa atgagggtgg aggtgggaat aggatctcga ggagactatt 4200
ggcatatgat tccaaggact ccagtgcctt ttgaatgggc agaggtgaga gagagagaga 4260
gaaagagaga gaatgaatgc agttgcattg attcagtgcc aaggtcactt ccagaattca 4320
gagttgtgat gctctcttct gacagccaaa gatgaaaaac aaacagaaaa aaaaaagtaa 4380
agagtctatt tatggctgac atatttacgg ctgacaaact cctggaagaa gctatgctgc 4440
ttcccagcct ggcttccccg gatgtttggc tacctccacc cctccatctc aaagaaataa 4500
catcatccat tggggtagaa aaggagaggg tccgagggtg gtgggaggga tagaaatcac 4560
atccgcccca acttcccaaa gagcagcatc cctcccccga cccatagcca tgttttaaag 4620
tcaccttccg aagagaagtg aaaggttcaa ggacactggc cttgcaggcc cgagggagca 4680
gccatcacaa actcacagac cagcacatcc cttttgagac accgccttct gcccaccact 4740
cacggacaca tttctgccta gaaaacagct tcttactgct cttacatgtg atggcatatc 4800
ttacactaaa agaatattat tgggggaaaa actacaagtg ctgtacatat gctgagaaac 4860
tgcagagcat aatagctgcc acccaaaaat ctttttgaaa atcatttcca gacaacctct 4920
151
Figure BRPI9915679B1_D0103
tactttctgt gtagttttta attgttaaaa aaaaaaagtt ttaaacagaa gcacatgaca tatgaaagcc tgcaggactg gtcgtttttt tggcaattct tccacgtggg acttgtccac aagaatgaaa gtagtggttt ttaaagagtt aagttacata tttattttct cacttaagtt 4980 5040 5100 5160
atttatgcaa aagtttttct tgtagagaat gacaatgtta atattgcttt atgaattaac
5 agtctgttct tccagagtcc agagacattg ttaataaaga caatgaatca tgaccgaaag 5220
gatgtggtct cattttgtca accacacatg acgtcatttc tgtcaaagtt gacacccttc 5280
tcttggtcac tagagctcca accttggaca cacctttgac tgctctctgg tggcccttgt 5340
ggcaattatg tcttcctttg aaaagtcatg tttatccctt cctttccaaa cccagaccgc 5400
atttcttcac ccagggcatg gtaataacct cagccttgta tccttttagc agcctcccct 5460
10 ccatgctggc ttccaaaatg ctgttctcat tgtatcactc ccctgctcaa aagccttcca 5520
tagctccccc ttgcccagga tcaagtgcag tttccctatc tgacatggga ggccttctct 5580
gcttgactcc cacctcccac tccaccaagc ttcctactga ctccaaatgg tcatgcagat 5640
ccctgcttcc ttagtttgcc atccacactt agcaccccca ataactaatc ctctttcttt 5700
aggattcaca ttacttgtca tctcttcccc taaccttcca gagatgttcc aatctcccat 5760
15 gatccctctc tcctctgagg ttccagcccc ttttgtctac accactactt tggttcctaa 5820
ttctgttttc catttgacag tcattcatgg aggaccagcc tggccaagtc ctgcttagta 5880
ctggcataga caacacaaag ccaagtacaa ttcaggacca gctcacagga aacttcatct 5940
tcttcgaagt gtggatttga tgcctcctgg gtagaaatgt aggatcttca aaagtgggcc 6000
agcctcctgc acttctctca aagtctcgcc tccccaaggt gtcttaatag tgctggatgc 6060
20 tagctgagtt agcatcttca gatgaagagt aaccctaaag ttactcttca gttgccctaa 6120
ggtgggatgg tcaactggaa agctttaaat taagtccagc ctaccttggg ggaacccacc 6180
cccacaaaga aagctgaggt ccctcctgat gacttgtcag tttaactacc aataacccac 6240
ttgaattaat catcatcatc aagtctttga taggtgtgag tgggtatcag tggccggtcc 6300
cttcctgggg ctccagcccc cgaggaggcc tcagtgagcc cctgcagaaa atccatgcat 6360
25 catgagtgtc tcagggccca gaatatgaga gcaggtagga aacagagaca tcttccatcc 6420
ctgagaggca gtgcggtcca gtgggtgggg acacgggctc tgggtcaggt ttgtgttgtt 6480
tgtttgtttg ttttgagaca gagtctcgct ctattgccca ggctggagtg cagtgtcaca 6540
atctcggctt actgcaactt ctgccttccc ggattcaagt gattctcctg cctcagcctc 6600
152
139
cagagtagct gggattacag gtgcgtgcca ccacgcctgg ctaatttttg tatttttgat 6660
agagacgggg tttcaccatg ttggccaggc tagtctcgaa ctcttgacct caagtgatct 6720
