BRPI0916101B1 - método para determinar o estágio de uma gravidez empregando um dispositivo portátil adequado para venda ao público, dispositivo portátil para venda ao público adaptado para detectar os níveis/a quantidade de lactogênio placentário humano (hpl) ou de um fragmento detectável do mesmo, e uso de um anticorpo anti-hpl em um dispositivo portátil adequado para venda ao público - Google Patents

Description

(54) Título: MÉTODO PARA DETERMINAR O ESTÁGIO DE UMA GRAVIDEZ EMPREGANDO UM DISPOSITIVO PORTÁTIL ADEQUADO PARA VENDA AO PÚBLICO, DISPOSITIVO PORTÁTIL PARA VENDA AO PÚBLICO ADAPTADO PARA DETECTAR OS NÍVEIS/A QUANTIDADE DE LACTOGÊNIO PLACENTÁRIO HUMANO (HPL) OU DE UM FRAGMENTO DETECTÁVEL DO MESMO, E USO DE UM ANTICORPO ΑΝΤΙ-HPL EM UM DISPOSITIVO PORTÁTIL ADEQUADO PARA VENDA AO PÚBLICO (73) Titular: GUY'S AND ST. THOMAS'S NHS FOUNDATION TRUST, Sociedade do Reino Unido. Endereço: THE COUNTING HOUSE, GREAT MAZE POND, LONDON SEI 9RT - REINO UNIDO, REINO UNIDO(GB); ANATOLE SEBASTIAN MENON-JOHANSSON, Médico(a). Endereço: 104 CARDINGTON SQUARE, HOUNSLOW MIDDLESEX TW4 6AJ - REINO UNIDO, REINO UNIDO(GB) (72) Inventor: ANATOLE SEBASTIAN MENON-JOHANSSON.

Código de Controle: EE45F75B8D96EF47 5FBDE3B59999F17A

Prazo de Validade: 20 (vinte) anos contados a partir de 16/11/2009, observadas as condições legais

Expedida em: 13/11/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

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MÉTODO PARA DETERMINAR O ESTÁGIO DE UMA GRAVIDEZ EMPREGANDO UM DISPOSITIVO PORTÁTIL ADEQUADO PARA VENDA AO PÚBLICO, DISPOSITIVO PORTÁTIL PARA VENDA AO PÚBLICO ADAPTADO PARA DETECTAR OS NÍVEIS/A QUANTIDADE DE LACTOGÊNIO PLACENTÁRIO HUMANO (HPL) OU DE UM FRAGMENTO DETECTÁVEL DO MESMO, E USO DE UM ANTICORPO ΑΝΤΙ-HPL EM UM DISPOSITIVO PORTÁTIL ADEQUADO PARA VENDA AO PÚBLICO

DESCRIÇÃO

A descrição refere-se a um método e a um dispositivo para o estabelecimento do estágio aproximado de gravidez (gestação) de uma fêmea humana, com base no estabelecimento da concentração do lactogênio placentário humano (hPL) ou de um fragmento correspondente do mesmo em uma amostra de fluido corpóreo da dita fêmea humana. A descrição também se refere ao uso de um anticorpo anti-hPL para identificação do estágio da gravidez.

Os testes de gravidez são amplamente utilizados pelos profissionais de saúde e pelas pessoas. Os testes de gravidez estão disponíveis em supermercados e em farmácias há vários anos. Uma das marcas mais famosas é o CLEARBLUE®. Os testes mais recentes são apresentados como dispositivos simples, robustos (ver, por exemplo, o documento EP 0291194), que podem prontamente ser utilizados em casa pelas pessoas e o resultado é dado em questão de minutos. Os testes são baseados na detecção da presença ou da ausência de um hormônio humano, a gonadotrofina coriônica (hCG) na urina da fêmea humana.

Tradicionalmente, o resultado do teste era positivo ou negativo, isto é, gravidez ou não gravidez. No entanto, foi lançado recentemente um teste mais sofisticado onde a concentração de hCG é utilizada para estabelecer se a fêmea humana está grávida de 1-2, 2-3 ou 3/3+ semanas. Este teste é descrito no pedido de patente publicado WO 2006/100415.

Embora este teste novo seja útil, a informação fornecida quando o tempo de gravidez é maior do que três

Petição 870180061990, de 18/07/2018, pág. 14/21

2/21 semanas é muito limitada.

Isto quer dizer que ele simplesmente indica que o tempo de gravidez é de 3 semanas ou mais.

Se o estágio da gravidez não puder ser calculado com base na informação que a própria fêmea humana grávida puder fornecer, por exemplo, por causa de uma informação incompleta ou imprecisa, a única outra maneira de datar a gravidez, atualmente, é com a varredura por ultrassom. Embora a precisão da varredura por ultrassom para determinação do estágio da gravidez seja geralmente muito alta e apresente precisão de 3 ou 4 dias, essa exatidão pode ser reduzida nas varreduras realizadas antes da 13^a semana de gravidez. Além disso, não é praticável determinar rotineiramente o estágio de uma gravidez utilizando uma varredura de ultrassom por causa das implicações de recursos e ônus no sistema de saúde. Atualmente, dada a grande demanda por varreduras, a primeira varredura por ultrassom é feita em aproximadamente 13 semanas, a menos que haja suspeitas de complicações na gravidez.

