CN1111283C - 人胎盘泌乳素诊断血球免疫扩散板的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种人胎盘泌乳素诊断试剂的制备方法，是应用免疫学原理，从人胎盘提取HPL，经两次亲和层析后获得高纯度的HPL，分别制成诊断血球和扩散板，本发明的HPL纯品为单一成份，无非特异性，并与HPL抗血清有免疫反应，而与抗HCG、抗AFP、抗人全血清无免疫反应，应用本发明，方法简单，操作方便，性能稳定，结果准确，一般实验室均可操作，在临床上对妊娠高血压综合症、胎儿发育迟缓、死胎、过期妊娠等异常疾病的诊断有较大参考意义，是围产期监护的最佳诊断试剂。
Description
技术领域：
本发明涉及人胎盘泌乳素诊断血球免疫扩散板的制备方法。
背景技术：
人胎盘泌乳素是由胎盘合作滋养层细胞分泌的，测定孕妇血中人胎盘泌乳素的含量，能反映胎盘体积和功能的变化，目前多采用放射免疫法，虽测值可信，但由于放射性衰变和需要贵重的医疗设备，不易普及基层医院。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是提供一种在孕晚期、足月或过期妊娠情况下，测定人胎盘泌乳素值的人胎盘泌乳素诊断血球免疫扩散板的制备方法。
本发明中人胎盘泌乳素诊断血球免疫扩散板的制备方法采用如下步骤：
1.人胎盘泌乳素的提纯
1.1饱和硫酸铵盐析
正常足月分娩产妇胎盘5-10个，应用组织捣碎机匀浆，加2倍体积生理盐水搅拌20-40分钟，以3000-6000r/min离心20分钟，去沉淀，上清用50％体积比的饱和硫酸铵盐析，再以4000-10000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，以生理盐水透析至无NH+；
1.2葡聚糖凝胶柱层析
取葡聚糖凝胶10克，按常规处理装柱2.5×100cm，用0.1-0.3mol/l NaCL和0.05mol/l tris-HCL缓冲液PH8.0平衡，取盐析浓缩样品10ml，流速每小时10-80ml，以每管2-10ml分别收集洗脱液，应用人胎盘泌乳素血球试剂检查各管浓度，收集人胎盘泌乳素高浓度管合并，用50％体积比的饱和硫酸铵沉淀，透析至无NH+；
1.3人胎盘泌乳素偶联琼脂糖亲和层析
取琼脂糖10-40ml，经0.5mol/lNaCL和冷蒸馏水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/l NaOH调PH值，使之维持在5-12左右，反应5-20分钟，用布氏漏斗抽干，加入经PH7-11的0.1mol/l NaHCO3透析的人胎盘泌乳素抗体搅拌4℃过夜，次H装柱，用0.01mol/l磷酸盐或0.5mol/l NaCL缓冲液洗至280nmOD值＜0.01为止，收集全部洗脱液，经紫外分光光度计测定280nmOD值，计算其偶联率体积比为78.2％，将合并的高浓度样品5ml加入人胎盘泌乳素抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.01mol/IPH6-8磷酸盐缓冲液洗脱，流速每小时10-60ml，洗至280nmOD值＜0.02时，改用0.1mol/l甘氨酸一HCL缓冲液PH2.4解吸附，流速每小时10-80ml，收集人胎盘泌乳素高浓度区，用50％体积比的饱和硫酸铵浓缩除盐；
1.4抗人全血清抗体偶联琼脂糖亲和层析柱制备
与人胎盘泌乳素抗体偶联琼脂糖相同，其偶联率体积比为7.28％，将浓缩除盐人胎盘泌乳素样品5ml加入抗人全血清抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.01mol/l磷酸盐缓冲液PH7.0洗脱，洗速为每小时30ml，收集第一蛋白吸收峰，合并各管浓缩，冻干为人胎盘泌乳素纯品。
2.人胎盘泌乳素抗血清的制备
选择2kg雄性家兔，于双后足掌注射活卡介苗5-40mg，5-20天后向淋巴结周围多点注射，人胎盘泌乳素抗原加福氏完全佐剂0.5-4ml，每千克体重50-400μg人胎盘泌乳素抗原，以后每间隔一周免疫一次，经5次免疫后，试血效价达到1∶64倍时，颈动脉放血分离血清；
