BRPI0907530B1 - Anticorpos monoclonais isolados, fragmentos de ligação ao antígeno e composições farmacêuticas - Google Patents

Abstract

anticorpo direcionados á angiopoietina -1angiopoietina-2 e seus usos. são divulgados agentes de ligação específicos, tais como anticorpos totalmente humanos, que se ligam á angiopoietina 1 e/ou á angiopoietina 2. também são divulgados fragmentos de cadeia pesada, fragmentos de cadeia leve e cdrs dos anticorpos, bem como métodos para fabricar e usar os anticorpos.

Description

REFERÊNCIA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S de Número de Série 61/139.361 depositado em 19 de dezembro de 2008, do Pedido Provisório U.S de Número de Série 61/061.943 depositado em 16 de junho de 2008, e do Pedido Provisório U.S de Número de Série 61/066.632 depositado em 20 de fevereiro de 2008, todos estão incorporados neste documento para referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se aos agentes de ligação específicos que reconhecem e se ligam a angiopoetinas-1 (Ang-1) e/ou a angiopoetina-2 (Ang-2). Mais especificamente, a invenção refere-se à produção, à utilização diagnóstica, ao uso terapêutico de anticorpos monoclonais e policlonais e aos fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente a Ang-1 e/ou Ang-2. Aspectos da invenção também se relacionam aos hibridomas ou a outras linhagens celulares que expressam esses anticorpos. Os anticorpos descritos são úteis para o diagnóstico e para o tratamento de doenças associadas à atividade e ao excesso de produção de Ang-1 ou Ang-2.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Angiogênese, a formação de novos vasos sanguíneos a partir dos já existentes é essencial para muitos processos fisiológicos e patológicos. Normalmente, a angiogênese é fortemente regulada por fatores pró e anti-angiogênicos, mas no caso de doenças como o câncer, doenças oculares neovasculares, artrite e psoríase, o processo pode dar errado. Folkman, J., Nat. Med., 1:27-31 (1995).

Existem várias doenças conhecidas por estarem associadas à angiogênese desregulada ou indesejada. Tais doenças incluem, entre outras, neovascularização ocular, tais como retinopatias, incluindo retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade, psoríase, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerose, doenças inflamatórias, tais como doença inflamatória reumatóide ou reumática, especialmente a artrite (incluindo artrite reumatóide) ou outros distúrbios inflamatórios crônicos, como asma crônica, aterosclerose arterial ou pós- transplante, endometriose e doenças neoplásicas, por exemplo, os chamados tumores sólidos e tumores líquidos, ou hematopoiéticos (tal como leucemias e linfomas). Outras doenças associadas à angiogênese indesejada serão evidentes para aqueles versados na técnica.

Embora muitos sistemas de transdução de sinal tenham sido implicados na regulação da angiogênese, um dos sistemas melhor caracterizados e o mais seletivo para células endoteliais envolve a tirosina quinase receptor Tie-2 (conhecida como “Tie-2” ou “Tie-2R” (também conhecida como “ORK”); Tie-2 murino é também conhecido como “tek”) e seus ligantes, as angiopoetinas (Gale, N. W. and Yancopoulos, G. D., Genes Dev. 13:1055-1066 [1999]). Há 4 angiopoetinas conhecidas; angiopoietina-1 (“Ang-1") até angiopoietina-4 (“Ang-4”). Estas angiopoetinas também são referidas como "ligantes de Tie-2". (Davis, S., et al., Cell, 87:1161-1169 [1996]; Grosios, K., et al., Cytogenet Cell Genet, 84:118-120 [1999]; Holash, J., et al.,

Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625 [1999]; Koblizek, T. I., et al., Current Biology, 8:529-532 [1998]; Lin, P., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95:88298834 [1998]; Maisonpierre, P. C., et al., Science, 277:5560 [1997]; Papapetropoulos, A., et al., Lab Invest, 79:213223 [1999]; Sato, T. N., et al., Nature, 375:70-74 [1998]; Shyu, K. G., et al., Circulation, 98:2081-2087 [1998]; Suri, C., et al., Cell, 87:1171-1180 [1996]; Suri, C., et al., Science, 282:468-471 [1998]; Valenzuela, D. M., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 96:1904-1909 [1999]; Witzenbichler, B., et al., J Biol Chem, 273:18514-18521 [1998]). Enquanto a ligação de Ang-1 a Tie-2 estimula a fosforilação do receptor em células endoteliais cultivadas, Ang-2 tem sido observada tanto sendo agonista como antagonista da fosforilação do receptor Tie-2 (Davis, S., et al., [1996], supra; Maisonpierre, P.C., et al., [1997], supra; Kim, I., J.H. Kim, et al., Oncogene 19 (39): 4549-4552 (2000); Teichert-Kuliszewska, K., P.C. Maisonpierre, et al., Cardiovascular Research 49(3): 659-70 (2001)).

Os fenótipos de nocautes de camundongo para Tie-2 e Ang-1 são similares e sugerem que a fosforilação de Tie-2 estimulada por Ang-1 media a remodelação e a estabilização de vasos em desenvolvimento in útero por meio da manutenção da aderência celular sustentada pelas células endoteliais (Dumont, D. J., et al., Genes & Development, 8:1897-1909 [1994]; Sato, T. N., et al., Nature, 376:70-74 [1995]; Suri, C., et al., [1996], supra). Acredita-se que o papel da Ang-1 na estabilização dos vasos seja conservado no adulto, onde ela é expressa constitutivamente e amplamente (Hanahan, D., Science, 277:48-50 [1997]; Zagzag, D., et al., Experimental Neurology, 159:391-400 [1999]). Em contraste, a expressão da Ang-2 é essencialmente limitada aos sítios de remodelação vascular, onde se acredita que bloqueie a função de Ang-1, induzindo a um estado de plasticidade vascular propício para angiogênese (Hanahan, D., [1997], supra; Holash, J., et al., Science, 284:19941998 [1999]; Maisonpierre, P. C., et al., [1997], supra).

Numerosos estudos publicados têm supostamente demonstrado a expressão Ang-2 seletiva de vasos em estados patológicos associados à angiogênese. Estas condições patológicas incluem, por exemplo, psoríase, degeneração macular e câncer (Bunone, G., et al., American Journal of Pathology, 155:1967-1976 [1999]; Etoh, T., et al., Cancer Research, 61:2145-2153 [2001]; Hangai, M., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625 [2001]; Holash, J., et al., [1999] supra; Kuroda, K., et al., Journal of Investigative Dermatology, 116:713-720 [2001]; Otani, A., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40:1912-1920 [1999]; Stratmann, A., et al., American Journal of Pathology, 153:1459-1466 [1998]; Tanaka, S., et al., J Clin Invest, 103:34-345 [1999]; Yoshida, Y., et al., International Journal of Oncology, 15:1221-1225 [1999]; Yuan, K., et al., Journal of Periodontal Research, 35:165-171 [2000]; Zagzag, D., et al., [1999] supra). Muitos desses estudos focalizaram o câncer, em que muitos tipos de tumores parecem mostrar a expressão de Ang-2 vascular. Em contraste com sua expressão na angiogênese patológica, a expressão de Ang-2 em tecidos normais é extremamente limitada (Maisonpierre, P. C., et al., [1997], supra; Mezquita, J., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 260:492-498 [1999]).

Nos adultos normais, os três principais locais da angiogênese são os ovários, a placenta e o útero; estes são os principais tecidos, dentre tecidos normais (isto é, não cancerosos), em que o mRNA de Ang-2 foi detectado.

Alguns estudos funcionais sugerem que a Ang-2 pode estar envolvida na angiogênese do tumor. Ahmad et al. (Cancer Res., 61:1255-1259 [2001]) descrevem a superexpressão da Ang 2 e mostram que essa está supostamente associada ao aumento do crescimento do tumor em um modelo de xenoenxerto em camundongo. Veja também Etoh et al., supra, and Tanaka et al., supra, onde os dados são apresentados supostamente associando à superexpressão da Ang-2 na hipervascularização tumoral. No entanto, em contraste, Yu et al. (Am. J. Path., 158:563-570 [2001]) reportam os dados para mostrar que a superexpressão da Ang- 2 nas células de carcinoma mamário TA3 e carcinoma pulmonar de Lewis supostamente prolongou a sobrevida dos camundongos injetados com os transfectantes correspondentes.

Nos últimos anos, várias publicações sugeriram Ang-1, Ang-2 e Tie-2 como um possível alvo para a terapia anticâncer. Por exemplo, as Patentes US Nos. 6.166.185; 5.650.490 e 5.814.464 cada uma divulga o conceito de anticorpo anti-ligante de Tie-2 e de corpos (Fc) de receptor. A publicação do pedido de patente U.S. No. 2003/0124129A1 descreve certos anticorpos anti-Ang 2 e seus usos no tratamento do câncer. Lin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci E.U.A., 95:8829-8834 [1998]) injetaram um adenovírus expressando Tie-2 solúvel em camundongos, o Tie-2 solúvel supostamente diminuiu o número e tamanho dos tumores desenvolvidos pelos camundongos. Em um estudo relacionado, Lin et al. (J. Clin. Invest. ,100:2072-2078 [1997]) injetaram uma forma solúvel de Tie-2 em ratos; este composto supostamente reduziu o tamanho do tumor nos ratos. Siemeister et al. (Cancer Res., 59:3185-3189 [1999]) geraram linhagens de células de melanoma humano expressando o domínio extracelular do Tie-2, estas linhagens celulares foram injetadas em camundongos atímicos e concluiu-se que o Tie-2 solúvel supostamente resulta em uma “inibição significativa” do crescimento do tumor e da angiogênese tumoral.

Assim, uma terapia anti-Ang-2 eficaz poderia beneficiar uma vasta população de pacientes com câncer porque a maioria dos tumores sólidos necessita da neovascularização para crescer além de 1 a 2 milímetros de diâmetro. Essa terapia pode ter uma aplicação mais ampla em outras doenças associadas à angiogênese, bem como retinopatias, artrite e psoríase.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Embora as evidências apontem muito para a utilidade de inibir os níveis Ang2 no tratamento da angiogênese indesejada (ou qualquer subconjunto de condições que implique na geração indesejada de vasos sanguíneos, como arteriogênese), o estado atual da técnica não deixa claro se a inibição simultânea da Ang1 seria benéfica para tais terapias e em caso afirmativo qual o grau de inibição da Ang1, além da inibição da Ang2, pode vir a proporcionar, pelo menos, um efeito terapêutico aditivo. Assim, a presente invenção destina-se a reconhecida necessidade de identificação de novos agentes que reconheçam especificamente e se liguem tanto aos ligantes da Ang-1 quanto da Ang-2. Os agentes de ligação, tais como os anticorpos da presente invenção, têm os níveis de atividade desejada para inibir a Ang2 bem como a ANG1 que os tornam particularmente úteis em uma variedade de situações, tais como triagem diagnóstica, bioensaios e intervenção terapêutica em doenças que estão associadas a Ang-1 e/ou atividade da Ang-2, tais como o câncer, e outras doenças relacionadas à angiogênese indesejada.

As várias modalidades da invenção relacionam-se aos agentes de ligação alvo que se ligam especificamente a Ang- 1 e/ou Ang-2 e assim inibem a angiogênese patológica ou fisiológica. Os mecanismos pelos quais isso pode ser alcançado podem incluir, dentre outros, a inibição da ligação da Ang-1 e/ou Ang-2 ao receptor Tie1 e/ou Tie2, inibição da Ang-1 e/ou Ang-2 induzida sinalização da Tie1 e/ou Tie2, ou aumento da depuração da Ang-1 e/ou Ang-2 do corpo do paciente reduzindo, assim, a concentração eficaz de Ang-1 e/ou Ang-2.

Em uma modalidade da invenção, o agente de ligação específico é um anticorpo totalmente humano que se liga especificamente a Ang-1 e/ou Ang-2 e impede a Ang-1 e/ou a Ang-2 de ligar-se aos receptores Tie1 e/ou Tie2. No entanto, em outra modalidade da invenção é um anticorpo monoclonal totalmente humano que se liga a Ang-1 e/ou Ang-2 e também inibe a Ang-1 e/ou Ang-2 induzindo a fosforilação de Tie1 e/ou Tie2. O anticorpo pode ligar-se a Ang-1 e/ou a Ang-2 por meio de um Kd inferior a cerca de 100 pM, 30 pm, 20 pM, 10 pM, 5 pM ou 1pM. Certas modalidades da invenção são anticorpos do tipo IgG, ou seja, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Outra modalidade da invenção fornece um agente de ligação como um anticorpo que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada selecionada do grupo constituído de H2 (SEQ ID NO. 1); H3 (SEQ ID NO. 2); H4 (SEQ ID NO. 3); H6 (SEQ ID NO. 4); H10 (SEQ ID NO. 5); H11 (SEQ ID NO. 6); H5P (SEQ ID NO. 7) e fragmentos de antígeno de ligação dos mesmos; e a cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve selecionado do grupo constituído de: L1 (SEQ ID NO. 8); L2 (SEQ ID NO. 9); L4 (SEQ ID NO. 10); L6 (SEQ ID NO. 11); L7 (SEQ ID NO. 12); L8 (SEQ ID NO. 13); L9 (SEQ ID NO. 14); L11 (SEQ ID NO. 15); L12 (SEQ ID NO. 16); L13 (SEQ ID NO. 17); e fragmentos de ligação a antígeno do mesmo.

A invenção também fornece um agente de ligação específico incluindo pelo menos um peptídio selecionado do grupo constituído de: H2 (SEQ ID NO. 1); H3 (SEQ ID NO. 2); H4 (SEQ ID NO. 3); H6 (SEQ ID NO. 4); H10 (SEQ ID NO. 5); H11 (SEQ ID NO. 6); H5P (SEQ ID NO. 7); L1 (SEQ ID NO. 8); L2 (SEQ ID NO. 9); L4 (SEQ ID NO. 10); L6 (SEQ ID NO. 11); L7 (SEQ ID NO. 12); L8 (SEQ ID NO. 13); L9 (SEQ ID NO. 14); L11 (SEQ ID NO. 15); L12 (SEQ ID NO. 16); L13 (SEQ ID NO. 17); e fragmentos de ligação a antígeno do mesmo. Nota-se que o agente de ligação específico pode ser, por exemplo, um anticorpo, como um policlonal, monoclonal quimérico, humanizado ou um anticorpo totalmente humano. Os anticorpos também podem ser um anticorpo de cadeia única. Outros exemplos de agentes de ligação específicos incluem pepticorpos (peptídeo mais anticorpo), como pepticorpo ML4-3, avimers, outras formas de moléculas de peptídeo (como moléculas de fusão com Fc e moléculas de fusão com Ab (veja tecnologia CovX-Pfizer)) que contem sequências de peptídeo que identificam e ligam-se a uma proteína alvo (neste contexto, o ligante (s) da Ang-1 e/ou Ang-2), etc.

Uma modalidade específica da invenção relaciona-se aos pepticorpos como ML4-3 que liga Ang-1. Outras modalidades da invenção incluem a porção de peptídeo ML4-3, bem como peptídeos de ligação da Ang-1 semelhantes que pode ser feito por adição, exclusão e/ou inserção de aminoácidos para formar o peptídeo. Adições, exclusões ou inserções similares podem ser feitas a porção Fc do pepticorpo ML4-3. Outras alterações no mL4-3 e nos pepticorpos, em geral, são bem conhecidas na técnica e ensinada, por exemplo, em WO00/24782 e WO03/057134 que são incorporados neste documento para referência nas seções que descrevem e ensinam a fazer ligantes que contêm um peptídio gerado aleatoriamente que se liga um alvo desejado.

A invenção ainda refere-se à hibridoma que produz um anticorpo monoclonal, de acordo com a invenção, bem como linhagens celulares contendo (por qualquer meio, tais como a transfecção, transformmation, eletroporação), sequências de ácidos nucleicos necessários para expressar o presente agente de ligação específico como os anticorpos descritos aqui.

Também nota-se que a invenção se refere a conjugados, como descrito aqui. O conjugado pode ser, por exemplo, um agente de ligação específico (tal como um anticorpo) da invenção conjugado com outras moléculas proteináceas, de carboidrato, lipídicas, ou de fração mista.

A invenção ainda refere-se a moléculas de ácido nucleico codificando os agentes de ligação específica (tal como um anticorpo) da invenção, bem como um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico, bem como uma célula hospedeira contendo o vetor.

Além disso, a invenção fornece um método para produzir um agente de ligação específico compreendendo: (a) transformar uma célula hospedeira com pelo menos uma molécula de ácido nucleico codificando o agente de ligação específica, (b) expressar a molécula de ácido nucleico na célula hospedeira e (c) isolar o agente de ligação específico mencionado. A invenção também fornece um método para produzir um anticorpo compreendendo: (A) transformar uma célula hospedeira com pelo menos uma molécula de ácido nucleico codificando os anticorpos de acordo com a invenção, (b) expressar a molécula de ácido nucleico na célula hospedeira e (c) isolar o agente de ligação específico.

Além disso, a invenção se refere a um método de inibição da angiogênese indesejada em um mamífero pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação específico de acordo com a invenção. Além disso, também fornece um método para tratar o câncer em um mamífero pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação específico de acordo com a invenção.

Além disso, também se refere a um método de inibição da angiogênese indesejada em um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com a invenção. A invenção adicionalmente também fornece um método para tratar o câncer em um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com a invenção.

Será notado que a invenção ainda refere-se a composições farmacêuticas compreendendo o agente de ligação específico de acordo com a invenção e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode compreender um anticorpo de acordo com a invenção e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável.

A invenção fornece um método de modulação ou inibição da atividade da angiopoietina-2 por meio da administração de um ou mais agentes de ligação específico da invenção. A invenção também fornece um método de modulação ou inibição da atividade angiopoietina-2 por meio da administração de um anticorpo da invenção.

A invenção ainda refere-se a um método de modulação de pelo menos dentre permeabilidade vascular ou vazamento de plasma em um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de ligação específico de acordo com a invenção. A invenção também se refere a um método de tratamento de pelo menos uma doença neovascular ocular, obesidade, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerose, doenças inflamatórias, distúrbios inflamatórios, aterosclerose, endometriose, doença neoplásica, doenças relacionadas aos ossos, ou psoríase em um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação específico de acordo com a invenção.

A invenção ainda refere-se a um método de modulação de pelo menos uma permeabilidade vascular ou vazamento de plasma em um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com a invenção. A invenção também se refere a um método de tratamento de pelo menos uma doença neovascular ocular, obesidade, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerose, doenças inflamatórias, distúrbios inflamatórios, aterosclerose, endometriose, doença neoplásica, doenças relacionadas aos ossos, ou psoríase em um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com a invenção.

Além disso, a invenção refere-se a um método para tratar o câncer em um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação específico de acordo com a invenção e de um agente quimioterápico. Será notado por aqueles na técnica que o agente de ligação específico e quimioterápico não precisam ser administrados simultaneamente.

A invenção também fornece um agente de ligação específico que inclui uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada de qualquer dentre: SEQ ID NO. 18; A invenção também se refere a um agente de ligação específico que inclui uma região determinante de complementaridade 2 (CDR 2) de cadeia pesada de qualquer dentre: SEQ ID NO. 26; SEQ ID NO. 27; SEQ ID NO. 28; SEQ ID NO. 29); e fragmentos de ligação a antígeno do mesmo.

A invenção também se refere a um agente de ligação específico que inclui uma região determinante de complementaridade 3 (CDR 3) de cadeia pesada de qualquer: SEQ ID NO. 32; SEQ ID NO. 34; SEQ ID NO. 35; SEQ ID NO. 37; SEQ ID NO. 38; SEQ ID NO. 39); e fragmentos de ligação a antígeno do mesmo.

A invenção também fornece um agente de ligação específico que inclui uma região determinante de complementaridade 1 (CDR 1) de cadeia leve de qualquer: SEQ ID NO. 19; SEQ ID NO. 20; SEQ ID NO. 21; SEQ ID NO. 22; SEQ ID NO. 23; SEQ ID NO. 24; SEQ ID NO. 25); e fragmentos de ligação a antígeno do mesmo.

A invenção também se refere a um agente de ligação específico que inclui uma região determinante de complementaridade 2 (CDR 2) de cadeia leve de qualquer: SEQ ID NO. 27; SEQ ID NO. 30; SEQ ID NO. 31); e fragmentos de ligação a antígeno do mesmo.

A invenção também se refere a um agente de ligação específico que inclui uma região determinante de complementaridade 3 (CDR 3) de cadeia leve de qualquer: SEQ ID NO.33; SEQ ID NO. 36; SEQ ID NO. 40); e fragmentos de ligação a antígeno do mesmo.

Outras modalidades da invenção incluem moléculas de ácido nucleico isoladas codificando qualquer um dos anticorpos descritos aqui, vetores tendo moléculas de ácido nucleico isoladas codificando os anticorpos anti-Ang-1 e/ou Anti-Ang-2 ou uma célula hospedeira transformada com qualquer uma das moléculas de ácidos nucleicos. Além disso, uma modalidade da invenção é um método de produzir anticorpos anti-Ang-1 e/ou anti-Ang-2 por meio do cultivo da células hospedeira em condições em que a molécula de ácido nucleico é expressa para produzir o anticorpo seguido pela recuperação dos anticorpos . Deve ser percebido que as modalidades da invenção também incluem uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo ou fragmento de um anticorpo da invenção incluindo sequências de ácidos nucleicos otimizadas para aumentar o rendimento dos anticorpos ou fragmentos dos mesmos, quando transfectado em células hospedeiras para a produção de anticorpos.

Além disso, uma modalidade inclui um método de produção de anticorpos de alta afinidade com a Ang-1 e/ou Ang-2 por imunizar um mamífero com Ang-1 ou 2 humanos, ou um fragmento da mesmo, e uma ou mais sequências de ortólogos ou fragmentos.

Além disso, a invenção se refere a um método de detectar o nível de Ang-1 ou Ang-2 em uma amostra biológica pelo (a) entrar em contato com um agente de ligação específico da invenção com a amostra e (b) determinar a extensão da ligação do agente de ligação específico para a amostra. A invenção também se refere a um método de detectar o nível de Ang-1 ou Ang-2 em uma amostra biológica pelo (a) entrar em contato do um anticorpo da invenção com a amostra e (b) determinar a extensão da ligação do anticorpo para a amostra.

A invenção também se refere a um método de inibição da angiogênese indesejada em um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou composição como descrito neste documento. A invenção também se refere a um método de modulação da angiogênese em um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou composição como descrito neste documento. A invenção também se refere a um método de inibição do crescimento do tumor caracterizado pela angiogênese indesejada em um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou composição como descrito neste documento. Além disso, A invenção também se refere a um método de tratamento do câncer em um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou composição como descrito neste documento e de um agente quimioterápico. O polipeptídio ou composição específica, conforme descrito aqui, e o agente quimioterápico não precisam ser administrados simultaneamente. Em uma modalidade preferida, o agente quimioterápico é, pelo menos, um dos 5-FU, CPT-11 e Taxotere. Será notado, no entanto, que outros agentes quimioterápicos adequados e outras terapias de câncer podem ser usados.

Além disso, a invenção se refere a um método de tratamento do câncer em um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou composição como descrito neste documento e de um agente anti- VEGF ou de um inibidor multiquinase (MKI). Em uma modalidade preferida, o agente anti-VEGF ou o inibidor multiquinase (MKI) serão escolhidos a partir de Avastin ® (bevacizumab), Lucentis ® (ranibizumabe), Macugen ® (Macugen), Sutent ® (sunitinib), Nexavar ® (sorafenib), difosfato de motesanib, Zactima ® (Vandetanib), Recentin (AZD 2171) AG-013.736 (axitinib). Será notado, no entanto, que outros agentes anti-angiogênico adequados e outras terapias de câncer podem ser usados.

Será notado que os agentes de ligação específico da invenção são usados para tratar várias doenças associadas à angiogênese desregulada ou indesejada. Tais doenças incluem, entre outras, neovascularização ocular, tais como retinopatias (incluindo retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade), psoríase, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerose, doenças inflamatórias, tais como reumatoide ou doença inflamatória reumática, especialmente a artrite (incluindo artrite reumatoide) ou outros distúrbios inflamatórios crônicos, como asma crônica, arterial ou pós-transplantacional aterosclerose, endometriose e doenças neoplásicas, por exemplo, os chamados tumores sólidos e tumores líquidos (como a leucemia). Outras doenças que podem ser tratadas pela administração de agentes de ligação específicos serão evidentes para aqueles versados na técnica. Essas doenças adicionais incluem, dentre outras, a obesidade, a permeabilidade vascular, vazamento de plasma e distúrbios relacionados aos ossos incluindo a osteoporose. Assim, a invenção também diz respeito aos métodos de tratamento destas doenças associadas à angiogênese indesejada ou desregulada.

Outras modalidades da invenção incluem um agente de ligação específico, compreendendo pelo menos um peptídio selecionado do grupo consistindo em: SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO. 5; SEQ ID NO. 6; SEQ ID NO. 7; SEQ ID NO. 8; SEQ ID NO. 9; SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 11; SEQ ID NO. 12; SEQ ID NO. 13; SEQ ID NO. 14; SEQ ID NO. 15; SEQ ID NO. 16; SEQ ID NO. 17); e fragmentos de ligação a antígeno do mesmo. Também são contemplados os anticorpos contendo as sequências de polipeptídeos mencionados. Estes anticorpos são policlonais, monoclonais quiméricos, humanizados, ou anticorpos totalmente humanos. Eles são anticorpos de cadeia única, bem como anticorpos de cadeia múltipla. Hibridomas que produzem os anticorpos monoclonais são também contemplados, bem como, as moléculas de ácido nucleico codificando os polipeptídeos e os anticorpos, os vetores contendo essas moléculas de ácido nucleico e as células hospedeiras, como as células CHO que contêm e as expressam. Um método para produzir um agente de ligação ou um anticorpo da presente invenção compreendendo transformar uma célula hospedeira com pelo menos uma molécula de ácido nucleico codificando o agente de ligação específico ou o anticorpo; expressando a molécula de ácido nucleico na célula hospedeira; e isolar o agente de ligação específico ou anticorpo.

A utilização de diagnóstico da invenção inclui um método para detectar o nível de angiopoietina-1 e/ou angiopoietina-2 em uma amostra biológica compreendendo o contato de um anticorpo ou de um agente de ligação descrito neste documento com as amostras biológicas, e determinar a extensão da ligação do anticorpo ou do agente de ligação da amostra.

Entre as utilizações terapêuticas específicas da invenção estão os métodos de inibição da angiogênese indesejada (ou qualquer subconjunto de condições que impliquem na produção indesejada de vasos sanguíneos, como arteriogênese) em um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos polipeptídeos isolados ou dos agentes de ligação, tais como anticorpos feitos dos mesmos. Entre tais angiogênese indesejada (ou qualquer subconjunto de condições que impliquem na produção indesejada de vasos sanguíneos, como arteriogênese) estão o câncer e doenças inflamatórias em mamíferos. Portanto, uma composição farmacêutica é contemplada que compreende o polipeptídeo isolado, o agente de ligação ou o anticorpo da invenção em mistura com um transportador farmacêutico. Agentes de formulação farmaceuticamente aceitável, é claro, são muitas vezes utilizados para preparar essas composições farmacêuticas para a administração a sujeitos que dela necessitam.

Outros métodos que utilizam as composições da presente invenção incluem um método de modulação ou inibição da atividade da angiopoietina-1 e/ou angiopoietina-2 compreendendo a administração a um paciente do polipeptídeo isolado, agente de ligação ou anticorpo descrito neste documento. Tais métodos de modulação ou inibição da atividade da angiopoietina-1 e/ou angiopoietina-2 compreendendo a administração a um paciente do polipeptídeo, o agente de ligação ou anticorpos descritos neste documento. Tais métodos incluem a modulação de pelo menos uma permeabilidade vascular ou vazamento de plasma em um mamífero compreendendo a administração a um mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo isolado, do agente de ligação ou do anticorpo descrito neste documento. Também estão incluídos métodos de tratamento de pelo menos uma das doenças neovasculares oculares, obesidade, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerose, doenças inflamatórias, distúrbios inflamatórios, aterosclerose, endometriose, doença neoplásica, doença relacionada aos ossos ou psoríase.

Também é prevista um método de comboterapia (terapia de combinação) como um método de tratamento do câncer em um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo isolado, do agente de ligação ou do anticorpo descritos neste documento e de um agente quimioterápico. Em tais métodos, por vezes, o polipeptídeo isolado, o agente de ligação ou o anticorpo e o agente quimioterápico são administrados simultaneamente e em outras vezes não, dependendo da condição específica, aprovação regulamentar e o julgamento dos profissionais de medicina.

Outros tipos de comboterapia incluem um método de tratamento do câncer em um mamífero compreendendo a administração a um paciente, em necessidade do mesmo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo isolado, do agente de ligação ou do anticorpo descritos neste documento e uma molécula secundária que liga um ligante a qualquer um dos receptores VEGF 1-3. Exemplos de tais moléculas secundárias um ligam uma ligante a qualquer um dos receptores do VEGF 1-3 são Avastin ®, Lucentis ® e Macugen ®.

O uso dos polipeptídeos, agentes de ligação ou anticorpos descritos aqui são também contemplados em combinação com agentes de moléculas pequenas para a administração terapêutica a sujeitos que dela necessitam. Tais agentes de moléculas pequenas incluem aqueles que modulam a sinalização de qualquer um dos receptores do VEGF 1-3, bem como aqueles que são inibidores multiquinase. Por exemplo, Sutent ®, Nexavar ®, difosfato Motesanib, Axitinib, Zactima, AZD 2171, Recentin e AG-013736 são contemplados para o uso na comboterapia com os polipeptídios, agentes de ligação, e os anticorpos descritos neste documento.

Outras modalidades da invenção relacionam-se com um agente de ligação específico compreendendo uma CDR 1 de qualquer das SEQ ID NO. 18; SEQ ID NO. 19; SEQ ID NO. 20; SEQ ID NO. 21; SEQ ID NO. 22; SEQ ID NO. 23; SEQ ID NO. 24; SEQ ID NO. 25; um agente de ligação específico compreendendo CDR 2 de qualquer um dos SEQ ID NO. 26; SEQ ID NO. 27; SEQ ID NO. 28; SEQ ID NO. 29; SEQ ID NO. 30; SEQ ID NO. 31; e um agente de ligação específico compreendendo CDR 3 de qualquer um dos SEQ ID NO. 32; SEQ ID NO. 33; SEQ ID NO. 34; SEQ ID NO. 35; SEQ ID NO. 36; SEQ ID NO. 37; SEQ ID NO. 38; SEQ ID NO. 39; SEQ ID NO. 40. O agente de ligação específico pode incluir 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs.

Da mesma forma, as moléculas de ácido nucleico que codificam os agentes de ligação específicos, acima mencionado, são contempladas. Também é contemplado um método para detectar o nível de angiopoietina-1 e/ou angiopoietina-2 em uma amostra biológica compreendendo o contato de um agente de ligação específico descrito neste documento com as amostras biológicas, e determinar a extensão da ligação do agente de ligação específico da amostra. Também é contemplado um método para detectar o nível de angiopoietina-1 e/ou angiopoietina-2 em uma amostra biológica compreendendo o contato de um agente de ligação específico descrito neste documento com as amostras biológicas, e determinar a extensão da ligação do agente de ligação específico da amostra.

Outra modalidade da invenção é um anticorpo que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada selecionada do grupo constituído de SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO. 5; SEQ ID NO. 6 e SEQ ID NO. 7) e a cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve selecionada do grupo constituído de SEQ ID NO. 8; SEQ ID NO. 9; SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 11; SEQ ID NO. 12; SEQ ID NO. 13; SEQ ID NO. 14; SEQ ID NO. 15; SEQ ID NO. 16 e SEQ ID NO. 17); bem como fragmentos de ligação a antígeno do mesmo. Naturalmente, as moléculas de ácido nucleico codificam os anticorpos acima descritos e os fragmentos de ligação de antígenos são também contemplados.

Em outra modalidade, a presente invenção é destinada a um anticorpo isolado constituído por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, a cadeia leve que compreende um domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada compreendendo um domínio variável de cadeia pesada, o domínio variável de cadeia pesada tendo a sequência selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 1, SEQ ID: 2, SEQ ID: 3, SEQ ID: 4, SEQ ID: 5, SEQ ID NO: 6, e SEQ ID NO: 7, onde o anticorpo se liga especificamente a pelo menos um dos ligantes ANG1 e Ang2 do receptor Tie 2.

