BRPI0813985B1 - Anticorpos humanos ou fragmentos de ligação a antígenos, composição farmacêutica dos mesmos e método para produzir um anticorpo anti-cd20 humana ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo - Google Patents

Anticorpos humanos ou fragmentos de ligação a antígenos, composição farmacêutica dos mesmos e método para produzir um anticorpo anti-cd20 humana ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo Download PDF

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BRPI0813985-7A
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Li-Hsien Wang
Sean Stevens
Erin M. Allison
Joel H. Martin
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Regeneron Pharmaceuticals, Inc
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Abstract

ANTICORPO HUMANO OU FRAGMENTO DE LlGAÇÃO A ANTÍGENO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, MÉTODO PARA PRODUZIR O REFERIDO ANTICORPO OU FRAGMENTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E USOS DOS MESMOS. A invenção refere-se a um anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo que se liga especificamente a CD20 humana e é capaz de induzir citotoxicidade dependente de complemento (CDC), e é capaz de aumentar o tempo de sobrevida isenta de sintomas entre cerca de 2 vezes e 9 vezes ou mais, em relação a animais tratados com o controle em um modelo murino de linfoma humano. O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é útil em um método terapêutico para tratar uma doença ou condição mediada por CD20, tal como, por exemplo, linfoma não- Hodgkin, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, doença de Crohn, leucemia linfocítica crônica, e doenças inflamatórias.

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos específicos para CD20 humana, composições farmacêuticas, e seus métodos terapêuticos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] CD20 (conhecida também como antígeno de diferenciação restrito a linfócitos B humanos ou Bp35; antigen B1 da superfície de linfócitos B, Leu-16, BM5, e LF5) é uma proteína transmembrana hidrofóbica com um peso molecular de ~35 kD, expressada sobre linfócitos pré-B e B maduros (Valentine et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:11282; Einfield et al. (1988) EMBO J. 7:711-717). A sequência de aminoácidos de CD20 humana está ilustrada em SEQ ID NO:1 (N° de Acesso do GenBank: NP_690605). Ps anticorpos anti-CD20 estão descritos, por exemplo, nos documentos nos US 5.736.137, WO 2004/056312, e US 2004/0167319.
[0003] Os métodos para produzir anticorpos úteis como produtos terapêuticos humanos incluem a geração de anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados (vide, por exemplo, a patente n° US 6.949.245). Vide também, por exemplo, os documentos nos WO 94/02602 e US 6.596.541 que descrevem métodos para gerar camundongos geneticamente modificados capazes de produzir anticorpos úteis para fabricar produtos terapêuticos humanos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0004] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece anticorpos humanos, de preferência anticorpos humanos recombinantes que se ligam especificamente a CD20 humana. Estes anticorpos se caracterizam por se ligarem especificamente a CD20 humana e por mediarem a exterminação de células de linfoma de células B que expressam CD20. Os anticorpos podem ser de comprimento inteiro (por exemplo, um anticorpo IgG1 ou IgG4) ou podem compreender apenas uma parte de ligação a antígeno (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab’)2 ou scFv), e podem ser modificados para efetivar uma funcionalidade, por exemplo, para eliminar ou intensificar funções efetoras residuais (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933).
[0005] O anticorpo ou um seu fragmento de ligação a antígeno se liga especificamente a CD20 humana e é capaz de induzir citotoxicidade dependente de complemento (CDC) de células que expressam CD20 na presença de complemento, onde o anticorpo em uma concentração de cerca de 10 nM ou menos induz 50% de lise de células Daudi e RL na presença de 5% de soro humano normal com complemente. Em modalidades preferidas, a concentração do anticorpo que induz 50% de lise é cerca de 5 nM ou menos; cerca de 2 nM ou menos; ou cerca de 1 nM ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento apresenta uma CE50 0,2 nM ou menos, medida em células Daudi, ou uma CE50 0,4 nM ou menos, medida em células RL. Em várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é capaz de aumentar o tempo de sobrevida isento de sintomas entre cerca de 2 vezes e cerca de 9 vezes ou mais, em relação a animais tratados com controle em um modelo murino de linfoma humano.
[0006] O anticorpo ou seu fragmento se liga especificamente a CD20 humana e é capaz de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) de células que expressam CD20 na presença de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), onde o anticorpo apresenta uma CE50 de cerca de 1 nM ou menos, medida em células Daudi. Em modalidades preferidas, o anticorpo apresenta uma CE50 de cerca de 50 pM ou menos; cerca de 20 pM ou menos; cerca de 10 pM ou menos. Em uma modalidade preferida, o anticorpo que apresenta maior atividade de ADCC pode compreender níveis reduzidos de fucosilação, por exemplo, cerca de 5% de fucose.
[0007] Em uma modalidade, o anticorpo ou a parte de ligação de antígeno do anticorpo da invenção compreende uma sequência da região variável da cadeia pesada (HCVR) selecionada no grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, 19, 23, 27, 43, 47, 51, 67, 71, 75, 91, 95, 99, 115, 119, 123, 139, 143, 147, 163, 167, 171, 187, 191, 195, 211, 215, 219, 235, 239, 243, 259, 263, 267, 283, 287, 291, 307, 311, 315, 331, 335, 339, 355, 359, 363, 379, 383, 387, 395, e 403, ou uma sequência substancialmente similar. Em uma modalidade preferida, o anticorpo ou fragmento compreende uma sequência de HCVR selecionada no grupo que consiste em SEQ ID NO:339, 195 e 243.
[0008] Em uma modalidade mais específica, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende ainda uma sequência da região variável da cadeia leve (LCVR) selecionda no grupo que consiste em SEQ ID NO:11, 21, 25, 35, 45, 49, 59, 69, 73, 83, 93, 97, 107, 117, 121, 131, 141, 145, 155, 165, 169, 179, 189, 193, 203, 213, 217, 227, 237, 241, 251, 261, 265, 275, 285, 289, 299, 309, 313, 323, 333, 337, 347, 357, 361, 371, 381 e 385, ou uma sequência substancialmente similar. Em uma modalidade preferida, o anticorpo ou fragmento compreende uma LCVR selecionada no grupo que consiste em SEQ ID NO:347, 203 e 251.
[0009] Em modalidades específicas, o anticorpo ou seu fragmento compreende pares de sequências de HCVR/LCVR selecionadas no grupo que consiste em SEQ ID NO:3/11, 19/21, 23/25, 27/35, 43/45, 47/49, 51/59, 67/69, 71/73, 75/83, 91/93, 95/97, 99/107, 115/117, 119/121, 123/131, 139/141, 143/145, 147/155, 163/165, 167/169, 171/179, 187/189, 191/193, 195/203, 211/213, 215/217, 219/227, 235/237, 239/241, 243/251, 259/261, 263/265, 267/275, 283/285, 287/289, 291/299, 307/309, 311/313, 315/323, 331/333, 335/337, 339/347, 355/357, 359/361, 363/371, 379/381 e 383/385. Em uma modalidade preferida, o anticorpo ou seu fragmento compreende um par de sequências de HCVR/LCVR selecionadas no grupo que consiste em SEQ ID NO:339/347, 195/203 e 243/251.
