MXPA00009422A - Proceso para la conversion microbiana de fitoesteroles a androstendiona y androstadiendiona. - Google Patents

Abstract

Se describe un proceso novedoso para la fermentacion de composiciones de fitoesteroles a androstendiona (androst-4- en3,17-diona, AD) y/o androstadiendiona (androsta-1,4- dieno-3,17-diona, ADD). El proceso utiliza el microorganismo Mycobacterium MB 3683, y agentes solubilizantes adecuadas seleccionadas tales como polipropilen glicol o silicona para solubilizar las composiciones de fitoesteroles en altas concentraciones en el medio nutriente. El inoculado de Mycobacterium MB 8683 se hace creer en un medio nutriente que comprende melaza de refinadores y sales inorganicas.

Description

PROCESO PARA LA CONVERSIÓN MICROBIANA DE FITOESTEROLES A ANDROSTENDiONA Y ANDROSTADIENDIONA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere en general a procesos de fermentación, y en particuiar a la bioconversión de composiciones de fitoesteroles a androstendiona y/o androstadiendiona.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La conversión microbiana de fitoesteroles (derivados lo más frecuentemente de frijol de soya) mediante varias cepas de bacterias es un proceso bien conocido que le ha sido usado para la producción comercial de androstendiona (AD) y androstadiendiona (ADD) desde mediados de los 70's. En general, los procesos de fermentación conocidos involucran ia propagación de un mutante de Micobacterium en un medio nutriente apropiado, transferir el cultivo a un bioreactor que contiene los fitoesteroles, y después permitir la biotransformación a AD y/o ADD durante un periodo de aproximadamente 120 horas. La cosecha del caldo de fermentación, extracción del último con un solvente orgánico, y cristalización subsecuente en un solvente orgánico, proporciona generalmente los productos AD y/o ADD, como polvos cristalinos blancos. Referencias pertinentes que discuten los procesos conocidos y resumen los estudios iniciales son como sigue: S. Kraychy, y R. D. Muir, Patente de E. U., No. 3,684,657 (1972). W. J. Marsheck, S. Kraychy y R. D. Muir, Appi. Microbiol. , 23, 72 (1972).

