CS235661B1 - Způsob výroby l,4-androstadien-3,17-dionu mikrobiálním odštěpením postranního řetězce sterolů - Google Patents

Abstract

Způsob výroby l,4-androstadien-3,Í7 -dionu mikrobiálním odštěpením postranního řetězce sterolů, přičemž 1,4-androstadien-3,17-dion je konečný produktem řady reakcí katalysovaných enzymy nově vyšlechtěného mutantu Mycobacterium sp. CCM 3529.

Description

(54) Způsob výroby l,4-androstadien-3,17-dionu mikrobiálním odštěpením postranního řetězce sterolů

Způsob výroby l,4-androstadien-3,Í7 -dionu mikrobiálním odštěpením postranního řetězce sterolů, přičemž 1,4-androstadien-3,17-dion je konečný produktem řady reakcí katalysovaných enzymy nově vyšlechtěného mutantu Mycobacterium sp. CCM 3529.

235 661

- 1 235 661

Vynález se týká způsobu výroby l,4-androstadiea-3,17-dionu mikrobiálním odštěpením postranního*řetězce sterolů enzymatickou činností nově vyšlechtěného bakteriálního kmene, získaného mutací kultury Myoobacterium vaccae ATCC 15483· Nově vyšlechtěný mutant Mycobacterium sp· CCM 3529, uložený v Čsl.sbírce mikroorganismů UJEP v Brně, odštěpuje enzymaticky alifatický postranní řetězec různých zoosterolů a fytosterolů, přičemž ee ja** ko konečný produkt reakce hromadí l,4-androetadiea-3,17-dion doprovázený malým množstvím 4-androsten-3,17-dionu, 22-hydroxy-23»24-bisnorchola~l,4-dien-3-onu a 173-hydroxy-l,4-androstadien-3-onu, na rozdíl od kmene Mycobacterium vaccae ATCC 15483, který degraduje různé zoosteroly a fytosteroly na nízkomolekulární ne steroidní ětěpy.

Význam postupu podle vynálezu spočívá mimo jiné v tom, že jím získaný hlavní produkt, l,4-androstadiea-3,17-dion, je klíčovým meziproduktem pro syntézu různých steroidních hormonů, přičemž používaná výohozí steroly jsou levné «snadné dostupné a lze je použít bez jakékoliv předběžné úpravy jejich struktury.

Je známo, že některé druhy Arthrobacter, Mycobacterium, Proactinomyces a jiných rodů mohou tvořit ze sterolů androstanové sloučeniny, avšak výlučně za přítomnosti enzymových inhibitorů jako jsou ionty kadmia, kobaltu, niklu, slava, selenu a podobné (Brit.pat. 1,113,887, Steroids 11, 401, 1968), nebo chelátotvorné Činidla jako jsou např.α,a'-dipyridyl, 1,10-fsnanthrolin, 8-hydroxychinolin, β-naftol atd. (VS pat. 3,388, 042).

Později Marsheck a spol. (US pat. 3,684,657, US pat. 3,759, 791, Appl.Miorobiol. 23, 72, 1972) popsali postup mikrobiální degradace některých sterolů na l,4-androstadien-3,17-dion resp· 4-androsten-3,17-dion laboratorními mutanty označenými Mycobac235 681

- 2 terium sp. NRRL B-3805 a Mycobacterium ap. NRRL B-3683, které získali z populace isolátu neidentifikovaného půdního mykobaktéria po mutagenním zásahu UV světlem.

Vovcha a Biggs (US pat. 4,293,644) získali mutací baktérie Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 nitrosoguanidinem nový mutant Mycobacterium fortuitum NRRL B-11045, který štěpí selektivně postranní řetězec sterolů za vzniku 4-androaten-3,17-dionu.

Výše zmíněná mutantní mykobaktéria hromadí ve fermentačním médiu značná množství androstanovýoh sloučenin, aniž by ve významné míře docházelo k degradaci ateroidního jádra, přičemž není potřebná přítomnost jakéhokoliv enzymového inhibitoru.

Mikroorganismus Mycobacterium sp. CCM 3529, používaný v postupu podle vynálezu, byl získán mutací UV zářením z isolátu divokého kmene Mycobacterium vaccae ATCC 15483· Provedení mutagenního zásahu UV světlem a technika výběru žádaných mutantů z ozářené populace jsou odborníkům dostatečně známé. V tomto vynálezu popsaný mutant Mycobacterium sp. CCM 3529 se odlišuje od ostatních dosud známých laboratorních mutantů mykobaktérií podobného použití nejen systematickým zařazením výchozího šlechtěného druhu (viz: Bergey's Manuel of Determinative Baoteriology, 8.vydání, 1974), ale zejména vyšší biodegradační aktivitou za srovnatelných reakčnich podmínek.

