DE69334191T2 - Epstein-Barr-Virus verwandte Peptide und Nukleinsäuresegmente - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, welche immunochemisch reaktiv mit Antikörpern gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV) sind, Nukleinsäuresequenzen, welche diese Peptide codieren, monoklonale Antikörper gegen diese Peptide, Zelllinien, welche zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern und Anti-Idiotyp-Antikörpern in der Lage sind. Die Erfindung betrifft ferner immunologische Reagenzien und Verfahren für den Nachweis von EBV oder Anti-EBV-Antikörpern.
  • EBV ist ein ubiquitäres humanes Herpesvirus, welches zuerst in Assoziation mit der afrikanischen (endemischen oder e) Form des Burkitt-Lymphoms (BL) festgestellt wurde. Anschließend wurde das Virus ebenfalls assoziiert mit Nasopharynxkarzinom (NPC) gefunden, und von ihm wurde gezeigt, das auslösende Agents von infektiöser Mononukleose (IM) zu sein. Die Infektion findet üblicherweise während der frühen Kindheit statt, was im Allgemeinen zu einer subklinischen Manifestation, gelegentlich mit schwachen Symptomen, führt. Eine Infektion während der Adoleszenz oder Erwachsenenzeit kann jedoch zu IM führen, die durch das Vorhandensein von atypischen Lymphozyten in der Peripherie charakterisiert ist. Die Hauptmasse dieser Lymphozyten sind T-Lymphozyten; eingeschlossen in ihrer Zahl ist jedoch eine kleine Population von durch EBV infizierten B-Lymphozyten. Die Infektion von B-Lymphozyten kann auch in vitro bewerkstelligt werden. Solche Zellen werden transformiert und proliferieren unbegrenzt in Kultur und sind als "immortalisiert", "latent infiziert" oder "wachstums-transformiert" bezeichnet worden. Wie bislang bekannt ist, bleiben alle Individuen, die mit EBV infiziert wurden, lebenslang latent infiziert. Dies wird von der lebenslangen kontinuierlichen Gegenwart geringer Zahlen an EBV-Genom-positiven transformierten B-Zellen unter den zirkulierenden Lymphozyten des peripheren Bluts und der kontinuierlichen aber periodischen Absonderung von Virus im Oropharynx widergespiegelt.
  • In der großen Mehrheit von Fällen führt eine EBV-Infektion zu einer lymphoproliferativen Erkrankung, welche zeitweilig schwächend sein kann, aber stets gutartig und selbsteinschränkend ist. In gewissen immunsupprimierten Individuen kann das Ergebnis jedoch eine voll ausgeprägte Malignität sein. Dies findet in Individuen statt, welche immununterdrückt sind, und zwar absichtlich, insbesondere bei Kindern, welche Organtransplantate erhalten, die mit Cyclosporin A behandelt werden, oder opportunistisch, wie im Falle bei Individuen, die mit HIV infiziert sind, oder genetisch, wie im Falle von betroffenen Männern, welche das XLP-Gen (X-gekoppeltes proliferatives Syndrom) tragen. In diesen Fällen leiten sich die resultierenden Malignitäten aus der polyklonalen Proliferation von EBV-infizierten B-Zellen her. Darüber hinaus ist in solchen Patienten eine unkontrollierte epitheliale Replikation des Virus in Wunden der oralen haarigen Leukoplakie nachweisbar. Somit spielt die Immunantwort eine zentrale Rolle in der Bekämpfung von EBV-Infektionen.
  • Wie oben erwähnt, ist EBV ein Mitglied der Herpesviren. Es besitzt die folgenden strukturellen Eigenschaften:
    • – Das EBV-Genom besteht aus einem linearen doppelsträngigen DNA-Molekül (173000 Basenpaare).
    • – Das Virion besteht aus einem Kern (Proteine und DNA), umgeben von einem ikosaedrischen Capsid und einer Membranhülle, welche das Capsid umschließt. Das ikosaedrische Capsid ist aus hexameren und pentameren Capsomeren aufgebaut. Die Membranhülle besteht aus einer Protein/Lipid-Doppelschichtmembran mit Spikes auf ihrer Außenoberfläche. Der Raum zwischen der Capsidschale und der Hülle ist mit amorphem Protein gefüllt, welches als das Tegument bezeichnet wird.
    • – Wie alle Herpesviren ist EBV in der Lage zur Herbeiführung einer latenten lebenslangen Infektion in seinem Wirt anschließend an eine primäre Infektion. Diese Latenz repräsentiert ein perfektes Gleichgewicht zwischen EBV und seinem menschlichen Wirt, das vom Immunsystem des Wirtes gesteuert wird.
  • Bis heute sind die meisten biochemischen und biologischen Untersuchungen an drei Prototypstämmen von EBV durchgeführt worden, nämlich B95-8 (transformierendes Virus, hergestellt in einer Krallenaffen-Zelllinie), P3HR1 (nicht-transformierendes Virus, hergestellt von einer Burkitt-Lymphom-Tumorzelllinie) und Raji (latentes Virus in einer Burkitt-Lymphom-Tumorzelllinie).
  • Während der letzten Jahre ist die gesamte DNA-Sequenz des Prototyp-Virusstammes 695-8 bestimmt worden. Die Analyse dieser Sequenz hat zur Identifizierung von mehr als 80 offenen Leserahmen geführt (Baer et. al., 1984, Nature 310, S. 207–211).
  • Die Biologie von EBV stellt Wissenschaftlern ein spezielles Problem, weil seine biologischen Charakteristika (latente Infektion) sich nicht für die klassische Virusanalyse eignen. Darüber hinaus sind sein Zell- und Wirtsbereich effektiv auf humane B-Lymphozyten und Epithelzellen (und diejenigen von einigen wenigen höheren Primaten) begrenzt, welche im Allgemeinen nicht einer Kultivierung in vitro zuführbar sind. Weiterhin hat die Abwesenheit eines vollständig permissiven Zelltyps, eines solchen, in welchem das Virus lytisch repliziert, die Befähigung, große Mengen des Virus zu produzieren, stark eingeschränkt. DNA-Moleküle von B95-8-, P3HR1- und Raji-Isolaten waren die Prototypen für eine ausführliche Restriktionsendonuklease-Kartierung und für die Klonierung in Escherichia coli(E. coli)-Plasmide und in den Bakteriophagen Lambda sowie für eine Nukleotidsequenzierung.
  • Das EBV-Genom besteht aus einem einzelnen doppelsträngigen DNA-Molekül-Aufbau mit einmaligen und tandemartig wiederholten DNA-Elementen. Jedes Ende des DNA-Moleküls enthält mehrere terminale Sequenzen, welche das kovalente Verbinden und das Zirkularisieren des Genoms gestatten. In Viruspartikeln ist das EBV-Genom nur in einer linearen Form nachweisbar. Im Gegensatz dazu existiert es als ringförmiges Episom innerhalb des Zellkerns von latent infizierten Zellen.
  • Die internen Wiederholungssequenzen IR1 bis IR4 teilen das EBV-Genom in fünf einmalige Regionen. Die U2- und U3-Regionen variieren unter verschiedenen EBV-Isolaten erheblich, und die erstere ist im P3HR-1-Stamm von EBV fast vollständig deletiert.
  • Die Nomenklatur für EBV-Leserahmen basiert auf deren Position im Virusgenom. Die Namen beginnen mit den Anfangsbuchstaben des BamH1- oder EcoR1-Restriktionsfragments, an welchem die Expression beginnt. Der dritte Buchstabe im Namen ist L oder R, abhängig davon, ob die Expression auf der Standardkarte nach links oder nach rechts erfolgt (So ist BLLF2 der zweite nach links gerichtete Leserahmen, der im BamH1-Restriktionsfragment L beginnt).
  • Die serologische Klassifizierung von Virusantigenen im produktiven Zyklus von EBV beruht auf verschiedenen Fluoreszenztechniken.
  • Antigene, welche mittels der Anti-Komplement-Immunfluoreszenztechnik spezifisch im Zellkern von fixierten latent infizierten B-Zellen (z. B. Raji-Zellen) nachgewiesen werden, werden als Epstein-Barr-Nukleär-Antigene (EBNA) klassifiziert. Nach Aktivierung der viralen Genexpression durch chemische oder virale Faktoren wird eine Klasse von frühen Antigenen (EA) nachgewiesen, deren Synthese nicht durch die Inhibition der viralen DNA blockiert wird. Abhängig vom Typ des verwendeten Fixativs (Methanol oder Aceton) sind zwei unterschiedliche Sätze von EA nachweisbar, EAR und EAD. EA ist durch indirekte Immunfluoreszenz im Zytoplasma und Zellkern von induzierten Zellen nachweisbar. Im Anschluss an den Beginn der viralen DNA-Synthese (und abhängig davon) werden Virus-Strukturproteine (VCA) synthetisiert, welche durch indirekte Immunfluoreszenz im Zytoplasma und Zellkern von Virus-Prozentenzellen (z. B. P3HR1-Zellen) nachweisbar sind. Auf der Oberfläche von lebensfähigen infizierten Zellen, welche hinsichtlich der Virusproduktion induziert wurden, ist ein Satz von Antigenen (MA) durch indirekte Immunfluoreszenz nachweisbar. Diese Antigene können auch auf der viralen Hülle gefunden werden und sind bedeutende Ziele für die Virus-Neutralisation. Der Nachweis von EBV-spezifischen Antikörpern in humanen Seren kann routinemäßig durch serologische Techniken durchgeführt werden, wie von Menke und Henle (Human Pathology, 5, 551–565, 1974) beschrieben wurde.
  • Basierend auf biochemischen und Immunfluoreszenzdaten ist es möglich, fünf verschiedene Klassen von Antigenmolekülen zu unterscheiden. Die verschiedenen viralen Polypeptide werden nach ihrem Molekulargewicht bezeichnet, und es ist keine gemeinsame Nomenklatur festgelegt worden, außer für die Virushüllenproteine. Die fünf verschiedenen Gruppen von Antigenen sind:
    • A. Die Gruppe von Antigenen, welche während einem Latenz-Zustand exprimiert werden (EBNAs und LMPs).
    • B. Die Gruppe von Antigenen, welche für Genomaktivierung und anfängliche Induktion der viralen Replikation verantwortlich sind (IEA).
    • C. Die Gruppe von Antigenen, welche durch IEA-Genprodukte induziert werden und welche für eine Replikation von viraler DNA benötigt werden; diese Antigene sind hauptsächlich virale Enzyme (EA).
    • D. Die Gruppe von Antigenen, welche Strukturkomponenten des Viruspartikels sind und spät im viralen Replikationszyklus exprimiert werden (VCA), nach der Initiation der viralen DNA-Synthese.
    • E. Die Gruppe von Antigenen, welche in der Zellmembran der infizierten Zelle exprimiert werden (MA).
  • Die viralen Capsid-Antigene (VCA) von EBV
  • Für diesen Antigenkomplex ist ebenfalls zu berücksichtigen, dass der Vergleich von EBV-spezifischen Proteinen, die in verschiedenen Untersuchungen identifiziert wurden, auf Grund von Variationen in den verwendeten Polyacrylamid-Gelsystemen, Zelllinien und chemischen Induktoren und den eingesetzten Seren schwierig ist.