Seria muito útil estar na posição de datar uma gravidez sem os recursos de uma varredura por ultrassom, utilizando preferivelmente um teste não invasivo simples.

O autor da presente invenção descobriu que o estágio de uma gravidez pode ser correlacionado à concentração do hormônio humano lactogênio placentário.

Esse mesmo hormônio é conhecido há vários anos e foi apresentado como um biomarcador de anormalidades na gravidez e/ou no feto, tais como pré-eclampsia e aneuploide cromossômico fetal, entre outras. Ver, por exemplo, a patente norte-americana 7.235.359.

No entanto, até onde sabemos, ele nunca foi apresentado como útil na determinação do estágio de uma gravidez normal.

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Desse modo, em um aspecto, é apresentado um método de determinação do estágio de uma gravidez que compreende as etapas de quantificar a concentração de hPL em uma amostra de fluido corpóreo derivada de uma fêmea humana, selecionada dentre uma amostra de sangue, plasma, soro e/ou urina, e estabelecer o estágio da gravidez correspondente.

O hPL também é conhecido como o hormônio somatomamotropina coriônico 1 ou coriomamotropina lactogênio. O UniProt indica que o peptídeo tem um comprimento de 217 aminoácidos, tal como mostrado na sequência ID n° 1, mas também parece existir na forma de um comprimento de 190 ou 191 aminoácidos. O hormônio tem duas subunidades.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra o perfil de secreção do hPL em nmol/1 como uma função das semanas de gravidez.

A Figura 2 mostra uma realização simples de um arranjo de teste apropriado para indicar o estágio de uma gravidez.

As Figuras 3 e 4 mostram vários arranjos de um dispositivo com uma unidade de exibição digital.

A Figura 5 mostra o arranjo de um dispositivo para leitura do resultado.

É interessante o fato que há uma correlação entre a massa da placenta e a quantidade de hPL presente e há a hipótese de que cada célula trofoblástica sintetiza uma quantidade fixa de hPL por dia e que,à medida que o número de células aumenta, também aumenta a quantidade de hPL sintetizado e secretado. Por essa razão, o hPL foi proposto como um marcador útil para detectar determinadas anormalidades durante a gravidez, especialmente no período de 30-35 semanas, no terceiro trimestre de gravidez. Somente níveis muito baixos de hPL são secretados antes de 6 semanas. Depois de 6 semanas a quantidade secretada aumenta exponencialmente até aproximadamente a 24^a semana, quando a curva de concentração começa a se nivelar (ver figura 1).

O estágio de gravidez, tal como aqui empregado, refere-se à associação de um ponto no tempo com a gravidez, por exemplo, o número de semanas da gestação, tais como 1; 2;

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3;	4; 5;	6;	7; 8; 9; 10; 11; 12;	13; 14; 15; 16;	17;	18; 19;
20;	21;	22;	23; 24; 25; 26; 27;	28; 29; 30; 31;	32;	33; 34;
35;	36;	37;	38; 39; 40; 41; 42 semanas ou faixas	das	mesmas.
Não	se	refere simplesmente à	provisão de um resultado

binário, isto é, um resultado positivo ou negativo, de gravidez ou não gravidez.

A quantificação da quantidade de hPL ou de outro hormônio aqui indicado pode ser a quantidade absoluta, a massa por volume de unidade, moles (nano moles etc.) por volume de unidade ou unidades internacionais por volume de unidade, e inclui também o estabelecimento da quantidade relativa, por exemplo, pela referência a um padrão. Em uma realização, o método empregado é semi-quantitativo.

O fragmento, tal como aqui empregado, refere-se a um fragmento detectável que corresponde à quantidade real de hPL presente, e pode incluir uma subunidade tal como a subunidade-a.

Em uma realização, o método pode caracterizar os pontos de tempo a seguir em uma gravidez: 6 semanas ou menos, 6 a 9 semanas, 10 a 12 semanas, 13 a 15 semanas, 16 a 18 semanas, 19 a 21 semanas e/ou 21 a 24 semanas.

Os estágios menores do que 6 semanas podem ser caracterizados por uma concentração de hPL de 2 nmol/1 ou menos. O estágio de 6 semanas até 9 semanas pode ser caracterizado por uma concentração na faixa acima de 2 nmol/1 até aproximadamente 9 nmol/1. O estágio de 10 a 12 semanas pode ser caracterizado por uma concentração na faixa acima de 9 nmol/1 a aproximadamente 34 nmol/1. O estágio de 13 a 15

5/21 semanas pode ser caracterizado por uma concentração na faixa acima de 80 nmol/1 a aproximadamente 95 nmol/1. 0 estágio de 16 a 18 semanas pode ser caracterizado por uma concentração na faixa acima de 95 nmol/1 a aproximadamente 105 nmol/1. 0 estágio de 19 a 21 semanas pode ser caracterizado por uma concentração na faixa acima de 105 nmol/1 a aproximadamente 200 nmol/1. O estágio de 22 semanas a 24 semanas pode ser caracterizado por uma concentração na faixa acima de 200 nmol/1 a aproximadamente 225 nmol/1.