3.人“O”型红细胞的醛化
取健康男性“O”型红细胞，经戊二醛、甲醛、丙酮醛处理后，配成10％体积比的醛化血球悬液；
4.人胎盘泌乳素抗血清致敏醛化血球
取10％体积比的醛化血球离心后用0.1mol/l醋酸钠配成1-10％体积比的血球，将人胎盘泌乳素免疫球蛋白分别稀释成2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml浓度，与等量醛化血球混合，在20-60℃恒温振荡水浴下反应1-3小时，经含有0.1-3％体积比的兔血清的磷酸盐缓冲液洗去未结合免疫球蛋白，配成1％体积比的血球悬液，生产出人胎盘泌乳素冻干诊断血球；
5.将人胎盘泌乳素冻干诊断血球用0.02mol/l Tris-HCL、0.15mol/l NaCL、0.05％重量比的NaN3稀释成100、150、200倍，于56℃灭活10-40分钟，分别加入等体积煮沸后冷却40-70℃的1-4％体积比的琼脂液，混合均匀铺板，琼脂厚度1-4mm，打孔直径1-5mm，孔距0.5-3cm。
本发明制备的人胎盘泌乳素的鉴定：
1. 8％聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳，常规制备分离胶与浓缩胶，取50μg提纯的人胎盘泌乳素纯品进行聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳，电流2mA/管，用1％氨基黑染色呈现一条带。
2.免疫电泳结果表明：本室提纯的人胎盘泌乳素只与人胎盘泌乳素抗血清和妊娠全血清呈现一条免疫沉淀弧。
3.双向免疫交叉试验结果表明：提纯的人胎盘泌乳素与抗人绒毛膜促性腺激素、抗甲胎蛋白、抗妊娠特异性糖蛋白、抗人全血清无免疫沉淀线，而与抗人胎盘泌乳素血清和抗妊娠全血清有明显的沉淀线，从而表明所提纯的人胎盘泌乳素为胎盘泌乳素纯品。
以上三种方法按“实验免疫学技术”介绍的方法进行。
4.检查单向免疫扩散板非特异性：取非孕妇女血清9份，男性血清9份，分别加入人胎盘泌乳素单向免疫板琼脂孔内各30μl，放置37℃恒温24小时判定结果，均无沉淀环出现，说明人胎盘泌乳素单向免疫板无非特异性反应。
5.稳定性检查：将人胎盘泌乳素单向免疫板存放4℃不同月份进行比较，每批均加入相同样品各30μl，放置37℃恒温24小时进行观察，发现放置6个月以内的免疫板，其沉淀环大小和清晰度无差别，而放置6个月以上的免疫板，沉淀环清晰度略差，由于免疫板放置时间过长，导致人胎盘泌乳素抗血清失活。经观察比较，免疫板使用期限应在6个月以内为宜，每批使用前，均用人胎盘泌乳素标准进行质量检测。
具体实施方式
实施例
1.人胎盘泌乳素的提纯
1.1饱和硫酸铵盐析
正常足月分娩产妇胎盘10个，应用组织捣碎机匀浆，加2倍体积生理盐水搅拌30分钟，以4000r/min离心20分钟，去沉淀，上清用50％体积比的饱和硫酸铵盐析，再以5000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，以生理盐水透析至无NH+；
1.2葡聚糖凝胶柱层析
取葡聚糖凝胶10克，按常规处理装柱2.5×100cm，用0.2mol/l NaCL和0.05mol/l tris-HCL缓冲液PH8.0平衡，取盐析浓缩样品10ml，流速每小时60ml，以每管5ml分别收集洗脱液，应用人胎盘泌乳素血球试剂检查各管浓度，收集人胎盘泌乳素高浓度管合并，用50％体积比的饱和硫酸铵沉淀，透析至无NH+；
1.3人胎盘泌乳素偶联琼脂糖亲和层析
取琼脂糖30ml，经0.5mol/lNaCL和冷蒸馏水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/l NaOH调PH值，使之维持在11左右，反应10分钟，用布氏漏斗抽干，加入经PH值为9的0.1mol/l NaHCO3透析的人胎盘泌乳素抗体搅拌4℃过夜，次日装柱，用0.01mol/l磷酸盐或0.5mol/l NaCL缓冲液洗至280nmOD值＜0.01为止，收集全部洗脱液，经紫外分光光度计测定280nmOD值，计算其偶联率体积比为78.2％，将合并的高浓度样品5ml加入人胎盘泌乳素抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.01mol/lPH值7.4磷酸盐缓冲液洗脱，流速每小时30ml，洗至280nmOD值＜0.02时，改用0.1mol/l甘氨酸一HCL缓冲液PH值2.4解吸附，流速每小时60ml，收集人胎盘泌乳素高浓度区，用50％体积比的饱和硫酸铵浓缩除盐；