  • Dolyniuk et al. (1979) beschrieben insgesamt 33 Proteine, welche mit gereinigten Virionen assoziiert sind. Die differenzielle Solubilisierung mit Detergenzien legt nahe, dass das Nucleocapsid aus mindestens sieben Proteinen aufgebaut ist. Eine bedeutende Komponente des VCA-Komplexes ist das Major-Capsid-Protein (MCP). Das EBV-MCP wird innerhalb des BcLF1-Leserahmens des viralen Genoms codiert (Bear et al., 1984) und wird als ein 153–160 kDa großes nicht-glykosiertes Protein in EBV-Produzenten-Zelllinien mit einem pI von 7,5 bis 9,0 exprimiert. Dieses Protein wird im Zytoplasma in einer löslichen Form synthetisiert und dann in den Zellkern transportiert, wo es zu Capsiden kondensiert und nicht länger durch Detergenzien solubilisiert wird. Eine andere größere VCA-Komponente besitzt ein Molekulargewicht von 125 kDa und ist glykosyliert. Dieses Protein wird innerhalb des BALF4-Leserahmens des viralen Genoms codiert. Obwohl dieses Glykoprotein ursprünglich als eine VCA-Komponente klassifiziert wurde, zeigen kürzliche Befunde, dass es tatsächlich mit zytoplasmatischen und nukleären Membranstrukturen assoziiert sein könnte.
  • Früher beschriebene Experimente (J. M. Middeldorp und P. Herbrink, J. Virol. Meth., 21, 133–146, 1988) zielten auf die Identifizierung und Charakterisierung von diagnostisch relevanten EBV-Markerproteinen im Verhältnis zu verschiedenen EBV-Erkrankungen. Dies wurde unter Verwendung von Immunoblot-Streifen durchgeführt, welche Antigene enthielten, die von der Virusproduzenten-Zelllinie HH514-C16 (einem superinduzierbarem Derivat von P3HR1), induziert hinsichtlich der Expression von VCA/EA oder EA, und von den EBV-negativen Zelllinien Ramos und Bjab hergestellt wurden. Zelllinien, welche das EBV-Genom in einem (vollständig) latenten Zustand tragen, X50-7 und JC-5, können verwendet werden, um EBNA/LMP spezifisch zu untersuchen.
  • Die Muster von EBV-Antikörperantworten wurden in Seren von gesunden seropositiven Blutspendern, in Seren von IM-Patienten und chronischen IM-Patienten oder Patienten mit EBV-assoziierten Tumoren, wie Nasopharynx-Karzinom, untersucht. Polyklonale und monoklonale Antikörper, welche mit definierten EBV-Genomproduktven reaktiv sind, können verwendet werden, um einige der Proteinbanden, welche in diesem experimentellen System nachgewiesen werden, zu charakterisieren. Diese Untersuchungen beschrieben jedoch nur Proteine oder Polypeptide mit einem gewissen Molekulargewicht. Es war keine Information hinsichtlich der codierenden Sequenz auf dem EBV-Genom für diese Proteine verfügbar. Ebenso wenig war es bekannt, ob immunreaktive Banden auf den Immunoblots auf Reaktivität mit einzelnen oder mehreren Proteinen desselben Molekulargewichts beruhten.
  • Mit der Immunoblot-Technik ist es möglich, ein EBV-Antigen mit einem Molekulargewicht von 18 kDa nachzuweisen. Dieses Protein wird nicht exprimiert, wenn Phosphonoessigsäure (PAA) verwendet wird, um die virale DNA-Synthese zu blockieren, und wird von allen Seren nachgewiesen, welche Anti-VCA-Antikörper enthalten, was anzeigt, dass es sich dabei um eine VCA-verwandte Komponente handelt. Eine andere VCA-Komponente ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 40 kDa. Viele der viralen Capsidantigene sind mit dem Zellkernpellet assoziiert.
  • Derzeitig wird die EBV-spezifische Serodiagnose durch einigermaßen subjektive Immunfluoreszenz-Tests bewerkstelligt. Ein Fortschritt zu einer einfacheren und gleichmäßigeren Diagnose (z. B. ELISA) wird behindert, weil die Massenproduktion und Reinigung von viralen Antigenen unter Verwendung von standardmäßigen virusproduzierenden Zelllinien nicht möglich ist. Der einzige Weg, um dies zu erreichen, bestünde darin, alternativ hergestellte EBV-Antigen(e) zu verwenden. Diese EBV-Antigene könnten entweder mit gentechnischen Verfahren oder synthetischen Peptid-Techniken hergestellt werden.
  • Für die Entwicklung eines spezifischen und empfindlichen Verfahrens, um zu ermöglichen, dass eine zuverlässige Diagnose in verschiedenen Phasen der Infektion mit EBV erstellt wenden kann, ist es von großer Bedeutung, immundominante virale Proteine und Epitope davon zu identifizieren.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, umfassend wenigstens einen Teil des VCA-p40-Proteins, codiert innerhalb des offenen EBV-Leserahmens BdRF1, und Fragmente davon, welche mit Antikörpern gegen das Epstein-Barr-Virus immunochemisch reaktiv sind. Ein Teil der Erfindung sind daher Peptide mit 345 Aminosäuren und einer Amminosäuresequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr.: 4, welche mit EBV-Antikörpern immunochemisch reaktiv sind.
  • Die Peptide gemäß der Erfindung sind festgestelltermaßen besonders geeignet zur Verwendung in einem diagnostischen Verfahren für die Bestimmung der Gegenwart von EBV oder EBV-Antikörpern in einer Probe. Darüber hinaus kann ein Peptid gemäß der Erfindung in geeigneten pharmazeutischen Dosierungsformen bei der Behandlung einer mit EBV zusammenhängenden Erkrankung verwendet werden. Die Herstellung von so erhaltenen Impfstoffen, welche ein Peptid oder Fragment davon als Wirkstoffe enthalten können, ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
  • Im Gegensatz zum natürlichen EBV besitzen die Peptide gemäß der Erfindung den großen Vorteil, dass diese von sicherem, nicht-infektiösen Ursprung sind. Die Erfindung umfasst ebenfalls Fragmente der Peptide, welche noch mit Antikörpern gegen das Epstein-Barr-Virus immunochemisch reaktiv sind.
  • Der Begriff "Peptid", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Molekülkette von Aminosäuren mit einer biologischen Aktivität und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Produktes. Somit sind unter anderem Proteine, Fusionsproteine oder -peptide, Oligopeptide und Polypeptide eingeschlossen. Falls erforderlich, können Peptide gemäß der Erfindung in vivo oder in vitro z. B. durch Glykosylierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung modifiziert werden. Funktionelle Varianten, wie zum Beispiel Säureadditionssalze, Amide, Ester und spezifisch C-terminale Ester, und N-Acyl-Derivate der Peptide gemäß der Erfindung, werden deshalb ebenfalls als Teil der vorliegenden Erfindung angesehen. Es versteht sich, dass für die hierin eingeschlossenen besonderen Proteine oder Polypeptide auch natürliche Variationen existieren können. Diese Variationen können durch (einen) Aminosäureunterschied(e) in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen von (einer) Aminosäure(n) in der Sequenz verdeutlicht werden. Aminosäuresubstitutionen, von welchen erwartet werden kann, dass sie die biologischen und immunologischen Aktivitäten nicht wesentlich verändern, sind beschrieben worden. Aminosäureaustausche zwischen verwandten Aminosäuren oder Austausche, welche häufig in der Evolution aufgetreten sind, sind unter anderem Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (siehe Dayhof, M. D., Atlas of Protein se quence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Wahington D.C., 1978, Band 5, Suppl. 3). Basierend auf dieser Information entwickelten Lipman und Pearson ein Verfahren zum raschen und empfindlichen Proteinvergleich (Science 227, 1435–1441, 1985) und zur Bestimmung der funktionellen Ähnlichkeit zwischen homologen Proteinen.
  • Der Begriff "Fragment", wie hierin verwendet, bedeutet eine Aminosäuresequenz, welche eine Teilsequenz eines Peptides der Erfindung umfasst. Das Fragment ist ein Peptid mit einer oder mehren immonogenen Determinanten des VCA-p40-Proteins. Fragmente können unter anderem durch enzymatische Spaltung von Vorläufermolekülen unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen für die DNA und Proteasen für die Polypeptide hergestellt werden. Andere Verfahren schließen die chemische Synthese der Fragmente oder die Expression von Peptidfragmenten durch DNA-Fragmente ein.
  • Geeignete immunogene Fragmente eines Peptides gemäß der Erfindung, welche (ein) Epitop(e) enthalten, können mittels des Verfahrens gefunden werden, das in der Patentanmeldung WO 86/06487 , Geysen, H. M., et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3998–4002, 1984), Geysen, H. M., et al. (J. Immunol. Meth. 102, 259–274, 1987), beschrieben wurde, basierend auf dem so genannten Pepscan-Verfahren, worin eine Reihe von partiell überlappenden Peptiden, entsprechend partiellen Sequenzen des vollständigen Polypeptids unter Betrachtung, synthetisiert wird und ihre Reaktivität mit Antikörpern untersucht wird. Darüber hinaus kann es sich bei einer Anzahl von Regionen der Peptide um, auf der Basis von theoretischen Erwägungen, benannte Epitope handeln, obwohl der Vorhersagewert dieser theoretischen Erwägungen begrenzt ist. Die Bestimmung dieser Regionen basiert auf einer Kombination der Hydrophilie-Kriterien gemäß Hopp und Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3824–3828, 1981) und der sekundären Strukturaspekte gemäß Chou und Fasman (Advances in Enzymology 47, 45–148, 1987).
  • Bevorzugte Peptide gemäß der Erfindung sind Peptide, die mindestens eine der Aminosäuresequenzen, wie in SEQ. ID. Nr.: 5 und SEQ. ID. Nr.: 6 gezeigt, umfassen. Am stärksten bevorzugt ist ein Peptid, umfassend die Aminosäure, wie gezeigt in SEQ. ID. Nr.: 5, verknüpft an die Aminosäuresequenz, wie gezeigt in SEQ. ID. Nr.: 6. Ein derartiges Kombi-Peptid hat sich als äußerst nützlich für den spezifischen Nachweis von IgG-, IgA-, IgM-Antikörpern gegen EBV-VCA erwiesen, mit einer Empfindlichkeit, die ähnlich oder sogar besser als bei standardmäßigen serologischen Techniken ist. Als solches ist IgM-EBV ein nützlicher diagnostischer Marker für akute primäre EBV-Infektionen, wohingegen IgA gegen EBV nützlich für die Diagnose und Prognose bei Nasopharynx-Karzinom ist. EBV-IgG ist in allen menschlichen EBV-Trägern positiv und bei Personen, welche nicht mit dem Virus infiziert sind, negativ. Zusätzlich dazu können Änderungen im Antikörpertiter für jeden der Antikörper einer spezifischen Unterklasse von zusätzlichem diagnostischen Wert sein. Da Antikörper unterschiedlicher Subklassen einen spezifischen diagnostischen Wert in verschiedenen Stadien der EBV-Infektion besitzen, kann die Verwendung eines Kombi-Peptides gemäß der Erfindung in diagnostischen Testes, z. B. ELISA, von großem Vorteil sein.