[00010] Em um segundo aspecto, a invenção fornece moléculas de ácidos nucleicos isoladas que codificam um anticorpo ou seu fragmento. Em modalidades específicas, a molécula de ácido nucleico codifica uma HCVR, onde a sequência de nucleotídeo é selecionada no grupo que consiste em SEQ ID NO:2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114, 118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 266, 282, 286, 290, 306, 310, 314, 330, 334, 338, 354, 358, 362, 378, 382, 386, 394 e 402, ou uma sequência substancialmente idêntica. Em um aspecto relacionado, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma LCVR, onde a sequência de nucleotídeo é selecionada no grupo que consiste em SEQ ID NO: 10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 106, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250, 260, 264, 274, 284, 288, 298, 308, 312, 322, 332, 336, 346, 356, 360, 370, 380 e 384, ou uma sequência substancialmente idêntica. Em uma modalidade preferida, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma HCVR codificada por uma molécula de ácido nucleico selecionada no grupo que consiste em SEQ ID NO:338, 194 e 242, e uma LCVR codificada por uma molécula de ácido nucleico selecionada no grupo que consiste em SEQ ID NO:346, 202 e 250, respectivamente.
[00011] Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, compreendendo uma cadeia pesada CDR3 da cadeia pesada (HCDR3) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada no grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, 33, 57, 81, 104, 129, 153, 177, 201, 225, 249, 273, 297, 321, 345, 369, 393, 401 e 409; e uma CDR3 da cadeia leve (LCDR3) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada no grupo que consiste em SEQ ID NO:17, 41, 65, 89, 113, 137, 161, 185, 209, 233, 257, 281, 305, 329, 353 e 377. Em uma modalidade preferida, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma sequência de HCDR3 e LCDR3 selecionada entre os pares de sequências de HCDR3/LCDR3 SEQ ID NO: 345/353, 201/209 e 249/257.
[00012] Em uma modalidade mais específica, o anticorpo ou seu fragmento compreende ainda uma sequência do domínio da cadeia pesada CDR1 (HCDR1) selecionada no grupo que consiste em SEQ ID NO:5, 29, 53, 77, 101, 125, 149, 173, 197, 221, 245, 269, 293, 317, 341, 365, 389, 397 e 405; uma sequência do domínio da cadeia pesada CDR2 (HCDR2) selecionada SEQ ID NO:7, 31, 55, 79, 103, 127, 151, 175, 199, 223, 247, 271, 295, 319, 343, 367, 391, 399 e 407; uma sequência do domínio cada cadeia leve CDR1 (LCDR1) selecionada no grupo que consiste em SEQ ID NO:13, 37, 61, 85, 109, 133, 157, 181, 205, 229, 253, 277, 301, 325, 349 e 373; e uma sequência do domínio da cadeia leve CDR2 (LCDR2) selecionada no grupo que consiste em SEQ ID NO:15, 39, 63, 87, 111, 135, 159, 183, 207, 231, 255, 279, 303, 327, 351 e 375. Em uma modalidade preferida, o anticorpo ou seu fragmento compreende sequências de CDRs de cadeia pesada e leve selecionadas no grupo que consiste em SEQ ID NO:341, 343, 345, 349, 351 and 353; 197, 199, 201, 205, 207 e 209; e 245, 247, 249, 253, 255 e 257, respectivamente.
[00013] Em um quarto aspecto, a invenção refere-se a moléculas de ácidos nucleicos isoladas que codificam um anticorpo ou fragmentos de ligação de antígeno da invenção, onde as moléculas de ácidos nucleicos que codificam um domínio HCDR3 e um domínio LCDR3 são selecionadas no grupo que consiste em SEQ ID NO:9 e 16; 33 e 41; 57 e 65; 81 e 89; 104 e 113; 129 e 137; 153 e 161; 177 e 185; 201 e 209; 225 e 233; 249 e 257; 273 e 281; 297 e 305; 321 e 329; 345 e 353; e 369 e 377, respectivamente.
[00014] Em um quinto aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, compreendendo um domínio HCDR3 e um domínio LCDR3, onde o domínio HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 -X9 - XW - X11 - X12 - X13 - X14 - X15 - X16 -X17 - X18 - X19 (SEQ ID NO:412), onde X1= A, V ou T; X2=K; X3=D; X4= P, F ou G; X5= S ou H; X6=Y; X7=G; X8=S or H; X9= G ou F; X10= S ou Y; X11= Y, N ou S; X12= Y, G ou H; X13= G, L ou S; X14= Y, M ou D; X15= Y, D ou V; X16= G, V ou está ausente; X17= M ou está ausente; X18= D ou está ausente; X19= V ou está ausente; e o domínio LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 -X9 (SEQ ID NO:415), onde X1 = Q; X2 = Q; X3 = R ou S; X4 = N, Y ou F; X5= N, D, ou Y; X6= W; X7= P; X8 = L; X9 = T.
[00015] Em uma modalidade mais específica, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende ainda domínios CDR1 e CDR2 da cadeia pesada e leve, onde o domínio HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO:410), onde X1=G; X2=F ou I; X3=T; X4=F; X5= H, R ou Y; X6=D; X7=Y; X8=T ou A; o domínio HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO:411), onde X1=I; X2=S; X3=W; X4=N; X5=S; X6= G ou D; X7=S, Y ou T; X8=I ou L; o domínio LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 (SEQ ID NO:413), onde X1= Q; X2=S; X3= V ou I; X4= S; X5 = S ou R; X6 = Y ou N; e o domínio LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula X1 - X2 - X3 (SEQ ID NO:414), onde X1 = E, G ou V; X2 = A; X3= S.
[00016] Em um sexto aspecto, a invenção fornece vetores de expressão recombinantes portadores das moléculas de ácidos nucleicos da invenção, e células hospedeiras dentro das quais tais vetores foram introduzidos, bem como métodos para fabricar os anticorpos ou seus fragmentos da invenção obtidos cultivando as células hospedeiras da invenção. A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica ou eucariótica, e de preferência a célula hospedeira é uma célula de E. coli ou uma célula de mamífero, tal como uma célula CHO. Em uma modalidade preferida, um anticorpo pode ser produzido com quantidades variadas de fucosilação. Por exemplo, uma linhagem de células CHO pode ser selecionada para produzir um anticorpo ou fragmento de anticorpo com uma faixa de fucosilação entre um mínimo de cerca de 5% e um máximo de cerca de 95%.
[00017] Em um sétimo aspecto, a invenção fornece uma composição darmacêutica que compreende um anticorpo anti-CD20 humana ou seu fragmento e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00018] Em um oitavo aspecto, a invenção fornece um anticorpo completamente humano ou fragmento de anticorpo capaz de se ligar a CD20 humana, com uma CE50 menor do que cerca de 10 nM, medida por experimentos de ligação a células (descritos abaixo). Em uma modalidade preferida, o anticorpo da invenção apresenta uma CE50 de cerca de 10-8 a cerca de 10-12 M ou mais alta, por exemplo, pelo menos 10-8 M, pelo menos 10-9 M, pelo menos 10-10 M, pelo menos 1011 M, ou pelo menos 10-12 M, quando medida pela ligação ao antígeno apresentada sobre a superfície das células.
[00019] A invenção engloba anticorpos anti-CD20 que têm um padrão de glicosilação modificado. Em algumas aplicações, a modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, ou um anticorpo carecedor de um grupamento fucose presente na cadeia de oligossacarídeo, por exemplo, para aumentar a função de citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) (vide Shield et al. (2002) JBC 277:26733). Em outras aplicações, a modificação de uma galactosilação pode ser feita para modificar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC).
[00020] Em um nono aspecto, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno descrito acima para uso para atenuar ou inibir uma doença ou condição medidada por CD20 em um ser humano. Em uma modalidade preferida, a doença ou condição é linfoma não-Hodgkin, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, doença de Crohn, leucemia linfocítica crônica, e doenças inflamatórias. Em uma modalidade relacionada, a invenção engloba um método para atenuar ou inibir uma doença ou condição mediada por CD20 em um ser humano, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo como descrito acima. Além disso, a invenção engloba o uso de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da invenção na fabricação de um medicamento para uso para atenuar ou inibir uma doença ou condição medidada por CD20 em um ser humano.