A. H . Conner, M. Nagaoka, J . W. Rowe y D. Perlman, Appl. and Environ.

Microbiol. , 32, 310 (1976). K. Kieslich, J . Basic Microbiol., 25, 461 (1985). Uno de los problemas asociado con el proceso conocido de bioconversión de fitoesteroles (dicho problema inunda la industria de esteroides entera) involucra la pobre solubilidad del substrato, en este caso una composición de fitoesteroles, en el medio nutriente acuoso. La solubilidad inadecuada dicta la presencia de solamente concentraciones relativamente bajas de sustratos en el medio nutriente, resultando en contacto pobre con el microorganismo y conduciendo generalmente a bajos rendimientos de productos finales. Los tiempos largos de fermentación son necesarios también típicamente para alcanzar cualquier grado satisfactorio de bioconversión. Otro problema asociado con ei proceso conocido de bíoconversión de fitoesteroles es que el producto final de la bioconversión a partir de fitoesteroles (o composiciones de fitoesteroles) contiene típicamente cantidades significativas de ambas AD y ADD. Dada fa estructura química similar de AD y ADD, es difícil y caro separar subsecuentemente esos dos productos esteroides uno de otro. Un problema más, asociado con el proceso conocido de bioconversión de fitoesteroles, es que el microorganismo usado para efectuar la bioconversión (típicamente un mutante de Micobacterium) se hace crecer y se propaga en medios nutrientes que son típicamente caros de fabricar.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Una solución para ei problema de la solubilidad involucra el uso de agentes solubilizantes adecuados seleccionados que permitan que la composición de fitoesterol se disuelva para formar una solución clara, por lo que se permite excelente contacto con el microorganismo usado en la bioconversión. Se ha encontrado que los agentes solubilizantes conocidos anteriormente tales como aceite de girasol son solamente efectivos marginalmente. Un aspecto de la presente invención involucra el desarrollo y uso de agentes solubilizantes altamente efectivos para la bioconversión de una variedad de composiciones de fitoesterotes a AD y/o ADD. Las composiciones de fitoesteroles mismas se pueden obtener a partir de un subproducto del proceso de pulpa de madera (conocido como "jabón de subproducto de la producción de pulpa química de madera"), de cualquiera de los aceites vegetales comunes (incluyendo por ejemplo soya, colza, maíz, algodón, girasol, oliva, linaza y salvado de arroz), o a partir de una mezcla de las fuentes anteriores. Estos agentes sol?bilizantes adecuados seleccionados, que incluyen miembros de la familia de los glicoles y miembros de la familia de los silicones. permiten que se disuelvan altas concentraciones de fitoesterofes en el medio nutriente. Esto proporciona excelente contacto con el microorganismo, reduce tiempos de fermentación, y da rendimientos relativamente altos de productos finales. De acuerdo con otro aspecto la invención, se utiliza Micobacterium MB 3683 para efectuar la bioconversión de una composición de fitoesteroles a AD y/o ADD. Se ha encontrado que las bioconversiones que utilizan Micobacterium MB 3683 para fermentar las composiciones de fitoesteroles a AD dan un producto final que está significativamente libre de ADD; inversamente, las bioconversiones que utilizan Micobacterium MB 3683 para fermentar composiciones de fitoesteroles a ADD dan un producto final que está significativamente libre de AD. De acuerdo con un aspecto más de la invención, los microorganismos usados para efectuar la bioconversión se hacen crecer y propagas en un medio nutriente que comprende melaza de refinadores y sales inorgánicas.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención se ilustra mediante el siguiente dibujo no limitativo en el cual: La figura 1 es una gráfica de barras que muestra el por ciento de bioconversión de fitoesteroles a AD en el curso de 12 experimentos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un proceso preferido, los agentes solubilizantes específicos están dentro de la familia de los glicoles. Los agentes solubilizantes dentro donde la familia de los glicoles. tales como polipropilén glicol (PPG). permiten la solubilidad de altas concentraciones de fitoesteroles y, a su vez, sus bioconversiones eficientes a AD y/o ADD. Por ejemplo, como se muestra en ia Figura 1 , se han completado bioconversiones exitosas de composiciones de fitoesteroles a AD bajo varias condiciones. En ensayos representativos, la concentración de la composición de fitoesteroles ha variado desde 5 hasta 30 gramos por litro de medio nutriente. Para mejorar la interacción entre la composición de fitoesteroles y el microorganismo, la composición de fitoesteroles se disuelve en una cantidad seleccionada de PPG (por ejemplo, 100 gramos o un kg por litro de PPG) y la conversión conduce a AD determinado como se muestra en ta Figura 1. De significancia particular en este proceso es ta concentración mucho más alta de composición de fitoesteroles (30 gramos o más por litro de medio nutriente) que puede ser convertida a AD. La concentración normal empleada en fermentaciones industriales de acuerdo con los procesos de bioconversión de fitoesteroles conocidos es de 10 g por litro de medio nutriente. Los Ejemplos 1 y 3 ilustran que cuando se utiliza PPG como el agente solubilizante, el proceso de la invención permite la conversión de varias composiciones de fitoesteroles derivados de diferentes fuentes. El Ejemplo 1 , describe la conversión exitosa a AD utilizando una composición de fitoesteroles obtenida a partir del subproducto de "jabón de subproducto de la producción de pulpa química de madera" de la industria de pulpa y papel, mientras que el Ejemplo 3 muestra la conversión de una composición de fitoesteroles obtenida a partir del aceite de colza. Los Ejemplos anotados anteriormente revelan también que el mutante de Micobacteríum designado como MB 3683 es capaz de convertir estas composiciones de fitoesteroles, las cuales varían en las proporciones relativas de sus componentes principales (incluyendo por ejemplo beta-sitosterol, campesterol, estigmasterol, brassicasterol) a AD. Es evidente a partir de estos ejemplos que las varias composiciones de fitoesteroles derivadas de subproductos de la industria de pulpa y papel y/o de cualquiera de los varios aceites vegetales comunes, todos cuales contienen estos fitoesteroles comunes en diferentes relaciones, se pueden utilizar para la bioconversión a AD. En otro proceso preferido, como se ejemplifica en el Eiemplo 2. los agentes solubilizantes específicos están dentro de la familia de la siliconas. Como es el caso con agentes solubilizantes dentro de la familia de los glicoles. los agentes solubilizantes dentro donde la familia de las siliconas permiten la solubilidad de altas concentraciones de fitoesteroles y. a su vez, sus bioconversiones eficientes a AD y/o ADD. En todos los Ejemplos citados, la inoculación de microorganismo se hace crecer inicialmente en un medio nutriente que comprende melaza de refinadores y sales inorgánicas antes de transferirlo al bioreactor en el cual se realiza la bioconversión. Las bioconversiones exitosas se logran cuando la composición de fitoesteroles se calienta en ia presencia del agente solubilizante adecuado seleccionado para formar una consistencia como pasta, y el último se agrega entonces ai bioreactor que contiene el microorganismo y un medio de sales inorgánicas apropiado. Durante el proceso de fermentación, es importante mantener una temperatura en el rango de aproximadamente 30-35° C. La supervisión del pH durante la fermentación reveta que el pH puede variar en el rango de aproximadamente 7.0 en el pepodo inicial a aproximadamente 4.7 en el momento de la cosecha. Como se muestra en la Tabla 1 , el periodo de fermentación puede variar desde aproximadamente 6-25 días, dependiendo en parte de la cantidad de composición de fitoesteroles (en gramos por litro de medio en el bioreactor) a ser bioconvertidos en los productos finales. Los rendimientos de AD producida pueden variar dependiendo de las condiciones de fermentación, pero rendimientos de 80-90% se pueden lograr fácilmente como se muestra en ia Figura 1 , (Experimentos Nos. 7-10). El Experimento No. 10 es particularmente impresionante, con un rendimiento de 80% de AD en un nivel de 30 gramos de composición de fitoesteroles por litro de medio. Como se anotó anteriormente, el nivel de composición de fitoesteroles generalmente empleado en los procesos conocidos de bioconversión de fitoesteroles es de 10 gramos por litro de medio. El uso de aceite vegetal (por ejemplo aceite de girasol) como agente solubilizante (Experimentos Nos. 1 , 2, 5), conduce generalmente a un rendimiento mucho menor de AD. Se encontrado que el uso de aceite vegetal como agente solubilizante es de hecho perjudicial al rendimiento de AD, aún cuando esté mezclado con PPG (Expepmento No. 11) como el agente solubilizante. Los Ejemplos 1 a 5 más adelante representan pruebas de laboratorio específicamente exitosas. Sin embargo, cada uno puede ser extrapolado para aplicación a escala industrial usando técnicas industriales conocidas para impfementar la invención como se describe en la presente.