  • Die Präparation der Peptide oder Fragmente davon gemäß der Erfindung wird mittels eines der bekannten organischen chemischen Verfahren zur Peptidsynthese oder mit Hilfe von rekombinanten DNA-Techniken bewirkt.
  • Es wird in Betracht gezogen, dass die organischen chemischen Verfahren für die Peptidsynthese die Kopplung der erforderlichen Aminosäuren mittels einer Kondensationsreaktion, entweder in homogener Phase oder mit Hilfe einer so genannten Festphase, einschließen.
  • Die Kondensationsreaktion kann wie folgend durchgeführt werden.
    • a) Kondensation einer Verbindung (Aminosäure, Peptid) mit einer freien Carboxylgruppe und geschützten anderen reaktiven Gruppen mit einer Verbindung (Aminosäure, Peptid) mit einer freien Aminogruppe und geschützten anderen reaktiven Gruppen, in Gegenwart eines Kondensationsmittels;
    • b) Kondensation einer Verbindung (Aminosäure, Peptid) mit einer aktivierten Carboxylgruppe und freien oder geschützten anderen Reaktionsgruppen mit einer Verbindung (Aminosäure, Peptid) mit einer freien Aminogruppe und freien oder geschützten anderen reaktiven Gruppen. Die Aktivierung der Carboxylgruppe kann unter anderem stattfinden durch Umwandlung der Carboxylgruppe in ein Säurehalogenid, Azid, Anhydrid, Imidazolid oder einen aktivierten Ester, wie dem N-Hydroxysuccinimid-, N-Hydroxybenzotriazol- oder p-Nitrophenylester.
  • Die häufigsten Verfahren für die oben genannten Kondensationsreaktionen sind: das Carbodiimid-Verfahren, das Azid-Verfahren, das Verfahren mit Hilfe von gemischtem Anhydrid und das Verfahren unter Verwendung von aktivierten Estern, wie beschrieben in The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Band 1–3 (Hrsg.: Gross, E., und Meienhofer, J.) 1979, 1980, 1981 (Adademic Press, Inc.).
  • Die Herstellung von geeigneten Fragmenten der oben erwähnten Peptide gemäß der Erfindung unter Verwendung der "Festphase" wird zum Beispiel in J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149 (1963), und in Int. J. Peptide Protein Res. 35, 161–214 (1990), beschrieben. Die Kopplung der Aminosäuren des herzustellenden Peptides beginnt üblicherweise von der Seite des Carboxylendes her.
  • Für dieses Verfahren wird eine Festphase benötigt, auf welcher reaktive Gruppen sind oder auf welcher solche Gruppen eingebracht werden können. Dies kann zum Beispiel ein Copolymer von Benzol und Divinylbenzol mit reaktiven Chlormethylgruppen oder eine polymere Festphase, die mit Hydroxymethyl- oder Aminfunktionen reaktiv gemacht wurde, sein.
  • Eine besonders geeignete Festphase ist zum Beispiel das p-Alkoxybenzyl-Alkoholharz (4-Hydroxymethylphenoxymethyl-Copolystyrol-1%Divinylbenzol-Harz), das von Wang (1974) J. Am. Chem. Soc. 95, 1328, beschrieben wurde. Nach der Synthese können die Peptide von dieser Festphase unter milden Bedingungen abgespalten werden.
  • Nach der Synthese der gewünschten Aminosäuresequenz folgt die Ablösung des Peptids vom Harz, zum Beispiel mit Trifluoremethansulfonsäure oder mit Methansulfonsäure, gelöst in Trifluoressigsäure. Das Peptid kann ebenfalls von dem Träger durch Umesterung mit einem Niederalkohol, vorzugsweise Methanol oder Ethanol, entfernt werden, wobei in diesem Fall ein Niederalkylester des Peptids direkt gebildet wird. In gleicher Weise ergibt die Abspaltung mit Hilfe von Ammoniak das Amid eines Peptids gemäß der Erfindung.
  • Die reaktiven Gruppen, welche nicht an der Kondensationsreaktion teilnehmen können, werden, wie angegeben, effektiv durch Gruppen geschützt, welche sehr einfach durch Hydrolyse mit Hilfe von Säure, Base oder Reduktion wieder entfernt werden können. So kann eine Carboxylgruppe effektiv geschützt werden zum Beispiel durch Veresterung mit Methanol, Ethanol, tertiärem Butanol, Benzylalkohol oder p-Nitrobenzylalkohol und Aminen, welche am festen Träger verknüpft sind.
  • Gruppen, welche in effektiver Weise eine Aminogruppe schützen können, sind die Ethoxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonyl-(t-boc) oder p-Methoxybenzyloxycarbonyl-Gruppe oder eine aus einer Sulfonsäure abgeleitete Säuregruppe, wie die Benzolsulfonyl- oder p-Toluensulfonyl-Gruppe, aber andere Gruppen können auch verwendet werden, wie substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aralkylgruppen, zum Beispiel Benzyl und Triphenylmethyl, oder Gruppen, wie ortho-Nitrophenylsulfenyl und 2-Benzyl-1-methylvinyl. Eine besonders geeignete o-Amino-Schutzgruppe ist zum Beispiel die basenempfindliche 9-Fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)-Gruppe [Carpino & Han (1970) J. Amer. Chem. Soc. 92, 5748].
  • Eine umfassendere Aufstellung von möglichen Schutzgruppen kann in "The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology", Band 1–9 (Hrsg.: Gross, Udenfriend und Meienhofer) 1979–1987 (Academic Press, Inc.) gefunden werden.
  • Es ist notwendig, ebenfalls die ε-Aminogruppe von Lysin zu schützen, und empfehlenswert für die Guanidingruppe von Arginin. Maßgeschneiderte Schutzgruppen in diesem Zusammenhang sind eine Boc-Gruppe für Lysin und eine Pmc- oder Pms- oder Mbs-Gruppe oder Mtr-Gruppe für Arginin.
  • Die Schutzgruppen können durch verschiedene herkömmliche Verfahren, abhängig von der Natur der jeweiligen Gruppe, abgespalten werden, zum Beispiel mit Hilfe von Trifluoressigsäure oder durch milde Reduktion, zum Beispiel mit Wasserstoff und einem Katalysator, wie Palladium, oder mit HBr in Eisessig.
  • Wir bereits oben angegeben, können die Peptide gemäß der Erfindung gleichermaßen mit Hilfe von rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden. Diese Möglichkeit ist insbesondere von Bedeutung, wenn das Peptid in einer wiederkehrenden Sequenz ("in tandem") eingebaut wird oder wenn das Peptid als Bestandteil eines (viel größeren) Proteins oder Polypeptids oder als Fusionsprotein mit zum Beispiel (einem Teil von) β-Galactosidase hergestellt werden kann. Dieser Typ von Peptiden liegt daher gleichermaßen innerhalb des Umfangs der Erfindung. Für diesen Zweck wird, als Bestandteil einer rekombinanten DNA, eine Nukleinsäuresequenz verwendet, welche für ein Peptid gemäß der Erfindung codiert und welche darüber hinaus im Wesentlichen frei von Nukleinsäuresegmenten ist, welche im natürlich vorkommenden EBV-Genom die oben angegeben Nukleinsäuresequenz flankieren.
  • Dieses letztgenannte Verfahren beinhaltet die Herstellung des gewünschten Peptides, indem ein rekombinantes Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die für eines oder mehrere der fraglichen Peptide codiert, in einem geeigneten Mikroorganismus als Wirt zur Expression gebracht wird.
  • Die Erfindung beschreibt daher ferner Nukleinsäuresequenzen, welche ein Peptid gemäß der Erfindung codieren, vorzugsweise umfassend mindestens einen Teil der Nukleinsäuresequenz, wie gezeigt in SEQ. ID. Nr.: 1 und/oder 3.
  • "Nukleinsäuresequenz", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine polymere Form von Nukleotiden von beliebiger Länge, und zwar sowohl auf Ribonukleinsäure-Sequenzen als auch Desoxyribonukleinsäure-Sequenzen. Im Prinzip bezieht sich dieser Begriff auf die Primärstruktur des Moleküls. Somit schließt dieser Begriff doppel- und einzelsträngige DNA sowie doppel- und einzelsträngige RNA und Modifikationen davon ein.
  • Ein Nukleinsäuresequenz kann an verschiedene, die Replikation bewirkende DNA-Sequenzen ligiert werden, mit denen sie in der Natur nicht assoziiert oder verknüpft ist, was zu einem sogenannten rekombinanten Vektormolekül führt, welches für die Transformation oder Transfektion eines geeigneten Wirtes verwendet werden kann. Nützliche rekombinante Vektormolekü le werden vorzugsweise zum Beispiel aus Plasmiden, Bakteriophagen, Cosmiden oder Viren abgeleitet. Spezifische Vektoren oder Klonierungsvehikel, welche zum Klonieren von Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können, sind im Fachgebiet bekannt und schließen unter anderem Plasmidvektoren, wie pBR322, die verschiedenen pUC-, pGEM- und Bluescript-Plasmide, Bakteriophagen, z. B. kgt-Wes, Charon 28 und die M13-abgeleiteten Phagen, oder virale Vektoren, wie SV40, Adenovirus oder Polyoma-Virus, ein (siehe auch Rodriquez, R. L., und D. T. Denhardt, Hrsg., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths, 1988; Lenstra, J. A., et al., Arch. Virol. 110, 1–24, 1990). Die für die Konstruktion eines rekombinanten Vektormoleküls anzuwendenden Verfahren sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt und werden unter anderem dargestellt in Maniatis, T., et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe; Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Zum Beispiel kann die Insertion der Nukleinsäuresequenz in einen Klonierungsvektor leicht erzielt werden, wenn sowohl die Gene als auch das gewünschte Klonierungsvehikel mit den gleichen Restriktionsenzym(en) geschnitten worden sind, da hierbei komplementäre DNA-Enden erzeugt werden.
  • Die rekombinanten Vektormoleküle können zusätzlich eine oder mehrere Markeraktivitäten enthalten, welche verwendet werden können, um nach gewünschten Transformanten zu selektieren, wie Ampicillin- und Tetracyclinresistenz in pBR322, wie zum Beispiel Ampicillinresistenz und α-Peptid von β-Galactosidase in pUC8.
