BRPI9909107B1

BRPI9909107B1 - Processo para a conversão microbiana de fitosteróis em adrostenodiona e androstadienodiona

Info

Publication number: BRPI9909107B1
Application number: BRPI9909107-0A
Authority: BR
Inventors: James P Kutney; Radka K Milanova; Christo Dimitrov Vassilev; Svetoslav Stefanov Stefanov; Natalya Velikova Nedelcheva
Original assignee: Merck Sharp & Dohme
Priority date: 1998-03-26
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2015-09-01
Also published as: DE69929180D1; EP1066399A1; EP1066399B1; WO1999049075A1; US6071714A; RU2252259C2; DE69929180T2; CA2326121A1; MXPA00009422A; ES2257040T3; DK1066399T3; BRPI9909107B8; ATE314486T1; AU3020699A; BR9909107A; JP2002507432A; JP4038643B2

Description

"PROCESSO PARA A CONVERSÃO MICROBIANA DE FITOSTE- RÓIS EM ANDROSTENODIONA E ANDROSTADIENODIONA" CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se em geral a processos de fermentação, e em particular à bioconversão de composições de fitosterol e androstenodiona e/ou androstadienodiona.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A conversão microbial de fitosteróis (mais fre- quentemente derivados de óleo de soja) por várias linhagens de bactérias é um processo bem conhecido que tem sido usado para a produção comercial de androstenodiona (AD) e andros- tadienodiona (ADD) desde os anos 70. Em geral, o conhecido processo de fermentação envolve a propagação de um mutante de Mycobacterium em um meio nutriente apropriado, transfe- rência da cultura para um bio - reator contendo os fitoste- róis, e então permitindo a biotransformação para AD e/ou ADD em um periodo de aproximadamente 120 horas. Colheita do cal- do de fermentação, extração do último com solvente orgânico, e subsequente cristalização em um solvente orgânico, generi- camente provê os produtos AD e/ou ADD como pulverizados cristalinos brancos. Referências pertinentes que discutem o processo conhecido e resumem os estudos iniciais são como se segue: S. Kraychy, and R.D. Muir, U.S. Patent N° 3,684,657 (1972). W.J. Marsheck, S. Krayohy and R.D. Muir, Appl. Mi- crobiol, 23, 72 (1972). A.H. Conner, M. Nagaoka, J.W. Rowe and D. Perlman, Appl. And Environ. Microbiol, 32, 310 (1976). K. Kleslich, J. Basic Microbiol, 25, 461 (1965) .

Um dos problemas associados como conhecido proces- so de bioconversão de fitosterol (cujo problema importuna toda a indústria de esteróides) envolve a solubilidade pobre do substrato, neste caso uma composição fitosterol, no meio nutriente aquoso. Inadequada solubilidade dita a presença de concentrações somente relativamente baixas de substrato no meio nutriente, resultando em contato pobre com o microorga- nismo e genericamente conduzindo a baixos rendimentos de produtos finais. Longos tempos de fermentação também são ti- picamente necessários para obter-se qualquer grau satisfató- rio de bioconversão.

Um outro problema associado com o processo conhe- cido de bioconversão de fitosterol é que o produto final da bioconversão de fitosteróis (ou composições de fitosteróis) tipicamente contem quantidades significantes de ambos AD e ADD. Dada a similar estrutura química de AD e ADD, é difícil e caro subsequentemente separar estes dois produtos esterói- des um do outro.

Ainda um problema associado com o processo conhe- cido de bioconversão de fitosterol é que o microorganismo usado para efetuar a bioconversão (tipicamente um mutante de Mycobacterium) é crescido e propagado em meios nutrientes que são tipicamente caros de fabricar.