Em uma realização, o método pode caracterizar entre os estágios de gravidez a seguir: 6 semanas ou menos, 7/8 semanas, 9 semanas, 10/11 semanas, 11/12 semanas, 12/13 semanas, 14/15/16 semanas, 17/18 semanas, 18/19 semanas, 19/20 semanas, 21 semanas, 22 semanas, 23 semanas e/ou 24 semanas ou mais.

Uma concentração de hPL de 0,04 mg/1 ou abaixo pode ser indicativa de uma gravidez no período de 6 semanas ou menos. Uma concentração de hPL na faixa de 0,04-0,05 mg/1 pode ser indicativa de uma gravidez de 7/8 semanas. Uma concentração de hPL na faixa de 0,1 a 0,2 mg/1 pode ser indicativa de uma gravidez de 9 semanas. Uma concentração de hPL na faixa de 0,25 a 0,3 5 mg/1 pode ser indicativa de uma gravidez de 10/11 semanas. Uma concentração de hPL na faixa de 0,3 a 0,5 mg/1 pode ser indicativa de uma gravidez de 11/12 semanas. Uma concentração de hPL na faixa de 0,65 a 0,7 mg/1 pode ser indicativa de uma gravidez de 12/13 semanas. Uma concentração de hPL de aproximadamente 0,9 mg/1 pode ser indicativa uma gravidez de 14/15/16 semanas. Uma concentração de hPL de aproximadamente 1,5 mg/1 pode ser indicativa de uma gravidez de 17/18 semanas. Uma concentração de hPL de aproximadamente 2,5 mg/1 pode ser indicativa de uma gravidez de 19/20 semanas.

As figuras identificadas acima são baseadas nas

6/21 quantidades de hPL no soro. Embora o hPL tenha uma meia vida curta no soro, parece que, devido ao tamanho do peptídeo, pelo menos algum hPL é filtrado do glomérulo para a urina. Uma vez na urina, o hPL parece ser protegido contra 5 degradação ou degradação posterior. Desse modo, o perfil de secreção de hPL na urina parece seguir a mesma curva que a observada no soro, mesmo que as quantidades absolutas de hPL na urina sejam mais baixas do que aquelas observadas no soro.

No entanto, técnicas analíticas de detecção, tais como os 10 ensaios ELISA, podem detectar e quantificar as quantidades de hPL na urina, o qual, depois de um período de 24 horas, em uma gravidez de cerca de 8 semanas, é aproximadamente 10 pg.

O presente método pode ser aplicado na determinação do estágio de gravidez acima de 24 semanas. As quantidades de 15 hPL no soro até o fim da gravidez podem alcançar o nível aproximado de 5-7 mg/1.

Pelo menos as quantidades de hPL mostradas na

Tabela 1 foram identificadas na urina:

Tabela 1

Gestação (semanas)	Gestação (dias)	Nível (microgramas)
8	56	10
14	98	13,1
14,4	101	17,7
19,2	135	56,9
24,3	170	59,5
25,4	178	31,1
28,2	198	100,4
29	203	69,2
31,7	222	76,4
31,9	223	36,5
31,9	223	121,5

7/21

34,1	239	93,2
36,6	256	105

As quantidades absolutas de hPL detectadas e/ou extraídas da amostra dependem das técnicas exatas empregadas. Quanto mais sensível a técnica, mais alto o valor que pode finalmente ser detectado. Desse modo, os níveis na tabela 1 podem ser mais altos, dependendo de qual técnica é empregada.

A presente descrição é particularmente apropriada para estabelecer o estágio da gravidez quando a mulher está no primeiro ou no segundo trimestre de gravidez.

Em uma realização, o método é apropriado para caracterizar uma semana de gestação da outra, em particular quando as semanas caem dentro da faixa 7 a 28 semanas.

Os métodos para estabelecer o estágio de gravidez com base em um hormônio (analito) e nos algoritmos que possam ser adaptados para uso na presente descrição são descritos no documento WO 2006/100415 (ver, em particular, da página 11 à página 16).

Ê muito conveniente poder estabelecer o estágio de uma gravidez com base na tecnologia de fluxo lateral, que emprega a urina como amostra. Portanto a tecnologia aqui descrita é propensa a ter uma ampla aplicação, e pode ser prontamente implementada por técnicos no assunto correspondente.

O teste acima pode naturalmente ser executado após a realização de um teste baseado nos níveis de hCG que tenha identificado a fêmea humana como grávida. Isto pode ser importante para uma gravidez não confirmada em um estágio inicial porque um teste baseado somente em hPL antes de 6 semanas não pode confirmar a gravidez. Desse modo, em uma realização, um dispositivo que testa as concentrações de hPL é provido em um kit com um dispositivo separado que testa os níveis de hCG, por exemplo, o CLEARBLUE EASY®.

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Em uma realização no método de acordo com a presente descrição, uma combinação de níveis do hormônio é medida, por exemplo, a concentração de hPL e hCG é medida, por exemplo, concomitante ou sequencialmente, no mesmo dispositivo (ou alternativamente em dispositivos separados). Isto é particularmente útil quando a gravidez está em um estágio de seis semanas ou menos porque permite que o estágio de gravidez seja estabelecido como 1 a 2 semanas, 2 a 3 semanas ou 3 a 6 semanas, além de os estágios serem identificados empregando somente o hPL.

Isto pode, por exemplo, ser conseguido empregando um único dispositivo que compreende múltiplas, tais como 2, 3 ou 4, tiras de teste separadas.

