BRPI0807635A2 - Métodos para detecção de doença inflamatória intestinal - Google Patents

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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a perfis de expressão gênica na patogênese da doença inflamatória intestinal. Esta descoberta encontra uso na detecção e diagnóstico da doença inflamatória intestinal. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Doença inflamatória intestinal (IBD), um distúrbio inflamatório crônico do trato gastrointestinal sofrido por aproximadamente um milhão de pacientes nos Estados Unidos, é composta de dois grupos principais de do- ença: colite ulcerativa (UC) e Doença de Crohn (CD). Em ambas as formas de IBD1 micróbios intestinais podem iniciar a doença em indivíduos geneti- camente suscetíveis. UC muitas vezes é restringente ao cólon, enquanto CD tipicamente ocorre no íleo do intestino delgado e no cólon. (Podolsky, D.K., N. Engl. J. Med. 347:417-429 (2002). Perfil de expressão gênica do tecido de pacientes com IBD forneceu alguma percepção de alvos possíveis para te- rapia e/ou diagnóstico (vide, por exemplo, Dieckgraefe, B.K. et al., Physiol. Genomics 4:1-11 (2000); Lawrance I.C. et al., Hum Mol Genet. 10:445-456
(2001); Dooley T.P. etal., Inflamm. Bowel Dis. 10:1-14 (2004); e Uthoff S.M., Int J Oncol. 19:803-810 (2001)). Investigações adicionais da desregulação gênica em pacientes experimentando doença inflamatória intestinal incluem, ou por exemplo, Lawrance, I.C. ei al., que descreveram perfis de expressão gênica distintos para vários genes em UC e CD (Lawrance, I.C. et al., Hu- man Mol. Genetics 10(5):445-456 (2001)). Uthoff, S.M.S. et al. descreveram a identificação de genes candidatos para UC e CD usando análise de micro- arranjo (Uthoff, S.M.S. et al., Int'l. J. Oncology 19:803-810 (2001). Dooley, T.P. et al. descreveram a correlação da expressão gênica em IBD com tra- tamento com fármaco para distúrbio (Dooley, T.P. et al., Inflamm. Bowel Dis. (1): 1 -14 (2004).
Há uma necessidade de identificação de marcadores biológicos adicionais da doença inflamatória intestinal para uso em diagnóstico desta doença crônica. A presente descrição preenche essa necessidade. Os conteúdos completos de todas as referências citadas aqui estão por meio deste incorporados por referência.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Descrito aqui é o achado único que membros da superfamília de genes LY6 estão regulados para cima na superfície de células epiteliais in- testinais (IEC) em modelos murinos de colite e no tecido intestinal de pacien- tes humanos experimentando IBD1 genes os quais não são expressos em IEC saudáveis. A maioria dos membros da família LY6 são glicoproteínas de superfície celular ancoradas em GPI com ampla distribuição em células de origem hematopoiética, e expressão mais limitada em células não- hematopoiéticas. Embora largamente usadas como marcadores de diferen- ciação de células imunes (Sunderkotter, C. ei ai., J. immunol. 172:4410-4417 (2004)), as funções que a família LY6 possui foram difíceis de elucidar (She- vach, E.M. and P.E. Korty, Immunol. Today 10:195-200 (1989)). Relatos mostraram que moléculas LY6 estão envolvidas em uma matriz diversa de funções incluindo ativação de célula T (Zhang, Z.X. et al., Eur. J. Immunol. 32:1584-1592 (2002) e Henderson1 S.C. et al. J. Immunol. 168:118-126
(2002), olfação (Chou, J.H. et al., Genetics 157:211-224 (2001) e adesão celular (Jaakkola, I. etal., J. Immunol. 170:1283-1290 (2003)).