Eiemplo 1 La inoculación de Micobacterium MB 3683 se prepara en cuatro matraces Erlemeyer de dos litros, conteniendo cada uno 500 ml del siguiente medio (gm/litro): melaza de refinadores (54 ml), NaN?3 (5.4 gm), NH4H2PO4 (0.4 gm), glucosa (6.0 gm). El pH def medio es 7.0. La mezcla se deja crecer durante un periodo de 2-3 días. La composición de fitoesteroles obtenida del "jabón de subproducto de ta producción de pulpa química de madera" (100 gm) en polipropilén glicol (0.8-1 litros) se Calienta 100-130° C hasta que se obtiene una solución cremosa como pasta. Esta solución se agrega a un bioreactor de 50 litros que contiene 15 litros de medio salino que contiene lo siguiente (gm/litro): NH4NO3 (2 gm), KH2P04 (1 gm), Na2HPO4 (2 gm), KCl (0.2 gm), MgSO4 (0.2 gm), CaCl (0.3 gm), y los siguientes microelementos, agregados en el nivel de 1 mL/litro de medio salino, y extraídos de la siguiente solución típica de almacén (gm/litro): 2nSO (1 1 gm), MnSO (6 gm), FeSO4 (1 gm), C0CI2 (0.3 gm), CuSO4 (0.04 gm), H3BO3 (0.03 gm), Kl (O.OOl gm). Los contenidos enteros en el bioreactor se esterilizan a 120° C y se enfrían a temperatura ambiente. La inoculación antes anotada se agrega ahora a este bioreactor y se deja proceder ta fermentación durante 120-144 h a 35° C. Durante este pepodo, el pH inicial de 7.0 varía a 4.7-5.5 en el momento de la cosecha. GLC (ver, por ejemplo, experimentos 6 y 7, Figura 1 ). La extracción de la mezcla de fermentación con cloroformo rinde un extracto que contiene polipropilén glicol y una mezcla de AD/ADD en una relación variante de 9: 1 a 7:3 respectivamente.