Em outra modalidade, a invenção é um anticorpo isolado constituído por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, a cadeia pesada compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e da cadeia leve compreendendo um domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia leve tendo a sequência selecionada do grupo constituído de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, e SEQ ID NO: 17; onde o anticorpo se liga especificamente a pelo menos um dos ligantes Ang1 e Ang2 do receptor Tie 2.

Em outra modalidade, a invenção é direcionada a um anticorpo isolado constituído por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, a cadeia pesada compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e a cadeia leve compreendendo um domínio variável de cadeia leve, em que o domínio variável de cadeia pesada compreende 1, 2, ou 3 cadeias pesadas de CDRs selecionada do grupo constituído de HC CDRs consistindo em SEQ ID NOs: 18, 26, 28, 32, 34, 35, 37, 38 e 39, e em que o anticorpo se liga especificamente a pelo menos um dos ligantes ANG-1 e Ang-2 do receptor Tie 2.

Em outra modalidade, a presente invenção é destinada a um anticorpo isolado constituído por uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a cadeia leve compreende um domínio variável de cadeia leve e a cadeia pesada compreende um domínio variável de cadeia pesada, em que o domínio variável de cadeia leve compreende 1,2 ou 3 cadeias leves CDRs selecionada do grupo constituído por LC CDRs consistindo em SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23, 27, 33, 36, 40, e em que o anticorpo se liga especificamente a pelo menos um dos ligantes ANG-1 e Ang-2 do receptor Tie 2.

Em uma modalidade, a invenção é um anticorpo isolado que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende um domínio variável de cadeia pesada e a cadeia leve compreende um domínio variável de cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende 3 cadeias pesadas (HC) CDRs e o domínio variável de cadeia leve compreende 3 cadeias leves (LC) CDRs, em que as sequências do referido HC e LC CDRs dos anticorpos são selecionados do grupo constituído por: (a) SEQ ID NOs: 18, 26, 32 de HC mais SEQ ID NOs: 19, 27, 33 da LC, (b) SEQ ID NOs: 18, 26, 34 de HC mais SEQ ID NOs: 19, 27, 33 da LC, (c) SEQ ID NOs: 18, 26, 35 de HC mais SEQ ID NOs: 20, 27, 36 de LC, (d) SEQ ID NOs: 18, 26, 37 de HC mais SEQ ID NOs: 19, 27, 33 de LC, (e) SEQ ID NOs: 18, 26, 38 de HC mais SEQ ID NOs: 19, 27, 33 de LC, (f) SEQ ID NOs: 18, 26, 35 de HC mais SEQ ID NOs: 19, 27, 33 de LC, (g) SEQ ID NOs: 18, 26, 34 de HC mais SEQ ID NOs: 21, 27, 33 de LC, (h) SEQ ID NOs: 18, 28, 39 de HC mais SEQ ID NOs: 19, 27, 33 de LC, (i) SEQ ID NOs: 18, 26, 34 de HC mais SEQ ID NOs: 22, 27, 33 de LC, (j) SEQ ID NOs: 18, 26, 32 de HC mais SEQ ID NOs: 22, 27, 33 de LC, (k) SEQ ID NOs: 18, 29, 39 de HC mais SEQ ID NOs: 19, 27, 33 de LC, (l) SEQ ID NOs: 18, 26, 34 de HC mais SEQ ID NOs: 23, 27, 33 de LC, (m) SEQ ID NOs: 18, 26, 35 de HC mais SEQ ID NOs: 20, 27, 40 de LC, (n) SEQ ID NOs: 18, 26, 32 de HC mais SEQ ID NOs: 21, 27, 33 de LC, (o) SEQ ID NOs: 18, 26, 35 de HC mais SEQ ID NOs: 24, 27, 33 de LC, (p) SEQ ID NOs: 18, 26, 35 de HC mais SEQ ID NOs: 21, 27, 33 de LC, (q) SEQ ID NOs: 18, 26, 35 de HC mais SEQ ID NOs: 23, 27, 33 de LC, (r) SEQ ID NOs: 18, 26, 34 de HC mais SEQ ID NOs: 20, 30, 33 de LC, (s) SEQ ID NOs: 18, 26, 34 de HC mais SEQ ID NOs: 25, 27, 33 de LC, (t) SEQ ID NOs: 18, 26, 35 de HC mais SEQ ID NOs: 20, 30, 33 de LC, (u) SEQ ID NOs: 18, 26, 34 de HC mais SEQ ID NOs: 20, 27, 40 de LC, e (v) SEQ ID NOs: 18, 26, 34 de HC mais SEQ ID NOs: 20, 31, 33 de LC; liga especificamente a pelo menos um dos ligantes Ang-1 e Ang-2

A presente invenção também é dirigida a um anticorpo com uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia leve tem um domínio variável de cadeia leve tendo 3 LC CDRs de qualquer um (a) através (v), supra, na qual o anticorpo especificamente para pelo menos um dos ligantes e Ang-1 e Ang-2 do receptor Tie 2.

Adicionalmente, a presente invenção também é dirigida a um anticorpo com uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada tem um domínio variável de cadeia pesada tendo 3 LC CDRs de qualquer um (a) através (v), supra, na qual o anticorpo especificamente para pelo menos um dos ligantes Ang-1 e Ang-2 do receptor Tie 2.

As moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos acima descritos e os fragmentos de ligação a antígenos são também contemplados. Outras modalidades da presente invenção serão facilmente perceptíveis a partir da divulgação prevista neste documento. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra um gráfico do tamanho do tumor (eixo y) versus tempo (eixo-x) em camundongos portadores de tumor tratados com ambos os anticorpos anti-Ang1/2 (H4L4, H4L11 ou H6L7) da invenção ou um pepticorpo de controle altamente potente (AMG 386) ou anticorpo 536, comparado ao tratamento com um anticorpo de controle isotípico. Os detalhes são descritos nos exemplos. A Figura 2 mostra um gráfico da carga tumoral (% do tumor viável [seção dividida] x peso do tumor) em camundongos portadores de tumor tratados com os anticorpos anti-Ang1/2 ((H4L4, H4L11 ou H6L7) da invenção ou pepticorpo de controle altamente potente (AMG 386) ou anticorpo 536, comparado ao tratamento com um anticorpo de controle isotípico. Os detalhes são descritos nos exemplos. A Figura 3 mostra o efeito do H4L4, H4L11 e H6L7 da invenção, um pepticorpo de controle altamente potente (AMG 386) e anticorpo 536 na proliferação das células endoteliais em camundongos portadores de tumor Colo205. Os detalhes são descritos nos exemplos. A Figura 4 mostra o anticorpo H4L4 na relação de dose- resposta em camundongos portadores de tumor Colo205. Os detalhes são descritos nos exemplos. A Figura 5 mostra o efeito do anticorpo H4L4 na carga tumoral in vivo do Colo205. Os detalhes são descritos nos exemplos. A Figura 6 mostra o efeito do anticorpo H4L4 na proliferação de células endoteliais em camundongos portadores de tumor Colo205. Os detalhes são descritos nos exemplos. A Figura 7 mostra sistemicamente a administração da ML4-3 que neutraliza a indução da Ang-1 para a fosforilação Tie2 nos pulmões do camundongo. Os camundongos (n = 3 por grupo) foram tratados com o L1-7 (N) (2 mg/kg), mL4-3 (20 mg/kg) ou controle de Fc (20 mg/kg) diariamente durante 23 dias antes do desafio i.v. com Ang1 ou BSA. Os pulmões do camundongo foram posteriormente colhidos, e os níveis da fosforilação Tie2 foram determinados por análise Western blot de imunoprecipitação. Os dados são valores médios ± SE. * P = 0,0005 vs. Ang1 mais Fc, ANOVA com teste post hoc da Fisher. A Figura 8 mostra a inibição farmacológica da Ang1 durante o alerta da organogênese precoce do desenvolvimento do coração. A) embriões de camundongos expostos a 300 mg/kg de mL4-3 (painel direito) possuíam corações com menos, mais estreitos e mais espaços amplos de trabéculas em relação aos corações maiores com trabéculas maiores e amplas encontradas na fase de combinação de embriões expostos a 300 mg/kg de controle de Fc (painel esquerdo). Imagens representativas são mostradas. B) A incidência de anormalidades cardíacas em embriões tratados com Fc- e mL4- 3. * P <0,0001 vs Fc, teste chi-square. A Figura 9 mostra o efeito de inibição da Ang1 e Ang2 combinadas no crescimento do tumor xenoenxerto Colo205. OS camundongos (n = 10 por grupo) foram implantados com células Colo205, e o tratamento começou quando os tumores atingiram cerca de 500 mm3 com o controle de FC (5,2 mg/kg QD), mL4-3 (3,2 mg/kg QD), L1-7 (N) (2,0 mg/kg QD), L1-7 (N) combinado com mL4-3 (no mesmo regimes de dosagem usada nos grupos de agente único), ou AMG 386 (5,6 mg/kg, duas vezes por semana). Um dos quatro experimentos representativos é mostrado. Os dados são valores médios ± SE. * P <0,0001 vs L1-7 (N), RMANOVA com teste Scheffé post hoc. A figura 10 ilustra o efeito do antagonismo Ang1 e Ang2 na proliferação das células endoteliais do tumor, angiogênese na córnea e angiogênese da retina. A) O efeito da inibição da Ang1 e Ang2 na captação de BrdU em células endoteliais de camundongos derivados de xenoenxertos tumorais Colo205. Os camundongos portadores de tumores foram tratados por três dias com o Fc (5,7 mg/kg QD), AMG 386 (6 mg/kg em dose única), L1-7 (N) (2,2 mg/kg QD), mL4-3 (3,5 mg/kg QD), ou L1-7 (N) combinado com mL4-3 (nas mesmas doses e horários utilizados nos grupos de agente único). Cada barra representa média endotelial:total de células de camundongos em relação ao BrdU (n = 3). Os dados são valores médios ± SE. * P <0,05 vs Fc, pareado teste t de Student. B e C) O efeito de inibição da Ang1 e Ang2 em (B) indução de VEGF e (C) angiogênese corneal induzida bFGF. A angiogênese foi induzida pelo implante de discos de náilon molhados VEGF- ou bFGF no estroma corneal de ratos (n = 8 por grupo). O tratamento foi iniciado um dia antes da implantação da córnea e continuou a cada três dias com: Fc (60 mg/kg), L1-7 (N) (5 mg/kg), mL4-3 (60 mg/kg) e L1-7 (N) combinado com mL4-3 (na mesma dose e horário usado nos grupos de agente único). Os dados são valores médios ± SE. ■ P <0,0001 vs Fc + VEGF (B); #P <0,002 vs Fc + bFGF (C), ANOVA com teste post hoc da Fisher. D) Inibição da Ang2 impede que o oxigênio indiza a neovascularização na retina do camundongo. A partir do P8 dias do pós-parto, os filhotes (n = 5 por grupo) foram tratados diariamente com s.c. durante nove dias, com FC (200 mg/kg) L1-7 (N) (100 mg/kg) mL4-3 (100 mg/kg) ou L1-7 (N) combinado com mL4-3 (na mesma dose e horário utilizado nos grupos de agente único). Os dados são valores médios ± SE. §P < 0.0001 vs Fc, ANOVA com teste post hoc de Fisher. A figura 11 ilustra inibidores Ang1 e Ang2 que cooperativamente suprimem a angiogênese folicular ovariano. O HCG foi usado para induzir a superovulação em camundongos. Fc (300 mg/kg), mL4-3 (150 mg/kg), L1-7 (N) (150 mg/kg), ou um mL4-3/L1-7 (N) combinação de (150 mg / kg cada ) administrado s.c. (N = 10/07 camundongos por grupo) foram avaliados quanto à capacidade de prevenir a neovascularização em ovulação dos folículos. A área do vaso sanguíneo foi calculado a partir das seções imunomarcadas anti-CD31 dos folículos individuais. Os dados são valores médios ± SE. Dois experimentos independentes são mostrados. * P = 0,005 comparando a combinação mL4-3/L1-7 (N) vs um único agente isolado; #P <0,05 vs Fc, ANOVA com teste post hoc de Dunnett.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os títulos das seções são utilizados aqui apenas para fins de organização, e não devem ser interpretados como uma limitação do assunto divulgado.

As técnicas padrão podem ser utilizadas para a molécula de DNA recombinante, proteína e produção de anticorpos, bem como para cultura de tecidos e transformação celular. As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são normalmente realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como é comumente feito na técnica através dos procedimentos convencionais, tais como os previsto em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]), ou como descritos neste documento. Salvo indicação em contrário, a nomenclatura utilizada em conexão com, e os procedimentos de laboratório e as técnicas de química analítica, química orgânica sintética e produtos químicos farmacêuticos e medicinais descritos neste documento são aqueles bem conhecidos e normalmente usados na técnica. As técnicas padrão podem se usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e distribuição e tratamento de pacientes.

Os termos usados para descrever a presente invenção, a menos que definido especificamente aqui, terão o seu significado como é entendido e utilizado na técnica.

Deve-se notar que os termos H5 e H5P são sinônimos e referem-se à cadeia pesada utilizada em várias modalidades da invenção, ou seja, mAbs nomeado como H5L7, H5L6, H5L8, H5L4, H5L11, H5L1, H5L12 e H5L9.

O termo "Ang-2" refere-se ao polipeptídeo previsto na Figura 6 da Patente U.S. No. 6.166.185 (“ligante-2 de Tie- 2”), aqui incorporados por referência, ou fragmentos dos mesmos, bem como polipeptídeos relacionados que incluem variantes alélicas, variantes de splice, derivados, substituição, deleções e/ou variantes de inserção, os peptídeos de fusão e polipeptídeos, e homólogos interespecíficos. O Ang-2 polipeptídeo pode ou não incluir resíduos terminal adicional, ou seja, sequências líder, sequências de endereçamento, metionina amino-terminal, metionina amino-terminal e resíduos de lisina e/ou sequências de proteínas de fusão ou marcadores, dependendo da forma em que é preparado.

O termo "agente de ligação específico" refere-se a uma molécula, de preferência uma molécula proteica, que liga Ang-2, bem como Ang-1 (e suas variantes e seus derivados, como aqui definido), com maior afinidade do que outras angiopoetinas. Um agente de ligação específico pode ser uma proteína, peptídeos, ácidos nucleicos, carboidratos, lipídios, ou compostos de baixo peso molecular que se liga preferencialmente a Ang-2 e Ang-1. Em uma modalidade preferida, o agente de ligação específico, de acordo com a presente invenção, é um anticorpo, como um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal (mAb), um anticorpo quimérico, um anticorpo enxertado com CDR, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo biespecífico, um anticorpo catalítico, um anticorpo humano, um anticorpo anti- idiotípicos (anti-Id), e os anticorpos que podem ser marcados na forma solúvel ou aderida, bem como os fragmentos de ligação de antígeno, variantes ou seus derivados, isoladamente ou em combinação com outras sequências de aminoácidos, fornecida por meio das técnicas conhecidas. Tais técnicas incluem, entre outras, a clivagem enzimática, clivagem química, síntese de peptídeos ou técnicas recombinantes. Os agentes de ligação específicos da presente invenção anti-Ang-2 e Ang-1 são capazes de ligar porções de Ang-2 e Ang-1 que modulam, ou seja, inibir ou promover a atividade biológica da Ang-2 e Ang-1 e/ou de outras atividades associadas a Ang-2 e Ang-1.

O termo "anticorpo policlonal" refere-se a uma mistura heterogênea de anticorpos que identificam e se ligam a diferentes epítopos do mesmo antígeno. Os anticorpos policlonais podem ser obtidos a partir de preparações de soro bruto, ou podem ser purificados, utilizando, por exemplo, cromatografia de afinidade de antígeno ou cromatografia de afinidade da proteína A/proteína G.

O termo "anticorpos monoclonais" refere-se a um conjunto de anticorpos codificado pela mesma molécula de ácido nucleico que são, opcionalmente, produzida por uma única hibridoma (ou clone dela) ou linhagem de células, ou um mamífero transgênico de tal forma que cada anticorpo monoclonal normalmente identifica o mesmo epítopo sobre o antígeno. O termo "monoclonal" não se limita a qualquer método particular para produzir o anticorpo, nem o termo se limita a produção de anticorpo em uma determinada espécie, ou seja, camundongo, rato, etc.

O termo "anticorpos quiméricos" refere-se aos anticorpos em que uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntico ou homólogo a uma sequência correspondente em um anticorpo derivado de uma determinada espécie ou pertencente a uma classe de anticorpos específicos ou subclasse, enquanto o restante da cadeia(s) é/são idêntico ou homólogo a uma sequência correspondente de anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpos. Também estão incluídos os fragmentos de ligação de antígeno desses anticorpos que exibem atividade biológica desejada (ou seja, a capacidade de ligar-se especificamente a Ang-2). Veja, patente U.S 4.816.567 e Morrison et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 81:6851-6855 [1985].

O termo "anticorpo enxertado com CDR" refere-se a um anticorpo em que o CDR de um anticorpo de uma determinada espécie ou isotipo é recombinantemente inserido na região de arcabouço de outro anticorpo de espécie ou isotipo igual ou diferente.

O termo "anticorpo multiespecífico" refere-se a um anticorpo com regiões variáveis que identifica mais de um epítopo em um ou mais antígenos. Uma subclasse desse tipo de anticorpo é o "anticorpo biespecífico" que identifica dois epítopos distintos no mesmo antígeno ou em antígeno diferentes.

Anticorpos ”catalíticos” referem-se a anticorpos em que uma ou mais frações citotóxicas ou, de forma mais geral, uma ou mais biologicamente ativa, são acopladas ao agente de ligação de direcionamento.

O termo "anticorpo humanizado" refere-se a um tipo específico de anticorpo enxertado com CDR em que a região da estrutura do anticorpo é derivada de um ser humano, mas cada CDR é substituído por aquele proveniente de outra espécie, como um CDR de murino. O termo "CDR" é definido infra.

O termo anticorpo "totalmente humano" refere-se a um anticorpo em que ambos os CDR e a estrutura são derivados de uma ou mais moléculas de DNA humano.

O termo anticorpo "anti-idiotipo" se refere a qualquer anticorpo que se liga especificamente a outro anticorpo que identifica um antígeno. A produção dos anticorpos anti- idiotipo pode ser realizada por qualquer um dos métodos descritos neste documento para a produção de anticorpos específicos Ang-2, salvo se que estes anticorpos surgem a partir, por exemplo, da imunização de um animal com um anticorpo específico Ang-2 ou fragmento de ligação de Ang-2 dos mesmos, ao invés do polipeptídeo Ang-2 em si ou um fragmento do mesmo.

O termo "variantes", como usado neste documento, inclui os polipeptídeos em que os resíduos de aminoácidos estão inseridos, excluídos e/ou substituído na ocorrência natural (ou pelo menos um conhecido) da sequência de aminoácidos para o agente de ligação. As variantes da invenção incluem proteínas de fusão, como descrito abaixo. "Derivados" incluem aqueles agentes de ligação que foram modificados quimicamente de alguma maneira distinto da inserção, deleção ou substituição de variantes. "Liga-se especificamente" refere-se à capacidade de um agente de ligação específico (tal como um anticorpo ou fragmento desse) da presente invenção para reconhecer e se ligar ao polipeptídeo alvo maduro, completo, ou parcial (aqui Ang-2 e Ang-1 ), ou um de seus ortólogo, tal que a sua afinidade (como determinado por, ou seja, testes de afinidade ELISA ou BIAcore, conforme descrito aqui) ou a sua capacidade de neutralização (como determinado por, ou seja, teste de neutralização ELISA aqui descrito, ou testes similares) é de pelo menos 10 vezes maior, mas, opcionalmente, 50 vezes maior, 100, 250 ou 500 vezes maior, ou até pelo menos 1000 vezes tão maior quanto a afinidade ou neutralização capacidade de neutralização do mesmo para qualquer outro angiopoietina ou outros peptídeo ou polipeptídeos.

O termo “domínio de ligação a antígeno" ou "região de ligação a antígeno" refere-se àquela porção do agente de ligação específico (como uma molécula de anticorpo) que contém o agente de ligação específico dos resíduos de aminoácidos (ou outras metades) que interagem com um antígeno e conferem ao agente de ligação a sua especificidade e afinidade para com o antígeno. Em um anticorpo, o domínio de ligação a antígeno é comumente referido como a “região de determinação de complementaridade ou CDR."

O termo “epítopo” refere-se àquela porção de qualquer molécula capaz de ser identificada e ligada por um agente de ligação específico, ou seja, um anticorpo, em um ou mais dos antigénios do agente de ligação de regiões de ligação. Os epítopos consistem geralmente em grupos de superfície quimicamente ativos das moléculas, como, por exemplo, aminoácidos ou cadeias laterais de carboidratos, e possuem uma estrutura tridimensional específica características, bem como características de carga específica. Os epítopos como aqui utilizados podem ser contíguas ou não contíguas. Além disso, os epítopos podem ser mimético em que compreende uma estrutura tridimensional que é idêntico ao epítopo usado para gerar o anticorpo, no entanto, incluir nenhum ou apenas alguns dos resíduos de aminoácidos encontrados no Ang-2 utilizado para estimular a resposta imune do anticorpo.

O termo "epítopo inibidor e/ou neutralizante" é um epítopo que, quando ligado por um agente de ligação específico como um anticorpo, resulta na perda (ou pelo menos na diminuição) da atividade biológica da molécula, célula ou organismo contendo epítopo, in vivo, in vitro ou in situ. No contexto da presente invenção, o epítopo neutralizante está localizado ou está associada a uma região biologicamente ativa da Ang-2. Alternativamente, o termo "epítopo ativado" é um epítopo que, quando ligado por um agente de ligação específico da invenção, tal como um anticorpo, resulta em ativação, ou pelo menos a manutenção de uma conformação biologicamente ativa de Ang-2.

O termo “fragmento de anticorpo” refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo que compreende menos de um anticorpo completo ou intacto. Os anticorpos completos compreendem duas partes funcionalmente independentes ou fragmentos: um fragmento de ligação de antígeno conhecido como "Fab", e um fragmento carboxi terminal cristalizável conhecido como o fragmento “Fc”. O fragmento Fab inclui o primeiro domínio constante de ambas as cadeias pesada e leve (CH1 e CL1), juntamente com as regiões variáveis de ambas as cadeias pesada e leve que se ligam ao antígeno específico. Cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e leve inclui três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) e uma estrutura de resíduos de aminoácidos que separam os CDRs individual. A região Fc inclui a segunda e terceira região constante de cadeia pesada (CH2 e CH3) e está envolvida em funções efetoras, tais como ativação do complemento e ataque por células fagocíticas. Em alguns anticorpos, as regiões Fc e Fab são separadas por uma "região de dobradiça" de anticorpo, e dependendo de como o anticorpo completo é proteoliticamente clivado, a região de dobradiça pode estar associada tanto ao fragmento Fab ou ao fragmento Fc. Por exemplo, a clivagem de um anticorpo com a protease papaína resulta na região de dobradiça sendo associada ao fragmento Fc resultante, enquanto a clivagem com a protease pepsina fornece um fragmento em que a dobradiça é associado a ambos os fragmento Fab simultaneamente. Como os dois fragmentos Fab são, na verdade, ligados covalentemente seguindo a clivagem pepsina, o fragmento resultante é chamado de fragmento F(ab ')2.

Um domínio Fc pode ter uma meia vida de soro relativamente longa, ao passo que um Fab é de curta duração. [Capon et al., Nature, 337: 525-31 (1989)] Quando expresso como parte de uma proteína de fusão, um domínio Fc pode dar meia-vida mais longa ou incorporar tais funções como a ligação ao receptor Fc, uma proteína A de ligação, fixação de complemento e talvez até mesmo a transferência placentária na proteína que é fundida. A região Fc pode ser uma região ocorrência natural do Fc, ou pode ser alterada para melhorar certas qualidades, tais como as qualidades terapêuticas ou tempo de circulação.

O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se a uma porção da cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo, em geral, incluindo aproximadamente o amino terminal de 120 a 130 aminoácidos da cadeia pesada e cerca de 100 a 110 amino-terminal de aminoácidos na cadeia leve.

As regiões variáveis geralmente diferem amplamente na sequência de aminoácidos, mesmo entre anticorpos da mesma espécie. A região variável de um anticorpo normalmente determina a ligação e a especificidade de cada anticorpo específico para seu antígeno específico. A variabilidade na sequência está concentrada nas regiões referidas como regiões de determinação de complementaridade (CDRs), enquanto as regiões mais altamente conservadas no domínio variável são chamadas regiões de estruturas (FR). Os CDRs das cadeias leve e pesada contendo em seu interior os aminoácidos que são amplamente responsáveis pela interação direta do anticorpo com o antígeno, no entanto, aminoácidos nas FRs podem afetar significativamente a ligação/identificação do antígeno como discutido aqui em infra.

O termo “cadeia leve" quando usado em referência a um anticorpo, coletivamente refere-se a dois tipos distintos, chamados Kappa (k) ou lambda (l) baseado na sequência de aminoácidos dos domínios constantes.

O termo "cadeia pesada" quando usado em referência a um anticorpo, coletivamente refere-se a cinco tipos distintos, chamados alfa, delta, épsilon, gama e mu, baseado na sequência de aminoácidos de cadeia pesada de domínio constante. A combinação das cadeias leves e pesadas dão origem a cinco classes conhecidas de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluindo quatro subclasses de IgG conhecidas como, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

O termo "ocorrência natural" quando usado em conexão com materiais biológicos, tais como moléculas de ácido nucleico, polipeptídeos, células hospedeiras, e assim por diante, refere-se aos que são encontrados na natureza e não modificados por um ser humano.

O termo "isolado", quando utilizado em relação a Ang-2 ou a um agente de ligação específico da Ang-2 refere-se a um composto que é livre de, pelo menos, um polipeptídeo contaminado ou composto que se encontra no seu ambiente natural, e, de preferência, substancialmente livre de qualquer outro polipeptídeos de mamíferos contaminados que possam interferir com a sua utilização terapêutica ou diagnóstica.

O termo "maduro", quando utilizado em relação ao anticorpo anti-Ang-2, Ang-2, ou a qualquer outro agente de ligação especifico proteico da Ang-2 refere-se a um peptídeo ou um polipeptídeo sem uma sequência líder ou sinal. Quando um agente de ligação da invenção é expresso, por exemplo, em uma célula hospedeira procarióticas, o peptídio “maduro” ou polipeptídio pode também incluir outros resíduos de aminoácidos (mas ainda falta uma sequência líder), como um metionina amino terminal ou um ou mais resíduos de metionina e lisina. Um peptídio ou polipeptídio produzido dessa maneira pode ser utilizado com ou sem esses resíduos de aminoácidos adicionais tendo sido removido. Agentes de Ligação Específicos e Anticorpos

Como usado aqui, o termo "agente de ligação específico" refere-se a uma molécula que tem especificidade para a identificação e a ligar Ang-2 e Ang-1, conforme descrito neste documento. Os agentes de ligação específicos apropriados incluem, dentre outros, anticorpos e seus derivados, polipeptídios, e moléculas pequenas. Os agentes de ligação específicos apropriados podem ser preparados usando métodos conhecidos na técnica. Um exemplar dos polipeptídios Ang-2 e Ang-1 do agente de ligação específico da presente invenção é capaz de ligar uma determinada porção dos polipeptídios Ang-2 e Ang-1, e de preferência modular a atividade ou função dos polipeptídios Ang-2 e Ang-1.

Os agentes de ligação específicos, tais como anticorpos e fragmentos de anticorpos que liga os polipeptídios Ang-2 e Ang-1 estão dentro do escopo da presente invenção. Os anticorpos podem ser policlonais incluindo policlonal monoespecífico, monoclonal (mAbs), recombinante, quimérico humano como enxertos CDR, humano, cadeia única, catalisador, multiespecífico e/ou biespecífico, bem como fragmentos de ligação de antígeno, variantes e/ou seus derivados.

Os anticorpos policlonais contra polipeptídios Ang2 e Ang1 são geralmente produzidos em animais (p. ex., coelhos, hamsters, cabras, ovelhas, cavalos, porcos, ratos, gerbilos, porquinhos-da-índia, camundongos, ou qualquer outro mamífero adequado, bem como outras espécies de não mamíferos) por meio de injeções intraperitoneais ou subcutâneas múltiplas de polipeptídio Ang-2 e/ou Ang-1 ou um de seus fragmentos com ou sem adjuvante. Tais adjuvantes incluem, dentre outros, o completo e o incompleto de Freund, géis minerais tais como o hidróxido de alumínio e substâncias de ativação de superfície, tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídios, emulsões de óleo, hemocianina de Megathura crenulata e dinitrofenol. BCG (bacilo Calmette-Guerin) e

Corynebacterium parvum são adjuvantes humanos potencialmente úteis. Pode ser útil conjugar um polipeptídio antígeno a uma proteína transportadora que é imunogênica na espécie a ser imunizada, como a hemocianina de Megathura crenulata, soro, albumina, tireoglobulina bovina, soja ou inibidor de tripsina. Além disso, os agentes de agregação, como o alumínio são usados para aumentar a resposta imune. Após a imunização, os animais são sangrados e o soro é analisado para titulação de anticorpos anti-Ang-2 polipeptídeo que podem ser determinados por meio dos testes aqui descritos em "Exemplos". Os anticorpos policlonais podem ser utilizados nos soros sanguíneos a partir do qual eles são detectados, ou pode ser purificado a partir dos soros sanguíneos, por exemplo, cromatografia de afinidade de antígeno ou cromatografia de afinidade da proteína A/G.

Os anticorpos monoclonais voltados para os polipeptídios de Ang-2 podem ser produzidos usando, por exemplo, dentre outros, o método tradicional de “hibridoma” ou a técnica mais recente de phage display (exposição em fago). Por exemplo, os anticorpos monoclonais da invenção podem ser produzidos pelo método hibridoma como descrito em Kohler et al., Nature 256:495 [1975]; the human B-cell hybridoma technique [Kosbor et al., Immunol Today 4:72 (1983); Cote et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 80: 2026-2030 (1983); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987)] and the EBV-hybridoma technique [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, New York N.Y., pp 77-96, (1985)]. Também é fornecido pela invenção as linhagens de células de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais reativos com polipeptídios Ang-2.

Quando a técnica de hibridomas é empregada, as linhagens de células do mieloma podem ser usadas. Essas linhagens de células adequadas para o uso nos procedimentos de fusão da produção da hibridoma são, de preferência, não produtoras de anticorpos, possuem alta eficiência de fusão e deficiências enzimáticas que as tornam incapazes de crescer em determinados meios de cultura que auxiliam o crescimento apenas das células fundidas desejadas (hibridomas). Por exemplo, as linhagens de células utilizadas nas fusões das células do camundongo são Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 e S194/5XX0 Bul; as linhagens de células utilizadas nas fusões das células do rato são R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210. Outras linhagens de células úteis para a fusão celular U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6. As hibridomas e as outras linhagens de células que produzem anticorpos monoclonais são contempladas nas novas composições da presente invenção.

A técnica de phage display também pode ser usada para gerar anticorpos monoclonais a partir de qualquer espécie. Preferencialmente, essa técnica é usada para a produção de anticorpos monoclonais totalmente humanos em que um polinucleotídeo codifica um único fragmento de anticorpo Fab ou Fv que é expressado na superfície de uma partículas fago. [Hoogenboom et al., J Mol Biol 227: 381 (1991);

Marks et al., J Mol Biol 222: 581 (1991); see also U.S. Patent No. 5,885,793)]. Cada fago pode ser "triado" utilizando os testes de ligação aqui descritos para identificar os fragmentos de anticorpos que possuem afinidade com Ang-2. Assim, esses processos simulam a seleção imune por meio da apresentação de repertórios de fragmentos de anticorpos na superfície de bacteriófagos filamentosos, e subsequente seleção de fago pela sua ligação a Ang-2. Tal procedimento é descrito no pedido PCT No. PCT/US98/17364, depositado no nome de Adams et al., que descreve isolamento de fragmentos de anticorpo agonistas funcionais e de alta afinidade para receptores MPL- e msk- utilizando essa abordagem. Nesta abordagem, um repertório completo de genes de anticorpos humanos podem ser criados pela clonagem reorganizada naturalmente dos genes V humanos a partir dos linfócitos sanguíneos periférico como descrito anteriormente [Mullinax et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 87: 8095-8099 (1990)].