RESUMO DA INVENÇÃO

Uma solução para o problema de solubilidade envol- ve o uso de agentes solubilizantes apropriados selecionados que permitem que a composição de fitosterol seja dissolvida na forma de solução oleosa, pelo que permitindo excelente contato com o microorganismo utilizado na bioconversão, A- gentes solubilizantes conhecidos anteriormente tais como ó- leo de girassol foram verificados somente marginalmente efi- cazes. Um aspecto da presente invenção envolve o desenvol- vimento e uso de agentes solubilizantes altamente eficazes para a bioconversão de uma variedade de composições de fi- tosterol para AD e/ou ADD. As próprias composições de fitos- terol podem ser obtidas de um subproduto do processo de for- mação de polpa de madeira (conhecido como "Tall Oil soap"), a partir de qualquer um dos óleos vegetais comuns (incluin- do, por exemplo, soja, semente de colza, milho, semente de algodão, girassol, oliva, linhaça, e farelo de arroz), ou de uma mistura das fontes acima.

Estes agentes solubilizantes apropriados selecio- nados, que incluem membros da família glicol e membros da família silicone, permitem que altas concentrações de fitos- teróis sejam dissolvidas no meio nutriente. Isto provê exce- lente contato com o microorganismo, reduz tempos de fermen- tação e proporciona rendimentos relativamente altos dos pro- dutos finais.

De acordo com um outro aspecto da invenção, Myco- bacterium MB 3683 No ATCC PTA-352 é utilizado para efetuar a bioconversão de uma composição de fitosterol a AD e/ou ADD.

Foi verificado que bioconversões utilizando Mycobacterium MB3683 No ATCC PTA-352 para fermentar composições de fitos- terol a AD rendem um produto final que é significantemente livre de ADD; ao contrário, bioconversões utilizando Myco- bacterium MB 3683 No ATCC PTA-352 para fermentar composi- ções de fitosterol a ADD rendem um produto final que é sig- nif icantemente livre de AD.

De acordo com ainda um aspecto da invenção, os microorganismos usados para efetuar a bioconversão são cres- cidos e propagados em um meio nutriente compreendendo mela- ços de refinação e sais inorgânicos.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A presente invenção é ilustrada pelos seguintes desenhos não - limitantes, nos quais: A Figura 1 é um gráfico de barra mostrando a por- centagem de bioconversão de fitosteróis a AD sobre o curso de 12 experimentos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo com um processo preferido, os agentes solubilizantes específicos estão dentro da família de gli- cóis. Agentes solubilizantes dentro da família glicol, tal como polipropileno glicol (PPG) permitem a solubilidade de altas concentrações de fitosteróis e, por sua vez, sua efi- ciente bioconversões a AD e/ou ADD. Por exemplo, como mos- trado na Figura 1, bioconversões bem - sucedidas de composi- ções de fitosteróis a AD sob várias condições foram comple- tadas. Em experimentos representativos, a concentração da composição de fitosterol variou de 5 a 30 gramas por litro de meio nutriente. Para aperfeiçoar a interação entre a com- posição de fitosterol e o microorganismo, a composição de fitosterol é dissolvida em uma quantidade selecionada de PPG (por exemplo, 100 gramas ou um quilograma por litro de PPG) e os rendimentos de conversão a AD como mostrados na Figura 1.

De particular significância neste processo é a concentração muito maior de composição de fitosterol (30 gramas ou mais por litro de meio nutriente) que pode ser convertida a AD. A concentração normal empregada em fermen- tações industriais de acordo com os processos conhecidos de bioconversão de fitosterol é 10 gramas por litro de meio nu- triente .

Os Exemplos 1 e 3 ilustram que quando PPG é utili- zado como o agente solubilizante, o processo inventivo per- mite conversão de várias composições de fitosteróis deriva- das de diferentes fontes. O Exemplo 1 descreve descreve a conversão bem sucedida a AD utilizando uma composição de fi- tosterol obtida do subproduto "Tall Oil soap" da indústria de polpa e papel, enquanto o Exemplo 3 mostra a conversão de uma composição de fitosterol obtida de óleo de colza.

