BRPI0808442A2 - Composições de àcido nucleico de filamento duplo fechado - Google Patents

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BRPI0808442A2
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES DE ÁCIDO NUCLEICO DE FITA DUPLA FECHADO".
Este Pedido de Patente reivindica o benefício dos Pedidos Provisórios de Patentes dos Estados Unidos Nos. 60/905.461 e 60/950/271, ambos os quais são incorporados aqui, por referência em suas totalidades. CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se com o campo da imunologia e dos agentes estimulantes da imunização. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a composições de ácido nucleico de fita dupla fechado. Os ácidos nucleicos podem compreender dsRNA.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
O sistema imunológico inato tem um papel como tanto como uma "primeira linha" de defesa com relação a um patógeno invasor, e também um papel de suporte para uma resposta imune adaptáveis. Os recepto15 res do tipo Toll-Iike (TLRs) são uma família de receptores que tem um papel chave no início de ambas as respostas adaptáveis e inatas. Os TRLs respondem individualmente com relação a diversas indicações de qualidade de agentes infecciosos, por exemplo, o TRL4 é responde especificamente aos lipopolissacarídeos, o TRL9 responde de modo preferencial aos ácidos nu20 cleicos metilados, tais como os ácidos nucleicos que compreendem um motivo CpG, enquanto que os dsRNAs são os agonistas de preferência do TRL3.
O RNA de filamento duplo (dsRNA) é um intermediário replicante comum de infecções viróticas. A TRL3 inicia uma resposta imune inata não25 específica quando a replicação viral ocorre no hospedeiro ou quando um hospedeiro fica exposto a imitadores de replicação viral tais como o RNA de fita dupla polilC. A estimulação da TRL3 leva a ativação do NF-kB e a subsequente produção de citocinas inflamatórias incluindo ao interferons que por sua vez aumentam a resposta adaptativa imune através do estímulo da 30 expressão aumentada da MHC classe I e classe II.
A característica imunoestimulante do dsRNA tem sido de interesse com relação ao desenvolvimento de terapêuticas do câncer. O uso de polilC como um adjuvante e usado em combinação com agentes terapêuticos é bem-conhecido. Além disso, o sdRNA PoIiIC tem sido combinado com outros agentes para o aumento da estabilidade, A Patente U.S. 4.346.538 descreve complexos PoIiIC compreendendo poli:C, poly-L-lisina (um polipep5 tídio policatiônico) de peso molecular relativamente alto em uma faixa de MW de 13 a 35 kDa e carboximetilcelulose ("polilCLC"); e métodos para a preparação e utilização de tais composições. O uso da polilCLC como um agente terapêutico para o tratamento de alguns cânceres, algumas doenças viróticas tais como o HIV ou Ebola, e também na esclerose múltipla também 10 foi sugerido (Publicação US 2006/0223742).
Outras dsRNAs também tem demonstrado ter algum potencial como agentes terapêuticos do câncer. Por exemplo, as dsRNAs em combinação com Iinfocinas foram descritas como tendo um efeito de sinergia como agentes terapêuticos para o tratamento de melanomas (EP 0281380). Os 15 agonistas TLR3, incluindo polylC e polyAU, para uso como métodos aperfeiçoados para o tratamento de cânceres também foram descritos (US 2006/011-746).
Zhu et al (J. Translational Medicine 2007 5:10 doi: 10.1186/1479- 5876-5-10) descreve uma combinação de polilCLC (administrada por via intramuscular e imunógenos específicos para tumor em combinação com IFA)como um tratamento efetivo para camundongos que continham gliomas CSN.
Algumas composições polil:C tem sido usadas no tratamento da síndrome de fadiga crônica, e em combinação com agentes antiviróticos no tratamento de variantes da infecção por HIV (Thompson et al., Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1996 Jul; 15(7):580-7; Gillespie et al., In Vivo. 1994 MayJun; 8(3):375-81; Strayer et al., Clin Infect Dis 1994 Jan;18 Suppl 1-.S88-95).
Outros motivos de oligonucleotídeos específicos foram identificados como tendo efeitos de estímulo de imunização, por exemplo os dinucleotídeos CpG. Alguns motivos CpG não metilados no DNA são agonistas TRL9, e tem sido propostos como terapêuticas para o câncer (Krieg AM. 2007 J. Clin Invest 117:1184-94). A US 7.148.191 descreve uma composição antigênica que compreende um peptídio policatiônico e um ácido nucleico compreendendo inosina e citosina, para ser usado em combinação com um antígeno pequeno (de 6 a 20 aminoácidos). A WO 01/93905 descreve oligodesoxinucleotídeos estimulantes da imunização que excluem os motivos 5 CpGm citando efeitos colaterais tais como TNF-alfa altamente sistêmica e uma falta de especificidade.
Os ácidos nucleicos terapêuticos, incluindo os RNA1 podem ser submetidos a degradação pela resposta imune que eles estimulam, como parte da resposta inata de defesa virótica. A US 6.194.388 (e as referências 10 dento da mesma) mostra que a troca de nucleosídeos de desoxirribose por nucleosídeos de ribose nas composições de ácido nucleico não é eficaz em aumentar a estabilidade, como a forma específica do açúcar de ribose aparece como sendo necessária para a ativação imune. O aumento da dose também não evita os itens de estabilidade, na forma em que a toxidez é de15 pendente da dose.
Os adjuvantes com a estabilidade melhorada, adequados para serem administrados em combinação com pelo menos um agente terapêutico, por exemplo, um imunógeno virótico, e capaz de aumentara atividade de estímulo da imunização do imunógeno viral são desejados.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a agentes estimulantes de imunização, e proporciona composições de ácido nucleico de fita dupla fechada (LNA). Os ácidos nucleicos podem compreender dsRNA.
É outro objetivo da invenção o de prover um composto aperfeiçoado que contenha dsRNA.
A presente invenção também proporciona um composto da fórmula que se segue
Vn-(Sm)-Wp
I I I
Zn-(Dm)-Qp
Fórmula Il
onde - n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
- V, W, Z e Q são qualquer nucleosídeo;
- m é qualquer número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,
34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina ou um nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um
nucleosídeo análogo de uracila;
- onde um ou mais do que um de V, S, W, Z, D e Q compreendem um ou mais do que um monômero de ácido nucleico fechado (LNA).
A presente invenção também proporciona um composto como definido acima, onde B é inosina e D é cisteína.
A presente invenção diz respeito a uma composição que compreende o composto como definido acima, um polipeptídio policatiônico, tal como a polilisina, poliornitina e carboximetilcelulose.
A presente invenção tambem proporciona uma composição que compreende qualquer um dos compostos definidos acima, e um imunógeno, por exemplo, HspE7.
A presente invenção também proporciona um composto da fórmula que se segue
Rkl-Vn- (Sm) —Wp~Rx2
R-k3 (Dm) Qp-Rk4
Fórmula lia, na qual:
- n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre, eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer
quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
- V, W, Z e Q podem ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de um grupo de ligação internucleosídeo, onde
VeZ são capazes de se ligar, e W e Q são capazes de se ligar;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou
100;
-Sé inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina ou um nucleosídeo análogo de adenina;
- D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila;
- k^ k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número
inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de um grupo de ligação de internucleosídeo ao nucleosídeo geminal, ou R pode estar ausente. Em algumas modalidades, por exemplo,
um ribonucleosídeo R 5’ da primeira fita é capaz de se ligar a um ribonucleosídeo R 3’ da segunda fita, e;
- em que um ou mais do que um de V, S, D, Z, Q, R e W compreendem um ou mais do que um monômero LNA.
A Fórmula Ila representa uma molécula de DNA de fita dupla
tendo uma base pendente de 5’, ou de 3’ ou ambas uma base pendente de 5’ e 3’, e tendo uma primeira fita Rk-Vn-(Sm)-Wp-Rk e uma segunda fita Rk-Zn(Dm)-Qp-Rk, com ligação entre os nucleosídeos complementares representada por uma única linha horizontal. A primeira fita é representada em uma direção de 5’ para 3’ (esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita é representada em uma orientação antiparalela com relação à primeira fita (aparecendo como de 3’ a 5’ quando lida da esquerda para a direita).
A presente invenção também está direcionada a um método pa
ra o tratamento de um sujeito com relação a um câncer ou uma doença ou um distúrbio associado a um patógeno bacteriano ou viral, o método compreendendo a administração ao sujeito de um composto de acordo com a fórmula que se segue:
Vn-(Sm)-Wp
I I I
Zn-(Dm)-Qp
Fórmula II
na qual:
- n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
- p é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer
quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9 ou 10;
- V, W, Z e Q são qualquer nucleosídeo;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina ou um nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citidina, um nucleosídeo análogo de citidina, uridina, ou um
nucleosídeo análogo de uridina;
- em que um ou mais do que um de V, W, S, Z, D e Q compreendem um ou mais do que um monômero de ácido nucleico fechado (LNA). A presente invenção também diz respeito ao método acima mencionado, onde S é inosina e D é citosina. Além disso, o composto pode ser administrado em conjunto com um Imunógeno, por exemplo, o HspE7.
De acordo com outro aspecto da invenção, é provido um método 5 para o aumento de uma resposta de imunização de um sujeito com relação a um imunógeno, o método compreendendo administração a um sujeito de uma composição que compreenda um imunógeno e um dsRNA contendo um LNA. O imunógeno pode ser um organismo completo morto, uma proteína, um peptídio, uma proteína de fusão, um peptídio de fusão, uma proteína re10 combinante ou um peptídio recombinante. O imunógeno pode ser o HspE7. Os exemplos de dsRNA que compreendem um LNA incluem, porém não estão limitados a, as Fórmulas de Il a Vll da presente invenção.
Os dsRNA que compreendem as moléculas da presente invenção contém um ou mais LNAs. Esses dsRNA que contém LNA, exibem a 15 propriedade de estabilidade aumentada, retendo ao mesmo tempo a atividade do dsRNA. Os LNA são capazes de formar dúplices e tríplices específicos de nucleobase com ácidos nucleicos de fita simples ou de fita dupla. Esses complexos exibem uma estabilidade térmica mais alta do que os complexos correspondentes formados com os ácidos nucleicos normais.
A presente invenção também proporciona um composto da fór
mula Vn-(Sm)-Wp
Fórmula IVa
onde:
- n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9 ou 10;
- p é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
VeW são qualquer nucleosídeo, ribonucleosídeo, desoxirribo
nucleosídeo, análogo de nucleosídeo, análogo de ribonucleosídeo ou análoqo de desoxirribonucleosídeo; - m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina ou um nucleosídeo análogo de adenina;
- na qual um ou mais do que um de V, S, e W compreendem um ou mais do que um monômero de ácido nucleico fechado (LNA).
A presente invenção também proporciona um composto da fór
mula:
Qp-(Dm)-Zn Fórmula IVb onde:
- n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9 ou 10;
-pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
ZeQ são qualquer nucleosídeo, ribonucleosídeo, desoxirribonu
cleosídeo, análogo de nucleosídeo, análogo de ribonucleosídeo ou análogo de desoxirribonucleosídeo;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila ou um nucleosídeo análogo de uracila;
- na qual um ou mais do que um de Z, D, e Q compreendem um
ou mais do que um monômero de ácido nucleico fechado (LNA).
A presente invenção também proporciona um método para a fabricação de um composto da fórmula
Vn-(Sm)-Wp
Zn-(Dm)-Qp
Fórmula II
onde:
- n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9 ou 10;
- p é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
- V, W, Z e Q são qualquer nucleosídeo;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50,
ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-Sé inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina ou um
nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citidina, um nucleosídeo análogo de citidina, uridina, ou um nucleosídeo análogo de uridina;
- em que um ou mais do que um de V, W, S, Z, D e Q compreendem um ou mais do que um monômero LNA, o método compreendendo
a mistura de uma proporção molar a partir de cerca de 0,5 a 1,0 até cerca de
1,0 até 0m5 de um primeiro oligômero de acordo com o composto da fórmula Vn-(Sm)-Wp com um segundo oligômero de acordo com o composto da fórmula para a formação de um ácido nucleico de fita dupla.
A presente invenção proporciona um composto da fórmula
Rki-V n-( Sm )-W p-Rk2 Fórmula IVc onde
- n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer
quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
VeW são qualquer nucleosídeo, ribonucleosídeo, desoxirribonucleosídeo, análogo de nucleosídeo, análogo de ribonucleosídeo ou análogo de desoxirribonucleosídeo;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou
100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina ou um nucleosídeo análogo de adenina;
- ki e k2 podem ser independentemente quaisquer números inteiros a partir de 0 a 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre os mesmos,
- R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo co
nectado através de um grupo de ligação de internucleosídeo ao nucleosídeo geminal, ou R pode estar ausente. Em algumas modalidades, por exemplo, um ribonucleosídeo R 5’ da primeira fita é capaz de se ligar a um ribonucleosídeo R 3’ da segunda fita, em que um ou mais do que um de V, S, R e W 25 compreendem um ou mais do que um monômero de ácido nucleico fechado (LNA).
A presente invenção proporciona um composto da fórmula:
A presente invenção proporciona um composto da fórmula:
Rk4” Qp-(Drn)- Zn "Rk3 Fórmula IVd
na qual
-n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-p é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-ZeQ são qualquer nucleosídeo, ribonucleosídeo, desoxirribonucleosídeo, análogo de nucleosídeo, análogo de ribonucleosídeo, ou análogo de desoxirribonucleosídeo.
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, adenina ou um nucleosídeo análogo de adenina;
- k3 e k4 podem ser independentemente quaisquer números inteiros a partir de 0 a 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre os mesmos,
- R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de um grupo de ligação de internucleosídeo ao nucleosídeo
geminal, ou R pode estar ausente. Em algumas modalidades, por exemplo, um ribonucleosídeo R 5’ da primeira fita é capaz de se ligar a um ribonucleosídeo R 3’ da segunda fita, em que um ou mais do que um de R, Z, D e Q compreendem um ou mais do que um monômero de ácido nucleico fechado (LNA).
A presente invenção proporciona um método para a fabricação
de um composto da fórmula
Rkl-Vn- (Sin) -Wp-R)c2
Rk3~-Zn— (Dm) — Qp-Rk 4
Fórmula Ila
- n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer
quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9 ou 10;
- V, W, Z e Q são quaisquer nucleosídeos;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou
100;
-Sé inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina ou um nucleosídeo análogo de adenina;
- D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila;
- ki, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número
inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de um grupo de ligação de internucleosídeo ao nucleosídeo geminal, ou R pode estar ausente, o método compreendendo
a mistura de uma proporção molar a partir de cerca de 0,5 a 1,0 até cerca de
1,0 até 0,5 de um primeiro oligômero de acordo com o composto da fórmula Rki-Vn-(Sm)-Wp-Rk2 com um segundo oligômero de acordo com o composto da fórmula Rk-Qp-(Dm)-Zn-Rk e temperando os referidos primeiro e segundo oligômeros para a formação de um ácido nucleico de fita dupla.
A presente invenção proporciona um composto da fórmula: Via:
Rki— (Sm) — { Elna ) — () — Rk2 Rk3~ (Dm) - (Flna) - (Sm) -Rk4
VIb:
Rki- (Dm) - (Elna) - (Sm) -Rk2
Illll
Rk3“ (Sm) - (Flna) ~ (Dm) -Rk3
Vlc:
Rki- (Sm) - (Elna) ~ (Sm) -Rk2 R-k3“ (Dm) - (Flna) ~ (Dm) -Rk4
VId:
Rki- (Dm) - (Elna) — (Dm) ~ Rk2 Rk3 — ( Sm ) — ( F LNA ) — ( Sm ) — Rk4
onde
-Elna é CpG, ou um motivo CpG1 onde um ou mais do que um dos nucleosídeos C, G1 que compreendem o CpG ou o motivo CpG é um LNA;
-Flna é CpG1 ou um motivo CpG1 onde um ou mais do que um
dos nucleosídeos C1 G, que compreendem o CpG ou o motivo CpG é um LNA;
- m pode ser um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina, ou um nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila;
k-ι, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de uma ligação de internucleosídeo.
A presente invenção também proporciona um composto de
qualquer uma das fórmulas:
Vila: Rk3-(Sm)-(ELNA) Vllb: Rk2-(Dm)-(FLNA) Vllc: Rk3-(Dm)-(E lna) Vlld: RkI-(Sm)-(FLNA) Vlle: (Elna)-(Sit) )-Rk3 Vllf: (FLNA)-(Dm)-Rkl Vllg: (ELNA)-(Dm)-Rk2 Vllh: (Flna)-(Siti)- Rki nas quais
- Elna é CpG, ou um motivo CpG, onde um ou mais do que um dos nucleosídeos C, G, que compreendem o CpG ou o motivo CpG é um LNA;
-Flna é CpG, ou um motivo CpG, onde um ou mais do que um dos nucleosídeos C, G, que compreendem o CpG ou o motivo CpG é um LNA;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-Sé inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina, ou
um nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila;
k-ι, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de uma ligação de internucleosídeo.
De acordo com alguns aspectos da invenção,
- Elna é a SEC ID NO; 23; e - Flna é a SEQ ID NO: 24.
A presente invenção proporciona um composto de qualquer uma
das fórmulas:
VIe:
Rki (Shi)-Glna Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna-(Dm)-R^
I I I I I I I I I I
Rk3 (Dm) -Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Alna- (Sm) ~Rk4
VIf:
Rki- (Dm) -Glna-Tlna-Clna~Glna-Tlna-Tlna- (Sm) -Rk2
I I I I I I I I I I
Rk3 (Sm) Clna Alna-Glna-Clna-Alna-Alna- (Dm) -Rk4 VIg:
Rki- (Sm) -GijNa-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna- (Sm) Rk2
I l I I I I I I I I
Rk3- (Dm) -Clna-Alna-Glna-Clna-Alna Alna (Dm) Rk4
VIh:
Rki- (Dm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna- (Dm) Rk2
I I I I I I I I I I
Rk3- (Sm) -Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Alna- (Sm) Rk4
onde
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina, ou um nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila;
ki, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de uma ligação de internucleosídeo.
A presente invenção proporciona um composto de qualquer uma
das fórmulas:
VH: Rk1-(Sm)-GLNA-Ti_NA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(Dm)-Rk2 Vlj:
Rk3-(Dm)-Ci_NA Alna Glna Clna Alna ALNA"(Sm)-Rk4 Vlk: Rk1-(Dm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA“(Sm)-Rk2 VII: Rk3-(Sm)-CLNA Alna Glna Clna Alna ALNA"(Dm)-Rk4
Vl I m: Rki -(Sm )-Glna-T lna-Clna-Glna-T lna-T LNA_(Sm)-Rk2 Vln: Rk3-(Dm)-CLNA Alna Glna Clna Alna ALNA-(Dm)-Rk4 Vlo: Rkr(Dm)-GLNA-T lna-Clna-Glna-T lna-T LNA-(Dm)-Rk2
Vip: Rk3-(Sm)-CLNA-ALNA-GLNA-CLNA-ALNA-ALNA-(Sm)-Rk4
onde
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina, ou um nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila;
k-ι, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo co
nectado através de uma ligação de internucleosídeo.