[00021] Outros objetivos e vantagens ficarão evidentes a partir de uma revisão da descrição detalhada que se segue.
BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO
[00022] A Figura 1 é uma curva de sobrevida isenta de sintomas. Os resultados estão ilustrados para Controle com Fc humano, anticorpos de controle I e II, e anticorpos: 8G6-5, 9D4-7, 10F2-13, e 7E1-13.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00023] Antes de os presentes métodos serem descritos, deve-se entender que esta invenção não está limitada aos métodos específicos e condições experimentais específicas descritas, pois tais métodos e condições podem variar. Deve-se entender também que a terminologia aqui utilizada é com o propósito de descrever apenas modalidades específicas, e não pretende ser limitativa, pois o âmbito da presente invenção deve ser limitado apenas pelas reivindicações apensadas.
[00024] A menos que diferentemente definido, todos termos técnicos e científicos aqui tilizados têm o mesmo significado que aquele entendido pelos versados nas técnicas às quais esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos serão agora descritos.
Definições
[00025] O termo "CD20" inclui variantes e isoformas de CD20 humana, que são expressadas naturalmente por células. A ligação de um anticorpo da invenção ao antígeno CD20 medeia a exterminação de células que expressam CD20 (por exemplo, uma célula tumorosa). A exterminação de células que expressam CD20 pode ocorrer de inúmeras maneiras, incluindo citotoxicidade dependente de complemento (CDC) de células que expressam CD20, apoptose de células que expressam CD20, fagocitose por células efetoras de células que expressam CD20, ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) por células efetoras de células que expressam CD20.
[00026] O termo "anticorpo,", como aqui utilizado, pretende se referir a moléculas de imunoglobulina que compreendem quatro cadeias de polipeptídeos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve compreende um domínio (CL1). As regiões VH e VL podem ser subdivididas adicionalmente em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões do arcabouço (FR). Cada VH e VL é constituída de três CDRs e quarto FRs, arranjadas a partir de terminal amina até o terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
[00027] O termo "parte de ligação a antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "parte de anticorpo" ou "fragmento de anticorpo"), como aqui utilizado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligarem especificamente a um antígeno (por exemplo, hCD20). Demonstrou-se que fragmentos de um anticorpo de comprimento inteiro podem realizar a função de ligação a antígeno de um anticorpo. Os exemplos de fragmentos ligantes englobados pelo termo "parte de ligação a antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL1 e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos F(ab)’ ligados por uma ponte dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (v) um fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintérico que permite que eles sejam fabricados como uma única cadeia contígua na qual o par de regiões VL e VH forma moléculas monovalentes (conhecida como cadeia única Fv (scFv); vide, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Pretende-se também que tais anticorpos de cadeia única estejam englobados no termo "parte de ligação a antígeno" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como "diacorpos", também estão englobadas (vide, por exemplo, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448).
[00028] Uma "CDR" ou região determinante de complementaridade é uma região de hipervariabilidade intercalada dentro de regiões que são mais conservadas, denominadas "regiões de arcabouço" (FR). Em várias modalidades do anticorpo ou fragmento anti-hCD20 da invenção, as FRs podem ser idênticas às sequências de linhagem germinal humanas, ou podem ser naturalmente ou artificialmente modificadas.
[00029] O termo "ressonância plasmônica superficial", como aqui utilizado, refere-se a um fenômeno óptico que permite a análise de interações em tempo real pela detecção de alterações em concentrações de proteínas em uma matriz de biossensores, usando, por exemplo, o sistema BIACORE® (Pharmacia Biosensor AB).
[00030] O termo "epítopo" refere-se a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação de antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como parátopo. Um único antígeno pode ter mais do que um epítopo. Os epítopos podem ser conformacionais ou lineares. Um epítopo conformacional é produzido por aminoácidos espacialmente justapostos a partir de diferentes segmentos de uma (ou mais) cadeias de polipeptídeos lineares. Um epítopo linear é um epítopo produzido por resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia de polipeptídeo. Em certas circunstâncias, um epítopo pode incluir outros grupamentos, tais como sacarídeos, grupos fosforila, ou grupos sulfonila no antígeno.
[00031] O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico", quando se refere a um ácido nucleico ou fragmento dele, indica que, quando alinhado otimamente com inserções ou deleções apropriadas de nucleotídeos com outro ácido nucleico (ou seu filamento complementar), há identidade de sequências de nucleotídeos em pelo menos cerca de 95%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeos, medida por qualquer algoritmo de identidade de sequências bem conhecido, tal como FASTA, BLAST ou GAP, como discutido abaixo.
[00032] Como aplicado a polipeptídeos, o termo "substancial similaridade" ou "substancialmente similar" significa que duas sequências peptídicas, quando otimamente alinhadas, como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos para lacunas de omissão, compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência. De preferência, as posições dos resíduos, que não são idênticas, diferem em substituições conservativas de aminoácidos. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou caráter hidrofóbico). Geralmente, uma substituição de aminoácido conservativa não deve mudar substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Nos casos nos quais duas ou mais sequências de aminoácidos diferem entre si por substituições conservativas, a percentual ou grau de similaridade pode ser ajustado para cima a fim de corrigir a natureza conservativa da substituição. Os meios para fazer este ajuste são bem conhecidos pelos versados nessas técnicas. Vide, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Os exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais hidróxi- alifáticas: serina a treonina; 3) cadeias laterais que contêm amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina, e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato, e 7) cadeias laterais que contêm enxofre: cisteína e metionina. Os grupos de substituições conservativas preferidos são: valina-leucina- isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer mudança que tem um valor positivo na matriz log-probabilidade PAM250 descrita em Gonnet et al. (1992) Science 256:1443 45. Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer mudança que tem um valor não-negativo na matriz log-probabilidade PAM250.
[00033] A similaridade de sequências para polipeptídeos é medida tipicamente usando softwares de análise de sequências. O software de análise de proteínas equipara sequências similares usando medidas de similaridade designadas para várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições conservativas de aminoácidos. Por exemplo, o software GCG contém programas tais como GAP e BESTFIT que podem ser usados com parâmetros de omissão para determinar a homologia de sequências ou identidade de sequências entre polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma sua muteína. Vide, por exemplo, GCG Versão 6.1. As sequências de polipeptídeos podem ser também comparadas usando FASTA com parâmetros de omissão ou recomendados; um programa no GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identidade percentual de sequências das regiões de melhor sobreposição entre as sequências de consulta e busca (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferido quando se compara uma sequência da invenção com uma base da dados que contém um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros de omissão. Vide, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.
[00034] O termo "quantidade eficaz" é uma concentração ou quantidade de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, que resulta na consecução de um propósito específico assinalado. Uma "quantidade eficaz" de um anticorpo anti-CD20 ou de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser determinada empiricamente. Além disso, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma concentração ou quantidade de um anticorpo anti-CD20 ou de um seu fragmento de ligação a antígeno, que é eficaz para atingir um efeito terapêutico assinalado. Esta quantidade também pode ser determinada empiricamente.