Depois que são identificadas sequências polinucleotídicas que codificam cada cadeia do anticorpo monoclonal completo ou do(s) fragmento(s) Fab ou Fv da invenção, células hospedeiras, eucarióticas ou procarióticas, podem ser usadas para expressar o anticorpo monoclonal polinucleotídeos utilizando técnicas recombinantes bem conhecida e praticada rotineiramente na técnica. Alternativamente, os animais transgênicos são produzidos onde um polinucleotídeo que codifica o agente de ligação específico desejado é introduzido no genoma de um animal receptor, como, por exemplo, um camundongo, coelho, cabra ou vaca, de forma que permita a expressão das moléculas de polinucleotídeo codificando o anticorpo monoclonal ou outro agente de ligação específico. Em um aspecto, o polinucleotídeos codificando o anticorpo monoclonal ou um agente de ligação especifico pode ser ligado a sequências regulatórias mamária específicas e os polinucleotídeos quimérico podem ser introduzidos na linha germinativa do animal alvo. O animal transgênico resultante produz então o anticorpo desejado em seu leite [Pollock et al., J Immunol Meth 231:147-157 (1999); Little et al., Immunol Today 8:364-370 (2000)]. Além disso, as plantas podem ser usadas para expressar e produzir agentes de ligação específicos para Ang-2, tais como anticorpos monoclonais por meio da transferência de plantas adequadas com os polinucleotídeos codificando os anticorpos monoclonais ou outros agentes de ligação específicos.

Em outra modalidade da presente invenção, um anticorpo monoclonal ou policlonal ou um desses fragmentos que é derivado de outra espécie que não a humana pode ser "humanizado" ou "quimerizado". Métodos para a humanização de anticorpos não-humanos são bem conhecidos na técnica. (Veja a patente U.S. 5,859,205; 5,585,089 e 5,693,762). A humanização é realizada, por exemplo, por meio de métodos descritos na técnica [Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988);

Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)] substituindo pelo menos uma porção, por exemplo, de um roedor, de uma região que determina a complementaridade (CDRs) para as regiões correspondentes de um anticorpo humano. A invenção também fornece variantes e derivados destes anticorpos humanos, como discutido neste documento e com é bem conhecido na técnica.

Também é englobado pela invenção os anticorpos totalmente humanos que ligam os polipeptídios Ang-2, assim como, fragmentos de ligação de antígeno, variantes e/ou seus derivados. Esses anticorpos podem ser produzidos utilizando a técnica de phage display acima descrita. Alternativamente, os animais transgênicos (ou seja, os camundongos), que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos, na ausência da produção de imunoglobulina endógena pode ser usado para gerar esses anticorpos. Isto pode ser conseguido através da imunização dos animais com um antígeno Ang-2 ou fragmentos dos mesmos, onde os fragmentos de Ang-2 possuem uma sequência de aminoácidos que é exclusivo para Ang-2. Tais imunogénios podem ser opcionalmente conjugados com um transportador. Veja, por exemplo, Jakobovits et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno, 7: 33 (1993). Em um método, os animais transgênicos são produzidos pela incapacitação do seu loci endógena codificando a cadeia imunoglobulina pesada ou leve e inserindo um loci codificando as proteínas de cadeias pesada e leve humanas para o seu genoma. Os animais parcialmente modificados, que são aqueles que têm menos do que o complemento total destas modificações, são, então, híbridos para obter um animal com todas as modificações desejadas do sistema imunológico. Quando é administrado um imunógeno, estes animais transgênicos são capazes de produzir anticorpos com regiões variáveis humanas, incluindo sequências de aminoácidos humanas (ao invés de, p. ex., murinas), que são imunoespecíficas para os antígenos desejados. Veja o pedido PCT/US96/05928 e PCT/US93/06926. Os métodos adicionais são descritos na patente U.S. 5.545.807, no pedido PCT/US91/245, PCT/GB89/01207 e em EP 546073B1 e EP 546073A1. Os anticorpos humanos podem ser produzidos por meio pela expressão de DNA recombinante em células hospedeiras ou pela expressão em células de hibridoma, como descrito neste documento.

A transgênese é alcançada em um número de maneiras diferentes. Veja, por exemplo, Bruggeman et al., Immunol Today 17:391-7 (1996). Em uma abordagem, é construído um minilocus de tal modo que os segmentos de gene em uma configuração de linhagem germinativa são colocados artificialmente próximos uns dos outros. Devido a limitações de tamanho (ou seja, tendo em geral menos de 30 kb), o minilocus resultante irá conter um número limitado de diferentes segmentos do gene, mas ainda será capaz de produzir um grande repertório de anticorpos. O miniloci contendo apenas sequências de DNA humano, incluindo promotores e enhancers (intensificadores) são totalmente funcionais no camundongo transgênico.

Quando um maior número de segmentos gênicos são desejados em um animal transgênico, cromossomos artificiais de levedura (YACs) são utilizados. O YACs pode variar de algumas centenas de kilobases de 1 Mb e são introduzidos no camundongo (ou em outro animal adequado) do genoma por via de microinjeção diretamente em um óvulo ou por via de transferência dos YAC em tronco embrionários de linhagem celular (ES). Em geral, YACs são transferidos para as células-tronco embrionárias por lipofecção do DNA purificado, ou fusão de esferoplasto de levedura onde o DNA purificado é carregado em micelas e a fusão é realizada de forma similar aos protocolos de fusão de hibridoma. A seleção de células ES após a transferência de DNA é realizada por meio da inclusão no YAC de qualquer um dos marcadores selecionáveis conhecido na técnica.

Como alternativa, são utilizados vetores de bacteriófago P1 que são amplificados em bactéria hospedeira E. coli. Embora esses vetores em geral transportem menos DNA inserido que um YAC, os clones são facilmente cultivadas em rendimento alto o suficiente para permitir a microinjeção direta em um óvulo de camundongo. O uso de um coquetel de diferentes vetores P1 foi mostrado para conduzir a elevados níveis de recombinação homóloga.

Uma vez que um camundongo transgênico adequado (ou outro animal adequado) foi identificado, utilizando qualquer uma das técnicas conhecidas na técnica para detectar os níveis de soro dos anticorpos circulantes (p. ex., ELISA), é realizado cruzamento do animal transgênico com um camundongo em que o locus endógeno de Ig foi interrompido. O resultado fornece progênie em que essencialmente todas as células B expressam anticorpos humanos.

Ainda como alternativa, o locus inteiro de Ig do animal é substituído pelo locus de Ig humano, onde o animal resultante expressa apenas anticorpos humanos. Em outra abordagem, porções do locus do animal são substituídos por regiões específicas e correspondentes no locus humano. Em certos casos, os animais resultantes deste processo podem expressar anticorpos quiméricos, ao contrário de anticorpos completamente humanos, dependendo da natureza da substituição do locus de Ig no camundongo.

Os anticorpos humanos podem ser produzidos por meio da exposição esplenócitos humano (células B ou T) a um antígeno in vitro, em seguida, reconstituir as células expostas em um camundongo imunodeficiêntes, p. ex., SCID ou nod/SCID. Veja Brams et al., J Immunol, 160: 2051-2058 [1998]; Carballido et al., Nat Med, 6: 103-106 [2000]. Em uma abordagem, o enxerto de tecido fetal humano em camundongos SCID (SCID-hu) resulta na hematopoiese de longa duração e no desenvolvimento das células T humanas [McCune et al., Science 241:1532-1639 (1988); Ifversen et al., Sem Immunol 8:243-248 (1996)].Qualquer resposta imune humoral nesses camundongos quiméricos é completamente dependente de codesenvolvimento das células T dos animais [Martensson et al., Immunol 83:1271-179 (1994)]. Em uma abordagem alternativa, linfócitos sanguíneos periférico humano são transplantados por via intraperitoneal (ou por outro meio) nos camundongos SCID [Mosier et al., Nature 335:256-259 (1988)]. Quando as células transplantadas são tratadas com um agente preparatório, como a enterotoxina estafilocócica A [Martensson et al., Immunol 84: 224-230 (1995)], ou anticorpos monoclonais anti-CD40 humanos Murphy et al., Blood 86:1946-1953 (1995)], os níveis mais elevados de produção de células B são detectados.

Alternativamente, um repertório de cadeia pesada humana inteiramente sintético é criado a partir de segmentos de gene V que não sofreram rearranjo, pela montagem de cada segmento VH humano com segmentos D de nucleotídeos aleatórios juntamente com um segmento J humano [Hoogenboom et al., J Mol Biol 227:381-388 (1992)]. Da mesma forma, um repertório de cadeia leve é construído por meio da combinação de cada segmento V humano com um segmento J [Griffiths et al., EMBO J 13:3245-3260 (1994)].

Os nucleotídeos codificando os anticorpos completo (ou seja, tanto as cadeias pesadas quanto as leves) são ligados como uma único fragmento Fv de cadeia e este polinucleotídeo é ligado a um nucleotídeo que codifica uma proteína de revestimento secundária de fago filamentoso. Quando esta proteína de fusão é expressa na superfície do fago, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo específico é identificado por meio da seleção usando um antígeno imobilizado.

Ainda uma outra abordagem, os fragmentos de anticorpos são agregados como dois fragmentos Fab pela fusão de uma cadeia com a proteína do fago e secreção dos outros no periplasma bacteriano [Hoogenboom et al., Nucl Acids Res 19:4133-4137 [1991]; Barbas et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 88:7978-7982 (1991)].

A produção em larga escala de anticorpos quimérico, humanizado, enxertados com CDR, totalmente humano ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos são normalmente produzidos por métodos de recombinação. As moléculas de polinucleotídeo que codificam as cadeias pesadas e leves de cada anticorpo ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, podem ser introduzidas nas células hospedeiras e expressa utilizando materiais e procedimentos aqui descritos. Em uma modalidade preferida, os anticorpos são produzidos em células hospedeiras de mamíferos, como as células CHO. Detalhes dessa produção são descritos.

Os agentes de ligação específico da presente invenção, como os anticorpos, fragmentos de anticorpos, e os derivados de anticorpos da invenção podem compreender qualquer região constante conhecida na técnica. A região constante de cadeia leve pode ser, por exemplo, uma região constante de cadeia leve do tipo kappa- ou lambda-, ou seja, uma região constante de cadeia leve do tipo kappa humano ou lambda-. A região constante de cadeia pesada pode ser, por exemplo, um alfa-, delta-, epsilon-, gama-, ou mu- do tipo região constante de cadeia pesada, ou seja, um ser alfa humano, delta, epsilon-, gama-, ou mu-tipo de região constante da cadeia pesada. Em uma modalidade, a região constante de cadeia leve ou pesada é um fragmento, derivado, variante, ou muteína de uma região naturalmente constante.

Em uma modalidade, os agentes de ligação específico da presente invenção, como os anticorpos, fragmentos de anticorpos, e os derivados de anticorpos da invenção podem compreender um IgG.

As técnicas são conhecidas para a derivação de um anticorpo de uma subclasse diferente ou isotipo a partir de um anticorpo de interesse, ou seja, alteração da subclasse. Assim, os anticorpos IgG podem ser derivadas de um anticorpo IgM, por exemplo, e vice-versa. Essas técnicas permitem a preparação de novos anticorpos que possuem as propriedades de ligação de antígeno de um anticorpo dado (o anticorpo parental), mas também apresentam propriedades biológicas associadas a um isotipo de anticorpos ou subclasse diferente das do anticorpo parental. As técnicas de DNA recombinante podem ser empregadas. O DNA clonado codificando polipeptídios de anticorpo específico pode ser empregado em tais procedimentos, ou seja, o DNA codificando o domínio constante de um anticorpo do isotipo desejado. Veja também Lantto et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:30316.

Os agentes de ligação específico da presente invenção, como os anticorpos, fragmentos de anticorpos, e os derivados de anticorpos da invenção podem compreender domínio constante de cadeia pesada IgG1 ou o fragmento do domínio de cadeia pesada IgG1. Os anticorpos, fragmentos de anticorpos, e os derivados de anticorpos da invenção podem ainda compreender a cadeia leve constante kappa ou domínio lambda ou fragmento desses. As regiões constante de cadeia leve e polinucleotídeos os codificando são fornecidos em seguida. Em outra modalidade, os anticorpos, fragmentos de anticorpo e anticorpos derivados da invenção compreendem um domínio constante de cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, tais como a região constante de cadeia pesada IgG2, também mostrada a seguir.

Os ácidos nucleicos (DNA) codificando os domínios constantes de cadeia pesada e de cadeia leve, e as sequências de aminoácidos dos domínios da cadeia pesada e leve são fornecidos a seguir. Os domínios variáveis Lambda podem ser fundidos com domínios constantes lambda e domínios variáveis kappa podem ser fundidos com domínios constantes kappa. DNA de Domínio Constante de Cadeia Pesada de IgG2 (SEQ ID NO: 41): gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacc tccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgac ggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctac agtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggc acccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagac agttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggac cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccct gaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactg gtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttca acagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggc aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccat ctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggg aggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagc gacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacc tcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaaga gcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac cactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga Proteína de Domínio Constante de Cadeia Pesada de IgG2 (SEQ ID NO: 42): ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK DNA de Domínio Constante de Cadeia Leve Kappa (SEQ ID NO: 43): cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttg aaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaa agtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacag agcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagca gactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcc cgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag Proteína de Domínio Constante de Cadeia Leve Kappa (SEQ ID NO: 44): RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC DNA de Domínio Constante de Cadeia Leve Lambda (SEQ ID NO: 45): ggccaaccgaaagcggcgccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggag cttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgt gacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacac cctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgag cagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtgga gaagacagtggcccctacagaatgttcatag Proteína de Domínio Constante de Cadeia Leve Lambda (SEQ ID NO: 46): GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVE TTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

Os agentes de ligação específicos da presente invenção como os anticorpos, os fragmentos de anticorpos e os derivados de anticorpos da invenção incluem, por exemplo, as combinações do domínio variável H6L7, H5L7, H4L13, H11L7, H4L7, H10L7, H5L6, H2L7, H5L8, H6L8, H3L7, H5L4, H4L12, H6L6, H4L2, H4L6, H4L4, H5L11, H5L1, H4L11, H5L12, H5L9 tendo o isotipo desejado (por exemplo, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, and IgD) bem como seus fragmentos Fab ou F(ab’)2. Além disso, se um IgG4 é desejado, também pode ser desejado introduzir uma mutação pontual na região da dobradiça, conforme descrito em Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407 (incorporado aqui por referência) para atenuar a tendência de formar ligações dissulfeto de intracadeia-H que pode levar a heterogeneidade dos anticorpos de IgG4. Informações de Sequência Úteis e Adicionais As seguintes sequências dos isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 são usados em combinação com as sequências de cadeias pesadas variáveis dos anticorpos da invenção presente para produzir um isotipo específico desejado do anticorpo mencionado: IgG1 humana ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG2 humana ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG3 humana ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPR CPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK IgG4 humana ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPE FEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Sequências de HC de anticorpos da presente invenção como uma IgG2 As sequências a seguir representam as sequências de cadeia pesada dos anticorpos da presente invenção como isotipo IgG2. As sequências de cadeias leves permanecem as mesmas, que são fornecidas nos exemplos. As partes sublinhadas das sequências representam a sequência IgG2: H2 EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIE YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPV AGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK H3 EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSS GSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK H6 EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSS GSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDIYTGYGYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK H10 EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSS GSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGLWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK H11 EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSS GSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGMWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK H4 EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSS GSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDLLTGYGYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK H5 EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSS GSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDIWTGYGYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Pares de Fusão de agentes de ligação específicos

Em uma modalidade adicional da invenção, os polipeptídios compreendendo os domínios variáveis da sequência de aminoácidos dos anticorpos Ang-2, tais como uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos como aqui descrito ou uma região variável da cadeia leve com uma sequência de aminoácidos como descritos aqui, podem ser fundidos e no N-terminal ou C-terminal de um ou mais domínios de uma região Fc de um IgG humano. Quando construído juntamente com uma proteína terapêutica como a Fab de um anticorpo Ang-2 específico, um domínio Fc pode fornecer meia-vida ou incorporar tais funções como ligação ao receptor Fc, proteína de ligação A, fixação de complemento e talvez até mesmo a transferência placentária. [Capon et al., Nature, 337: 525-531 (1989)].

Em um exemplo, o anticorpo dobradiça, as regiões CH2 e CH3 podem ser fundidas em N-terminal ou C-terminal dos agentes de ligação específicos dos polipeptídios, como um anti Fab Ang-2 ou fragmento Fv (obtido, por exemplo, de um biblioteca apresentada por fagos (phage display) usando métodos conhecidos pelos profissionais da área. A proteína de fusão resultante pode ser purificada por meio da utilização de uma proteína A ou uma coluna de afinidade da proteína G. Os peptídeos e as proteínas fundidas para uma região Fc demonstraram exibir uma meia-vida substancialmente maior in vivo do que a contrapartida não fundida. Além disso, uma fusão na região Fc permite a dimerização/multimerização do polipeptídio de fusão. A região Fc pode ser uma região Fc naturalmente, ou pode ser alterada para melhorar certas qualidades, tais como as qualidades terapêuticas, o tempo de circulação, diminuição de problemas de agregação, etc. Outros exemplos conhecidos na técnica incluem aqueles em que a região Fc, que pode ser humano ou de outra espécie, ou podem ser sintéticos, é fundida ao N-terminal de CD30L para tratar a doença de Hodgkin, linfoma anaplásico e leucemia de células T (patente U.S. 5480981), a região Fc é fundida ao receptor TNF para o tratamento de choque séptico [Fisher et al., N Engl J Med, 334: 1697-1702 (1996)], e a região Fc é fundida ao receptor Cd4 para tratar a AIDS [Capon et al., Nature, 337: 525-31 (1989)].

Anticorpos catalíticos são outro tipo de molécula de fusão e incluem anticorpos nos quais uma ou mais frações citotóxicas, ou, de modo mais geral, uma ou mais frações biologicamente ativas, são acopladas ao agente de ligação específico. Veja, por exemplo, Rader et al., Chem Eur J 12:2091-2095 (2000). Os agentes citotóxicos desse tipo melhoraram a citotoxicidade mediada por anticorpos, e incluem frações como citocinas, que direta ou indiretamente, estimulam a morte celular, radioisótopos, drogas quimioterápicas (inclusive pró-drogas), toxinas bacterianas (ex. exotoxina de Pseudomonas, a toxina diftérica, etc), toxinas vegetais (ex. ricina, gelonina, etc), conjugados químicos (por exemplo, toxinas maitansinoides, caliquemicina, etc), radioconjugados, conjugados enzimáticos (conjugados de RNase, enzima dirigida por anticorpo/ terapia de pró-droga [ADEPT)]), entre outras. Em um aspecto, o agente citotóxico pode ser "acoplado" a um componente de um anticorpo bi-específico ou multiespecífico por meio da ligação do agente a um dos sites de reconhecimento alternativos do antígeno do anticorpo. Como alternativa, proteína associada à citotoxina pode ser expressa como proteínas de fusão com o agente de ligação específico seguindo a ligadura de um polinucleotídeo que codifica a toxina a um polinucleotídeo que codifica o agente de ligação. Ainda em outra alternativa, o agente de ligação específico pode ser covalentemente modificado para incluir a citotoxina desejada. Exemplos de tais proteínas de fusão são polipeptídios imunogênicos, proteínas com longa circulação de meia-vida, como as regiões constante de imunoglobulina, proteínas marcadoras, proteínas ou polipeptídios que facilitam a purificação do agente de ligação específico do polipeptídeo desejado, e as sequências de polipeptídios que promovem a formação de proteínas multimericas (tais como motivos do zipper da leucina que são úteis na formação/estabilidade de dímero).

Este tipo de variante de inserção geralmente tem a totalidade ou uma parte substancial da molécula nativa, ligada a N- ou C-terminal, para a totalidade ou uma parte de um segundo polipeptídeo. Por exemplo, as proteínas de fusão tipicamente empregam sequências líder de outras espécies que permitam a expressão recombinante de uma proteína em um hospedeiro heterólogo. Outra proteína de fusão útil inclui a adição de um domínio ativo imunologicamente, tais como um epítopo de anticorpos, para facilitar a purificação da proteína de fusão. A inclusão de um sítio de clivagem em ou perto da junção da fusão irá facilitar a remoção do polipeptídio estranho após a purificação. Outras fusões úteis incluem ligação de domínios funcionais, tais como sítios ativos de enzimas, domínios de glicosilação, sinais de endereçamento celular ou regiões transmembrana.

Existem vários sistemas da expressão da proteína de fusão disponíveis comercialmente que podem ser utilizados na presente invenção. Particularmente, os sistemas úteis incluem, dentre outros, o sistema glutationa-S-transferase (GST) (Pharmacia), o sistema de proteína ligadora de maltose (NEB, Beverley, Massachusetts), o sistema FLAG (IBI, New Haven, Coneticute), e o sistema His 6x (Qiagen, Chatsworth, Califórnia). Estes sistemas são capazes de produzir polipeptídeos recombinantes tendo apenas um pequeno número de outros aminoácidos, que são susceptíveis de afetar a capacidade antigênica do polipeptídeo recombinante. Por exemplo, tanto o sistema FLAG como o sistema His 6x adicionam somente sequências curtas, as quais são conhecidas por serem pouco antigênicas e que não afetam adversamente o enovelamento do polipeptídio de sua conformação nativa. Outra fusão N-terminal que está prevista para ser útil é a fusão de um dipeptídio Met-Lys na região N-terminal da proteína ou peptídeos. Essa fusão pode produzir um aumento benéfico na expressão de proteínas ou atividade.

O constructo de fusão particularmente útil pode ser um no qual um agente de ligação específico do peptídeo é fundido a um hapteno para aumentar a imunogenicidade de um constructo de fusão do agente de ligação específico o que é útil, por exemplo, na produção de anticorpos anti-idiotipo da invenção. Esses constructos de fusão para aumentar a imunogenicidade são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, uma fusão de agente de ligação específico com um antígeno auxiliar como hsp70 ou sequências de peptídios como da cadeia de toxina da difteria ou citocinas como IL-2 Serão úteis para provocar uma resposta imune. Em outras modalidades, o constructo de fusão pode ser produzido que irá reforçar o alvo das composições do agente de ligação antígeno para um site específico ou célula.

Outros constructos de fusão incluindo polipeptídios heterólogos com propriedades desejadas, ou seja, uma região constante Ig para prolongar a meia-vida do soro ou de um anticorpo ou de seu fragmento para alvo também são contemplados. Outros sistemas de fusão que produzem polipeptídios híbridos onde é desejável para extirpar o parceiro de fusão do polipeptídeo desejado. Em uma modalidade, o parceiro de fusão está ligado ao agente de ligação específico do polipeptídeo recombinante por uma sequência de peptídeos contendo uma sequência de reconhecimento específico para uma protease. Exemplos de sequências disponíveis são aqueles reconhecidas pelo protease Tobacco Etch Virus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ou Fator Xa (New England Biolabs, Beverly, MA).

A invenção também fornece polipeptídios de fusão compreendendo a totalidade ou parte de um domínio variável de um anticorpo Ang-2, tais como uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos como aqui descrito ou de uma região variável da cadeia leve com uma sequência de aminoácidos, como descrito aqui em combinação com o fator tissular truncado (tTF), um agente de direcionamento vascular constituído de uma forma truncada de uma proteína de indução de coagulação humana que atua como um agente de coagulação do vaso sanguíneo do tumor. A fusão do tTF para o anticorpo anti-Ang-2 de, ou os seus fragmentos, podem facilitar a liberação do anti-Ang-2 para as células-alvo.

Variantes dos agentes de ligação específicos As variantes dos agentes de ligação específicos da presente invenção incluem a inserção, eliminação e/ou variantes de substituição. Em um aspecto da invenção, as variantes de inserção são fornecidas em que uma ou mais resíduos de aminoácidos complementam um agente de ligação específico de uma sequência de aminoácidos. As inserções poderão ser localizadas em um ou ambos os terminais da proteína, ou pode ser posicionado dentro das regiões internas do agente de ligação específico da sequência de aminoácidos. As variantes de inserção com resíduos adicionais em um ou ambos os terminais podem incluir, por exemplo, proteínas de fusão e proteínas, incluindo identificações de aminoácidos ou marcas. As variantes de inserção incluem agentes de ligação específicos de polipeptídios onde um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados a um agente de ligação específico de uma sequência de aminoácidos, ou seus fragmentos.

Os produtos variantes da invenção incluem também produtos de agente de ligação específicos maduro. Tais produtos dos agentes de ligação específicos possuem o líder ou sequências de sinais removidos, no entanto, a proteína resultante tem outros resíduos amino terminal em relação ao tipo selvagem polipeptídeo Ang-2. Os resíduos amino terminal adicionais podem ser derivados de outra proteína, ou podem incluir um ou mais resíduos que não são identificáveis como sendo derivados de uma proteína específica. Os produtos dos agentes de ligação específicos com um resíduo de metionina adicional na posição -1 (Met-1- agente de ligação específico) são contemplados, assim como os produtos do agente de ligação específico com metionina adicional e resíduos de lisina nas posições -2 e -1 (Met-2- Lys-1- agente de ligação específico). As variantes dos agentes de ligação específicos que possuem os resíduos adicionais Met, Met-Lys, Lys (ou um ou mais resíduos de base em geral) são particularmente úteis para a produção de proteínas recombinantes nas células hospedeiras bacteriana.

A invenção também engloba as variantes dos agentes de ligação específicos que possuem resíduos de aminoácidos adicionais que surgem a partir da utilização de sistemas de expressão específicos. Por exemplo, o uso de vetores disponíveis comercialmente que expressam um polipeptídio desejado como parte do produto de fusão do glutationa S- transferase (GST) fornece polipeptídeo desejado com um resíduo de glicina adicional na posição do aminoácido -1 após a clivagem do componente GST do polipeptídio desejado. Variantes que resultam da expressão de outros sistemas de vetores são também contemplados, incluindo aqueles em que as identificações de poli-histidina são incorporadas a sequência de aminoácidos, geralmente, a carboxi e/ou amino terminal da sequência.

Variantes de inserção também incluem proteínas de fusão, como descrito acima, onde o amino e/ou carboxi terminal do agente de ligação específico do polipeptídeo é fundido a outro polipeptídeo, a seus fragmento, ou sequências de aminoácidos que não são geralmente identificados como parte de uma sequência de proteína especifica.

Em outro aspecto, a invenção fornece variantes de deleção em que um ou mais resíduos de aminoácidos em um agente de ligação específico do polipeptídio são removidos. As exclusões podem ser efetuadas em um ou ambos os terminais dos agentes de ligação específicos do polipeptídio, ou de remoção de um ou mais resíduos junto do agente de ligação específico da sequência de aminoácidos. As variantes de deleção incluem necessariamente todos os fragmentos de um agente de ligação específico do polipeptídio.

Os fragmentos de anticorpos incluem aquelas porções do anticorpo que se ligam a um epítopo do antígeno polipeptídeo. Exemplos de tais fragmentos incluem fragmentos gerados Fab e F(ab')2, por exemplo, por clivagem enzimática ou química dos anticorpos de comprimento total. Outros fragmentos de ligação incluem aqueles gerados por técnicas de DNA recombinante, tal como a expressão de plasmídeos recombinantes contendo sequências de ácidos nucleicos codificando as regiões variáveis dos anticorpos. A invenção também abrange fragmentos de polipeptídios de agentes de ligação Ang-2 onde os fragmentos mantêm a capacidade de ligar especificamente um polipeptídeo Ang-2.

Os fragmentos compreendem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 ou mais aminoácidos consecutivos de um peptídeo ou polipeptídios da invenção são compreendidos aqui. Os fragmentos de polipeptídios preferidos para exibir propriedades imunológicas únicas ou específicas para o agente de ligação de antígenos assim da invenção. Os fragmentos da invenção com as propriedades imunológica desejadas podem ser preparados por quaisquer dos métodos conhecidos e rotineiramente praticados na técnica.

Ainda em outro aspecto, a invenção fornece variantes de substituição de certos agentes de ligação da invenção. As variantes de substituição são geralmente consideradas como "similar" ao polipeptídeo original ou possuem certo “percentual de identidade” com o polipeptídeo original, e incluem os polipeptídios nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos de um polipeptídio são removidos e substituídos com resíduos de alternativos. Em um aspecto, as substituições são conservadoras por natureza, porém, a invenção abrange substituições que também não são conservadoras.

Identidade e semelhança dos polipeptídios relacionados podem ser facilmente calculados por métodos conhecidos. Tais métodos incluem, entre outros, aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing:

Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); and Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).

Os métodos preferidos para determinar o parentesco ou percentual de identidade de dois polipeptídios são projetados para fornecer maior equilíbrio entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade são descritos em programas de computador disponíveis publicamente. Os métodos de programas de computador preferidos para determinar a identidade entre duas sequências incluem, entre outros, o pacote de programas GCG, incluindo GAP (Devereux et al. Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). The BLASTX program is publicly available from the National Center for

Biotechnology Information (NCBI) and other sources (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., supra (1990)). O conhecido algoritmo de Smith-Waterman também pode ser usado para determinar a identidade.

Alguns esquemas de alinhamento para alinhar duas sequências de aminoácidos podem resultar na correspondência de apenas uma pequena região das duas sequências, e esta pequena região alinhada pode ter uma sequência muito alta de identidade, embora não exista uma relação significativa entre as duas sequências completas. Assim, em certas modalidades, o método de alinhamento selecionado (programa GAP) resultará em um alinhamento que se estende por pelo menos dez por cento do comprimento total do polipeptídeo alvo a ser comparado, ou seja, pelo menos 40 aminoácidos contíguos, onde sequências de pelo menos 400 aminoácidos estão sendo comparados, 30 aminoácidos contíguos, onde sequências de pelo menos 300 para cerca de 400 aminoácidos estão sendo comparados, pelo menos 20 aminoácidos contíguos, onde sequências de 200 a cerca de 300 aminoácidos são comparados, sendo pelo menos 10 aminoácidos contíguos, onde sequências de cerca de 100 a 200 aminoácidos são comparados.

Por exemplo, usando o algoritmo computacional GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin), dois polipeptídios para o qual o percentual de identidade de sequência a ser determinado estão alinhados para pareamento ótimo de seus respectivos aminoácidos (o “período pareado" , conforme determinado pelo algoritmo). Em algumas modalidades, a penalidade de abertura de intervalo (que é normalmente calculado como 3 x a diagonal média; a "diagonal média" é a média da diagonal da matriz de comparação que está sendo utilizada; a "diagonal" é a contagem ou o número atribuído a cada pareamento perfeito de aminoácidos através da matriz de comparação particular) e uma penalidade de prolongamento de intervalo (que é geralmente 1/10 vezes a penalidade de abertura de intervalo), bem como uma matriz de comparação, tais como PAM 250 ou BLOSUM 62 são usadas em conjunto com o algoritmo. Em algumas modalidades, uma matriz de comparação padrão (veja Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978) para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) para a matriz de comparação BLOSUM 62) também é usada pelo algoritmo.

Em certas modalidades, os parâmetros para uma comparação da sequência de polipeptídios incluem o seguinte: Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970); Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et al., supra (1992); Penalidade de intervalo: 12 Penalidade de extensão de intervalo: 4 Limite de similaridade: 0

O programa GAP pode ser útil com os parâmetros acima. Em certas modalidades, os parâmetros acima referidos são os parâmetros padrão para comparações de polipeptídio (juntamente com nenhuma penalidade para intervalos terminais) utilizando o algoritmo GAP.

Em certas modalidades, os parâmetros para uma comparação da sequência de moléculas de polipeptídios incluem o seguinte: Algoritmo: Needleman et al., supra (1970); Matriz de comparação: pareamento = +10, despareamento = 0 Penalidade de intervalo: 50 Penalidade de extensão de intervalo: 3

O programa GAP pode também ser útil com os parâmetros acima. Os parâmetros acima são os parâmetros padrão para comparações de molécula polinucleotídica.

Outros exemplos de algoritmos, penalidade de abertura de intervalo, penalidade de prolongamento de intervalo, matrizes de comparação, limites de similaridade, etc podem ser utilizados, inclusive aqueles previstos no Manual do Programa, Wisconsin Package, Version 9, September, 1997. As escolhas particulares a serem feitas serão evidente para aqueles versados na técnica e dependerá da comparação específica a ser feita, como o DNA a DNA, a proteína a proteína, proteína a DNA; e, adicionalmente, se a comparação é entre pares de sequências (neste caso, GAP ou BestFit são geralmente os preferenciais), ou entre uma sequência e um grande banco de dados de sequências (neste caso, FASTA ou BLASTA são preferíveis).