No sentido mais amplo, a invenção fornece um método para de-
tecção da expressão aumentada de genes da família gênica LY6 humana em tecido intestinal no tecido intesiinai de um primeiro mamífero experimen- tando um distúrbio intestinal em relação a um mamífero de controle. Em um sentido mais direcionado, espera-se que o método seja aplicável ao diagnós- 25 tico de distúrbios relacionados o distúrbios intestinais associados com ex- pressão de LY6H, LYPD1, LYPD3 e LYPD5 humanos, distúrbios os quais incluem sem limitação, doença inflamatória intestinal (IBD), tal como colite ulcerativa (UC) e Doença de Crohn (CD). Em uma modalidade, o método da invenção é útil para detectar respondedores e não respondedores de trata- 30 mento terapêutico para IBD. Em uma modalidade, a IBD é colite ulcerativa (UC). Em uma modalidade, a IBD é Doença de Crohn (CD). Em uma moda- lidade, o tecido intestinal é tecido de cólon. Em uma modalidade, o tecido de cólon é cólon sigmoide. Em uma modalidade, a expressão gênica de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 está aumentada no tecido intestinal (tal como tecido de cólon) em uma IBD, UC ou CD de mamífero em relação ao intesti- nal normal (tal como tecido de cólon normal) de um mamífero não experi- 5 mentando IBD, CD ou UC. Em uma modalidade, o gene LY6H compreende o ácido nucleico da SEQ ID NO:1 e codifica o polipeptídeo LY6H compreen- dendo a SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, o gene LYPD1 compreende o ácido nucleico das SEQ ID NOS:3 ou 4 e codifica o polipeptídeo LYPD1 compreendendo a SEQ ID NO:5. Em uma modalidade, o gene LYPD3 com- 10 preende o ácido nucleico da SEQ ID NO:6 e codifica o polipeptídeo LYPD3 compreendendo a SEQ ID NO:7. Em uma modalidade, o gene LYPD5 com- preende o ácido nucleico das SEQ ID NOS:8 ou 9 e codifica o polipeptídeo LYPD5 compreendendo SEQ ID NO: 10.
Em uma modalidade, o método da invenção compreende a ob- tenção de uma amostra de tecido de um mamífero de teste suspeito de ex- perimentar um distúrbio intestinal, contactando o tecido com um agente de- tectável que interage com as proteínas LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 ou com o ácido nucleico que codifica LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 e determinação do nível de expressão de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 em relação a um tecido de controle. Em uma modalidade, expressão aumen- tada de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 em relação ao controle é indica- tiva de !BD no mamífero de teste. Ern uma modalidade, a expressão aumen- tada de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 no tecido intestinal de teste em relação ao tecido intestinal de controle é indicativa de UC no mamífero de teste. Em uma modalidade, a expressão aumentada de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 no teste de tecido intestinal em relação ao tecido intesti- nal de controle é indicativa do CD no mamífero de teste.
Em uma modalidade, o tecido ou as células do mamífero de con- trole e teste são do cólon.
Em uma modalidade, a expressão de LY6H, LYPD1, LYPD3
e/ou LYPD5 é determinada pela detecção da expressão gênica, tal como pela detecção de mRNA que codifica LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 em uma amostra de tecido ou células. Em uma modalidade, uma amostra de controle é uma amostra de tecido ou células do mesmo tecido ou tipo celular obtido de um mamífero conhecido que não esteja experimentando um dis- túrbio gastrointestinal, tal como IBD, UC ou CD. Em uma modalidade, uma 5 amostra de controle é um padrão universal compreendendo RNA de vários tecidos normais ou de múltiplas linhagens celulares. Na análise por microar- ranjo, tais padrões universais são úteis para monitoração e controle da vari- ação intra e interexperimental. Em uma modalidade, um padrão universal (ou RNA de Referência Universal (URR) é preparado conforme fornecido em 10 Novoradovskaya, N. et al., (2004) BMC Genomics 5:20, referência a qual é incorporada por meio deste por referência em sua totalidade. Em uma moda- lidade, para uso como um controle na análise de microarranjo de RNA de camundongo, o URR é um RNA de Referência de Camundongo Universal de Stratagene® (número de catálogo 740100, Stratagene®, La Jolla, CA). Em 15 uma modalidade, para uso como um controle na análise de microarranjo de RNA humano, o URR é um RNA de Referência Humano Universal de Stra- tagene® (número de catálogo 740000). Em uma modalidade, para uso como um controle na análise de microarranjo de RNA de rato, o URR é um RNA de Referência de Rato Universal de Stratagene® (número de catálogo 20 740200). Em uma modalidade, onde o RNA é RNA de camundongo, as li- nhagens celulares das quais o RNA total é extraído compreendem linhagens celulares derivadas de embrião, fibroblasto embrionário, rim, hepatócito de fígado, macrófago alveolar de pulmão, linfócito B, linfócito T (timo), glândula mamária, mioblasto muscular, pele e testículo. Em uma modalidade, onde o 25 RNA é RNA humano, as linhagens celulares das quais o RNA total é extraí- do compreendem linhagens celulares derivadas de adenocarcinoma de glândula mamária, hepatoblastoma de fígado, adenocarcinoma de cérvix, carcinoma embrionário ou testículo, glioblastoma cerebral, melanoma, Iipos- sarcoma, Iinfoma histiocítico (macrófago, histiócito), leucemia linfoblástica de 30 Iinfoblasto T, melanoma plasmacitoma de linfócito B. Em uma modalidade, onde o RNA é RNA de rato, as linhagens celulares das quais o RNA total é extraído compreendem linhagens celulares derivadas de leucemia basofílica sanguínea, Iinfoma de linfócito T sanguíneo, hibridoma de Iinfoblasto B san- guíneo, glioma cerebral, carcinoma de saco vitelínico embrionário, fibroblas- to normal embrionário, rim normal, hepatoma de fígado, macrófago alveolar normal de pulmão, macrófago tipo Il alveolar normal de pulmão, adenocarci- 5 noma de glândula mamária, mioblasto muscular, pele normal e tumor de cé- lula de Leydig de testículo.