Ejemplo 2 El inoculado se prepara como en el Ejemplo 1 , pero con un periodo de crecimiento más corto (2 días), en un matraz sencillo de dos litros que contiene 500 ml del medio antes anotado. Esta inoculado se transfiere después a un bioreactor de 10 litros que contiene 5 litros del siguiente medio de "semilla" (gm/litro): melaza (54 gm), KNO3 (5.4 gm), NH4H2PO4 (0.6 gm), aceite de girasol (20 mi). Después de dejar crecer en el bioreactor durante un pepodo de 12-16 h, se agrega entonces una porción (1.5 litros) de este inoculado a otro bioreactor de 50 litros que contiene la composición de fitoesteroles ya esterilizada como se muestra más adelante. La composición de fitoesteroles, obtenida a partir de aceite de colza (100 gm), se mezcla con silicona (1.6 litros) y se calienta a 100-130° C para obtener una pasta. Esta pasta se transfiere entonces a un bioreactor de 50 litros que contiene 15 litros de medio salino de la misma composición como en el Ejemplo 1. El contenido entero se esteriliza a 120° C, y se enfría a temperatura ambiente. La porción de inoculado (1.5 litros), como se anotó antes, se transfiere ahora a este bioreactor y se deja que la fermentación proceda a 35° C durante un periodo de 48 h. La supervisión de GLC reveló que, en este momento, había tenido lugar un 90% de la bioconversión de la composición de fitpesteroles. El pH inicial de 7.2 se había alterado ligeramente hasta 7.4. La capa separada de silicona, que contiene AD, se extrajo con acetonitrilo (3 x 0.7 litros), y se evaporó el solvente para dar el producto crudo. La cristalización de la AD cruda utilizando solventes de hidrocarburo (n-pentano o n-hexano) conteniendo n-butanol (2-5%) o isopropanof (2-5%), permitió una excelente recuperación (>90%) de AD puro (pureza >96%). El inoculado restante (3.5 litros) preparado como se anotó anteriormente se usó ahora el Ejemplo 3.

Eiemplo 3 El inoculado restante (3.5 litros) del Ejemplo 2 se utilizó en este experimento de escala más grande. La composición de fitoesteroles, obtenida a partir de aceite de colza (900 gm, concentración de 30 gm/litro) se coloca en un bioreactor de 50 litros, se disuelve en polipropilén glicot (8 litros) mediante calentamiento a 100-130° C y el contenido se enfría a temperatura ambiente. El inoculado (3.5 litros) se agregó y se dejó proceder la fermentación durante un periodo de 18-25 días (Experimento 10, Tabla ,1). Como en el Ejemplo 1 , este experimento a mayor escala reveló de manera similar un cambio de pH inicial de 7.0 a 5.5 en el momento de la cosecha. La supervisión de GLC indicó una bioconversión de 80%. La extracción de la mezcla de fermentación con cloroformo proporcionó un extracto que contiene polipropilén glicol y AD.