Como aqui utilizado, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviaturas seguem o uso convencional. Veja Immunology--A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. 1991)), o qual é incorporado aqui por referência para todos os fins.

Os aminoácidos podem ter uma estereoquímica L ou D (exceto para Gly, que não é nem L, nem D) e os polipeptídios e composições da presente invenção podem incluir uma combinação de estereoquímicas. No entanto, a estereoquímica L é preferida. A invenção também fornece moléculas reversas onde o amino terminal a sequência carboxi terminal dos aminoácidos é invertida. Por exemplo, o reverso de uma molécula possuindo uma sequência normal X1-X2-X3 seria X3-X2-X1. A invenção também fornece moléculas de retro-reverso onde, como acima, o amino terminal para sequência carboxi terminal dos aminoácidos é invertida e os resíduos que são normalmente enantiômeros "L" são alterados para a forma de estereoisômero "D".

Os estereoisômeros (ou seja, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, os aminoácidos não naturais, tais como a-, a-aminoácidos dissubstituídos, N-aminoácidos alquil, ácido lático, e outros aminoácidos não convencionais também podem ser componentes adequados para os polipeptídios da presente invenção. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem, dentre outros: ácido aminoadípico, beta-alanina, ácido beta-aminopropiônico, ácido aminobutírico, ácido piperidínico, ácido aminocaprioico, ácido aminoeptanoico, ácido aminoisobutírico, ácido aminopimélico, ácido diaminobutírico, desmosina, ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiônico, N-etilglicina, N-etilaspargina, hiroxilisina, alo-hidroxilisina, hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, sarcosina, N- metilisoleucina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, oritina, 4-hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, εN,N,N- trimetilisina, ε-N-acetilisina, O -fosfoserina, N- acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5- hidroxilisina, α-N-metilarginina, e outros aminoácidos semelhantes e aminoácidos (ou seja, 4-hidroxiprolina).

Do mesmo modo, salvo indicação em contrário, a extremidade esquerda de sequências polinucleotídicas de fita simples é a extremidade 5’, a direção esquerda de sequências polinucleotídicas de dupla fita é conhecida como a direção 5’. A direção de 5' para 3' de adição de transcritos de RNA nascente é referida como a direção de transcrição; regiões de sequência na fita de DNA possuindo a mesma sequência do RNA e que estão a 5' da extremidade 5' do transcrito de RNA são chamados como ”sequências a jusante”; regiões de sequência na fita de DNA possuindo a mesma sequência do RNA e que estão a 3' da extremidade 3' do transcrito de RNA são chamados de ”sequências a montante“.

Substituições conservativas de aminoácidos podem englobar resíduos de aminoácidos ocorridos não naturalmente, que são normalmente incorporados por síntese química de peptídeos, em vez de síntese em sistemas biológicos. Isto inclui peptidomiméticos e outras formas revertidas ou invertidas de frações de aminoácidos.

Resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base nas propriedades da cadeia lateral comum: 1) hidrofóbicos: Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) acídos: Asp, Glu; 4) básicos: His, Lys, Arg; 5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro e 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Por exemplo, as substituições não conservativas podem envolver a troca de um elemento de uma dessas classes para um elemento de outra classe. Esses resíduos substituídos podem ser introduzidos em regiões do anticorpo humano, que são homólogos aos anticorpos não humanos, ou nas regiões não homólogas da molécula.

Ao fazer essas alterações, de acordo com certas modalidades, o índice hidropático dos aminoácidos pode ser considerado. Cada aminoácido tem sido atribuído um índice hidropático com base em suas características de hidrofobicidade e carga. Eles são: isoleucina (+4,5), valina (+4,2), leucina (+3,8), fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5), metionina (+1,9); alanina (+1,8), glicina (-0,4); treonina (-0,7), serina (-0,8), triptofano (-0,9), tirosina (-1,3), prolina (-1,6), histidina (-3,2), glutamato (-3,5), glutamina (-3,5), aspartato (-3,5); asparagina (-3,5), lisina (-3,9) e arginina (-4,5).

A importância do índice hidropático do aminoácido em conferir a função biológica interativa em uma proteína é entendida na técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105131 (1982). É sabido que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que têm uma pontuação ou índice hidropático semelhante e ainda mantêm uma atividade biológica similar.

Ao fazer alterações baseadas no índice hidropático, em certas modalidades, é incluída a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ± 2.

Em certas modalidades, aquelas que estão dentro de ± 1, são incluídas, e em certas modalidades, aquelas dentro de ± 0,5 são incluídas.

Entende-se igualmente na técnica que, a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita de forma eficaz com base na hidrofilicidade, particularmente quando a proteína ou peptídeo biologicamente funcional assim criado é destinado para uso em modalidades imunológicas, como no caso em apreço. Em certas modalidades, a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, conforme regido pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com sua imunogenicidade e antigenicidade, isto é, com uma propriedade biológica da proteína.

Os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos a estes resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0), lisina (+3,0), aspartato (+3,0 ± 1), glutamato (+3,0 ± 1), serina (+0,3); asparagina (+0,2), glutamina (+0,2), glicina (0) ; treonina (-0,4), prolina (-0,5 ± 1), alanina (-0,5), histidina (-0,5), cisteína (-1,0), metionina (-1,3), valina (-1,5), leucina (-1,8), isoleucina (-1,8), tirosina (-2,3), fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4). Ao fazer alterações com base em valores de hidrofilicidade semelhante, em certas modalidades, a substituição de aminoácidos, cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ± 2 está incluída, em certas modalidades, aquelas que estão dentro de ± 1, estão incluídas, e em certas modalidades, aquelas dentro de ± 0,5 estão incluídas. Pode-se também identificar epítopos de sequências primárias de aminoácidos com base na hidrofilicidade. Essas regiões também são referidas como “regiões de cerne de epítopo”. Substituições de aminoácidos exemplares são expostas na Tabela 1. Tabela 1.

Um técnico versado será capaz de determinar variantes adequadas do polipeptídeo como aqui exposto usando técnicas bem conhecidas. Em certas modalidades, alguém versado na técnica pode identificar áreas adequadas da molécula que podem ser alteradas sem destruir a atividade, visando regiões que não se acredita serem importantes para a atividade. Em certas modalidades, é possível identificar resíduos e porções das moléculas que são conservadas entre polipeptídios similares. Em certas modalidades, mesmo áreas que podem ser importantes para a atividade biológica ou para a estrutura pode estar sujeitas substituições conservativas de aminoácidos sem destruir a atividade biológica ou sem afetar adversamente a estrutura polipeptídica.

Adicionalmente, alguém versado na técnica pode rever estudos de estrutura-função identificando resíduos em polipeptídeos similares que são importantes para a atividade ou estrutura. Perante tal comparação, pode-se prever a importância dos resíduos de aminoácidos em uma proteína que correspondem a resíduos de aminoácidos que são importantes para a atividade ou estrutura em proteínas similares. Alguém versado na técnica pode optar por substituições de aminoácidos quimicamente similares para tais resíduos de aminoácidos previstos como importantes.

Alguém versado na técnica também pode analisar a estrutura tridimensional e sequência de aminoácidos em relação àquela estrutura em polipeptídeos similares. Em vista dessas informações, alguém versado na técnica pode predizer o alinhamento dos resíduos de aminoácidos de um anticorpo em relação à sua estrutura tridimensional. Em certas modalidades, alguém versado na técnica pode escolher por não fazer alterações radicais em resíduos de aminoácidos previstos para estarem na superfície da proteína, uma vez que tais resíduos podem estar envolvidos em interações importantes com outras moléculas. Além disso, alguém versado na técnica pode gerar variantes teste contendo uma única substituição de aminoácido em cada resíduo de aminoácido desejado. As variantes podem ser triadas usando ensaios de atividade conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais variações poderiam ser usadas para coletar informações sobre variantes adequadas. Por exemplo, se foi descoberto que uma alteração em um resíduo de aminoácido particular resultou em atividade destruída, indesejavelmente reduzida ou imprópria, variantes com tal alteração podem ser evitadas. Em outras palavras, com base nas informações recolhidas a partir de tais experimentos de rotina, alguém versado na técnica pode prontamente determinar os aminoácidos onde substituições adicionais devem ser evitadas isoladamente ou em combinação com outras mutações.

Várias publicações científicas foram dedicadas à predição de estrutura secundária. Veja Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 e Chou et al. Biophys. J., 26:367-384 (1979). Além disso, programas de computador estão atualmente disponíveis para ajudar com a predição de estrutura secundária. Um método de predição de estrutura secundária é baseado em modelagem por homologia. Por exemplo, dois polipeptídeos ou proteínas que têm uma identidade de sequência maior que 30%, ou similaridade maior que 40% têm frequentemente topologias estruturais similares. O crescimento recente do banco de dados estrutural de proteína (PDB) proporcionou melhor previsibilidade da estrutura secundária, incluindo o número potencial de dobras dentro de uma estrutura de polipeptídeo ou de proteína. Veja Holm et al. Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Foi sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)) que há um número limitado de dobras em um dado polipeptídeo ou protein e que uma vez que um número crítico de estruturas tenha sido resolvido, a predição estrutural se tornará dramaticamente mais acurada.

Métodos adicionais de predição de estrutura secundária incluem "reconhecimento de enovelamento" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1):15-19 (1996)), "análise de perfil" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84 (13):4355-4358 (1987)) e "ligação evolucionária" (Veja Holm, supra (1999) e Brenner, supra (1997)).

Em certas modalidades, variantes de anticorpos incluem variantes de glicosilação em que o número e/ou tipo de sítio de glicosilação foi alterado em comparação com as sequências de aminoácidos do polipeptídeo parental. Em certas modalidades, variantes de proteicas compreendem um número de sítios de N-glicosilação maior ou menor que o da proteína nativa. Um sítio de N-glicosilação é caracterizado pela sequência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, onde o resíduo de aminoácido designado como X pode ser qualquer resíduo de aminoácido, exceto prolina. A substituição de resíduos de aminoácidos para criar esta sequência provê um potencial sítio novo para a adição de uma cadeia de carboidratos N-ligados. Senão, as substituições que eliminam essa sequência removerão uma cadeia de carboidratos N-ligados existente. Também é provido um rearranjo de cadeias de carboidratos N-ligados em que um ou mais sítios de N-glicosilação (tipicamente aqueles que ocorrem naturalmente) são eliminados e um ou mais novos sítios de N-glicosilação são criados. Variantes de anticorpos preferidas adicionais incluem variantes de cisteína em que um ou mais resíduos de cisteína são excluídos ou substituídos por outro aminoácido (por exemplo, serina) em comparação com a sequência de aminoácidos parental. Variantes de cisteína podem ser úteis quando anticorpos devam ser reenovelados em uma conformação biologicamente ativa, tal como após o isolamento de corpos de inclusão insolúveis. Variantes de cisteína geralmente têm menos resíduos de cisteína que a proteína nativa e tipicamente têm um número par para minimizar interações resultantes de cisteínas não pareadas.

De acordo com certas modalidades, substituições de aminoácidos são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para a formação de complexos proteicos, (4) alteram afinidades de ligação e/ou (5) conferem ou modificam outras propriedades funcionais em tais polipeptídeos. De acordo com certas modalidades, substituições de aminoácidos simples ou múltiplas (em certas modalidades, substituições de aminoácidos conservativas) podem ser feitas na sequência de ocorrência natural (em certas modalidades, na porção do polipeptídeo fora do(s) domínio(s) que faz contatos intermoleculares). Em certas modalidades, uma substituição conservativa de aminoácido tipicamente não pode alterar consideravelmente as características estruturais da sequência parental (p. ex., uma substituição de aminoácido não deve tender a quebrar uma hélice que ocorre na sequência parental, ou perturbar os outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a sequência parental). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeo reconhecidas na técnica são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nova Iorque (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nova Iorque, N.Y. (1991)); and Thornton et al., Nature 354:105 (1991).

As moléculas de agente de ligação específico desta invenção que são variantes de substituição de polipeptídeo ou peptídeo podem ter até cerca de 10-12 por cento da sequência de amino ácidos original substituída. Para variantes de anticorpo, a cadeia pesada pode ter 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 aminoácido substituído, enquanto a cadeia leve pode ter 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 aminoácido substituído. Derivados de Agentes de Ligação Específicos

A invenção também provê derivados de polipeptídeos de agente de ligação específico. Os derivados incluem polipeptídeos de agente de ligação específicos que portam modificações fora inserção, deleção ou substituição de resíduos de aminoácidos. De preferência, as modificações são de natureza covalente e incluem, por exemplo, ligações químicas com polímeros, lipídios, outras frações orgânicas e inorgânicas. Derivados da invenção podem ser preparados para aumentar a meia-vida de circulação de um polipeptídeo de agente de ligação específico, ou podem ser projetados para melhorar a capacidade de direcionamento do polipeptídeo às células, tecidos ou órgãos desejados.

A invenção abrange adicionalmente agentes de ligação derivados modificados covalentemente para incluir um ou mais adesões de polímeros hidrossolúveis, tais como polietileno glicol, polioxietileno glicol, ou polipropileno glicol conforme descrito na Patente U.S. Nos.: 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 e 4.179.337. Ainda outros polímeros úteis conhecidos na técnica incluem monometóxi-polietileno glicol, dextrano, celulose, ou outros polímeros baseados em carboidratos, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, um co-polímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (p. ex., glicerol) e álcool polivinílico, assim como misturas destes polímeros. Particularmente preferidos são produtos de agente de ligação específico modificados covalentemente com subunidades de polietileno glicol (PEG). Polímeros hidrossolúveis podem ser ligados em posições específicas, por exemplo, na extremidade amino-terminal de produtos de agente de ligação específico, ou aleatoriamente aderidos a uma ou mais cadeias laterais do polipeptídeo. O uso de PEG para melhorar a capacidade terapêutica de agente de ligação específico e de anticorpos humanizados em particular, é descrito na U.S. Patente 6.133. 426 de Gonzales et al., publicada em 17 de outubro de 2000. Sítios Alvo para Mutagênese de Anticorpo

Certas estratégias podem ser empregadas para manipular propriedades inerentes a um anticorpo específico para Ang-1 e/ou Ang-2, tal como a afinidade do anticorpo por seu alvo. Essas estratégias incluem o uso de mutagênese sítio- specífica ou aleatória da molécula de polinucleotídeo que codifica o anticorpo, para gerar variantes de anticorpo, seguidas por uma etapa de triagem designada para recuperar variantes de anticorpo que exibem a alteração desejada, p. ex., aumento ou diminuição de afinidade.

Os resíduos de aminoácidos mais comumente alvejados por estratégias mutagênicas são aqueles nas CDRs. Conforme descrito supra, essas regiões contêm os resíduos que realmente interagem com Ang-1 e/ou Ang-2 e outros aminoácidos que afetam o arranjo espacial desses resíduos. No entanto, aminoácidos nas regiões estruturais dos domínios variáveis fora das regiões CDR também foram mostrados como contribuindo consideravelmente para as propriedades de ligação ao antígeno do anticorpo, e podem ser alvos para a manipulação dessas propriedades. Veja Hudson, Curr Opin Biotech, 9:395-402 (1999) e referências neste.

Bibliotecas de variantes de anticorpo menores e mais eficazmente triadas podem ser produzidas, restringindo a mutagênese aleatória ou sítio-dirigida aos sítios nas CDRs que correspondem a áreas propensas a “hipermutação” durante o processo somático de maturação de afinidade. Veja Chowdhury e Pastan, Nature Biotech, 17: 568-572 [1999] e referências neste. Os tipos de elementos de DNA conhecidos por definir sítios de hipermutação desta forma incluem repetições diretas e invertidas, certas sequências consenso, estruturas secundárias e palíndromos. As sequências de DNA consenso incluem a sequência tetrabase Purina-G-Pirimidina-A/T (isto é, A ou G - G - C ou T - A ou T) e o códon de serina AGY (onde Y pode ser um C ou um T).

Assim, uma modalidade da presente invenção inclui estratégias mutagênicas com o objetivo de aumentar a afinidade de um anticorpo por seu alvo. Essas estratégias incluem a mutagênese da cadeia leve e pesada variável inteira, mutagênese apenas das regiões CDR, mutagênese dos sítios de hipermutação de consenso dentro das CDRs, mutagênese de regiões estruturais, ou qualquer combinação destas abordagens (“mutagênese” neste contexto pode ser aleatória ou sítio-dirigida). A delimitação definitiva das regiões CDR e identificação dos resíduos que compreendem o sítio de ligação de um anticorpo podem ser conseguidas pela solução da estrutura do anticorpo em questão, e do complexo ligante-anticorpo, através de técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica, tal como cristalografia de raios-X. Vários métodos baseados na análise e caracterização de tais estruturas cristalinas de anticorpo são conhecidos por aqueles versados na técnica e podem ser empregados, embora não definitivos, para aproximar as regiões CDR. Exemplos de tais métodos comumente utilizados incluem as definições de Kabat, Chothia, AbM e de contato.

A definição de Kabat baseia-se na variabilidade de sequência e é a definição mais comumente utilizada para predizer regiões CDR. [Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 28: 214-8 (2000)]. A definição de Chothia baseia-se na localização das regiões de alças estruturais. [Chothia et al., J Biol Mol, 196: 901-17 (1986); Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989)]. A definição de AbM é um acerto entre a definição de Kabat e a de Chothia. AbM é um conjunto integrado de programas para modelagem de estrutura de anticorpos produzido pelo Grupo Molecular de Oxford [Martin et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 86:9268-9272 (1989), Rees, et al., ABMTM, um programa de computador para modelagem de regiões variáveis de anticorpos, Oxford, Reino Unido; Oxford Molecular, Ltd.]. O conjunto AbM modela a estrutura terciária de um anticorpo a partir do sequenciamento primário, utilizando uma combinação de bases de dados de conhecimento e os métodos ab initio. Uma definição adicional, conhecida como a definição de contato, foi introduzida recentemente. [MacCallum et al., J Mol Biol, 5:732-45 (1996)]. Esta definição é baseada em uma análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis.

Por convenção, as regiões CDR da cadeia pesada são tipicamente referidas como H1, H2 e H3 e são numeradas sequencialmente em ordem de contagem da extremidade amino-terminal para carbóxi-terminal. As regiões CDR da cadeia leve são tipicamente referidas como L1, L2 e L3 e são numeradas sequencialmente em ordem de contagem da extremidade amino-terminal para carbóxi-terminal.

A CDR-H1 tem aproximadamente 10-12 resíduos de comprimento e tipicamente começa 4 resíduos após uma Cys de acordo com as definições de Chothia e AbM ou tipicamente 5 resíduos posteriores de acordo com a definição de Kabat. A H1 é geralmente seguida por um Trp, tipicamente Trp-Val, mas também Trp-Ile, ou Trp-Ala. O comprimento de H1 é de aproximadamente 10-12 resíduos de acordo com a definição de AbM, enquanto a definição de Chothia exclui os últimos 4 resíduos.

A CDR-H2 começa tipicamente 15 resíduos após o final de H1 de acordo com a definição de Kabat e AbM. Os resíduos anteriorres a H2 são tipicamente Leu-Glu-Trp-Ile- Gly, mas há inúmeras variações. H2 é tipicamente seguida pela sequência de aminoácidos Lys/Arg- Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala. De acordo com a definição de Kabat, o comprimento de H2 é de aproximadamente 16-19 resíduos, em que a definição de AbM prediz que o comprimento tipicamente é de 9-12 resíduos.

A CDR H3 começa tipicamente 33 resíduos após o final de H2 e é tipicamente precedida pela sequência de aminoácidos (tipicamente Cys-Ala-Arg). O H3 é tipicamente seguido pela sequência de aminoácidos-Gly. O comprimento de H3 pode ser qualquer um entre 3-25 resíduos.

A CDR-L1 tipicamente começa aproximadamente no resíduo 24 e tipicamente virá após uma Cys. O resíduo após a CDR- L1 é sempre um Trp e tipicamente iniciará a sequência Trp- Tyr-Gln, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, ou Trp-Tyr-Leu. O comprimento de CDR-L1 é de aproximadamente 10-17 resíduos. A CDR-L1 punitiva para os anticorpos da invenção segue esse padrão exatamente com um resíduo de Cys seguido por 15 aminoácidos, em seguida, Trp-Tyr-Gln.

A CDR-L2 começa aproximadamente 16 resíduos após o fim da L1. Geralmente, virá após os resíduos Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys ou Ile-Phe. O comprimento de CDR-L2 é de aproximadamente 7 resíduos.

A CDR-L3 começa tipicamente 33 resíduos após o final da L2 e tipicamente vem depois de uma Cys. A L3 é tipicamente seguida pela sequência de aminoácidos Phe-Gly- XXX-Gly. O comprimento de L3 é de aproximadamente 7-11 resíduos.

Vários métodos para modificar anticorpos foram descritos na técnica. Por exemplo, Patente U.S. 5.530.101 (de Queen et al., de 25 de junho de 1996) descreve métodos para produzir anticorpos humanizados onde a sequência da estrutura de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina possui 65% a 95% de identidade com a sequência da estrutura de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina doadora. Cada cadeia de imunoglobulina humanizada geralmente incluirá, além das CDRs, aminoácidos do arcabouço da imunoglobulina doadora que são, p. ex., capazes de interagir com as CDRs para afetar afinidade de ligação, tal como um ou mais aminoácidos, que são imediatamente adjacentes a uma CDR na imunoglobulina doadora ou aqueles dentro de cerca de 3 angstroms conforme predito pela modelagem molecular. As cadeias pesadas e leves podem ser, cada uma, concebidas pelo uso de qualquer um ou de todos dentre vários critérios de posição. Quando combinados em um anticorpo intacto, as imunoglobulinas humanizadas da presente invenção serão consideravelmente não imunogênicas em humanos e reterão consideravelmente a mesma afinidade da imunoglobulina doadora pelo antígeno, tal como uma proteína ou outro composto contendo um epítopo. Veja também, métodos relacionados em Patente U. S. 5.693.761 de Queen, et al., publicada em 02 dezembro de 1997 (“Polynucleotides encoding improved humanized immunoglobulins”); Patente U.S. 5.693.761 de Queen, et al., publicada em 02 dezembro de 1997 (“Humanized Immunoglobulins”); Patente U.S. 5.585.089 de Queen, et al., publicada em 17 dezembro de 1996 (“Humanized Immunoglobulins”).

Em um exemplo, Patente U.S. 5.565.332 de Hoogenboom et al. publicada em 15 outubro de 1996 (“Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach”) descreve métodos para a produção de anticorpos, e fragmentos de anticorpo que têm especificidade de ligação similar como um anticorpo parental, mas que têm características humanas aumentadas. Anticorpos humanizados são obtidos por rearranjo de cadeia, utilizando, por exemplo, tecnologia de phage display, e um polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve ou pesada de um anticorpo não humano específico para um antígeno de interesse é combinado com um repertório de domínios variáveis de cadeia complementar (leve ou pesada) humana. Pareamentos híbridos que são específicos para o antígeno de interesse são identificados e cadeias humanas dos pareamentos seleccionados são combinadas com um repertório de domínios (pesado ou leve) variáveis complementares humanos. Em outra modalidade, um componente de uma CDR de um anticorpo não humano é combinado com um repertório de partes de componente de CDRs de anticorpos humanos. A partir da biblioteca resultante de dímeros polipeptídicos de anticorpo, híbridos são selecionados e usados em uma segunda etapa de rearranjo para humanização. Senão, esta segunda etapa é eliminada se o híbrido já tiver características humanas suficientes para ser de valor terapêutico. Métodos de modificação para aumentar o caráter humano também são descritos. Veja também Winter, FEBS Letts 430:92-92 (1998).

Como outro exemplo, a Patente U. S. 6.054.297 de Carter et al. publicada em 25 de abril de 2000 descreve um método para produzir anticorpos humanizados substituindo uma sequência de aminoácidos de CDR humana correspondente pela sequência de aminoácidos de CDR e/ou substituindo sequências de aminoácidos de FR humana correspondente por uma sequência de aminoácidos FR.

Como outro exemplo, Patente U. S. 5.766.886 de Studnicka et al. publicada em 16 de junho de 1998 (“Modified antibody variable domains”) descreve métodos para identificar os resíduos de aminoácidos de um domínio variável de anticorpo que pode ser modificado sem diminuir a afinidade nativa do domínio de ligação antigênica enquanto reduz sua imunogenicidade em relação a uma espécie heteróloga e métodos para preparar estes domínios variáveis de anticorpos modificados que são úteis para a administração às espécies heterólogas. Veja também Patente U.S. 5.869.619 de Studnicka publicada em 09 de fevereiro de 1999.

Conforme discutido, a modificação de um anticorpo, por quaisquer dos métodos conhecidos na técnica é tipicamente concebida para obter uma maior afinidade de ligação por um antígeno e/ou reduzir a imunogenicidade do anticorpo naquele que o recebe. Em uma abordagem, anticorpos humanizados podem ser modificados para eliminar sítios de glicosilação, a fim de aumentar a afinidade do anticorpo por seu antígeno cognato [Co et al. Mol Immunol 30:13611367] (1993)]. Técnicas tais como a “remodelamento”, “hiperquimera” e “revestimento/recobertura” produziram anticorpos humanizados, com maior potencial terapêutico. [Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma & Immunol 81:105 (1998); Roguska et al., Prot Engineer 9:895-904 (1996)].

Veja também Patente U.S. 6.072.035 de Hardman et al., publicada em 6 de junho de 2000, que descreve métodos para a remodelação de anticorpos. Embora essas técnicas diminuiam a imunogenicidade de anticorpos pela redução do número de resíduos estranhos, elas não previnem respostas anti-idiotípicas e antialotípicas após a administração repetida dos anticorpos. Alternativas a esses métodos para reduzir a imunogenicidade são descritas em Gilliland et al. J Immunol 62 (6): 3663-71 (1999).

Em muitos casos, a humanização de anticorpos resulta na perda de capacidade de ligação ao antígeno. Por conseguinte, é preferível “alterar de novo” o anticorpo humanizado para incluir um ou mais dos resíduos de aminoácidos encontrados no anticorpo original (na maioria das vezes de roedor) em uma tentativa para restaurar a afinidade de ligação do anticorpo. Veja, por exemplo, Saldanha et al., Mol Immunol 36:709-19 (1999). Miméticos de Proteína/Análogos de Agente de Ligação Específico Não Peptídico

Além disso, análogos de agente de ligação específico não peptídico de peptídeos que provêm uma estrutura estabilizada ou degradação biológica diminuída, também são contemplados. Análogos de miméticos peptídicos de agente de ligação específico podem ser preparados com base em um peptídeo inibidor selecionado pela substituição de um ou mais resíduos por frações peptídicas. Preferencialmente, as frações não peptídicas permitem que o peptídeo retenha sua conformação natural, ou estabilize uma conformação preferida, por exemplo, bioativa, que retém a habilidade de reconhecer e se ligar a Ang-1 e/ou Ang-2. Em um aspecto, o análogo/mimético resultante exibe maior afinidade de ligação a Ang-1 e/ou Ang-2. Um exemplo de métodos para a preparação de análogos miméticos não peptídicos de peptídeos de agente de ligação específico é descrito em Nachman et al., Regul Pept 57:359-370 (1995). Se desejado, os peptídeos de agente de ligação específico da invenção podem ser modificados, por exemplo, por glicosilação, amidação, carboxilação ou fosforilação, ou pela criação de sais de adição ácida, amidas, ésteres, em especial ésteres C-terminais e derivados de N-acila dos peptídeos da invenção. Os peptídeos de agente de ligação específico também podem ser modificados para criar derivados peptídicos, formando complexos covalentes ou não covalentes com outras frações. Complexos ligados covalentemente podem ser preparados pela ligação das frações químicas aos grupos funcionais nas cadeias laterais de aminoácidos que compreendem peptídeos de agente de ligação específico, ou na extremidade N-ou C-terminal.

Em particular, antecipa-se queos peptídeos de agente de ligação específico podem ser conjugados com um grupo repórter, incluindo, mas não limitando a um radiomarcador, um marcador fluorescente, uma enzima (p. ex., que catalisa uma reação colorimétrica ou fluorimétrica), um substrato, uma matriz sólida, ou um transportador (p. ex., biotina ou avidina). A invenção, portanto fornece uma molécula que compreende uma molécula de anticorpo, em que a molécula de preferência compreende ainda um grupo repórter selecionado do grupo que consiste em um radiomarcador, um marcador fluorescente, uma enzima, um substrato, uma matriz sólida, e um transportador. Tais marcadores são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, p. ex., marcadores de biotina são particularmente contemplados. O uso de tais marcadores é bem conhecido por aqueles versados na técnica e é descrito em, p. ex., Patente U.S. No. 3.817.837; Patente U.S. No. 3.850.752; Patente U.S. No. 3.996.345 e Patente U.S. No. 4.277.437. Outros marcadores que serão úteis incluem, mas não estão limitados a marcadores radioativos, marcadores fluorescentes e marcadores quimioluminescentes. U.S. Patentes sobre uso de tais marcadores incluem, por exemplo, Patente U.S. No. 3.817.837; Patente U.S. No. 3.850.752; Patente U.S. No. 3.939.350 e Patente U.S. No. 3.996.345. Qualquer um dos peptídeos da presente invenção pode compreender um, dois, ou mais de quaisquer desses marcadores. Métodos para Fazer Agentes de Ligação Específicos

Agentes de ligação específicos da presente invenção que são proteínas podem ser preparados por síntese química em solução ou em um suporte sólido de acordo com técnicas convencionais. O limite atual para a síntese em fase sólida é de cerca de 85-100 aminoácidos de comprimento. No entanto, as técnicas de síntese química, podem frequentemente ser usadas para ligar quimicamente uma série de peptídeos menores para gerar polipeptídeos completos. Vários sintetizadores automáticos estão disponíveis comercialmente e podem ser utilizados de acordo com protocolos conhecidos. Veja, por exemplo, Stewart e Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co., (1984); Tam et al., J Am Chem Soc, 105:6442, (1983); Merrifield, Science, 232:341-347, (1986); e Barany e Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284; Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739 (1987); e U.S. Pat. No. 5.424.398), cada um aqui incorporado como referência.

Métodos de síntese peptídica em fase sólida usam um copoli(estireno-divinilbenzeno) contendo 0,1-1,0 mM de aminas/g de polímero. Estes métodos para síntese peptídica usam proteção por butiloxicarbonil (t-BOC) ou 9- fluorenilmetiloxi-carbonila (FMOC) dos grupos alfa-amino. Ambos os métodos envolvem sínteses graduais pelas quais um único aminoácido é adicionado em cada etapa começando pela extremidade C-terminal do peptídeo (Veja, Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unidade 9). Após a conclusão da síntese química, o peptídeo sintético pode ser desprotegido para remover os grupos de bloqueio de aminoácidos t-BOC ou Fmoc e clivado do polímero por tratamento com ácido em temperatura reduzida (p. ex., HF líquido- anisol 10% para cerca de 0,25 a cerca de 1 hora a 0°C). Após a evaporação dos reagentes, os peptídeos de agente de ligação específico são extraídos do polímero com 1% de solução de ácido acético que é então liofilizada para produzir o material bruto. Isto normalmente pode ser purificado por técnicas como gel filtração em Sephadex G-15 usando 5% de ácido acético como solvente. A liofilização das frações apropriadas da coluna trará o peptídeo de agente de ligação específico homogêneo ou derivados peptídicos, que podem então ser caracterizados por técnicas padrão, como análise de aminoácidos, cromatografia em camada delgada, cromatografia líquida de alta eficiência, espectroscopia de absorção ultravioleta, rotação molar, solubilidade e quantificada pela degradação de Edman em fase sólida.

A síntese química de anticorpos anti-Ang-1 e/ou anti- Ang-2, derivados, variantes e fragmentos dos mesmos, bem como a de outros agentes de ligação à Ang-2 baseados em proteína, permite a incorporação de aminoácidos de ocorrência não natural no agente.

Técnicas de DNA recombinante são um método conveniente para preparar anticorpos completos e outros agentes de ligação específicos proteináceos grandes da presente invenção, ou fragmentos dos mesmos. Uma molécula de DNA que codifica o anticorpo ou fragmento pode ser inserida em um vetor de expressão, que por sua vez pode ser inserido em uma célula hospedeira para a produção do anticorpo ou fragmento. Entende-se que os cDNAs que codificam tais anticorpos podem ser modificados para variar do cDNA “original” (traduzidos do mRNA) para previnir a degeneração de códons ou para permitir uso de preferência de códons em várias células hospedeiras.