A presente invenção proporciona um método (A) para a fabricação de um composto da fórmula:
VIe:
Rki~ (Sm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna- (Dra) ~Rk2
I I I I I I I I I I
Rk3" (Dm)- Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Alna- (Sm) -Rw
onde:
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50,
ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina, ou
um nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila; ki, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de uma ligação de internucleosídeo;
o método compreendendo misturar uma proporção molar a partir de cerca de 0,5:1,0 até cerca de 1.0:0,5 de um primeiro oligômero de acordo com a fórmula:
Vl i: Rki -(Sm )-Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna-( Dm )-Rk2
com um segundo oligômero de acordo com a fórmula Vlj: Rk3-(Dm)-CLNA Alna Glna Clna Alna ALNA-(Sm)-Rk4,
e temperando os primeiro e segundo oligômeros para a formação de um ácido nucleico de fita dupla.
A presente invenção proporciona um método (B) para a fabricação de um composto da fórmula:
VIf:
Rki- (Dm) "Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-TlinA- (Sm) -Rk2
I I I I I I I I I
Rk3 (Sm) Clna ALna Glna-Clna-Alna-Alna- (Dm) -Rk4
onde:
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina, ou um nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila;
ki, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número
inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de uma ligação de internucleosídeo;
o método compreendendo: misturar uma proporção molar a partir de cerca de 0,5:1,0 até cerca de 1.0:0,5 de um primeiro oligômero de acordo com a fórmula:
Vlk: Rk1-(Dm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-T|_NA-TLNA-(Snn)-Rk2
com um segundo oligômero de acordo com o composto da fórmula VII: Rk3"(Sm)-CLNA Alna Glna Clna Alna ALNA-(Dm)-Rk4 e temperando os referidos primeiro e segundo oligômeros para a formação de um ácido nucleico de fita dupla.
A presente invenção proporciona um método (C) para a fabrica
ção de um composto da fórmula:
VIg:
Rki- (Sm) -Glna-Tlna-Cl,na_Glna-Tlna-Tlna~ (Sm) -Rjc2
I I I I I I I I I
Rk3 (Dm) Clna~Alna-Glna-Clna-Alna“Alna- (Dm) -Rk4
na qual:
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina, ou um nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um
nucleosídeo análogo de uracila;
k-ι, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de uma ligação de internucleosídeo; o método compreendendo: misturar uma proporção molar a partir de cerca de 0,5:1,0 até cerca de 1.0:0,5 de um primeiro oligômero de acordo com a fórmula:
Vim: Rki-(Sm)-Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna-( Sm )-Rk2
com um segundo oligômero de acordo com o composto da fórmula Vln: Rk3-(D m)-Ci_NA Alna Glna Clna Alna ALNA-(Dm)-Rk4 e temperando os referidos primeiro e segundo oligômeros para a formação de um ácido nucleico de fita dupla.
A presente invenção proporciona um método (D) para a fabricação de um composto da fórmula Vlh:
Rki- (Dm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-TxjNa- (Dm) -Rk2
I I I I I I I I I
Rk3~ (Sm) -Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Alna- (Sm) Rk4
na qual:
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50,
ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,
35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-Sé inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina, ou
um nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila;
k pode ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de uma ligação de internucleosídeo;
o método compreendendo: misturar uma proporção molar a partir de cerca de 0,5:1,0 até cerca de 1.0:0,5 de um primeiro oligômero de acordo com a fórmula:
Vlo: Rkr(Dm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(Dm)-Rk2 com um segundo oligômero de acordo com um composto da fórmula: Vip: Rk3-(Sm)-CLNA AlNA GlNA ClNA AlNA ALNA-(Sm)-Rk4 e temperando os referidos primeiro e segundo oligômeros para a formação de um ácido nucleico de fita dupla.
A presente invenção também proporciona com relação a um composto de acordo com a fórmula:
GlNA-GlNA"(I22)-GlNA-GlNa
Illll
ClNA-Clna-(C22)-ClNA-ClNA
Fórmula IIIa
A presente invenção tambem proporciona com relação a um método para a fabricação de um composto de acordo com a fórmula 11 Ia, o método compreendendo a combinação de oligômeros de cada uma das SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 e permitindo que os oligômeros se temperem para prover o composto de fita dupla da fórmula 11 Ia.
A presente invenção também proporciona compostos de acordo com as fórmulas:
I-X-I-I-X-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-GTul G -AT .-A-T -Glka
Il Il I Il I Il I I I Il
ClnaCTlna- ATl^a AClna C-C C C-C-C-C-C-C-C C-C-C C-C
(Fórmula Va)
Glna-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-G-Tuia-Gu1a-A-Tuwi-A-Tuuv
I I I I I Il I Il I Il I I I I
AlnA-Clna-U A-Tlna-A-Clna- C—C—C—C—C—C-C-C-C-C—C—C—C-C-C CjjPia
(Fórmula Vb)
Tlna- GlNA-Ι“Ι-Ι~Ι~Ι*·Ι_Ι“Ι —I-I-I-X-I-I-I-G - Tlna-Gu^-A-Tli1Ia-At^ml
Il Il I I Il I I I I Il Il I I I
C-Tlna-A-Τγ,να“A- Ct1NA-- C-C—C—C-C-C-C-C—C —C-C-C-C-C-C-Clna^Alna
(fórmula Vc)
A presente invenção também proporciona métodos para a fabricação de compostos de acordo com as fórmulas Va, Vb, e Vc, o método 15 compreendendo a combinação de oligômeros de acordo com as SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8; e permitindo que os oligômeros se temperem para a produção dos compostos de ácido nucleico de fita dupla mostrados nas Fórmulas Va. Vb e Vc.respectivamente. (Ii5)-G-Tlna-Glna-A-Tlna-A-Tlna-Glna (SEQ ID NO: 3)
(Cis)-Clna-A- Tlna-A-Tlna-C-Alna- Clna (SEQ ID NO: 4) Glna-(Iis)-G-Tlna-Glna-A-Tlna-A-Tlna (SEQ ID NO: 5)
Clna-(Ci5)- Clna-A-Tlna-A-U-Clna- Alna (SEQ ID NO: 6)
Tlna-Glna-(I-i5)-Tlna-Tlna-A-Tlna-Alna (SEQ ID NO: 7)
Alna-Clna-(Ci5)-Clna*A- Tlna-A- Tlna-Clna (SEQ ID NO: 8)
A presente invenção também proporciona oligômeros de fita dupla com finais 3’ não pareados. A presente invenção também proporciona com relação a métodos para a fabricação de oligômeros de fita dupla com 10 finais 3’ não pareados, o método compreendendo a combinação de oligômeros de acordo com as SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO.11 e SEQ ID NO: 12, ou SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 25, possam ser combinados e permitindo que se temperem para a produção dos compostos de ácido nucleico de fita dupla mostrados nas Fórmulas Vd e Vc, respectivamente.
Glna-Glna- (I)i5-(A)i5 (SEQ ID NO: 9)
(C)-i5-Clna-Clna-(U)i5 (SEQ ID NO: 10)
Glna-Glna- (Oio-(A)10 (SEQ ID NO: 11)
(U)io-Clna-Clna-(C)-io (SEQ ID NO: 12)
(C)-io-Clna- Clna-(U)10 (SEQ ID NO: 25)
A presente invenção também proporciona oligômeros de fita du
pla que compreendem motivos CpG. A presente invenção também proporciona métodos para a fabricação de oligômeros de fita dupla compreendendo a combinação de oligômeros de acordo com as SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, ou SEQ ID NO: 17 e SEQ ID 25 NO: 18, ou SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22, e permitindo que os oligômeros se temperem, para a produção do composto de dsRNA de acordo com as Fórmulas VIg, Vlh, Vli, Vlj e Vlk. Glna-Glna-(I)i5- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna-(I)i5- Glna-Glna (SEQ ID NO: 13)
Clna-Clna-(C)1S- Alna-Alna-Clna-Glna-Alna-Clna-(C)1S-Clna-Clna (SEQ ID NO: 14)
Glna-Glna-( I )i5- Glna-T lna-Clna-Glna-T lna-T lna- (SEQ ID NO: 15) G LNA”( I )l 5' G LNA-TLNA-ClNA'G LNA-TLNA-TLNA
(SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 20)
Clna-(C)15- Alna-Alna-Clna-Glna-Alna-Clna
Clna-Glna_(I )i5- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna Glna-Clna-(C)1S- Alna-Alna-Clna-Glna-Alna-Clna
(SEQ ID NO: 21) (SEQ ID NO: 22)
Os compostos da presente invenção na forma como descritos acima contêm motivos CpG que compreendem um ou mais do que um LNA. 10 Esses ácidos nucleicos que contêm LNA exibem a propriedade de aumentar a estabilidade, retendo ao mesmo tempo a atividade associada com o CpG. Os LNA são capazes de formar dúplices e tríplices de bases de núcleo específicas com ácidos nucleicos de fita única ou de fita dupla. Esses complexos exibem uma estabilidade térmica mais alta do que os complexos corres15 pondentes formados com ácidos nucleicos normais.
De acordo com alguns aspectos da invenção no composto definido por qualquer uma das Fórmulas Vla até Fórmula Vld1 Fórmula Vlla até Fórmula Vllh ou Fórmula Vllla até Fórmula Vlllh,
- Elna é a SEQ ID NO: 23, e - Flna é a SEQ ID NO: 24.
De acordo com alguns aspectos da invenção no composto definido por qualquer uma das Fórmula II, Fórmula Ila até Fórmula lie, Fórmula IVa até Fórmula IVd1 Fórmula Vla até Fórmula Vld1 Fórmula Vle até Fórmula Vlh, Fórmula Vli até Fórmula Vip, Fórmula Vlla até Fórmula Vllh1 Fórmula 25 Vllla até Fórmula Vlllh, S é inosina e D é citosina em todos os compostos como definidos acima.
De acordo com alguns aspectos da invenção no composto definido por qualquer uma das o composto como definido acima, por qualquer uma das Fórmula II, Fórmula Ila até a Fórmula lie, Fórmula III, Fórmula Illa 30 até a Fórmula llld, Fórmula IVa até a Fórmula IVd1 Fórmula Va até a Fórmula Vc, Fórmula Vla até a Fórmula Vld, Fórmula Vle até a Fórmula Vlh, Fórmula Vli até a Fórmula Vip, Fórmula Vlla até a Fórmula Vllh, Fórmula Vllla até a Fórmula Vlllh pode também compreender um polipeptídio, policatiônico incluindo a polilisina, poliarginina, poliornitina.
A presente invenção tambem proporciona uma composição que compreende o composto como definido acima (Fórmula II, Fórmula Ila até a 5 Fórmula Ile, Fórmula III, Fórmula Illa até a Fórmula llld, Fórmula IVa até a Fórmula IVd1 Fórmula Va até a Fórmula Vc, Fórmula Vla até a Fórmula Vld, Fórmula Vle até a Fórmula Vlh, Fórmula Vli até a Fórmula Vip, Fórmula Vlla até a Fórmula Vllh, Fórmula Vllla até a Fórmula Vlllh) e um imunógeno, por exemplo o HspE7. A presente invenção também compreende métodos para 10 o tratamento de um sujeito, que compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamente aceitável da composição ao sujeito.
De acordo com outro aspecto da invenção, é provido um método para o aumento da resposta imune de um sujeito com relação a um imunógeno, o método compreendendo a administração a um sujeito de uma com15 posição que compreenda o imunógeno e um composto como definido acima por qualquer uma das Fórmula II, Fórmula Ila até a Fórmula lie, Fórmula III, Fórmula Illa até a Fórmula llld, Fórmula IVa até a Fórmula IVd1 Fórmula Va até a Fórmula Vc, Fórmula Vla até a Fórmula Vld, Fórmula Vle até a Fórmula Vlh, Fórmula Vli até a Fórmula Vip, Fórmula Vlla até a Fórmula Vllh, Fór20 mula Vllla até a Fórmula Vlllh. O imunógeno pode ser um organismo completo morto, uma proteína, um peptídeo, uma proteína de fusão, um peptídeo de fusão, uma proteína recombinante ou um peptídio recombinante. O Imunógeno pode ser o HspE7.
De acordo com outro aspecto da invenção, é provido um com25 posto que compreende: um primeiro polímero de nucleotídeo de fita única, compreendendo a partir de um até 500 ribonucleotídeos de inosina, citosina ou uma combinação de inosina e de citosina e a partir de um até dez resíduos de ácido nucleico fechado; e um segundo polímero de nucleotídeo de fita dupla, compreendendo a partir de um até 500 ribonucleotídeos de inosi30 na, citosina ou uma combinação de inosina e de citosina e a partir de um até dez resíduos de ácido nucleico fechado; onde o primeiro polímero de nucleotídeo de fita única e o segundo polímero de nucleotídeo de fita dupla estão ligados por hidrogênio para a formação de um ácido nucleico de fita dupla, e o ácido nucleico de fita dupla compreendendo uma região polilC de fita dupla e uma região de fita dupla compreendendo resíduos de ácido nucleico fechado.
A presente invenção também proporciona um composto que
compreende um primeiro polímero de nucleotídeo de fita única, compreendendo a partir de um até 500 ribonucleotídeos de inosina, citosina ou uma combinação de inosina e de citosina e uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 23; e um segundo polímero de nucleotídeo de fita 10 dupla, compreendendo a partir de um até 500 ribonucleotídeos de inosina, citosina ou uma combinação de inosina e de citosina e uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 24; onde o primeiro polímero de nucleotídeo de fita única e o segundo polímero de nucleotídeo de fita dupla estão ligados por hidrogênio para a formação de um ácido nucleico de fita 15 dupla, e o ácido nucleico de fita dupla compreendendo uma região polilC de fita dupla e uma região de fita dupla compreendendo resíduos de ácido nucleico fechado.
A presente invenção também proporciona um composto que compreende um primeiro polímero de nucleotídeo de fita única, compreendendo a partir de um até 500 ribonucleotídeos de inosina, citosina ou uma combinação de inosina e de citosina e uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 23; e um segundo polímero de nucleotídeo de fita única que compreende partir de um até 500 ribonucleotídeos de inosina, citosina ou uma combinação de inosina e de citosina e uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 24; onde o primeiro polímero de nucleotídeo de fita única e o segundo polímero de nucleotídeo de fita única estão ligados por hidrogênio para a formação de um ácido nucleico de fita dupla, e o ácido nucleico de fita dupla compreendendo uma região polilC de fita dupla e uma região de fita dupla compreendendo resíduos de ácido nucleico fechado.
A presente invenção também proporciona um adjuvante ou uma composição adjuvante composta por um primeiro polímero de nucleotídeo de fita única, compreendendo a partir de um até 500 ribonucleotídeos de inosina, citosina ou uma combinação de inosina e de citosina e a partir de um até dez resíduos de ácido nucleico fechado; e um segundo polímero de nucleotídeo de fita única, compreendendo a partir de um até 500 ribonucleotídeos 5 de inosina, citosina ou uma combinação de inosina e de citosina e a partir de um até dez resíduos de ácido nucleico fechado; onde o primeiro polímero de nucleotídeo de fita única e o segundo polímero de nucleotídeo de fita única estão ligados por hidrogênio para a formação de um ácido nucleico de fita dupla, e o ácido nucleico de fita dupla compreendendo uma região polilC de 10 fita dupla e uma região de fita dupla compreendendo resíduos de ácido nucleico fechado.
A presente invenção ainda proporciona um adjuvante ou uma composição adjuvante tendo uma atividade agonista de receptor duplo com relação aos receptores TLR3 e TLR9, o adjuvante ou uma composição adju
vante que compreende um primeiro polímero de nucleotídeo de fita única, compreendendo a partir de um até 500 ribonucleotídeos de inosina, citosina ou uma combinação de inosina e de citosina e uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 23; e um segundo polímero de nucleotídeo de fita única que compreende partir de um até 500 ribonucleotídeos de 20 inosina, citosina ou uma combinação de inosina e de citosina e uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 24; na qual o primeiro polímero de nucleotídeo de fita única e o segundo polímero de nucleotídeo de fita única estão ligados por hidrogênio para a formação de um ácido nucleico de fita dupla, e o ácido nucleico de fita dupla compreendendo uma 25 região polilC de fita dupla e uma região de fita dupla compreendendo resíduos de ácido nucleico fechado.
Este sumário da invenção não descreve necessariamente todas as características da invenção. Outros aspectos e características da presente invenção se tornarão aparentes aquelas pessoas versadas na técnica na ocasião da revisão da descrição que se segue de modalidades especificas da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Essas e outras características da invenção se tornarão aparentes, a partir da descrição que se segue na qual é feita referência aos desenhos apensados nos quais:
A Figura 1 mostra compostos de ácido nucleico de fita dupla de acordo com as Fórmulas Vd e Ve1 de acordo com uma modalidade da presente invenção.
A Figura 2 mostra um ácido nucleico de fita dupla de acordo com a Fórmula Vlg até a Fórmula Vlk1 de acordo com uma modalidade da presente invenção.
A Figura 3 mostra um ácido nucleico de fita dupla que compre
ende uma região polilC, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA
A presente invenção refere-se a agentes imunoestimulantes, e proporciona composições de ácido nucleico de fita dupla fechado (LNA). Os ácidos nucleicos podem compreender dsRNA.
O uso de exemplos no relatório descritivo incluindo exemplos de termos, é somente para finalidades de ilustração e não estão destinados a limitar o âmbito e o significado das modalidades da invenção aqui, .
A presente invenção proporciona uma composição que compre
ende polímeros de oligonucleotídeos polil e poliC, ou poliA e poliU, em que cada um polímero do oligonucleotídeo compreende pelo menos um resíduo de um ácido nucleico fechado (LNA). O dsRNA pode ser composto por cerca de quantidades equimolares de polímeros de oligonucleotídeos polil e poliC 25 (polil:C), ou cerca de quantidades equimolares de polímeros de oligonucleotídeos poliA e poliU (poliA:U).
