CS235660B1

CS235660B1 - Způsob výroby 22-hydroxy-23,24-bisnorchola-l,4-dien-3-onu mikrobiálním štěpením postranního řetězce sterolů

Info

Publication number: CS235660B1
Application number: CS812682A
Authority: CS
Inventors: Jiri Protiva; Vladimir Schwarz; Pavel Pihera
Original assignee: Jiri Protiva; Vladimir Schwarz; Pavel Pihera
Priority date: 1982-11-15
Filing date: 1982-11-15
Publication date: 1985-05-15

Abstract

Způsob výroby 22-hydroxy-23,24-bisnorchola-l,4-dien-3-onu spočívající v odštěpení části alifatického postranního řetězce různých zoosterolů a fytosterolů, přičemž 22-hydroxy-23,24-bisnorchola-l,4-dien-3-on je konečným produktem řady reakcí katalysovaných enzy9 my nově vyšlechtěného mutantu Mycobací terium sp. CCM 3528.

Description

Způsob výroby 22-hydroxy-23,24-bisnorchola-l,4-dien-3-onu mikrobiálním štěpením postranního řetězce sterolů

235 660

- 1 235 660

Vynález se týká způsobu výroby 22-hydroxy-23,24-bisnorchola-l,4-'dien-3-onu mikrobiálním odštěpením části alifatického postranního řetězce sterolů za současné oxidace 3β-hydroxylové skupiny enzymatickou činností nově vyšlechtěného bakteriálního kmene, získaného mutací kultury Mycobacterium vaccae ATCC 15483. Nově vyšlechtěný mutant Mycobacterium sp. CCM 3528, uložený v Čel.sbírce mikroorganismů UJEP v Brně, částečně odštěpuje alifatický postranní řetězec různých zoosterolů a fytosterolů, přičemž v médiu se hromadí jako konečný produkt sledu enzymatických reakcí 22-hydroxy-23,24-bisnorchola-l,4-dien-3-on spolu s malým množstvím 22-hydroxy-23,24-bisnorchol-4-en-3-onu, na rozdíl od výchozího kmene Mycobacterium vaccae ATCC 15483, který různé steroly degraduje hluboce až na nízkomolekulární nesteroidní štěpy.

Význam postupu podle vynálezu spočívá mimo jiné v tom, že jím získaný hlavní produkt 22-hydroxy-23,24-bisnorchola-l,4-dien-3-ron je klíčovým meziproduktem pro syntézu význačných steroidních hormonů 20-pregnanonové skupiny, jako jsou kortikoidy, gestageny a jiné, přičemž k biodegradaci používané výchozí steroly jsou snadno dostupné a lze jich použít bez jakékoliv předběžné úpravy jejich chemické struktury.

Je známo, že různé mikroorganismy rozkládají přírodní steroly až na kysličník uhličitý a vodu, aniž by bylo možno zachytit jednotlivé meziprodukty ve využitelném množství. Pouze za přítomnosti enzymových jedů v reakční směsi (Brit.patent 1,113, 887, US patent 3,338,042), nebo při použití uměle připravených laboratorních mutantů (US patent 3',684,654, US patent 3,759,791, US patent 4,293,644) se podařilo isolovat steroidní štěpy s 19 uhlíky, androst-4-en-3,17-dion a androsta-l,4-dien-3,17-dion, vhodné pro syntézu steroidních hormonů.

- 2 235 660

Poněvadž řada cenných léčiv jsou steroidní deriváty zpravidla odvozené od struktury s 21 uhlíky a poněvadž výstavba postranního řetězce u odpovídajících C-19 steroidů je chemicky značně nesnadná, vznikla potřeba vyšlechtit takové mikroorganismy, které by štěpily postranní řetězec sterolů nikoliv beze zbytku, ale za vzniku produktu s více než 19 uhlíky, zejména poté, když jako vedlejší produkt biodegradace různých sterolů mutanty Mycobacterium sp. NRRL B-3683 a Mycobacterium sp. NRRL B-3805 byl v malém množství zachycen 22-hydroxy-23,24-bisnorchol-4-en-3-on a jeho 1-dehydroderivát (US patent 3,684,657, US patent 3,759,791). Množství těchto steroidních štěpů se podařilo u obou zmíněných mutantů zvýšit při biodegradaei sterolů za přítomnosti různých sloučenin boru až na trojnásobek (DT patent 2,757,156).