Geralmente, uma molécula de DNA que codifica um anticorpo pode ser obtida usando procedimentos aqui descritos nos Exemplos. Quando for desejável obter moléculas Fab ou CDRs que estão relacionados com a molécula de anticorpo original, pode-se triar uma biblioteca adequada (biblioteca apresentada em fagos; biblioteca de linfócitos, etc.) usando técnicas padrão para identificar e clonar Fabs/CDRs relacionados. Sondas usadas para tal triagem podem ser sondas de Fab truncado ou completo codificando a porção Fab do anticorpo original, sondas contra uma ou mais CDRs da porção Fab do anticorpo original, ou outras sondas adequadas. Quando fragmentos de DNA forem usados como sondas, condições de hibridização típica são aquelas tal como exposto em Ausubel et. al., (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press [1994]). Após a hidridização, o blot (transferência) marcado com sonda pode ser lavado com uma estringência adequada, dependendo de fatores como tamanho da sonda, homologia esperada da sonda para o clone, tipo de biblioteca sendo triada e número de clones sendo triado. Exemplos de triagem de alta estringência são SSC 0,1 X e SDS 0,1% em uma temperatura entre 50-65 °C.

Uma variedade de sistemas de vetor de expressão/hospedeiro pode ser utilizada para conter e expressar as moléculas polinucleotídicas que codificam os polipeptídeos de agente de ligação específico da invenção. Esses sistemas incluem, mas não estão limitados a microorganismos, tais como bactérias transformadas com vetores de expressão de DNA cosmidial, plasmidial ou de bacteriófago recombinante; levedura transformada com vetores de expressão em levedura; sistemas de células de inseto infectadas com vetores de expressão viral (p. ex., baculovírus); sistemas de células vegetais transfectadas com vetores de expressão viral (p. ex., vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão bacteriana (p. ex., plasmídeo Ti ou pBR322); ou sistemas de células animais.

Células de mamíferos que são úteis em produções de proteína de agente de ligação específico recombinante incluem, mas não estão limitadas às células VERO, células HeLa, linhagens celulares de ovário de hamster chinês (CHO), células COS (tal como COS-7), células W138, BHK, HepG2, 3T3 , RIN, MDCK, A549, PC12, K562 e 293, assim como linhagens celulares de hibridoma, conforme descrito aqui. Células de mamíferos são preferidas para a preparação daqueles agentes de ligação específicos, tais como anticorpos e fragmentos de anticorpos que são tipicamente glicosilados e requerem reenovelamento apropriado para a atividade. Células de mamíferos preferidas incluem células CHO, células de hibridoma e células mieloides. Alguns protocolos exemplares para a expressão recombinante das proteínas de agente de ligação específico são aqui descritos abaixo.

O termo “vetor de expressão” se refere a um plasmídeo, fago, vírus ou vetor, para expressar um polipeptídeo a partir de uma sequência de DNA (RNA). Um vetor de expressão pode compreender uma unidade transcricional compreendendo um conjunto de (1) um elemento ou elementos genéticos que têm um papel regulador na expressão gênica, por exemplo, promotores ou enhancers, (2) uma estrutura ou sequência que codifica o agente de ligação que é transcrito em mRNA e traduzido em proteína, e (3) sequências de início e terminação de transcrição apropriadas. Unidades estruturais destinadas para uso em sistemas de expressão de levedura ou eucarióticos incluem de preferência uma sequência líder que permite a secreção extracelular da proteína traduzida por uma célula hospedeira. Senão, quando é expressa proteína de agente de ligação específico recombinante sem uma sequência líder ou de transporte, ela pode incluir um resíduo de metionina amino-terminal. Este resíduo pode ou não ser subsequentemente clivado da proteína recombinante expressa para prover um produto de agente de ligação específico final.

Por exemplo, os agentes de ligação específicos podem ser expressos recombinantemente em levedura usando um sistema de expressão disponível comercialmente, p. ex., o Sistema de Expressão em Pichia (Invitrogen, São Diego, Califórnia), seguindo as instruções do fabricante. Este sistema baseia-se também na sequência pré-pró-alfa para secreção direta, mas a transcrição do inserto é dirigida pelo promotor da álcool oxidase (AOX1) na indução por metanol.

O peptídeo de agente de ligação específico secretado é purificado do meio de crescimento de levedura por, p. ex., os métodos usados para purificar o peptídeo de sobrenadantes de células bacterianas e de mamíferos.

Alternativamente, o cDNA codificando o peptídeo de agente de ligação específico pode ser clonado no vetor de expressão de baculovírus pVL1393 (PharMingen, São Diego, Califórnia). Este vetor pode ser usado de acordo com as instruções do fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda em meios sem proteína sF9 e para produzir proteína recombinante. A proteína de agente de ligação específico pode ser purificada e concentrada dos meios usando uma coluna de heparina-Sefarose (Pharmacia).

Alternativamente, o peptídeo pode ser expresso em um sistema de inseto. Sistemas de inseto para a expressão de proteínas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Em um de tais sistemas, vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) pode ser usado como um vetor para expressar genes exógenos em células de Spodoptera frugiperda ou em larvas de Trichoplusia. A sequência que codifica o peptídeo de agente de ligação específico pode ser clonada em uma região não essencial do vírus, tal como no gene da poliedrina, e colocada sob controle do promotor da poliedrina. A inserção bem-sucedida do peptídeo de agente de ligação específico tornará o gene da poliedrina inativo e produzirá vírus recombinantes sem revestimento proteico. Os vírus recombinantes podem ser usados para infectar células de S. frugiperda ou larvas de Trichoplusia em que é expresso peptídeo [Smith et al., J Virol 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc Nat Acad Sci (USA) 91: 3224-7 (1994)].

Em outro exemplo, a sequência de DNA que codifica o peptídeo de agente de ligação específico pode ser amplificada por PCR e clonada em um vetor apropriado, por exemplo, pGEX-3X (Pharmacia). O vetor pGEX é projetado para produzir uma proteína de fusão compreendendo glutationa-S-transferase (GST), codificada pelo vetor, e uma proteína de agente de ligação específica codificada por um fragmento de DNA inserido no sítio de clonagem do vetor. Os primers (iniciadores) para a PCR podem ser gerados para incluir, por exemplo, um sítio de clivagem apropriado. Quando a fração de fusão de agente de ligação específico for usada apenas para facilitar a expressão ou não for desejável de outro modo como ligação ao peptídeo de interesse, a proteína de fusão do agente de ligação específico recombinante pode então ser clivada da porção GST da proteína de fusão. A construção de pGEX- 3X/peptídeo do agente de ligação epecífico é transformada em células de E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, Califórnia), e transformantes individuais são isolados e cultivados. O DNA plasmidial de transformantes individuais pode ser purificado e parcialmente sequenciado usando um sequenciador automático para confirmar a presença do ácido nucleico que codifica o agente de ligação específico inserido na orientação correta.

A expressão de polinucleotídeos codificando anticorpos anti-Ang-1 e/ou anti-Ang-2 e seus fragmentos usando os sistemas recombinantes descritos acima, pode resultar na produção de anticorpos ou seus fragmentos, que devem ser "reenovelados" (para criar corretamente várias ligações dissulfeto), a fim de serem biologicamente ativos. Procedimentos típicos de reenovelamento para tais anticorpos são expostos nos Exemplos aqui e na seção seguinte.

Agentes de ligação específicos feitos em células bacterianas podem ser produzidos como um corpo de inclusão insolúvel na bactéria, podem ser purificados como a seguir. Células hospedeiras podem ser sacrificadas por centrifugação; lavadas em NaCl 0,15 M, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM; e tratadas com lisozima 0,1 mg/mL (Sigma, São Luís, Missouri) por 15 minutos em temperatura ambiente. O lisado pode ser clarificado por sonicação e os restos celulares podem ser sedimentados por centrifugação durante minutos a 12.000 x g. O sedimento contendo agente de ligação específico pode ser ressuspenso em Tris 50 mM, pH 8 e EDTA 10 mM, colocado como camada sobre glicerol 50% e centrifugado por 30 min a 6000 x g. O sedimento pode ser ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato (PBS) padrão sem Mg++ e Ca++. O agente de ligação específico pode ser purificado adicionalmente pelo fracionamento do sedimento ressuspenso em um gel de poliacrilamida e SDS desnaturante (Sambrook et al. supra). O gel pode ser embebido em KCl 0,4 M para visualizar a proteína, que pode ser excisada e eletroeluída em tampão para gel de corrida sem SDS. Se a proteína de fusão com GST for produzida em bactérias, como uma proteína solúvel, ela pode ser purificada usando o Módulo de Purificação de GST (Pharmacia).

Sistemas hospedeiros de mamíferos para a expressão da proteína recombinante são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Cepas de células hospedeiras podem ser escolhidas por uma habilidade particular para processar a proteína expressa ou produzir certas modificações pós- traducionais que serão úteis em prover a atividade da proteína. Tais modificações do polipeptídeo incluem, mas não estão limitadas a, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, adição de lipídeos e acilação. Diferentes células hospedeiras, como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, assim como linhagens celulares de hibridoma e smelhantes, têm maquinaria celular e mecanismos característicos específicos para tais atividades pós- traducionais e podem ser escolhidas para assegurar a correta modificação e processamento da proteína exógena introduzida.

Vários sistemas de seleção podem ser usados para recuperar as células que foram transformadas para produção de proteína recombinante. Tais sistemas de seleção incluem, mas não estão limitados a, genes de timidina quinase de HSV, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase e adenina fosforibosiltransferase, em células-tk, -hgprt ou -aprt, respectivamente. Além disso, a resistência anti- metabólito pode ser usada como base para a seleção por DHFR, que confere resistência ao metotrexato; gpt que confere resistência ao ácido micofenólico; neo que confere resistência ao aminoglicosídeo G418 e confere resistência à clorsulfurona; e higro que confere resistência à higromicina. Genes selecionáveis adicionais que podem ser úteis incluem trpB, que permite às células utilizar indol no lugar de triptofano, ou hisD, que permite às células utilizar histinol no lugar de histidina. Marcadores que dão uma indicação visual para a identificação de transformantes incluem antocianinas, β-glucuronidase e seu substrato, GUS, e luciferase e seu substrato, luciferina. Purificação e Renaturação de Agentes de Ligação Específicos

Em alguns casos, os agentes de ligação específicos produzidos por meio dos procedimentos descritos anteriormente podem necessitar ser "renaturados" e oxidados em uma estrutura terciária apropriada, gerando ligações dissulfeto, para tornarem-se biologicamente ativos. A renaturação pode ser realizada por meio de uma série de procedimentos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, por exemplo, a exposição do agente polipeptídico solubilizado a um pH geralmente acima de 7 na presença de um agente caotrópico. A seleção do caotrópico é similar às seleções usadas na solubilização do corpo de inclusão, embora o caotrópico seja normalmente usado em menor concentração. Um agente caotrópico exemplar é a guanidina. Na maioria dos casos, a solução de renaturação/oxidação irá conter também um agente redutor acrescido de sua forma oxidada em uma razão específica para gerar um potencial redox particular que permite a ocorrência do rearranjo das ligações dissulfeto para a formação de pontes de cisteína. Alguns pares redox comumente usados incluem cisteína/cistamina, glutationa/ditiobis GSH, cloreto cúprico, ditiotreitol DTT/ditiano DTT e 2-mercaptoetanol (bME)/ditio-bME. Em muitos casos, um cossolvente pode ser usado para aumentar a eficiência da renaturação. Os cossolventes comumente usados incluem glicerol, polietilenoglicol de vários pesos moleculares e arginina.

Será desejável purificar proteínas de agentes de ligação específicos ou suas variantes na presente invenção. As técnicas de purificação de proteínas são conhecidas por aqueles versados na técnica. Essas técnicas envolvem, em um nível, o fracionamento bruto das frações polipeptídicas e não polipeptídicas. Uma vez que o polipeptídeo de agente de ligação específico foi separado de outras proteínas, o polipeptídeo em questão também pode ser purificado por meio de técnicas de cromatografia e eletroforese para atingir a purificação total ou parcial (ou purificação até a homogeneidade). Os métodos analíticos particularmente apropriados para a preparação de um peptídeo puro de agente de ligação específico são a cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão; eletroforese em gel de poliacrilamida, focalização isoelétrica. Um método particularmente eficaz de purificação de peptídeos é a cromatografia líquida de proteína rápida ou ainda a HPLC.

Certos aspectos da presente invenção referem-se à purificação, e em modalidades particulares, à purificação substancial, de uma proteína ou peptídeo codificado(a) de agente de ligação específico. O termo "proteína ou peptídeo purificado(a) de agente de ligação específico", conforme usado aqui, refere-se a uma composição, isolável de outros componentes, em que a proteína ou peptídeo de agente de ligação específico é purificado(a) até atingir qualquer grau relativo ao estado natural em que é obtido. Uma proteína ou peptídeo purificado(a) de agente de ligação específico, portanto, refere-se ainda a uma proteína ou peptídeo de agente de ligação específico, isolado(a) do ambiente em que pode ocorrer naturalmente.

Em geral, "purificado(a)" irá se referir a uma composição de agente de ligação específico que foi sujeita ao fracionamento para a remoção de vários outros componentes, e cuja composição retém substancialmente a sua atividade biológica expressa. Na hipótese em que o termo "substancialmente purificado(a)" for usado, esta denominação estará fazendo referência a uma composição de agente de ligação específico em que a proteína ou peptídeo de agente de ligação específico forma o componente principal da composição, constituindo cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70 %, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95% ou mais das proteínas na composição.

Vários métodos para quantificar o grau de purificação do agente de ligação específico são conhecidos por aqueles versados na técnica, à luz da presente modalidade. Esses métodos incluem, por exemplo, a determinação da atividade de ligação específica de uma fração ativa ou a avaliação da quantidade de polipeptídeos de agente de ligação específico em uma fração por meio de análise de SDS/PAGE. Um método recomendado para avaliar a pureza de uma fração de agente de ligação específico é o cálculo da atividade de ligação da fração, seguido da sua comparação com a atividade de ligação do extrato inicial e do cálculo do grau de purificação, avaliado aqui por um "fator de purificação". As unidades reais usadas para representar a quantidade de atividade de ligação dependerão, naturalmente, da técnica de ensaio particular selecionada para acompanhar o tratamento e se a proteína ou peptídeo de agente de ligação específico expressado(a) exibe uma atividade de ligação detectável.

Várias técnicas apropriadas para uso na purificação de proteínas de agentes de ligação específicos são conhecidas por aqueles versados na técnica. Essas técnicas incluem, por exemplo, a precipitação por sulfato de amônio, precipitação por PEG, precipitação por anticorpos (imunoprecipitação), e similares, ou precipitação por desnaturação térmica, seguido de centrifugação; etapas de cromatografia, como cromatografia de afinidade (por exemplo, Proteína A Sefarose), cromatografia de troca iônica, cromatografia de gel filtração, cromatografia de fase reversa, cromatografia em hidroxiapatita e cromatografia de afinidade, isoeletrofocalização , eletroforese em gel; e combinações dessas e outras técnicas. Conforme geralmente conhecido na técnica, acredita-se que a ordem de realização das diferentes etapas de purificação pode ser alterada, ou que certas etapas possam ser omitidas, ainda assim, resultando em um método apropriado para a preparação de um agente de ligação específico substancialmente purificado.

Não há qualquer exigência geral de que o agente de ligação específico seja sempre fornecido em seu estado mais puro. De fato, é contemplado que os produtos de agentes de ligação consideravelmente menos específicos terão utilidade em certas modalidades. A purificação parcial pode ser alcançada usando-se menos etapas de purificação em combinação, ou usando-se formas diferentes do mesmo esquema geral de purificação. Por exemplo, é apreciado que uma cromatografia em coluna de troca catiônica efetuada por meio de um instrumento de HPLC resulta, em geral, em um maior "fator de purificação", se comparado à mesma técnica que usa um sistema de cromatografia de baixa pressão. Os métodos que exibem um menor grau de purificação relativa podem apresentar vantagens na recuperação total do produto de proteína de agente de ligação específico ou na manutenção da atividade de ligação de uma proteína expressa de agente de ligação específico.

Sabe-se que a migração de um polipeptídeo pode variar, por vezes, significativamente, com diferentes condições de SDS/PAGE [Capaldi et al., Biochem Biophys \ Res Comm, 76: 425 (1977)]. Portanto, será apreciado que, sob diferentes condições de eletroforese, os pesos moleculares aparentes dos produtos de expressão de agentes de ligação específicos purificados ou parcialmente purificados podem variar. Ensaios de Ligação

Os ensaios de ligação imunológicos usam, normalmente, um agente de captura para ligar-se especificamente ao e, muitas vezes, imobilizar o antígeno-alvo do analito. O agente de captura é uma fração que se liga especificamente ao analito. Em uma modalidade da presente invenção, o agente de captura é um anticorpo ou seu fragmento que se liga especificamente a Ang-2 e/ou a Ang-1. Esses ensaios de ligação imunológicos são conhecidos na técnica [veja, Asai, ed., Methods in Cell Biology, Vol. 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993)].

Os ensaios de ligação imunológica usam, frequentemente, um marcador que irá sinalizar a existência de um complexo de ligação formado pelo agente de captura e pelo antígeno. O marcador pode ser uma das moléculas que compreendem o complexo de ligação; ou seja, pode ser um agente de ligação específico marcado ou um anticorpo marcado de agente de ligação não específico. Alternativamente, o marcador pode ser uma terceira molécula, geralmente outro anticorpo, que se liga ao complexo de ligação. O marcador pode ser, por exemplo, um anticorpo de agente de ligação não específico contendo uma marcação. O segundo anticorpo, específico do complexo de ligação, pode não conter uma marcação, mas pode ser ligado por uma quarta molécula específica das espécies de anticorpos, que têm o segundo anticorpo como membro. Por exemplo, o segundo anticorpo pode ser modificado com uma fração detectável, como a biotina, que pode então ser ligada por uma quarta molécula, como a estreptavidina marcada com enzima. Outras proteínas com capacidade para ligar especificamente regiões constantes da imunoglobulina, como a proteína A ou a proteína G, também podem ser usadas como o marcador. Essas proteínas de ligação são constituintes normais das paredes celulares das bactérias estreptococos, e exibem alta reatividade não imunogênica com as regiões constantes da imunoglobulina de uma variedade de espécies [veja, em geral Akerstrom, J Immunol, 135:2589-2542 (1985); e Chaubert, Mod Pathol, 10:585-591 (1997)].

Ao longo dos ensaios, as etapas de incubação e/ou de lavagem podem ser necessárias após cada combinação de reagentes. As etapas de incubação podem variar de cerca de 5 segundos a várias horas, de preferência, de cerca de 5 minutos a cerca de 24 horas. No entanto, o tempo de incubação irá depender do formato, analito, volume da solução, concentrações do ensaio, entre outros. Em geral, os ensaios serão realizados em temperatura ambiente, embora possam ser conduzidos em uma gama de temperaturas. A. Ensaios de Ligação Não Competitiva:

Os ensaios de ligação imunológicas podem ser do tipo não competitivo. Esses ensaios possuem uma quantidade de analitos capturados que é medida diretamente. Por exemplo, em um ensaio “sanduíche” recomendado, o agente de captura (anticorpo) pode ser ligado diretamente a um substrato sólido no qual é imobilizado. Esses anticorpos imobilizados então capturam (ligam-se ao) o antígeno presente na amostra de teste. A proteína imobilizada é, portanto, ligada a um marcador, como um segundo anticorpo que contém uma marcação. Em outro ensaio “sanduíche” recomendado, o segundo anticorpo não contém uma marcação, mas pode ser ligado por um anticorpo marcado específico para anticorpos da espécie da qual o segundo anticorpo é derivado. O segundo anticorpo também pode ser modificado com uma fração detectável, como a biotina, a qual uma terceira molécula marcada pode ligar-se especificamente, como a estreptavidina. [Veja, Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988), incorporado aqui por referência]. B. Ensaios de Ligação Competitivos:

Os ensaios de ligação imunológicos podem ser do tipo competitivo. A quantidade de analitos presentes na amostra é medida indiretamente, por meio da medição da quantidade de um analito adicionado, deslocado ou eliminado de um agente de captura pelo analito presente na amostra. Em um ensaio de ligação competitivo recomendado, uma quantidade conhecida de analitos, geralmente marcados, é adicionada à amostra e a amostra é então colocada em contato com um anticorpo (o agente de captura). A quantidade de analitos marcados ligados ao anticorpo é inversamente proporcional à concentração de analitos presente na amostra. (Veja, Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch 14, pp. 579583, supra).

Em outro ensaio de ligação competitivo recomendado, o anticorpo é imobilizado em um substrato sólido. A quantidade de proteínas ligadas ao anticorpo pode ser determinada por meio da medição da quantidade de proteínas presentes em um complexo proteína/anticorpo ou, alternativamente, por meio da medição da quantidade de proteínas não complexadas restantes. A quantidade de proteínas pode ser detectada por meio do fornecimento de uma proteína marcada. Veja, Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch 14, supra).

Em ainda outro ensaio de ligação competitivo recomendado, a inibição do hapteno é usada. Aqui, um analito conhecido é imobilizado em um substrato sólido. Uma quantidade conhecida de anticorpos é adicionada à amostra, e a amostra é colocada em contacto com o analito imobilizado. A quantidade de anticorpos ligados ao analito imobilizado é inversamente proporcional à quantidade de analitos presentes na amostra. A quantidade de anticorpos imobilizados pode ser detectada por meio da detecção da fração de anticorpos imobilizados ou da fração restante na solução. A detecção pode ser direta, em que o anticorpo é marcado, ou indireta, por meio da adição posterior de uma fração marcada que se liga especificamente ao anticorpo, conforme descrito anteriormente. C. Utilização dos Ensaios de Ligação Competitivos:

Os ensaios de ligação competitivos podem ser usados em determinações de reatividade cruzada, a fim de permitir que uma pessoa versada na técnica determine se um complexo proteico ou enzimático, que é reconhecido por um agente de ligação específico da invenção, é a proteína desejada e não uma molécula de reatividade cruzada, ou determine se o anticorpo é específico para o antígeno e não liga antígenos não relacionados. Nesses tipos de ensaios, o antígeno pode ser imobilizado em um suporte sólido, e uma mistura proteica desconhecida é adicionada ao ensaio, que vai competir com a ligação dos agentes de ligação específicos à proteína imobilizada. A molécula concorrente também liga um ou mais antígenos não relacionados com o antígeno. A capacidade das proteínas de competir com a ligação dos anticorpos dos agentes de ligação específicos ao antígeno imobilizado é comparada com a ligação pela mesma proteína que foi imobilizada no suporte sólido para determinar a reatividade cruzada da mistura proteica. D. Outros Ensaios de Ligação:

A presente invenção também fornece métodos Western blot para detectar ou quantificar a presença de Ang-1 e/ou Ang-2 em uma amostra. Em geral, a técnica compreende a separação das proteínas da amostra por eletroforese em gel com base no peso molecular e na transferência das proteínas para um suporte sólido apropriado, como um filtro de nitrocelulose, filtro de náilon ou filtro de náilon derivatizado. A amostra é incubada com anticorpos ou seus fragmentos que ligam especificamente a Ang-1 e/ou a Ang-2, e o complexo resultante é detectado. Esses anticorpos podem ser marcados diretamente ou, de maneira alternativa, podem ser posteriormente detectados por meio de anticorpos marcados que se ligam especificamente ao anticorpo.

Os ensaios de ligação para detectar os agentes de ligação específicos de Ang-1 e/ou Ang-2 que desfazem a ligação de Ang-2 com o seu receptor são demonstrados nos exemplos aqui descritos. Ensaios de Diagnóstico

Os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção são úteis para o diagnóstico de condições ou doenças caracterizadas pela expressão de Ang-1 e/ou Ang-2 ou subunidades, ou em ensaios para monitorar pacientes em tratamento com indutores de Ang-1 e/ou Ang-2, seus fragmentos, agonistas ou inibidores da atividade de Ang-1 e/ou Ang-2. Os ensaios de diagnóstico para Ang-1 e/ou Ang-2 incluem métodos que usam um agente de ligação específico e um marcador para detectar Ang-1 e/ou Ang-2 em fluidos corporais humanos ou extratos de células ou tecidos. Os agentes de ligação específicos da presente invenção pode ser usada com ou sem modificações. Em um ensaio de diagnóstico recomendado, os agentes de ligação específicos serão marcados por meio da adesão, por exemplo, de um marcador ou de uma molécula repórter. Uma grande variedade de marcadores e moléculas repórteres é conhecida, algumas das quais já foram descritas aqui. Em particular, a presente invenção é útil para o diagnóstico de doenças humanas.

Uma variedade de protocolos para medição de proteínas Ang-1 e/ou Ang-2 usando anticorpos policlonais ou monoclonais específicos para a respectiva proteína é conhecida na técnica. Os exemplos incluem o ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), o radioimunoensaio (RIA) e a separação de células ativadas por fluorescência (FACS). Um imunoensaio de dois sítios, com base monoclonal, que usa anticorpos monoclonais reativos a dois epítopos sem interferência em Ang-1 e/ou Ang-2, é recomendado, mas um ensaio de ligação competitiva pode ser empregado. Esses ensaios são descritos, por exemplo, em Maddox et al., J Exp Med, 158:1211 [1983].

A fim de fornecer uma base para o diagnóstico, os valores normais ou padrão de expressão da Ang-1 e/ou Ang-2 humana são normalmente estabelecidos. Essa determinação pode ser realizada por meio da combinação de fluidos corporais ou extratos de células de indivíduos normais, de preferência humanos, com um agente de ligação específico, por exemplo, um anticorpo, a Ang-1 e/ou Ang-2, sob condições apropriadas para a formação de complexos que são conhecidos na técnica. A quantidade de formação de complexos padrão pode ser quantificada pela comparação da ligação dos agentes de ligação específicos com quantidades conhecidas de proteína Ang-1 e/ou Ang-2, com amostras de controle e doença. Em seguida, os valores padrão obtidos a partir de amostras normais podem ser comparados com os valores obtidos a partir de amostras de indivíduos potencialmente afetados pela doença. O desvio entre os valores padrão e do sujeito sugere uma função para a Ang-1 e/ou Ang-2 no estado de doença.

Para aplicações de diagnóstico, em certas modalidades, os agentes de ligação específicos serão marcados normalmente com uma fração detectável. A fração detectável pode ser qualquer uma com capacidade para produzir, direta ou indiretamente, um sinal detectável. Por exemplo, a fração detectável pode ser um radioisótopo, como 3H, 14C, 32P, 35S ou 125I, um composto fluorescente ou quimioluminescente, como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina; ou uma enzima, como a fosfatase alcalina, β-galactosidase ou peroxidase de raiz forte [Bayer et al., Meth Enz, 184: 138-163, (1990)]. Doenças

A presente invenção fornece um agente de ligação específico que se liga a Ang-1 e/ou Ang-2, e é útil para o tratamento de doenças humanas e condições patológicas. Os agentes que modulam a atividade de ligação da Ang-1 e/ou da Ang-2, ou outras atividades celulares, podem ser usados em combinação com outros agentes terapêuticos para aumentar seus efeitos terapêuticos ou diminuir os efeitos colaterais.

Em um aspecto, a presente invenção fornece reagentes e métodos úteis para o tratamento de doenças e condições caracterizadas por níveis anormais ou indesejáveis de atividade de Ang-1 e/ou Ang-2 em uma célula. Essas doenças incluem os cânceres e outras condições hiperproliferativas, como hiperplasia, psoríase, dermatite de contato, doenças imunológicas e infertilidade.

A presente invenção também fornece métodos para tratamento de câncer em animais, incluindo humanos, compreendendo a administração, ao animal, de uma quantidade eficaz de um agente de ligação específico que inibe ou diminui a atividade de Ang-1 e/ou Ang-2. A invenção é ainda referida a métodos para inibição do crescimento de células cancerosas, incluindo os processos de proliferação celular, invasividade e metástase em sistemas biológicos. Os métodos incluem o uso de um composto da invenção como um inibidor do crescimento de células cancerosas. Preferivelmente, os métodos são empregados para inibir ou reduzir o crescimento de células cancerosas, invasividade, metástase ou incidência de tumores em animais vivos, como os mamíferos. Os métodos da invenção também são facilmente adaptáveis para uso em sistemas de ensaio, por exemplo, ensaios de crescimento de células cancerosas e suas propriedades, bem como na identificação de compostos que afetam o crescimento de células cancerosas.

Os cânceres tratáveis por meio dos métodos da presente invenção ocorrem, preferivelmente, em mamíferos. Os mamíferos incluem, por exemplo, humanos e outros primatas, bem como animais de estimação ou animais de companhia, como cães e gatos; animais de laboratório, como ratos, camundongos e coelhos; e animais de fazenda, como cavalos, porcos, ovelhas e gado.

Os tumores ou neoplasias incluem o crescimento de células teciduais, em que a multiplicação das células é desordenada e progressiva. Alguns desses crescimentos são benignos, porém outros são denominados como malignos e podem levar à morte do organismo. As neoplasias ou cânceres malignos são distintos dos crescimentos benignos pelo fato de que, além de exibirem proliferação celular agressiva, podem invadir tecidos adjacentes e realizarem metástase. Além disso, as neoplasias malignas são caracterizadas pelo fato de que exibem uma maior perda de diferenciação (maior desdiferenciação), assim como a perda de sua organização e de seus tecidos adjacentes. Essa propriedade é também chamada de “anaplasia”.

As neoplasias tratáveis por meio da presente invenção incluem ainda tumores sólidos, isto é, carcinomas e sarcomas. Os carcinomas incluem as neoplasias malignas derivadas de células epiteliais que infiltram (invadem) os tecidos adjacentes e dão origem às metástases. Os adenocarcinomas são carcinomas derivados do tecido glandular, ou que formam estruturas glandulares reconhecíveis. Outra categoria ampla de cânceres inclui os sarcomas, que são tumores cujas células estão embebidas em uma substância homogênea ou fibrilar, como o tecido conjuntivo embrionário. A invenção também possibilita o tratamento dos cânceres dos sistemas mieloide ou linfoide, incluindo as leucemias, os linfomas e outros tipos de cânceres que geralmente não se manifestam como massa tumoral, mas são distribuídos nos sistemas vascular ou linforreticular.

Os tipos de células tumorais ou de câncer sensíveis ao tratamento, de acordo com a invenção, incluem, por exemplo, tumor produtor de ACTH, leucemia linfocítica aguda, leucemia não linfocítica aguda, câncer de córtex adrenal, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de mama, câncer cervical, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielocítica crônica, câncer colorretal, linfoma cutâneo de células T, câncer de endométrio, câncer de esôfago, sarcoma de Ewing, câncer de vesícula biliar, leucemia de células pilosas, câncer de cabeça e pescoço, linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, câncer renal, câncer de fígado, câncer de pulmão (células pequenas e não pequenas), derrame peritoneal maligno, derrame pleural maligno, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiplo, neuroblastoma, glioma, linfoma não-Hodgkin, osteossarcoma, câncer de ovário, câncer de ovário (células germinativas), cancer pancreático, câncer de pênis, cancer de próstata, retinoblastoma, câncer de pele, sarcoma de tecidos moles, carcinoma de células escamosas, câncer de estômago, câncer testicular, câncer de tireoide, neoplasias trofoblásticas, câncer uterino, câncer vaginal, câncer de vulva e tumor de Wilms.

A invenção é particularmente ilustrada em referência ao tratamento de certos tipos de cânceres experimentalmente definidos. Nesses tratamentos ilustrativos, modelos padrão inovadores in vitro e in vivo foram usados. Esses métodos podem ser usados para identificar agentes que possam vir a ser eficazes em regimes de tratamento in vivo. No entanto, será compreendido que o método da invenção não é limitado ao tratamento desses tipos de tumores, e sim, estende-se a qualquer tumor sólido derivado de qualquer sistema de órgãos. Os cânceres cuja invasividade ou metástase está associada com a expressão ou atividade de Ang-2 são especialmente suscetíveis a serem inibidos ou até mesmo induzidos à regressão por meio da invenção.