Os exemplos notados acima também revelam que o mu- tante de Mycobacterium designado como MB 3683 No ATCC PTA- 352 é capaz de conversão destas diferentes composições de fitosteróis, que variam nas razões relativas de seus prin- cipais componentes (incluindo, por exemplo, beta - sitoste- rol, campesterol, stigmastanol, stigmasterol, brassicaste- rol) a AD. É evidente a partir destes exemplos que várias composições de fitosteróis derivadas de subprodutos deriva- dos da indústria de polpa e papel e/ou de qualquer um dos vários óleos vegetais comuns, todos os quais contêm estes fitosteróis comuns em diferentes razões, podem ser usadas para bioconversão a AD.

Em um outro processo preferido, como exemplificado no Exemplo 2, os específicos agentes solubilizantes estão dentro da família silicone. Como é o caso com agentes solu- bilizantes dentro da família glicol, agentes solubilizantes dentro da família silicone permitem a solubilidade de altas concentrações de fitosteróis e, por sua vez, suas eficientes bioconversões a AD e/ou ADD.

Em todos os exemplos citados, o innoculum de mi- croorganismo é inicialmente crescido em um meio nutriente compreendendo melaços de refinação e sais inorgânicos antes de transferência para o bioreator no qual a bioconversão é realizada.

Bioconversões bem sucedidas são obtidas quando a composição de fitosterol é aquecida na presença do agente solubilizante apropriado selecionado para formar uma consis- tência semelhante a pasta e a última é então adicionada no bioreator contendo o microorganismo e um meio sal inorgânico apropriado.

Durante o processo de fermentação, é importante manter uma temperatura na faixa de cerca de 30-35°C. Monito- ração do pH durante a fermentação revela que o pH pode vari- ar na faixa de aproximadamente 7,0 no período inicial para aproximadamente 4,7 no momento de colheita.

Como mostrado na Tabela 1, o período de fermenta- ção pode variar de cerca de 6-25 dias, dependendo em parte da quantidade de composição de fitosterol (em gramas por li- tro de meio no bioreator) a ser bioconvertida aos produtos finais.

Os rendimentos de AD produzidos podem variar de- pendendo de condições de fermentação, mas rendimentos de 80- 90% podem ser facilmente obtidos como mostrado na Figura 1 (Experimentos Nos. 7-10). O Experimento No. 10 é particular- mente impressionante, com um rendimento de 80% AD em um ní- vel de 30 gramas de composição de fitosterol por litro de meio. Como notado acima, o nível de composição de fitosterol genericamente empregado no processo conhecido de bioconver- são de fitosterol é 10 gramas por litro de meio. O uso de um óleo vegetal (por exemplo, óelo de gi- rassol) como um agente solubilizante (Experimento Nos. 1,2,5) genericamente conduz a um rendimento muito menor de AD. Foi verificado que o uso de óleo vegetal como agente so- lubilizante é de fato prejudicial para o rendimento de AD, mesmo quando ele é misturado com PPG (Exeperimento No. 11) como o agente solubilizante.