Alternativamente, ou além disso, o método pode também testar as concentrações de relaxina. Assim como o hCG, este hormônio é secretado logo depois da implantação e, portanto, a relaxina e o hPL podem ser utilizados em combinação para verificar o estágio das gravidezes, por exemplo, acima de e incluindo o estágio de 6 semanas, além de os estágios serem identificados empregando somente o hPL.

Em uma realização, a relaxina é utilizada em um ensaio que testa se uma amostra indica que a fêmea correspondente, da qual foi derivada, está grávida, e um teste subsequente é realizado para determinar os níveis de hPL a fim de estabelecer o estágio da gravidez.

Os níveis de relaxina estão em seus níveis mais altos em torno das semanas 10 a 12. Desse modo, em combinação com pelo menos o hPL e opcionalmente outros hormônios, por exemplo, aqueles aqui descritos, a relaxina pode ser particularmente útil para caracterizar as gravidezes no estágio de 10 a 12 semanas.

Os níveis de estradiol não-conjugado tornam-se significativos aproximadamente na 13^a de gravidez e podem ser

9/21 utilizados em combinação com pelo menos o hPL e opcionalmente outros hormônios, especialmente aqueles aqui descritos, para identificar o estágio correspondente de gravidez. A combinação de estradiol e hPL pode ser particularmente útil para, em particular, caracterizar as gravidezes no estágio de 13 semanas.

Outros hormônios que podem ser analisados em um método/dispositivo de acordo com a presente descrição incluem o hormônio luteinizante e/ou o hormônio folículo estimulante.

Em uma realização, o presente método é apropriado para identificar um estágio de gravidez na faixa de 6 a 28 semanas, por exemplo, 7 a 24 semanas, tais como 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 semanas ou suas combinações.

Em uma realização alternativa, que envolve, por exemplo, a análise de pelo menos dois hormônios (analitos), um estágio de gravidez pode ser identificado na faixa de 1-2, 2-3, 3-6 semanas, sendo que os estágios restantes podem ser identificados por alguma das realizações aqui descritas.

Os métodos de medição dos níveis de hormônio incluem o ensaio de proteína, a HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência), a SDS-Page, a transferência Western e os imunoensaios. Há formas diferentes de imunoensaios, por exemplo, empregando enzimas e/ou fluorescência. Uma forma particularmente sensível de imunoensaio é o ensaio ELISA (ensaio imunoabsorvente de ligação de enzimas), indicado às vezes indicado como um ensaio sanduíche. 0 fato de que o teste emprega dois anticorpos distintos direcionados ao mesmo alvo aumenta a precisão/especificidade do teste.

Exemplos de tecnologia apropriada que pode ser adaptada para implementar a presente descrição são descritos no documento EP 0219194, ver em particular a página linhas 14-23, que descrevem tiras de teste, página 2 linhas 27-36,

10/21 que descrevem um dispositivo típico, página 2 linhas 37-55, que descrevem a fase sólida porosa posterior e o sanduíche e os ensaios de competição, página 3 linhas 34-39, que discutem as propriedades apropriadas do veículo poroso, tais como a nitrocelulose, no contexto de permitir o movimento das etiquetas/partículas. O último texto também discute sobre se as etiquetas/partículas apropriadas estarão geralmente na faixa de tamanho de 0,05 a 0,5 mícron.

As etiquetas apropriadas também incluem partículas coloridas de material, por exemplo, sol de ouro, sol de tintura ou um polímero colorido, tal como o laytex, que se acumula para prover um sinal/resultado, em particular em uma zona de detecção. Ver, por exemplo, o documento EP 0219194, página 5, linhas 2-15, a preparação do sol de ouro, do sol de tintura e das Partículas coloridas na página 12, e o acoplamento de um anticorpo a uma das ditas etiquetas é descrito na página 13 linhas 10-19.

Alternativamente, para os testes realizados por profissionais, então as etiquetas no anticorpo, empregadas por exemplo no imunoensaio, podem ser uma radioetiqueta.

Alternativamente, os níveis de hPL podem ser estabelecidos indiretamente empregando, por exemplo, QPCR para medir os níveis de mRNA em uma amostra de sangue.

plasma.	Em Em	uma uma	realização, a amostra realização, a amostra	é sangue, soro ou
é uma	amostra de
urina.
	Geralmente o método, o teste	e/ou o	dispositivo
devem	ter	uma	sensibilidade de	50IU/1	(unidades

internacionais por litro) como 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou

IU/1.

Os princípios de um ensaio ELISA são simples, em que um anticorpo específico da molécula alvo é fixado a um

11/21 grânulo insolúvel (que pode ser colorido) ou à superfície. A amostra de teste é então inserida e, se as moléculas alvo estiverem presentes, o anticorpo liga as mesmas. Finalmente, um segundo anticorpo distinto, que é etiquetado de tal modo que possa ser detectado, é inserido (ou pode ter estado presente na porta de teste) e liga a molécula alvo em uma posição diferente ao primeiro anticorpo, formando desse modo um sanduíche do alvo. Alternativamente, o segundo anticorpo pode ser direcionado ao primeiro anticorpo. Uma vez ligado, a etiqueta é ativada e pode ser detectada, medida e quantificada, se assim desejado.

