CN1114104C - 妊娠特异性β1糖蛋白诊断试剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种妊娠特异性β1糖蛋白诊断试剂的制备方法，是应用免疫学原理，从人胎盘提取SP1，经两次亲和层析后获得高纯度的SP1，制成诊断血球和扩散板，本发明的SP1纯品为单一成份，无非特异性，并与SP1抗血清有免疫反应，而与抗HCG、抗AFP、抗人全血清无免疫反应，应用本发明，方法简单，操作方便，性能稳定，结果准确，一般实验室均可操作，在临床上对妊娠高血压综合症、胎儿发育迟缓、死胎、过期妊娠等异常疾病的诊断有较大参考意义，是围产期监护的最佳诊断试剂。
Description
技术领域：
本发明涉及测定孕晚期、足月或过期妊娠情况下的诊断试剂的制备方法。
背景技术：
妊娠特异性β1糖蛋白是由胎盘合体滋养层细胞分泌的，测定孕妇血中妊娠特异性β1糖蛋白的含量，能反映胎盘体积和功能的变化，目前多采用放射免疫法，虽测值可信，但由于放射性衰变和需要贵重的医疗设备，不易普及基层医院。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是提供一种在孕晚期、足月或过期妊娠情况下，测定妊娠特异性β1糖蛋白值的妊娠特异性β1糖蛋白诊断试剂的制备方法。
本发明中妊娠特异性β1糖蛋白诊断试剂的制备方法采用如下步骤：
1.妊娠特异性β1糖蛋白的提纯
1.1饱和硫酸铵盐析
正常足月分娩产妇胎盘5-10个，应用组织捣碎机匀浆，加2倍体积生理盐水搅拌20-40分钟，以3000-6000r/min离心20分钟，去沉淀，上清用50％体积比的饱和硫酸铵盐析，再以4000-10000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，以生理盐水透析至无NH+；
1.2葡聚糖凝胶柱层析
取葡聚糖凝胶10克，按常规处理装柱2.5×100cm，用0.1-0.3mol/L NaCl和0.05mol/L tris-HCl缓冲液PH8.0平衡，取盐析浓缩样品10ml，流速每小时10-80ml，以每管2-10ml分别收集洗脱液，应用妊娠特异性β1糖蛋白血球试剂检查各管浓度，收集妊娠特异性β1糖蛋白高浓度管合并，用50％体积比的饱和硫酸铵沉淀，透析至无NH+；
1.3妊娠特异性β1糖蛋白偶联琼脂糖4B亲和层析
取琼脂糖4B10-40ml，经0.5mol/L NaCl和冷蒸馏水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/L NaOH调PH值，使之维持在5-12左右，反应5-20分钟，用布氏漏斗抽干，加入经PH7-11的0.1mol/L NaHCO3透析的妊娠特异性β1糖蛋白抗体搅拌4℃过夜，次日装柱，用0.01mol/L磷酸盐或0.5mol/L NaCl缓冲液洗至280nmOD值＜0.01为止，收集全部洗脱液，经紫外分光光度计测定280nmOD值，计算其偶联率体积比为78.2％，将合并的高浓度样品5ml加入妊娠特异性β1糖蛋白抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.01mol/L PH6-8磷酸盐缓冲液洗脱，流速每小时10-60ml，洗至280nmOD值＜0.02时，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液PH2.4解吸附，流速每小时10-80ml，收集妊娠特异性β1糖蛋白高浓度区，用50％体积比的饱和硫酸铵浓缩除盐；
1.4抗人全血清抗体偶联琼脂糖4B亲和层析柱制备
与妊娠特异性β1糖蛋白抗体偶联琼脂糖4B相同，其偶联率体积比为7.28％，将浓缩除盐妊娠特异性β1糖蛋白样品5ml加入抗人全血清抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液PH7.0洗脱，洗速为每小时30ml，收集第一蛋白吸收峰，合并各管浓缩，冻干为妊娠特异性β1糖蛋白纯品。
2.妊娠特异性β1糖蛋白抗血清的制备