  • Die Erfindung beschreibt ebenfalls (eine) Wirtszelle(n), welche mit einer Nukleinsäuresequenz oder einem oben beschriebenen rekombinanten Expressionsvektormolekül transformiert oder transfiziert ist/sind, fähig zur Herstellung der Peptide gemäß der Erfindung durch Expression der entsprechenden Nukleinsäuresequenz. Eine geeignete Wirtszelle ist ein Mikroorganismus oder eine Zelle, welche(r) durch eine, für ein Peptid codierende Nukleinsäuresequenz oder durch ein rekombinantes Vektormolekül, das eine solche Nukleinsäuresequenz umfasst, transformiert werden kann und welche(r) nach Wunsch verwendet werden kann, um das von der Nukleinsäuresequenz codierte Peptid zu exprimieren. Die Wirtszelle kann von prokaryotischem Ursprung, z. B. Bakterien, wie Escherichia coli, Bacillus subtilis und Pseudomonas-Spezies; oder von eukaryotischem Ursprung sein, wie etwa Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae oder höhere eukaryotische Zellen, wie Insekten-, Pflanzen- oder Säugerzellen, einschließlich HeLa-Zellen und chinesische Hamster-Ovar(CHO)-Zellen. Im Allgemeinen werden Prokaryoten für die Konstruktion der in der Erfindung nützlichen rekombinanten Vektormoleküle bevorzugt. Für die Expression werden Nukleinsäuresequenzen in einen Expressionsvektor eingebracht, d. h. die Sequenzen werden funktionsfähig an Expressionssteuerungssequenzen verknüpft. Derartige Steuerungssequenzen können Promotoren, Enhancer, Operatoren, Induktoren, Ribosomenbindungsstellen etc. umfassen. Deshalb beschreibt die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Vektormolekül, welches eine die oben identifizierten Peptide codierende Nukleinsäuresequenz in funktionsfähiger Verknüpfung an Expressionssteuerungssequenzen umfasst, das zum Exprimieren der darin enthaltenen DNA-Sequenzen in (einer) transformierten oder transfizierten Wirtszelle(n) in der Lage ist.
  • Es versteht sich selbstverständlich, dass die an der gewählten Stelle des Klonierungsvektors inserierten Nukleotidsequenzen nur ein Fragment der vollständigen Nukleinsäuresequenz, codierend die Peptide gemäß der Erfindung, einschließen können, solange der transformierte oder transfizierte Wirt ein Polypeptid herstellen wird, welches mindestens eine oder mehrere immunogene Determinante(n) aufweist.
  • Antikörper, welche gegen ein Peptid gemäß der Erfindung gerichtet sind, sind ebenfalls ein Teil der vorliegenden Erfindung. Die Peptide oder Fragmente davon, welche [wie] oben hergestellt und beschrieben wurden, werden zur Erzeugung sowohl polyklonaler als auch monoklonaler Antikörper verwendet. Gegen Peptide gemäß der Erfindung gerichtete monoklonale Antikörper können vom Fachmann auf dem Gebiet leicht hergestellt werden.
  • Bevorzugte Antikörper gegen ein Epitop des VCA-p40-Proteins sind Antikörper mit der gleichen Reaktivität mit VCA-p40 wie Antikörper, welche von der Maus-Maus-Hybridomzelllinie hergestellt werden, die bei der "European Culture of Animal Cell Cutures" (ECACC), Porton Down (Großbritannien), unter der vorläufigen Hinterlegungsnummer 93020414 hinterlegt wurde.
  • Immortalisierte Zelllinien, welche fähig zum Absondern von monoklonalen Antikörpern gemäß der Erfindung sind, sind ebenfalls ein Teil der vorliegenden Erfindung.
  • Die Herstellung von Zelllinien, welche monoklonale Antikörper herstellen, kann beispielsweise durch die Technik nach Kohler und Milstein (Kohler und Milstein entwickelten die Techniken, welche zur Bildung von monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridomen führten (G. Kohler und C. Milstein, 1975, Nature 256: 495–497; 1976, Eur. J. Immunol. 6: 511–519)), Transformation mit dem Epstein-Barr-Virus oder eine direkte Transformationstechnik von B-Lymphozyten mit onkogener DNA, oder eine direkte Fusion von humanen B-Lymphozyten mit einem Fusionspartner, der entweder eine humane oder eine Maus-Mensch-Hybrid-Myelomzelllinie ist, oder eine direkte Fusion einer EBV-transformierten B-Zelllinie mit den Myelomzelllinien erfolgen.
  • Bevorzugte Zelllinien gemäß der Erfindung sind die Zelllinien, welche bei der "European Collection of Animal Cell Cultures", Porton Down (Großbritannien), unter der Hinterlegungsnummer 93020414 hinterlegt wurden. Diese Zelllinien sind bei der ECACC am 4. Februar 1993 unter den Regelungen und Bedingungen des Budapester Vertrages von 1977 hinterlegt worden.
  • Die Zelllinie mit der vorläufigen Hinterlegungsnummer 93020414 ist fähig zur Herstellung von Antikörpern gegen ein Epitop des VCA-p40-Proteins und ist eine Maus-Maus-Hybridomzelllinie. Die von diesen Zelllinien hergestellten Antikörper sind zum Identifizieren von Epitopen auf dem Protein verwendet worden (wie es in den Beispielen weiter veranschaulicht wird).
  • Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper, welche gegen Peptide gemäß der Erfindung gerichtet sind, sind sehr geeignet in der Diagnose und Immuncytochemie für einen In-situ-Nachweis in einer Gewebeprobe, während diejenigen Antikörper, welche neutralisierend sind, sehr nützlich in einer passiven Immuntherapie sind. Insbesondere können monoklonale Antikörper verwendet werden, um Anti-Idiotyp-Antikörper zu erzeugen. Techniken zum Erzeugen von Anti-Idiotyp-Antikörpern sind im Fachgebiet bekannt. Mit den monoklonalen Antikörpern gemäß der Erfindung, wie oben beschrieben, reaktive Anti-Idiotyp-Antikörper sind ein Teil der vorliegenden Erfindung.
  • Anti-Idiotyp-Antikörper sind Antikörper, welche gegen den variablen Teil von Immunglobulinen gerichtet sind. Eine Subpopulation von Anti-Idiotyp-Antikörpern ist als "Anti-Idiotyp β" oder "interne Abbilder" bekannt. Diese Anti-Idiotyp-β-Antikörper besitzen entweder eine strukturelle oder eine dreidimensionale Ähnlichkeit mit dem Antigen (Uytdehaag, F. G. C. M. et al., Immunol. Rev; 90; 93–113; 1986). Dieser Typ von Anti-Idiotyp-Antikörpern wird weithin als Impfstoff gegen Infektionskrankheiten in Tiermodellen verwendet (Hiernaux, J. R.; Infect. Immun.; 56; 1407–1413; 1988, Kennedy, R. C., et al.; Science 232; 220–223; 1986). Zur Verwendung in Assays können die Anti-Idiotyp-Antikörper in großen Mengen erzeugt werden. Techniken zum Erzeugen von Anti-Idiotyp-Antikörpern sind im Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel können Anti-Idiotyp-Antikörper gemäß der Erfindung durch Immunisieren von BALB/c-Mäusen mit monoklonalen Antikörpern, welche mit Glutaraldeyhyd gemäß Vorgehensweisen der Standardliteratur an KLH gekoppelt wurden, vermischt mit Freund'schem vollständigen Adjuvans, erhalten werden. Die Milzzellen dieser Mäuse können immortalisiert werden, und die so erhaltenen Hybridome können hinsichtlich Produktion von Anti-Idiotyp-Antikörpern gescreent werden. Das Screening der Hybridome kann beispielsweise durch Binden von monoklonalen Antikörpern gemäß der Erfindung an eine feste Phase (Vertiefungen von Mikrotiterplatten) und Inkubieren der festen Phase mit Kulturüberstand von wachsenden Hybridomen durchgeführt werden. Ein an Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppeltes EBV-Peptid kann zugesetzt werden. Die Gegenwart von Anti-Idiotyp-Antikörpern im Kulturüberstand wird dann durch die Inhibition der Bindung dieses Peptidkonjugats an die monoklonalen Antikörper, welche auf der festen Phase aufbeschichtet sind, angezeigt.
  • Anti-Idiotyp-Antikörper können zum Beispiel zum Inhibieren der Bindung von humanem und/oder tierischem EBV-Antigen in einem Immunoassay unter Verwendung von EBV-Antikörpern verwendet werden. Alternativ dazu können Anti-Idiotyp-Antikörper als ein Nachahmungs-Mittel des hierin nachstehend erwähnten immunchemischen Reagenzes verwendet werden. Die Anti-Idiotyp-Antikörper sind auch nützlich für die Diagnose und Behandlung von EBV sowie für die Aufklärung wichtiger epitoper Regionen von EBV-Antigenen.
  • Ein immunchemisches Reagenz, welches ein oder mehrere Peptide oder Antikörper gemäß der Erfindung umfasst, ist ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
  • Der Begriff "immunchemisches Reagenz" gemäß der Erfindung besteht üblicherweise aus einem oder mehreren Peptiden gemäß der Erfindung und einem geeigneten Träger oder einer Markierungssubstanz. Träger, welche verwendet werden können, sind zum Beispiel die Innenwand einer Mikrotestvertiefung oder einer Küvette, eines Röhrchens oder einer Kapillare, eine Membran, ein Filter, ein Teststreifen oder die Oberfläche eines Teilchens, wie zum Beispiel eines Latexteilchens, ein Erythrocyt, ein Farbstoff-Sol, ein Metall-Sol oder eine Metallverbindung als Sol-Teilchen, ein Trägerprotein, wie BSA oder KLH. Markierungssubstanzen, welche verwendet werden können, sind unter anderem ein radioaktives Isotyp, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym, ein Farbstoff-Sol, Metall-Sol oder eine Metall-Verbindung als Sol-Teilchen. In einem Verfahren für den Nachweis von gegen EBV gerichteten Antikörpern in einer Probe wird ein immunchemisches Reagenz gemäß der Erfindung mit der Probe in Kontakt gebracht. Danach wird das Vorliegen von zwischen dem Peptid und Antikörpern in der Probe gebildeten Immunkomplexen nachgewiesen, und durch diesen Nachweis ist das Vorhandensein von EBV-Antikörpern in der Probe bekannt und kann quantitativ bestimmt werden.
  • Abhängig von der Natur und weiteren Merkmalen des immunochemischen Reagenzes ist die immunochemische Reaktion, welche stattfindet, eine sogenannte Sandwich-Reaktion, eine Agglutinationsreaktion, eine Kompetitionsreaktion oder ein Inhibitionsreaktion.
  • Für den Nachweis von EBV in einer Probe kann ein immunchemisches Reagenz gemäß der Erfindung, welches ein oder mehrere Peptide gemäß der Erfindung enthält, mit der Probe und Anti-EBV in Kontakt gebracht werden, wonach das Vorliegen von gebildeten Immunkomplexen nachgewiesen werden kann, und hieraus kann man das Vorhandensein von EBV in einer Probe bestimmen.
  • Ein besonders geeignetes Verfahren für den Nachweis von EBV in einer Probe beruht auf einer Kompetitionsreaktion zwischen einem Peptid gemäß der Erfindung, welches mit einer Markierungssubstanz ausgestattet ist, und einem EBV-Antigen (welches in der Probe vorhanden ist), wodurch das Peptid und das Antigen [mit dem] um den gegen EBV gerichteten Antikörper, der an einem festen Träger befestigt ist, konkurrieren.