1.4抗人全血清抗体偶联琼脂糖亲和层析柱制备
与人胎盘泌乳素抗体偶联琼脂糖相同，其偶联率体积比为7.28％，将浓缩除盐人胎盘泌乳素样品5ml加入抗人全血清抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.01mol/l磷酸盐缓冲液PH值7.0洗脱，洗速为每小时30ml，收集第一蛋白吸收峰，合并各管浓缩，冻干为人胎盘泌乳素纯品。
2.人胎盘泌乳素抗血清的制备
选择2kg雄性家兔，于双后足掌注射活卡介苗20mg，10天后向淋巴结周围多点注射，人胎盘泌乳素抗原加福氏完全佐剂2ml，每千克体重150μg人胎盘泌乳素抗原，以后每间隔一周免疫一次，经5次免疫后，试血效价达到1∶64倍时，颈动脉放血分离血清；
3.人“O”型红细胞的醛化
取健康男性“O”型红细胞，经戊二醛、甲醛、丙酮醛处理后，配成10％体积比的醛化血球悬液；
4.人胎盘泌乳素抗血清致敏醛化血球
取10％体积比的醛化血球离心后用0.1mol/l醋酸钠配成5％体积比的血球，将人胎盘泌乳素免疫球蛋白分别稀释成2.μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml浓度与等量醛化血球混合，在45℃恒温振荡水浴下反应1.5小时，经含有1％体积比的兔血清的磷酸盐缓冲液洗去未结合免疫球蛋白，配成1％体积比的血球悬液，生产出人胎盘泌乳素冻干诊断血球；
5.将人胎盘泌乳素冻干诊断血球用0.02mol/l Tris-HCL、0.15mol/l NaCL、0.05％重量比的NaN3稀释成100、150、200倍，于56℃灭活20分钟，分别加入等体积煮沸后冷却56℃的2.4％体积比的琼脂液，混合均匀铺板，琼脂厚度3.0mm，打孔直径4.0mm，孔距1.5cm。
本发明应用实施例：
取10μl孕妇血清用1ml盐水稀释成100倍等待检测用，在V型微量血凝板上，从第1孔到第5孔各加样品稀释水25μl，取100倍稀释的血清25μl加到第1孔，用微量加样器从第1孔起依次做2倍稀释到第4孔，第5孔为空白对照，冻干人胎盘泌乳素诊断血球用血球稀释水2ml溶解并摇匀，4℃过夜放置后应用，取25μl稀释血球从第1孔到第5孔各加25μl，震匀后放37℃，1小时取出判定结果。
判定标准：孕妇血清中人胎盘泌乳素能与人胎盘泌乳素抗体致敏血球出现凝集反应(阳性)，反之，如血清中不含有或浓度较低，则小出现凝集(阴性)，依据出现血球凝集的血清最大稀释倍数乘以致敏血球的敏感度0.12μg/ml，便可确定血清中人胎盘泌乳素的浓度。
判定方法：
血球全部沉入孔底为阴性，根据凝集程度分为1-4各阶段，凝集在2以上可判定为阳性。
计算公式：
血清中人胎盘泌乳素含量(μg/ml)＝血球凝集孔的血清稀释倍数×诊断血球的敏感度(μg/ml)。
用毛细玻璃管取孕妇耳垂血0.1ml，分离出血清，用微量加样器吸取15微升加入琼脂孔内(注意不要溢出孔外)，加样完毕后，放置20-30分钟，待孔内血清沉淀完后再补加15微升血清，总计为30微升，盖好塑料板，水平放入温盒内，在37℃条件下扩散24小时观察结果，分别记录所测样品的免疫沉淀环直径(mm)，从标准曲线上可查出人胎盘泌乳素值，即得该样品的人胎盘泌乳素含量。通过应用人胎盘泌乳素标准品标定出血球敏感度为0.025μg/ml，确定孕38周以上大于5μg/ml为正常值，5μg/ml为警界值，小于5μg/ml为危险值。其中标准曲线的制备方法是：在琼脂板孔内分别加入4个不同浓度的人胎盘泌乳素标准液，每孔加样30μl，放入37℃恒温24小时后观察沉淀环直径，发现选择150倍稀释后所做的琼脂板，免疫沉淀环直径比较清晰，其扩散环直径分别为9mm、6.5mm、5.2mm、4.7mm，以标准含量为横坐标，标准液免疫沉淀环直径为纵坐标，绘制标准工作曲线。(参考德国Benring研究所的人胎盘泌乳素标准)