Eiemplo 4 El inoculado de Micobacteríum MB 3683 se preparó en seis matraces Erlenmeyer conteniendo cada uno 500 ml del siguiente medio (gm/litro): glucosa (10 gm), peptona (10 gm), extracto de levadura (3 gm) y extracto de malta (20 gm) y se dejó crecer durante dos días durante cuyo tiempo el pH permaneció en 7.0. Et inoculado (2 litros) de los matraces Erlenmeyer se transfirió después a un bioreactor de 30 litros que contiene 20 litros del medio de melaza de refinadores-sal inorgánica del Ejemplo 1 y se dejó crecer durante 16 horas. El último inoculado (20 litros) se transfirió después a un bioreactor de 400 litros que contiene 200 litros del medio de sal inorgánica del Ejemplo 1. La composición de fitoesteroles obtenida a partir de colza (un kilogramo, concentración de 5 gm por litro de medio nutriente) se disolvió en PPG (10 litros, concentración de 100 gm por litro) mediante calentamiento a 115° C para formar una pasta. Esta pasta se transfirió después al bioreactor de 400 litros y se dejó proceder la fermentación durante un total de 1 15 horas bajo las siguientes condiciones: aireación de un litro por minuto, agitación a 200 rpm, temperatura de 35° C. El pH varió ligeramente de 6.45 a 6.6 en el momento de la cosecha. Con el fin de calcular ta proporción de bioconversión, se extrajeron y analizaron alícuotas de la mezcla de fermentación. Se observaron los siguientes niveles de bioconversión a AD: 20 horas (10%), 44 horas (20%), 68 horas (50%), 91 horas (80%), 115 horas (90%). La extracción con cloroformo, como en el Ejemplo 1 , permitió un extracto que contiene PPG y AD.

Ejemplo 5 Este experimento es una repetición del Ejemplo 4 excepto por que ei agente solubilizante es silicona en lugar de PPG. La composición de fitoesteroles (1 kg) se disolvió en silicona (20 litros) mediante calentamiento a 130° C para formar una pasta. Esta pasta se transfirió al bioreactor de 400 litros que contiene 200 litros del medio nutriente como en el Ejemplo 4. La fermentación bajo las condiciones resumidas en el Ejemplo 4 y durante un periodo de 120 horas, completó ia bioconversión a AD. La extracción, de la capa de silicona, como en el Ejemplo 2, con acetonitrilo, seguida por cristalización, permitió un rendimiento de 90%. Aunque se han mostrado y descrito aspectos, modalidades y aplicaciones particulares de la presente invención, se entenderá, por supuesto, que la invención no está limitada a éstos, puesto que se pueden hacer modificaciones por aquellos expertos en las tecnologías aplicables, particularmente a la luz de la descripción precedente. Las reivindicaciones adjuntas incluyen dentro de su ámbito tales modificaciones y variantes de las modalidades ejemplificativos de ia invención descritas en la presente como sería aparente para aquellos expertos en las tecnologías aplicables.