Os Exemplos 1 a 5 abaixo representam experimentos de laboratório especificamente bem sucedidos. Entretanto, cada um pode ser extrapolado para aplicação em escala indus- trial, usando-se técnicas industriais conhecidas para imple- mentar a invenção como aqui descrita. EXEMPLO 1 O innoculum de Mycobacterium MB 3683 No ATCC PTA- 352 é preparado em quatro frascos erlenmeier de 2 litros, cada um contendo 500ml do seguinte meio (g/litro); melaços de refinação (54ml), NaN03 (5,4g), NH4H2P04 (0,6g), glucose (6,0g). 0 pH do meio é 7,0. A mistura é deixada crescer por um período de 2-3 dias. A composição de fitosterol obtida de "Tall Oil so- ap" (lOOg) em polipropileno glicol (0,8-1 litro) é aquecida a 100-130°C até uma solução semelhante a pasta cremosa ser obtida. Esta solução é adicionada a um bioreator de 50 li- tros contendo 15 litros de meio sal contendo 0 seguinte (g/litro): NH4N03 (2g), KH2P04 (lg), Na2HP04 (2g), KC1 (0,2g), MgS04 (0,2g), CaCl2 (0,3g), e os seguintes microelementos, adicionados no nível de lml/litro de meio sal, e retirados da seguinte solução estoque típica (g/litro): ZnS04 (llg), MnS04 (6g), FeS04 (lg), CoCl2 (0,3g), CuS04 (0,04g), H3BO3 90,03g), Kl (0,OOlg). O conteúdo inteiro do bioreator é esterilizado a 120°C e resfriado para temperatura ambiente. O innoculum no- tado acima é agora adicionado a este rioreator e a fermenta- ção deixada proceder por 120-144 horas a 35°C. Durante este período, 0 pH inicial de 7,0 varia para 4,7-5,5 no momento de colheita. GLC (ver, por exemplo, Experimentos 6 e 7, Fi- gura 1). Extração da mistura de fermentação com clorofórmio rende um extrato contendo polipropileno glicol e uma mistura de AD/ADD em uma razão variável de 9:1 a 7:3, respectivamen- te. EXEMPLO 2 0 innoculum é preparado como no Exemplo 1, mas com um período de crescimento mais curto (2 dias), em um frasco de 2 litros simples contendo 500ml do meio notado acima. Es- te innoculum é então transferido para um bioreator de 10 li- tros contendo 5 litros do seguinte meio "semente" (g/litro): melaços (54g), KN03 (5,4g), NH4H2P04 (0,6g), óleo de girassol (20ml). Após permitir crescimento no bioreator por um perío- do de 12-16 horas, uma porção (1,5 litros) deste innoculum é então adicionada a um outro bioreator de 50 litros contendo a composição de fitosterol já esterilizada como mostrado a- baixo. A composição de fitosterol, obtida de óleo de se- mente de colza (lOOg), é misturada com silicone (1,6 li- tros), e aguecida a 100-130°C para obter-se uma pasta. Esta pasta é então transferida para um bioreator de 50 litros contendo 15 litros de meio sal da mesma composição como no exemplo 1. Todo o conteúdo é esterilizado a 120°C e resfria- do para temperatura ambiente. A porção (1,5 litros) de inno- culum, como notado acima, é agora transferida para este bio- reator e a fermentação deixada proceder a 35°C por um perío- do de 48 horas. Monitoração GLC revelou gue, neste tempo, uma bioconversão de 90% da composição de fitosterol ocorreu. 0 pH inicial de 7,2 alterou-se levemente para um valor de 7,4. A camada de silicone separada, contendo AD, foi extraída com acetonitrila (3x0,7 litros), e o solvente eva- porado para render o produto bruto. Cristalização do AD bru- to utilizando solventes hidrocarbonetos (n-heptano ou n- hexano) contendo n-butanol (2-5%) ou isopropanol (2-5%), rende uma excelente recuperação (>90%) de AD pura (pureza > 96%) . O innoculum restante (3,5 litros) preparado como notado acima é agora usado no exemplo 3. EXEMPLO 3 0 innoculum restante (3,5 litros) do Exemplo 2 é utilizado neste experimento em maior escala. A composição de fitosterol, obtida de óleo de se- mente de colza (900g, concentração de 30 g/litro) é colocada em um bioreator de 50 litros, dissolvida em polipropileno glicol (8 litros) por aquecimento a 100-130°C e o conteúdo resfriado para temperatura ambiente. O innoculum (3,5 li- tros) é adicionado e a fermentação deixada proceder por um período de 18-25 dias (ver Experimento 10, Tabela 1) . Como no Exemplo 1, este experimento em maior escala similarmente revelou uma mudança do pH inicial de 7,0 para 5,5 no momento de colheita. Monitoração GLC indicou uma bioconversão de 80%. Extração da mistura de fermentação com clorofórmio ren- deu um extrato contendo polipropileno glicol e AD. EXEMPLO 4 0 innoculum de Mycobacterium MB 3683 No ATCC PTA- 352 é preparado em seis frascos erlenmeier de 2 litros cada um contendo 500ml do seguinte meio (g/litro): glucose (lOg), peptona (lOg), extrato de levedura (3g) e extrato de malte (20g) e deixadao crescer por 2 dias durante cujo tempo o pH permaneceu em 7,0. O innoculum (2 litros) dos frascos erlenmeier é então transferido para um bioreator de 30 litros contendo 20 litros do meio sal inorgânico - melaços de refinação do E- xemplo 1 e crescido por 16 horas. O último innoculum (20 li- tros) foi então transferido para um bioreator de 400 litros contendo 200 litros do meio sal inorgânico do Exemplo 1. A composição de fitosterol obtida de semente de colza (um quilograma, concentração de 5 g por litro de meio nutriente) é dissolvida em PPG (dez litros, concentração de lOOg por litro) por aquecimento a 115°C para formar uma pas- ta. Esta pasta é então transferida para o bioreator de 400 litros e a fermentação deixada proceder para um total de 115 horas sob as seguintes condições: aeração de um litro por minuto, agitação em 200 rpm, temperatura de 35°C. O pH vari- ou levemente de 6,45 a 6,6 no momento de colheita.