A invenção também pode ser praticada por meio da inclusão de um agente de ligação específico da invenção, como um anticorpo, em combinação com outro agente quimioterápico anticâncer, como qualquer agente quimioterápico convencional. A combinação de um agente de ligação específico com os outros agentes pode potencializar o protocolo quimioterápico. Inúmeros protocolos quimioterápicos virão à mente daquele versado na técnica, sendo este capaz de incorporá-los ao método da invenção. Qualquer agente quimioterápico pode ser usado, incluindo agentes alquilantes, antimetabólitos, hormônios e antagonistas, radioisótopos, bem como produtos naturais. Por exemplo, o composto da invenção pode ser administrado com antibióticos, como a doxorrubicina e outros análogos da antraciclina, mostardas nitrogenadas, como a ciclofosfamida, análogos da pirimidina, como 5-fluoruracil, cisplatina, hidroxiureia, taxol e seus derivados naturais e sintéticos, e similares. Como outro exemplo, no caso de tumores mistos, como o adenocarcinoma de mama, em que os tumores incluem células dependentes e independents de gonadotrofinas, o composto pode ser administrado em conjunto com a leuprolida ou a goserelina (peptídeos sintéticos análogos de LH-RH). Outros protocolos antineoplásicos incluem o uso de um composto de tetraciclina com outras modalidades de tratamento, por exemplo, cirurgia, radiação, etc., aqui também referidas como "modalidades antineoplásicas complementares".

Portanto, o método da invenção pode ser empregado com esses regimes convencionais, com a vantagem da redução dos efeitos colaterais e do aumento da eficácia.

A presente invenção, portanto, fornece composições e métodos úteis para o tratamento de uma ampla variedade de cânceres, incluindo tumores sólidos e leucemias. Os tipos de câncer que podem ser tratados incluem, mas não estão limitados a: adenocarcinoma de mama, próstata e cólon; todas as formas de carcinoma broncogênico de pulmão; mieloide; melanoma; hepatoma; neuroblastoma; papiloma; apudoma; coristoma; branquioma; síndrome carcinoide maligna; doença cardíaca carcinoide; carcinoma (por exemplo, carcinoma de Walker, carcinoma de células basais, carcinoma basoescamoso, carcinoma de Brown-Pearce, carcinoma ductal, carcinoma tumor de Ehrlich, carcinoma Krebs 2, carcinoma de células de Merkel, carcinoma mucinoso, carcinoma de pulmão de células não pequenas, carcinoma de células em "grão de aveia", carcinoma papilar, carcinoma esquirroso, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogênico, carcinoma de células escamosas e carcinoma de células transicionais); distúrbios histiocíticos; leucemia; histiocitose maligna; doença de Hodgkin; carcinoma imunoproliferativo de pequenas células de pulmão; linfoma não-Hodgkin; plasmacitoma; reticuloendoteliose; melanoma; condroblastoma; condroma; condrossarcoma; fibroma; fibrossarcoma; tumores de células gigantes; histiocitoma; lipoma; lipossarcoma; mesotelioma; mixoma; mixossarcoma; osteoma; osteossarcoma; cordoma; craniofaringioma; disgerminoma; hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma; miossarcoma; ameloblastoma; cementoma; odontoma; teratoma; timoma; tumor trofoblástico. Além disso, os seguintes tipos de cânceres podem ser tratados: adenoma; colangioma; colesteatoma; cilindroma; cistadenocarcinoma; cistadenoma; tumor de células da granulosa; ginandroblastoma; hepatoma; hidradenoma; tumor de células das ilhotas; tumor de células de Leydig; papiloma; tumor de células de Sertoli; tumor de células da teca; leiomioma; leiomiossarcoma; mioblastoma; mioma; miossarcoma; rabdomioma; rabdomiossarcoma; ependimoma; ganglioneuroma; glioma; meduloblastoma; meningioma; neurilemoma; neuroblastoma; neuroepitelioma; neurofibroma; neuroma; paraganglioma; paraganglioma não cromafínico; angioqueratoma; hiperplasia angiolinfoide com eosinofilia; angioma esclerosante; angiomatose; glomangioma; hemangioendotelioma; hemangioma; hemangiopericitoma; hemangiossarcoma; linfangioma; linfangiomioma; linfangiossarcoma; pinealoma; carcinossarcoma; condrossarcoma; cistossarcoma filodes; fibrossarcoma; hemangiossarcoma; leiomiossarcoma; leucossarcoma; lipossarcoma; linfangiossarcoma; miossarcoma; mixossarcoma; carcinoma ovariano; rabdomiossarcoma; sarcoma; neoplasias; neurofibromatose; e displasia cervical.

Outro aspecto da presente invenção utiliza os materiais e os métodos da presente invenção para prevenir e/ou tratar qualquer condição hiperproliferativa da pele, incluindo a psoríase e a dermatite de contato, ou outras doenças hiperproliferativas. Foi demonstrado que os pacientes com psoríase e dermatite de contato possuem elevada atividade de Ang-2 para essas lesões [Ogoshi et al., J. Inv. Dermatol., 110:818-23 (1998)]. Preferivelmente, certos agentes de ligação específicos para Ang-2 serão usados em combinação com outros agentes farmacêuticos para o tratamento de humanos que expressam esses sintomas clínicos. Os agentes de ligação específicos podem ser fornecidos pelo uso de qualquer um dos diversos transportadores por meio das vias de administração aqui descritas e por outras que sejam conhecidas por aqueles versados na técnica.

Outros aspectos da presente invenção incluem o tratamento de diversas retinopatias (incluindo a retinopatia diabética e a degeneração macular relacionada à idade), em que a angiogênese está envolvida, bem como distúrbios/doenças do trato reprodutivo feminino, como a endometriose, fibroides uterinos e outras condições associadas com a proliferação vascular disfuncional (incluindo o crescimento microvascular endometrial) durante o ciclo reprodutivo feminino.

Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se ao tratamento do crescimento vascular anormal, incluindo as malformações arteriovenosas cerebrais (MAV), lesão e reparação da mucosa gastrointestinal, ulceração da mucosa gastroduodenal em doentes com histórico de úlcera péptica, incluindo a isquemia resultante de acidente vascular cerebral, um amplo espectro de distúrbios vasculares pulmonares em doença hepática e hipertensão portal em pacientes com hipertensão portal não hepática.

Outro aspecto da presente invenção é a prevenção de cânceres por meio das composições e dos métodos aqui fornecidos. Esses reagentes incluem agentes de ligação específicos à Ang-2. Composições Farmacêuticas

As composições farmacêuticas de agentes de ligação específicos de Ang-1 e/ou Ang-2 estão dentro do escopo da presente invenção. As composições farmacêuticas que compreendem anticorpos são descritas em detalhes, por exemplo, na Patente US 6.171.586, em Lam et al., publicada em 9 de janeiro de 2001. Essas composições compreendem uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um agente de ligação específico, como um anticorpo, ou um fragmento, variante, derivado ou fusão destes, conforme aqui descrito, em admistura com um agente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade recomendada, as composições farmacêuticas compreendem agentes de ligação antagonistas específicos que modulam parcial ou completamente pelo menos uma atividade biológica de Ang-1 e/ou Ang-2 em admistura com um agente farmaceuticamente aceitável. Tipicamente, os agentes de ligação específicos serão suficientemente purificados para a administração a um animal.

A composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para a modificação, manutenção ou conservação, por exemplo, do pH, osmolaridade, viscosidade, pureza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração da composição. Os materiais de formulação apropriados incluem, mas não estão limitados a aminoácidos (como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio); tampões (como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, outros ácidos orgânicos); agentes de massa (como manitol ou glicina), agentes quelantes [como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)]; agentes complexantes (como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina e hidroxipropil-beta-ciclodextrina); agentes de enchimento; monossacarídeos; dissacarídeos e outros carboidratos (como glicose, manose ou dextrinas); proteínas (como soroalbumina, gelatina ou imunoglobulinas); corantes; agentes de diluição e aromatizantes; agentes emulsificantes; polímeros hidrofílicos (como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo peso molecular; contra-íons formadores de sal (como sódio); conservantes (como cloreto benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, fenetil álcool, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (como glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol); álcoois de açúcar (como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; tensoativos ou agentes umectantes (como plurônicos, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos como polissorbato 20, polissorbato 80, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapol); agentes de reforço da estabilidade (sacarose ou sorbitol); agentes de reforço da tonicidade (como haletos de metal alcalino (preferivelmente cloreto de sódio ou de potássio, sorbitol e manitol); veículos de liberação; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990).

A composição farmacêutica ideal será determinada por uma pessoa versada na técnica, dependendo, por exemplo, da via de administração pretendida, da forma de liberação e da dosagem desejadas. Veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Essas composições podem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de depuração in vivo do agente de ligação específico.

O principal veículo ou transportador em uma composição farmacêutica pode ser de natureza aquosa ou não aquosa. Por exemplo, um veículo ou transportador apropriado pode ser água para injeção, solução salina fisiológica ou fluido cerebrospinal artificial, possivelmente complementados com outros materiais comuns em composições para administração parenteral. A salina neutra tamponada ou a salina misturada com soroalbumina são outros veículos exemplares. Outras composições farmacêuticas exemplares compreendem tampão Tris com pH de aproximadamente 7,0-8,5, ou tampão acetato com pH de aproximadamente 4,0-5,5, que pode incluir ainda sorbitol ou um substituto apropriado. Em uma modalidade da presente invenção, as composições dos agentes de ligação podem ser preparadas para armazenamento pela mistura da composição selecionada em um grau de pureza desejado contendo agentes de formulação opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra), na forma de torta liofilizada ou solução aquosa. Além disso, o produto do agente de ligação pode ser formulado como um liofilizado por meio de excipientes apropriados, como a sacarose.

As composições farmacêuticas podem ser selecionados para liberação parenteral. Alternativamente, as composições podem ser selecionados para inalação ou para liberação enteral, por exemplo, por via oral, auricular, oftálmica, retal ou vaginal. A preparação dessas composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro do escopo da técnica.

Os componentes da formulação estão presentes em concentrações que são aceitáveis para o local de administração. Por exemplo, os tampões são usados para manter a composição em pH fisiológico ou em pH ligeiramente inferior, normalmente dentro de uma faixa de pH de cerca de 5 a cerca de 8.

Quando a administração parenteral é contemplada, as composições terapêuticas para uso nesta invenção podem estar na forma de uma solução aquosa apirogênica aceitável para uso parenteral com o agente de ligação específico desejado em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente apropriado para injeção parenteral é a água destilada estéril, na qual um agente de ligação é formulado como uma solução isotônica estéril, devidamente conservada. Ainda outra preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, como microesferas injetáveis, partículas biodegradáveis, compostos poliméricos (ácido polilático, ácido poliglicólico), grânulos ou lipossomas, que fornecem a liberação controlada ou sustentada do produto, que pode então ser liberado por via de injeção de depósito. O ácido hialurônico também pode ser usado, e o efeito pode ser a promoção da duração sustentada na circulação. Outros meios apropriados para a introdução da molécula desejada incluem dispositivos implantáveis de liberação de drogas.

Em outro aspecto, as formulações farmacêuticas apropriadas para administração parenteral podem ser formuladas em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis, como solução de Hanks, solução de Ringer ou solução salina tamponada fisiologicamente compatível. As suspensões aquosas injetáveis podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextran. Além disso, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparados como suspensões oleosas injetáveis apropriadas. Os solventes ou veículos lipofílicos apropriados incluem óleos graxos, como o óleo de gergelim, ou ésteres sintéticos de ácidos graxos, como o oleato de etila, triglicerídeos ou lipossomas. Aminopolímeros policatiônicos não lipídicos também podem ser usados para liberação. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes apropriados para aumentar a solubilidade dos compostos e permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

Em outra modalidade, uma composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. Por exemplo, um agente de ligação pode ser formulado como um pó seco para inalação. As soluções para inalação contendo moléculas de polipeptídeo ou de ácido nucleico também podem ser formuladas com um propelente para liberação em forma de aerossol. Em ainda outra modalidade, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar é descrita com detalhes no Pedido PCT N° PCT/US94/001875, que descreve a liberação pulmonar de proteínas quimicamente modificadas.

É também contemplado que certas formulações podem ser administradas por via oral. Em uma modalidade da presente invenção, as moléculas do agente de ligação que são administradas desse modo podem ser formuladas com ou sem os transportadores normalmente usados na composição de formas de dosagem sólidas, como comprimidos e cápsulas. Por exemplo, uma cápsula pode ser projetada para liberar a parte ativa da formulação no ponto do trato gastrointestinal, em que a biodisponibilidade é maximizada e a degradação pré-sistêmica é minimizada. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar a absorção da molécula do agente de ligação. Diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes para comprimidos de desintegração e aglutinantes também podem ser empregados.

As composições farmacêuticas para administração oral também podem ser formuladas por meio do uso de transportadores farmaceuticamente aceitáveis conhecidos na técnica, em doses apropriadas para a administração oral.

Esses transportadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas na forma de comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões, entre outros, para a ingestão pelo paciente.

As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas por meio da combinação de compostos ativos com excipientes sólidos e pelo processamento da mistura resultante de grânulos (opcionalmente, após a trituração) para a obtenção de núcleos de comprimidos ou drágeas. Auxiliares apropriados podem ser adicionados, caso desejado. Excipientes adequados incluem agentes de enchimento de carboidrato ou proteína, como açúcares, incluindo a lactose, sacarose, manitol e sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batatas ou outras plantas; celulose, como metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose ou carboximetilcelulose de sódio; gomas, incluindo goma arábica e goma tragacanto; e proteínas, como gelatina e colágeno. Caso desejado, agentes de desintegração ou solubilização podem ser adicionados, como polivinilpirrolidona reticulada, ágar, ácido algínico ou seus sais, como o alginato de sódio.

Os núcleos das drágeas podem ser usados em conjunto com revestimentos apropriados, como soluções concentradas de açúcar, que também podem conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenoglicol e/ou dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos apropriados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de comprimidos ou drágeas para a identificação do produto ou para caracterizar a quantidade do composto ativo, isto é, da dosagem.

As preparações farmacêuticas que podem ser usadas por via oral também incluem cápsulas gelatinosas duras e moles, além de um revestimento, como glicerol ou sorbitol. As cápsulas duras podem conter ingredientes ativos misturados com agentes de enchimento ou aglutinantes, como lactose ou amidos, lubrificantes, como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas moles, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos apropriados, como óleos graxos ou polietilenoglicol líquido, com ou sem estabilizadores.

Outra composição farmacêutica pode envolver uma quantidade eficaz de agentes de ligação em uma mistura de excipientes não tóxicos que são apropriados para a fabricação de comprimidos. Por meio da dissolução dos comprimidos em água estéril ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas na forma de dose unitária. Excipientes apropriados incluem, mas não estão limitados a diluentes inertes, como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, como amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes, como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.

Composições farmacêuticas adicionais estarão evidentes para aqueles versados na técnica, incluindo formulações que envolvem moléculas de agentes de ligação em formulações de liberação sustentada ou controlada. Técnicas para a formulação de uma variedade de outros meios de liberação sustentada ou controlada, como lipossomas transportadores, micropartículas biodegradáveis ou grânulos porosos e injeções de depósito, também são conhecidas por aqueles versados na técnica. Consulte, por exemplo, PCT/US93/00829, que descreve a liberação controlada de micropartículas poliméricas porosas para a liberação de composições farmacêuticas. Outros exemplos de preparações de liberação sustentada incluem matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos com formato definido, por exemplo, películas ou microcápsulas. As matrizes de liberação prolongada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos (US 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato [Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)], poli (2-hidroxietil metacrilato) [Langer et al., J Biomed Mater Res, 15:167277, (1981)] e [Langer et al., Chem Tech, 12:98-105(1982)], acetato de vinil etileno (Langer et al., supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988). As composições de liberação prolongada também incluem lipossomas, que podem ser obtidos por meio de qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Eppstein et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 82:3688-3692 (1985); EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949.

A composição farmacêutica a ser usada para administração in vivo deve ser tipicamente estéril. Isso é possível por meio do uso de membranas filtrantes estéreis. Quando a composição é liofilizada, a esterilização que usa esse método pode ser conduzida antes ou após a liofilização e a reconstituição. A composição para administração parenteral pode ser armazenada na forma liofilizada ou na forma de solução. Além disso, geralmente, as composições parenterais são colocadas em um recipiente contendo uma via de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa com uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.

Uma vez que a composição farmacêutica foi formulada, é possível armazená-la em frascos estéreis na forma de uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou pó desidratado ou liofilizado. Essas formulações podem ser armazenadas na forma pronta para uso ou em uma forma (por exemplo, liofilizada) que necessita de reconstituição antes da administração.

Em uma modalidade específica, a presente invenção é direcionada a kits para a produção de uma unidade de administração de dose única. Os kits podem incluir um primeiro recipiente contendo uma proteína seca, e um segundo recipiente contendo uma formulação aquosa. Também incluído no escopo desta invenção estão os kits contendo seringas pré-carregadas multicâmaras e de câmara única (por exemplo, seringas para líquidos e seringas do tipo “lyosyringe”).

Uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica a ser empregada terapeuticamente irá depender, por exemplo, do contexto e dos objetivos terapêuticos. Uma pessoa versada na técnica irá apreciar que os níveis de dosagem apropriados para o tratamento irão variar, dependendo, portanto, em parte, da molécula liberada, da indicação de uso da molécula do agente de ligação, da via de administração e do tamanho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho do órgão) e condição (a idade e o estado geral de saúde) do paciente. Dessa maneira, o clínico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ideal. Uma dosagem típica pode variar de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Em outras modalidades, a dosagem pode variar de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg; ou de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg; ou de 5 mg/kg a cerca de 100 mg/kg.

Para qualquer substância, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de cultura celular ou em modelos animais, como camundongos, ratos, coelhos, cães ou porcos. Um modelo animal também pode ser usado para determinar a faixa de concentração apropriada e a via de administração. Essas informações podem então ser usadas para determinar doses e vias úteis de administração em humanos.

A dosagem exata será determinada em função de fatores relacionados com o indivíduo que necessita de tratamento. A dosagem e a administração são ajustadas para proporcionar níveis suficientes do composto ativo ou para manter o efeito desejado. Os fatores que podem ser considerados incluem a gravidade do estado da doença, o estado geral de saúde, a idade, o peso e o sexo do indivíduo, o tempo e a frequência da administração, a(s) combinação(ões) de drogas, a sensibilidade de reação e a resposta à terapia. As composições farmacêuticas com tempo de ação prolongado podem ser administradas a cada 3-4 dias, semanalmente ou quinzenalmente, dependendo da meia-vida e da taxa de depuração da formulação particular.

A frequência de dosagem irá depender dos parâmetros farmacocinéticos da molécula do agente de ligação na formulação usada. Geralmente, a composição é administrada até alcançar-se uma dosagem que atinja o efeito desejado. A composição pode, portanto, ser administrada em dose única, ou em doses múltiplas (em concentrações/doses iguais ou diferentes) ao longo do tempo, ou como uma infusão contínua. O refinamento adicional da dosagem apropriada é realizado rotineiramente. Dosagens apropriadas podem ser determinadas por meio do uso de dados de dose-resposta apropriados.

A via de administração da composição farmacêutica está de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, por via oral, através de injeção por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal, intralesional, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, uretral, vaginal ou retal, por meio de sistemas de liberação sustentada ou dispositivos de implantação. Caso desejado, as composições podem ser administradas por injeção em bolus ou por infusão contínua, ou por um dispositivo de implantação.

Alternativa ou adicionalmente, a composição pode ser administrada localmente por meio da implantação de uma membrana, esponja ou outro material apropriado pelo qual a molécula desejada tenha sido absorvida ou encapsulada. Quando um dispositivo de implantação é usado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão apropriado, e a liberação da molécula desejada pode ser realizada por meio de difusão, injeção em bolus com liberação programada ou administração contínua.

Em alguns casos, pode ser desejável o uso de composições farmacêuticas na forma ex vivo. Nesses casos, células, tecidos ou órgãos que foram retirados do paciente são expostos às composições farmacêuticas, sendo estas células, tecidos e/ou órgãos, em seguida, novamente implantados no paciente.

Em outros casos, um agente de ligação, que é um polipeptídeo, pode ser liberado por meio da implantação de determinadas células que foram modificadas geneticamente, usando-se os métodos aqui descritos para expressão e secreção de polipeptídeos. Essas células podem ser animais ou humanas, e podem ser autólogas, heterólogas ou xenogênicas. Opcionalmente, as células podem ser imortalizadas. A fim de diminuir a chance de uma resposta imunológica, as células podem ser encapsuladas para evitar a infiltração dos tecidos adjacentes. Geralmente, os materiais de encapsulamento são biocompatíveis, invólucros ou membranas poliméricas semipermeáveis que permitem a liberação do(s) produto(s) proteico(s), mas evitam a destruição das células pelo sistema imunológico do paciente ou por outros fatores prejudiciais dos tecidos adjacentes. Terapia de Combinação

Agentes de ligação específicos da invenção podem ser usados em combinação com outras terapêuticas para o tratamento de patologias associadas a Ang-1 e/ou Ang-2. Essas terapêuticas incluem, por exemplo, tratamento por radiação, agentes quimioterápicos, bem como outros inibidores ou fatores de crescimento.

O tratamento quimioterápico pode empregar agentes antineoplásicos, compreendendo, por exemplo, agentes alquilantes, incluindo: mostardas nitrogenadas, como mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano e clorambucil; nitrosureias, como carmustina (BCNU), lomustina (CCNU) e semustina (metil-CCNU); etileniminas/metilmelaminas, como trietilenomelamina (TEM), trietileno, tiofosforamida (tiotepa), hexametilmelamina (HMM, altretamina); sulfonatos de alquila, como busulfan; triazinas, como dacarbazina (DTIC); antimetabólitos, includindo análogos de ácido fólico, como metotrexato e trimetrexato, análogos de pirimidina, como 5-fluoruracil, fluordesoxiuridina, gencitabina, citosina-arabinosídeo (Ara-C, citarabina), 5-azacitidina, 2,2'- difluordesoxicitidina, análogos de purina, como 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2’- desoxicoformicina (pentostatina), eritroidroxinoniladenina (EHNA), fosfato de fludarabina e 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA); produtos naturais, incluindo drogas antimitóticas, como paclitaxel, alcaloides da vinca, includindo vimblastina (VLB), vincristina e vinorelbina, taxotere, estramustina e fosfato de estramustina; epipodofilotoxinas, como etoposídeo e teniposídeo; antibióticos, como actinomicina D, daunomicina (rubidomicina), doxorrubicina, mitoxantrona, idarrubicina, bleomicinas, plicamicina (mitramicina), mitomicina C e actinomicina; enzimas, como L-asparaginase; modificadores de resposta biológica, como interferon alfa, IL-2, G-CSF e GM-CSF; agentes diversos, incluindo complexos de coordenação de platina, como cisplatina e carboplatina; antracenodionas, como mitoxantrona; ureia substituída, como hidroxiureia, derivados de metil-hidrazina, incluindo N- metil-hidrazina (MIH) e procarbazina, supressores adrenocorticais, como mitotano (o,p'-DDD) e aminoglutetimida; hormônios e antagonistas, incluindo antagonistas adrenocorticosteroides, como prednisona e equivalentes, dexametasona e aminoglutetimida; progestina, como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona e acetato de megestrol; estrógeno, como dietilestilbestrol e equivalentes de etinilestradiol; antiestrógeno, como tamoxifeno; andrógenos, includindo propionato de testosterona e fluoximesterona/equivalentes; antiandrógenos, como flutamida, análogos de hormônio liberador de gonadotropina e leuprolida; e antiandrógenos não esteroidais, como flutamida.

A terapia de combinação pode ser realizada em conjunto com os fatores de crescimento listados a seguir ou com os agentes que são projetados para inibir estes fatores de crescimento. Os fatores de crescimento incluem citocinas, linfocinas, fatores de crescimento ou outros fatores hematopoiéticos, como M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNF0, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoietina, fator de célula-tronco e eritropoetina. Outras composições podem incluir angiopoetinas conhecidas, por exemplo, Ang-1, -2, - 4, -Y e/ou polipeptídeo semelhante à Ang humana, e/ou fator de crescimento vascular endotelial (VEGF). Os fatores de crescimento incluem angiogenina, proteína morfogenética óssea 1, proteína morfogenética óssea 2, proteína morfogenética óssea 3, proteína morfogenética óssea 4, proteína morfogenética óssea 5, proteína morfogenética óssea 6, proteína morfogenética óssea 7, proteína morfogenética óssea 8, proteína morfogenética óssea 9, proteína morfogenética óssea 10, proteína morfogenética óssea 11, proteína morfogenética óssea 12, proteína morfogenética óssea 13, proteína morfogenética óssea 14, proteína morfogenética óssea 15, receptor da proteína morfogenética óssea IA, receptor da proteína morfogenética óssea IB, fator neurotrófico derivado do cérebro, fator neurotrófico ciliar, receptor do fator neurotrófico ciliar, fator quimiotático de neutrófilos induzido por citocinas 1, neutrófilos induzidos por citocinas, fator quimiotático 2, fator quimiotático de neutrófilos induzido por citocinas 2, fator de crescimento de células endoteliais, endotelina 1, fator de crescimento epidérmico, ativador de neutrófilos derivado de células epiteliais, fator de crescimento de fibroblastos 4, fator de crescimento de fibroblastos 5, fator de crescimento de fibroblastos 6, fator de crescimento de fibroblastos 7, fator de crescimento de fibroblastos 8, fator de crescimento de fibroblastos 8b, fator de crescimento de fibroblastos 8c, fator de crescimento de fibroblastos 9, fator de crescimento de fibroblastos 10, fator de crescimento de fibroblastos ácido, fator de crescimento de fibroblastos básico, receptor do fator neurotrófico derivado de linhagem celular glial 1, receptor do fator neurotrófico derivado de linhagem celular glial 2, proteína relacionada ao crescimento, proteína relacionada ao crescimento 1, proteína relacionada ao crescimento 2, proteína relacionada ao crescimento 3, fator de crescimento epidérmico ligado à heparina, fator de crescimento hepatócito, receptor do fator de crescimento hepatócito, fator de crescimento semelhante à insulina I, receptor do fator de crescimento semelhante à insulina, fator de crescimento semelhante à insulina II, proteína de ligação do fator de crescimento semelhante à insulina, fator de crescimento dos queratinócitos, fator inibidor da leucemia, receptor do fator inibidor da leucemia 1, fator de crescimento neural, receptor do fator de crescimento neural, neurotrofina 3, neurotrofina 4, fator de crescimento placentário, fator de crescimento placentário 2, fator de crescimento celular endotelial derivado de plaquetas, fator de crescimento derivado de plaquetas, cadeia A do fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento derivado de plaquetas AA, fator de crescimento derivado de plaquetas AB, cadeia B do fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento derivado de plaquetas BB, receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas 1, receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas 2, fator estimulador do crescimento de células pré-B, fator de célula-tronco, receptor do fator de célula-tronco, fator de crescimento transformador 1, fator de crescimento transformador 2, fator de crescimento transformador 3, fator de crescimento transformador 1.2, fator de crescimento transformador 4, fator de crescimento transformador 5, fator de crescimento transformador latente 1, proteína de ligação do fator de crescimento transformador I, proteína de ligação do fator de crescimento transformador II, proteína de ligação do fator de crescimento transformador III, receptor do fator de necrose tumoral tipo I, receptor do fator de necrose tumoral tipo II, receptor do ativador de plasminogênio tipo uroquinase, fator de crescimento endotelial vascular, bem como proteínas quiméricas e seus fragmentos biologica ou imunologicamente ativos.

A terapia de combinação também pode ser realizada com um agente de ligação específico da presente invenção, como um anticorpo, em combinação com um indutor de apoptose, como um agente de ligação específico (por exemplo, um anticorpo agonista ou um ligante TRAIL) que induz a apoptose por meio do receptor DR4 (TRAIL R-1) e/ou do receptor DR5 (TRAIL R-2). Exemplos desses agentes de ligação específicos são fornecidos no WO 2007/027713, incorporado aqui por referência, o qual divulga anticorpos agonistas que induzem a apoptose por meio do receptor DR5. Imunoterapêutica

A imunoterapêutica baseia-se, geralmente, no uso de células imunes efetoras e moléculas para localizar e destruir células cancerosas. Os efetores imunes podem ser, por exemplo, um anticorpo da presente invenção que reconheça alguns marcadores de superfície em uma célula- alvo. O anticorpo, isoladamente, pode servir como um efetor de terapia ou pode recrutar outras células para realizar efetivamente a morte celular. O anticorpo pode ainda ser conjugado com uma droga ou toxina (quimioterápicos, radionuclídeos, cadeia A da ricina, toxina da cólera, toxina da coqueluche etc.), servindo, portanto, apenas como um agente-alvo.

De acordo com a presente invenção, as formas mutantes da Ang-1 e/ou Ang-2 podem ser localizadas por meio de imunoterapia com anticorpos ou anticorpos conjugados da invenção. É contemplado, particularmente, que as composições de anticorpos da invenção podem ser usadas em uma abordagem de terapia de combinação em conjunto com a terapia-alvo para Ang-2. A imunoterapia passiva mostrou ser particularmente eficaz contra vários tipos de câncer. Consulte, por exemplo, WO 98/39027.

Os exemplos a seguir são destinados apenas a fins ilustrativos, e não devem ser interpretados, sob nenhum aspecto, como uma limitação do escopo da invenção. EXEMPLO 1 Geração de Anticorpos Maturados por Afinidade de Ligação à Ang-2 por Phage Display Estratégia Geral

A randomização de CDR foi empregada para aumentar a atividade do anticorpo Ang-2, conforme as abordagens anteriores (Chen Y et al., 1999 J Mol Biol (293)865-881; Yelton DE et al., 1995 J Immunol (155) 1994-2004; Yang W-P et al., 1995 J Mol Biol (254) 392-403). Em resumo, as regiões variáveis do anticorpo Ang-2 536 foram clonadas no vetor pCES-1 TargetQuest modificado (Dyax Corp, de Haard HJ et al 1999 J Biol Chem (274) 18218-30). Todas as regiões CDR foram identificadas para randomização de resíduos CDR por mutagênese, por meio do uso de oligonucleotídeos contendo NNK. Após a reação de mutagênese, os clones de fagos foram analisados em cada posição por ELISA em fago para identificar mutações benéficas (para métodos, veja WO 2004/046306, WO 2003/03057134 e US 2003/0099647 A1, para referências gerais sobre anticorpos e fagos, Marks JD et al., 1991 J Mol Biol (222) 581-597; Hoogenboom HR et al 1992 J Mol Biol (227) 381-388; Griffiths AD et al., 1993 EMBO J (12) 725-734; Vaughan TP et al., 1996 Nat Biotechnol (14) 309-314). Os clones com mutações benéficas foram convertidos em anticorpos completos. Os clones de cadeia pesada foram pareados com os clones de cadeia leve e a IgG resultante foi testada para detectar atividade de neutralização. Vinte e dois clones principais foram caracterizados posteriormente. A. Modelo de Construção de Fab Ab536

As regiões variáveis do anticorpo 536 foram clonadas em um vetor pCES-1 por meio de técnicas convencionais de biologia molecular (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001). Os fragmentos variáveis de cadeia pesada e os fragmentos de cadeia leve completos foram gerados por PCR a partir dos seguintes oligonucleotídeos: Sequência reversa de cadeia pesada: CCGCTGTGCCCCCAGAGGTGC Sequência direta de cadeia pesada: ttttttccatggccgaggtccagctggtgcagtc Sequência reversa de cadeia leve: TTTTTTGGCGCGCCTTATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT Sequência direta de cadeia leve: ttttttgtgcacttgacattgtgatgactcagtct

A região variável de cadeia pesada foi inserida entre os sítios de restrição, NcoI e BstEII. A cadeia leve completa foi inserida entre os sítios de restrição, ApaLI e AscI. O resultado foi usado como modelo para a randomização CDR. B. Mutações CDR

O anticorpo 536 como um Fab no vetor pCES-1 foi amadurecido por afinidade por meio de etapas de mutagênese sítio-dirigida usando oligonucleotídeos contendo códons NNK (N=ATCG; K=GT) para cada uma das posições CDR. O Kit QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Stratagene #200518-5) foi usado em conformidade com o protocolo recomendado pelo fabricante. Para identificar fagos com maior afinidade de ligação com a Ang2, o ensaio de ELISA em fagos foi realizado com a proteína Ang2 humana biotinilada revestida com 2ug/ml em PBS em placas Maxisorp de 96 poços (NUNC). Em resumo, após o bloqueio com leite a 2% em PBS, a cultura de fagos cultivados com fagos auxiliares durante a noite foi incubada, e fagos aderidos foram detectados com anticorpos anti-M13 conjugados com HRP (Pharmacia). O sinal de luminescência foi comparado com o Fab 536 parental, e os clones com sinal superior foram selecionados para análise adicional. C. Conversão de IgG de Fab de Fagos

Após o ensaio de ELISA em fagos e a análise sequencial, 95 clones oriundos da mutagênese de cadeia leve e pesada com alta afinidade de ligação à Ang2 foram selecionados e convertidos em IgG. Em resumo, as regiões variáveis de cada clone foram amplificadas por PCR com um par de primers. As sequências de primers para LC foram CTG CTG CTG TGG CTG AGA GGT GCG CGC TGT GAT ATT GTG ATG ACT CAG TCT CCA CTC TCC e AAA AAA CGT ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CC. Os primers para HC foram TTTTTTTTGCGCGCTGTGAGGTCCAGCTGGTGCAGTC e AAAAAAGGCACTA GAGACGGTGACCAGGGTTCC. Após a digestão com BssHII e BsiWI para LC e com BssHII e BsmBI para HC, as regiões variáveis foram inseridas em vetores pcDNA3 contendo sequência líder VK1 e sequência constante de Kappa humana e da IgG1 humana por meio de técnicas padrão de biologia molecular. Cada mistura de ligação foi transformada em duas placas de 96 poços com células competentes XL10-Gold (Stratagene), e a mistura de transformação foi cultivada durante a noite para a preparação de plasmídeos no dia seguinte. O DNA resultante foi pareado com o DNA de LC ou HC 536 parental relativo e transfectado transitoriamente nas células 293T em OPTI-MEM, usando-se Fugene6. Após 7 dias, os meios de células transfectadas foram coletados e a concentração de IgG foi quantificada pelo ensaio Lance usando-se anticorpo anti-IgG humano (Fc específico) marcado com európio e anticorpo anti-IgG humano marcado com APC (Perkin Elmer). D. Seleção de Clones IgG

Os meios condicionados contendo IgG foram testados em um ensaio de neutralização HTRF para seu efeito inibitório de interação de Tie-2 com Ang1 ou Ang2. Na triagem inicial, 15 clones LC e 11 clones HC que apresentaram maior atividade foram selecionados. O DNA dos clones selecionados foi preparado e confirmado por sequenciamento. Em seguida, a combinação de cada um dos mutantes LC e HC, bem como o clone parental 536, foram transfectados em duas placas de 96 poços semeadas com células 293T. Os meios condicionados foram coletados e analisados para a verificação da concentração de IgG e do efeito inibitório em um ensaio de neutralização de Tie2. Nessa combinação, 22 clones contendo uma única mutação em cada LC e HC foram selecionados para análise posterior. E. Expressão e Purificação de Anticorpos Ang2 Humanos Maduros com Afinidade de Ligação em Células CHO

As células CS-9 usadas para transfecção de plasmídeo(s) de expressão da IgG anti-Ang2 são uma linhagem celular CHO em suspensão livre de soro. São derivadas da adaptação gradual de células CHO DXB-11 para o crescimento em meio livre de soro, conforme descrito em Rasmussen et al, 1998 (Rasmussen, B., Davis, R., Thomas, J., Reddy, P. 1998. Isolation, characterization and recombinant protein expression in Veggie-CHO: A serum-free CHO host cell line. Cytotechnology. 28: 31-42). As células DXB-11 são mutantes deficientes em DHFR derivados de células CHO-K1. (Chasin and Urlaub, 1983; Urlaub and Chasin. 1980. Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 42164220.; Chasin L.A., Graf, L., Ellis, N., Lanzberg, M., Urlaub, G. 1982. Gene amplification in dihydro folate reductase deficient mutants. Schimke, R.T. (Ed.) Gene amplification; Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., p161-166.). CHO K1 é uma linhagem celular epitelioide originalmente isolada das células de Ovário de Hamster Chinês (Kao and Puck. Genetics of somatic mammalian cells. VII. Induction and isolation of nutritional mutants in Chinese hamster cells. Proc. Nat. Acad. Sci. 60: 1275-1281, 1968.).