Claims (1)
1、一种人胎盘泌乳素诊断血球免疫扩散板的制备方法，该方法采用如下步骤：
(1)人胎盘泌乳素的提纯
(1.1)饱和硫酸铵盐析
正常足月分娩产妇胎盘5-10个，应用组织捣碎机匀浆，加2倍体积生理盐水搅拌20-40分钟，以3000-6000r/min离心20分钟，去沉淀，上清用50％体积比的饱和硫酸铵盐析，再以4000-10000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，以生理盐水透析至无NH+；
(1.2)葡聚糖凝胶柱层析
取葡聚糖凝胶10克，按常规处理装柱2.5×100cm，用0.1-0.3mol/l NaCL和0.05mol/l tris-HCL缓冲液PH8.0平衡，取盐析浓缩样品10ml，流速每小时10-80ml，以每管2-10ml分别收集洗脱液，应用人胎盘泌乳素血球试剂检查各管浓度，收集人胎盘泌乳素高浓度管合并，用50％体积比的饱和硫酸铵沉淀，透析至无NH+；
(1.3)人胎盘泌乳素偶联琼脂糖亲和层析
取琼脂糖10-40ml，经0.5mol/lNaCL和冷蒸馏水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/l NaOH调PH值，使之维持在5-12左右，反应5-20分钟，用布氏漏斗抽干，加入经PH7-11的0.1mol/l NaHCO3透析的人胎盘泌乳素抗体搅拌4℃过夜，次日装柱，用0.01mol/l磷酸盐或0.5mol/l NaCL缓冲液洗至280nmOD值＜0.01为止，收集全部洗脱液，经紫外分光光度计测定280nmOD值，计算其偶联率体积比为78.2％，将合并的高浓度样品5ml加入人胎盘泌乳素抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.0lmol/lPH6-8磷酸盐缓冲液洗脱，流速每小时10-60ml，洗至280nmOD值＜0.02时，改用0.1mol/l甘氨酸一HCL缓冲液PH2.4解吸附，流速每小时10-80ml，收集人胎盘泌乳素高浓度区，用50％体积比的饱和硫酸铵浓缩除盐；
(1.4)抗人全血清抗体偶联琼脂糖亲和层析柱制备
与人胎盘泌乳素抗体偶联琼脂糖相同，其偶联率体积比为7.28％，将浓缩除盐人胎盘泌乳素样品5ml加入抗人全血清抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.01mol/l磷酸盐缓冲液PH7.0洗脱，洗速为每小时30ml，收集第一蛋白吸收峰，合并各管浓缩，冻干为人胎盘泌乳素纯品；
(2)人胎盘泌乳素抗血清的制备
选择2kg雄性家兔，于双后足掌注射活卡介苗5-40mg，5-20天后向淋巴结周围多点注射，人胎盘泌乳素抗原加福氏完全佐剂0.5-4ml，每千克体重50-400μg人胎盘泌乳素抗原，以后每间隔-周免疫一次，经5次免疫后，试血效价达到1∶64倍时，颈动脉放血分离血清；
(3)人“O”型红细胞的醛化
取健康男性“O”型红细胞，经戊二醛、甲醛、丙酮醛处理后，配成10％体积比的醛化血球悬液；
(4)人胎盘泌乳素抗血清致敏醛化血球
取10％体积比的醛化血球离心后用0.1mol/l醋酸钠配成1-10％体积比的血球，将人胎盘泌乳素免疫球蛋白分别稀释成2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml浓度，与等量醛化血球混合，在20-60℃恒温振荡水浴下反应1-3小时，经含有0.1-3％体积比的兔血清的磷酸盐缓冲液洗去未结合免疫球蛋白，配成1％体积比的血球悬液，生产出人胎盘泌乳素冻干诊断血球；
(5)将人胎盘泌乳素冻干诊断血球用0.02mol/l Tris-HCL、0.15mol/l NaCL、0.05％重量比的NaN3稀释成100、150、200倍，于56℃灭活10-40分钟，分别加入等体积煮沸后冷却40-70℃的1-4％体积比的琼脂液，混合均匀铺板，琼脂厚度1-4mm，打孔直径1-5mm，孔距0.5-3cm。
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