  • Die Erfindung umfasst ferner ein Verfahren für den Nachweis von Epstein-Barr-Virus in einer Probe, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Antikörper gemäß der Erfindung mit einer Probe in Kontakt gebracht wird, wonach das Vorliegen von gebildeten Immunkomplexen nachgewiesen wird, welches ein Maß für das Vorhandensein von Epstein-Barr-Virus in der Probe ist. Ein Test-Kit gemäß der Erfindung umfasst als einen wesentlichen Bestandteil ein immunchemisches Reagenz, wie oben beschrieben. Bei der Ausführung einer Sandwich-Reaktion, für den Nachweis von EBV-Antikörpern, kann das Test-Kit beispielsweise das Peptid gemäß der Erfindung, welches an einen festen Träger, zum Beispiel die Innenwand einer Mikrotestvertiefung, aufbeschichtet ist, und entweder ein markiertes Peptid gemäß der Erfindung oder einen markierten Anti-Antikörper umfassen.
  • Für die Ausführung einer Kompetitionsreaktion kann das Test-Kit ein Peptid gemäß der Erfindung, welches auf einen festen Träger beschichtet ist, und einen gegen EBV gerichteten markierten Antikörper, vorzugsweise einen gegen das Peptid gerichteten monoklonalen Antikörper, umfassen.
  • In einer Agglutinations-Reaktion umfasst das Test-Kit ein immunchemisches Reagenz, welches ein Peptid gemäß der Erfindung, aufbeschichtet auf Teilchen oder Sole, umfassen kann. Eine andere Ausführungsform eines Test-Kits ist beispielsweise die Verwendung eines markierten Peptids gemäß der Erfindung als immunchemisches Reagenz in einer Kompetitionsreaktion mit einem nachzuweisenden EBV-Antigen um eine Bindungsstelle auf dem, gegen EBV gerichteten, Antikörper, welcher auf einem festen Träger aufbeschichtet ist.
  • Die neue Nukleotidsequenz gemäß SEQ. ID. Nr.: 3 kann als Grundlage eines Tests zum Nachweisen von EBV-DNA oder -RNA mittels einer Nukleinsäureamplifikationstechnik verwendet werden, zum Beispiel der Polymerasekettenreaktion (PCR) oder der Nukleinsäuresequenzbasierenden Amplifikation (NASBA), wie beschrieben in EP 201 814 bzw. EP 329 822 . Ein Verfahren für die Amplifikation und den Nachweis einer Epstein-Barr-Virus-Nukleinsäuresequenz in einer Probe unter Verwendung mindestens einer Nukleinsäuresequenz oder eines Fragments davon gemäß der Erfindung [als] (einem) Primer zur Durchführung einer Nukleinsäureamplifikation der Epstein-Barr-Virus-Nukleinsäuresequenz und zum Nachweis der amplifizierten Sequenz wird ebenfalls beschrieben.
  • Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, worin zu vergleichenden Zwecken auf VCA-p18 und BFRF3 Bezug genommen wird.
  • LEGENDEN:
  • 1: Skizze des Vorgehens, welches zum Identifizieren der EBV-codierten Gene, welche die Proteine VCA-p40 und VCA-p18 codieren, angewandt wurde.
  • 2:
    • a) Western-Blot von nuklearem Antigenextrakt der Virusproduzenten-Zelllinie HH514, welche hinsichtlich Expression von EA und VCA induziert worden ist.
    • b) Western-Blot von Ganzzell-Lysat von E. coli, welches das BFRF3-β-Galactosidase-Fusionsprotein exprimiert.
    • c) Western-Blot von Ganzzell-Lysat von E. coli, welches das BdRF1-β-Galactosidase-Fusionsprotein exprimiert.
    • d) Western-Blot von Ganzzell-Lysat von E. coli, welches lediglich β-Galactosidase exprimiert.
  • Die Blots wurden mit einem Satz von individuellen Seren sondiert. Die in den Spuren 1–16 der Blots verwendeten Seren waren jeweils:
    • 1. Monoklonaler Maus-Antikörper gegen β-Gal (Promega).
    • 2. Monoklonaler Maus-Antikörper gegen VCA-P40, erzeugt durch Immunisieren mit natürlichen viralen Capsidproteinen (EBV.OT41A).
    • 3. Humaner Antikörper, der für virales VCA-P18 monospezifisch ist, welcher durch spezifische Immunaffinitätsreinigung mit viralem VCA-P18 erhalten wurde.
    • 4–5 Humane EBV-seronegative Seren.
    • 6–16 Humane EBV-seropositive Seren mit unterschiedlicher relativer Reaktivität gegenüber viralem VCA-P18 und VCA-P40.
  • 3:
    Immunoblots von drei humanen Seren (Serum 92, Serum 214 und Serum 219) auf Nitrozellulosestreifen, welche mit den folgenden Mengen an BFRF3-β-Galactosidase-Fusionsprotein vorabsorbiert worden waren:
    Spur 1: 0 μg BFRF3-β-Galactosidase
    Spur 2: 0,01 μg BFRF3-β-Galactosidase
    Spur 3: 0,1 μg BFRF3-β-Galactosidase
    Spur 4: 0,5 μg BFRF3-β-Galactosidase
    Spur 5: 1 μg BFRF3-β-Galactosidase
  • Die Spur, in welcher nur β-Galactosidase vorhanden ist, ist als Spur β gekennzeichnet.
  • 4:
    Ergebnisse der PEPSCAN-Analyse: Prozentsatz von 15 humanen Seren aus gesunden EBV-seropositiven Spendern, welche mit 12mer-Peptiden aus der VCA-18-Sequenz reaktiv waren. Die Startpositionen der 12mer-Peptide innerhalb der Aminosäuresequenz des VCA-p18-Proteins sind auf der X-Achse angegeben.
  • 5a und 5b:
    PEPSCAN-Ergebnisse (optische Dichte bei 450 nm) einer Analyse von VCA-p18-abgeleiteten 12mer-Peptiden, wobei zwei gegen VCA-p18 gerichtete monoklonale Ratten-Antikörper verwendet wurden (EBV.OT15E bzw. EBV.OT15I).
  • 6:
    PEPSCAN-Ergebnisse einer Analyse von, aus dem VCA-40-Protein abgeleiteten, 12mer-Peptiden mit einem monoklonalen Maus-Antikörper (EBV.OT41A), der gegen VCA-p40 gerichtet ist.
  • 7:
    ELISA-Reaktivität (optische Dichte bei 450 nm) von 43 humanen Serumproben, welche aus gesunden Blutspendern erhalten wurden, getestet hinsichtlich IgG-Reaktivität gegen ausgewählte synthetische Peptide, die aus dem BFRF3-codierten VCA-p18-Protein abgeleitet wurden.
    • Δ
    gibt Seren an, welche bei standardmäßiger serologischer Analyse negativ waren.
    ☐
    gibt Seren an, welche bei standardmäßiger serologischer Analyse positiv waren.
    ♢
    gibt Seren an, welche bei standardmäßiger serologischer Analyse hinsichtlich EBV-Antikörpern uneindeutig, aber auf dem Immunoblot negativ waren.
    *
    gibt Seren an, welche bei standardmäßiger Serologie positiv, aber auf dem Immunoblot hinsichtlich Anti-p18-Antikörpern negativ waren.
    Peptid 1: H2N-GVPRRQRAIDKRQRA-COOH
    Peptid 2: H2N-GQPHDTAPRGARKKQ-COOH
    Peptid 3: H2N-AVDTGSGGGGQPHDTAPRGARKKQ-COOH
    Peptid 4: H2N-STAVAQSATPSVSSSISSLRAATSGATAAA-COOH
    Peptid 5: Kombi-Peptid von Peptid 4 und 3, verknüpft durch S-S-Brückenbindung.
  • 8a, b, c:
    Analyse der Immunreaktivität (ELISA) des Kombi-Peptides Nr. 5 mit:
    • a) humanem IgG (76 VCA-I.F.-positive Seren)
    • b) humanem IgM (26 IgM-positive Seren)
    • c) humanem IgA (35 Seren aus NPC-Patienten)
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Vorgehensweise zur Isolierung und Identifizierung neuer DNA-Sequenzen, welche EBV-Proteine codieren.
  • Die für die Identifizierung befolgte allgemeine Strategie, welche zu den neuen EBV-Marker-Molekülen führte, kann in die folgenden Phasen unterteilt werden.
    • 1. Identifizierung und Herstellung von Antikörperreagenzien, die mit den EBV-Markermolekülen spezifisch reaktiv sind.
    • 2. Herstellen einer cDNA-Bank aus poly-A-selektierter oder gesamter Zell-mRNA, welche aus EBV-exprimierenden Zellen isoliert worden war, oder Herstellen einer genomischen DNA-Bank aus Fragmenten des viralen Genoms, vorzugsweise im Phagen Lambda gt11, gefolgt von Screening der Phagen-synthetisierten Proteine mit den oben genannten Antikörperreagenzien.
    • 3. Reinigung der reaktiven Phagen und Identifizierung der EBV-spezifischen Insertsequenzen, welche innerhalb des Genoms der Phagen enthalten sind.
    • 4. Korrelation der Insertsequenzen mit der veröffentlichten Prototyp-EBV-Genomsequenz, um die entsprechenden EBV-spezifizierten offenen Leserahmen zu lokalisieren.
    • 5. Klonierung, Expression und Produktion der identifizierten offenen Leserahmen in alternativen Wirtszellen, wie E. coli, Baculovirus, Hefe oder höheren eukaryotischen Zellen oder alternativen Expressions-, d. h. Produktionssystemen.
  • Diese Vorgehensweisen werden nachstehend ausführlich dargelegt und werden durch das Schema, wie abgebildet in der 1, veranschaulicht.
  • (Phase 1:)
  • Zellkulturen und Zellextrakte.
  • Die P3HR1-abgeleitete Zelllinie HH514.c16 wurde als Suspensionskultur in Rollerflaschen vermehrt und hinsichtlich VCA- und EA-Expression unter Verwendung von 20 ng/ml 12-Tetradecanophorbol-13-acetat (TPA) und 3 mM Natriumbutyrat exakt so induziert, wie es von Middeldorp und Herbrink (J. Virol. Meth., 21, 133–146, 1988) beschrieben wurde. Für die selektive Expression nur von EA-Antigenen wurde die virale DNA-Polymerase durch die Zugabe von 0,5 mM Phosphonoessigsäure zu der induzierten Zellkultur blockiert.
  • Monoklonale Antikörper.
  • Für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern wurden BALB/c-Mäuse mit der nukleären Fraktion von VCR-induzierten HH514-Zellen (F. Wielaard et al., J. Virol. Meth., 21, 105–115, 1988) oder mit gründlicher gereinigten Proteinen aus diesen Zellen oder aus alternativen Expressionssystemen immunisiert. Hybridome wurden gemäß Standardprotokollen hergestellt, und Überstände wurden in standardmäßigen EBV-Immunfluoreszenztests und auf Immunoblotstreifen, enthaltend Antigenextrakte aus VCR-induzierten HH514-Zellen, wie beschrieben von Middeldorp und Herbrink, J. Virol. Meth., 21, 133–146 (1988), analysiert.