Em um aspecto, a invenção refere-se a um artigo de produção compreendendo um recipiente e uma composição da matéria contida no re- cipiente, em que a composição da matéria compreende um ácido nucleico 10 que codifica LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 ou seus complementos, e/ou um anticorpo ou anticorpos anti LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5, ou fragmentos de ligação anti LY6H, LYPDI, LYPD3 e/ou LYPD5 dos mesmos, em que os ácidos nucleicos e/ou anticorpos são detectáveis. Em uma moda- lidade, a composição da matéria compreende agentes de detecção para de- 15 tectar ligação de ácido nucleico, tal como sem limitação ácidos nucleicos que codificam LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 ou seus complementos, para ácido nucleico de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 em uma amostra de tecido de um mamífero de teste suspeito de experimentar um distúrbio intes- tinal. Em uma modalidade, as composições da matéria compreendem agen- 20 tes de detecção para detectar a ligação de anticorpo a, por exemplo, LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 em uma amostra de tecido de um mamífero de teste suspeito de experimentar um disíúrbio intestinal. Em uma modalidade, o anticorpo da composição é detectavelmente marcado. Em uma modalida- de, o anticorpo da composição é detectável por um segundo anticorpo, se- 25 gundo anticorpo o qual é detectável ou marcado detectavelmente. O artigo pode compreender ainda opcionalmente um marcador afixado ao recipiente, ou inserção de pacote incluída com o recipiente, que refere-se ao uso do ácido nucleico de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 ou seu complemento e/ou o anticorpo antiLY6H, anti-LYPD1, anti-LYPD3 e/ou anti-LYPD5 ou 30 fragmento de ligação a LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 dos mesmos na detecção da expressão aumentada de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 em tecido intestinal, incluindo sem limitação, tecido de cólon. Em uma moda- lidade, o distúrbio intestinal é IBD. Em uma modalidade, o distúrbio intestinal é UC ou CD. Em uma modalidade o polipeptídeo LYPD1 e o anticorpo anti- LYPD1 são um anticorpo como descrito na Patente U.S. 7.157.558 e Patente U.S. 7.144.990, respectivamente.
5 Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de
diagnóstico da presença de um distúrbio intestinal em um mamífero, com- preendendo detecção do nível de expressão de um gene que codifica o poli- peptídeo LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 (a) em uma amostra de teste de tecido ou células obtidas do dito mamífero, e (b) em uma amostra de con- trole de células normais conhecidas de um mamífero não experimentando um distúrbio intestinal de mesma origem ou tipo de tecido, em que um nível maior de expressão do polipeptídeo LY6H, LYPDI, LYPD3 e/ou LYPD5 na amostra de teste, quando comparado à amostra de controle, é indicativo da presença de um distúrbio intestinal no mamífero a partir do qual a amostra de teste foi obtida. Em uma modalidade, o distúrbio intestinal é IBD. Em uma modalidade, a IBD é UC. Em uma modalidade, a IBD é CD. Em uma modali- dade, a detecção é pelo contato de um anticorpo ao polipeptídeo LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5, ou fragmento de ligação do anticorpo, com as amostras de teste e controle e determinando a quantidade relativa da forma- ção de complexo anticorpo-polipeptídeo. Um nível maior de formação do complexo de anticorpo-polipeptídeo na amostra de teste em relação à amos- tra de controle é indicativo de distúrbio intestinal, íai como iBD, UC ou CD, no mamífero de teste. O anticorpo da invenção é marcado detectavelmente ou, alternativamente, o anticorpo é detectado pela ligação subsequente de um segundo anticorpo que é detectável.