Preparação de Anticorpos Humanos
[00035] Os métodos para gerar anticorpos humanos incluem, por exemplo, VelocImmune® (Regeneron Pharmaceuticals), a tecnologia XenoMouse® (Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21; Abgenix), a abordagem "minilocus" e apresentação de fagos (e vide, por exemplo, patentes nos US 5.545.807, US 6.787.637). A tecnologia VelocImmune® (patente n° US 6.596.541) engloba um método para gerar um anticorpo completamente humano com alta especificidade para um antígeno seleto. Esta tecnologia envolve a geração de um camundongo transgênico que tem um genoma que compreende regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve humanas ligadas operacionalmente a loci da região constante endógena do camundongo, de tal modo que o camundongo produza um anticorpo que compreende uma região variável humana e uma região constante do camundongo em resposta a um estímulo antigênico. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo é isolado e ligado operacionalmente ao DNA que codifica as regiões constantes das cadeias pesada e leve humanas. O DNA é então expressado em uma célula capaz de expressar o anticorpo completamente humano. Em uma modalidade específica, a célula é uma célula de CHO.
[00036] Os anticorpos podem ser terapeuticamente úteis para bloquear uma interação ligante-receptor ou para inibir a interação de componentes do receptor, ao invés de exterminar as células através da fixação de complemento (CDC) e participação citotoxicidade mediada por células dependente do anticorpo (ADCC). A região constante de um anticorpo é importante na capacidade de um anticorpo fixar complemento e mediar a citotoxicidade dependente de célula. Assim sendo, o isótipo de um anticorpo pode ser selecionado na base de se é desejável que o anticorpo medeie a citotoxicidade.
[00037] As imunoglobulinas humanas podem existir em duas formas que estão associadas à heterogeneidade das articulações (hinge). Em uma forma, uma molécula de imunoglobulina compreende uma construção estável de quatro cadeias de aproximadamente 150- 160 kDa, na qual os dímeros são mantidos unidos por uma ligação dissulfeto da cadeia pesada entre cadeias. Em um segunda forma, os dímeros não estão ligados por intermédio de ligações dissulfeto entre cadeias e uma molécula de cerca de 75-80 kDa é formada, constituída de uma cadeia leve e pesada acoplada de forma covalente (meio- anticorpo). Estas formas eram extremamente difíceis de separar, mesmo depois de purificação por afinidade. A frequência do aparecimento da segunda forma em vários isótipos intactos de IgG deve-se, porém sem limitações, a diferenças estruturais associadas ao isótipo da região de articulação (hinge) do anticorpo. Uma única substituição de aminoácido na região de articulação (hinge) da articulação da IgG4 humana pode reduzir significativamente o aparecimento da segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) até níveis tipicamente observados usando uma articulação (hinge) de IgG1 humana. A presente invenção engloba anticorpos que têm uma ou mais mutações na região de articulação (hinge), CH2 ou CH3, que pode ser desejável, por exemplo, na produção, para melhorar o rendimento da forma desejada do anticorpo.
[00038] Os anticorpos da invenção são preparados, de preferência, com o uso da tecnologia VelocImmune®. Um camundongo transgênico no qual as regiões variáveis das cadeias pesada e leve da imunoglobulina endógenas são substituídas pelas regiões variáveis humanas correspondentes é inoculado com o antígeno de interesse, e as células linfáticas (tais como as células B) são recuperadas a partir dos camundongos que expressam anticorpos. As células linfáticas podem ser fundidas com uma linhagem de células de mieloma para preparar linhagens de células de hibridoma imortais, e tais linhagens de células de hibridoma são triadas e selecionadas para identificar linhagens de células de hibridoma que produzem anticorpos específicos para o antígeno de interesse. O DNA que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve pode ser isolado e ligado a regiões constantes isotípicas desejáveis da cadeia pesada e cadeia leve. Tal proteína anticorpo pode ser produzida em uma célula, tal como uma célula CHO. Alternativamente, o DNA que codifica os anticorpos quiméricos específicos do antígeno ou os domínios variáveis das cadeias leve e pesada pode ser isolado diretamente a partir da linfócitos específicos do antígeno.
[00039] Em geral, os anticorpos da presente invenção possuem afinidades muito altas, possuindo tipicamente KD ou CE50 entre cerca de 10-8 até cerca de 10-12 M ou mais altas, por exemplo, pelo menos 10-8 M, pelo menos 10-9 M, pelo menos 10-10 M, pelo menos 10-11 M, ou pelo menos 10-12 M, quando medidas pela ligação ao antígeno apresentado sobre a superfície celular.
[00040] Inicialmente, são isolados os anticorpos quiméricos com afinidade que têm uma região variável humana e uma região constante do camundongo. Como descrito abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados quanto às características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes do camundongo são substituídas por uma região constante humana desejada, para gerar o anticorpo completamente humano da invenção, por exemplo, IgG1 ou IgG4 do tipo selvagem ou modificada (por exemplo, SEQ ID NO:416, 417, 418). Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com o uso específico, as características de ligação ao antígeno com alta afinidade e de especificidade para o alvo residem na região variável. Mapeamento de Epítopos e Tecnologias Afins
[00041] Para triar quanto a anticorpos que se ligam a um epítopo específico, pode ser realizado um ensaio de bloqueio cruzado rotineiro, tal como descrito em "Antibodies: A Laboratory Manual" 1988 Cold Spring Harbor Laboratory, editores Harlow e Lane. Outros métodos incluem mutantes de varredura de alanina, blots de peptídeos (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248:443-63), ou análise de clivagem de peptídeos, como descrito nos exemplos abaixo. Além disso, métodos tais como excisão de epítopos, extração de epítopos e modificação química de antígenos podem ser empregados (Tomer (2000) Protein Science 9:487-496).
[00042] Para avaliar as características de ligação dos anticorpos, proteínas CD20 mutantes que consistem em substituições de aminoácidos selecionadas foram construídas. As proteínas CD20 mutantes continham substituições de certos aminoácidos que ocorrem na proteína humana por aminoácidos correspondentes que ocorrem na proteína do camundongo. Esta abordagem ajudou a assegurar que as proteínas CD20 mutantes mantivessem sua estrutura terciária e, presumivelmente, quaisquer epítopos conformacionais. A ligação dos anticorpos em teste a estas proteínas CD20 mutantes foi comparada com a ligação de anticorpos de CD20 do controle (conhecidos), medida por FACS. Nenhum dos anticorpos da invenção apresentou um perfil de ligação que fosse idêntico (em relação a cada um e todos mutantes) aos anticorpos do controle.
Imunoconjugados
[00043] A invenção engloba um anticorpo monoclonal anti-CD20 humana conjugado a um grupamento terapêutico ("imunoconjugado"), tal como uma citotoxina, um fármaco quimioterápico, um imunossupressor ou um radioisótopo. Os agentes citotoxinas incluem qualquer agente que é prejudicial para as células. Os exemplos de agentes citotoxinas e agentes quimioterápicos apropriados para formar imunoconjugados são conhecidos nessas técnicas (vide, por exemplo, documento n° WO 05/103081).
Biespecíficos
[00044] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos, ou multiespecíficos. Os anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipeptídeo-alvo ou podem conter domínios de ligação a antígeno específicos para mais do que um polipeptídeo-alvo. Vide, por exemplo, Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69. Os anticorpos anti-CD20 humanos podem ser ligados a ou coexpressados com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento pode ser ligado funcionalmente (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não- covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo, para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação. Um anticorpo multiespecífico da invenção pode se ligar especificamente a uma célula que expressa CD20 e uma célula efetora humana que expressa um polipeptídeo, tal como um receptor de Fc humano e/ou componentes do complexo receptor de células T. Em uma modalidade, o anticorpo multiespecífico da invenção compreende uma parte de ligação a CD20 e uma citocina. Usos Terapêuticos
[00045] Os anticorpos humanos, fragmentos de ligação a antígenos de anticorpos, imunoconjugados, e moléculas biespecíficas da invenção são úteis em métodos terapêuticos para tratar doenças humanas que são inibidas ou melhoradas inibindo o crescimento de células que expressam CD20 e/ou exterminam as células que expressam CD20. Os mecanismos de ação pelo qual os métodos terapêuticos da invenção são realizados incluem exterminação das células que expressam CD20 na presença de células efetoras, por exemplo, por CDC, apoptose, ADCC, fagocitose, ou por uma combinação de dois ou mais destes mecanismos. O mecanismo para conseguir o efeito terapêutico das moléculas da invenção pode resultar na exterminação ou inibição direta das células que expressam CD20, ou indiretamente, através da inibição das células que não expressam CD20, por exemplo, para expressar um antígeno da superfície celular estruturalmente relacionado (isto é, sem reatividade cruzada com antígenos da superfície celular relacionados, porém funcionalmente distintos). As células que expressam CD20 que podem ser inibidas ou exterminadas usando os anticorpos humanos da invenção incluem, por exemplo, células B tumorigênicas.