De modo a avaliar a taxa de bioconversão, alíquo- tas da mistura de fermentação foram retiradas e analisadas.

Os seguintes níveis de bioconversão a AD foram observados: 20 horas (10%), 44 horas (20%), 68 horas (50%), 91 horas (80%), 115 horas (90%). Extração com clorofórmio, como no Exemplo 1, rende um extrato contendo PPG e AD. EXEMPLO 5 Este experimento é uma repetição do Exemplo 4, ex- ceto que o agente solubilizante é silicone no lugar de PPG. A composição de fitosterol (um quilograma) é dis- solvida em silicone (20 litros) por aquecimento a 130°C para formar uma pasta. Esta pasta é transferida para o bioreator de 400 litros contendo 200 litros do meio nutriente como no Exemplo 4. Fermentação sob as condições resumidas no Exemplo 4 e por um período de 120 horas, completou a bioconversão a AD. Extração, da camada de silicone, como no Exemplo 2, com acetonitrila, seguida por cristalização, rendeu AD em 90% de rendimento.

Claims

1. Processo para fermentar uma composição de fi- tosterol para produzir androstenodiona (androst-4-eno-3,17- diona) e androstadienodiona (androsta-1,4-dieno-3r17-diona), compreendendo as seguintes etapas: (a) propagar uma cultura de Micobactéria MB 3683 No ATCC PTA-352 em um meio nutriente; (b) dissolver a composição de fitosterol usando um ou mais agentes solubilizantes selecionados a partir de po- lipropileno glicol e silicone em uma solução, e (c) colocar a cultura e a solução em um biorreator por um tempo suficiente para transformar a solução em an- drostenodiona e androstadienodiona; em que o dito processo é CARACTERIZADO pelo fato de que na etapa (b) a composição de fitosterol é solubiliza- da usando um ou mais agentes solubilizantes selecionados a partir de polipropilenoglicol e silicone, e é aquecida a 100-130 °C até a formação de uma pasta cremosa.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de fitosterol é derivada de sabão de talóleo.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de fitosterol é derivada de um óleo vegetal selecionado adequado.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o óleo vegetal é selecionado do grupo que compreende soja, semente de colza, milho, se- mente de algodão, oliva, girassol, linhaça ou farelo de ar- roz.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio nutriente compreende melaço de forno de refino e sais inorgânicos.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a fermentação é efetuada ae- robicamente.