Para derivar a linhagem celular hospedeira CS-9, as células DXB-11 foram cultivadas em meios com redução gradual de soro com mais de 100 passagens para a obtenção de células adaptadas livres de soro denominadas como SF-CHO (Rasmussen et al, 1998). As células SF-CHO foram posteriormente subclonadas por diluição limitante, e os clones individuais foram avaliados. O clone CS-9 foi selecionado como linhagem celular hospedeira para expressão de proteínas recombinantes e depositado em banco em meio livre de soro. O banco foi testado para a detecção de agentes adventícios e de esterilidade, e mostrou-se livre de agentes virais, microbianos e micoplasmas. A linhagem celular hospedeira CS-9 é uma linhagem celular CHO deficiente em DHFR auxotrófica para glicina, hipoxantina e timidina (GHT). Os plasmídeos pDC323 e pDC324 codificam uma parte do cDNA de DHFR e os 2 plasmídeos devem complementar- se para expressar uma molécula de DHFR funcional pela associação dos 2 fragmentos de DHFR in vivo.

Os 22 anticorpos seguintes são constituídos cada um de 2 cadeias pesadas e 2 cadeias leves (kappa ou lambda), conforme indicado na Tabela 2. Tabela 2

* Testado para ligação com hAng-2, mAng-2 e hAng-1, conforme aqui descrito. As tabelas 3 e 4 definem as sequências e os SEQ ID NOs. das cadeias leves e pesadas (kappa e lambda) dos 22 anticorpos anti-Ang-1 e/ou anti-Ang-2 convertidos de fagos em anticorpos IgG1 completos. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) dos anticorpos monoclonais foram previstas com o auxílio do banco de dados VBASE, que utiliza a técnica descrita por Kabat et al em: Sequences of Proteins of Immunological Interest (NIH Publication No. 913242; U.S. Dept. Health and Human Services, 5th ed.). As regiões do Fab foram alinhadas nas sequências do banco de dados com a sequência germinal mais próxima e, em seguida, comparadas visualmente com estas sequências. As CDRs de cada região variável (de cadeia pesada ou leve), resíduos e sequências são estabelecidos na Tabela 5. Tabela 3 Regiões Variáveis de Cadeia Pesada

EXEMPLO 2 Ensaios Moleculares para Avaliação de Anticorpos Ang-2

Os ensaios moleculares (ELISA para detecção de afinidade, ELISA para detecção de neutralização e BIAcore) foram desenvolvidos para avaliar a ligação direta do anticorpo à Ang-2 e aos membros relacionados da família (por exemplo, Ang-1), bem como o efeito dos anticorpos na interação Ang-2:Tie2. Esses ensaios in vitro baseados em células são descritos a seguir. A. ELISA para Detecção de Afinidade

Na triagem inicial de anticorpos candidatos anti-Ang- 2, a Ang-2 humana purificada (R and D Systems, Inc; catálogo número 623-AN; a Ang-2 é fornecida como uma mistura de 2 versões truncadas) ou o polipeptídeo Ang-2 murino (preparado conforme descrição a seguir) foram usados. Em ensaios de ligação confirmatórios, a Ang-2 humana foi obtida em meios condicionados de células 293T humanas transfectadas com DNA de Ang-2 humana completa e cultivada em DMEM livre de soro contendo cerca de 50 microgramas/ml de albumina de soro bovino (BSA).

Usando-se placas de microtitulação, cerca de 100 microlitros/poço de Ang-2 foram adicionados, e estas foram incubadas por aproximadamente 2 horas, sendo, após esse período, lavadas quatro vezes com solução salina em tampão fosfato (PBS) contendo Tween-20 a aproximadamente 0,1%. Os poços foram então bloqueados com cerca de 250 microlitros/poço de BSA a aproximadamente 5% em PBS, e as placas foram incubadas em temperatura ambiente por cerca de duas horas. Após a incubação, o excesso da solução de bloqueio foi descartado, e cerca de 100 microlitros de anticorpo candidato anti-Ang-2 foram adicionados a cada poço em uma série de diluições com uma concentração inicial de cerca de 40 nanomolares e, em seguida, em diluições em série por 4 vezes em PBS contendo BSA a aproximadamente 1%. As placas foram incubadas durante a noite em temperatura ambiente. Após a incubação, as placas foram lavadas com PBS contendo Tween-20 a aproximadamente 0,1%. A lavagem foi repetida por mais quatro vezes, seguida da adição de cerca de 100 microlitros/poço de anticorpo de cabra anti-IgG(Fc) humano-HRP (Pierce Chemical Co., catálogo # 31416), previamente diluído a 1:5000 em PBS contendo BSA (albumina de soro bovino) a 1%. As placas foram incubadas por cerca de uma hora em temperatura ambiente. As placas foram então lavadas cinco vezes com PBS contendo Tween-20 a aproximadamente 0,1%, em seguida, cerca de 100 microlitros/poço de substrato TMB (3,3’, 5,5'- Tetrametilbenzidina Sistema de Substrato Líquido; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, catálogo número T8665) foram adicionados, e as placas foram incubadas por cerca de 5-15 minutos até o surgimento da cor azul. A absorbância foi então lida por um espectrofotômetro em cerca de 370 nm. B. ELISA para Detecção de Neutralização

As placas de microtitulação às quais o polipeptídeo humano Ang-2 foi ligado foram preparadas conforme descrito no ensaio ELISA para detecção de afinidade. Os anticorpos candidatos anti-Ang-2 foram preparados em diluições em série, conforme descrito anteriormente no ensaio ELISA para detecção de afinidade, em uma solução de PBS contendo BSA a aproximadamente 1% e Tie2 a aproximadamente 1 nM (fornecido como uma molécula Tie2-Fc, em que a parte Tie2 contém apenas a parte solúvel extracelular da molécula; R and D Systems, catálogo número 313-TI). Após a adição de cerca de 100 microlitros da solução anticorpo/Tie2 a cada poço, as placas foram incubadas durante a noite em temperatura ambiente e, em seguida, foram lavadas cinco vezes em PBS contendo Tween-20 a 0,1%. Após a lavagem, cerca de 100 microlitros/poço de anticorpo anti-Tie2 (Pharmingen Inc., catálogo # 557039) foram adicionados a uma concentração final de cerca de 1 micrograma/ml, e as placas foram incubadas por cerca de 1 hora em temperatura ambiente, sendo, em seguida, lavadas cinco vezes em PBS contendo Tween-20 a 0,1%. Em seguida, cerca de 100 microlitros por poço de anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo-HRP (Pierce Chemical Co., catálogo # 31432) foram adicionados a uma diluição de 1:10.000 em PBS contendo BSA a aproximadamente 1%. As placas foram incubadas em temperatura ambiente por cerca de 1 hora, sendo então lavadas cinco vezes com PBS contendo Tween-20 a aproximadamente 0,1%. Em seguida, cerca de 100 microlitros/poço de substrato TMB (descrito anteriormente) foram adicionados, permitindo o surgimento de coloração. A absorbância foi então lida por um espectrofotômetro em 370 nm. C. BIAcore para Detecção de Afinidade

Uma análise de afinidade de cada anticorpo candidato Ang-2 foi realizada em um sistema Biacore®2000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) com PBS e surfactante P20 (Biacore, Inc.) a 0,005% como tampão de corrida. A proteína recombinante G (Repligen, Needham, MA) foi imobilizada no sensor chip CM5 (research grade) (Biacore, Inc.) por grupos amina primários usando-se o kit de acoplamento de aminas (Biacore, Inc.) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante.

Os ensaios de ligação foram realizados, primeiramente, por meio da ligação de cerca de 100 Ru de cada anticorpo candidato anti-Ang-2 à proteína G imobilizada, seguido da injeção de várias concentrações (0-100 nM) de huAng-2 ou mAng-2 na superfície do anticorpo ligado, a uma taxa de vazão de cerca de 50 ul/min por aproximadamente 3 minutos. A cinética de ligação do anticorpo, incluindo ka (taxa constante de associação), kd (taxa constante de dissociação) e KD (constante de equilíbrio de dissociação), foram determinados pelo software BIA evaluation 3.1 (BIAcore, Inc.). As baixas constantes de equilíbrio de dissociação indicaram uma maior afinidade do anticorpo para Ang-2.

Todos os 22 anticorpos e um controle negativo IgG1 (referido como RDB1) foram testados por ELISA para detecção de afinidade e neutralização (conforme descrito anteriormente no Exemplo 3), bem como pelo ensaio de neutralização Biacore para determinar sua afinidade, neutralização e capacidades específicas. Os resultados são apresentados a seguir (Tabela 2) e foram calculados por meio de procedimentos padrão. Três anticorpos, H6L7, H4L4 e H4L11 foram avaliados para detecção de concentrações de neutralização IC50 contra Ang-1 e Ang-2 humanas e murinas por meio da análise ELISA descrita anteriormente. Todos os 3 anticorpos mostraram reação cruzada com as Ang1 e Ang2 de camundongos, coelhos e macacos cynomolgus, exibindo potenciais similares em ortólogos da angiopoietina. Os resultados são apresentados na Tabela 3 abaixo. D. IC50 e IC90 de Anticorpos hAng-1 e hAng-2 com HTRF Volumes iguais de estreptavidina-európio (SA-UE) a 1,6nM e de angiopoietina 2 biotinilada (caseira) ou angiopoietina 1 biotinilada (R&D Cat. # BAF923) a 8Nm foram misturados e incubados em temperatura ambiente por 30 minutos, em local escuro, em rotação em um tubo cônico de 15ml (Fisher 352096). Em seguida, 50uL da mistura SA-EU/Ang 2(1) biotinilada foram adicionados a cada poço em uma placa de mistura (Costar 3356). A cada poço da placa de mistura foram adicionados 50uL de anticorpos Ang1 e Ang2 diluídos em série em concentrações finais a 4x. A placa de mistura foi então incubada em temperatura ambiente por 1 hora em um agitador, em local escuro. Em uma placa de ensaio (Costar 3356), 20uL de huTie-2-FC-APC (Prozyme Lote Personalizado # DF99-048) a 10nM foram adicionados a cada poço. Em seguida, 20uL da mistura de cada poço na placa de mistura foram transferidos para cada poço na placa de ensaio. A placa de ensaio foi incubada em temperatura ambiente por 2 horas em local escuro, com rotação. Em seguida, a placa de ensaio foi lida no leitor de placas RUBYstar (BMG labtechnologies, INC). Todos os reagentes no ensaio foram diluídos com HTRF (Tris HCl a 50 mM, NaCl a 100mM, BSA a 0,1% e Tween 20 a 0,05%) em solução tampão. As concentrações IC50 e IC90 foram calculadas com GRAFIT 5.0. Tabela 6 Potencial Bioquímico de Anticorpos Contra hAng1 e hAng2

EXEMPLO 3: Caracterização Molecular de Anticorpos da Angiopoietina

Quatro dos anticorpos humanos IgG2 completos (Ab536, H4L4, H6L7 e H4L11) com potente atividade inibitória de hAng2 e uma série de atividades inibitórias de hAng1 foram selecionados para estudos posteriores. Todos os 4 anticorpos mostraram reação cruzada com as Ang1 e Ang2 de camundongos, coelhos e macacos cynomolgus, exibindo potenciais similares em ortólogos da angiopoietina (Tabelas 7 e 8). Tabela 7

ELISA medindo a neutralização da interação ligante/receptor. Tabela 8 Potencial Bioquímico de Anticorpos da Angiopoietina Contra Ortólogos da Ang1

ELISA medindo a neutralização da interação ligante/receptor. EXEMPLO 4:

Atividade de Anticorpos da Angiopoietina em Xenoenxertos de Tumor de Colo205 Três anticorpos (H6L7, H4L4 e H4L11) foram avaliados no modelo de xenoenxerto de carcinoma colorretal humano. Em cada grupo de estudo, os camundongos receberam injeção subcutânea no flanco direito com 2 x 106 células em Matrigel™. Dez animais com volume tumoral médio de 300 mm3 foram atribuídos aleatoriamente a cada grupo experimental. Os animais receberam injeção IP duas vezes por semana, iniciando no 17° dia após a implantação, com 300 μg de anticorpos direcionados à angiopoietina ou anticorpo controle isotípico. O AMG 386 na dose biológica ideal (OBD) no modelo com 14 μg (SC) a duas vezes por semana foi incluído como um controle positivo, e o anticorpo 536LC1 foi incluído com 300 μg a duas vezes por semana. O peso corporal e o tamanho do tumor foram medidos duas vezes por semana.

Conforme mostrado na Figura 1, todos os três anticorpos inibiram significativamente o crescimento do tumor em comparação com o tratamento com um anticorpo controle isotípico (p<0,0001). O tratamento com H6L7 e H4L4 resultou em uma inibição significativamente maior do crescimento do tumor em comparação com 536LC1. Os dados representam o ± EPM. No final do experimento, os tumores foram colhidos, fixados em zinco-formalina e embutidos em parafina. As seções histológicas do tumor foram coradas com hematoxilina. A fração viável do tumor foi então estimada por limiar RGB e por contagem automática de pixels a partir de uma imagem digital 1x de toda a seção transversal do tumor. A carga tumoral viável foi calculada como a fração viável multiplicada pelo peso do tumor terminal. Os dados representam o ± EPM (n=10). A Figura 2 demonstra que os anticorpos H6L7, H4L4 e H4L11 também reduziram significativamente a carga tumoral relativa ao controle (p<0,0001), sugerindo que as medidas do volume tumoral subestimaram o efeito antitumoral dos anticorpos.

A histopatologia foi realizada em tumores e tecidos normais de camundongos no estudo mostrado nas Figuras 1 e 2. O tratamento de camundongos atímicos portadores de xenoenxertos com os inibidores de angiopoietina (AMG 386, 536LC1, H4L4, H4L11 ou H6L7) não provocaram efeitos anatômicos adversos em tecidos não-alvo. EXEMPLO 5

Efeito dos Anticorpos Anti-Ang-1 e/ou Ang-2 na Proliferação de Células Endoteliais Em um experimento paralelo, animais com tumores medindo aproximadamente 400 mm3 foram tratados com 536LC1 (AKA LC1), H4L11, H4L4, H6L7, AMG 386 ou IgG2 controle, por 72 horas. Dezessete horas antes do sacrifício, implantaram- se nos animais minibombas osmóticas contendo 3 mg/mL de BrdU. Após o sacrifício, as células endoteliais foram isoladas dos camundongos portadores de tumor de Colo205 e analisadas por citometria de fluxo para avaliar a proliferação. As células dissociadas foram coradas com CD45-FITC anticamundongo e anticorpos CD31-PE, seguido da fixação e da coloração com anticorpos anti-BrdU-alexa647. Os dados representam o ± EPM (n=5). Conforme mostrado na Figura 3, o tratamento com todos os anticorpos reduziu significativamente a porcentagem de células positivas BrdU (p<0,002 em compração com o IgG2 controle). Esses dados são compatíveis com um mecanismo terapêutico antiangiogênico em que os anticorpos direcionados à angiopoietina inibem a proliferação de células endoteliais de tumor in vivo. EXEMPLO 6 Titulação de Dose do H4L4 em Xenoenxertos de Tumor de Colo205

O anticorpo H4L4 foi selecionado para uma análise mais extensa, explorando-se a dose-dependência da inibição do crescimento do tumor mediada por H4L4. Os animais receberam injeção IP com H4L4 duas vezes por semana, com início no 14° dia, em doses variando de 3 μg a 300 μg. AMG 386 em dose biológica ideal de 14 μg (SC), duas vezes por semana, foi incluída como controle positivo. Conforme mostrado na Figura 4, todas as doses de H4L4 inibiram significativamente o crescimento do tumor e a carga tumoral viável (p<0,0001), com uma OBD de ~ 30 μg na análise de carga tumoral viável (Figura 5).. EXEMPLO 7 Efeito do H4L4 na Proliferação de Células Endoteliais de Tumor de Colo205 In Vivo

Em um experimento paralelo, camundongos portadores de tumor de Colo205 com volume tumoral de aproximadamente 450 mm3 foram tratados com uma dose única de H4L4, AMG 386 ou IgG2 controle, por 72 horas e, em seguida, analisados conforme a Figura 3. Conforme mostrado na Figura 6, o tratamento com H4L4 inibiu significativamente a proliferação de células endoteliais de forma dose- dependente com uma OBD de 30 μg. EXEMPLO 8

Farmacocinética de H4L4, H6L7, H4L11 e 536LC1 em Camundongos, Ratos e Macacos Cynomologus A farmacocinética (PK) de H4L4, H6L7, H4L11 e 536LC1 foi caracterizada em camundongos CD-1 após dose única intravenosa (IV) ou administração intraperitoneal (IP). A PK de H4L4 e H6L7 também foi caracterizada em ratos Sprague-Dawley e macacos cynomolgus após administração de dose única IV.

Após dose única IV ou administração IP a camundongos, a exposição ao H4L4 mostrou aumentar aproximadamente a dose proporcional na faixa de 0,1 a 10 mg/kg (Tabela 4). A meia- vida terminal média (t1/2,z), a depuração (CL) e o volume de distribuição no estado estacionário (Vss) foi de 207 horas, 0,43 mL/hr/kg e 128 mL/kg, respectivamente. A biodisponibilidade (%F) após a administração IP foi superior a 90% em todos os grupos de dose. Em contraste, H6L7, H4L11 e 536LC1 exibiram PK não linear em camundongos com aumento de exposição mais que proporcional à dose de 0,1 a 10 mg/kg. A exposição de H6L7 em camundongos e macacos também aumentou mais que proporcionalmente à dose após dose única IV de 0,1 a 10 mg/kg.

Em contraste com o seu perfil PK linear em camundongos, H4L4 exibiu PK não linear de ratos e macacos. O tempo de residência média (MRT) em ratos variou de 57 a 217 horas; a CL variou de 0,3 a 1,4 mL/hr/kg; o Vss variou de 57 a 68 mL/kg. Em macacos, o MRT variou de 40 a 163 horas; a CL variou de 0,4 to 1,9 mL/hr/kg; o Vss variou de 49 a 75 mL/kg. A PK do H4L4 também foi avaliada em camundongos atímicos portadores de xenoenxertos de tumor de Colo205 em um estudo farmacológico a 3, 10, 30, 100 ou 300 μg/dose/camundongo, com administração IP duas vezes por semana durante 4 semanas. A exposição ao soro do H4L4 aumentou quase proporcionalmente à dose, conforme avaliado pelo soro nas concentrações. A PK do H4L4 em camundongos atímicos foi similar à observada em camundongos CD-1, e a PK não mostrou alteração ao longo do tempo. Tabela 9 Parâmetros PK de H4L4 e H6L7 em Espécies Pré-Clínicas

EXEMPLO 9 Neutralização da Angiopoietina-1 como Mediador da Supressão Contexto-Dependente da Angiogênese e do Crescimento Tumoral

Enquanto a Angiopoietina-2 (Ang2) é um mediador chave na angiogênese pós-natal, o papel da Angiopoietina-1 (Ang1) nesse contexto é menos definido. Para investigar a função pós-natal da Ang1, desenvolvemos pepticorpos (proteínas de fusão peptídeo-Fc) potentes e seletivos que inibem a interação entre a Ang1 e seu receptor, o Tie2. Mostramos que o antagonismo seletivo da Ang1 não possui efeito independente em modelos de doenças associadas à angiogênese (câncer e retinopatia diabética), embora possa induzir a atrofia ovariana em ratos normais jovens e inibir a angiogênese folicular ovariana em um modelo de ovulação induzida por hormônios. Surpreendentemente, a atividade de inibidores de Ang1 é aparente em alguns modelos de doenças quando em combinação com inibidores de Ang2. A inibição dupla de Ang1 e Ang2 suprime cooperativamente a angiogênese folicular ovariana e o crescimento do enxerto tumoral; no entanto, a inibição de Ang1 não aumenta a atividade de inibição de Ang2 na supressão da proliferação de células endoteliais de tumor, da angiogênese corneal e da angiogênese da retina induzida por oxigênio. Em nenhum caso a inibição de Ang1 mostrou 1) conferir atividade superior à atividade de inibição de Ang2 ou à atividade de inibição dupla de Ang1/Ang2 ou 2) antagonizar os efeitos da inibição de Ang2. Esses resultados indicam que a Ang1 desempenha uma função contexto-dependente na promoção da angiogênese pós-natal e na patologia associada à angiogênese.

A Ang1 desempenha um papel importante na angiogênese do desenvolvimento, mas a sua função na neovascularização pós-natal é menos definida. A Ang1 mostrou mediar os efeitos pró e antiangiogênicos em vários contextos pós- natais. Para investigar a função da Ang1 pela inibição da Ang1 endógena, desenvolvemos pepticorpos neutralizadores de Ang1 e os testamos isoladamente ou em combinação com inibidores de Ang2 em modelos pré-clínicos de angiogênese pós-natal.

Geramos pepticorpos neutralizadores de Ang1 para investigar o papel funcional da Ang1 na angiogênese. As bibliotecas peptídicas de “phage display” foram selecionadas para identificar peptídeos que ligam a Ang1, mas não a Ang2. Os clones resultantes foram convertidos em pepticorpos, expressando peptídeos nas bactérias E. coli em fusão com a porção Fc da IgG1 humana. Os pepticorpos foram triados por ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) e por ensaio de fluorescência homogênea com resolução temporal (HTRF) para detectar a sua capacidade de neutralização da interação entre Tie2 e as angiopoetinas. Um desses pepticorpos foi amadurecido com afinidade para aumentar a sua capacidade de antagonizar a Ang1, e um pepticorpo resultante, o mL4-3, foi selecionado para os presentes estudos. O mL4-3 apresentou potencial similar contra vários ortólogos de Ang1, e mostrou seletividade superior a 40.000 vezes para Ang2 (Tabelas 10 e 11). Também são mostrados na Tabela 10 dois pepticorpos descritos anteriormente: o AMG 386 [também conhecido como 2xCon4(C)] e o L1-7(N). O L1-7(N) é um inibidor de Ang2 bastante potente e seletivo, e o AMG 386 é um inibidor duplo de Ang1 e Ang2. Os perfis farmacocinéticos do mL4-3 em roedores eram aceitáveis para a dosagem SC diária-semanal (Tabela 3).

O mL4-3 pode ser usado como um reagente para examinar a função da Ang1 in vivo. Para avaliar se o mL4-3 apresentou capacidade para sequestrar seletivamente a Ang1 in vivo, mL4-3, L1-7(N) e Fc foram administrados por via SC aos camundongos, seguido de um desafio IV com Ang1 recombinante. A Ang1 induziu a fosforilação do Tie2 no endotélio pulmonar do camundongo (aproximadamente 5 vezes), um efeito que poderia ser evitado por mL4-3, mas não por L1-7(N) ou Fc (Figura 7).

Em seguida, quisemos determinar se o mL4-3 apresentou capacidade para neutralizar a Ang1 endógena em um contexto em que a Ang1 era conhecida por desempenhar um papel fisiologicamente relevante. Estudos de nocaute de genes do desenvolvimento demonstraram que a deleção da Ang1 reduz o tamanho cardíaco e a dobra do endocárdio em embriões. Em uma tentativa de replicar farmacologicamente esse fenótipo, o mL4-3 foi administrado aos camundongos gestantes no início e no meio da gestação. Os embriões foram colhidos no dia embrionário 12,5, no momento em que a letalidade foi observada nos embriões de camundongo nulos em Ang1. A avaliação farmacocinética de lisatos de embriões de camundongo demonstrou um nível de vale médio do mL4-3 de 3,0 μg/g de tecido, confirmando que o mL4-3 foi capaz de atravessar a placenta. A análise histológica revelou tamanho cardíaco e trabeculação reduzidos, similares, porém menos drásticos em comparação com o observado em embriões nulos em Ang1 (Figura 8). O fenótipo menos pronunciado dos embriões mL4-3 tratados pode ser consequência da exposição não-ideal de embriões ML4-3 e do sequestro incompleto da Ang1. No entanto, o ML4-3 induz claramente defeitos cardíacos embrionários que fenocopiam os do nocaute genético da Ang1 em camundongos, confirmando a utilidade do ML4-3 como um reagente para a investigação da função da Ang1 in vivo.

O antagonismo da Ang1 aumenta o antagonismo da Ang2 na supressão do crescimento tumoral. Em um relatório anterior, demonstramos que, administrados sistemicamente, L1-7(N) e AMG 386 foram capazes de inibir o crescimento de xenoenxertos de tumor de Colo205 implantados em ratos atímicos. Nesse estudo, os efeitos antitumorais do AMG 386 mostraram-se modestamente superiores aos do L1-7(N) (P=0,006). Para confirmar que a inibição dupla de

Ang1/Ang2 confere maior supressão do crescimento tumoral que a inibição de Ang2 isoladamente, um experimento semelhante foi realizado, porém dessa vez, os grupos tratados com mL4-3 ou com uma combinação de mL4-3 e L1-7(N) também foram testados (Figura 9). O grupo tratamento com AMG 386 e o grupo tratamento combinado com mL4-3/L1-7(N) mostraram eficácia antitumoral comparáveis; além disso, ambos os grupos exibiram eficácia superior à mediada por L1-7(N) ou mL4-3 isoladamente. De fato, o mL4-3 não apresentou nenhum efeito discernível como agente único de crescimento tumoral, indicando que a combinanação do antagonismo da Ang2 com o antagonismo da Ang1 pode ter revelado o efeito antitumoral da inibição da Ang1. Replicações adicionais desses experimentos confirmaram que o 386 AMG e a combinação mL4-3/L1-7(N) mediaram maior supressão do crescimento tumoral em comparação com o L1- 7(N) isoladamente (dados não mostrados). No entanto, em uma minoria de casos, essas diferenças não alcançaram significância estatística, refletindo, possivelmente, a natureza sutil da vantagem incremental conferida pela inibição dupla de Ang1/Ang2 sobre a inibição seletiva da Ang2. A inibição seletiva da Ang1, isoladamente, não mostrou nenhum efeito antitumoral em qualquer dos experimentos em que foi testada (Figura 9 e dados não mostrados).

O antagonismo da Ang2, e não o antagonismo da Ang1, inibe a proliferação de células endoteliais do tumor, angiogênese corneal e angiogênese da retina. Mostramos anteriormente que a inibição dupla de Ang1/Ang2 foi capaz de suprimir a proliferação de células endoteliais do tumor de Colo205 in vivo. Para investigar se esse efeito foi conferido pela inibição da Ang1, pela inibição da Ang2 ou por uma combinação de ambas, os camundongos portadores de tumor de Colo205 foram tratados com mL4-3, L1-7(N), mL4- 3/L1-7(N) ou AMG 386. Como na leitura volumétrica do tumor descrita na seção anterior, o mL4-3 não apresentou efeito como agente único na proliferação de células endoteliais do tumor, enquanto o efeito do L1-7(N) foi inibitório (Figura 10A). Curiosamente, entretanto, a inibição dupla de Ang1/Ang2 não conferiu maior efeito de proliferação de células endoteliais em comparação com a inibição da Ang2 isoladamente (Figura 10A), uma observação que foi reproduzida repetidamente (dados não mostrados), e que contrasta com os efeitos cooperativos aparentes da inibição combinada de Ang1/Ang2 no crescimento do tumor de Colo205. Essa dissimilaridade sugere que a supressão da proliferação de células endoteliais é apenas um componente subjacente à inibição do crescimento tumoral mediada pelo antagonismo da angiopoietina.

Esses agentes foram testados em seguida, em dois modelos de angiogênese ocular, um envolvendo a córnea e o outro envolvendo a retina. A córnea é tipicamente avascular, mas a angiogênese patológica pode ocorrer na córnea secundariamente a condições como a ceratite e a rejeição do transplante de córnea. Modelos de angiogênese corneal induzidos por VEGF e bFGF (fator de crescimento básico de fibroblastos) foram usados para testar as funções de antagonismo de Ang1 e Ang2 na formação neovascular. Conforme observado na proliferação de células endoteliais, a angiogênese corneal mostrou ser dependente de Ang2, mas não de Ang1 (Figuras 10B e 10C). Pode-se chegar à mesma conclusão na avaliação dos pepticorpos antagonistas da angiopoietina em um modelo de retina dependente de Tie2 em que a neovascularização foi induzida por alterações na tensão de oxigênio ambiente (Figura 10D). Dessa maneira, em três contextos pré-clínicos (proliferação de células endoteliais, angiogênese corneal, angiogênese da retina), a inibição da Ang2 suprimiu drasticamente a formação neovascular, enquanto a inibição da Ang1 não apresentou nenhum efeito isoladamente ou em combinação com a inibição da Ang2.