A presente invenção também proporciona uma composição que compreende um par de polímeros de oligonucleotídeos, cada um compreendendo uma mistura de nucleosídeos de I (inosina) e C (citosina), na qual os 30 nucleosídeos de I e de C no par de polímeros de oligonucleotídeos são dispostos de tal forma a permitir que o par de polímeros de oligonucleotídeos se híbridize para a formação de uma molécula de fita dupla. A presente invenção também proporciona uma composição que compreende polímeros de oligonucleotídeo polil e poliC ou poliA e poliU, em que cada um dos polímeros de oligonucleotídeos compreende pelo menos um motivo CpG e pelo menos um resíduo de um ácido nucleico fechado 5 (LNA). O motivo CpG pode compreender pelo menos um resíduo de LNA. O dsRNA pode ser composto por cerca de quantidades equimolares de polímeros de oligonucleotídeos polil e poliC (polil:C), ou cerca de quantidades equimolares de polímeros de oligonucleotídeos poliA e poliU (poliA:U).
A presente invenção também provê uma composição que com10 preende polímeros de oligonucleotídeo compreendendo pelo menos um motivo CpG e pelo menos um resíduo de LNA, e uma combinação de resíduos I e C, ou uma combinação de resíduos A e U. Os polímeros de oligonucleotídeo podem se hibridizar e formar moléculas de fita dupla, por exemplo, RNA de fita dupla (dsRNA). Por exemplo, o dsRNA que compreende um motivo 15 CpG e que tenha um ou mais do que um LNA pode ser um composto polil:C que compreenda um ou mais do que um LNA. O dsRNA pode ser composto de cerca de quantidades equimolares de polímeros de oligonucleotídeos polil e poliC (polil:C), ou cerca de quantidades equimolares de polímeros de oligonucleotídeos poliA e poliU (poliA:U).
Em outro exemplo, os polímeros de oligonucleotídeo podem
compreender um motivo CpG composto por um ou mais do que um LNA, e uma mistura de nucleosídeos I e C, ou uma mistura de nucleosídeos A e U, onde o motivo CpG e os nucleosídeos I e C de cada um dos oligonucleotídeos no par são dispostos de tal forma a se hibridizarem para a formação de uma molécula de fita dupla.
O dsRNA da presente invenção, que compreende pelo menos um motivo CpG e um ou mais do que um LNA, pode ser usado para uma variedade de finalidades, por exemplo, porém não limitadas ao uso do mesmos como adjuvantes, ou como agentes de imunoestimulação, ou como a30 gentes terapêuticos. Por exemplo, os dsRNA que compreendem pelo menos um motivo CpG e um ou mais do que um LNA pode ser um composto polil:C compreendendo um ou mais do que um LNA. Os agentes de imunoestimulação são compostos ou composições que iniciam uma resposta imune, ou proporcionam um efeito catalítico em iniciar uma resposta imune. A resposta imune pode ser somente uma resposta imune inata (ou não-adaptativa), tal como induzindo a produção de 5 a secreção de citocinas (por exemplo, interferons, interleucinas, fatores de estímulo de colônias e os semelhantes) que por sua vez incitam as células fagocitária a migrarem e ingerir os imunógenos estranhos não-especificamente e apresentarem os imunógenos para o reconhecimento pelo sistema imune adaptativo. De forma alternativa, a resposta imune pode ser uma res10 posta imune adaptativa, em resposta a presença de imunógenos específicos (tais como aqueles apresentados por uma célula fagocitária, também referidas como uma célula que apresenta um antígeno).
O uso dos termos "um", ou "um/uma" incluem ambas as referências singulares e plurais.
Um adjuvante é um agente imunoestimulante que não tem efeito
imunogênico específico por si próprio, porém estimula o sistema imune a aumentar ou melhorar a resposta a um imunógeno específico, ou a um grupo de imunógenos. A capacidade de um imunógeno para induzir uma resposta inata ou adaptativa do sistema imune é referida como "atividade bioló20 gica" do imunógeno. Um adjuvante pode mediar, aumentar ou estimular a atividade biológica de um imunógeno. Em alguns exemplos, o imunógeno pode ter muito pouca atividade biológica ou uma atividade biológica desprezível na ausência de um adjuvante.
A atividade biológica de um imunógeno pode ser medida por 25 qualquer um de numerosos ensaios conhecidos na técnica. Por exemplo, a indução de linfócitos T específicos para antígeno positivo para CD8 pode ser quantificada através do uso de um ensaio ELISPOT (Ásia et al 2000 Clin. Dia. Lab. Enfunou 7:145-154). Podem ser usadas outras versões de um ensaio ELISPOT para outras citocinas, ver, por exemplo, Kalyzhny et al 2005. 30 Methods Mol Biol 302:15-31; Ott, et al. J. Immunol. Methods. 2004 Feb 15;285(2):223-35; Forsthuber, et al. Science, 271: 1728-1730. Outros ensaios de células T que podem ser úteis para a monitoração de uma resposta a um imunógeno inclui a citometria de fluxo da citocina intracelular, análises de proliferação, microconjuntos de anticorpos, e os semelhantes. Ver, por exemplo, Nagorsen et al 2004. Expert Opin Biol Ther 4:1677-84, or Handbook of Experimental Immunology1 Vols. I-IV, D. M. Weir and C. C.
5 Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications. Os lnterferon-α e β podem ser quantificados com um kit Interferon ELISA (Kim et al 2004. Nature Biotechnology 22:321-325). Ensaios multiplexados podem ser, por exemplo, sistemas com base em contas (Luminex, Panomics e os semelhantes) permitem a quantificação simultânea de uma pluralidade de citocinas. Os e10 xemplos de citocinas incluem IL-1a, IL-1 β, IL-2, II-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL9, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IFNa, IFN3, IFNy, GM-CSF, TNFa, G-CSF, MIP-Ia1 ΜΙΡ-1β, MCP-1, EOTAXIN, RANTES, FGF-basic, VEGF e os semelhantes. Para clareza, o termo "citocina" inclui nomenclaturas alternativas tais como linfocinas, interleucinas, ou quimocinas.
O termo "sujeito" e "paciente" podem ser usados de forma inter
cambiável. Um "sujeito" refere-se a um animal, ou a um mamífero, incluindo, porém não limitado a, um camundongo, rato, cão, gato, porco ou primata, incluindo, porém não limitado a um macaco, chimpanzé ou um ser humano. O sujeito pode ser imunologicamente não experiente com relação a um imunógeno específico ou a um grupo de imunógenos, ou o sujeito pode ter sido previamente exposto a um imunógeno específico ou a um grupo de imunógenos. A exposição prévia pode ser resultado a partir de, por exemplo, uma imunização deliberada com um imunógeno específico ou com um grupo de imunógenos, exposição a um agente infeccioso que compreenda um imunógeno específico ou com um grupo de imunógenos, ou exposição com reação cruzada a um primeiro imunógeno ou grupo de imunógenos, que permita uma resposta imune a um segundo imunógeno ou um grupo de imunógenos. O segundo imunógeno ou grupo de imunógenos pode ser similar ao, ser o mesmo como, ou ser diferente do primeiro imunógeno ou grupo de imunógenos.
Na forma usada aqui, a expressão "oligonucleotídeo modificado com LNA", inclui qualquer oligonucleotídeo tanto totalmente como parcialmente modificado com um ou mais monômero de LNA. Desse modo, um oligonucleotídeo modificado com LNA pode ser composto inteiramente por monômeros LNA, ou um oligonucleotídeo modificado com LNA pode compreender um monômero LNA.
A expressão "monômero de DNA" refere-se a um açúcar deso
xirribose ligado a uma base de nitrogênio, enquanto que a expressão "monômero de RNA" refere-se a um açúcar de ribose ligado a uma base que contenha nitrogênio. Os exemplos de monômeros de DNA que podem compreender composições de acordo com diversas modalidades da presente 10 invenção, incluem porém não estão limitados a, desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina, desoxiuridina, desoxicitidina, desoxiinosina e os semelhantes. Os exemplos de monômeros de RNA que podem compreender composições de acordo com diversas modalidades da presente invenção incluem porém não estão limitados a, adenosina, guanosina, 5-metiluridina, 15 uridina, citidina, inosina e os semelhantes. Outros monômeros de DNA ou de RNA de acordo com diversas modalidades da presente invenção podem compreender outras bases que contenham nitrogênio, na forma como são conhecidas na técnica.
Na forma usada aqui, a expressão "monômeros LNA" refere-se 20 tipicamente a um nucleosídeo que tenha uma ligação cíclica 2-4’ como descrito nas US 6.268.490, US 6.794.499, US 7.034,133, (cada uma das quais fica incorporada aqui, por referência). Os nucleotídeos bicíclicos (ver abaixo) podem prover restrições de conformação ao oligonucleotídeo, e podem prover perfis variáveis de hibridização ou de estabilidade quando comparados 25 aos oligonucleotídeos não modificados.
O termo "nucleosídeo" refere-se a uma molécula de açúcar de ribose ou de desoxirribose ligada através de carbono-1 do anel do açúcar a uma base que contenha nitrogênio. Os exemplos de bases que contêm nitrogênio incluem as purinas tais como a adenina, guanina, 6-tioguanina, hi30 poxantina, xantina e pirimidinas tais como a citosina, timina e uracila. Os exemplos de nucleosídeos de purina incluem a adenosina (A), guanosina (G), inosina (I), 2’-0-metil-inosina, 2’-0-metil-adenosina, 2’-0-metil-guanina, 2- clorodesoxiadenosina, 7-halo-7-deaza-adenosina, 7-halo-7-deaza-guanina, 7-propina-7-deaza-adenosina, 7-propina-7-deaza-guanina, 2-aminoadenosina, 7-deazainosina, 7- tia-7,9-dideazainosina, formicina B1 8- Azainosina1 9-deazainosina, alopurinol ribosídeo, 8-bromo-inosina, 8- 5 cloroinosina, 7-deaza-2-desóxi-xantosina, 7-deaza-8-aza-adenosina, 7- deaza-8-aza-guanosina, 7-deaza-8-aza-desoxiadenosina, 7-deaza-8-azadesoxiguanosina, 7-deaza-adenosina, 7-deaza-guanosina, 7-deazadesoxiadenosina, 7-deaza-desoxiguanosina, 8-amino-adenosina, 8-aminodesoxiadenosina, 8-amino-guanosina, 8-amino-desoxiguanosina,3-deaza10 desoxiadenosina, 3-deaza-adenosina, 6-tio-desoxiguanosina, N6- isopenteniladenosina, 1-metiladenosina, 1-metilpseudouridina, 1- metilguanosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 2-metiladenonsina, 2- metilguanosina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 2-metiltioN6- isopenteniladenosina, N-((9-beta-D-ribofuranosil-2-metiltiopurina-6-
il)carbamoil)treonina, N-((9-beta-D-ribofuranosilpurina -6-il)N
metilcarbamoil)treonina, N-((9-beta-D-ribofuranosilpurina-6-
il)carbamoil)treonina, wybutosina, wybutoxosina e as semelhantes, e outros nucleosídeos de purina como os descritos em Freier et al 1997 (Nucleic Acids Res. 25:4429-4443), incorporado aqui, por referência.
Os exemplos de nucleosídeos de pirimidina incluem citidina (C)1
desoxicitidina (dC), timidina (T), desoxitimidina (dT), 5-flúor-uracila, 5- bromouracila, 2’-0-metil-uridina, 2’-0-metil citidina, 5-iodouracila, 5-metóxietóxi-metil-uracila, 5-propinil desoxiuridina, pseudoisocitidina, 5-azacitidina, 5-(1-propinil)citidina, 2'-desoxipseudouridina, 4-tio-desoxitimidina, 4-tio25 desoxiuridina, 4-acetilcitidina, 5-(carboxihidroximetil)uridina) 2-0- metilcitidina, 5-carboximetilaminometiluridina, di-hidrouridina, 2’-0- metilpseudouridina, 3-metilcitidina, 5-metilcitidina, 5-metilaminometiluridina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina, 5- metoxicarbonilmetiluridina, 5-metoxiuridina, metil éster do ácido uridina-5- 30 oxiacético, ácido uridina-5-oxiacético, pseudouridina, 2-tiocitidina, 5-metil-2- tiouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metiluridina, 2’-0-metil-5-metiluridina, 2’-0-metiluridina, 3-(3-amino-3-carbóxi-propil)uridina e similares, e outras pirimidinas substituídas como descritas em Freier, et al,1997 (Nucleic Acids Res. 25:4429-4443).
Os nucleosídeos de purina ou pirimidina também incluem os derivados de fosforamidita usados na síntese do oligonucleotídeo, com a utilização de métodos padronizados.
O termo nucleosídeo também inclui ao análogos de nucleosídeos bicíclicos de acordo com a Fórmula (I), como descritos, por exemplo, na US 6.268.490 (que fica incorporada por referência.
(Fórmula I)
- B pode ser qualquer base que contenha nitrogênio, por exempio, uma base de ácido nucleico de pirimidina ou purina, ou um análogo das mesmas.
-XeY podem ser idênticos ou diferentes, e podem ser qualquer grupo de ligação internucleosídeo.
Esses análogos de nucleosídeo bicíclico podem ser referidos 15 alternativamente como um "monômero de ácido nucleico fechado" ou "monômero de nucleosídeo fechado" ou "monômero LA", ou "resíduo LNA". Os métodos para a síntese e a polimerização de polímeros de ácido nucleico que compreendam monômeros LNA estão descritos, por exemplo, nas, WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO 01/48190, WO 20 02/28875, WO 03/006475, WO 03/09547, WO 2004/083430, US 6.268.490, US 6.794,499, US 7.034,133 (cada um das quais são incorporadas aqui, por referência).
Outros exemplos de análogos de nucleosídeos, como os descritos na WO 01/048190 (que fica incorporada aqui, por referência) incluem nucleosídeos bicíclicos não-LNA, por exemplo, porém não limitados a:
- nucleosídeos biciclo [3.3.0] com uma ponte de etano C-3’- C
5’adicional;
- nucleosídeos bicarbociclo [3.1.0] com uma ponte de metano C1’, C-6\ C-4’adicional;
- nucleosídeos biciclo [3.3.0]- e [4.3.0] que contenham um anel de C-2’, C-3’adicional de dioxano sintetizado como um dímero com um nucleosídeo não modificado onde o anel adicional faz parte da ligação internucleosídeos substituindo uma ligação de diéster de fósforo natural; dímeros
contendo um nucleosídeo biciclo[3.1.0] com uma ponte de metano C-2’, C-3’, como parte das ligações internucleosídeos do tipo de amida e de sulfonamida;
- análogo de nucleosídeo [3.3.0] derivado de glicose incorporado no meio de um trímero através de ligações internucleosídeos de formacetal;
- DNA triciclo onde dois anéis de cinco elementos e um anel de
três elementos constituem a estrutura principal;
- ácidos nucleicos 1,5-anidrohexitol; e
- nucleosídeos bicíclicos [3.3.0]- e [4.3.0] com um anel adicional de cinco e de seis C-2’, C-3’ adicional conectado.
"Nucleosídeos" também incluem os nucleosídeos que tenham
açúcares de ribose substituídos (bicíclicos ou de outra forma). Os exemplos de açúcares de ribose substituídos estão descritos, por exemplo, em Freier, 1997 (Nucleic Acids Res. 25:4429-4443), que fica incorporado aqui, por referência.
Um "nucleotídeo" refere-se a um nucleosídeo que tenha um gru
po de ligação internucleosídeos ligado através do carbono-5 do anel do açúcar. Uma estrutura principal de um oligonucleotídeo refere-se a, por exemplo, em um ácido nucleico que ocorra de forma natural, a cadeia alternativa de ribose/fosfato ligada de forma covalente através do carbono-5 e carbono
3 de açúcares consecutivos, formados através da polimerização de uma população de nucleotídeos. Isso pode envolver métodos químicos sintéticos, como são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Gait1 pp. 1-22; Atkinson et al., pp. 35-81; Sproat et al., pp. 83-115; e Wu et al., pp. 135-151, in Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approaeh, M. J. Gait, ed., 1984, IRL Press, Oxford; ou Molecular Cloning: a Laboratory Manual 3rd edition. Sambrook and Russell, CSHL Press, Cold Spring Harbour, New York (todos os quais ficam incorporados aqui, por referência).
A polimerização pode ser enzimática. Os trifosfatos do nucleosídeo LNA também podem ser usados como substratos para a polimerização enzimática de compostos ou composições de ácido nucleico de acordo com algumas modalidades da invenção. Os nucleosídeos LNA podem ser incor10 porados dentro de um polímero prolongado de ácido nucleico através de uma polimerase, por exemplo, uma polimerase de DNA ou de RNA, em uma reação PCR ou ensaio de prolongamento de iniciador. Os exemplos de polimerases adequadas incluem, porém não estão limitados, a polimerase DNA Phusion™ High Fidelity (Finnzymes), ou polimerase de DNA 9°Nm™. Os mé15 todos para a incorporação enzimática de nucleosídeos LNA estão descritos, por exemplo, em Veedu RN et al 2007. Nucleic Acids Symposium 51:29-30 e Veedu RN et al. 2007, ChemBioChem 8:490-492 e Veedu et al 2007. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 26:1207-1210; cada um dos quais fica incorporado aqui, por referência.
Um grupo de ligação internucleosídeo refere-se a um grupo ca
paz de ligar dois nucleosídeos, como parte de uma estrutura principal de oligonucleotídeo. Os exemplos de grupos de ligação internucleosídeo estão descritos em Praseuth et al (Biochimica et Biophysica Acta 1489:181-206, incorporado aqui, por referência), incluindo o fosfodiéster (PO4-), fosforotioa25 to (P03s-), fosforamidato (N3’-P5’) (PO3NH) e o metilfosfonato (PO3CH3), ligações peptídicas ("PNA"), e os semelhantes.
Os termos "polímero de nucleotídeo", "oligonucleotídeo", "polímero de oligonucleotídeo", "oligonucleotídeo", "ácido nucleico", "oligômero" ou "polímero de ácido nucleico" são usados de forma intercambiável, e refe30 re-sem a polímeros que compreendam pelo menos dois nucleotídeos. O polímero de nucleotídeo pode compreender uma única espécie de monômero de DNA, monômero de RNA, ou pode compreender duas ou mais espécies de monômeros de DNA1 monômeros de RNA em qualquer combinação. Ácido nucleico pode ser de fita única ou de fita dupla, por exemplo, uma molécula de um ácido nucleico de fita dupla pode compreender dois ácidos nucleicos de fita única que se hibridizam através do pareamento de bases, de bases complementares.
Um oligonucleotídeo "polil" inclui uma maioria de nucleosídeos de inosina, nucleosídeos análogos de inosina, ou uma combinação dos mesmos, Os nucleosídeos análogos de inosina, incluem, por exemplo, 7- Deazainosina, 2’-0-metil-inosina, 7- thio-7,9-dideazainosina, formicina B, 8- 10 Azainosina, 9-deazainosina, ribosídeo alopurinol, 8-bromo-inosina, 8- cloroinosina e os semelhantes.