Ainda em uma modalidade adicional, a presente invenção refere- se a um método de diagnóstico da presença de um distúrbio intestinal em um mamífero, compreendendo (a) contatar uma amostra de teste compre- endendo tecido ou células obtidas a partir do mamífero de teste com um oli- 30 gonucleotídeo que hibridiza em alta estringência a ácido nucleico de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 (ou seu complemento) ou um anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 e (b) detecção de formação de um complexo entre o oligonucleotídeo ou anti- corpo e ácido nucleico de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 (ou seu com- plemento) ou polipeptídeo LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5, respectiva- mente, na amostra de teste, em que a formação de mais de tal complexo na 5 amostra de teste em relação a uma amostra de controle é indicativa da pre- sença de um distúrbio intestinal (tal como IBD, UC ou CD) no mamífero de teste. Em uma modalidade, o distúrbio intestinal é IBD. Em uma modalidade, o distúrbio é UC. Em uma modalidade, o distúrbio é CD. Em uma modalida- de, o tecido dos mamíferos de teste e controle é tecido de cólon. Opcional- 10 mente, o anticorpo de ligação ao polipeptídeo LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 ou oligonucleotídeo de hibridização gênica a LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 empregado pelo método da invenção é aetecíávei, marcado detectavelmente, ligado a um suporte sólido, ou similares, e/ou amostra de teste de tecido ou células é obtida a partir de um indivíduo suspeito de expe- 15 rimentar um distúrbio intestinal, em que o distúrbio é IBD, tal como sem limi- tação, UC ou CD.
Ainda em uma modalidade adicional, a presente invenção refere- se ao uso de (a) um polipeptídeo LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5, (b) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou 20 LYPD5 ou um vetor ou célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico de (a), (c) um anticorpo polipeptídico antiLY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5, ou (d) um oligopepíídeo de ligação a LY6H, LYPDI, LYPD3 e/ou LYPD5, na preparação de um medicamento útil para a detecção diagnostica de um dis- túrbio intestinal, incluindo sem limitação, IBD, CD ou UC, em um tecido intes- 25 tinal de um mamífero, incluindo sem limitação o tecido de cólon.
Em um aspecto, a invenção compreende um método de detec- ção de uma resposta a fármaco terapêutica em um mamífero tratado com um agente terapêutico para IBD, em que o método compreende determina- ção da expressão de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 no tecido gastroin- 30 testinal de um mamífero de teste em relação a um tecido gastrointestinal controle de um mamífero de controle, onde um nível maior de expressão de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 em um tecido de teste em relação a um tecido de controle indica um estado de doença ou continuação do estado de doença. Uma diferença na expressão de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 no tecido de teste que não é significativamente maior do que os níveis de expressão de controle normais ou estão em uma faixa de níveis de expres- 5 são normais de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 em uma população de mamíferos indica melhora ou resolução da distúrbio intestinal, em que me- lhora ou resolução as quais podem ser atribuídas ao agente terapêutico. Em uma modalidade, uma resposta terapêutica é determinada quando os níveis de expressão de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 em tecidos ou células 10 gastrointestinais ou do cólon do mamífero tratado com um agente terapêuti- co são diferentes (expressão é mais similar ao controle normal, isto é, níveis de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 estão menores do que eram os níveis de expressão de LY6H, LYPD1, LYPD3 e/ou LYPD5 no mamífero antes do tratamento.
Modalidades ainda adicionais da presente invenção serão evi-
dentes para o versado em uma leitura do presente pedido de patente.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
As Figuras 1A e 1B representam a seqüência de ácido nucleico (SEQ ID NO:1) de codificação do polipeptídeo LY6H humano e a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo LY6H humano (SEQ ID NO:2).