A inibição seletiva de Ang1 ou Ang2 induz a atrofia ovariana, mas não o espessamento da placa epifisária. Para avaliar os efeitos da inibição da angiopoietina em animais normais, os ratos foram tratados sistemicamente com mL4-3, L1-7(N) ou AMG 386 por um mês. O AMG 386, assim como os antagonistas do VEGF, mostrou induzir o espessamento da placa epifisária e a atrofia ovariana, efeitos considerados consequências com base em mecanismo da terapia antiangiogênica. No presente estudo, o AMG 386 provocou espessamento da placa epifisária em todos os animais tratados, enquanto, notavelmente, L1-7(N) e mL4-3 não conseguiram alterar a morfologia da epífise em nenhum dos camundongos (Tabela 13). Portanto, a indução do espessamento da placa epifisária mostra necessidade de inibição de Ang1 e Ang2. Em flagrante contraste, todos os três pepticorpos produziram atrofia ovariana com taxas de incidência semelhantes, indicando que a inibição seletiva de Ang1 ou Ang2 é suficiente para induzir a atrofia ovariana. Supressão Cooperativa da Angiogenêse Folicular Ovariana pelos Inibidores de Ang1 e Ang2

Para compreender melhor os efeitos da inibição da angiopoietina no ovário, empregamos um modelo induzido por hormônio de angiogênese folicular ovariana que permitiu a avaliação controlada da neovascularização em camundongos que nunca haviam ovulado. Nesse modelo, o soro de égua gestante (PMS) e a gonadotrofina coriônica humana (HCG) foram usados para induzir a ovulação rápida e sincronizada em folículos múltiplos (Figura 11). Os camundongos foram tratados sistemicamente com controle Fc, mL4-3, L1-7(N) ou uma combinação de mL4-3/L1-7(N) para determinar os efeitos desses agentes na formação neovascular da transformação de folículos de Graaf. Duas réplicas identicamente projetadas desse experimento foram realizadas em dias diferentes e, notavelmente, ambos produziram perfis de atividade quase idênticos em relação ao percentual de inibição da área do vaso sanguíneo (réplica 1, réplica 2): L1-7(N) (8%,11%), mL4-3 (15%,14%), mL4-3/L1-7(N) (24%,26%). Todos os grupos de agente único e pepticorpo de combinação, com exceção do grupo L1-7(N) no Experimento 1, mediaram a inibição estatisticamente significativa da angiogênese em relação ao controle Fc (P<0,05) (Figura 11). Dessa maneira, tanto a inibição da angiogênese ovariana como a indução da atrofia ovariana podem ser provocadas pela inibição de Ang1, Ang2 ou ambas, em consonância com a noção de que a atrofia ovariana observada foi consequência do mau desenvolvimento neovascular.

Demonstramos que a inibição da Ang1 desempenha uma função contexto-dependente na supressão da angiogênese em modelos de doenças pré-clínicos e em animais normais. No útero, a inibição farmacológica da Ang1 fenocopiou parcialmente a ablação genética da Ang1, em consonância com o importante papel da Ang1 na angiogênese do desenvolvimento. No pós-parto, o antagonismo seletivo da Ang1 inibiu a angiogênese ovariana e induziu a atrofia ovariana, efeitos que também podem ser alcançados pela inibição da Ang2 isoladamente ou pela inibição de ambas a Ang1 e a Ang2. No entanto, em modelos de doenças pós- natais, a inibição da Ang1 mostrou pouco efeito isoladamente, embora sua atividade biológica tenha sido aparentemente revelada em alguns contextos, quando combinada com a supressão da Ang2. O mecanismo subjacente à dependência diferencial da Ang1 nesses contextos ainda necessita ser determinado.

O ovário, em virtude do seu papel no ciclo reprodutivo, é um dos poucos órgãos de que sofre angiogênese normal em adultos. Com base nos padrões de expressão de Ang1 e Ang2 em ovários de ratos em ovulação induzida por hormônios, foi proposto que a Ang2 desempenha um papel precoce na invasão vascular e a Ang1 desempenha um papel tardio no amadurecimento dos vasos recém-formados. Mediante essa hipótese, Ang2 e Ang1 desempenham funções opostas, em que, inicialmente, a Ang2 substitui a Ang1 por Tie2, resultando na desestabilização vascular e na angiogênese. Esse estado de plasticidade é posteriormente revertido quando a Ang1 expulsa a Ang2 do receptor para restabelecer a quiescência e a estabilidade vascular. Em constraste com esse modelo, os dados do presente estudo sugerem que ambas a Ang1 e a Ang2 desempenham papéis pró- angiogênicos no ovário.

No modelo de xenoenxerto de tumor de Colo205, o antagonismo de Ang1 e Ang2 mediou maior supressão do tumor em comparação com o resultado alcançado pela inibição de Ang1 ou Ang2 individualmente, indicando que esse modelo é dependente de ambas as angiopoetinas. No entanto, no mesmo modelo, apenas a inibição da Ang2 apresentou capacidade para modular negativamente a proliferação de células endoteliais de tumor, sugerindo que a Ang1 não está envolvida nessa função. O que explica, nas duas ocorrências, as diferentes dependências da Ang1? Uma possibilidade é que a inibição da Ang1 tenha um efeito direto nas células tumorais. Isso parece improvável, no entanto, dado que o AMG 386, um inibidor duplo de Ang1 e Ang2, não apresenta efeito sobre o crescimento de células de tumor de Colo205 cultivadas in vitro. Uma segunda possibilidade é que o antagonismo da Ang1 desempenhe um papel antiangiogênico, que não é conferido pela inibição da proliferação de células endoteliais, e sim, por mecanismos que possam ter efeito sobre funções como a migração ou invasão de células endoteliais. Essa explicação pode ser aplicável se a Ang1 e a Ang2 tiverem mediado qualitativa ou quantitativamente diferentes sinais por meio do Tie2, ou se a Ang1 tiver sinalizado por meio de receptores adicionais que não apresentaram sensibilidade à Ang2. Uma terceira possibilidade é que os sinais da Ang1 pelo Tie2 em células não endoteliais, como os monócitos com expressão de Tie2 (TEMs). Os TEMs são recrutados nos tumores, onde se aglomeram ao redor de neovasos. A ablação seletiva dos TEMs em camundongos portadores de tumor suprime a angiogênese do tumor e inibe o crescimento tumoral, tendo-se postulado que os TEMs promovem a angiogênese do tumor por meio de sinais parácrinos que estimulam a neovascularização. É possível que a Ang1 estimule os TEMs para a liberação de citocinas pró-angiogênicas diferentes das angiopoetinas. Nesse contexto, a inibição da Ang1 pode apresentar um efeito antineovascular indireto que pode complementar o efeito antiangiogênico direto da supressão da Ang2.

Em contraste com os efeitos sutil e contexto- dependente da inibição da Ang1, a inibição da Ang2 mediou constantemente os efeitos que foram equivalentes ou quase equivalentes aos efeitos conferidos pelo antagonismo combinado de Ang1 e Ang2, indicando que a Ang2 pode ser a angiopoietina dominante envolvida na angiogênese pós-natal. A Ang1 mostrou ser a angiopoietina dominante envolvida na angiogênese pré-natal, sugerindo uma mudança na dependência desses dois fatores próximo ao momento do nascimento. Nossos inibidores não antagonizam a Ang4, mas a relevância funcional deste fator não é evidente, dado o seu padrão de expressão restrito ao pulmão.

A Ang1 e a Ang2 mostraram desempenhar papéis funcionais semelhantes e opostos em vários sistemas in vitro e in vivo. A incapacidade de fornecer conclusões consistentes sobre esse aspecto em várias publicações pode ser em parte uma consequência das diferentes condições em que a questão foi examinada. Essas diferenças incluem a evaliação de 1) sistemas in vitro versus in vivo, 2) angiogênese pré-natal versus pós-natal, 3) leitos vasculares variantes, 4) angiogênese patológica versus normal, e 5) delineamentos experimentais com ganho de função versus perda de função. Essa diferença final pode ser particularmente importante, assim como a adição de fatores exógenos a um sistema modelo pode ser um meio menos relevante fisiologicamente para elucidar a função de remoção de fatores endógenos. Possivelmente, os experimentos informativos mais publicados nesse aspecto são aqueles em que a Ang1 e a Ang2 foram excluídas geneticamente na linhagem germinativa de roedores. Esses estudos fornecem conhecimentos significativos sobre os papéis da Ang1 e da Ang2 no desenvolvimento. No entanto, é mais difícil examinar geneticamente a função pós-natal in vivo da Ang1 e da Ang2 sem a disponibilidade dos sistemas nocaute condicionais; o camundongo nocaute com Ang1 constitutiva morre no útero (como ocorre com o camundongo nocaute com Ang2 constitutiva em alguns “backgrounds” genéticos de cepas), e o fenótipo pós-natal de camundongos nocaute com Ang2 sobreviventes pode ser influenciado pelos efeitos residuais da deleção dos genes do desenvolvimento. Usando inibidores farmacológicos de Ang1 e Ang2 para examinar as funções pós-natais de Ang1 e Ang2 in vivo, exploramos com detalhes essas questões. Os resultados do presente estudo demonstram que a Ang1 e a Ang2 não são funcionalmente opostas em sistemas pós-natais, e que, em alguns casos, mostram agir cooperativamente.

A angiogênese patológica está associada a níveis de angiopoietina alterados em uma série de doenças, incluindo câncer, retinopatia diabética, degeneração macular, artrite reumatoide, osteoartrite e psoríase. As intervenções direcionadas à angiopoietina nessas indicações terapêuticas podem oferecer benefício clínico. Os dados aqui apresentados sugerem que, em alguns contextos, a inibição combinada de Ang1 e Ang2 pode oferecer eficácia terapêutica superior à mediada pelo direcionamento da Ang2 isoladamente. Métodos

Seleção por "Phage Display" de peptídeos com ligação à Ang1. Três bibliotecas de fagos filamentosos, TN8-IX (5 x 109 transformantes independentes), TN12-I (1,4 x 109 transformantes independentes) e Linear (2,3 x 109 transformantes independentes) (Dyax Corp., Cambridge, MA), foram usadas para selecionar os fagos com ligação à Ang1. Após a seleção negativa na estreptavidina Dynabeads (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) incompleta bloqueada com albumina de soro bovino (BSA) a 2% ou grânulos carregados com Ang2 biotinilada (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN), os fagos restantes foram incubados com grânulos carregados com Ang1 biotinlada (R&D Systems, Inc.). Após a lavagem completa, os fagos de cada ciclo de seleção foram eluídos de forma inespecífica com uma solução de trietilamina (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) a 100 mM. Os fagos eluídos foram amplificados em cepas XL-1 Blue MRF’ de E. coli, purificados por precipitação e, então, usados no próximo ciclo de seleção.

Após três rodadas de seleção, os clones de fagos individuais foram isolados e analisados por “phage ELISA” e sequenciamento de DNA. Em resumo, a proteína Ang1 foi revestida em placas Maxisorp de 96 poços (Nunc brand,

Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY) e bloqueada com PBST (PBS com Tween-20 a 0,05%) contendo leite seco a 4%. Os fagos sobrenadantes foram incubados nos poços e os fagos ligados foram detectados com um anticorpo anti-M13 conjugado à HRP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Para verificar a reatividade cruzada da Ang2 ou estreptavidina, placas controle foram configuradas de maneira semelhante. Os resultados do ensaio ELISA e os dados do sequenciamento de DNA foram usados como critérios para selecionar sequências de peptídeos de expressão em formato de pepticorpos. Os pepticorpos foram avaliados em um ensaio de HTRF, e vários deles foram selecionados para a maturação de afinidade.

A maturação de afinidade dos peptídeos foi realizada por meio da geração e da seleção de bibliotecas de “phage display“ com dopagem por nucleotídeos. Bibliotecas com mais de 1 x 109 transformantes independentes foram obtidas. Essas bibliotecas específicas foram selecionadas por meio de um procedimento similar ao usado para selecionar as bibliotecas primárias.

Expressão e purificação de pepticorpos. O pepticorpo mL4-3 foi expresso e purificado conforme descrito em Oliner, J., et al. 2004., Cancer Cell 6:507-516. A sequência de aminoácidos do mL4-3 é conforme segue, onde Fc, em negrito e itálico, denota a sequência de Fc da IgG1 humana, conforme descrito anteriormente em Oliner, J., et al. 2004., Cancer Cell 6:507-516: MREWTEEMQVIFDAMMFGPRNDRGGSGSATGSGSTASSGSGSATHREWTEEMQV IFDAMMFGPRNDRGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 47)

A sequência de aminoácidos da porção Fc do pepticorpo mL4-3 é conforme segue (do amino-terminal ao carboxila- terminal): DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 48)

Ensaio de neutralização HTRF para angiopoietina:Tie2. Estreptavidina marcada com európio (LANCE reagent, PerkinElmer Inc., Boston, MA) e Ang1 ou Ang2 humana biotinilada (R&D Systems, Inc.) foram misturadas em tampão HTRF (Tris-HCl a 50mM, pH 7,5, NaCl a 100 mM, Tween 20 a 0,05%, BSA a 0,1%) e incubadas em temperatura ambiente, em ambiente escuro, por 30 minutos, em um agitador. Volumes iguais desta mistura e de pepticorpos ou Fc diluídos em série foram misturados e incubados por 1 hora em temperatura ambiente. Volumes iguais de Tie2-Fc conjugado com aloficocianina (Tie2-APC) (Prozyme, San Leandro, CA) e da mistura acima foram misturados e incubados por 2 horas em temperatura ambiente. A concentração final dos reagentes no ensaio foi de 4nM de estreptavidina-európio, 2nM de Ang1 ou Ang2 biotinilada e 5nM de Tie2-APC. Os pepticorpos foram diluídos em série, de 10.000nM a 0,5nM ou de 100nM a 0,005nM, para gerar curvas de titulação completas. A neutralização da interação angiopoietina:Tie2 foi medida pela transferência de energia reduzida entre a APC e o európio, e foi quantificada por um leitor de placas Rubystar (BMG Labtechnologies, Offenberg, Germany). O potencial de neutralização de angipoietina/Tie2 foi determinada pelo cálculo do percentual de inibição da diluição de cada pepticorpo em referência aos controles com inibição máxima (sem angiopoietina na mistura de ensaio) e mínima (sem pepticorpos na mistura de ensaio). Os valores IC50 foram calculados pela plotagem do percentual de inibição, usando-se XLfit4, onde fit = A+((B- A)/(1+((C/X)AD))) (IDBS, Guildford, UK). Ensaio de neutralização ELISA para angiopoietina:Tie2.

Placas de microtitulação de 96 poços foram revestidas com um painel de angiopoetinas recombinantes em meios condicionados de células 293T (DMEM/BSA a 50ug/ml) a 37°C por 1 hora. Os meios condicionados foram usados com concentrações de angiopoietina que conferiram 70% da ligação máxima atingível a 1nM de hTie2-Fc (hTie2-Fc recombinante, Catálogo # 313-TI, R&D Systems Inc.). As placas foram lavadas três vezes com PBS/Tween-20 a 0,1% e, então, bloqueadas por 2 horas, em temperatura ambiente, com PBS/BSA a 5%. A solução de bloqueio foi removida sem a lavagem das placas. mL4-3 ou Fc diluído em série em uma solução de Tie2-Fc a 1 nM/BSA a 1%/PBS foi adicionado às placas revestidas de angiopoietina, que foram incubadas durante a noite em temperatura ambiente e, então, lavadas com PBS/Tween-20 a 1%. Um anticorpo anti-Tie2 derivado de camundongo (Catálogo # 557039, BD Pharmingen Inc., San Jose, CA) foi adicionado a cada poço em uma concentração final de 1 ug/ml e incubado por 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 3 vezes com PBS/Tween-20 a 0,1%. O anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo-HRP (anticorpo de cabra anti-camundongo conjugado com peroxidase de raiz forte, Catálogo # 31432, Pierce, Rockford, IL) foi adicionado a uma diluição de 1:10.000 em PBS/BSA a 1% a cada poço, e as placas foram incubadas por 1 hora em temperature ambiente. As placas foram lavadas três vezes com PBS/Tween-20 a 0,1% antes da adição de substrato TMB (SureBlue Reserve TMB, Catálogo#53- 00002, KPL, Gaithersburg, Maryland), e a densidade óptica a 650 nM foi medida em um leitor de placas (SpectraMax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). O grau de neutralização (IC50) da angiopoietina:Tie2 foi determinado por comparação em uma curva padrão do Tie2 (a atividade de ligação do Tie2 diluído em série na ausência de um competidor) usando-se o software XLfit. Estudos com animais. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Amgen Animal Care and Use Committee e atendem aos padrões requeridos pela Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care.

Avaliação farmacocinética. Três camundongos CD-1 receberam injeção SC única de 3,2 mg/kg de mL4-3 e dois ratos Sprague-Dawley receberam injeção IV única de 10 mg/kg de mL4-3. As amostras de sangue foram coletadas dos camundongos em no máximo 274 horas e dos ratos em no máximo 336 horas para avaliação farmacocinética sérica. As concentrações de mL4-3 nas amostras de soro de cada espécie foram medidas por um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA). As placas de poliestireno de 96 poços foram revestidas com Ang1 humana, seguido da incubação com amostras de soro contendo mL4-3. Após a lavagem para a remoção de quaisquer substâncias não ligadas, um anticorpo monoclonal anti-IgG1 de camundongo marcado com peroxidase de raiz forte foi adicionado aos poços. Após uma etapa de lavagem para a remoção de quaisquer anticorpos monoclonais não ligados, o substrato de peroxidase-TMB foi adicionado aos poços. As unidades de densidade óptica medidas entre 450-650nm foram convertidas em concentrações pela comparação com uma curva padrão simultaneamente analisada.

Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados pela análise não compartimental dos dados individuais de tempo da concentração sérica (WinNonlin Professional, versão 3.3; Pharsight Corp, Mountain View, CA). A meia-vida da fase terminal (ti/2) foi calculada como ti/2= ln(2)/Àz, onde Àz é a constante da taxa de eliminação terminal de primeira ordem estimada via regressão linear da fase de declínio logarítmico linear terminal. A área sob a curva de tempo da concentração sérica (AUC0-last) foi estimada pelo método trapezoidal linear/logarítmico do tempo 0 ao tempo da última concentração quantificável (Clast). A AUC0-inf foi estimada do tempo 0 ao infinito como AUC0-inf = AUC0-last + Clast/Àz. Os valores de AUC0-inf foram normalizados para uma dose de i mg/kg.

Como as propriedades farmacocinéticas de mL4-3, Li-7 e AMG 386 apresentaram desigualdade, os níveis de dose e posologias de cada agente foram selecionados, quando possível, para atingir concentrações séricas Cmin equimolares no estado estacionário nos estudos farmacológicos.

Administração de mL4-3 a camundongos gestantes. Dois grupos de seis camundongos fêmeas i29/SV foram fecundadas por machos C57BL/6. As fêmeas gestantes receberam uma dose de 300 mg/kg de controle Fc ou mL4-3 via administração SC nos dias gestacionais E4,5, E7,5 e Eii,5. Os conceptos (embriões e placentas) foram removidos no dia E12,5, avaliados para detecção de anomalias significativas e fixados por imersão em IHC zinco (mL4-3 tratado, n=10; controle Fc tratado, n=10) ou em solução de Bouin (mL4-3 tratado, n=5; controle Fc tratado, n=6). Os tecidos incluídos em parafina foram seccionados em série em intervalos de 50 μm no coração (embriões em orientação longitudinal e transversal) e no meio da placenta. As secções seriadas de cada intervalo foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E) ou coradas por um processo convencional de imunohistoquímica indireta usando-se anticorpo policlonal anti-CD31 (anticorpo monoclonal de rato anticamundongo MEC 13.3, BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) para marcar especificamente os vasos sanguíneos. Os critérios para o registro das mudanças foram estabelecidos pela avaliação das secções com uma previsão do tratamento. Posteriormente, a gravidade da lesão foi rapidamente classificada usando-se uma escala de níveis (mínima, leve, moderada ou acentuada) e um paradigma analítico cego. Esses dados patológicos ordinais foram analisados por meio do teste do qui-quadrado contido no pacote de software estatístico JMP (v.5.1; SAS Institute Inc., Cary, NC). Um embrião de cada progenitora gestante coletado no dia E12,5 foi analisado por ELISA usando-se a Ang1 humana como reagente de captura e o anticorpo monoclonal anti-IgG1 de camundongo marcado com peroxidase de raiz forte como reagente de detecção.

Ensaio de fosforilação do Tie2. O efeito dos inibidores seletivos da angiopoietina na fosforilação do Tie2 induzida por Ang1 nos pulmões dos camundongos foi conduzido conforme descrito (Hodous, B.L., et al. 2007., J. Med. Chem 50:611-626. Em resumo, os camundongos atímicos CD-1 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) foram tratados por via SC uma vez ao dia durante 23 dias com controle Fc (20 mg/kg), mL4-3 (20 mg/kg) ou L1-7(N) (2 mg/kg). Aos camundongos (n=3 por grupo) foi administrado, por injeção IV, 12 μg de Angl recombinante (R&D Systems Inc.). Após quinze minutos, os pulmões do camundongo foram colhidos e os níveis de Tie2 fosforilado foram determinados por análise de imunoprecipitação de Western Blot. A análise estatística foi realizada por meio da análise de variância (ANOVA), seguida do teste post hoc de Fisher, usando-se o software Statview 5.0.1 (SAS Institute Inc.). Os resultados são expressos como erro padrão ± médio (SE). Modelos de xenoenxerto de tumor. Camundongos fêmeas atímicos CD1 com oito a dez semanas de idade (Charles River Laboratories) foram usados em todos os experimentos. Os camundongos receberam injeção SC contendo 2 x 106 células de Colo205 em Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) com um terço do volume. Os pepticorpos ou controle Fc foram administrados por injeção SC uma vez que os tumores foram estabelecidos. O AMG 386 foi dosado duas vezes por semana; os outros pepticorpos e o controle Fc foram dosados uma vez ao dia. Quando necessário, a proteína de controle Fc foi adicionada aos grupos tratamento para coincidir com a quantidade total de proteínas fornecida no grupo combinação (5,2 mg/kg). As medidas do tumor e os pesos corporais foram registrados duas vezes por semana. Todos os estudos tumorais foram realizados de maneira cega. O volume do tumor foi calculado como comprimento x largura x altura em mm3. Os resultados são expressos na forma de erro padrão ± médio (SE). A análise estatística foi realizada por meio da análise de medidas repetidas de variância, seguida do teste post hoc de Scheffé, usando-se o software StatView 5.0.1 (SAS Institute Inc.).

Ensaio de proliferação de células endoteliais de tumor. A proliferação de células endoteliais de tumor foi testada conforme descrito anteriormente (Oliner, J., et al. 2004., Cancer Cell 6:507-516). Resumidamente, os camundongos portadores de tumor de Colo205 foram tratados sistemicamente com pepticorpos por 72 horas e receberam implantes de bombas osmóticas contendo 3 mg/mL de BrdU, 16 horas antes da eutanásia. Os tumores foram colhidos, dissociados, fixados e corados para permitir a determinação da incorporação da BrdU nas células endoteliais do tumor. A análise estatística foi realizada por meio de teste t não pareado. Modelo de angiogênese corneal. Os estudos da angiogênese induzida por VEGF e bFGF foram realizados em ratos fêmeas CD (n=8 por grupo), conforme descrito em Coxon, A., et al. Arthritis Rheum 46:2604-2612, 2002. A inibição da interleucina-1, e não do fator de necrose tumoral, suprime a neovascularização em modelos de ratos da angiogênese corneal e da artrite adjuvante. O tratamento com Fc (60 mg/kg), L1-7(N) (5 mg/kg), mL4-3 (60 mg/kg), ou com uma combinação de L1-7(N) e mL4-3 (nas mesmas doses usadas nos grupos de agente único) foi iniciado no dia anterior à cirurgia e continuou nos dias 3 e 6. No dia 8, o estudo foi encerrado e as córneas foram fotografadas conforme descrito (Oliner, J., et al. 2004., Cancer Cell 6:507-516). Em cada imagem da córnea, o número de vasos sanguíneos que intercepta o ponto médio entre o disco implantado e o limbo foi contado. Todas as avaliações foram realizadas de maneira cega. A significância estatística foi avaliada por ANOVA, seguida do teste post hoc de Fisher.

Neovascularização retinal. A retinopatia isquêmica foi produzida em camundongos C57BL/6J por meio do método descrito por Smith et al., Invest. Ophthalmol Vis Sci 35: 101-111, 1994. Os filhotes no sétimo dia pós-parto (P7) e suas progenitoras foram colocados em uma câmara hiperóxica (75 ± 0,5% de oxigênio) por 5 dias e, então, retornaram ao ar ambiente por mais 5 dias (n=7 filhotes por grupo). A temperatura da câmara foi mantida entre 20°C e 22°C, e o oxigênio foi constantemente controlado por uma unidade de controle de oxigênio (ProOx Modelo P110 acoplado a um sensor de oxigênio Modelo E702 Biospherix Ltd, Redfield, NY). Uma gaiola com filhotes no dia P7 permaneceu em ar ambiente (condição de normóxia). Controle Fc (200 mg/kg), mL4-3 (100 mg/kg), L1-7(N) (100 mg/kg) ou uma combinação de mL4-3/L1-7(N) (100 mg/kg cada) foi administrado por via SC uma vez ao dia durante 9 dias, com início no dia P8. Do dia P8 ao dia P11, as injeções foram administradas por vias de acesso no interior da câmara. No dia P17, os filhotes foram sacrificados, e seus olhos foram removidos e fixados com fixador de Davidson. Os olhos foram então processados em parafina, usando-se métodos padrão. As secções seriadas foram cortadas paralelamente ao eixo óptico em intervalos de 100 μm. Os blocos foram seccionados transversalmente, resultando em 15 ou 16 secções por olho. Todas as secções foram coradas com H&E. Dos 15 ou 16 cortes na série de secções, 10 cortes intermediários consecutivos foram usados nas análises, associando ambos os lados do eixo óptico. Em cada secção, o número de núcleos vasculares (ambos os núcleos endotelial e pericístico) que estavam do lado vítreo da membrana interna limitante foi contado. As contagens de cortes individuais foram registradas e as contagens de todas as dez secções foram somadas em cada animal. Cinco camundongos de cada grupo de estudo foram contados. Todas as contagens foram realizadas de maneira cega, sem o conhecimento das condições do tratamento. A análise estatística foi realizada por ANOVA, seguida do teste post hoc de Fisher.

Angiogênese folicular ovariana. A superovulação foi induzida em camundongos de estudo usando-se a metodologia padrão. Em resumo, 4 camundongos fêmeas C57BL/6J com 4 semanas de idade receberam injeção de 5-7 IU PMS, reiniciando efetivamente o ciclo estral. Após quarenta e oito horas, os camundongos receberam injeção de 5 IU de HCG para induzir a superovulação. As fêmeas foram então pseudocruzadas e permaneceram em estudo por 24 horas. Os camundongos de estudo foram tratados com pepticorpos duas vezes ao dia. A dosagem foi iniciada no momento da injeção inicial de PMS e continuou por dois dias consecutivos, administrando-se a quarta dose concomitantemente com a injeção de HCG. Os camundongos foram sacrificados 48 horas após a injeção de HCG. Os ovários direito e esquerdo foram removidos e fixados em imersão de solução de tris e zinco gelada. Após 48 horas, os ovários foram transferidos para etanol a 70% e processados em parafina, usando-se métodos padrão. Duas secções sequenciais foram cortadas de cada par de ovários e coradas individualmente com H&E ou imunocoradas para endotélio vascular (CD31, anticorpo monoclonal de rato anticamundongo MEC 13.3, BD Biosciences PharMingen), usando-se DAB como cromógeno. Além disso, as secções anti-CD31 IHC foram levemente contracoradas com hematoxilina. Os folículos individuais selecionados para análise foram identificados com base no estado de transformação. Isso foi determinado pela inspeção de tratamento cego das secções com H&E sob baixo potencial. Imagens correspondentes a 10 folículos transformados por animal, quando possível, foram então capturados por ampliação da objetiva de 10x das secções imunocoradas de anti-CD31. A área da secção do folículo foi delineada como uma ROI, e a fração de área positiva para CD31 foi determinada por limiar RGB, usando-se o software de análise de imagem MetaMorph (MetaMorph v6.1, UIC, Downingtown, PA). A análise estatística foi realizada por ANOVA, seguida do teste post hoc de Dunnett.

Avaliação de tecidos normais em ratos tratados. Os pepticorpos foram avaliados em ratos Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) para efeitos sobre os tecidos normais. Os animais receberam injeção IV de 300 mg/kg de AMG 386, L1-7(N) ou mL4, duas vezes por semana, durante 28 dias (n=10 animais por grupo). Na necrópsia programada, um conjunto completo de tecidos foi seccionado, corado e observado para detecção de alterações microscópicas. Tabela 10 As interações angiopoietina:Tie2 são inibidas competitivamente por pepticorpos

Claims (16)

1. Anticorpo monoclonal isolado caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, em que a referida cadeia pesada compreende três CDRs e a referida cadeia leve 26, 34 de HC mais SEQ ID Nos: 23, 27, 33 de LC, (m) SEQ ID Nos: 18, 26, 35 de HC mais SEQ ID Nos: 20, 27, 40 de LC, (n) SEQ ID Nos: 18, 26, 32 de HC mais SEQ ID Nos: 21, 27, 33 de LC, (o) SEQ ID Nos: 18, 26, 35 de HC mais SEQ ID Nos: 24, 27, 33 de LC, (p) SEQ ID Nos: 18, 26, 35 de HC mais SEQ ID Nos: 21, 27, 33 de LC, (q) SEQ ID Nos: 18, 26, 35 de HC mais SEQ ID Nos: 23, 27, 33 de LC, (r) SEQ ID Nos: 18, 26, 34 de HC mais SEQ ID Nos: 20, 30, 33 de LC, (s) SEQ ID Nos: 18, 26, 34 de HC mais SEQ ID Nos: 25, 27, 33 de LC, (t) SEQ ID Nos: 18, 26, 35 de HC mais SEQ ID Nos: 20, 30, 33 de LC, (u) SEQ ID Nos: 18, 26, 34 de HC mais SEQ ID Nos: 20, 27, 40 de LC, e (v) SEQ ID Nos: 18, 26, 34 de HC mais SEQ ID Nos: 20, 31, 33 de LC; em que o referido anticorpo se liga especificamente a pelo menos um dos ligantes Ang1 e Ang2 do receptor Tie 2.

2. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido anticorpo ser uma IgG.

3. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um anticorpo totalmente humano.

4. Fragmento de ligação ao antígeno caracterizado por ser do anticorpo conforme definido na reivindicação 1.

5. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o anticorpo conforme definido na reivindicação 2 em mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável do mesmo.

6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por compreender adicionalmente uma molécula selecionada do grupo que consiste em uma molécula repórter, um polímero solúvel em água, uma região Fc de anticorpo e um agente citotóxico.

7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o referido transportador farmaceuticamente aceitável ser um agente de formulação farmacêutica.

8. Anticorpo monoclonal isolado caracterizado por se ligar especificamente a pelo menos um dos ligantes Ang1 e Ang2 do receptor Tie 2, em que o referido anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve selecionado do grupo que consiste em: (a) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 12; (b) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 12; (c) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência selecionada da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, e SEQ ID NO: 17; (d) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 4 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência selecionada da SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13; (e) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 12; (f) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 6 e uma cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 12; e (g) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência selecionada da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16.

9. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente um domínio constante pesado de IgG e um domínio constante de cadeia leve de IgG.

10. Anticorpo monoclonal isolado que compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve caracterizado por o referido domínio variável de cadeia pesada compreender três CDRs possuindo sequências dadas pelas SEQ ID NOs: 18, 26, 35 e domínio variável de cadeia leve compreendendo três CDRs possuindo as sequências dadas pelas SEQ ID NOs: 23, 27, 33, em que o referido anticorpo se liga especificamente a pelo menos um dos ligantes Ang 1 e Ang 2 do receptor Tie 2.

11. Anticorpo monoclonal isolado que se liga especificamente a pelo menos um dos ligantes Ang 1 e Ang 2 do receptor Tie 2 caracterizado por o referido anticorpo compreender um domínio variável de cadeia pesada possuindo a sequência dada pela SEQ ID NO: 3 e um domínio variável de cadeia leve possuindo a sequência dada pela SEQ ID NO: 10.

12. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por o referido anticorpo ser uma IgG.

13. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por o referido anticorpo ser uma IgG1.

14. Anticorpo monoclonal isolado, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por ser um anticorpo totalmente humano.

15. Fragmento de ligação a antígeno caracterizado por ser do anticorpo conforme definido na reivindicação 10.

16. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o anticorpo conforme definido na reivindicação 12 em mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável do mesmo.

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