Postup štěpení sterolů, při kterém jako hlavní produkty vznikají 22-hydroxy-23,24-bisnorchola-l,4-dien-3-on a 22-hydroxy-23,24-bisnorchol-4-en-3-on pomocí mikroorganismu systematicky zařazeného jako Mycobacterium parafortuitum komplex MCI 0617 je chráněn EP 0001622. Podle něho produkční mikroorganismus, který byl získán mutací divokého kmene Mycobacterium parafortuitum komplex ATCC 25790, hromadí jako produkty degradace různých sterolů značná množství výše specifikovaných 22 uhlíkatých štěpů zejména za přítomnosti glyceridů nebo tuků ve fermentačnim médiu.

Mikroorganismus Mycobacterium sp. CCM 3528, používaný v postupu podle vynálezu, byl získán mutací UV zářením z isolátu divokého kmene Mycobacterium vaccae ATCC 15483· Provedením mutagenního zásahu UV zářením a technika výběru žádaných mutantů z ozářené populace jsou odborníkovi dostatečně známé. V tomto vynálezu popsaný mutant Mycobacterium sp. CCM 3528 se odlišuje od dříve popsaného mutantu Mycobacterium parafortuitum komplex MCI 0617 nejen systematickým zařazením výchozího šlechtěného druhu (viz: Bergey^s Manual of Determinative Bacteriology, 8.vydání, 1974), ale zejména vyšší biodegradační aktivitou při nízké náročnosti na složení fermentačni půdy.

Mutant Mycobacterium sp. CCM 3528 má kultivační znaky a většinu znaků morfologických shodných s výchozím kmenem Mycobacterium vaccae ATCC 15483. Kromě výrazně odlišného učinku na steroly se zřetelně odlišuje nepřítomností žluté složky pigmentu, vy235 660

- 3 tvářeného při kultivaci na tekutých nebo ztužených živných médiích. Roste rychle na jednoduchých kultivačních půdách v rozmezí teplot 25 °C až 37 °C. Živné půdy sestávají z asimilovatelných zdrojů uhlíku a dusíku a z minerálních solí. Vhodnými zdroji uhlíku jsou např. sacharosa, glukosa, fruktosa, maltosa, glycerol, kyselina citrónová, kyselina mléčná, melasa a pod. Jako dusíkaté živiny se používají anorganické sole amonné, nebo sloučeniny odvozené od kyseliny dusičné, dále organické zdroje jako jsou pepton, hydrolysát kaseinu, masový extrakt, kvasničný extrakt, kukuřičný extrakt, sojová mouka, bavlníková mouka, arašídová mouka, močovina a pod. Pro průběh a výsledky biodegradace sterolů mutantem Mycobacterium sp. CCM 3528 není rozhodující přítomnost glyceridů nebo tuků, nebo jejich přírodních zdrojů ve fermentačním médiu. Pokud je to nezbytné, mohou se do kultivačního média přidat některé anorganické sloučeniny, např. fosforečnany, sole hořčíku a železa. Potřebné stopové prvky jsou obvykle obsaženy v dostatečném množství v komplexních složkách živného média, nebo v použité vodě. Pro rychlý nárůst mykobaktéria je vhodné upravit počáteční reakci živného média na hodnotu pH v rozmezí 6,0 až 7,5· Kultivace se uskuteční za aerobních podmínek s výhodou za přítomnosti malé koncentrace některé z povrchově aktivních látek. Pokud je to nezbytné, může být složkou živného média protipěnidlo, ovšem jeho přídavek není nezbytně nutný.

K uskutečnění selektivního Štěpení postranního řetězce sterolů se použije rostoucích nebo narostlých buněk Mycobacterium sp. CCM 3528 v kultivačním médiu, nebo suspense buněk z kultivačního média oddělených, nebo se použije do různého stupně.vyčištěných enzymů isolovaných z buněk mykobaktéria.

Jako substráty ke štěpení postranního řetězce enzymatickou činností mikroorganismu Mycobacterium sp. CCM 3528 jsou použitelné cholesterol, β-sitosterol, stigmasterol, kampesterol, ergosterol, nebo směs dvou nebo více sterolů, jako je tomu např. u steroidní frakce získané z talových olejů nebo z desodoračních kondensátů odpadajících při čištění jedlých tuků. Jako substráty jsou vhodné též produkty oxidace přírodních sterolů, nebo jejich 3-estery.