  • Affinitätsreinigung von Anti-VCA-p18-Antikörpern.
  • Anti-VCA-p18-Antikörper wurden aus einem humanen EBV-positiven Serum gemäß dem Verfahren von Robinson und Miller (The herpesviruses, Band 1, 151–192, 1991, Publ. Plenum Publishing Corp. New York) mit einigen kleineren Modifikationen gereinigt. Kurz gesagt, wurden die Proteine, im Anschluss an die elektrophoretische Auftrennung in 10%igen Acrylamidgelen, auf PVDF-Membranen (Millipore Corporation, Bedford, USA) geblottet, und die Region auf der PVDF-Membran, entsprechend VCA-p18, wurde ausgeschnitten und als Affinitätsmatrix verwendet. Nicht-spezifische Bindung von Antikörpern an die Streifen wurde durch Inkubation über Nacht in Blockierungslösung (5% Trockenmilchpulver, 4% Pferdeserum in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (PBS)) verhindert. Danach wurden die Streifen mit verdünntem humanen Serum (1:25 in Blockierungslösung) 2 Stunden lang inkubiert. Nach drei Waschschritten mit PBS, enthaltend 0,05% Tween-20, wurden die gebundenen Antikörper mit 0,1 M Glycin, pH 2,7, in zwei aufeinanderfolgenden Inkubationen eluiert. Das Eluat wurde mit 1/20 Volumen an 1 M Tris/HCl, pH 9,0, neutralisiert. Schließlich wurde das Eluat gegen PBS dialysiert und in Aliquots bei –20°C aufbewahrt.
  • (Phase 2:)
  • RNA-Reinigung von HH514.c16-Zellen.
  • Gesamt-RNA wurde aus induzierten HH514.c16-Zellen durch die Guanidinium/CsCl-Prozedur eluiert, wie es von Maniatis et al. (Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) beschrieben wurde. Die Reinigung von Poly(A+)-RNA wurde durch Oligo(dT)-Chromatographie (Pharmacia, Inc., Piscataway N. Y.) durchgeführt, wie es von Ausubel et al. (Current protocols in molecular biology (1991), Greene Publishing Associates, John Wiley & Sons, New York) beschrieben wurde.
  • Northern-Blot-Analyse.
  • Gesamt-RNA (10 μg) wurde durch Glyoxal (P. S. Thomas, Methods in Enzymology, 100, 255–266, 1983) denaturiert und in Agarosegelen laufen gelassen. Nach einer Färbung mit Ethidiumbromid wurde die aufgetrennte RNA auf Nitrozellulose vakuumgeblottet. Nach 3 Stunden langer Vorhybridisierung wurde der Filter über Nacht bei 42°C mit [α-32P]-markierten (Amersham, Bristol, Großbritannien), statistisch geprimten oder nick-translatierten DNA-Sonden hybridisiert. Die Hybridisierungslösungen bestanden aus 50% Formamid, 5×SSPE, 5×Denhardt-Lösung (0,1% (w/v) Polyvinylpyrrolidon, 0,1% (w/v) BSA, 0,1% (w/v) Ficoll), 0,2 mg schallbehandelter Heringssperma-DNA pro ml und 0,5% SDS. Anschließend wurden die Blots gewaschen und an Röntgenfilm (Eastman Kodak Co., Rochester, N. Y., USA) unter Verwendung von Verstärkerfolien exponiert.
  • Konstruktion einer cDNA-Bibliothek in Lambda-gt11.
  • Fünf Mikrogramm Poly(A+)-selektierte RNA wurden mit Methylquecksilberhydroxid denaturiert. Die cDNA-Synthese wurde entweder mit Oligo(dT) oder Hexanukleotiden geprimt. Vorgehensweisen für Erst- und Zweitstrang-Synthese waren identisch zu denjenigen, welche von Gubler und Hoffman (Gene 25, 263–269, 1983) beschrieben wurden. Nach EcoRI-Methylierung, EcoRI-Linker-Addition und EcoRI-Verdau wurde die modifizierte cDNA nach der Größe durch Sepharose-CL4B(Pharmacia)-Chromatographie selektiert, wie es in Maniatis et al. beschrieben wurde. cDNA mit einer variierenden Größe von 0,5 kB bis 3,0 kB wurde in Phosphatase-behandelte Lambda-gt11-Arme ligiert, gefolgt von In-vitro-Verpackung unter Verwendung des Packagene-Kits (Promega, San Diego, USA).
  • Immunologisches Screening der Lambda-gt11-Bibliothek.
  • Insgesamt 1 × 104 rekombinante Phagen der Oligo(dT)-geprimten Bibliothek und 5 × 105 Rekombinanten der Hexanukleotid-geprimten Bibliothek wurden hinsichtlich immunologischer Reaktivität (siehe Maniatis et al.) mit affinitätsgereinigten humanen Anti-p18-Antikörpern oder dem monoklonalen Antikörper EBV.OT41A gescreent. Immunreaktive Plaques wurden jeweils mit an alkalische Phosphatase konjugiertem Anti-Mensch- oder Anti-Maus-IgG nachgewiesen, wie es vom Hersteller (Promega) beschrieben wird.
  • (Phase 3:)
  • Nukleotidsequenzanalyse.
  • Insert-DNA von positiven Plaques, gereinigt durch wiederholtes Plaque-Lifting und Immuno-Screening, wurde durch die Polymerasekettenreaktion(PCR)-Technik unter Verwendung von Primern der Lambda-gt11-Flankierungs-Sequenzen, welche Restriktionsstellen an ihrem 5'-Ende enthielten, amplifiziert. Nach dem Verdau mit dem passenden Restriktionsenzym wurde das DNA-Fragment in pGEM-4Z subkloniert und von beiden Seiten her unter Anwendung eines Sequenz-Kits (Pharmacia, Uppsala, Schweden), welches eine Modifikation des Verfahrens von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463–5467, 1997) anwendet, sequenziert.
  • (Phase 4:)
  • Alignment von Sequenzen.
  • Sequenzen wurden mit der veröffentlichten Sequenz von EBV-B95-8-Prototyp (Baer et al., Nature 310, 207–211, 1984), wie hinterlegt bei der EMBL-Sequenzdatenbank, aligniert bzw. parallel übereinandergestellt, wobei die Software-Programme der "University of Wisconsin, Genetics Computer Group" (Gribshov et al., Nucl. Acid. Res., 14, 327–334, 1986) eingesetzt wurden.
  • (Phase 5:)
  • Klonierung und Expression von BFRF3 und BdRF1 in E. coli.
  • Die im EBV-Genom codierten offenen Leserahmen (ORFs) BFRF3 und BdRF1 wurden durch PCR unter Verwendung von viraler DNA, welche aus, durch Saccharose-Dichtezentrifugation aus HH514.c16-Kultur-Überständen isolierten Virionen gereinigt worden war, als Ziel amplifiziert. Primer von jedem Satz, welche Restriktionsstellen an ihrem 5'-Ende enthielten, wurden für die Klonierung des amplifizierten Fragments in die EcoRI-HindIII-Stelle des Expressionsvektors pMLB1113 verwendet (ein Derivat von PBR322) (Zagurski und Berman, Gene, 27, 183–101, 1984), welche am fünften Codon des 5'-Endes des LacZ-Gens lokalisiert ist. Von diesen Konstrukten aus exprimierte Proteine bestehen aus den ersten 5 Aminosäuren von β-Galactosidase, gefolgt von dem rekombinanten Protein, wobei sie an ihrem C-Terminus an den Rest der β-Galactosidase verknüpft sind. Nicht-Fusions-Proteine wurden in ähnlicher Weise konstruiert, wobei jedoch ein Stopcodon am 3'-Ende des Inserts inseriert war.
  • E. coli-Expression von rekombinanten Proteinen.
  • Transformierte E. coli-Kulturen wurden durch Zugabe von 1 mM IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induziert. 2 Stunden nach der Induktion wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation abgesammelt und in SDS-PAGE-Probenpuffer suspendiert und durch Immunblotting analysiert.
  • Beispiel 2:
  • Immunreaktivität der VCA-p18- und VCA-p40-Proteine.
  • Die Immunreaktivität der unter Befolgung des Vorgehens, wie skizziert in Beispiel 1, erhaltenen Proteine wurde mittels Immunoblot-Analyse untersucht. Für diesen Zweck wurden Ganzzell-Proteine von entweder VCA-induzierten HH514.c16-Zellen oder E. coli, welches BFRF3- oder BdRF1-β-Galactosidase-Fusionsproteine oder lediglich β-Galactosidase exprimierte, durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulose geblottet. Aus diesen Blots hergestellte Streifen wurden mit individuellen Seren und Antikörperpräparationen inkubiert.
  • Immunoblot-Vorgehen:
  • Das Immunoblot-Vorgehen wurde im Wesentlichen durchgeführt, wie es von Middeldorp und Herbrink (J. Virol. Meth., 21, S. 133–159, 1988) beschrieben wurde, und ist nachstehend kurz dargestellt: Nach der SDS-PAGE wurden die Proteine auf Nitrozellulose-Filter (0,2 μ Schleicher & Schuell, Den Bosch, Niederlande) überführt. Nicht-spezifische Bindung von Antikörpern an die Filter wurde durch Inkubation während mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) mit Blockierungspruffer (4% Trockenmilchpulver, 5% Pferdeserum in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS)) verhindert. Humane Seren wurden zu einer geeigneten Verdünnung in Blockierungspuffer verdünnt und mindestens 1 Stunde lang inkubiert. Blots oder Streifen wurden dreimal in TBS + 0,05% Tween-20 (TBSt) gewaschen, und mit alkalischer Phosphatase (AP) konjugierter Anti-Mensch-IgG-Antikörper (Promega) oder HRP-konjugiertes Anti-Maus-IgG oder Anti-Ratte-IgG (Organon Teknika Cappel, Boxtel, Niederlande) wurde bei der angemessenen Verdünnung in Blockierungspuffer zugegeben. Nach weiteren Inkubations- und Spülschritten wurde der Blot unter Verwendung von Nitroblau-Tetrazolium (NBT) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) als Substraten für AP und 4-Chlornaphtol für HRP entwickelt.
  • Die resultierenden Blots sind in der 2a–d abgebildet. Die in den Spuren 1–12 der Blots verwendeten Seren waren jeweils:
    • 1. Monoklonaler Maus-Antikörper gegen β-Gal (Promega).
    • 2. Monoklonaler Maus-Antikörper gegen VCA-P40, erzeugt durch Immunisieren mit natürlichen viralen Capsidproteinen (EBV.OT41A).
    • 3. Humaner Antikörper, der für virales VCA-P18 monospezifisch ist, welcher durch spezifische Immunaffinitätsreinigung mit viralem VCA-P18 erhalten wurde.