Um oligonucleotídeo "poliC" inclui uma maioria de nucleosídeos de citidina, nucleosídeos análogos de citidina, ou uma combinação dos mesmos. Os nucleosídeos análogos de citidina incluem, por exemplo, 5- metilcitidina, 2’-0-metil-citidina, 5-(1-propinil)citidina, e os semelhantes.
Um oligonucleotídeo "poliA" inclui uma maioria de nucleosídeos de adenosina, nucleosídeos análogos de adenosina ou uma combinação dos mesmos. Os nucleosídeos análogos de adenosina incluem, por exemplo, 2- amino-ademosina, 2’-0-metil-adenosina, 2-amino-desoxiademosina, 7- deaza-2’-adenosina, 7-deaza-2’-desoxiadenosina, e os semelhantes.
Um oligonucleotídeo "poliU" inclui uma maioria de nucleosídeos de uridina, nucleosídeos análogos de uridina, ou uma combinação dos mesmos. Os nucleosídeos análogos de uridina incluem, por exemplo, desoxiuridina (dU), citidina (C), desoxicitidina (dC), timidina (T), desoxitimidina 25 (dT), 5-flúor-uracila, 5-bromouracila, 2’-0-metil-uridina, 5-iodouracila, 5- metóxi-etóxi-metil-uracila, 5-propinil desoxiuridina, e os semelhantes.
Um "motivo CpG" ou um "elemento CpG", ou um "sítio CpG" refere-se a um motivo de nucleotídeo que compreenda um nucleosídeo de citosina ocorrendo adjacente a um nucleosídeo de guanina em um ácido nu30 cleico. Os nucleosídeos CeG são separados por um fosfato que liga os dois juntos em uma ligação nucleosídica convencional de 5’-3’. Um motivo CpG pode ser descrito em geral como XnCpGXn, na qual X é qualquer nucleosídeo e n é qualquer número a partir de 1 até 500 ou qualquer quantidade entre os mesmos, por exemplo, a partir de cerca de 1 até 300 qualquer quantidade entre os mesmos, a partir de cerca de 1 até 250 qualquer quantidade entre os mesmos, a partir de cerca de 1 até 200 qualquer quantidade entre 5 os mesmos, a partir de cerca de 1 até 150 ou qualquer quantidade entre os mesmos, a partir de 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 250, 275, 400, 425, 250, 475, 500 ou qualquer quantidade entre os mesmos. Como descrito aqui, é de preferência que um ou mais do que um dos nucleosídeos C e Gm dentro do motivo CpG 10 seja um LNA.
As fitas das moléculas de ácido nucleico de fita dupla, incluindo o dsRNA, interagem de uma maneira ordenada através de ligação com hidrogênio - também referida como pareamento de bases de "Watson-Crick''.
O pareamento de bases variante também pode ocorrer através de uma Iiga15 ção de hidrogênio não-canônica e inclui o pareamento de bases de Hoosteen. Sob algumas condições termodinâmicas, iônicas ou de pH, podem ocorrer hélices triplas, especificamente com os ácidos ribonucleicos. Essas e outras ligações com hidrogênio ou pareamentos de bases são conhecidas na técnica, e podem ser encontradas, por exemplo, em Lehninger - Princi20 pies of Biochemistry, 3rd edition (Nelson and Cox, eds. Worth Publishers, New York) incorporado aqui, por referência.
Os oligonucleotídeos Polil e poliC, ou poliA e poliU de acordo com as diversas modalidades da invenção e sob condições adequadas de temperatura, iônicas ou de pH podem formar complexos de fita dupla através 25 da ligação de hidrogênio de Watson-Crick. As condições específicas de temperatura, iônicas ou de pH adequadas para essa formação de complexos podem ser discerníveis por uma pessoa versada na técnica - exemplos de métodos, cálculos, técnicas e semelhantes para discernir essas condições podem ser encontrados, por exemplo, em Freier, (1997, Nucleic Acids Res. 30 25:4429-4443; que fica incorporado aqui, por referência). A formação de tais complexos de fita dupla pode ser referida de forma alternativa como "hibridização". As moléculas de RNA (dsRNA) de fita dupla de acordo com as diversas modalidades da invenção que contenham pelo menos um LNA, são em geral descritas pela Fórmula Il
Vn-(Sm)-Wp
I I I
Zn(Dm)-Qp
A fórmula Il representa uma molécula de RNA de fita dupla que 5 tem uma primeira fita Vn-(Sm)-Wp e uma segunda fita Zn-(Dm)-Qp, com as ligações entre os nucleosídeos complementares representados por uma única linha horizontal. A primeira fita é representada em uma direção de 5’ para 3’ (da esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita é representada em uma orientação antiparalela com relação à primeira fita (aparecendo como
de 3’-5’ quando lido da esquerda para a direita); na qual
- n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer
quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
- V, W, Z e Q são qualquer nucleosídeo, ribonucleosideo, desoxirribonucleosídeo, análogo de nucleosídeo, análogo de ribonucleosideo ou
análogo de desoxirribonucleosídeo;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou
100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina ou um nucleosídeo análogo de adenina: -D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila; e
- em que um ou mais do que um de V, S, W1 Z1 D e Q compreendem um ou mais do que um monômero de ácido nucleico fechado (LNA).
As moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA) de acordo com as
diversas modalidades da invenção que contenham pelo menos um LNA e também compreendendo R, são em geral descritas como a Fórmula I Ia;
^kl"" Vn- (Snt) — ^p- R-k2
I I
R-k3 (Dm) —Qp-Rk4
Fórmula IIa
A Fórmula Ila representa uma molécula de RNA de fita dupla tendo uma base 5’, uma base 3’, ou ambas uma base 5’ e uma base 3’, e 10 tendo uma primeira fita Rki-Vn-(Sm)-WP-Rk2 e uma segunda fita Rk3-Zn-(Dm)Qp-Rk4l com as ligações entre os nucleosídeos complementares representadas por uma única linha horizontal. A primeira fita é representada em uma direção de 5’ para 3’ (da esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita é representada em uma orientação antiparalela com relação à primeira 15 fita (aparecendo como 3’-5’ quando lida da esquerda para a direita).
- n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
- V, W, Z e Q podem ser independentemente qualquer ribonucleosideo conectado através de um grupo de ligação internucleosídeo, onde VeZ são capazes de se ligar, e W e Q são capazes de se ligar;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50,
ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14,
Λ κ. 1R 17 -IP 10 90 O-I 99 90 O/l 9C Ofi 97 9P 90 ΟΓ> 01 09 OO 04
IV/, I W , IfJ I J Iv/, Λ-V^J I, tLt— ■, V/ , ^ *— » J A-Oj W Vy , •'-'•j '-'í- 5 W 3 V-ZtTT , 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
5
- S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina ou um nucleosídeo análogo de adenina;
- D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila;
- k-ι, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número
inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
nectado através de um grupo de ligação de internucleosídeo ao nucleosídeo geminal, ou R pode estar ausente. Em algumas modalidades, por exemplo, um ribonucleosideo R 5’ da primeira fita é capaz de se ligas com um ribonucleosideo R 3’ da segunda fita; e
RNA da Fórmula II, na qual S e DS são I e C, como definidos abaixo (Fórmula Nb)
que tem uma primeira fita Vn-(Im)-Wp e uma segunda fita Zn-(Cm)-Qp, com as ligações entre os nucleosídeos complementares representadas por uma única linha horizontal. A primeira fita é representada em uma direção de 5’ para 3’ (da esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita é representada 25 em uma orientação antiparalela com relação à primeira fita (aparecendo como 3’-5’ quando lida da esquerda para a direita).
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosideo co
- em que um ou mais do que um de R, V, S, W, Z, D e Q, compreendem um ou mais do que um monômero LNA.
Ácidos Nucleicos Compreendendo polihC
A presente invenção também proporciona um composto de ds
20
Fórmula IIb
A Fórmula Ilb representa uma molécula de RNA de fita dupla quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
- V, W, Z e Q podem ser independentemente qualquer ribonucleosideo conectado através de um grupo de ligação internucleosídeo, onde VeZ são capazes de se ligar, e W e Q são capazes de se ligar;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-1 é inosina, ou qualquer nucleosídeo análogo de inosina, conectado a V, W e ao nucleotídeo geminal de inosina ou análogos de inosina através de um grupo de ligação internucleosídeo;
- C é citosina, ou qualquer nucleosídeo análogo de citosina, conectado a V, W e ao nucleotídeo geminal de inosina ou análogos de inosina através de um grupo de ligação internucleosídeo; e
- na qual um ou mais do que um de V, I, W, Z, C e Q compreen
dem um ou mais do que um monômero LNA.
As moléculas de dsRNA alternadas da presente invenção, incluem um composto da Fórmula Il na qual SeD são I e C, e também compreendendo R, como definido abaixo (Fórmula llc):
Rkl Vn (Ini) W;? Rk2
Rk3 — Zn“ (Cm) “Qp-Rk4
Fórmula IIc
A fórmula llc, representa uma molécula de RNA de fita dupla
tendo uma base pendente de 5’, ou de 3’ ou ambas uma base pendente de
5’ e 3’, e tendo uma primeira fita RK-Vn-(Im)-Wp-Rk e uma segunda fita Rk-Zn(Cm)-Qp-Rkj com ligação entre os nucleosídeos complementares representada por uma única linha horizontal.A primeira fita é representada em uma direção de 5’ para 3’ (esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita é representada em uma orientação antiparalela com relação à primeira fita (aparecendo como de 3’ a 5’ quando lida da esquerda para a direita).
- n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer
quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
- V, W, Z e Q podem ser independentemente qualquer ribonucleosideo conectado através de um grupo de ligação internucleosídeo, onde VeZ são capazes de se ligar, e W e Q são capazes de se ligar;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50,
ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
- I pode ser inosina, ou qualquer nucleosídeo análogo de inosi
na, conectado a V, W e ao nucleotídeo geminal de inosina ou análogos de inosina através de um grupo de ligação internucleosídeo;
- C pode ser citosina, ou qualquer nucleosídeo análogo de citosina, conectado a V, W e ao nucleotídeo geminal de inosina ou análogos de
inosina através de um grupo de ligação internucleosídeo;
- ki, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosideo conectado através de um grupo de ligação de internucleosídeo ao nucleosídeo
geminal, ou R pode estar ausente. Em algumas modalidades, por exemplo, um ribonucleosideo R 5’ da primeira fita é capaz de se ligar a um ribonucleosideo R 3’ da sequnda fita, e; - em que um ou mais do que um de R1 V, I, W1 C e Q, compreendem um ou mais do que um monômero LNA.
As moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA) que contenham pelo menos um LNA, incluem um composto da Fórmula II, na qual SeD são A e U1 como definido abaixo (Fórmula Md) também são descritas através da Fórmula lld:
Vn-(Am)-Wp
I I I
Zn-(Um)-Qp
Fórmula Ild
A Fórmula Ild representa uma molécula de RNA de fita dupla que tem uma primeira fita Vn-(Am)-Wp e uma segunda fita Zn-(Um)-Qp, com as 10 ligações entre os nucleosídeos complementares representadas por uma única linha horizontal. A primeira fita é representada em uma direção de 5’ para 3’ (da esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita é representada em uma orientação antiparalela com relação à primeira fita (aparecendo como 3’-5’ quando lida da esquerda para a direita).
- n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer
quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
- V, W, Z e Q podem ser independentemente qualquer ribonucleosideo conectado através de um grupo de ligação internucleosídeo, onde VeZ são capazes de se ligar, e W e Q são capazes de se ligar;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100; - A pode ser adenosina, ou qualquer nucleosídeo análogo de adenosina, conectado a V, W e ao nucleotídeo geminal de adenosina ou análogos de adenosina através de um grupo de ligação internucleosídeo;
- U pode ser uridina, ou qualquer nucleosídeo análogo de uridina conectado a V, W e ao nucleotídeo geminal de uridina ou análogos de uridina através de um grupo de ligação internucleosídeo; e
- na qual um ou mais do que um de R, V, A, W, Z e Q compreendem um ou mais do que um monômero LNA.
As moléculas de dsRNA alternadas da presente invenção, incluem um composto da Fórmula Il na qual SeD são A e U, e também compreendendo R, como definido abaixo (Fórmula lie):
Rki-Vn- (Am) -Wp-Rk2
Rk3 Zn (Um) Qp-Rk4
•P'
Fórmula IIe
A fórmula lie, representa uma molécula de RNA de fita dupla tendo uma base pendente de 5’, ou de 3’ ou ambas uma base pendente de 5’ e 3’, e tendo uma primeira fita Rki-Vn-(Im)-Wp-Rk2 e uma segunda fita Rk4- 15 Zn-(Cm)-Qp-Rk3, com ligação entre os nucleosídeos complementares representada por uma única linha horizontal. A primeira fita é representada em uma direção de 5’ para 3’ (esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita é representada em uma orientação antiparalela com relação à primeira fita (aparecendo como de 3’ a 5’ quando lida da esquerda para a direita).
- n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer
quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
- V, W, Z e Q podem ser independentemente qualquer ribonucleosideo conectado através de um grupo de ligaçao iriternucleosideo, onde VeZ são capazes de se ligar, e W e Q são capazes de se ligar;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,
35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
- A pode ser adenosina, ou qualquer nucleosídeo análogo de adenosina, conectado a V, W e ao nucleotídeo geminal de inosina ou análogos de adenosina através de um grupo de ligação internucleosídeo;
-U pode ser uridina, ou qualquer nucleosídeo análogo de uridina
conectado a V, W e ao nucleotídeo geminal de uridina ou análogos de uridina através de um grupo de ligação internucleosídeo;
- k-ι, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer nucleosídeo conecta
do através de um grupo de ligação de internucleosídeo ao nucleosídeo geminal, ou R pode estar ausente. Em algumas modalidades, por exemplo, um ribonucleosideo R 5’ da primeira fita é capaz de se ligar a um ribonucleosideo R 3’ da segunda fita, e;
- em que um ou mais do que um de R, V, A, W, Z1 U e Q, com
preendem um ou mais do que um monômero LNA.
Os compostos de acordo com as Fórmulas II, lia, llb, He, Md, Ile podem compreender uma ou mais do que uma molécula de LNA em um ou mais do que um dos R, V, W, Z, Q. Por exemplo, uma ou mais do que uma
molécula de LNA pode estar posicionada no final 5’ das fórmulas II, lia, llb, Ne, Ild ou lie, dentro de V, Q, ou de ambos VeQ, uma ou mais do que uma molécula de LNA pode estar posicionada no final 3’ das Fórmulas II, lia, llb, llc, Ild ou Ile dentro de Z, W, ou de ambos Z e W, ou uma ou mais do que uma molécula de LNA pode estar posicionada nos finais 5’ e no final 3’das
Fórmulas II, Na, llb, Ne, Md ou Ile dentro de V, W, Z, Q ou de uma combinação dos mesmos.
A presente invenção tambem proporciona um composto de acordo com Fórmulas II, Ila1 llb, He, Nd ou Ile nas quais VeW são nucleosídeos LNA (Vlna, vvlna, respectivamente), ZeQ são nucleosídeos LNA (ZLna, Qlna, respectivamente), I é inosina, C é citidina, n e p são 2, m é como definido acima, e pode ser a partir de cerca de 1 até cerca de 500 ou qualquer 5 quantidade entre os mesmos, por exemplo, m é a partir de 10 até cerca de 50 ou qualquer quantidade entre os mesmos, por exemplo, m é de cerca de 1, 2, 5, 7, 10, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 90, 100 ou qualquer quantidade entre os mesmos, por exemplo, m pode ser 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, e os grupos de 10 ligação internucleosídeos entre os mesmos são fosfodiéster. Um exemplo não Iimitativo desse composto é mostrado na Fórmula Ill
v LNA-V LNA-(Iiii)-Wlna-WlnA
Illll
Zln a-Zln A-(Cm)-QuM A-Quma
Fórmula Ill
Um exemplo não Iimitativo de um dsRNA da presente invenção pode ser como mostrados em qualquer uma das fórmulas llla, lllb, Illc ou
I Nd, nas quais G é um nucleosídeo de guanosina, C é um nucleosídeo de citidina e m é 22:
GlNA-GLna-(I22)-GlNA"GLna
Illll
ClNA-Clna-(C22)-Clna-ClNA
Fórmula Illa
Glna-Glna-(I22)-Clna-Clna
Illll
ClNA-Clna~(C22)-Glna-Glna
Fórmula Illb
Clna-Clna-(I22)“Clna-Clna
Illll
Glna-Glna-(C22)-Glna-GlNA
Fórmuía Illc Cijma-Clna-(^)-GlnA-GlnA
IIIII
GlnA-GlnA‘(C22)'ClnA-ClnA
Fórmula llld.
As moléculas de ácido nucleico de fita única ou as moléculas de RNA (ssRNA) de fita única de acordo com várias modalidades da invenção que compreendem pelo menos um LNA são em geral descritas através da fórmula IVa:
Vn-(Sm)-W1
P
Fórmula IVa.
A fórmula IVa representa uma molécula de ácido nucleico de fita
única, que tem uma configuração Vn-(Sm)-Wp, representada em uma direção de 5’ para 3’ ( da esquerda para a direita) na qual na qual:
- n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer
quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
VeW são qualquer nucleosídeo, ribonucleosideo, desoxirribonucleosídeo, análogo de nucleosídeo, análogo de ribonucleosideo ou análogo de desoxirribonucleosídeo;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina ou um nucleosídeo análogo de adenina;
- em que um ou mais do que um de V, S, e W compreendem um ou mais do que um monômero de ácido nucleico fechado (LNA).
As moléculas de ácido nucleico de fita única ou as moléculas de
RNA (ssRNA) de fita única de acordo com várias modalidades da invenção que compreendem pelo menos um LNA são em geral descritas através da fórmula IVb:
que tem uma primeira fita Qp-(Dm)-Zn, representada em uma direção de 5’
para 3’ (da esquerda para a direita)
onde:
quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-ZeQ são qualquer nucleosídeo, ribonucleosideo, desoxirribonucleosideo, análogo de nucleosídeo, análogo de ribonucleosideo ou análogo de desoxirribonucleosídeo;
- m é um número inteiro a partir de 1 até 500, ou qualquer quantidade entre os mesmos;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila ou um nucleosídeo análogo de uracila; e
- em que um ou mais do que um de Z, D e Q compreendem um ou mais do que um monômero de ácido nucleico fechado (LNA).
Em algumas modalidades da invenção, as composições podem
compreender moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVa ou a fórmula IVb, ou ambas as fórmulas IVa e a fórmula IVb, em diversas proporções molares. Por exemplo, em algumas modalidades, as moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVa ou a fórmula IVb podem
Fórmula IVb.