V případě, že se štěpení provede v nativní kultuře, může se steroidní substrát přidat do kultivačního média před jeho steří- 4 235 660 lisací, nebo před zaočkováním, nebo během kultivace a to najednou, nebo po částech. Koncentrace přidávaného sterolu je obecně od 0,01 % do 1,0 % hmotnostních, přičemž doba potřebná k odštěpení části postranního řetězce substrátu je od 10 hodin do 7 dní. Rychlost štěpení je do značné míry úměrná stupni disperse použitého sterolu, který lze přidat v pevné formě jako prášek nebo mikrokryetalickou hmotu, nebo jako roztok ve vhodném rozpouštědle např. dimethylformamidu, nebo jako dispersi sterolu připravenou např. mechanicky nebo působením ultrazvuku, případně za zvýšené teploty, ve vodném prostředí v přítomnosti povrchově aktivní látky.

S výhodou se postup podle vynálezu uskuteční v nativní kultuře Mycobacterium sp. CCM 3528 rostoucí v živném médiu, ke kterému se před sterilisací přidá vodná mikrosuspense sterolu v koncentraci 0,1 % hmotnostních. Po 48 až 96 hodinové inkubaci při 30 °C za aerobních podmínek je biotransfcrmace ukončena. Nahromaděné steroidní produkty se z kultivačního média extrahují vhodným organickým rozpouštědlem s vodou omezeně mísitelným a hlavní produkt, 22-hydroxy-23,24-bisnorchola-l,4-dien-3-on se isoluje ze surového extraktu krystalisací. Výtěžek hlavního produktu se vypočítá ze vztahu p

Ϊ =----------- _f

Q . S kde Y značí výtěžek v procentech molárních, S je množství spotřebovaného substrátu v gramech, P je množství čistého produktu v gramech a Q je poměr molekulových hmotností produktu a substrátu.

Podrobnosti postupu podle vynálezu vyplývají z příkladů provedení, které však tento způsob nijak neomezují pouze na uvedené podmínky.

- 5 Příklad 1 ^{235 θΒ0}

Ve varné baňce obsahu 6 litrů se vysterilisuje 1OOO ml živného média obsahujícího 5,0 g glycerolu, 8,0 g kukuřičného extraktu (50 % hmotnostních sušiny), 5,0 g peptonu, 2,0 g KHgPO^, 1,0 g ífigSQ^ kryst., 1,0 g polyethylensorbitanmonooleátu (Tween 80) a upraveného roztokem hydroxidu draselného na pH 7,0. Před sterilisací se přidá k živnému médiu vodná mikrosuspense připravená z 1,0 g cholesterolu. Obsah baňky se sterilisuje 30 minut při 120 °C. Po ochlazení na kultivační teplotu 30 °C se obsah baňky zaočkuje 50 ml submersního inokula Mycobacterium sp. CCM 3528 starého 24 hodin a inkubuje se na reciprokém třepacím stroji 66 hodin. Poté se kultivační médium opakovaně extrahuje dichlormethanem, spojené organické výtřepky se promyjí vodou, vysuší bezvodým síranem sodným a organické rozpouštědlo se oddestiluje za zvýšené teploty ve vakuu. Odparek se rozpustí v nejmenším množství ©etanu ethylnatého a z roztoku se krystalisací získá 585 mg (výtěžek 76 %) 22-hydroxy-23,24-bisnorchola-1,4-dien-3-onu o t.t. 181 až 183 °C, /a/p +28° (chloroform).

Z matečných louhů se chromatografii na sloupci silikagélu dále získá po eluci směsí benzen - octan ethylnatý 98 : 2 90 mg nezreagovaného cholesterolu, směsí benzen - octan ethylnatý 87 :

: 13 dalších 75 mg 22-hydroxy-23,24-bisnorchola-l,4-dien-3-onu o t.t. 180 až 182 °C, směsi benzen - octan ethylnatý 85 : 15 malá množství 24-norchol-4-en-3,22-dionu o t.t. 192 až 195 °C a 24-norchola-l,4-dien-3,22-dionu o t.t. 220 až 224 °C.