Em uma realização, o dispositivo é um dispositivo de fluxo lateral que compreende um dispositivo de transporte líquido, por exemplo, um veículo poroso, tal como a nitrocelulose.

Em alguns testes simples, tais como os testes de gravidez de primeira geração, o resultado positivo era simplesmente uma linha azul que aparecia na janela de teste. Em uma realização simples da presente descrição, as tiras de teste que compreendem os reagentes necessários podem ser providas na forma de pontos no tempo e ser etiquetadas com o estágio de gravidez correspondente, tal como mostrado na Figura 2. Isto utiliza tecnologia, tal como descrito no documento EP 291194 e as técnicas de quantificação descritas no documento WO 2006/100415. A saída de dados de tal teste é muito simples. Portanto, em uma realização, o dispositivo compreende múltiplas janelas de resultados, por exemplo, sendo que cada janela de resultado é etiquetada com um ponto no tempo de modo que o usuário pode prontamente ler o resultado na mesma e estabelecer o estágio sem nenhuma interpretação. A acumulação de grânulos coloridos na janela correspondente ou nas janelas pode indicar o resultado.

No entanto, as leituras da densidade óptica podem

12/21 ser feitas em dispositivos digitais de laboratório ou em dispositivos descartáveis portáteis, por exemplo, tal como descrito no documento WO 2007/017648. Em uma realização da presente descrição, há o dispositivo tal como mostrado nas Figuras 3 ou 4 abaixo, a saber, um dispositivo de aproximadamente 12 cm de comprimento e 2 cm. O dispositivo compreende um invólucro (2) , formado, por exemplo, de um material de plástico opaco. Em uma extremidade do invólucro é provida uma abertura estreita através da qual um transporte ou um veículo líquido pode se projetar além do invólucro para ficar em contato com um líquido de amostra.

Um visor (6) para exibir a informação ao usuário é fixado de modo liberável ao dispositivo, de tal modo que possa ser removido do dispositivo após a geração do resultado do ensaio. A pressão para baixo no grampo deformável de modo resiliente (8) facilita a dita remoção. O visor é tal que o resultado e qualquer outra informação no mesmo podem ser retidos após a remoção do visor do dispositivo, para futura referência.

O invólucro do dispositivo compreende um conjunto analítico etiquetado (10), que compreende uma placa de circuito (12) que suporta dois LEDs e dois fotodiodos (14) , alinhados com uma zona de teste de uma tira de nitrocelulose lateral à tira de fluxo (16) que está em comunicação de fluxo líquida com uma parte da amostragem (4) do transporte ou veículo líquido. A zona de teste é a zona em que um reagente etiquetado se acumula na presença (ou na ausência, tal como apropriado) do analito de interesse. Esta acumulação afeta a propriedade óptica da tira de teste (16) , tal como sua refletividade ou transmissividade, uma propriedade que pode ser medida pelo arranjo de LED/fotodiodo. O arranjo produz uma corrente de saída, cuja magnitude é relacionada à quantidade de etiquetas acumuladas na zona de teste.

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O conjunto analítico (10) também compreende uma fonte de energia elétrica (pilha do tipo botão 18) para prover energia ao visor (6) quando ele é fixado ao invólucro (2) .

Há sulcos (20) providos no topo do invólucro para acomodar uma parte ligeiramente em flange do visor (6) . O visor (6) é retido no invólucro em uma abertura com formato e dimensões apropriados por um grampo (8) . Quando posicionados corretamente, os conectores elétricos no visor entram em contato com os conectores elétricos (22) providos no invólucro, garantindo desse modo conexões elétricas entre o visor (6) e o conjunto analítico (10).

membro analítico (10) compreende componentes de transdução de sinal (24), que compreendem um separador de armazenagem de dados, um conversor analógico para digital (CAD) e um microprocessador ou um microcontrolador. O visor (6) é responsivo a uma saída do microprocessador ou do microcontrolador.

A detecção de fluxo para determinar os resultados do ensaio é descrita na publicação do pedido de patente norte-americano n° 2005/037511. Os dispositivos de ensaio e os métodos são apresentados na publicação do pedido de patente norte-americano n° 2008/213875.

Em uma realização, a descrição apresenta um dispositivo adaptado para estabelecer o estágio aproximado de uma gravidez a partir da concentração pelo menos de hPL em uma amostra, por exemplo, que compreende um ou mais elementos aqui descritos. O dispositivo pode opcionalmente apresentar um resultado positivo ou negativo, com relação à gravidez, com base, por exemplo, no hCG. Nesta realização, o dispositivo empregado pode compreender reagentes para a análise do hPL e do hCG.

Vantajosamente, a análise pode ser repetida em

14/21 pontos no tempo diferentes para fornecer a evidência de que a gravidez está progredindo e o feto está crescendo.

Em uma realização, o resultado é exibido como um número ou uma faixa na janela, por exemplo, na forma de uma exibição digital.

Em uma realização, o dispositivo é um dispositivo portátil, por exemplo, um dispositivo portátil descartável.

Em um aspecto o dispositivo compreende um anticorpo anti lactogênio placentário humano, por exemplo, um anticorpo monoclonal. 0 anticorpo pode opcionalmente ser etiquetado, por exemplo, tal como discutido acima.