A fórmula IVb representa uma molécula de RNA de fita única,
10
- n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer
ser combinadas em cerca de prcporçce
irr.olares. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVa ou a fórmula IVb1 podem se hibridizar com outra molécula complementar de RNA de fita única para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de a5 cordo com a fórmula IVa podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVb em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita único de acordo 10 com a Fórmula IVa ou a Fórmula IVb podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVb podem ser combinadas em uma composição com 15 moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVb em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula IVa ou a Fórmula IVb podem se hibridizar com outra molécu20 Ia de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
As moléculas de ácido nucléico de filamento único, ou moléculas de RNA de filamento único (ssRNA) de acordo com as diversas modalidades da invenção que compreendem pelo menos um LNA, são geralmente descritas pela Fórmula IVC:
RkrVn-(Sm)-Wp-Rk2 Fórmula IVc
A fórmula IVc representa uma molécula de ácido nucléico de filamento único tendo a configuração RkrVn-(Sm)-Wp-Rk2 representada em uma direção de 5’ para 3’ (esquerda para a direita)
na qual
- n é qualquer numero inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-pé qualquer numero inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
VeW são qualquer nucleosídeo, ribonucleosideo, desoxiribonu
cleosídeo, análogo de nucleosídeo, análogo de ribonucleosideo ou análogo de desoxiribonucleosídeo;
- m pode ser qualquer número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina ou um nucleosídeo análogo de adenina;
- k-ι e k2 podem ser independentemente quaisquer números intei
ros a partir de 0 a 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre os mesmos,
- R pode ser independentemente qualquer ribonucleosideo conectado através de um grupo de ligação de internucleosídeo ao nucleosídeo geminal, ou R pode estar ausente. Em algumas modalidades, por exemplo,
um ribonucleosideo R 5’ do primeiro filamento é capaz de se ligar a um ribonucleosideo R 3’ do segundo filamento,
- em que um ou mais do que um de V, S, R e W compreendem um ou mais do que um monômero de ácido nucléico fechado (LNA).
As moléculas de ácido nucleico de fita única, ou as moléculas de
RNA (ssRNA) de fita única de acordo com as diversas modalidades da invenção que compreendam pelo menos um LNA, são descritas em geral pela Fórmula IVd:
Rk3" Qp-(Dm)" Zn "Rk4
(Fórmula IVd)
A fórmula IVd representa uma molécula de ácido nucleico de fita única que tem uma configuração Rk3- Qp-(Dm)- Zn -Rk4, representada em uma
direção 5’ - 3’ (da esquerda para a direita) na qual
-n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre/eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer
quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;
-ZeQ são qualquer nucleosídeo, ribonucleosideo, desoxirribonucleosídeo, análogo de nucleosídeo, análogo de ribonucleosideo, ou aná
logo de desoxirribonucleosídeo.
- m pode ser qualquer número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,
32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60,
70, 80, 90 ou 100;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila ou um nucleosídeo análogo de uracila;
- k3 e k4 podem ser independentemente quaisquer números inteiros a partir de 0 a 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre os mesmos,
- R pode ser independentemente qualquer ribonucleosideo co
nectado através de um grupo de ligação de internucleosídeo ao nucleosídeo geminal, ou R pode estar ausente. Em algumas modalidades, por exemplo, um ribonucleosideo R 5’ da primeira fita é capaz de se ligar a um ribonucleosideo R 3’ da segunda fita, e;
- em que um ou mais do que um de R, Z, D e Q compreendem
um ou mais do que um monômero de ácido nucleico fechado (LNA).
Em algumas modalidades da invenção, as composições podem compreender moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVc ou a fórmula IVd, ou ambas as fórmulas IVc e a fórmula IVd, em diversas
proporções molares. Por exemplo, em algumas modalidades, as moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVc ou a fórmula IVd podem ser combinadas em cerca de proporções equimolares. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVc ou a fórmula IVd1 podem se hibridizar com outra molécula complementar de RNA de fita única para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de a5 cordo com a fórmula IVc podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVd em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo 10 com a Fórmula IVc ou a Fórmula IVd podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVd podem ser combinadas em uma composição com 15 moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVc em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula IVc ou a Fórmula IVd podem se hibridizar com outra molécu20 Ia de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla. Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVc podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVd em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 25 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula IVc ou a Fórmula IVd podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Exemplos não-limitativos de ácidos nucleicos de fita única da
presente invenção podem ser como mostrados em qualquer uma das Fórmulas IVe, IVf, IVg, IVh, IVi, or IVj, (mostradas em uma orientação 5’-3’ da esquerda para a direita), na qual I é um nucleosídeo de 2’-0-metil- inosina, C é um nucleosídeo de 2’-0-metil-citosina, G é um nucleosídeo de 2’-0-metilguanosina, T é um nucleosídeo de 2’-0’metil-timidina, A é um nucleosídeo de 2’-0-metihadenosina, U é um nucleosídeo 2’-0-metil-uridina, TLna é um 5 nucleosídeo de timidina com uma ribose de LNA, GLna é um nucleosídeo de guanosina com uma LNA, Clna é um nucleosídeo de citosina com uma ribose de LNA, Alna é um nucleosídeo de adenosina com uma ribose de LNA, e m é 15:
(115>G-T lna"Glna~ A-T lna'A-T lna“Glna
fórmula IVe
(Cis)-Clna-A- Tlna-A-Tlna-C-Alna-Clna
iormula IVt
Glna-(Iis)-G-T lna-Glna-A-T lna-A-Tlna
fórmula IVg
Clna-(C15)- Clna-A-Tlna-A-U-Clna-Alna „
fórmula IVh
Tlna-Glna-(Iis)-Tlna-Tlna-A-Tlna-Alna
fórmula IVi
Alna-Clna-(Cis)-Clna-A- Tlna-A- Tlna-Clna
fórmula IVj
Em algumas modalidades da invenção, as composições podem 10 compreender moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVe ou a fórmula IVf, ou ambas as fórmulas IVe e a fórmula IVf, em diversas proporções molares. Por exemplo, em algumas modalidades, as moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVe ou a fórmula IVf podem ser combinadas em cerca de proporções equimolares. Algumas, nenhuma ou 15 todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVe ou a fórmula IVf, podem se hibridizar com outra molécula complementar de RNA de fita única para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVe podem ser combinadas em uma composição com 20 moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVf em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula IVe ou a Fórmula IVf podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de filamento único 5 de acordo com a fórmula IVf podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de filamento único de acordo com a fórmula IVe em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de filamento unido 10 de acordo com a Fórmula IVe ou a Fórmula IVf podem se hibridizar com outra molécula de RNA de filamento único complementar para a formação de moléculas de RNA de filamento duplo.
Em algumas modalidades da invenção, as composições podem compreender moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVg 15 ou a fórmula IVh, ou ambas as fórmulas IVg e a fórmula IVh, em diversas proporções molares. Por exemplo, em algumas modalidades, as moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVg ou a fórmula IVh podem ser combinadas em cerca de proporções equimolares. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVg ou 20 a fórmula IVh, podem se hibridizar com outra molécula complementar de RNA de fita única para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVg podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVh em um exces25 so molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula IVg ou a Fórmula IVh podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de 30 RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVh podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVg em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo 5 com a Fórmula IVg ou a Fórmula IVh podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em algumas modalidades da invenção, as composições podem compreender moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVi 10 ou a fórmula IVj, ou ambas as fórmulas IVi e a fórmula IVj, em diversas proporções molares. Por exemplo, em algumas modalidades, as moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVi ou a fórmula IVj podem ser combinadas em cerca de proporções equimolares. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVi ou a 15 fórmula IVj, podem se hibridizar com outra molécula complementar de RNA de fita única para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVi podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVj em um excesso 20 molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula IVi ou a Fórmula IVj podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de 25 fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVj podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula IVi em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em 30 um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula IVi ou a Fórmula IVj podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em algumas modalidades, pares de ácidos nucleicos de fita única, por exemplo das Fórmulas IVe e IVf1 ou das Fórmulas IVg e IVh, ou das Fórmulas IVi e IVj1 podem se hibridizar e/ou se (concatemerizar) sob algumas condições termodinâmicas, iônicas ou de pH.
Ácidos Nucleicos que compreendem motivos CpG
Moléculas de ácido nucleico de fita dupla de acordo com as diversas modalidades da invenção que compreendem um motivo CpG, nas quais o motivo CpG compreende pelo menos um LNS, são descritas em geral através das fórmulas de Vla a Vld:
Rki- (Sm) — (Elna) ~ (Dm) — Rk2
Rk3 ( Dm) ( FLNA) ( Sm) Rk4
Fórmula Via.
A fórmula Vla representa uma molécula de ácido nucleico de fita dupla, tendo uma primeira fita RkI-(Sm)-(ELNA)-(Dm)-Rk2 e uma segunda fita Rk3-(Dm)-(FLNA)-(Sm)-Rk4, com a ligação entre os nucleosídeos complementa15 res representada através de uma única linha horizontal. A primeira fita é representada em uma direção de 5’ para 3’ (da esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita é representada em uma orientação antiparalela com relação à primeira fita (aparecendo como de 3’ para 5’ quando lida da esquerda para a direita).
Rki- (Dm) - (Elna) - (Sm) -Rk2
Rk3 ( Sm) ( FLNA ) ( Dm) Rk4
Fórmula Vlb.
A fórmula Vlb representa uma molécula de ácido nucleico de fita
dupla, tendo uma primeira fita Rkr(Dm)-(ELNA)-(Sm)-Rk2 e uma segunda fita Rk3-(Sm)-(FLNA)-(Dm)-Rk4, com a ligação entre os nucleosídeos complementares representada através de uma única linha horizontal. A primeira fita é representada em uma direção de 5’ para 3’ (da esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita e representada em uma orientaçac antiparalela com relação à primeira fita (aparecendo como de 3’ para 5’ quando lida da esquerda para a direita).
Rkir" ( Sm) ~ ( Elna) — (Sm) —Rk2
Rk3 ( Dm) ( FLNA) ( Dm) Rk4
Formula Vlc.
A fórmula Vlc representa uma molécula de ácido nucleico de fita dupla, tendo uma primeira fita Rkr(Sm)-(ELNA)-(Sm)-Rk2 e uma segunda fita 5 Rk3-(Dm)-(FLNAMDm)-Rk4, com a ligação entre os nucleosídeos complementares representada através de uma única linha horizontal. A primeira fita é representada em uma direção de 5’ para 3’ (da esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita é representada em uma orientação antiparalela com relação à primeira fita (aparecendo como de 3’ para 5’ quando lida da 10 esquerda para a direita).
Rki" (Dm) - ( Elna ) ~ (Dm) ~ Rk2
Rk3- (Sm) - (Flna) “ (Sm) -Rk4
Fórmula Vld.
A fórmula Vld representa uma molécula de ácido nucleico de fita dupla, tendo uma primeira fita Rkr(Dm)-(ELNA)-(Dm)-Rk2 e uma segunda fita Rk3-(Sm)-(FLNA)-(Sm)-Rk4, com a ligação entre os nucleosídeos complementares representada através de uma única linha horizontal. A primeira fita é re15 presentada em uma direção de 5’ para 3’ (da esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita é representada em uma orientação antiparalela com relação à primeira fita (aparecendo como de 3’ para 5’ quando lida da esquerda para a direita).
Para cada uma das fórmulas de Vla a Vld:
-Elna é CpG, ou um motivo CpG1 onde um ou mais do que um
dos nucleosídeos C, G, que compreendem o CpG ou o motivo CpG é um LNA;
-Flna é CpG, ou um motivo CpG, onde um ou mais do que um dos nucleosídeos C, G, que compreendem o CpG ou o motivo CpG é um LNA; - m pode ser um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,
33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina, ou um nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila;
k-ι, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosideo conectado através de uma ligação de internucleosídeo.
Em algumas modalidades da invenção que não são consideradas de qualquer modo como limitativas, o motivo CpG pode compreender duas seqüências de hexâmeros de nucleosídeos LNA:
Elna = 5’ - Glna Tlna Clna Glna Tlna Tlna - 3’(SEQ ID NO: 23); e Flna = 5’ - Alna Alna ClnaGlna Alna Clna - 3’(SEQ ID NO: 24).
Os exemplos não-limitativos de tais seqüências são em geral descritos através das Fórmulas de Vle até Vlh:
Rkl- (Sra) -GLNA-rTi1NA-CijNA-GLNA-rTijNA-TijNA- (Dm) -R-k2
I I I I I I I I I I
Rk3“ (Dm) -Clna-aLNA-GLna-Clna-Alna-ALna (Sm) Rk4 fórmula Vle
A fórmula Vle representa uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que tem uma primeira fita
Vli: Rkr(Sm)-GLNA-T lna-Clna-Glna-T lna-T LNA-(Dm)-Rk2
e uma segunda fita
Vlj: Rk3-(Dm)-CLNA'ALNA-GLNA-CLNA-ALNA-ALNA-(Sm)-Rk4, com a ligação entre os nucleosídeos complementares representada através de uma única linha horizontal. A primeira fita é representada em uma direção de 5’ para 3’ (da esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita é re30 presentada em uma orientação antiparalela com relação à primeira fita (aparecendo como de 3’ para 5’ quando !ida da esquerda para a direita). Rki (Dm) ~Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna- (Sm) -Rk2
I I I I I Illll
Rk3 (:Sm) -Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Alna- (Dm) -Rk4
Fórmula Vlf
A fórmula V!f representa uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que tem uma primeira fita
Vlk: Rki-(Dm)-GLNA-T lna-Clna-Glna-T lna-T LNA-(Sm)-Rk2
e uma segunda fita VII: Rk3-(Sm)-CLNA-ALNA-GLNA-CLNA-ALNA-ALNA-(Dm)-Rk4,
com a ligação entre os nucleosídeos complementares representada através de uma única linha horizontal. A primeira fita é representada em uma direção de 5’ para 3’ (da esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita é representada em uma orientação antiparalela com relação à primeira fita (aparecendo como de 3’ para 5’ quando lida da esquerda para a direita).
Rki- (Sm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna- (Sm) -Rk2
I I I I I I I I I I
Rk3 (Dm) Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Alna- (Dm) -Rk 4
Fórmula Vlg.
A fórmula Vlg representa uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que tem uma primeira fita
Vim: Rki -(Sm )-Glna*T lna-Clna-G lna-T lna-T lna-( Sm)- Rk2
e uma segunda fita Vln: Rk3-(Dm)-CLNA-ALNA-GLNA-CLNA-ALNA-ALNA-(Dm)-Rk4,
com a ligação entre os nucleosídeos complementares representada através de uma única linha horizontal. A primeira fita é representada em uma direção de 5’ para 3’ (da esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita é representada em uma orientação antiparalela com relação à primeira fita (aparecendo como de 3’ para 5’ quando lida da esquerda para a direita).
Rki- (Dm) "Glna-Tlna-Clna_Glna~Tlna-Tlna" (Dm) -Rk2
I I I I I I I I I I
Rk3 (Sm) -Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Alna- (Sm) -Rk4 Fórmula Vlh
A fórmula Vlh representa uma molécula de ácido nucleico de fita dupla que tem uma primeira fita
Vlo: Rki-( Dm )-Glna-T lna-Clna-Glna-T lna-T lna_( Dm )-Rk2 e uma segunda fita Vip: Rk3-(Sm)-C|_NA-ALNA-G LNA-CLNA-ALNA-A[_NA-(Sm )- R|<4, com a ligação entre os nucleosídeos complementares representada através de uma única linha horizontal. A primeira fita é representada em uma direção de 5’ para 3’ (da esquerda para a direita), enquanto que a segunda fita é re5 presentada em uma orientação antiparalela com relação à primeira fita (aparecendo como de 3’ para 5’ quando lida da esquerda para a direita).
Para cada uma das fórmulas de Vle a Vlh e Vli até Vip:
- m pode ser qualquer número inteiro a partir de 1 até 500, ou de até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,
32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina, ou um nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um
nucleosídeo análogo de uracila;
k-ι, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosideo conectado através de uma ligação de internucleosídeo.
Combinações (concateméricas).
Em algumas modalidades da invenção, os ácidos nucleicos de fita dupla que compreendem pelo menos um motivo CpG, que compreenda pelo menos um nucleosídeo LNA, podem incluir nucleosídeos não pareados, 25 formando um "final pegajoso" e pode formar concatêmeros. As fórmulas de Vlla a Vllh (mostradas abaixo em uma orientação de 5’-3’, lidas da esquerda para a direita) representam ácidos nucleicos de fita única que hibridizam de acordo com a capacidade de complementação da seqüência para a formação dos ácidos nucleicos de fita dupla, por exemplo, como aqueles descritos 30 acima nas Fórmulas de Vla até Vlh. Um ácido nucleico de fita dupla que compreende um "final pegajoso" também pode ser referido como um monômero de polímero concatemérico, de acordo com algumas modalidades da invenção. As Fórmulas de Vlla até Vllh são mostradas abaixo, seguidas por exemplos de combinações de ácidos nucleicos compreendo as Fórmulas de Vlla até Vllh.
Rkl-(Sm)-(ELNA)
formula Vlla
Rk2-(Dm)-(FLNA)
fórmula Vllb
Rk3-(Dm)'(E LN a)
fórmula Vllc
Rk4-(Sm)-(FLNA)
formula Vlld
(ELNA)-(Sm)-RkI
fórmula Vlle
(FLNA)-(Dm)-Rk2
fórmula Vllf
(ELNAMDm)-Rk2
formula Vllg
(Flna)-(Stti)- Rk2
formula Vllh
Para cada uma das fórmulas de Vlla a Vllh:
-Elna é CpG1 ou um motivo CpG1 onde um ou mais do que um
dos nucleosídeos C1 G, que compreendem o CpG ou o motivo CpG é um LNA;
-Flna é CpG1 ou um motivo CpG1 onde um ou mais do que um dos nucleosídeos C, G, que compreendem o CpG ou o motivo CpG é um LNA;
- m pode ser um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10 até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,
33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina, ou um nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila; k-ι, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosideo conectado através de uma ligação de internucleosídeo.