[00046] Os exemplos de doenças e condições que podem ser tratadas ou melhoradas com os anticorpos anti-CD20 e seus fragmentos incluem, porém sem limitações, doenças tumorigênicas, tais como linfoma de células B (NHL, leucemia/linfoma linfoblástico de células B precursoras, neoplasmas de células B maduras, leucemia linfocítica crônica de células B/linfoma linfocítico pequeno, leucemia pró-linfocítica de células B, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de células do manto, linfoma folicular, linfoma centrofolicular cutâneo, linfoma de células B da zona marginal, leucemia de células pilosas, linfoma de células B grandes difusas, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, distúrbio linfoproliferativo pós- transplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, e linfoma de células grandes anaplásicas); doenças imunes, tais como doenças autoimunes (psoríase, artrite psoriática, dermatite, esclerodermia sistêmica e esclerose, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome da insuficiência respiratória, meningite, encefalite, uveíte, glomerulonefrite, eczema, asma, aterosclerose, deficiência da adesão de leucócitos, esclerose múltipla, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren, diabetes de início na juventude, doença de Reiter, doença de Behcet, nefrite por complexo imunológico, nefropatia por IgA, polineuropatias por IgM); trombocitopenias imunomediadas, púrpura trombocitopênica idiopática aguda e púrpura trombocitopênica idiopática crônica, anemia hemolítica, miastenia grave, nefrite por lúpus,lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, dermatite atópica, pênfigo, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, síndrome de Omenn, insuficiência renal crônica, mononucleose infecciosa aguda, HIV, e doenças associadas a herpes-vírus; síndrome da angústia respiratória aguda grave e coreorretinite; doenças e distúrbios causados por infecção de células B com vírus, tal como vírus Epstein-Barr.
[00047] Em uma modalidade específica, o indivíduo que está recebendo administração do anticorpo é tratado adicionalmente com um agente quimioterápico, radiação, ou um agente que modula (intensifica ou inibe) a expressão ou atividade de um receptor de Fc, tal como uma citocina. Tipicamente, as citocinas para administração durante o tratamento incluem o fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), interferon gama (IFN-y), e fator de necrose tumoral (TNF). Os agentes terapêuticos típicos incluem, dentre outros, agentes antineoplásicos tais como doxorrubicina, cisplatina, bleomicina, carmustina, clorambucil, e ciclofosfamida. Administração e Formulações Terapêuticas
[00048] A invenção fornece composições terapêuticas que compreendem os anticorpos anti-CD20 humana ou seus fragmentos de ligação a antígenos da presente invenção. As composições terapêuticas de acordo com a invenção devem ser administradas com veículos, excipientes, e outros agentes apropriados que são incorporados nas formulações para proporcionar melhor transferência, distribuição, tolerância, e benefícios similares. Geralmente, os veículos, excipientes, ou outros agentes podem incluir, por exemplo, óleos (por exemplo, canola, algodão, amendoim, açafroa, gergelim, soja), ácidos graxos e seus sais e ésteres (por exemplo, ácido oleico, ácido esteárico, ácido palmítico), álcoois (por exemplo, etanol, álcool benzílico), poliálcoois (por exemplo, glicerina, propilenoglicóis e polietilenoglicóis, por exemplo, PEG 3350), polissorbatos (por exemplo, polissorbato 20, polissorbato 80), gelatina, albumina (por exemplo, albumina de soro humano), sais (por exemplo, cloreto de sódio), ácido succínico e seus sais (por exemplo, succinato de sódio), aminoácidos e seus sais (por exemplo, alanina, histidina, glicina, arginina, lisina), ácido acético ou um seu sal ou éster (por exemplo, acetato de sódio, acetato de amônio), ácido cítrico e seus sais (por exemplo, citrato de sódio), ácido benzoico e seus sais, ácido fosfórico e seus sais (por exemplo, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibásico), ácido láctico e seus sais, poli(ácido láctico), ácido glutâmico e seus sais (por exemplo, glutamato de sódio), cálcio e seus sais (por exemplo, cloreto de cálcio, acetato de cálcio), fenol, açúcares (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, maltose, trealose), eritritol, arabitol, isomalte, lactitol, maltitol, manitol, sorbitol, xilitol, tensoativos não-iônicos (por exemplo, TWEEN® 20, TWEEN® 80), surfactantes iônicos (por exemplo, dodecil-sulfato de sódio), clorobutanol, DMSO, hidróxido de sódio, glicerina, m-cresol, imidazol, protamina, zinco e seus sais (por exemplo, sulfato de zinco), timerosal, metilparaben, propilparaben, carbóxi-metil-celulose, clorobutanol, e heparina. Outros agentes não-terapêuticos estão descritos na patente n° US 7.001.892, particularmente an Tabela A. Uma multiplicidade de formulações apropriadas pode ser encontrada no formulário conhecido por todos químicos farmacêuticos: "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Company, Easton, PA). Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geléias, ceras, óleos, lipídeos, vesículas que contêm lipídeos (catiônicos ou aniônicos) (tal como LIPOFECTIN®), conjugados de DNA, pastas anidras para absorção, emulsões de óleo em água e água em óleo, emulsões Carbowax (polietilenoglicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos, e misturas semi-sólidas que contêm Carbowax. Quaisquer das misturas precedentes podem ser apropriadas nos tratamentos e terapias de acordo com a presente invenção, desde que o ingrediente ativo na formulação não seja inativado pela formulação e a formulação seja fisiologicamente compatível e tolerável com a via de administração. Vide também Powell et al. PDA (1998) J. Pharm. Sci. Technol. 52:238311 e citações lá mencionadas para obter informações adicionais relacionadas a excipientes e veículos bem conhecidos pelos químicos farmacêuticos.
[00049] A dose das composições farmacêuticas pode variar dependendo da idade e porte de um indivíduo que vai receber a administração, doença-alvo, condições, via de administração, e fatores similares. Quando o anticorpo da presente invenção é usado para tratar várias condições e doenças associadas à atividade de CD20, incluindo linfoma não-Hodgkin, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, doença de Crohn, leucemia linfocítica crônica, doenças inflamatórias, e similares, em um paciente adulto, é vantajoso administrar por via intravenosa o anticorpo da presente invenção normalmente em uma única dose de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg de peso corporal, de preferência cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, e mais preferivelmente cerca de 0,1 a cerca de 5 mg/kg de peso corporal. Dependendo da gravidade da condição ou doença, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas. Em outra administração parenteral e administração oral, o anticorpo pode ser administrado em uma dose correspondente à dose fornecida acima.
[00050] Vários sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Os métodos de introdução incluem, porém sem limitações, as vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, peridural, e oral. A composição pode ser administrada por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção maciça, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada junto com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser, de preferência, sistêmica ou local.