Em uma realização, o dispositivo compreende um anticorpo lactogênio placentário distinto adicional, por exemplo, um anticorpo monoclonal, sendo que o dito anticorpo é etiquetado adicionalmente para permitir a detecção da ligação ao hPL ou a um fragmento correspondente do mesmo.

Alternativamente, um segundo anticorpo empregado pode ser um anticorpo anti-anticorpo e, por exemplo, pode ser direcionado na região de Fc do primeiro anticorpo. Este segundo anticorpo pode ser etiquetado.

Onde um primeiro e um segundo anticorpos são empregados, então cada anticorpo pode ser etiquetado.

Um anticorpo anti lactogênio placentário humano, tal como aqui empregado, presta-se a indicar um anticorpo específico ao dito antígeno (hPL).

Em uma realização, uma combinação de anticorpos, por exemplo, anticorpos monoclonais em mistura, é empregada, direcionada aos hormônios específicos a serem testados.

Em uma realização, o anticorpo empregado tem uma etiqueta fluorescente. Em uma realização, um anticorpo adicional, por exemplo, para um hormônio distinto, é empregado com uma etiqueta fluorescente que emite luz em um comprimento de onda distinto do primeiro anticorpo etiquetado

15/21 fluorescente .

Se o dispositivo estiver à venda para o público, por exemplo, em balcões de farmácias e supermercados, então o ensaio deve ser robusto o bastante para manipular uma faixa apropriada de concentração de hormônios correspondentes, prováveis de ser encontrados, e fornecer um resultado para o usuário final.

Pode ser aconselhável que o teste seja realizado na primeira amostra de urina do dia que é expelida pela fêmea. Portanto, em uma realização, o dispositivo é acompanhado por instruções explicativas.

Tendo dito isso, se o dispositivo for fornecido a hospitais e médicos, pode ser importante saber exatamente se a gravidez ocorreu a menos de 9 semanas, a menos de 12 semanas, a menos de 18 semanas, 21 semanas e/ou 24 semanas. Neste exemplo o teste, o kit, o dispositivo e/ou o reagente podem ser providos como entidades otimizadas separadas para cada ponto no tempo correspondente. A otimização pode envolver a modificação da concentração dos reagentes empregados e/ou a combinação dos hormônios empregados.

Em uma realização adicional, o método aqui empregado pode ser adaptado para detectar uma diminuição nos níveis de hPL em uma fêmea, como meio de monitoramento da perda ou da terminação do feto. Esse monitoramento adequado pode ser problemático para os profissionais médicos. Um teste de rotina para identificar a diminuição nos níveis de hPL seria, portanto, muito útil.

Em uma realização, a descrição apresenta o uso de um anticorpo anti-hPL, tal como o anticorpo monoclonal, por exemplo, um anticorpo murino, porcino, ovino, bovino, de cabra, de camelo, de rato, de coelho ou outro anticorpo, para uso na quantificação de hPL em uma amostra de fluido, tal como uma amostra de sangue, de soro, de plasma ou de urina,

16/21 derivada de uma fêmea humana, por exemplo, com a finalidade de estimar o estágio da gravidez.

Em uma ou mais realizações da descrição, o anticorpo empregado é direcionado à subunidade-a do hPL.

Vários anticorpos monoclonais estão comercialmente disponíveis, por exemplo: Anticorpo monoclonal Anti Lactogênio Placentário Humano de camundongo (epitope 2), nãoconjugado, Clone INN-hPL-37, disponível junto a Abcam, Anticorpo monoclonal Anti Lactogênio Placentário Humano de camundongo, não-conjugado, Clone INN-hPL-5, disponível junto a AbD Serotec, e Anticorpo monoclonal Anti Lactogênio Placentário de camundongo (hPL), não-conjugado, Clone Lip603, disponível junto a Acris Antibodies GmbH.

Alternativamente, os anticorpos que incluem anticorpos monoclonais podem ser prontamente preparados por técnicas rotineiras no campo técnico correspondente, por exemplo, imunizando um hospedeiro com hPL conjugado a um veículo apropriado, tal como ovalbumina ou similar. O anticorpo empregado deve ser específico ao hPL, por exemplo, tendo uma reatividade cruzada de 1% ou menos ou como apropriado nas circunstâncias.

Em uma realização, a descrição apresenta um kit que compreende um dispositivo e/ou um reagente para testar a concentração de hPL em uma amostra de fluido corpóreo, derivada de uma fêmea humana, com a finalidade de estabelecer o estágio da gravidez.

Em uma realização, é provido um kit adaptado para identificar a queda nos níveis de hPL após a perda ou a terminação de um feto.

Devido ao fato que o teste aqui descrito conta com a correlação entre a massa da placenta e a concentração da secreção de hPL, se a fêmea estiver grávida de dois ou mais fetos então o presente método pode apresentar o resultado

17/21 como um estágio mais adiantado de gravidez do que o apropriado. Assim sendo, considerando que a gravidez múltipla responde por somente 3% das gravidezes, portanto, o teste/método/dispositivo e o uso da presente descrição representam uma etapa prática avançada ao fornecer a informação às pessoas de maneira conveniente, barata e eficaz.

Deve ser considerado que uma ou mais realizações aqui descritas podem ser combinadas, tal como tecnicamente apropriado.

No contexto deste relatório descritivo, que compreende deve ser interpretado como que inclui.