Em algumas modalidades da invenção, as composições podem
compreender moléculas de RNA de fita única de acordo com um ou mais do que um ácido nucleico das fórmulas Vlla até Vllh, ou uma combinação de pelo menos dois ou mais do que dois ácido nucleico das fórmulas Vlla até Vllh em várias proporções molares. Por exemplo, em algumas modalidades, 10 as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vlla e Fórmula Nllb podem ser combinadas em cerca de proporções equimolares. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de acordo com a Fórmula Vllc, Fórmula VlId, Fórmula Vlle, Fórmula VlIf, Fórmula Vllg1 ou Fórmula Vllh podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar 15 para a formação de uma molécula de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlla podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vllb em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 20 em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vlla ou a Fórmula Vllb podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de a
cordo com a fórmula Vllc podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlld em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Al30 gumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vllc ou a Fórmula Vlld podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlle podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vllf em um exces5 so molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vlle ou a Fórmula Vllf podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de 10 RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vllg podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vllh em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 15 em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vllg ou a Fórmula Vllh podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de a
cordo com a fórmula Vllg podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlld em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Al25 gumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vllg ou a Fórmula Vlld podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlla podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vllf em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vlla ou a Fórmula Vllf podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de 5 RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlle podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vllb em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 10 em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vlle ou a Fórmula Vllb podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de a
cordo com a fórmula Vllc podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vllh em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Al20 gumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vllc ou a Fórmula Vllh podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Os exemplos de estão ilustrados abaixo. Outros pareamentos e 25 arranjos de ácidos nucleicos de fita dupla de acordo com as diversas modalidades da invenção se tornarão aparentes aquelas pessoas versadas na técnica. Para cada um dos pareamentos de exemplo ilustrados abaixo, a primeira fita é provida em uma orientação de 5’ para 3’, e a segunda fita é provida em uma orientação de 3’ para 5’, quando lidos da esquerda para a 30 direita, de acordo com as convenções da técnica. Fórmula VIIa
Kk3~ (om; ~ \ & LNA λ
I
(F lna) ~ (Dm) -Rk2 Fórmula VIIb
Fórmula VIIc
Rk3~ (Dm) - (E lna)
I
(F lna) - (Sm) -Rkl Fórmula VIId
(E lna) ~ (Sm) -R3k
I
Rkl - ( Dm ) - ( F LNA )
(E lna) ~ (Dm) -Rk2
I
Rkl — (Sm)- ( F LNA )
Fórmula VIIe Fórmula VIIf
Fórmula VIIg Fórmula VIIh
Pareamentos alternados para as Fórmulas de Vlla até Vllh, nas quais ki,
2, 3, 4=0,:
RiJ-(S.)-(Elm) Fórmula VIla (F lna) -(DJ -Rk2 Fórmula VIIb
Rk3“ (Dm) - (E LNA ) Fórmula VIIc
I
(F lna) ~ (Sm) -RkI Fórmula VIId
(Elns)-ISJ-Ru Fórmula VIIe Rl-(Dn)-(Ftm) Fórmula VIIf
( E LNA ) ~ ( Dm ) - Rk2
I
Rkl- (Sm) ~(F lna)
Fórmula VIIg Fórmula VIIh
Esses monômeros podem se concatenar para a formação de um polímero de ácido nucleico de duas fitas mais longo ou circular.
Em algumas modalidades da invenção, as moléculas de ácido
nucleico de fita única de acordo com as fórmulas de Vlla a Vllh podem parear suas bases para a formação de moléculas de ácido nucleico de fita dupla com final rombudo. Os arranjos de pareamento de bases a título de exemplo estão ilustrados abaixo.
Fórmula VIIg
(E lna) ~ (Dm) -Rk2
I Il
(F ^a)-(Sm)-Rkl Fórmula VIId
Fórmula VIIa
Rk3- (Sm) - (E lna)
I I I
Rki - (Dm) - (F LNA) Fórmula VIIf
Fórmula VIIe
(E lna) ~ ( Sm) -Rk3
I I I
(F LNA) - (Dm)-Rk2 Fórmula VIIb
Rk3~ (Dm) - (E lna)
I I I
Rki- (Sm) - (F lna)
Fórmula VIIc Fórmula VIIh
No exemplo acima, ki,2,3,4 é um número inteiro a partir de 1 até 10 (e não de zero), R pode ser um nucleosídeo ou um grupo de nucleosídeos como os descritos acima, nos quais pelo menos dos nucleosídeos a partir de cada uma das primeira e segunda fitas forma um pareamento de base ligado por hidrogênio.
Em algumas modalidades, pares de ácidos nucleicos de fita única, por exemplo, Fórmula Vlla e Vllb1 ou Fórmula Vllc e Vlld, ou Fórmula Vlle e Vllf, ou Fórmula Vllg e VlIh, ou Fórmula Vllg e Vlld, ou Fórmula Vlla e Vllf, ou Fórmula Vlle e VlIb, ou Fórmula Vllc e Vllh, podem se concatenar sob algumas condições termodinâmicas, iônicas ou de pH.
Em algumas modalidades da invenção, os ácidos nucleicos de 15 fita dupla que compreendem pelo menos um motivo CpG1 que compreende pelo menos um nucleosídeo LNA, podem incluir nucleosídeos não pareados, formando um "final pegajoso" e podendo formar (concatêmeros). As fórmulas de Vllla a Vlllh (mostradas abaixo em uma orientação de 5’-3’, lidas da esquerda para a direita) representam ácidos nucleicos de fita única que hibridizam de acordo com a capacidade de complementação da seqüência para a formação dos os ácidos nucleicos de fita dupla, por exemplo, como aqueles descritos acima nas Fórmulas de Vla até Vlh, como aqueles descritos acima para as Fórmulas Vlla a Vllh. Um ácido nucleico de fita dupla que 5 compreende um "final pegajoso" também pode ser referido como um monômero de polímero concatemérico, de acordo com algumas modalidades da invenção. As Fórmulas de Vllla até Vlllh são mostradas abaixo, seguidas por exemplos de combinações de ácidos nucleicos compreendo as Fórmulas de Vllla até Vlllh. nucleicos compreendo as Fórmulas de Vlla até Vllh.
10
(Sm)- Rkr (Elna)
(Dm)- Rk2- (Flna)
(Dm)- Rk3- (E LN λ)
(Sm)- Rk4- (Flna)
(ELNA)-Rkl-(Sm)
(Flna) -Rk2 (Dm)
(Elna) -Rk2-(Dm) (FLNA)-Rk2 -(Sm)
Para cada uma das fórmulas de Vllla a Vlllh:
-Elna é CpG, ou um motivo CpG1 onde um ou mais do que um dos nucleosídeos C, G, que compreendem o CpG ou o motivo CpG é um LNA;
-Flna é CpG1 ou um motivo CpG1 onde um ou mais do que um dos nucleosídeos C1 G, que compreendem o CpG ou o motivo CpG é um LNA;
- m pode ser um número inteiro a partir de 1 até 500, ou de 10
Fórmula VIIIa
Fórmula VIIIb Fórmula VIIIc
Fórmula VIIId Fórmula VIIIe
Fórmula VIIIf Fórmula VIIIg Fórmula VIIIh até 50, ou qualquer número inteiro entre os mesmos, incluindo 5, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100;
-Sé inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina, ou
um nucleosídeo análogo de adenina;
-D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila;
k-ι, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles;
-R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de uma ligação de internucleosídeo.
Em algumas modalidades da invenção, as composições podem compreender moléculas de RNA de fita única de acordo com um ou mais do 15 que um ácido nucleico das fórmulas Vllla até Vlllh, ou uma combinação de pelo menos dois ou mais do que dois ácido nucleico das fórmulas Vllla até Vlllh em várias proporções molares. Por exemplo, em algumas modalidades, as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vllla e Fórmula Vlllb podem ser combinadas em cerca de proporções equimolares. Algumas, 20 nenhuma ou todas as moléculas de RNA de acordo com a Fórmula Vlllc, Fórmula VlIId, Fórmula Vllle, Fórmula VllIf, Fórmula VlHg, ou Fórmula VIHh podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de uma molécula de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de a25 cordo com a fórmula Vllla podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlllb em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo 30 com a Fórmula Vllla ou a Fórmula Vlllb podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla. Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlllc podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vllld em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 5 ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vlllc ou a Fórmula Vllld podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de a
cordo com a fórmula Vllle podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlllf em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Al15 gumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vllle ou a Fórmula Vlllf podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de a20 cordo com a fórmula Vlllg podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlllh em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo 25 com a Fórmula Vlllg ou a Fórmula Vlllh podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlllg podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vllld em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vlllg ou a Fórmula Vllld podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de a
cordo com a fórmula Vllla podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlllf em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Al10 gumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vllla ou a Fórmula Vlllf podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de a15 cordo com a fórmula Vllle podem ser combinadas em uma composição com moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlllb em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo 20 com a Fórmula Vllle ou a Fórmula Vlllb podem se hibridizar com outra molécula de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Em outras modalidades, moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlllc podem ser combinadas em uma composição com 25 moléculas de RNA de fita única de acordo com a fórmula Vlllh em um excesso molar de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em um excesso em vezes de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes. Algumas, nenhuma ou todas as moléculas de RNA de fita única de acordo com a Fórmula Vlllc ou a Fórmula Vlllh podem se hibridizar com outra molé30 cuia de RNA de fita única complementar para a formação de moléculas de RNA de fita dupla.
Arranjos de pareamento de bases a título de exemplo são ilustrados abaixo. Outros pareamentos e arranjos de ácidos nucleicos de fita dupla de acordo com as diversas modalidades da invenção se tornarão aparentes aauelas pessoas versadas na técnica. Para cada um dos pareamentos de exempio ilustrados abaixo, a primeira fita é provida em uma orienta5 ção de 5’ para 3’, e a segunda fita é provida em uma orientação de 3’ para 5’, quando lidos da esquerda para a direita, de acordo com as convenções da técnica.
Fórmula VIIIa
( Sm) - R]c3~ (E lna)
(F lna) -Rk2_ (Dm)
Fórmula VIIIb
Fórmula VIIIc
( Dm ) - Rk3 - ( E LNA )
(F LNA) -Rkl (Sm)
Fórmula VIIId
(E lna) ~Rk3_ (Sm)
Fórmula VIIIe
(Dm)- Rki- (F lna)
Fórmula VIIIf
Fórmula VIIIg
(E lna) —Rk2— (Dm)
( Sm ) - Rkl ~ ( F lna )
Fórmula VIIIh
Pareamentos alternados para as Fórmulas de Vllla até Vlllh: /c χ T5 ,T7 x FórmulaVIIIa
t bm) - Kk 3 - { E. lna )
t-P \ T5 /n v Fórmula VIIIb
l* lna) -Rk2“ (JJm)
, Fórmula VIIIc
( Dm ) - Rk3 ~ ( E LNA )
I
(F lna) -Rki-(Sm) Fórmula VIIId
(Elna) -Rk3-(Sm) Fórmula VIIIe
I
(Dm)- Rk- (Flna) Fórmula VIIIf
( E LNA ) ~ Rk2 “ ( Dm )
I
( Sm ) - Rki - ( F LNA )
Fórmula VIIIg Fórmula VIIIh
Esses monômeros podem se concatenar para a formação de um polímero de ácido nucleico de duas fitas mais longo ou circular.
Em algumas modalidades da invenção, as moléculas de ácido nucleico de fita única de acordo com as fórmulas de Vllla a Vlllh podem parear suas bases para a formação de moléculas de ácido nucleico de fita dupla com final rombudo. Os arranjos de pareamento de bases a título de exemplo estão ilustrados abaixo.
(E lna) -Rk2- (Dm) Fórmula VIIlg
I I I
(F lna)-Rki-(Sm) Fórmula VIIId
( Sm) Rk3 ( E LNA)
I I I
( Dm ) - Rkl - ( F LNA )
Fórmula VIIIa Fórmula VIIIf
Fórmula VIIIe
(E lna) Rk3 (Sm)
/•P > T3 /n \ FórmulaVIIIb
V-P lna) -Rk2- I-Um/
Fórmula VIIIc
( Dm ) - Rk3 - ( E LNA )
Ill
(Sm) -Rki - (F lna) Fórmula VIIIh No exemplo acima, k-1,2,3,4 é um número inteiro a partir de 1 até 10 (e não de zero), R pode ser um nucleosídeo ou um grupo de nucleosídeos como os descritos acima, Em algumas modalidades nas quais k é maior do que zero, pelo menos um nucleosídeo de R de cada uma das primeiro 5 e segunda fitas formam um pareamento de base ligado por hidrogênio. Em algumas modalidades, pares de ácidos nucleicos de fita única, por exemplo, Fórmula Vllla e VlIb, ou Fórmula Vlllc e Vllld, ou Fórmula Vllle e Vlllf, ou Fórmula Vllg e Vlllh, ou Fórmula Vlllg e Vllld, ou Fórmula Vllla e Vlllf, ou Fórmula Vllle e Vlllb, ou Fórmula Vlllc e Vllh, podem se concatenar sob al10 gumas condições termodinâmicas, iônicas ou de pH.
Os adjuvantes ou as composições de adjuvantes, de acordo com as diversas modalidades da invenção compreendem uma ou mais do que uma espécie de ácido nucleico como os descritos aqui. A espécie de ácido nucleico pode ser de fita única ou de fita dupla. Uma combinação de espé15 cies de fita única e de fita dupla pode estar presente em um adjuvante ou em uma composição de adjuvante.
O adjuvante ou a composição adjuvante pode ser um agonista seletivo para TRL3 ou TRL9. Em algumas modalidades da invenção, o adjuvante ou a composição adjuvante é um agonista para ambos TRL3 e TRL9. 20 Os exemplos de ácidos nucleicos de fita dupla que compreendem ambos o TRL3 e TRL9 incluem aqueles que compreendem dois ou mais das Fórmulas Vlla-h ou Fórmulas Vllla-h, ou Fórmulas Vlla-h and Fórmulas Vllla-h.
Os ácidos nucleicos de fita dupla de acordo com algumas modalidades da invenção, por exemplo, aqueles que compreendem duas ou mais 25 das Fórmulas Vlla-h ou Fórmulas Vllla-h podem ser incluídos em um adjuvante ou em uma composição adjuvante para prover um adjuvante ou uma composição adjuvante que compreenda atividade de agonista de ambos TRL3 e TRL9. A atividade de agonista de TRL3 e TRL9 pode ser provida por uma única espécie de ácido nucleico de fita dupla.
Um ensaio IP-10 pode ser usado para avaliar a capacidade de
uma composição adjuvante para prover atividade agonista de TLR-3. Células humanas HT29 secretam IP-10 dentro de um sobrenadante de cultura como o resultado de uma estimulação com um agonista TLR-3. O IP-10 no sobrenadante da cultura pode ser quantificado, por exemplo, através de ELISA. Como outro exemplo, as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) secretam citocinas dentro do sobrenadante como o resultado da 5 estimulação com um agonista TLR-3. As citocinas secretadas, por exemplo, o interferon alfa, beta ou gama pode ser quantificado, por exemplo, através de ELISA. Como outro exemplo, a maturação de células efetoras imunes,tais como as células dendríticas, pode ser avaliada.
Os ensaios in vitro podem ser usados para a avaliação da a ca10 pacidade de uma composição adjuvante para prover atividade agonista de TLR-3. Por exemplo, a atividade da composição de ácido nucleico de fita dupla pode ser avaliada através de ensaios de proliferação de células B ou da produção de citocina por macrófagos ou por células dendríticas. Os exemplos de tais ensaios estão descritos, por exemplo, em Jiang W et al 15 2006. Methods Mol Med 127:55-70.
As composições de acordo com as diversas modalidades da invenção, incluindo as composições adjuvantes podem ser administradas em uma dose a partir de cerca de 0,1 ug/kg até cerca de 20 mg/kg de ácido nucleico (com base no peso do paciente), ou qualquer quantidade entre as 20 mesmas, por exemplo a partir de cerca de 1 ug até cerca de 2000 ug/ml de ácido nucleico ou de qualquer quantidade entre as mesmas, cerca de 10 ug até cerca de 1000 ug de ácido nucleico ou de qualquer quantidade entre as mesmas, ou cerca de 30 ug até cerca de 1000 ug de ácido nucleico ou qualquer quantidade entre as mesmas, Por exemplo, uma dose de cerca de 0,1, 25 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 50,0 60,0, 70,0, 80,0, 90,0, 100, 120, 140, 160 180, 200, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000, 20000 ug de ácido nucleico, pode ser usada.
Uma "quantidade efetiva" de um adjuvante na forma como usada aqui, refere-se a quantidade de adjuvante requerida para ter um efeito de estímulo de imunização quando co-administrada com um imunógeno em que o imunógeno demonstra atividade biológica. Um imunógeno pode estar presente em uma quantidade a partir de cerca de 0,1 uq/ml até cerca de 20 mg/ml ou em qualquer quantidade entre as mesmas, ou de cerca de 1 ug/ml até cerca de 2000 ug/ml. ou em qualquer quantidade entre as mesmas. O imunógeno pode ser a um organismo total morto, uma proteína, um peptídeo, uma proteína de fusão, um peptídeo de fusão, uma proteína recombi5 nante ou um peptídeo recombinante. O imunógeno pode ser HspE7.
Os adjuvantes de acordo com as diversas modalidades da invenção podem ser formulados com uma variedade de excipientes farmaceuticamente aceitáveis, frequentemente em um veículo aquoso tal como Água para Injeção, Iactato de Ringer, solução salina isotônica ou semelhante. Os 10 excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, sais, tampões, antioxidantes, agentes de complexação, agentes de tonicidade, crioprotetores, lioprotetores, agentes de suspensão, agentes de emulsificação, agentes antimicrobianos, conservantes, agentes de quelação, agentes de ligação, tensoativos, agentes de umidificação, veículos não-aquosos tais 15 como os óleos fixados, ou polímeros para a liberação continuada ou controlada. Ser, por exemplo, Berge et al. (1977. J. Pharm Sei. 66:1-19), ou Remington- The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition. Gennaro et al editors. Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia (ambos os quais ficam incorporados aqui, por referência)
Os excipientes também podem ser carboximetilcelulose ou um
polímero policatiônico. Oe exemplos de polímeros policatiônicos incluem, porém não estão limitados a poli-L-lisina, poliarginina, poliornitinina, ou um polipeptídio que compreenda uma maioria de aminoácidos catiônicos. Os pesos moleculares, concentrações e métodos para a preparação de tais ex25 cipientes podem ser encontrados, por exemplo, na US 4.349.538 (que fica incorporada aqui, por referência).
As composições que compreendem um adjuvante de acordo com as diversas modalidades da invenção podem ser administradas através de diversas vias de administração, incluindo, por exemplo, injeção subeutâ30 nea, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, injeção intravenosa, administração epidérmica ou transdérmica, administração em membrana mucosa, por via oral, via nasal, via retal ou via vaginal. Ver, por exemplo, Remington - The Science and Practice of Pharmacy1 21st edition. Gennaro et al editors. Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia. A formulação de veículos pode ser selecionada ou modificada de acordo com a via de administração.
As composições de acordo com as diversas modalidades da invenção podem ser providas em uma forma de unidade de dosagem, ou em uma forma a granel adequada para formulação ou diluição no ponto de uso.