As Figuras 2A e 2B representam seqüências de ácidos nucleicos (SEQ ID NOS:3 e 4) de codificação do polipeptídeo LYPDI humano e a se- qüência de aminoácidos do polipeptídeo LYPD1 humano mostrado na Figura 2C (SEQ ID NO:5).
As Figuras 3A e 3B representam a seqüência de ácido nucleico
(SEQ ID NO:6) de codificação do polipeptídeo LYPD3 humano e a seqüên- cia de aminoácidos do polipeptídeo LYPD3 humano (SEQ ID NO:7).
As Figuras 4A e 4B representam seqüências de ácido nucleico (SEQ ID NOS:8 e 9) de codificação do polipeptídeo LYPD5 humano e a se- quência de aminoácidos do polipeptídeo LYPD5 humano mostrado na Figura 4C (SEQ ID N0:10).
As Figuras 5A e 5B representam a seqüência de ácido nucleico (SEQ ID N0:11) de codificação do polipeptídeo LY6D humano e a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo LY6D humano (SEQ ID NO:12).
As Figuras 6A e 6B representam a seqüência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 13) de codificação do polipeptídeo LY6E humano e a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo LY6E humano (SEQ ID NO:14).
As Figuras 7A e 7B representam a seqüência de ácido nucleico (SEQ ID NO:15) de codificação do polipeptídeo LYPD2 humano e a seqüên- cia de aminoácidos do polipeptídeo LYPD2 humano (SEQ ID NO:16).
As Figuras 8A a 8H representam seqüências de moléculas GLG- 10 1 (ESL-1): (A-B) Número de Acesso U64791, seqüência de ácido nucleico (SEQ ID NO:17) de codificação do polipeptídeo GLG-1 humano (ESL-1) (SEQ ID NO:18); (C-D) Número de Acesso NM_012201, seqüência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 19) de codificação do polipeptídeo GLG-1 humano (ESL-1) (SEQ ID N0:20); (E-F) Número de Acesso AK172806, seqüência de 15 ácido nucleico (SEQ ID NO:21) de codificação do polipeptídeo GLG-1 huma- no (ESL-1) (SEQ ID NO:22); e Número de Acesso AK131501, seqüência de ácido nucleico (SEQ ID NO:23) de codificação do polipeptídeo GLG-1 huma- no (ESL-1) (SEQ ID NO:24).
As Figuras 9A e 9B representam a seqüência de ácido nucleico (SEQ ID NO:25) de codificação do polipeptídeo LY6A murino e a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo LY6A murino (SEQ ID NO:26).
As Figuras 10A e 10B representam a seqüência de ácido nuclei- co (SEQ ID NO:27) de codificação do polipeptídeo LY6C murino e a seqüên- cia de aminoácidos do polipeptídeo LY6C murino (SEQ ID NO:28).
As Figuras 11A e 11B representam a seqüência de ácido nuclei-
co (SEQ ID NO:29) de codificação do polipeptídeo murino LY6D e a seqüên- cia de aminoácidos do polipeptídeo LY6D murino (SEQ ID N0:30).
As Figuras 12A e 12B representam a seqüência de ácido nuclei- co (SEQ ID NO:31) de codificação do polipeptídeo LY6E murino e a sequên- cia de aminoácidos do polipeptídeo LY6E murino (SEQ ID NO:32).
As Figuras 13A e 13B representam a seqüência de ácido nuclei- co (SEQ ID NO:33) de codificação do polipeptídeo LY6F murino e a sequên- cia de aminoácidos do polipeptídeo LY6F murino (SEQ ID NO:34).
As Figuras 14A e 14B representam a seqüência de ácido nuclei- co (SEQ ID NO:35) de codificação do polipeptídeo LY6I murino e a seqüên- cia de aminoácidos do polipeptídeo LY6I murino (SEQ ID NO:36).
As Figuras 15A e 15B representam a seqüência de ácido nuclei-
co (SEQ ID NO:37) de codificação do polipeptídeo LY6K murino e a seqüên- cia de aminoácidos do polipeptídeo LY6K murino (SEQ ID NO:38).
As Figuras 16A e 16B representam a seqüência de ácido nuclei- co (SEQ ID NO:45) de codificação do polipeptídeo LYPD3 murino e a se- quência de aminoácidos do polipeptídeo LYPD3 murino (SEQ ID NO:46).