Mutant Mycobacterium sp. CCM 3529 má většinu morfologiekých a kultivačních znaků shodných s divokým kmenem Mycobacterium vaccae ATCC 15483· Kromě výrazně odlišného účinku na steroly se zřetelně odlišuje nepřítomností žluté složky buněčného pigmentu, vytvářeného při kultivaci na tekutých nebo ztužených živných půdách. Roste rychle na jednoduchých kultivačních půdách v rozmezí teplot 25 °C až 37 °C. Živné půdy sestávají z asimilovatelného zdroje uhlíku, dusíku a z minerálních solí. Vhodnými zdroji uhlíku jsou např. sacharosa, glukosa, fruktosa, maltosa, glycerol, kyselina oitronová, kyselina mléčná, melasa atd. Jako zdroje dusíku se používají anorganické sole amonné, nebo sloučeniny odvozené od kyseliny dusičné, dále organické zdroje jako jsou pepton, hydrolysát kaseinu, masový extrakt, kvaeničný extrakt, kukuřičný extrakt, sojová mouka, bavlníková mouka, arašídová mouka, močovina apod.

Pokud je to třeba, mohou se přidat do kultivačního média

- 3 235 681 některé anorganické sloučeniny, např. fosforečnany, sole hořčíku a železa. Nezbytné stopové prvky jsou obvykle v dostatečném množství obsaženy v komplexních složkách živného média, nebo v použité vodě. Fro rychlý nárůst mykobaktéria je vhodné upravit počáteční reakci živného média na hodnotu pH v rozmezí 6,0 až 7,5. Kultivace se uskuteční za aerobních podmínek s výhodou za přítomnosti malé koncentrace některé z povrchově aktivních látek. Ke stimulaci růstu Mycobacterium sp. CCM 3529 není třeba přidávat jakékoliv další anorganické nebo organické sloučeniny na rozdíl od jiných mykobaktérií s podobným účinkem (US pat. 3., 684,657).

K uskutečnění selektivního štěpení se použije rostoucích nebo narostlých buněk Mycobacterium sp. CCM 3529 v kultivačním médiu, nebo suspense buněk isolovaných z živného média, nebo se použije do různého stupně vyčištěných enzymů isolovaných z buněk mykobaktéria. K selektivnímu odštěpení postranního řetězce enzymatickou činností mikroorganismu Mycobacterium sp. CCM 3529 jsou jako steroidní substráty použitelné cholesterol, β-sitosterol, stigmasterol, kampesterol, ergosterol, nebo směs dvou hebo více sterolů, jako je tomu např. u steroidní frakce získané z talových olejů nebo z desodoračních kondensátů odpadajících při čištění jedlých tuků. Jako substráty štěpení jsou vhodné též produkty oxidace výše zmíněných sterolů, nebo jejich 3-estery.

V případě, že se odštěpení provede v nativní kultuře, může se steroidní substrát přidat do kultivačního média před jeho sterilisací, nebo před zaočkováním, nebo během kultivace a to najednou nebo po částech. Koncentrace přidávaného sterolu je od 0,01 % do 1,0 % hmotnostních, přičemž doba potřebné k odštěpení postranního řetězce substrátu je od 10 hodin do 7 dní. Rychlost štěpení ©

je do značné míry závislá na stupni disperse použitého sterolu, který lze přidat jako prášek, nebo jako roztok ve vhodném organickém rozpouštědle, např. dimethylformamidu, nebo jako disperse sterolu připravená např. mechanicky, nebo působením ultrazvuku, případně za zvýšené teploty, ve vodném prostředí v přítomnosti povrchově aktivní látky.

S výhodou se postup odštěpení postranního alifatického řetězce sterolu uskuteční v nativní kultuře Mycobacterium sp. CCM

3529 rostoucí v Živném médiu, ke kterému se před sterilisací přidá vodná mikrosuspense sterolu v koncentraci 0,1 % hmotnostních.

- 4 235 551

Po 48 až 96 hodinové inkubaci při 30 °C za aerobaích podmínek je přidaný sterol rozštěpen. Vzniklé eteroidní produkty ae z kultivačního média extrahují vhodným organickým rozpouštědlem 8 vodou omezeně míeitelným a isolují ae chromátografieky. Výtěžek 1,4-androstadien-3,17-dionu se vypočítá ze vztahu

100 . P

Y -----------Q . 3 kde Y je výtěžek v procentech molárních, S je množství spotřebovaného substrátu v gramech, P je množství čistého produkt v gramech a Q je poměr molekulových hmotností produktu a substrátu.

Podrobnosti postupu podle vynálezu vyplývají z příkladů provedení, které však tento způeob nijak neomezují pouze na uvedené podmínky.

- 5 Příklad 1 235 661

Ve varné baňce obsahu 6 litrů 3e vyaterilisuje 1000 ml živného média obsahujícího 10,0 g glukosy, 15»0 g kukuřičného extraktu (50 % hmotnostních sušiny), 1,0 g KEyPO^, 0,5 g MgSO^ kryst.,

1,0 g polyethylensorbitanmonobleátu (Tween 80) a upraveného roztokem hydroxidu draselného na pH 7,0. Před sterilisací se přidá k živnému médiu vodné mikrosuspense z 1,0 g cholesterolu. Po ochlazení na kultivační teplotu 30 °C se obsah baňky zaočku, je 50 ml submersního inokula Mycobacterium sp. CCM 3529 starého 24 hodin a inkubuje se na reciprokém třepacím stroji 60 hodin.