选择2kg雄性家兔，于双后足掌注射活卡介苗5-40mg，5-20天后向淋巴结周围多点注射，妊娠特异性β1糖蛋白抗原加福氏完全佐剂0.5-4ml，每千克体重50-400μg妊娠特异性β1糖蛋白抗原，以后每间隔一周免疫一次，经5次免疫后，用双向琼脂扩散法试血效价达到1∶64倍时，颈动脉放血分离血清；
3.人“O”型红细胞的醛化
取健康男性“O”型红细胞，经戊二醛、甲醛、丙酮醛处理后，配成10％体积比的醛化血球悬液；
4.妊娠特异性β1糖蛋白抗血清致敏醛化血球
取10％体积比的醛化血球离心后用0.1mol/L醋酸钠配成1-10％体积比的血球，将妊娠特异性β1糖蛋白免疫球蛋白分别稀释成1-20μg/ml浓度，与等量醛化血球混合，在20-60℃恒温振荡水浴下反应0.5-3小时，经含有0.1-3％体积比的兔血清的磷酸盐缓冲液洗去未结合免疫球蛋白，配成1％体积比的血球悬液，生产出妊娠特异性β1糖蛋白冻干诊断血球；
5.将妊娠特异性β1糖蛋白冻干诊断血球用0.05mol/L NaCl、0.05％重量比的NaN3稀释成100、200、400倍，于56℃灭活10-40分钟，分别加入等体积的1-4％体积比的琼脂液中，琼脂液需煮沸10-40分钟后，冷却40-70℃时方可混合均匀铺板，琼脂厚度3.0mm，打孔直径2.5mm，孔距1.2cm。
本发明制备的妊娠特异性β1糖蛋白的鉴定：
1.非特异性检查：应用非孕妇女血清6份，男性血清6份，分别加入妊娠特异性β1糖蛋白单向免疫板琼脂孔内各5μl，放置37℃恒温24小时判定结果，均无沉淀环出现，说明妊娠特异性β1糖蛋白单向免疫板无非特异性反应。
2.稳定性检查：将妊娠特异性β1糖蛋白单向免疫板存放4℃不同月份进行比较，每批均加入相同样品各5μl，放置37℃恒温24小时进行观察，发现放置6个月以内的免疫板，其沉淀环大小和清晰度无差别，而放置7个月的免疫板，沉淀环清晰度略差，8个月放置的免疫板，沉淀环不清楚。由于免疫板放置时间过长，导致妊娠特异性β1糖蛋白抗血清失活。经观察比较，免疫板使用期限应在6个月以内为宜，每批使用前，均用妊娠特异性β1糖蛋白标准进行质量检测。通过对211例28-41孕周正常妊娠妇女血清测定，结果表明正常孕妇血清妊娠特异性β1糖蛋白值随孕周增加，41孕周达到高峰并维持到分娩。本方法以各孕周平均值正负两个标准差为各孕周正常范围的下限值。确定36-41孕周血清妊娠特异性β1糖蛋白≤100μg/ml为警界值，大于100μg/ml为正常值，以此对高危妊娠妇女进行观查。
具体实施方式
实施例
1.妊娠特异性β1糖蛋白的提纯
1.1饱和硫酸铵盐析
正常足月分娩产妇胎盘10个，应用组织捣碎机匀浆，加2倍体积生理盐水搅拌30分钟，以4000r/min离心20分钟，去沉淀，上清用50％体积比的饱和硫酸铵盐析，再以5000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，以生理盐水透析至无NH+；
1.2葡聚糖凝胶柱层析
取葡聚糖凝胶10克，按常规处理装柱2.5×100cm，用0.2mol/L NaCl和0.05mol/L tris-HCl缓冲液PH8.0平衡，取盐析浓缩样品10ml，流速每小时60ml，以每管5ml分别收集洗脱液，应用妊娠特异性β1糖蛋白血球试剂检查各管浓度，收集妊娠特异性β1糖蛋白高浓度管合并，用50％体积比的饱和硫酸铵沉淀，透析至无NH+；
1.3妊娠特异性β1糖蛋白偶联琼脂糖4B亲和层析
取琼脂糖4B30ml，经0.5mol/L NaCl和冷蒸馏水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/L NaOH调PH值，使之维持在11左右，反应10分钟，用布氏漏斗抽干，加入经PH值为9的0.1mol/L NaHCO3透析的妊娠特异性β1糖蛋白抗体搅拌4℃过夜，次日装柱，用0.01mol/L磷酸盐或0.5mol/L NaCl缓冲液洗至280nmOD值＜0.01为止，收集全部洗脱液，经紫外分光光度计测定280nmOD值，计算其偶联率体积比为78.2％，将合并的高浓度样品5ml加入妊娠特异性β1糖蛋白抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.01mol/L PH值7.4磷酸盐缓冲液洗脱，流速每小时30ml，洗至280nmOD值＜0.02时，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液PH值2.4解吸附，流速每小时60ml，收集妊娠特异性β1糖蛋白高浓度区，用50％体积比的饱和硫酸铵浓缩除盐；