As composições de acordo com as diversas modalidades da invenção podem ser administradas a um sujeito em uma dose única, ou em diversas doses administradas com o passar do tempo. Os programas de dosagem podem ser dependentes de, por exemplo, a condição, idade, gênero, peso, via de administração, formulação ou saúde geral do sujeito. Os programas de dosagem podem ser calculados a partir das medições de adsorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxidez em um sujeito, ou podem ser extrapoladas a partir de medições em um animal experimental, tal como um rato ou um camundongo, para ser usada em um sujeito humano. A otimização da dosagem e dos regimes de tratamento são discutidos, por exemplo, em Goodman & GiIman1S The Pharmacological Basis of Therapeuties 11th edition. 2006. LL Brunton, editor. McGraw-HiII, New York, ou Remington- The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition. Gennaro et al editors. Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia.
No contexto da presente invenção, os termos "tratamento", "tratando", "uso terapêutico", ou "regime de tratamento", usados aqui, podem ser usados de forma intercambiável, são destinados a englobar modalidades de administração profiláticas, paliativas e terapêuticas, das composições da 25 presente invenção, e incluem qualquer e todos os usos dos presentes compostos reivindicados que remediam um estado de doença, condição, sintoma, sinal ou distúrbio ocasionado por uma patologia com base em inflamação, câncer, doença infecciosa, resposta alérgica, resposta hiper-imune, ou outra doença ou distúrbio a ser tratado, ou que, ou que previna, prejudique, 30 retarde, ou reverta a progressão de sintomas, sinais, condições, ou distúrbios associados com os mesmos. Desse modo, qualquer prevenção, melhoria, alívio, reversão ou eliminação completa de um estado de doença, sintoma, condição, sinal ou distúrbio indesejável associados com uma patologia com base em inflamação, ou outra doença ou distúrbios que se beneficie a partir do estímulo da resposta imune do corpo, está englobada pela presente invenção. Um tratamento pode compreender a administração de uma quan5 tidade efetiva de uma composição como as descritas aqui, de forma isolada ou em combinação com um imunógeno.
As composições de acordo com as diversas modalidades da invenção podem ainda compreender um ou mais do que um imunógeno, por exemplo, um imunógeno viral ou bacteriano ("patógeno"). Todos os imunó10 genos podem ser preparados a partir de um organismo total morto ("uma vacina morta") ou podem ser preparados a partir de uma proteína, peptídeo ou outra estrutura específica do patógeno. De forma alternativa, o imunógeno pode ser uma proteína de fusão que compreenda uma proteína ou um peptídio inteiro ou parcial a partir de um patógeno fundido com outra proteí15 na ou peptídio não-patógeno, tal como "His-Tag"ou outra porção útil para a purificação do imunógeno. As proteínas e peptídios específicos podem ser produzidas com a utilização de técnicas ou métodos de biologia molecular (proteínas ou peptídios "recombinantes"). As técnicas ou métodos convencionais usados na biologia molecular recombinante estão descritos, por e20 xemplo, em Molecular Cloning: a Laboratory Manual 3rd edition. Sambrook and Russell. CSHL Press, Cold Spring Harbour, New York; Current Protocols in Molecular Biology, 2007 Ausubel et al editors. Wiley InterScience, New York; Current Protocols in Immunology, 2006 Coligan et al editors. Wiley InterScience, New York.
Os exemplos de imunógenos incluem, porém não estão limita
dos a proteínas que compreendem as proteínas de choque de calor, antígenos a partir de patógenos bacterianos, fúngicos ou virais, ou proteínas de fusão de choque de calor, por exemplo, porém não limitadas a HspE3 (WO 99/07860, US 7.157.089, ambas as quais são incorporadas aqui, por refe30 rência) que compreendem antígenos a partir de patógenos bacterianos ou virais. Os exemplos de patógenos bacterianos ou virais incluem, porém não estão limitados a, agentes causadores das seguintes doenças: papiloma, verrugas genitais, influenza, hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D, hepatite F, hepatite G, Citomegalovírus, vírus de Epstein-Barr, AIDS, Complexos relacioandos com AIDS, Varicela, Resfriado comum, Infecção por citomegalovírus, Febre do carrapato do Colorado - febre Dengue, febre he5 morrágica Ebola, Doença da mão,pé e boca, Hepatite, Herpes simplex, Herpes zoster, HPV, Influenza (Flu), Febre de Lassa, Sarampo, Febre hemorrágica de Marburg1 Mononucleose infecciosa, Cachumba, Poliomielite, Leucenfalopatia multifocal progressiva, Raiva, Rubéola, SARS, Varíola, Encefalite viral, Gastroenterite viral, Meningite viral, Pneumonia viral, Doença do Oeste 10 do Nilo, Febre amarela, Antraz, Meningite bacteriana, Botulismo, Brucelose, Campilobacteriose, Doença do Arranhão do Gato, Cólera, Difteria, Tifo epidêmico, Gonorréia, lmpetigo, Legionelose, Lepra (doença de Hansen), Leptospirose, Listeriose, Doença de Lyme, Melidose, Infecção MRSA, Nocardiose, Coqueluche (Tossee Convulsa), Praga, Pneumonia Pneumocócica, Psi15 tacose, Febre Q, Febre Marcada das Montanhas Rochosas (RMSF), Salmonelose, Escarlatina, Shigelose, Sífilis, Tétano, Tracoma, Tuberculose, Turaremia, Febre Tifoide, Tifo, infecções do trato urinário, aspergilose, basidiobolomicose, candidíase, criptocose, coccidiomicose, dermatofitose, tinha, histoplasmose, fungemia, paracoccidioidomicose, pneumonia pneumocística e 20 as semelhantes. Os imunógenos recombinantes podem ser expressos com a utilização de um sistema de expressão recombinante, por exemplo um sistema de expressão bacteriano, de levedura, baculoviral, de célula de mamífero ou de vegetal.
Em algumas modalidades da invenção, as composições de a25 cordo com as diversas modalidades da invenção podem ser usadas para o tratamento de uma doença ou de um distúrbio associado com um patógeno bacteriano ou viral. Uma doença ou distúrbio associado com um patógeno bacteriano ou viral inclui, porém não está limitado a uma infecção ativa ou latente com um patógeno bacteriano ou viral, uma resposta autoimune de30 senvolvida em conjunto com, ou em seguida a uma infecção ativa ou latente com um patógeno bacteriano ou viral, um efeito colateral desenvolvido em conjunto com, ou em seguida a uma infecção ativa ou latente com um patógeno bacteriano ou viral.
Em algumas modalidades da invenção, um imunógeno pode ser um antígeno de tumor, ou um antígeno encontrado em associação com um câncer.
5 O termo "câncer" tem muitas definições. De acordo com
American Cancer Society, câncer é um grupo de doenças caracterizado através de um crescimento incontrolado (a algumas vezes a dispersão) de células anormais. Embora quase sempre referido como uma condição única, ela realmente consiste em mais do que 200 doenças diferentes. Os cresci10 mentos cancerosos podem matar, quando essas células impedem a função normal de órgãos vitais, ou se espalha através de todo o corpo, danificando os sistemas essenciais. A composição da presente invenção pode ser usada para o tratamento de neoplasmas suscetíveis em um animal ou em um sujeito em um método que compreende a administração ao animal ou ao sujeito 15 que esteja necessitando do mesmo de uma quantidade efetiva de um composto ou de uma composição da presente invenção.
Os exemplos não-limitativos dos tipos diferentes de cânceres contra os quais os compostos da presente invenção podem ser efetivos como agentes terapêuticos incluem: carcinomas, tais como neoplasmas do 20 sistema nervoso central, incluindo o glioblastoma multiforme, astrocitoma, Timor oligodendrogliano, tumores do plexo do ependimo e da corpide, tumores pineiais, tumores neurônicos, meduloblastoma, schwanoma, meningiona e sarcoma da meninge, neoplasmas do olho, incluindo carcinoma de célula basal, carcinoma de célula escamosa, melanoma, rabdomiossarcoma e reti25 noblastoma; neoplasmas das glândulas endócrinas, incluindo neoplasmas da glândula pituitária, neoplasmas da tireoide, neoplasmas do córtex adrenal, neoplasma do sistema neuro endócrino, neoplasmas do sistema gastroenteropancreático endócrino, e neoplasmas das gônadas; neoplasmas da cabeça e do pescoço, incluindo câncer da cabeça e do pescoço, neoplas30 mas da cavidade oral, faringe e laringe, e tumores odontogênicos; neoplasmas do tórax, incluindo carcinoma das células grandes do pulmão, carcinoma das células pequenas do pulmão, carcinoma das células não-pequenas do pulmão, mesotelioma maligno, timomas e tumores primários de germe de célula; neoplasmas do canal alimentar, incluindo neoplasma do esôfago, estômago, fígado, vesícula biliar.do pâncreas exócrino, do intestino delgado, do apêndice veriforme, e do peritônio, adenocarcinoma do cólon e do reto, e 5 neoplasmas do anus; neoplasmas do trato geniturinário, incluindo carcinoma da célula renal; neoplasmas da pélvis renal, uréter, bexiga urinária, uretra, próstata, pênis, testículos,; e dos órgão de reprodução femininos, incluindo os neoplasmas da vulva e da vagina, cérvix, adenocarcinoma do corpus uterino, câncer de ovário, sarcomas ginecológicos e neoplasmas da mama; ne10 oplasmas da pelem incluindo carcinoma da célula basal, carcinoma da célula escamosa, dermatofibrossarcoma, tumor da célula de Merkel, e melanoma maligno; neoplasmas do osso e do tecido mole, incluindo o sarcoma osteogênico, histiocitoma fibroso maligno, condrossarcoma, sarcoma de Erwing, tumor neuro dérmico primitivo, e angiossarcoma; neoplasmas do sistema 15 hematopoiético, incluindo as síndromes mielodisplásicas, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfocítica aguda, HTLV-1 e 5, linfoma/leucemia da célula T, leucemia linfocítica crônica, leucemia de célula do cabelo, doença de Hodgkin, Iinfomas de doença não- Hodgkin, e leucemia da célula mastócita; neoplasmas de crianças, incluindo a leucemia Iinfo20 blástica aguda, leucemia mielocítica aguda, neuro blastoma, tumores dos ossos, rabdomiossarcoma, linfomas, tumores renais e os semelhantes.
Em algumas modalidades da invenção, um imunógeno pode ser um alergeno. Um alergeno é um agente que induz uma resposta alérgica em um sujeito, quando da exposição ao alergeno. A inflamação crônica obser25 vada em distúrbios alérgicos e asmáticos resultantes da alergenos inalados é amplamente dominada pela infiltração localizada no tecido de imunógenos esinófilos e a hiperatividade dos tecidos ao alergeno. A inflamação pode ser reduzida através do uso de corticosteroides e/ ou bronco dilatadores, no entanto esses fármacos não tratam a raiz da causa. Como discutido na WO 30 99/07860 os linfócitos T específicos para os alergenos são enriquecidos seletivamente nesse tecido hiper-reativo, e essa sensibilidade pode ser dependente de uma exposição anterior ao antígeno na infância. A seleção para células de memória específicas do tipo Th 1 versus Th 2 em uma resposta imune individual a antígenos inalados ocorre nos nódulos linfáticos regionais que drenam as rias respiratórias condutoras. Essas seleções podem ser reguladas através de uma variedade de citocinas 5 produzidas por antígenos específicos para células T CD4+ e CD8+. Esse processo de seleção de células T pode ser influenciado por agentes infecciosos: as infecções na mucosa das vias aéreas podem mobilizar e ativar os macrófagos do tecido local (alveolar), que migram para os nódulos linfáticos regionais e secretam as citoquinas inibidoras TH2 tais como a IL-12 e alfa 10 interferon. Além disso, elas podem adicionar os níveis de gama interferon no meio através da ativação das células matadoras naturais. A rede resulta na produção das CTL (as quais são predominantemente células CD8+). O gama interferon inibe a geração das células TH2 e por esse motivo a produção das citocinas IL-4 e IL-5, da maior importância para a geração de respostas 15 alérgicas humorais (IgE) e celulares (células esinófilos, basófilos e mastócitos) (Anderson, G. P. and Coyle, A. J., Trends Pharmacol. Sci., 15:324-332 (1995); Stam, W. B., van Oosterhout, A. J. and Nijkamp, F. P., Life Sci., 53:1921-1934 (1993)).
Em mamíferos as proteínas de estresse tem mostrado induzir respostas humorais bem como imune celulares. Quando um antígeno solúvel misturado com, quimicamente conjugado a, ou fundido a uma proteína de estresse é administrado a um mamífero, respostas imunes citolíticas mediadas pós células são substancialmente aumentadas. Essas respostas são largamente devidos a células T CD8+. Por esse motivo, uma comparação das respostas de CG4+ aos antígenos por elas próprias, àquelas misturadas com ou acopladas a proteínas de estresse dão o perfil previsto: antígenos solúveis misturados com ou ligados a proteínas de estresse produzem uma elevada proporção de CTLs (principalmente células T CD8+) que são uma medida do estimulo do trajeto Th1 descrito anteriormente devido a que essas CTL aparecem como o resultado da indução de células T específicas para o antígeno do tipi TH1. Essas células Th1 produzem interferon-gama, que inibe as células TH2. Por essa razão, as citocinas de Th2 IL-4 e IL-5 não ficam mais disponíveis para sustentar a produção de IgE e de esinófilos. Com a diminuição da titulação do IgE1 a estimulação antigênica direta de células mastócitos e basófilos irá declinar. Além disso, a produção diminuída de IL-5 irá levar a diminuição da produção, diferenciação e ativação dos eo5 sinófilos. Esse padrão irá ocasionar a diminuição da inflamação do tecido envolvido e resultar em menos eventos hiper-reativos (asmáticos).
Por esse motivo, a administração de uma mistura de antígenos alergênicos conhecidos (alergenos), ou proteínas de estresse ou de composição que compreendam alergenos ligados quimicamente a ou fundidos a 10 proteínas de estresse em combinação com agentes de acordo com as Fórmula II, lla-e, Fórmula III, llla-d, Fórmula IVa-j, combinações de pelo menos duas das Fórmula IVa-j, Fórmula Va até Fórmula Vc, Fórmula Vla até Fórmula Vlh, Fórmula Vlj até Fórmula Vlo, Fórmula Vlla até a Vllh, Fórmula VllIa até a Fórmula VIIIH, em diversas proporções molares pode influenciar a 15 proporção de das Th1 até Th2 em pacientes atópicos, restaurando um equilíbrio mais normal e levando a uma diminuição de uma resposta alérgica ou asmática.
Por esse motivo, a invenção proporciona um agonista TLR3, ou um agonista TLR9, ou uma composição que seja tanto um agonista TLR3 como um agonista TLR9, e um adjuvante ou uma composição adjuvante que seja tanto um agonista TLR3 como um agonista TLR9.
Em algumas modalidades da invenção, o imunógeno inclui HspE7. Métodos para a produção da proteína de fusão HspE7 estão descritos na WO 99/07860 e na US 60/803.606, ambas as quais são incorporadas aqui, por referência.
Seqüências.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 1, os resíduos G1, G2, G25 e G26 são resíduos de LNA; os resíduos 3 até 24 são ribonucleotídeos de inosina.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 2, os resíduos
C1, C2, C25 e C26 são resíduos de LNA; os resíduos C3 até C24 são ribonucleotídeos. Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 3, os resíduos T17, G18, T20, T22 e G23 são resíduos de LNA; os resíduos 1 até 15 são ribonucleotídeos de inosina; os resíduos G16, A19 e A21 podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Para a seqüência de acordo com a 5 SEQ ID NO: 3, os resíduos T17, G18, T20, T22 e G23 são resíduos de LNA; os resíduos 1 até 15 são ribonucleotídeos de inosina; os resíduos G16, A19 e A21 pode ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 4, os resíduos C16, T18, T20, A22 e C23 são resíduos de LNA; os resíduos C1 até C15 são ribonucleotídeos; os resíduos A17, A19 e C21 pode ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 5, os resíduos G1, T18, T19, T21 e T23 são resíduos de LNA; os resíduos 1 até 17 são ribonucleotídeos de inosina; os resíduos G17, A20 e a22 pode ser ribonucleo
tídeos ou desoxirribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 6, os resíduos C1, C17, T19, C22 e C23 são resíduos de LNA; os resíduos 02 até 016 são ribonucleotídeos; os resíduos A18, A20 e U21 pode ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 7, os resíduos
T1, T2, T18, T19, T21 e A22 são resíduos de LNA, os resíduos 3 até 17 são ribonucleotídeos de inosina; os resíduos A19 e A21 pode ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 8, os resíduos A1, C2, C18, T20, T22 e C23 são resíduos de LNA C3 até C17 são ribonucleotídeos; os resíduos A19 e A21 pode ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 9, os resíduos G1 e G2 são resíduos de LNA; os resíduos 2 até 17 são ribonucleotídeos de inosina e A18 até A32 são ribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 10, os resíduos C16 e C17 são resíduos de LNA; os resíduos C1 até C15 e U 18 até U32 são ribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 11, os resíduos G1 e G2 são resíduos de LNA; os resíduos 3 até 12 são ribonucleotídeos de inosina e A13 até A22 são ribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 12, os resíduos
C11 e C12 são resíduos de LNA; os resíduos U1 até U10 e C13 até C22 são ribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 13, os resíduos G1, G2, G18, T19, C20, G21, T11, T23, G39 e G40 são resíduos de LNA; os resíduos 3 até 17 e 24 até 38 são ribonucleotídeos de inosina.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 14, os resíduos C1, C2, A18, A19, C20, G21, A22, 023, C39 e C40 e C23 são resíduos de LNA; os resíduos C3 até C17 e C24 até C38 são ribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 15, os resíduos G1, G2, G18, T19, 020, G21,T22 e T23 são resíduos de LNA; os resíduos 3 até 17 são ribonucleotídeos de inosina.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 16, os resíduos A1, A2, C3, G4, A5, C6, C22 e C23 são resíduos de LNA; os resíduos C7 até C21 são ribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 17, os resíduos
G16, T17, C18, G19, T20, e T21 são resíduos de LNA; os resíduos 1 até 15 são ribonucleotídeos de inosina.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 18, os resíduos A16, A17, C18, G19, A20, e C21 são resíduos de LNA; os resíduos 01 até C15 são ribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 19, os resíduos G1, G17, T18, C19, G20, T21 e T22 são resíduos de LNA; os resíduos 2 até
16 são ribonucleotídeos de inosina.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 20, os resíduos C1, A17, A18, C19, G20, A21 e C22 são resíduos de LNA; os resíduos 02 até C16 são ribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 21, os resíduos C1, G2, G18, Τ19, C20, G21, Τ22 e Τ23 são resíduos de LNA; os resíduos 3 até 17 são ribonucleotídeos de inosina.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 22, os resíduos G1, C2, A18, A19, C20, G21, A22 e C23 são resíduos de LNA; os resíduos C31 C17 são ribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 23, todos os seis resíduos são resíduos de LNA.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 24, todos os seis resíduos são resíduos de LNA.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 25, os resíduos
C2 e C3 são resíduos de LNA; os resíduos C1 até C10 e U13 até U23 são ribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 26, os resíduos G1 e G2 são resíduos de ácido nucleico fechado; C3, G4, T5, C6, G7, T8, T9, A10, T26, G27, T28, C29, G30, T31, T32, G33 são desoxirribonucleotídeos; A11 até A25 inclusive são ribonucleotídeos.