gcctgcctcg gcctcccaaa gtgctgggat tacaggcgtg agccaccaca cccagcccca 6780
ggttggtgtt tgaatctgag gagactgaag caccaagggg ttaaatgttt tgcccacagc 6840
catacttggg ctcagttcct tgccctaccc ctcacttgag ctgcttagaa cctggtgggc 6900
acatgggcaa taaccaggtc acactgtttt gtaccaagtg ttatgggaat ccaagatagg 6960
agtaatttgc tctgtggagg ggatgaggga tagtggttag ggaaagcttc acaaagtggg 7020
tgttgcttag agattttcca ggtggagaag ggggcttcta ggcagaaggc atagcccaag 7080
caaagactgc aagtgcatgg ctgctcatgg gtagaagaga atccaccatt cctcaacatg 7140
taccgagtcc ttgccatgtg caaggcaaca tgggggtacc aggaattcca agcaatgtcc 7200
aaacctaggg tctgctttct gggacctgaa gatacaggat ggatcagccc aggctgcaat 7260
cccattacca cgagggggaa aaaaacctga aggctaaatt gtaggtcggg ttagaggtta 7320
tttatggaaa gttatattct acctacatgg ggtctataag cctggcgcca atcagaaaag 7380
gaacaaacaa cagacctagc tgggaggggc agcattttgt tgtagggggc ggggcacatg 7440
ttctgggggt acagccagac tcagggcttg tattaatagt ctgagagtaa gacagacaga 7500
gggatagaag gaaataggtc cctttctctc tctctctctc tctctctctc actctctctc 7560
tctctcacac acacacacag acacacacac acgctctgta ggggtctact tatgctccaa 7620
gtacaaatca ggccacattt acacaaggag gtaaaggaaa agaacgttgg aggagccaca 7680
ggaccccaaa attccctgtt ttccttgaat caggcaggac ttacgcagct gggagggtgg 7740
agagcctgca gaagccacct gcgagtaagc caagttcaga gtcacagaca ccaaaagctg 7800
gtgccatgtc ccacacccgc ccacctccca cctgctcctt gacacagccc tgtgctccac 7860
aacccggctc ccagatcatt gattatagct ctggggcctg caccgtcctt cctgccacat 7920
ccccacccca ttcttggaac ctgccctctg tcttctccct tgtccaaggg caggcaaggg 7980
ctcagctatt gggcagcttt gaccaacagc tgaggctcct tttgtggctg gagatgcagg 8040
aggcagggga atattcctct tagtcaatgc gaccatgtgc ctggtttgcc cagggtggtc 8100
tcgtttacac ctgtaggcca agcgtaatta ttaacagctc ccacttctac tctaaaaaat 8160
gacccaatct gggcagtaaa ttatatggtg cccatgctat taagagctgc aacttgctgg 8220
gcgtggtggc tcacacctgt aatcccagta ctttgggacg tcaaggcggg tggatcacct 8280
153
Figure BRPI9915679B1_D0104
gaggtcacga gttagagact ggcctggcca gcatggcaaa accccatctt tactaaaaat 8340
acaaaaatta gcaaggcatg gtggcatgca cctgtaatcc caggtactcg ggaggctgag 8400
acaggagaat ggcttgaacc caggaggcag aggttgcagt gagccaagat tgtgccactg 8460
ccctccagcc ctggcaacag agcaagactt catctcaaaa gaaaaaggat actgtcaatc 8520
actgcaggaa gaacccaggt aatgaatgag gagaagagag gggctgagtc accatagtgg 8580
cagcaccgac tcctgcagga aaggcgagac actgggtcat gggtactgaa gggtgccctg 8640
aatgacgttc tgctttagag accgaacctg agccctgaaa gtgcatgcct gttcatgggt 8700
gagagactaa attcatcatt ccttggcagg tactgaatcc tttcttacgg ctgccctcca 8760
atgcccaatt tccctacaat tgtctggggt gcctaagctt ctgcccacca agagggccag 8820
agctggcagc gagcagctgc aggtaggaga gataggtacc cataagggag gtgggaaaga 8880
gagatggaag gagaggggtg cagagcacac acctcccctg cctgacaact tcctgagggc 8940
tggtcatgcc agcagattta aggcggaggc aggggagatg gggcgggaga ggaagtgaaa 9000
aaggagaggg tggggatgga gaggaagaga gggtgatcat tcattcattc cattgctact 9060
gactggatgc cagctgtgag ccaggcacca ccctagctct gggcatgtgg ttgtaatctt 9120
ggagcctcat ggagctcaca gggagtgctg gcaaggagat ggataatgga cggataacaa 9180
ataaacattt agtacaatgt ccgggaatgg aaagttctcg aaagaaaaat aaagctggtg 9240
agcatataga cagccctgaa ggcggccagg ccaggcattt ctgaggaggt ggcatttgag 9300
c 9301