- Příklad 2

K 1000 ml živného média popsaného v příkladu 1 se před sterilisací přidá vodná mikrosuspense připravená z 1,0 g β-sitosterolu. Po sterilisaci 30 minut při 120 °C a po ochlazení na kultivační teplotu 30 °C se živné médium zaočkuje 50 ml 24 hodin starého submersního inokula Mycobacterium sp. CCM 3528 a inkubuje se na reciprokém třepacím stroji 90 hodin. Produkty biotransformace se z kultivačního média extrahují a pak isolují jak je popsáno v příkladu 1. Získá se 0,31 g čistého krystalického 22-hydroxy-23>24-bisnorchola-l,4-dien-3-onu (výtěžek 55 %} a 0,29 g nezreagováného β-sitosterolu.

Příklad 3

K 1000 jsi živného média popsaného v příkladu 1 se před sterilisací přidá vodná mikrosuspense připravená z 1,0 g stigmasterolu.

- 6 235 660

Po sterilisaci 30 minut při 120 °C a po ochlazení na kultivační teplotu 30 °C se živné médium zaočkuje 50 ml 24 hodin starého submersního inokula Mycobacterium sp· CCM 3528 a inkubuje se na reciprokém třepacím stroji 90 hodin. Produkty biotransformace se z kultivačního média extrahují a pak isolují jak je popsáno v příkladu 1. Získá se 0,47 g Čistého krystalického 22-hydroxy-23,24-bisnorchola-l,4-dien-3-onu (výtěžek 69 %) a 0,15 g ne*· zreagovaného stigmasterolu.

Příklad 4

K 1000 ml živného média popsaného v příkladu 1 se před sterilisací přidá vodná mikrosuspense připravená z 1,0 g směsi sterolů isolovaných z desodoračního kondensátu (složení: 46 % hmotnostních β-sitosterolu, 32 % kampesterolu, 11 % brasikasterofcu, 6 % cholesterolu a 4,5 % stigmasterolu). Po sterilisaci 30 minut při 120 °G a po ochlazení na kultivační teplotu 30 °C se živné médium zaočkuje 50 ml 24 hodin starého submersního inokula Mycobacterium sp. CCM 3528 a inkubuje se na reciprokém třepacím stroji 90 hodin. Produkty biotransformace se z kultivačního média extrahují a isolují jak je popsáno v příkladu 1. Získá se 0,39 g čistého krystalického 22-hydroxy-23,24-bisnochola-l,4~dien-3-onu (výtěžek 67 %) a 0,28 g směsi nezreagovaných sterolů. Příklad 5

K 1000 ml živného média popsaného v příkladu 1 se před sterilisací přidá vodná mikrosuspense připravená z 1,0 g směsi sterolů isolovaných z talového oleje (složení: 80 % hmotnostních β-sitosterolu a 20 % kampesterolu). Po sterilisaci 30 minut při 120 °C a po ochlazení na kultivační teplotu 30 °C se živné médium zaočkuje 50 ml 24 hodin starého submersního inokula Mycobacterium sp. CCM 3528 a inkubuje se na reciprokém třepacím stroji 90 hodin. Produkty biotransformace se z kultivačního média extrahují a pak isolují jak je popsáno v příkladu 1. Získá se 0,51 g čistého krystalického 22-hydroxy-23»24-bisnorchola-l,4-dien-3-onu (výtěžek 68 %) a 0,06 g směsi nezreagovaných sterolů.

Claims

ř Ě S Β Μ I I VYH/lBZU

235 660

Způsob výroby 22-hydroxy-23,24-bisnorohola-l,4*dien-3-onu mikrobiálním odštěpením části postranního řetězce sterolů, např. cholesterolu/ /5 -sitosterolu, stigmasterolu, kampesterolu, brasikasterolu, ergosterolu nebo směsi dvou nebo vine sterolů, popřípadě produktů jejich oxidace nebo jejich 3-esterů, vyznačující se tím, že se ke štěpení využívá čin* nosti enzymů mutantu Myeobacterium sp. CCM 3528 při výchozí koncentraci steroidního substrátu 0,02 $ až 1 $ hmot. a při ¹ pH reakční směsi v rozmezí hodnot 6,0'aš 8,8, za aerobních podmínek.