Os aspectos da descrição que compreendem certos elementos também pretendem se estender a realizações alternativas que consistem ou que consistem essencialmente de elementos correspondentes.

Todos os documentos indicados são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

EXEMPLOS

A realização de um ensaio que resulta na leitura de um dispositivo que tem fotodetectores compartilhados e zonas comumente lidas é ilustrada na Figura 5. O dispositivo de leitura tem aproximadamente 12 cm de comprimento e aproximadamente 2 cm de largura e tem geralmente o formato de um dedo ou de um charuto. Nas realizações preferidas, o invólucro tem não mais do que aproximadamente 12 cm de comprimento, aproximadamente 2,5 cm de largura e aproximadamente 2,2 cm de altura. No entanto, qualquer formato conveniente pode ser empregado, como um leitor com formato de cartão de crédito. 0 dispositivo compreende um invólucro 1 formado por um material de plástico sintético impermeável à luz (por exemplo, policarbonato, ABS, poliestireno, polietileno de alta densidade ou polipropileno

18/21 ou polistirol contendo um pigmento de bloqueio de luz apropriado, tal como o carbono) . Em uma extremidade do dispositivo de leitura há um entalhe ou uma abertura estreita 3 pelo qual uma tira de teste (não mostrada) pode ser inserida no leitor. Em sua face superior o leitor tem duas aberturas de formato oval. Uma abertura acomoda a tela do visor de cristal líquido 5 que exibe a informação a um usuário, por exemplo, os resultados de um ensaio, em termos qualitativos ou quantitativos. A outra abertura acomoda um ativador de mecanismo de ejeção 7 (na forma de um botão que pode ser pressionado) que, quando ativado, ejeta forçosamente o dispositivo de ensaio inserido do dispositivo de leitura do ensaio.

A tira de teste para uso com o dispositivo de leitura é uma haste de teste de fluxo lateral geralmente convencional, por exemplo, do tipo descrito na Patente NorteAmericana n° 6.156.271, na Patente Norte-Americana n° 5.504.013, no documento EP 728309 ou no documento EP 782707. A tira de teste e uma superfície ou superfícies do entalhe no leitor, nas quais a tira de teste é inserida, são formadas e dimensionadas de modo que a tira de teste só pode ser inserida com sucesso no leitor na orientação apropriada. 0 dispositivo de ensaio e a superfície ou superfícies do entalhe no leitor, nas quais o dispositivo do ensaio é inserido, também podem ser formadas e dimensionadas de modo que haja um alinhamento tridimensional preciso do leitor e do dispositivo de ensaio inserido, que garanta que o resultado do ensaio possa ser lido corretamente no leitor. Quando uma tira de teste é inserida corretamente no leitor, um comutador é fechado e ativa o leitor de um modo dormente, que é o estado normal adotado pelo leitor, reduzindo desse modo o consumo de energia.

Dentro do invólucro do leitor (e portanto não

19/21 visíveis na Figura 5) são incluídos vários componentes adicionais, incluindo um leitor que compreende três LEDs. Quando uma tira de teste é inserida no leitor, cada LED é alinhado com uma respectiva zona da tira de teste. O primeiro LED é alinhado com a zona de teste, o segundo LED é alinhado com a zona de referência e o terceiro LED é alinhado com a zona de controle. Dois fotodiodos detectam a luz refletida das várias zonas e geram uma corrente, cuja magnitude é proporcional à quantidade de luz incidente sobre os fotodiodos. A corrente é convertida em uma voltagem, isolada pelo separador e enviada ao conversor analógico para digital (CAD) . O sinal digital resultante é lido pelo microcontrolador.

Em algumas realizações, é provido um fotodiodo separado para detecção de cada zona (isto é, o número de fotodiodos é igual ao número de zonas das quais as medições da luz refletida são feitas).

Em outras realizações, o número de fotodetectores é menor do que o número de zonas. Um fotodiodo detecta a luz refletida da zona de teste e alguma luz refletida da zona de referência. 0 outro fotodiodo detecta alguma luz refletida da zona de referência e a luz refletida da zona de controle. O microcontrolador alterna entre os LEDs um de cada vez, de modo que somente uma das três zonas é iluminada em qualquer tempo dado - dessa maneira os sinais gerados pela luz refletida das respectivas zonas podem ser discriminados em uma base temporal.

Um comutador é fechado pela inserção de um dispositivo de ensaio no leitor, que ativa o microcontrolador. O dispositivo compreende adicionalmente uma fonte de energia (normalmente uma ou duas pilhas do tipo de botão) e um dispositivo de LCD que responde à saída do microcontrolador.

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No uso, uma tira de teste seca (isto é, antes de entrar em contato com a amostra) é inserida no leitor; este fecha o comutador, ativando o dispositivo de leitura, que então realiza uma calibração inicial. A intensidade da saída da luz de diferentes LEDs raramente é idêntica. Do mesmo modo, é improvável que os fotodetectores tenham sensibilidades idênticas. Uma vez que tal variação podería afetar a leitura do ensaio, é realizada uma calibração inicial, em que o microcontrolador ajusta a duração de tempo que cada um dos três LEDs é iluminado, de modo que o sinal medido de cada uma das três zonas (teste, referência e controle) seja aproximadamente igual em uma posição de operação apropriada em uma região linear do perfil de resposta do sistema (de tal modo que uma mudança na intensidade da luz refletida das várias zonas produz uma mudança diretamente proporcional no sinal).