[00051] A composição farmacêutica pode ser distribuída também em uma vesícula, particularmente um lipossoma (vide Langer (1990) Science 249:1527-1533). Em certas situações, a composição farmacêutica pode ser distribuída em um sistema com liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (vide Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados (vide "Medical Applications of Controlled Release", Langer and Wise (editores), CRC Pres., Boca Raton, Flórida (1974); "Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance", Smolen e Ball (editores), Wiley, New York (1984). Em ainda outra modalidade, um sistema com liberação controlada pode ser colcoado na proximidade do alvo da composição, requerendo assim apenas uma fração da dose sistêmica (vide, por exemplo, Goodson, em ‘Medical Applications of Controlled Release’, supra, volume 2, páginas 115-138, 1984).
[00052] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagem para injeção intravenosa, subcutânea, intracutânea e intramuscular, infusões por gotejamento, etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas por métodos universalmente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, dissolvendo, colocando em suspensão ou emulsificando o anticorpo ou seu sal descrito acima em um meio aquoso ou um meio oleoso estéril usado convencionalmente para injeções. Na qualidade do meio aquoso para injeções, há, por exemplo, solução salina fisiológica, uma solução isotônica que contém glicose e outros agentes auxiliares, etc., que podem ser usados em combinação com um agente para solubilização apropriado, tal como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propilenoglicol, polietilenoglicol), um surfactante não-iônico [por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (aduto polioxietilênico (50 mols) de óleo de mamona hidrogenado)], etc. Na qualidade do meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de gergelim, óleo de soja, etc., que podem ser usados em combinação com um agente auxiliar de solubilização tal como benzoato de sódio, álcool benzílico, etc. A injeção assim preparada é, de preferência, envasada em uma ampola apropriada.
[00053] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagem em uma dose unitária apropriada para se adaptar a uma dose dos ingredientes ativos. Tais formas de dosagem em uma dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade contida do anticorpo supramencionado, é geralmente cerca de 5 a 500 mg por forma de dosagem em uma dose unitária; especialmente na forma de injeção, prefere-se que o anticorpo supramencionado esteja contido em cerca de 5 a 100 mg e em cerca de 10 a 250 mg para outras formas de dosagem.
EXEMPLOS
[00054] Os exemplos que se seguem são fornecidos de modo a apresentar para os versados nessas técnicas uma divulgação e descrição completa de como fabricar e usar os métodos e composições da invenção, e não pretendem limitar o âmbito da invenção. Esforços foram envidados para assegurar a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser levados em consideração. A menos que diferentemente indicado, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura é em graus Celsius, e a pressão é na pressão atmosférica ou perto dela.
Exemplo 1: Geração de Anticorpos Humanos para CD20 Humana
[00055] A imunização de roedores pode ser feita por qualquer método conhecido nessas técnicas (vide, por exemplo, Harlow & Lane, editores (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, New York; Malik e Lillehoj, "Antibody techniques", Academic Press, 1994, San Diego). Em uma modalidade, as células que expressam CD20 são administradas diretamente aos camundongos que têm loci de DNA que codificam regiões variáveis da cadeia pesada de Ig humana e regiões variáveis da cadeia leve Kapa (VelocImmune®, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; patente n° US 6.596.541),com um adjuvante para estimular a resposta imune. Tal adjuvante pode incluir adjuvante de Freund completo e incompleto, sistema adjuvante MPL+TDM (Sigma), ou RIBI (muramil dipeptídeos) (vide O’Hagan, "Vaccine Adjuvant", Human Press, 2000, Totawa, NJ). Para tingir altos níveis de expressão de CD20 humana sobre uma superfície celular, as linhagens de células murinas, células MG87 e/ou NS/0, são transfectadas com um plasmídeo que codifica CD20 humana, e as células que expressam altos níveis de CD20 são enriquecidas usando a tecnologia FACS. Em uma modalidade, CD20 é administrada indiretamente como um DNA plasmídico que contém um gene de CD20, e CD20 é expressada usando o sistema de expressão de proteína do hospedeiro para produzir proteína de antígeno in vivo. Em ambas abordagens, para conseguir uma resposta imune ideal ao anticorpo, os camundongos recebem injeções de reforço a cada 3~4 semanas. A resposta imune é monitorada por um imunoensaio baseado em células, como descrito abaixo, no qual amostras de soro em diluições seriais de 1 a 3 vezes passam por imunoensaio. A titulação do soro é definida como a diluição da amostra de soro que produziu um sinal no ensaio que é o dobro do fundo. Quando os animais atingem sua resposta imune máxima, as células B que expressam o anticorpo são colhidas e fundidas com células de mieloma do camundongo para formar hibridomas.
Exemplo 2: Triagem quanto a Hibridoma Específico de Antígeno
[00056] Na triagem primária, células NS/0 (ATCC) foram transfectadas com o gene de CD20 humana e as células com alta expressão (células NS/0-hCD20) foram colecionadas e mantidas em cultura para uso em meios de triagem condicionados com hibridoma, geralmente cerca de 11 a 14 dias depois da fusão. As células NS/0- hCD20 em RPMI 1640 com 10% de soro fetal vitelínico foram plaqueadas em uma densidade de 50.000 céculas por poço em placas de poli-D-lisina com 96 poços. O meio condicionado com hibridoma foi diluído 5 vezes e deixado se ligar às células por 30 minutos. As células foram então fixadas sobre as places com a adição de um volume igual de formaldeído a 8% por 20 min, e em seguida, quatro sucessivas lavagens com PBST. As placas foram incubadas com 5% de BSA por 2 h à temperatura ambiente. Depois de lavar, os anticorpos ligados à placa foram incubados com anticorpos policlonais caprinos específicos de Fcy anti-IgG do camundongo conjugados com HRP por 30 min, e as placas se desenvolveram usando substrato de 3.3’, 5.5’-tetrametil- benzidina (TMB) (BD Pharmigen) depois das lavagens finais. A reação com HRP foi interrompida com um volume igual de ácido fosfórico 1 M. Os sinais de ligação do anticorpo foram medidos por densidade óptica a 450nm. As células NS/0 parentais, que não têm qualquer expressão detectável de CD20, foram usadas como controle de fundo para excluir sobrenadantes do hibridoma com ligação inespecífica à superfície celular. Os poços positivos quanto a células NS/0 parentais e também células que expressam CD20 foram excluídos.
Exemplo 3: Sequenciamento de Anticorpos Humanos Contra CD20
[00057] Antes do sequenciamento, células de hibridoma específicas do antígeno foram subclonadas em organismo unicelular usando um citômetro de fluxo MOFLO®. O sequenciamento das regiões das cadeias leve e pesada variáveis foi realizado por métodos padronizados (vide, por exemplo, documento n° US 2004/0167319A1). O RNA total foi preparado a partir de cada linhagem de células de hibridoma com um kit RNEASY® (Qiagen). O DNAc foi preparado usando o kit de Ampliação de DNAc SMART RACE® (Clonetech). As sequências de DNA das HCVRs e LCVR foram sequenciadas e as sequencias de aminoácidos previstas para HCVRs e LCVRs produziram anticorpos seletos (HCVR/LCVR SEQ ID NO): 3B9-10N (3/11); 3B9-10GSP (19/21); 3B9-10FGL (23/25); 9C11-14N (27/35); 9C11-14GSP (43/45); 9C11-14FGL (47/49); 2B7-7N (51/59); 2B7- 7GSP (67/69); 2B7-7FGL (71/73); 2C11-4N (75/83); 2C11-4GSP (91/93); 2C11-4FGL (95/97); 3H7-6N (99/107); 3H7-6GSP (115/117); 3H7-6FGL (119/121); 5H2-17N (123/131); 5H2-17GSP (139/141); 5H2- 17FGL (143/145); 6B9-4N (147/155); 6B9-4GSP (163/165); 6B9-4FGL (167/169); 6F6-1N (171/179); 6F6-1GSP (187/189); 6F6-1FGL (191/193); 8G6-5N ("8G6-5") (195/203); 8G6-5GSP (211/213); 8G6- 5FGL (215/217); 9C3-8N (219/227); 9C3-8GSP (235/237); 9C3-8FGL (239/241); 9D4-7N ("9D4-7") (243/251); 9D4-7GSP (259/261); 9D4- 7FGL (263/265); 9E4-20N (267/275); 9E4-20GSP (283/285); 9E4- 20FGL (287/289); 9H4-12N (291/299); 9H4-12GSP (307/309); 9H4- 12FGL (311/313); 10E3-17N (315/323); 10E3-17GSP (331/333); 10E3- 17FGL (335/337); 10F2-13N ("10F2-13") (339/347); 10F2-13GSP (355/357); 10F2-13FGL (359/361); 7E1-13N (363/371); 7E1-13GSP (379/381); 7E1-13FGL (383/385).