    • 4–5 Humane EBV-seronegative Seren.
    • 6–16 Humane EBV-seropositive Seren mit unterschiedlicher relativer Reaktivität gegenüber viralem VCA-P18 und VCA-P40.
  • Die 2a zeigt die Immunreaktivität der natürlichen viralen Polypeptide, aufgetrennt durch reduzierende SDS-PAGE in 12,5%igem Acrylamid. Anti-β-Galactosidase-Antikörper sind negativ (1), wohingegen Antiseren, welche spezifisch für VCA-p40 (2) und VCA-p18 (3) sind, mit den jeweiligen viralen Proteinen reagieren. Die Streifen 4 und 5, welche mit humanen EBV-negativen Seren gefärbt wurden, zeigen keine Reaktivität, wohingegen die Streifen 6–16 unterschiedliche Immunreaktivitäten mit EBV-Proteinen repräsentieren, wie sie in normalen gesunden seropositiven Blutspendern (6–15) oder Patienten mit einer aktiven EBV-Erkrankung (16) gefunden werden. Positionen der VCA-p18- und VCA-p40-Banden sind auf der rechten Seite angegeben.
  • Die 2b zeigt die Immunreaktivität von Gesamtzellproteinen aus E. coli, welches das VCA-p18-β-Galactosidase-Fusionsprotein (BFRF3-LacZ) exprimiert, die durch reduzierende SDS-PAGE in 10%igem Acrylamid aufgetrennt worden waren. Anti-β-Galactosidase- (1) und Anti-VCA-p18-Antikörper (3) reagieren spezifisch mit einer Anzahl von Proteinbanden, welche auf die proteolytische Fragmentierung des ursprünglichen Fusionproteins bei 134 kDa in E. coli zurückzuführen sind. Der monoklonale Anti-VCA-p40-Antikörper (2) ist negativ, ebenso wie die humanen EBV-negativen Seren (4–5). Humane Seren mit verschiedenen Reaktivitäten gegenüber viralem VCA-p18 zeigen ähnliche verschiedene Reaktivitäten auf dem Fusionsprotein. Wiederum beruht die Anfärbung von mehreren Banden auf dem proteolytischen Abbau des Fusionsproteins in E. coli.
  • Die 2c zeigt die gleiche Analyse für das VCA-p40-β-Galactosidase-Fusionsprotein in E. coli, welches weniger empfindlich gegenüber Proteolyse ist, was zu einer Einzelbande bei 156 kDa führt. Die Interpretation von 2c ist analog zu 2b.
  • Die 2d repräsentiert einen Kontroll-Blot von E. coli, welches nur β-Galactosidase exprimiert.
  • Aus der oben beschriebenen Untersuchung ist es offensichtlich, dass die einzelnen E. coli-Konstrukte tatsächlich die jeweiligen Fusionsproteine exprimieren. Humane Seren zeigen die gleiche Reaktivität gegenüber den exprimierten Proteinen wie gegenüber den natürlichen viralen Proteinen.
  • Beispiel 3:
  • Immunadsorption.
  • Die immunchemische Identität eines alternativen Peptids gemäß der Erfindung und des entsprechenden natürlichen viralen Proteins kann durch Vorabsorption von humanen Seren, welche auf Immunoblots reaktiv sind, die natürliche virale Protein(e) enthalten, mit verschiedenen Konzentrationen des Peptids gemäß der Erfindung bewiesen werden, was zu dem Verschwinden von spezifischer Antikörperreaktivität gegen das entsprechende natürliche virale Protein auf dem Blot führt. Zusätzlich zum Beweisen der immunochemischen Identität liefert diese Technik einen starken Beweis, dass die Immunreaktivität eines viralen Proteins auf Immunoblots durch Antikörperbindung an eine einzelne (dominante) Proteinspezies vermittelt wird.
  • Ein Experiment, wie oben beschrieben, wurde für das VCA-p18-Marker-Protein durchgeführt:
    Die Immunreaktivität von humanen Seren (Serum 92, Serum 214 und Serum 219), welche aus drei gesunden EBV-seropositiven Spendern erhalten wurden, wurde durch Immunoblot-Analyse auf Nitrozellulosestreifen untersucht, welche nukleäre Antigene aus VCA-induzierten HH514-Zellen enthielten, die durch reduzierende SDS-PAGE in 10%igen Acrylamidgelen aufgetrennt worden waren. Die Seren wurden über Nacht bei +4°C mit wachsenden Mengen an gereinigtem BFRF3-β-Galactosidase-Fusionsprotein oder nur mit β-Galactosidase vor der Immunoblot-Analyse präabsorbiert (Die Färbung hinsichtlich IgG-Reaktivität wurde mit Peroxidasemarkiertem Schaf-Anti-Mensch-IgG durchgeführt, wobei N-Chlornaphtol als präzipitierendes Substrat verwendet wurde).
  • Die Ergebnisse dieses Experiments werden von der 3 veranschaulicht. Die Mengen an gereinigtem BFRF3-β-Galactosidase-Fusionsprotein, welche in der Präabsorption von 1 ml an 1:100 verdünntem Serum verwendet wurden, analysiert in den jeweiligen Spuren des Immunoblots, wie abgebildet in der 3, waren:
    Spur 1: 0 μg BFRF3-β-Galactosidase
    Spur 2: 0,01 μg BFRF3-β-Galactosidase
    Spur 3: 0,1 μg BFRF3-β-Galactosidase
    Spur 4: 0,5 μg BFRF3-β-Galactosidase
    Spur 5: 1 μg BFRF3-β-Galactosidase
  • Die Spur, in welcher nur β-Galactosidase für die Präabsorption verwendet wurde, ist als Spur β gekennzeichnet.
  • Aus der 3 kann man ersehen, dass die Reaktivität der Bande, welche VCA-p18 repräsentiert (Pfeil), mit zunehmenden Konzentrationen an BFRF3-β-Galactosidase-Fusionsprotein während der Präabsorption verschwindet. Die Präabsorption mit β-Galactosidase allein hatte keine Auswirkung, wohingegen Reaktivität mit anderen EBV-Proteinen durch irgendeine der Präabsorptionen nicht beeinflusst bzw. bewirkt wird. Die Färbung von nicht-verwandten Proteinen (z. B. EBNA, bei 72 kD oder VCA-p40 bei 40 kD) wird nicht bewirkt.
  • Aus dem oben beschriebenen Experiment ist es deutlich, dass die Immunfärbung von viralem VCA-p18 durch humane Serum-Antikörper durch Präabsorption dieser Seren mit BFRF3-Fusionsproteinen spezifisch inhibiert wird, was die immunochemische Identität von VCA-p18 und dem Protein, welches von dem BFRF3-Leserahmen codiert wird, beweist. Diese Experimente zeigen auch, dass die Reaktivität von humanen Seren mit VCA-p18 durch Wechselwirkung mit einem einzelnen viralen Protein verursacht wird.
  • Beispiel 4:
  • Lokalisierung von immunreaktiven Epitopen durch PEPSCAN.
  • Peptidsynthese und Immuno-Screening (PEPSCAN).
  • Peptide mit einer Länge von 12 Aminosäuren (AA) und einer Überlappung von 11 AA der AA-Sequenz von ORF BFRF3 und BdRF1 wurden durch automatisierte Festphasen-Peptidsynthese auf chemisch aktivierte Polyethylen-Nadeln synthetisiert, wie es ursprünglich von Geijsen et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83, 3998–4002, 1984) beschrieben wurde. Die Immunreaktivität für EBV-spezifische Antikörper unter Verwendung von 15 Seren aus gesunden EBV-seropositiven Spendern wurde ermittelt, wie es von Middeldorp und Meloen beschrieben wurde (J. Virol. Meth., 21, 147–159, 1988). Die Ergebnisse der PEPSCAN-Analyse von 12-AA-Peptiden, die aus der VCA-p18-Sequenz abgeleitet wurden, sind in der 4 gezeigt. Die Zahlen auf der X-Achse repräsentieren die Startposition auf der VCA-p18-Sequenz von jedem analysierten 12mer-Peptid. Auf der Y-Achse in 4 ist der Prozentsatz an humanen Seren angegeben, die mit einem bestimmten 12mer-Peptid des VCA-p18-Proteins, das im BFRF3-Leserahmen codiert wird, reaktiv sind. Eine positive Reaktion ist als die 3-fache Standardabweichung über der Mittelwert-Reaktivität von EBV-seronegativem humanen Serum auf dem gleichen Satz von Nadeln definiert. Aus der 4 können drei immundominante Domänen definiert werden:
    Domäne I: AA 120–140, Domäne II: AA 152–155, Domäne III: AA 159–165 (Diese Zahlen zeigen erneut die Startposition der für PEPSCAN verwendeten 12mer-Peptide). Die Tabelle 1 gibt eine ausführliche Beschreibung der reaktivsten Peptide für jedes, in dieser Untersuchung verwendete, individuelle Serum an. In der ersten Spalte von Tabelle 1 ist die Nummer der einzelnen Seren angegeben. Die zweite Spalte gibt den PEPSCAN-OD450-Wert (optische Dichte bei 450 nm) für das reaktivste Peptid innerhalb von Domäne I an, wobei das Peptid in der Spalte 3 angegeben wird. Die Spalten 4 und 5 repräsentieren ähnliche Daten für die Domäne II und III.
  • Tabelle 1: Immunologische Antwort von 15 EBV-VCA-p18-positiven Seren. (Nur die Antwort des reaktivsten Peptids, welches in den wichtigen Epitopdomänen von VCA-p18 lokalisiert ist, wird veranschaulicht).
    Figure 00250001
  • Beispiel 5:
  • PEPSCAN-Analyse mit monoklonalen Ratten- und Maus-Antikörpern, welche gegen das BFRF3-codierte VCA-p18-Protein oder das BdRF1-codierte VCA-p40-Protein gerichtet sind.
  • Eine PEPSCAN-Analyse wurde auf eine ähnliche Weise zu dem in Beispiel 4 beschriebenen Vorgehen für humane Seren durchgeführt, um die Position von linearen Epitopen abzugrenzen, welche durch monoklonale Antikörpern nachgewiesen wurden.
  • Die 5a und 5b zeigen die PEPSCAN-Ergebnisse einer solchen Analyse unter Verwendung von zwei monoklonalen Ratten-Antikörpern, welche gegen VCA-p18 gerichtet sind (EBV.OT15E bzw. EBV.OT15I), welche jeweils ein anderes lineares Epitop nachweisen.
  • Die 6 zeigt die PEPSCAN-Ergebnisse für einen monoklonalen Maus-Antikörper (EBV.OT41A), welcher gegen VCA-p40 gerichtet ist, welches von dem offenen Leserahmen BdRF1 codiert wird. Die Kreuzanalyse der zwei monoklonalen Ratten-[Antikörper] auf der VCA-p40(BdRF1)-Sequenz und umgekehrt des monoklonalen Maus-[Antikörpers] auf der VCA-p18(BFRF3)-Sequenz ergab deutliche negative Ergebnisse.