Do acima, será verificado que, embora modalidades 20 específicas da invenção tenham sido descritas aqui para fins ilustrativos, podem ser feitas várias modificações sem se desviar do espírito e escopo da invenção. Por conseguinte, a invenção não está limitada exceto pelas reivindicações apensas.
1/2

Claims (2)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Vetor de expressão CARACTERIZADO por compreender um promotor acoplado, de maneira operável, a uma molécula de ácido nucléico recombinante compreendendo a SEQ ID NO: 1, 5, 9, 11, 13 ou 15, ou sequências complementares destas.
    2 . Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do promotor ser selecionado do grupo consistindo em promotor CMV I-E,
    promotor adiantado de SV40 e MuLV LTR.
    3. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da sequência reguladora ser um promotor específico de tecidos.
    4. Método para produção de uma proteína que reduz o teor de minerais nos ossos CARACTERIZADO por compreender cultivar uma célula que contém o vetor conforme definido em
    qualquer uma das reivindicações 1-3, sob condições e por um período de tempo suficiente para produzir a referida proteína. 5 . Método para produção de ribozima in vitro
    CARACTERIZADO por compreender fornecer DNA recombinante que codifica a ribozima compreendendo uma sequência anti-sentido que se hibridiza especificamente sob condições severas com a SEQ ID NO: 1, sob o controle transcricional de um promotor; e transcrever o DNA para produzir a ribozima.
    6. Kit para detecção de expressão de genes BEER CARACTERIZADO por compreender um recipiente que inclui uma molécula de ácido nucléico, onde a molécula de ácido
  2. 2/2 nucléico é selecionada do grupo consistindo em: (a) uma molécula de ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15; (b) uma molécula de ácido nucléico compreendendo o complemento da sequência de nucleotídeos de (a) ; e (c) uma molécula de ácido nucléico que é um fragmento de (a) ou (b) de pelo menos 20 nucleotídeos em comprimento.
    Cadeia de Cisteína Comum
    1 50 human_gremlin.pro -------------------------------------------------— human_cerberus.pro MHLLLFQLLV LLPLGKTTRH QDGRQNQSSL SPVLLPRNQR.ELPTGNHEEA human_dan.pro -------------------------------------------------human_beer. pro --------—---------------------------------------human_gremlin.pro human_cerberus.pro hutnan_dan. pro human_beer.pro human_gremlin.pro human_cerberus.pro human_dan.pro human_beer.pro
    51 100
    -------------------M SRTAYTVGAL LLLLGTLLPA AEGKKKGSQG
    EEKPDLFVAV PHLVAT.SPA GEGQRQREKM LSRFGRFWKK PEREMHPSRD
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    101 150
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    AFRWEGQGW QAFKNDATEX IPELGEYPEP PPELENNKTM NRAENGGRPP human_gremlin.pro human_cerberus.pro hutnan_dan. pro human_beer.pro
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    201
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    human_gremlin.pro human_cerberus.pro human_dan.pro human_beer.pro
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