Após realizar a calibração inicial, o dispositivo realiza uma calibração adicional, mais fina. Isto envolve fazer a medição (valor de calibração) da intensidade da luz refletida para cada zona, ao passo as medições na tira de teste feitas em uma fase subsequente à seca (valores de teste) são normalizadas pela referência ao valor de calibração para as respectivas zonas (isto é, o valor normalizado=valor de teste/valor de calibração).

Para realizar um ensaio, a amostra que recebe parte da tira de teste é colocada em contato com a amostra líquida. No caso de uma amostra de urina, por exemplo, a amostra que recebe a parte pode ser mantida em um fluxo de urina, ou a amostra de urina coletada em um receptáculo e a amostra que recebe brevemente a parte (aproximadamente 5-10 segundos) imersas na amostra. A amostragem pode ser realizada enquanto a tira de teste é inserida no leitor ou, menos preferivelmente, a tira pode ser brevemente removida do

21/21 leitor para amostragem e então reinserida no leitor. As medições da intensidade da luz refletida de uma ou mais das zonas (preferivelmente de todas as três) são então iniciadas, normalmente após um intervalo de tempo específico depois da 5 inserção da tira de teste no leitor. Ê desejável que as medições sejam feitas em intervalos regulares (por exemplo, em intervalos entre 1-10 segundos, preferivelmente em intervalos entre 1-5 segundos). As medições são feitas como uma sequência de muitas leituras em curtos períodos de tempo 10 (10 milisegundos ou menos), intercalando zona por zona, minimizando desse modo quaisquer efeitos devido à variação da intensidade da luz ambiente que pode penetrar no interior do invólucro do leitor.

REFERÊNCIAS

Sorenson et al. (1995) Human Reproduction 10:453458

Kaplan et al (1965) Science 147:751

Josimovich et al (1964) Am J. Obst & Gynec 88:867879

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Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. MÉTODO PARA DETERMINAR O ESTAGIO DE UMA

   GRAVIDEZ EMPREGANDO UM DISPOSITIVO PORTÁTIL ADEQUADO PARA

   VENDA AO PUBLICO, caracterizado por compreender as etapas de quantificação da quantidade do hormônio lactogênio placentário humano em uma amostra estabelecimento do mesma.
2. 2.

   caracterizado quantificação
3. 3.

   caracterizado gonadotrofina (HPL) ou um de urina estágio da fragmento de uma gravidez detectável do mesmo fêmea humana, que corresponde

   MÉTODO, de acordo com a reivindicação por incluir adicionalmente a etapa da quantidade de um segundo hormônio.

   MÉTODO, de acordo com a reivindicação pelo segundo hormônio ser selecionado coriônica humana de

   2, de (hCG), estradiol nãoconjugado, relaxina, ou uma combinação destes.
4. 4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, emprega a empregar hormônio.

   detecção da um ou mais
5. 5.

   MÉTODO, reivindicações dispositivo de
6. 6.

   ADAPTADO PARA caracterizado em que a quantificação presença do anticorpos de acordo hormônio ou hormônios ao específicos para cada com qualquer uma das

   1 a 4, caracterizado fluxo lateral.

   DISPOSITIVO

   DETECTAR OS

   PLACENTARIO HUMANO (HPL) pelo dispositivo ser um

   PORTÁTIL

   NIVEIS/A

   OU DE

   UM

   PARA

   VENDA AO PUBLICO

   QUANTIDADE DE LACTOGÊNIO

   FRAGMENTO DETECTÁVEL DO

   MESMO, caracterizado por ser de fêmea humana, para estabelecer o
7. 7.

   caracterizado apresentar o amostra.

   uma amostra de urina de uma estágio da gravidez.

   DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 6, pelo dispositivo compreender um visor para resultado ou os resultados da análise de uma

   Petição 870180061990, de 18/07/2018, pág. 15/21

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8. 8. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo dispositivo compreender uma zona de teste em que um reagente etiquetado se acumula na presença de lactogênio placentário humano (HPL).
9. 9. DISPOSITIVO, de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo resultado ser exibido como um número ou uma faixa numa janela e o visor ser digital.
10. 10. DIPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pela detecção dos níveis ou quantidade de hormônio ou hormônios empregar um ou mais anticorpos específicos para cada hormônio.
11. 11. DIPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado por compreender reagentes para a análise de lactogênio placentário humano (HPL) e gonadotrofina coriônica humana (hCG).
12. 12. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, caracterizado por ser um dispositivo de fluxo lateral.
13. 13. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracterizado por ser descartável.
14. 14. USO DE UM ANTICORPO ΑΝΤΙ-HPL EM UM DISPOSITIVO PORTÁTIL ADEQUADO PARA VENDA AO PÚBLICO, caracterizado por servir para determinar o estágio da gravidez a partir de uma amostra de urina de uma fêmea humana.

    15. USO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo anticorpo anti- -HPL ser monoclonal. 16. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo anticorpo anti- HPL ser empregado em combinação com um anticorpo selecionado de um anti-hCG, anti-relaxina e/ou anti-estradiaol não-

    conjugado.

    Petição 870180061990, de 18/07/2018, pág. 16/21

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    Concentração de HPL durante a gestação