Tabla 1 Exp No. Conc. Fitoesteroles Conc. Fitoesteroles Tiempo Por Ciento de (gm) por L de Medio por Vol. de Agente (días) Bioconversión Solubilizante 1 5 1 Kg/L aceite" 7 30 2 5 1 Kg L aceite" 7 30 3 5 1 Kg/L PPGb 7 60 4 5 Micronizado no agente » 10 40 5 1 Kg/L aceite" 7 50 6 5 1 Kg/L PPGb 7 70 7 5 100 gm/L PPGb 7 90 8 10 100 gm L PPGb 12 90 9 5 50 gm/L PPGD 6 90 30 100 gm/L PPGb 25 80 11 5 200 gm/L PPGb/L aceite" 12 70 12 Vapor- sin otros aditivos 14 50 a+++ aceite de girasol b+++ polipropilén glicol

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES 1. Un proceso para fermentar una composición de fitoesteroles para producir androstendiona (androst-4-en-3, 17-diona) y androstadiendiona (androsta-1 ,4-dieno,3, 17-diona) que comprende: propagar un cultivo de Micobacterium MB 3683 en un medio nutriente; disolver la composición de fitoesteroles usando uno o más agentes solubilizantes en una solución; y, colocar el cultivo y la solución en un bioreactor durante un tiempo suficiente para transformar ta solución en androstendiona y androstadiendiona.
2. 2. El proceso de la reivindicación 1 en donde la composición de fitoesteroles se deriva de jabón de subproducto de la producción de pulpa química de madera.
3. 3. El proceso de la reivindicación 1 en donde la composición de fitoesteroles se deriva de un aceite vegetal seleccionado adecuado.
4. 4. El proceso de la reivindicación 3 en donde el aceite vegetal se selecciona del grupo que comprende soya, conza, maíz, semilla de algodón, girasol, oliva, linaza o salvado de arrozo.
5. 5. El proceso de la reivindicación 1 en donde el agente solubilizante es un miembro de la familia de los glicoles.
6. 6. El proceso de la reivindicación 1 en donde el agente solubilizante es propilén glicot.
7. 7. El proceso de la reivindicación 1 en donde el agente solubilizante es un miembro de la familia de las siliconas.
8. 8. El proceso de la reivindicación 1 en donde el agente sotubilizante es silicona.
9. 9. El proceso de la reivindicación 1 en donde el medio nutriente comprende melaza de refinadores y sales inorgánicas.
10. 10. El proceso de la reivindicación 1 en donde la fermentación se lleva a cabo aeróbicamente.
11. 11. En la bioconversión microbiana de fitoesteroles a androstendiona, ei uso de Micobacterium MB 3683.
12. 12. En la bioconversión microbiana de fitoesteroles a androstadiendiona, el uso de Micobacterium MB 3683.
13. 13. En la bioconversión microbiana de fitpesteroies a androstendiona, ei uso de un miembro de la familia de los glicotes como un agente solubilizante para los fitoesteroles.
14. 14. En la bioconversión microbiana de fitoesteroles a androstadiendiona, el uso de un miembro de la familia de los glicoles como un agente solubilizante para los fitoesteroles.
15. 15. En la bioconversión microbiana de fitoesteroles a androstendiona, el uso de propilén glicoi como un agente solubilizante para los fitoesteroles.
16. 16. En la bioconversión microbiana de fitoesteroles a androstadiendiona, el uso de polipropilén glicol como un agente solubilizante para ios fitoesteroles.
17. 17. En la bioconversión microbiana de fitoesteroles a androsténdiona, el uso de un miembro de la familia de las siliconas como un agente solubilizante para fos fitoesteroles.
18. 18. En la bioconversión microbiana de fitoesteroles a androstadiendiona, el uso de un miembro de la familia de las siliconas como un agente solubilizante para los fitoesteroles.
19. 19. En la biocanversión microbiana de fitoesteroles a androstendiona, el uso de silicona como un agente solubilizante para los fitoesterotes.
20. 20. En la bioconversión microbiana de fitoesteroles a androstadiendiona, el uso de silicona como un agente solubilizante para los fitoesteroles.
21. 21. En el crecimiento y propagación de un microorganismo para uso en la bioconversión de fitoesteroles a androstendiona y androstadiendiona, el uso de un medio nutriente que comprende melaza de refinadores y sales inorgánicas.