Exemplo 4: Especificade de Ligação a Antígeno dos Anticorpos Anti- CD20
[00058] Depois que os anticorpos quiméricos foram convertidos em IgGs completamente humanas, as propriedades de ligação específica ao antígeno foram determinadas com um protocolo ELISA similar ao protocolo descrito acima, exceto que um anticorpo policlonal específico de Fcy anti-hIgG conjugado com HRP foi usado como o anticorpo de detecção e uma linhagem de células Daudi (que expressa CD20 endógena) foi usada como uma fonte de antígeno. Todos os anticorpos testados se ligaram specificamente às células Daudi com valores de CE50 na faixa entre cerca de 0,4 nM e cerca de 20 nM.
[00059] A especificidade de ligação ao antígeno dos anticorpos anti- CD20 completamente humanos foi verificada usando citometria de fluxo, como descrito abaixo, com células MG87 transfectadas com CD20 humana. Resumidamente, as células MG87 parentais e MG87 transfectadas com CD20 humana foram incubadas por 30 min a 4 DC com cada um dos 15 anticorpos humanos e com os dois anticorpos do controle, e em seguida, incubação com anticorpo anti-IgG humana conjugado com PE. A ligação foi avaliada por citometria de fluxo. As intensidades da fluorescência foram comparadas com a ligação à linhagem de células parentais e a amostra equiparada ao isótipo de controle. Os resultados estão resumidos na Tabela 1. Todos anticorpos se ligaram às células MG87 transfectadas com CD20 humana, enquanto que nenhuma ligação foi observada às células MG87 parentais, indicando que os anticorpos são específicos para CD20. Controle I: mAb anti-CD20 quimérico (murino/humano), rituximab, (RITUXAN®, IDEC Pharmaceuticals Corp.); Control II: mAb anti-CD20 humano, 2F2, descrito no documento n° WO 2005/103081). Tabela 1
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Exemplo 5: Ligação do Anticorpo Anti-CD20 Humano a CD20 Humana Mutante
[00060] CD20's humanas mutantes foram geradas substituindo sequências de aminoácidos de CD20 humana por aminoácidos correspondentes do camundongo usando um kit de Mutagênese Strategene (Tabela 2). Um vetor plasmídico que compreende uma CD20 humana mutante, um promotor de CMV, e um marcador do gene resistente à higromicina IRES-GFP foi então transfectado para dentro de células MG87. Para cada CD20 humana mutante, uma coleção de células resistentes à higromicina que apresentavam alta expressão de GFP foi coletada e uma linhagem estável foi criada para o ensaio de ligação do anticorpo. Tabela 2
Figure img0002
[00061] Resumidamente, aproximadamente 1 x 106 células da cada linhagem de células transfectadas de forma estável, que expressam uma CD20 humana mutante, foram coletadas e incubadas com cada anticorpo anti-humano, a 10 μg/mL, sobre gelo por 1 h, e em seguida, incubação com IgG anti-humana caprina conjugada com APC (Jackson Immunolabs), a 10 μg/mL, sobre gelo por 45 min. Para cada anticorpo, a ligação a cada CD20 humana mutante foi avaliada por citometria de fluxo. Os níveis da intensidade de fluorescência média foram avaliados enquanto ocorria a delimitação emu ma pequena população (aproximadamente 20%) de células que apresentavam um nível médio da expressão de GFP para minimizar os efeitos devidos aos níveis de expressão variáveis da CD20 mutante em cada linhagem de células. Para cada CD20 mutante, o anticorpo que apresentou a intensidade de fluorescência média mais alta foi designado como 100% de ligação. A Tabela 3 indica a ligação percentual de cada anticorpo anti-CD20 a cada CD20 humana mutante. Tabela 3
Figure img0003
Exemplo 6: Potência em Citoxicidade Dependente de Complemento (CDC)
[00062] Os anticorpos humanos anti-CD20 humana foram testados quanto à sua capacidade de promover citotoxicidade dependente de complemento (CDC) usando linhagens de células de linfoma humano, Daudi e RL como linhagens de células-alvo. Os anticorpos foram diluídos serialmente (faixa de concentração final 50 nM a 0,85 pM mais controle com tampão) dentro do meio e adicionados às células-alvo desenvolvidas em um formato de placas com 96 poços. Soro humano e componentes do complemento (Quidel) foram adicionados a cada poço para dar uma concentração sérica final de 5%. As células foram incubadas a 37 aC por 2 h com os anticorpos em teste e soro humano com componentes do complemento e depois testadas quanto à sobrevivência detectada por ALAMARBLUE®. A fluorescência foi medida usando um comprimento de onde de excitação de 560 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm (Tabela 4).
Figure img0004
Tabela 4
Exemplo 7: Taxa de Desligamento/Diassociação (Off-Rate) de Anticorpos Humanos Anti-CD20
[00063] As taxas de desligamento dos mAb's anti-CD20 foram analisadas em um ensaio de CDC. Estes experimentos foram realizados em 3 conjuntos separados. Dentro de cada conjunto, a porcentagem de lise celular foi determinada para 5 anticorpos em um tempo em relação aos controles I e II em 0, 1, e 6 horas. O anticorpo foi ligado às células incubando 2 μg de cada anticorpo com 106 células Daudi por 45 min (temperatura ambiente). Para o ponto no tempo zero, as células foram lavadas e imediatamente recolocadas em suspensão em 100 μL de meio contendo 20% de complemento de soro humano normal, e depois incubadas por 45 min a 37 °C, e 5% de CO2. Para os pontos no tempo de 1 e 6 horas, 106 células foram lavadas depois da ligação do anticorpo, recolocadas em suspensão em 12 mL de meio fresco em um tubo Falcon de 15 mL, e incubadas em uma inversora mecânica por 1 e 6 horas, respectivamente. As células foram lavadas ao serem completados os tempo no ponto selecionados e incubadas em meio contend 20% de complemento de soro humano normal, e incubadas por 45 min. Depois da incubação do soro, 7-amino- actinomicina D (7AAD) foi adicionada a cada amostra e as amostras foram incubadas por 15 min à temperatura ambiente para avaliar a viabilidade celular. A citotoxicidade percentual foi determinada em cada ponto no tempo estabelecendo regiões como um espalhamento de avanço versus a plotagem de espalhamento bidimensional de 7AAD que representavam células 7AAD positivas e negativas, com detritos excluídos de ambas regiões. A citotoxicidade percentual foi plotado para cada ponto no tempo como 100 menos porcentagem de células 7AAD-negativas (Tabelas 5-7).