* Poté se kultivační médium opakovaně extrahuje dichlormethanem. Spojené organické výtřepky se vyuší bezvodým síranem sodným a organické rozpouštědlo se oddestiluje za zvýšené teploty ve vakuu. Surový produkt se rozpustí v nejmenším množství benzenu a jednotlivé steroidní složky se isoluji chromatografií na sloupci silikagelu. Po eluci směsí benzen - octan ethylnatý 98 ί 2 se získá 30 mg nezreagovaného cholesterolu, směsí benzen - octan ethylnatý 96 : 4 až 90 : 10 se získá 482 mg (výtěžek 67 %) 1,4-androstadien-3,17-dionu, t.t. 131 až 134 °C, /α/ρ +109 ⁰ (chloroform), směsí benzen - octan ethylnatý 87 : 13 se získá 22 mg 22-hydroxy-23,24-bisnorchola-l,4-dien-3-onu, t.t. 180 až 182 °C, /a/p +28 ⁰ (chloroform) a směsí benzen - octan ethylnatý 83 ί 17 se získá 15 mg 17p-hydroxy-l,4-androstadien-3-onu, t.t. 163 až 166 °C, /a/jj +18 ⁰ (chloroform).

Příklad 2

K 1000 ml živného média, popsaného v příkladu 1, se před sterilisací přidá vodná mikrosuspense z 1,0 g β-sitosterolu. Po ochlazení na kultivační teplotu 30 °C se obsah baňky zaočkuje 50 ml submersního 24 hodiny starého inokula Mycobacterium sp. CCM 3529 a inkubuje se na reciprokém třepacím stroji 72 hodin. Produkty biotransformace se z kultivačního média extrahují dichlormethanem a isolují sloupcovou chromatografií, jak je popsáno u příkladu 1. Získá se 0,20 g nezreagovaného β-sitosterolu a 0,24 g krystalického l,4-androstadien-3,17-dionu (výtěžek 44 %).

Příklad 3

K 1000 ml živného média popsaného v příkladu 1 se před sterilisací přidá vodná mikrosuspense z 1,0 g stigmasterolu. Po ochlazení na kultivační teplotu 30 °C se obsah baňky zaoěkuj® 50 ml hodiny starého submersního inokula Mycobacterium sp. CCM

- 6 235 861

3529 a inkubuje se na reciprokém třepacím stroji 96 hodin. Produkty biotransformace se z kultivačního média extrahují dichlormethanem a isolují sloupcovou chromatografií, jak je popsáno v příkladu 1. Získá se 0,15 g nezreagováného stigmasterolu a 0,25 g krystalického l,4-androstadien-3,17-dionu (výtěžek 41 %)· Příklad 4

K 1000 ml živného média popsaného v příkladu 1 se před sterilisací přidá vodná mikrosuspense z 1,0 g směsi sterolů isolovaných z desodoračního kondensátu (složení: 46 % hmotnostních β-sitosterolu, 32 % kampesterolu, 11 % brasikasterolu, 6 % cholesterolu a 4,5 % stigmasterolu). Po ochlazení na kultivační teplotu 30 °C se obsah baňky zaočkuje 50 ml 24.hodin starého aubmersního inokula Mycobacterium sp. COM 3529 a inkubuje se na reciprokém třepacím stroji 96 hodin. Produkty biotransformace se z kultivačního média extrahují dichlormethanem a isolují sloupcovou chromatografií, jak je popsáno v příkladu 1. Získá se 0,18 g směsi nezreagovaných výchozích sterolů a 0,38 g krystalického 1,4-androstadien-3,17-dionu (výtěžek 65 %)*

Příklad 5

K 1000 ml živného média, popsaného v příkladu 1, se před sterilisací přidá vodná mikrosuspense z 1,0 g sterolů isolovaných z talových olejů (složení: 80 % hmotnostních β-sitosterolu a 20 % kampesterolu). Po ochlazení na kultivační teplotu 30 °C se obsah baňky zaočkuje 50 ml 24 hodin starého submersního inokula Mycobacterium sp. CCM 3529 a inkubuje se na reciprokém třepacím stroji 96 hodin. Produkty biotransformace se z kultivačního média extrahují dichlormethanem a isolují sloupcovou chromatografií jak je popsáno v příkladu 1. Získá se 0,10 g směsi výchozích nezreagovaných sterolů a 0,40 g krystalického 1,4-androstadien-3,17-dionu (výtěžek 64 %) ·

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   235 661

   Způsob výroby l,4-Androstadien-3,17-dionu mikrobiálním odštěpením postranního řetězce sterolů, např. cholesterolu, fb wsitosterolu, stigmasterolu, kampesterolu, brasikasterolu, ergosterolu, nebo směsi dvou nebo více sterolů, případně produktů jejich oxidace, nebo jejich 3-esterů, vyznačující se tím, že se ke Štěpení využívá činnosti enzymů mutantu Mycobacterium sp. CCM 3529 při výchozí koncentraci steroidníhe substrátu 0,C2 $ až 1 % hmot. a při pH reakční směsi v rozmezí hodnot 6,0 až 8,8, za aerobních podmínek.