  • Aus der 6 ist es offensichtlich, dass EBV.OT41A ein gesondertes lineares Epitop in der C-terminalen Region des VCA-p40-Proteins erkennt.
  • Beispiel 6:
  • Selektion von synthetischen Peptiden, abgeleitet aus dem BFRF3-codierten VCA-p18-Protein, durch Computeranalyse und PEPSCAN, und Analyse der Immunreaktivität dieser Peptide mit normalen humanen Spender-Seren.
  • Synthetische Peptide wurden durch standardmäßige Festphasensynthese unter Anwendung der t-BOC-Chemie hergestellt. Peptide aus dem BFRF3-codierten VCA-p18-Protein wurden entweder auf Basis einer vorhergesagten hohen Antigenizität unter Einsatz des von Jameson und Wolf (CABIOS 4, 181–186, 1988) entwickelten Computerprogramms "Antigenic index" [Die Peptide 1 und 2 in der 7 wurden auf dieser Grundlage ausgewählt] oder auf Basis einer funktionellen hohen Antigenreaktivität im PEPSCAN, wie beschrieben im Beispiel 4, ausgewählt [Die Peptide 3 und 4 in der 7 wurden auf dieser Grundlage ausgewählt, wobei sie die Domäne I plus II und Domäne III aus der Tabelle 1 repräsentieren]. Darüber hinaus wurde ein Kombi-Peptid hergestellt (Peptid 5 in der 7), welches eine Kombination der drei reaktivsten Domänen, welche durch PEPSCAN identifiziert wurden, repräsentiert, wobei diejenigen Peptidregionen ausgelassen werden, welche eine niedrige PEPSCAN-Reaktivität zeigen.
  • Die Peptide 1–5 mit Aminosäuresequenzen, wie nachstehend angegeben, wurden auf die feste Phase, d. h. die Vertiefungen von Polystyrol-Mikrotiterplatten, bei 1 μg je ml in 0,05 M NHCO3-Puffer bei pH 9,6 über Nacht bei 4°C aufbeschichtet. Nach zweimaligem Waschen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,4 wurden die Vertiefungen mit 100 μl humanem Serum, welches 1:100 in PBS verdünnt worden war, das 0,05% Tween 20 enthielt (PEST), gefüllt und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Nach drei PBS-T-Waschschritten wurden HRP-markierte Schaf-Anti-Mensch-IgG-Antikörper bei der passenden Verdünnung in PBS-T zugegeben und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Nach drei PBS-T-Waschschritten wurde gebundene Enzymaktivität unter Verwendung von Tetramethylbenzidin als Substrat nachgewiesen. Die Reaktion wurde nach 30 Minuten durch Zusetzen von 100 μl 1M H2SO4 gestoppt. Die Absorption bzw. Extinktion wurde bei 450 nm unter Verwendung eines Multiscan-Photometers gemessen.
  • Die Seren wurden hinsichtlich EBV-Antikörpern unter Anwendung von standardmäßiger Immunfluoreszenz-Serologie oder Immunoblot-Analyse, wie zuvor beschrieben, getestet. Die verwendeten Peptide waren:
    Peptid 1: H2N-GVPRRQRAIDKRQRA-COOH
    Peptid 2: H2N-GQPHDTAPRGARKKQ-COOH
    Peptid 3: H2N-AVDTGSGGGGQPHDTAPRGARKKQ-COOH
    Peptid 4: H2N-STAVAQSATPSVSSSISSLRAATSGATAAA-COOH
    Peptid 5: Kombi-Peptid von Peptid 4 und 3, verknüpft durch S-S-Brückenbindung,
    unter Verwendung von Extra-Cysteinresten am C-Terminus von Peptid 4
    und dem N-Terminus von Peptid 3.
  • Die 7 zeigt die Ergebnisse von ELISA-Experimenten unter Verwendung der Peptide 1–5, welche auf die feste Phase beschichtet waren, und einer statistischen Auswahl an Seren aus gesunden menschlichen Blutspendern, welche bei einer Verdünnung von 1:100 gemäß Standardvorgehensweisen eingesetzt wurden.
  • Anschließend wurden diese Seren durch Immunoblot hinsichtlich der Reaktivität mit viralem VCA-p18 getestet.
  • Aus diesen Experimenten ist es offensichtlich, dass die auf dem Programm "Antigenic index" beruhenden Computervorhersagen keinen Vorhersagewert in Bezug auf die Immunogenizität gegenüber Seren aus natürlich infizierten Individuen besitzen, da fast alle Seren mit dem Peptid 1 negativ waren, wohingegen das Peptid 2 mit nur etwa 50% der getesteten Seren reaktiv ist. Peptide, welche auf der Basis von PEPSCAN gewählt wurden, zeigen eine gute Reaktivität mit jeweils 60–80% der getesteten Seren. Überraschenderweise zeigt das Kombi-Peptid, welches die Peptide 3 und 4 vereinigt, 95% Reaktivität mit humanen Seren. Im P18-Immunoblot negative Seren zeigen keinerlei Reaktivität mit den ausgewählten Peptiden.
  • Beispiel 7:
  • Reaktivität von Kombi-Peptid 5, abgeleitet aus dem BFRF3-codierten VCA-p18-Protein, mit humanen Serum-Antikörpern von verschiedenen Unterklassen.
  • Das Kombi-Peptid 5, mit der Aminosäuresequenz, wie sie im Beispiel 6 beschrieben ist, wurde verwendet, um die Reaktivität von humanen Serum-Immunglobulinen von verschiedenen Unterklassen mittels ELISA zu analysieren (Vorgehen, wie im Beispiel 6 beschrieben). In allen Fällen wurde das Kombi-Peptid 5 auf der festen Phase exakt wie in Beispiel 6 beschrieben verwendet. Die Antikörperreaktivität wurde nachgewiesen, wie beschrieben im Beispiel 6, unter Verwendung von 1:100 verdünnten Seren. Die Ergebnisse sind in der 8 gezeigt. Die IgM-Reaktivität wurde in humanen Seren nachgewiesen, welche mit Gull-Sorb (Gull Laboratories Inc., Salt Lake City, Utah, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers vorabsorbiert worden waren, um IgG-Reaktivität zu inhibieren. IgM-Antikörper wurden mit HRP-markierten Schaf-Anti-Mensch-IgM-Antikörpern, die spezifisch für die schwere Kette von humanem IgM waren, nachgewiesen. IgA-Reaktivität wurde ebenfalls in Gull-Sorb-behandelten Seren unter Verwendung von Anti-IgA-spezifischen, HRP-markierten Zweit-Antikörpern nachgewiesen.
  • Die Seren für 8a (IgG) wurden aus 76 gesunden seropositiven Blutspendern, welche bei Standardserologie positiv für VCA-IgG waren, und 9 Spendern, welche hinsichtlich EBV-Antikörpern negativ waren, erhalten.
  • Die Seren für 8b (IgM) wurden aus 26 Mononukleose-Patienten, welche bei Standard-Serologie positiv hinsichtlich VCA-IgM waren, und 18 gesunden Spendern, welche negativ hinsichtlich VCA-IgM aber positiv hinsichtlich VCA-IgG waren, erhalten.
  • Die Seren für 8c (IgA) wurden aus 35 bestätigten Nasopharynx-Karzinom-Patienten, von denen keine IgA-spezifischen Daten verfügbar waren, aber von denen alle IgG-VCA-positiv waren, und aus 7 gesunden VCA-IgG-positiven Spendern erhalten.
  • Aus den oben aufgeführten Experimenten lässt sich ersehen, dass das von VCA-p18 abgeleitete Kombi-Peptid für den spezifischen Nachweis von IgG-, IgM- und IgA-Antikörpern gegen EBV-VCA mit einer Empfindlichkeit verwendet werden kann, die ähnlich oder besser als bei standardmäßigen serologischen Techniken ist. EBV-negative Seren sind in allen Fällen negativ.
  • SEQUENZAUFLISTUNG
    Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001

Claims (14)

  1. Peptid, welches immunchemisch mit den Antikörpern gegen den Epstein Barr Virus reagiert und mindestens einen Teil des VCA-p40 Proteins umfasst, welches innerhalb des offenen EBV-Leserahmens BdRF1 kodiert wird, oder eine funktionelle Variante davon, mit den gleichen Eigenschaften.
  2. Peptid nach Anspruch 1, welches mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz umfasst, wie sie in SEQ ID Nr 4 dargestellt wird, oder eine funktionelle Variante davon mit den gleichen Eigenschaften.
  3. Antikörper, welcher speziell gegen ein Peptid nach einem der Ansprüche 1–2 gerichtet ist.
  4. Antikörper nach Anspruch 3, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
  5. Monoklonaler Antikörper (EBV.OT41A) der durch Maus-Maus-Hybridomzelllinien erzeugt wird, welche in der "European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down (UK) unter der Depositennummer 93020414 hinterlegt wurden.
  6. Monoklonaler Antikörper mit dem gleichen Reaktionsvermögen gegenüber VCA-p40 wie der monoklonale Antikörper EBV.OT41A, der durch Maus-Maus-Hybridomzelllinien erzeugt wird, welche in der "European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down (UK) unter der Depositennummer 93020414 hinterlegt wurden.
  7. Immortalisierte Zelllinie, welche fähig ist, monoklonale Antikörper nach Anspruch 4, 5 oder 6 zu produzieren.
  8. Immortalisierte Zelllinie, welche in der "European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down (UK) unter der Depositennummer 93020414 hinterlegt wurde.
  9. Anti-idiotypischer Antikörper welcher mit dem Antikörper nach Anspruch 3, 4, 5 oder 6 reagiert.
  10. Immunchemische Reagenz, welche einen oder mehrere Peptide nach Anspruch 1–2 umfasst, beschichtet auf einen festen Träger, betroffene(s) Peptid(e) ist synthetisch.
  11. Immunologische Reagenz, die ein oder mehrere Antikörper nach Anspruch 4–6 enthält, beschichted auf einen festen Träger.
  12. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen den Epstein-Barr Virus in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass ein immunochemischer Reagent nach Anspruch 10 mit der Probe in Kontakt gebracht wird, und die Anwesenheit von in der Probe gebildeten Immunkomplexen zwischen den Peptiden und den Antikörpern nachgewiesen wird, was ein Mass für die Anwesenheit von Antikörpern des Epstein-Barr-Virus in der Probe ist.
  13. Verfahren zum Nachweis des Epstein-Barr-Virus in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass eine immunologische Reagenz nach Anspruch 11 mit der genannten Probe in Kontakt gebracht wird woraufhin die Anwesenheit von gebildeten Immunkomplexen nachgewiesen wird, was ein Mass für die Anwesenheit des Epstein-Barr Virus in der Probe ist.
  14. Testset zur Durchführung für ein Verfahren nach Anspruch 12 oder 13.
DE69334191T 1992-03-13 1993-03-10 Epstein-Barr-Virus verwandte Peptide und Nukleinsäuresegmente Expired - Lifetime DE69334191T2 (de)

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EP92200721 1992-03-13

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