1.4抗人全血清抗体偶联琼脂糖4B亲和层析柱制备
与妊娠特异性β1糖蛋白抗体偶联琼脂糖4B相同，其偶联率体积比为7.28％，将浓缩除盐妊娠特异性β1糖蛋白样品5ml加入抗人全血清抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液PH值7.0洗脱，洗速为每小时30ml，收集第一蛋白吸收峰，合并各管浓缩，冻干为妊娠特异性β1糖蛋白纯品。
2.妊娠特异性β1糖蛋白抗血清的制备
选择2kg雄性家兔，于双后足掌注射活卡介苗20mg，10天后向淋巴结周围多点注射，妊娠特异性β1糖蛋白抗原加福氏完全佐剂2ml，每千克体重150μg妊娠特异性β1糖蛋白抗原，以后每间隔一周免疫一次，经5次免疫后，用双向琼脂扩散法试血效价达到1∶64倍时，颈动脉放血分离血清；
3.人“O”型红细胞的醛化
取健康男性“O”型红细胞，经戊二醛、甲醛、丙酮醛处理后，配成10％体积比的醛化血球悬液；
4.妊娠特异性β1糖蛋白抗血清致敏醛化血球
取10％体积比的醛化血球离心后用0.1mol/L醋酸钠配成5％体积比的血球，将妊娠特异性β1糖蛋白免疫球蛋白分别稀释成10μg/ml浓度与等量醛化血球混合，在45℃恒温振荡水浴下反应1.5小时，经含有1％体积比的兔血清的磷酸盐缓冲液洗去未结合免疫球蛋白，配成1％体积比的血球悬液，生产出妊娠特异性β1糖蛋白冻干诊断血球；
5.将妊娠特异性β1糖蛋白冻干诊断血球用0.05mol/L NaCl、0.05％重量比的NaN3稀释成100、200、400倍，于56℃灭活30分钟，分别加入等体积的2.4％体积比的琼脂液中，琼脂液需煮沸30分钟后，冷却至56℃时方可混合均匀铺板，琼脂厚度3.0mm，打孔直径2.5mm，孔距1.2cm。
本发明应用实施例：
取10μl孕妇血清用1ml盐水稀释成100倍等待检测用，在V型微量血凝板上，从第1孔到第5孔各加样品稀释水25μl，取100倍稀释的血清25μl加到第1孔，用微量加样器从第1孔起依次做2倍稀释到第4孔，第5孔为空白对照，冻干妊娠特异性β1糖蛋白诊断血球用血球稀释水2ml溶解并摇匀，4℃过夜放置后应用，取25μl稀释血球从第1孔到第5孔各加25μl，震匀后放37℃，1小时取出判定结果。
判定标准：孕妇血清中妊娠特异性β1糖蛋白能与妊娠特异性β1糖蛋白抗体致敏血球出现凝集反应(阳性)，反之，如血清中不含有或浓度较低，则不出现凝集(阴性)，依据出现血球凝集的血清最大稀释倍数乘以致敏血球的敏感度0.125μg/ml，便可确定血清中妊娠特异性β1糖蛋白的浓度。
判定方法：
血球全部沉入孔底为阴性，根据凝集程度分为1-4各阶段，凝集在2以上可判定为阳性。
计算公式：
血清中妊娠特异性β1糖蛋白含量(μg/ml)＝血球凝集孔的血清稀释倍数×诊断血球的敏感度(μg/ml)。
用毛细玻璃管取孕妇耳垂血0.1ml，分离出血清，用微量加样器吸取5微升加入琼脂孔内(注意不要溢出孔外)，加样完毕后，盖好塑料板，水平放入温盒内，在37℃条件下扩散24小时观察结果，分别记录所测样品的免疫沉淀环直径(mm)，从标准曲线上可查出妊娠特异性β1糖蛋白值，即得该样品的妊娠特异性β1糖蛋白含量。通过对211例28-41孕周正常妊娠妇女血清测定，结果表明正常孕妇血清妊娠特异性β1糖蛋白值随孕周增加，41孕周达到高峰并维持到分娩。本方法以各孕周平均值正负两个标准差为各孕周正常范围的下限值。确定36-41孕周血清妊娠特异性β1糖蛋白≤100μg/ml为警界值，大于100μg/ml为正常值，以此对高危妊娠妇女进行观查。其中标准曲线的制备方法是：在琼脂板孔内分别加入3个不同浓度的妊娠特异性β1糖蛋白标准液，每孔加样5μl，放入37℃恒温24小时后观察沉淀环直径，发现妊娠特异性β1糖蛋白抗血清200倍稀释后所做的琼脂板，免疫沉淀环直径比较清晰，其扩散环直径分别为8.1mm、6.2mm、5.0mm，以标准含量为横坐标，标准液免疫沉淀环直径为纵坐标，绘制标准工作曲线。(参考德国Benring研究所的妊娠特异性β1糖蛋白标准)