Figure img0005
Exemplo 8: Taxa de Desligamento/Dissociação Bioquímica dos Anticorpos Humanos Anti-CD20
[00064] As taxas de desligamento/dissociação bioquímica para anticorpos anti-CD20 selecionados em teste foram determinadas e comparadas com os anticorpos do controle I e II. Dois anticorpos humanos selecionados, controle I ou II (2 μg/mL de cada um) foram incubados com células Raji que expressam CD20, a 106/mL, por 2 h à temperatura ambiente. As células foram então lavadas, o excesso de anticorpo foi removido, recolocadas em suspensão em meio contendo 1% de soro, e incubadas a 37 DC. Nos tempos 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, e 180 min, uma alíquota de 1 mL de células foi removida, lavada, corada com anticorpo anti-hFc marcado com PE, e a análise FACS foi conduzida. A intensidade de fluorescência média (MFI) foi usada como um indicador da quantidade de anticorpo ligada à superfície celular. As taxas de desligamento bioquímico foram calculadas estabelecendo a ligação percentual no tempo zero como 100%. O experimento foi repetido mais 5 vezes, e a taxa de desligamento bioquímico para 12 dos anticorpos em teste foi determinada e comparada com os controles I e II (Tabelas 8-13).
Figure img0006
Figure img0007
Figure img0008
Exemplo 9: Ensaio da Citotoxicidade Mediada por Células Dpendente do Anticorpo (ADCC)
[00065] A ADCC induzida por anticorpos humanos anti-CD20 foi avaliada usando células Daudi (células de uma linhagem de células de linfoma humano que expressam de forma endógena CD20). Resumidamente, as células Daudi (10.000 células/poço em 50 μL) foram primeiramente misturadas com um volume igual de anticorpo humano anti-CD20 serialmente diluído, resultando em uma concentração final de anticorpo na faixa entre 0,169 pM e 10 nM, e incubadas por 10 min à temperatura ambiente em uma placa com 96 poços (controle = poços sem ab). Separadamente, células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs, células efetoras) foram preparadas seguindo um procedimento de enriquecimento por centrifugação com gradiente de Ficoll-Hypaque convencional. As PBMCs enriquecidas foram coletadas, lavadas, e plaqueadas em RPMI 1640 contendo 10% de PBS inativado por calor, glutamina 2 mM e beta-mercaptoetanol 50 nM. As células foram então estimuladas com 5 ng/mL de IL-2 humana por três dias, lavadas uma vez no meio, e depois usadas diretamente no ensaio de ADCC. Aproximadamente 300.000 PBMCs foram adicionadas a cada mistura de anticorpo e células-alvo para dar uma razão final de células efetoras para células-alvo de aproximadamente 30:1. As placas com 96 poços foram então incubadas por 4 h e centrifugadas a 250 x g. Os sobrenadantes foram colhidos e testados quanto a atividade de lactato desidrogenase (LDH) usando o sistema de Ensaio de Citotoxiciade Não-radioativa CYTOTOX 96® (Promega) (Tabela 14). Tabela 14
Figure img0009
Figure img0010
Exemplo 10: Atividades Terapêuticas de Anticorpos Anti-CD20 com um Modelo de Camundongo com Xenoenxerto de Linfoma Humano
[00066] Estudos de eficácia in vivo para anticorpos anti-CD20 selecionados foram conduzidos usando um modelo do camundongo com xenoenxerto de linfoma de células B não-Hodgkin humano. Camundongos fêmeos com imunodeficiência combinada grave (SCID) foram adquiridos aos 6 meses de idade. Depois de uma semana de aclimatação, 2,5 milhões de células Raji recém-colhidas (células de uma linhagem de células de linfoma de células B não-Hodgkin) foram injetadas por via intravenosa em cada camundongo. Cada camundongo enxertado com células Raji foi então tratado com FC humano humano (hFC), controle I, controle II, 8G6-5, 9D4-7, 10F2-13, ou 7E1-13, cada um a 10 mg/kg, por intermédio de injeção intravenosa através da cauda lateral, 3, 6, e 9 dias depois do enxerto. Os camundongos foram monitorados por um período de até 180 dias. Os camundongos que apresentavam sinais de doença incluindo paralisia das patas traseiras, caquexia, e massa tumoral grande ocasional foram sacrificados por asfixia com CO2. As curvas de sobrevida isenta de sintomas foram construídas usando o método de Kaplan-Meier (Figura 1). Os resultados são expressos como sobrevida percentual em função do tempo de sobrevida isenta de sintomas. Estes resultados indicam que o anticorpo (ab) 10F2-13 aumentou os tempos de sobrevida significativamente no modelo animal, de cerca de 20 dias (animais tratados com o controle de hFc) para cerca de 180 dias (um aumento maior do que 9 vezes na taxa de sobrevida) (50% dos animais tratados sobreviveram cerca de 20 dias (controle com hFc), cerca de 40 dias (controle I), cerca de 85 dias (controle II), e mais do que 180 dias (10F2-13). Estes tempos aumentados de sobrevida são pelo menos 2 vezes maiores (em relação ao control II), cerca de 4.5 vezes maiores (em relação ao controle I), ou pelo menos cerca de 9 vezes maiores em relação aos animais tratados com hFc.

Claims (10)

1. Anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno, caracterizado pelo fato de que é de um anticorpo que se liga especificamente a CD20 humana e é capaz de induzir citotoxicidade dependente de complemento (CDC) com uma concentração do anticorpo de cerca de 5 nM ou menos, e aumentar o tempo de sobrevida isenta de sintomas entre cerca de 2 vezes e cerca de 9 vezes ou mais, em relação a animais tratados com o controle em um modelo murino de linfoma humano, onde o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende - uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (HCDR1) e uma CDR1 da cadeia leve (LCDR1), onde a HCDR1 e a LCDR1 são SEQ ID NO:341 e 349; - uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (HCDR2) e uma CDR2 da cadeia leve (LCDR2), onde a HCDR2 e a LCDR2 são SEQ ID NO:343 e 351; e - uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada 3 (HCDR3) e uma CDR3 da cadeia leve (LCDR3), onde a HCDR3 e a LCDR3 são SEQ ID NO:345 e 353.
2. Anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno, caracterizado pelo fato de que é de um anticorpo que se liga especificamente a CD20 humana e é capaz de induzir citotoxicidade dependente de complemento (CDC) com uma concentração do anticorpo de cerca de 5 nM ou menos, onde o anticorpo ou seu fragmento compreende uma sequência da região variável da cadeia pesada (HCVR) e uma sequência da região variável da cadeia leve (LCVR), onde as sequências da HCVR e LCVR são selecionadas no grupo que consiste em SEQ ID NO: 339 e 347.
3. Anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a concentração do anticorpo necessária para induzir CDC é 1 nM ou menos.
4. Anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que ainda apresenta uma CE50 de 0.2 nM ou menos, medida em células Daudi, ou uma CE50 de 0,4 nM ou menos, medida por células RL.
5. Anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que apresenta uma KD ou CE50 de pelo menos 10-11 M, medida pela ligação ao antígeno apresentado sobre a superfície celular.
6. Método para produzir um anticorpo anti-CD20 humana ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de introduzir o vetor de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo humano ou fragmento de anticorpo humano como definido na reivindicação 5 em uma célula hospedeira isolada, desenvolver a célula sob condições que permitam a produção do anticorpo ou fragmento de anticorpo, e recuperar o anticorpo ou fragmento de anticorpo assim produzido.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de E. coli, uma célula CHO, ou uma célula COS.
8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação a anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
9. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso para atenuar ou inibir uma doença ou condição mediada por CD20 em um ser humano.
10. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição tratada é selecionada no grupo que consiste em linfoma não-Hodgkin, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, doença de Crohn, leucemia linfocítica crônica, e doenças inflamatórias.
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