Para a seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 27, os resíduos U1 até U15 inclusive são ribonucleotídeos; os resíduos T16, A, 17 A18, C19, G20, A21, C22, G23, C26, A27, A28, C29, G30, A31, C32 E A33 são desoxirribonucleotídeos; C24 e C25 são resíduos de ácido nucleico fechado.
O subscrito "LNA" em combinação com uma designação de uma única letra de base (A, C, G, T, U, I) indica que o nucleotídeo associado é um resíduo de ácido nucleico fechado, que compreende um 2’- 4’ como descrito acima
Exemplo 1: Preparação de oligômeros de fita dupla: GCLNA-polilC- GCLNA:
Os oligômeros de acordo com a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 foram sintetizados com a utilização de 2’-OMe-l-CE Fosforamiditas, 2’-OMeC-CE Fosforamiditas, 5-Me-Bz-C-LNA-CE fosforamiditas e dmf-G-LNA-CE fosforamiditas de acordo com as técnicas padronizadas, como pelo protocolo dos fabricantes(Glen Research, Sterling VA).
GlNa-Glna-(I22)-Glna-GlnA (SEQ ED NO:l) Clna-Clna-(Ç22)-Clna-Clna (SEQ ED NO:2).
Quantidades equimolares de cada um dos primeiro e segundo
*
oligômeros foram combinadas e permitidas se temperar para a produção do composto de dsRNA GCLNA-polilC-GCLNA, mostrado na fórmula llla:
Glna-Glna-(I22)-Glna-GlNa
Clna-Clna-(C22)-Clna-Clna
Fórmula llla.
Exemplo 2: Preparação de oligômeros de fita dupla com finais 3’ não pareados:
Os oligômeros de acordo com as SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, e SEQ ID NO: 8 podem ser sintetizados com a utilização de 5-Me-Bz-C-LNA-CE Fosforamiditas, Bz-ALNA-CE Fosforamiditas, dmf-G-LNA-CE Fosforamiditas, T-LNA-CE Fosfo
ramiditas, 2'-OMe-l-CE Fosforamiditas, 2-OMe-C-CE Fosforamiditas, 2'OMe-A-CE Fosforamiditas, 2-OMe-G-CE Fosforamiditas e 2-OMe-U-CE Fosforamiditas de acordo com as técnicas padronizadas, como pelo protoco
lo dos fabricantes(Glen Research, Sterling VA).
(Iis)-G-Tlna-Glna-A-Tlna-A-Tlna-Glna (SEQ ID NO: 3)
(C15)-Clna-A- Tuma-A-Tlna-C-Alna-Clna (SEQ ID NO: 4)
Glna-(Iis)-G-Tlna-Glna-A-Tlna-A-Tlna (SEQ ID NO: 5)
Clna-(Ci5)- Clna-A-Tlna-A-U-Clna-Alna (SEQ ID NO: 6)
Tlna-Glna-(Ii5)-Tlna-Tlna-A-Tlna-Alna (SEQ ID NO: 7)
Alna-Clna-(C15)-Clna-A- Tlna-A- Tlna-Clna (SEQ ID NO: 8)
Quantidades equimolares de cada uma das SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID N0:5 e SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 podem ser combinadas e permitidas se temperar para a produção dos compostos de ácido nucleico de fita dupla mostrados nas fórmulas Va, Vb e Vc, respectivamente:
^ ~ I-I-1-1-1 -1-I-I-I-X-X-X-GT1jNaGlna-AT Lna-A-Tij4a'
GjjNa
Il Il I I Il I I Il I Il
Clna-Alna-CTlna-ATlna-AClka-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
Fórmula Va
Glna-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-G-Tiwa-Guia-A-Tlha-A-Tlna
I I I Il Il Il Il Il Il I I
ALNA-CjjiA-U-A-TijNA-A Clha- CCC C-C-C-C C-C-C C-C-C-C C Cuja
Fórmula Vb
Tlna- GijNa- - TLna-Guja""A-Tlna-Alna
Il Il I I I I I I I I I I I Il I I
C-Tlna-A-Tlna-A- Clna- C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-Clna-Aln;,
e Fórmula Vc.
Exemplo 3: Preparação de oligômeros de fita dupla com finais 3’ não pareados:
Os oligômeros de acordo com as SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO: 12, podem ser sintetizados com a utilização de 5-Me-Bz-C-LNA-CE Fosforamiditas, Bz-A-LNA-CE Fosforamiditas, dmf-GLNA-CE Fosforamiditas, T-LNA-CE Fosforamiditas, 2'-OMe-l-CE Fosforami10 ditas, 2-OMe-C-CE Fosforamiditas, 2-OMe-A-CE Fosforamiditas, 2’-0Me-GCE Fosforamiditas e 2'-OMe-U-CE Fosforamiditas de acordo com as técnicas padronizadas, como pelo protocolo dos fabricantes(Glen Research, SterIing VA).
Glna-Glna- (I)15-(A)i5 (SEQ ID NO: 9) (C)I5-Clna-Clna-(U)is (SEQ ID NO: 10) Glna-Glna- (I)io-(A),o (SEQ ID NO: 11) (U)l0-CLNA-CmA-(C)10 (SEQ ID NO: 12) (C)I0-ClNa-Cuma-(U)I0 (SEQ ID NO: 25)
Quantidades equimolares de cada uma das SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 25 podem ser combinadas e permitidas se temperar para a produção dos compostos de ácido nucleico de fita dupla mostrados nas fórmulas Vd e Ve, respectivamente (Figura 1).
Exemplo 4: Atividade biológica in vitro de dsRNA em combinação com um imunógeno.
Uma composição compreendendo HspE7, produzida de acordo com o método da US 60/803,606 (a qual é incorporada aqui, por referência) e GCLNA-polilC-GCLNA produzido de acordo com o Exemplo 1 acima, pode ser testada com relação a atividade biológica in vitro.
O aumento da capacidade do HspE7 para a indução de linfócitos T específicos para E7, positivos para CD8 (como uma abordagem terapêutica viral a título de exemplo) pode ser determinada na presença de GCLNApolilC-GCLNA. Camundongos novos C57BI/6 podem ser injetados por via 15 subcutânea, tanto com HspE7 isolado, como com HspE7 mais GCLNApolilC-GCLNA. Depois de um intervalo de tempo, por exemplo, 5 dias, os baços podem ser removidos dos camundongos e o número de esplenócitos específicos para E7medidos Poe ELISPOT, por exemplo,através da utilização do peptídeo de ligação E749-57 específico para E7 classe I MHC 20 (RAHYNIVTF; Dalton Chemical Laboratories), ou um peptídeo de controle HBCAg93-100 (MGLKFRQL; Dalton Chemical Laboratories), como antígenos de chamada de volta.
Exemplo 4: Atividade biológica in vitro de dsRNA em combinação com um imunógeno.
Uma composição compreendendo HspE7, produzida de acordo
com o método da Publicação PCT WO 2007/137427 (a qual é incorporada aqui, por referência) e GCLNA-polilC-GCLNA produzido de acordo com o Exemplo 1 acima, pode ser testada com relação a atividade biológica in vitro.
Em um método a título de exemplo de um método terapêutico de um câncer, tumores TV-1 são primeiro estabelecidos em camundongos novos C57BI/6. Os camundongos foram injetados no flanco com 6 x 104 células de tumor TC-1. No dia 7, os camundongos que continham tumores TC-1 estabelecidos foram injetados por via subcutânea no cangote do pescoço tanto com o diluente, HspE7 isolado, ou doses graduadas de HspE7 purificado misturadas com doses diferentes de GCLNA-polilC-GCLNA. Os camundongos foram seguidos com relação ao crescimento dos tumores durante um 5 intervalo de tempo adicional, por exemplo, de 42 dias neste exemplo - os camundongos isentos de tumor durante 49 dias depois da implantação do tumor podem ser considerados como livres do tumor.
Exemplo 6: Preparação de oligômeros de fita dupla compreendendo motivos CpG.
Os oligômeros de acordo com as SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:
14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22 foram sintetizados com a utilização das 2’-OMe-l-CE Fosforamiditas, 2’-OMe-C-CE Fosforamiditas, 5-Me-Bz-C-LNA-CE fosforamiditas e dmf-G-LNA-CE fosforamidi15 tas de acordo com as técnicas padronizadas, como pelos protocolos do fabricante (Glen Research, Sterling VA).
Glna-Glna-(I) 15· Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna-(I)IS' Glna-Glna (SEQ ID NO. 13)
Clna-Clna-(C)is- Alna-Alna-Clna-Glna-Alna-Clna-(C)i5-Clna-Clna (SEQ ID NO. 14)
Glna-Glna-(I)i5- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna- (SEQ ID NO. 15)
Alna-Alna-Clna-Glna-Alna-Clna-(C)i5-Clna-Clna (SEQ ID NO: 16)
(I)i5- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna (SEQ ID NO. 17)
(C) 15- Alna-Alna-Clna-Glna-Alna-Clna (SEQ ID NO: 18)
Glna-(I)i5- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna- (SEQ ID NO: 19)
Clna-(C)i5- Alna-Alna-Clna-Glna-Alna-Clna (SEQ ID NO: 20)
Clna-Glna-(I)is- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna (SEQ ID NO. 21)
Glna-Clna-(C)i5- Alna-Alna-Clna-Glna-Alna-Clna (SEQ ID NO. 22)
Quantidades equimolares de cada uma das SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, ou SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO: 22 foram combinadas e permitidas que se temperassem para a produção do composto de dsRNA de acordo com as fórmulas Vlg, Vlh, Vli, Vlj e Vlk (Figura 2).
Exemplo 7: Preparação de oligômeros de fita dupla compreendendo motivos CpG e poliA:U.
Os oligômeros de acordo com as SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27 foram sintetizados com a utilização das 2’-OMe-A-CE Fosforamiditas, 2’OMe-U-CE Fosforamiditas, DMT-dA-fosforamiditas, DMT-dC-fosforamiditas, 10 DMT-dG-fosforamiditas, DMT-dT-fosforamiditas, 5-Me-Bz-C-LNA-CE fosforamiditas e dmf-G-LNA-CE fosforamiditas de acordo com as técnicas padrão como as dos protocolos do fabricante (Eurogentec North America).
Gln a-Gln A-dC-dG-dT-dC-dG-dT -dT-dA-(rA) 15-dT-dG-dT-dC-dG-dT-dT-dG
(SEQ ID NO: 26)
(rU)i5-dT-dA-dA-dC-dG-dA-dC-dG-CLNA-CLNA-dC-dA-dA-dC-dG-dA-dC-dA (SEQ ID NO: 27)
Quantidades equimolares de cada uma das SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27, podem ser combinadas e permitidas se temperar para a 15 produção do composto de ácido nucleico de fita dupla mostrados na Figura 3, tendo uma seção de nucleosídeos não pareados em cada uma das extremidades. Os nucleotídeos não pareados podem permitir a (concatemerização) do composto.
Todas as citações são incorporadas aqui, por referência.
Uma ou mais das modalidades correntemente de preferência
foram descritas a título de exemplo. Se tornarão aparentes às pessoas versadas na técnica que uma quantidade de variações e modificações pode ser feito sem que se afastem do âmbito da invenção como definido nas reivindicações.

Claims (15)

1. Composto da fórmula: <formula>formula see original document page 92</formula> onde: -n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; -p é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; -V, Z, Q e W é qualquer nucleosídeo, ribonucleosídeo, desoxirribonucleosídeo, análogo de nucleosídeo, análogo de ribonucleosídeo, ou análogo de desoxirribonucleosídeo. -m é qualquer número inteiro a partir de 1 até 500, ou qualquer quantidade entre eles; -Sé inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina ou um nucleosídeo análogo de adenina; -D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila; -k-ι, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles; -R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de um grupo de ligação de internucleosídeo ao nucleosídeo geminal, ou R pode estar ausente; e - em que um ou mais do que um de V, S, D, Z, Q, R e W compreende um ou mais do que um monômero de ácido nucleico fechado (LNA).
2. Composto da fórmula Rki-Vn-(Sm)-Wp-Rk2 Fórmula IVc na qual: -n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 ou 10; -pé qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 ou 10; -VeW são qualquer nucleosídeo, ribonucleosídeo, desoxirribonucleosídeo, análogo de nucleosídeo, análogo de ribonucleosídeo, ou análogo de desoxirribonucleosídeo. -m é qualquer número inteiro a partir de 1 até 500, ou qualquer quantidade entre eles; -S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina ou um nucleosídeo análogo de adenina; -ki e K2 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles; -R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de um grupo de ligação de internucleosídeo ao nucleosídeo geminal, ou R pode estar ausente; e - em que um ou mais do que um de V, S, R e W compreende um ou mais do que um monômero de ácido nucleico fechado (LNA).
3. Composto da fórmula: Rk4~ Qp-(Dm)- Zn -Rk3 Formula IVd onde: -n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 ou 10; -p é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, .8, 9 ou 10; -Z e Q são qualquer nucleosídeo, ribonucleosídeo, desoxirribonucleosídeo, análogo de nucleosídeo, análogo de ribonucleosídeo, ou análogo de desoxirribonucleosídeo. -m é qualquer número inteiro a partir de 1 até 500, ou qualquer quantidade entre eles; -D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila; -k3 e K4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles; -R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de um grupo de ligação de internucleosídeo ao nucleosídeo geminal, ou R pode estar ausente. Em algumas modalidades, por exemplo, um ribonucleosídeo R 5’ da primeira fita é capaz de se ligar a um ribonucleosídeo R 3’ da segunda fita, e; - em que um ou mais do que um de R, Z, D e Q compreendem um ou mais do que um monômero de ácido nucleico fechado (LNA).
4. Método para a fabricação de um composto da fórmula: <formula>formula see original document page 94</formula> na qual: -n é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se n = 0, p = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; -p é qualquer número inteiro a partir de 0 até 10, ou qualquer quantidade entre eles, com a condição de que se p = 0, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; -V, W, Z e Q são qualquer nucleosídeo; -m é qualquer número inteiro a partir de 1 até 500; -S é inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina, ou um nucleosídeo análogo de adenina; -D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila; k-ι, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles; -R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de um grupo de ligação de internucleosídeo ao nucleosídeo geminal, ou R pode estar ausente. Em algumas modalidades, por exemplo, um ribonucleosídeo R 5’da primeira fita é capaz de se ligar com um ribonucleosídeo 3’da segunda fita, e; - em que um ou mais do que um de V, S, W, Z, D e Q compreendem um ou mais do que um monômero LNA, o método compreendendo: misturar uma proporção molar a partir de cerca de 0,5 a 1,0 até cerca de 1,0 a 0,5 de um oligômero de acordo com o composto como definido na reivindicação 2 com um oligômero de acordo com o composto como definido na reivindicação 3, e temperando os referidos primeiros e segundos oligômeros para a formação de um composto de fita dupla.
5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, onde S é inosina e D é citosina.
6. Composição compreendendo o composto como definido na reivindicação 5, poli-L-lisina e carboximetilcelulose.
7. Composição compreendendo o composto como definido na reivindicação 5, e um imunógeno.
8. Composto das fórmulas: <formula>formula see original document page 96</formula> Fórmula VId nas quais: -Elna é CpG1 ou um motivo CpG1 onde um ou mais do que um dos nucleosídeos C, G, que compreendem o CpG ou o motivo CpG é um LNA; -Flna é CpG, ou um motivo CpG1 onde um ou mais do que um dos nucleosídeos C, G, que compreendem o CpG ou o motivo CpG é um LNA; -m é qualquer número inteiro a partir de 1 até 500, ou qualquer quantidade entre os mesmos; -Sé inosina, um nucleosídeo análogo de inosina, adenina, ou um nucleosídeo análogo de adenina; -D é citosina, um nucleosídeo análogo de citosina, uracila, ou um nucleosídeo análogo de uracila; ki, k2, k3 e k4 podem ser independentemente qualquer número inteiro a partir de 0 até 10 inclusive, ou qualquer número inteiro entre eles; -R pode ser independentemente qualquer ribonucleosídeo conectado através de uma ligação de internucleosídeo.
9. Composto de acordo com as fórmulas Via, Vlb, Vlc ou Vld de acordo com a reivindicação 8, em que S é inosina e D é citosina.
10. Composição que compreende o composto como definido na reivindicação 9 e um imunógeno.
11. Composição que compreende: um primeiro polímero de nucleotídeo de fita única compreendendo a partir de um até 500 ribonucleotídeos de inosina, citosina ou de uma combinação de inosina e de citosina e a partir de um até dez resíduos de ácido nucleico fechados; e um segundo polímero de nucleotídeo de fita única compreendendo a partir de um até 500 ribonucleotídeos de inosina, citosina ou de uma combinação de inosina e de citosina e a partir de um até dez resíduos de ácido nucleico fechados; onde o primeiro polímero de nucleotídeo de fita única e o segundo polímero de nucleotídeo de fita única estão ligados por hidrogênio para a formação de um ácido nucleico de fita dupla, o ácido nucleico de fita dupla compreendendo uma região polilC de fita dupla e uma região de fita dupla compreendendo resíduos de ácido nucleico fechados.
12. Composto que compreende: um primeiro polímero de nucleotídeo de fita única compreendendo a partir de um até 500 ribonucleotídeos de inosina, citosina ou de uma combinação de inosina e de citosina e uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 23; e um segundo polímero de nucleotídeo de fita única compreendendo a partir de um até 500 ribonucleotídeos de inosina, citosina ou de uma combinação de inosina e de citosina e uma seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 24; na qual o primeiro polímero de nucleotídeo de fita única e o segundo polímero de nucleotídeo de fita única estão ligados por hidrogênio para a formação de um ácido nucleico de fita dupla, o ácido nucleico de fita dupla compreendendo uma região polilC de fita dupla e uma região de fita dupla compreendendo resíduos de ácido nucleico fechados.
13. Composição adjuvante compreendendo o composto como definido na reivindicação 11.
14. Composição adjuvante compreendendo o composto como definido na reivindicação 12.
15. Agonista de TRL3 e TRL9 compreendendo o composto como definido na reivindicação 12.
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