Claims (1)
1、一种妊娠特异性β1糖蛋白诊断试剂的制备方法，该方法采用如下步骤：
(1)妊娠特异性β1糖蛋白的提纯
(1.1)饱和硫酸铵盐析
正常足月分娩产妇胎盘5-10个，应用组织捣碎机匀浆，加2倍体积生理盐水搅拌20-40分钟，以3000-6000r/min离心20分钟，去沉淀，上清用50％体积比的饱和硫酸铵盐析，再以4000-10000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，以生理盐水透析至无NH+；
(1.2)葡聚糖凝胶柱层析
取葡聚糖凝胶10克，按常规处理装柱2.5×100cm，用0.1-0.3mol/LNaCl和0.05mol/L tris-HCl缓冲液PH8.0平衡，取盐析浓缩样品10ml，流速每小时10-80ml，以每管2-10ml分别收集洗脱液，应用妊娠特异性β1糖蛋白血球试剂检查各管浓度，收集妊娠特异性β1糖蛋白高浓度管合并，用50％体积比的饱和硫酸铵沉淀，透析至无NH+；
(1.3)妊娠特异性β1糖蛋白偶联琼脂糖4B亲和层析
取琼脂糖4B 10-40ml，经0.5mol/L NaCl和冷蒸馏水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/L NaOH调PH值，使之维持在5-12左右，反应5-20分钟，用布氏漏斗抽干，加入经PH7-11的0.1mol/L NaHCO3透析的妊娠特异性β1糖蛋白抗体搅拌4℃过夜，次日装柱，用0.01mol/L磷酸盐或0.5mol/L NaCl缓冲液洗至280nmOD值＜0.01为止，收集全部洗脱液，经紫外分光光度计测定280nmOD值，计算其偶联率体积比为78.2％，将合并的高浓度样品5ml加入妊娠特异性β1糖蛋白抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.01mol/LPH6-8磷酸盐缓冲液洗脱，流速每小时10-60ml，洗至280nmOD值＜0.02时，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液PH2.4解吸附，流速每小时10-80ml，收集妊娠特异性β1糖蛋白高浓度区，用50％体积比的饱和硫酸铵浓缩除盐；
(1.4)抗人全血清抗体偶联琼脂糖4B亲和层析柱制备
与妊娠特异性β1糖蛋白抗体偶联琼脂糖4B相同，其偶联率体积比为7.28％，将浓缩除盐妊娠特异性β1糖蛋白样品5ml加入抗人全血清抗体亲和层析柱1.5×20cm中，用0.01mol/l磷酸盐缓冲液PH7.0洗脱，洗速为每小时30ml，收集第一蛋白吸收峰，合并各管浓缩，冻干为妊娠特异性β1糖蛋白纯品；
(2)妊娠特异性β1糖蛋白抗血清的制备
选择2kg雄性家兔，于双后足掌注射活卡介苗5-40mg，5-20天后向淋巴结周围多点注射，妊娠特异性β1糖蛋白抗原加福氏完全佐剂0.5-4ml，每千克体重50-400μg妊娠特异性β1糖蛋白抗原，以后每间隔一周免疫一次，经5次免疫后，用双向琼脂扩散法试血效价达到1∶64倍时，颈动脉放血分离血清；
(3)人“O”型红细胞的醛化
取健康男性“O”型红细胞，经戊二醛、甲醛、丙酮醛处理后，配成10％体积比的醛化血球悬液；
(4)妊娠特异性β1糖蛋白抗血清致敏醛化血球
取10％体积比的醛化血球离心后用0.1mol/L醋酸钠配成1-10％体积比的血球，将妊娠特异性β1糖蛋白免疫球蛋白分别稀释成1-20μg/ml浓度，与等量醛化血球混合，在20-60℃恒温振荡水浴下反应0.5-3小时，经含有0.1-3％体积比的兔血清的磷酸盐缓冲液洗去未结合免疫球蛋白，配成1％体积比的血球悬液，生产出妊娠特异性β1糖蛋白冻干诊断血球；
(5)将妊娠特异性β1糖蛋白冻干诊断血球用0.05mol/L NaCl、0.05％重量比的NaN3稀释成100、200、400倍，于56℃灭活10-40分钟，分别加入等体积的1-4％体积比的琼脂液中，琼脂液需煮沸10-40分钟后，冷却40-70℃时方可混合均匀铺板，琼脂厚度3.0mm，打孔直径2.5mm，孔距1.2cm。
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