As Figuras 17A e 17B representam a seqüência de ácido nuclei- co (SEQ ID NO:47) de codificação do polipeptídeo LY6H murino e a seqüên- cia de aminoácidos do polipeptídeo LY6H murino (SEQ ID NO:48).
As Figuras 18A e 18B representam a seqüência de ácido nuclei- co (SEQ ID NO:49) de codificação do polipeptídeo LYPD1 murino e a se- qüência de aminoácidos do polipeptídeo LYPD1 murino (SEQ ID N0:50).
As Figuras 19A e 19B representam a seqüência de ácido nuclei- co (SEQ ID NO:51) de codificação do polipeptídeo LYPD2 murino e a se- qüência de aminoácidos do polipeptídeo LYPD2 murino (SEQ ID NO:52).
As Figuras 20A e 20B representam a seqüência de ácido nuclei-
co (SEQ ID NO:53) de codificação do polipeptídeo LY6g5c murino e a se- qüência de aminoácidos do polipeptídeo LY6g5c murino (SEQ iD NO:54).
As Figuras 21A e 21B representam a seqüência de ácido nuclei- co (SEQ ID NO:55) de codificação do polipeptídeo LY6g6c murino e a se- quência de aminoácidos do polipeptídeo LY6g6c murino (SEQ ID NO:56).
As Figuras 22A e 22B representam a seqüência de ácido nuclei- co (SEQ ID NO:57) de codificação do polipeptídeo SLURP2/LYNX1 murino e a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo SLURP2/LYNX1 murino (SEQ ID NO:58).
A Figura 23 mostra que os membros da família LY6 são regula-
dos para cima em IEC em modelos murinos de colite. IEC em ambos IL10_/‘ (Figura 23A) e modelo de colite de transferência de CD45RBH| (Figura 23B) foram isolados por LCM e o RNA foi purificado. Análise por microarranjo foi realizada e analisada como descrito nos Exemplos. Os números represen- tam a média da modificação de vezes comparada a um RNA-padrão univer- sal de camundongos colíticos sobre camundongos saudáveis. Os números 5 abaixo do mapa de calor indicam o escore de inflamação do camundongo individual.
As Figuras 24A a 24D mostram que a expressão superficial de moléculas LY6 é regulada para cima em IEC no modelo IL10-/- de colite. Camundongos de tipo selvagem (Figura 24A) ou IL10-/- (Figura 24B) foram 10 corados para expressão superficial de LY6A (verde, com contracoração por DAPI). Similarmente, camundongos de tipo selvagem (Figura 24C) ou IL10-/- (Figura 24D) foram corados para expressão superficial de LY6C.
As Figuras 25A a 25I mostram que a expressão superficial de LY6A e LY6C são reguladas para cima em resposta a citoquinas inflamató- rias, particularmente IFNj. Células YAMC foram tratadas com a citoquina indicada por 15 horas e coradas para a expressão superficial de LY6C (Figu- ra 25A) e LY6A (Figura 25B). Células YAMC foram cultivadas por 15 horas na presença de doses crescentes de IFNj e analisadas por citometria de flu- xo para expressão de LY6C (Figura 25C) e LY6A (Figura 25D). Células YAMC estimuladas por IFNj foram coletadas em vários pontos de tempo, como indicado, e analisadas por citometria de fluxo para expressão de LY6C (Figura 25E) e LY6A (Figura 25F). Expressão de IL-22 reguiada para cima em ambos LY6C (Figura 25G) e LY6A (Figura 25H). Os níveis de ambos de LY6A e LY6C foram regulados para cima na linhagem murino de IEC, CMT93 em resposta ao tratamento com IFNj (Figura 25I).
Figuras 26A a 26E A depleção de jangada lipídica resulta em uma inibição da produção de quimiocina mediada por LY6C. Células YAMC com colesterol depletado (barras escuras) ou não depletado (barras aber- tas)foram incubadas com anti-KLH ou antiLY6C ligados à placa como indi- 30 cado por 15 horas. O RNA foi coletado e os níveis de expressão de CXCL2, CXCL5 e CCL7 foram determinados (Figuras 26A a 26C). Níveis superficiais de LY6A (Fiqura 26D) e LY6C (Fiqura 26E) foram reduzidos em resposta à depleção de colesterol.
As Figuras 27A a 27D mostram que a ligação cruzada de LY6C, mas não LY6A, induz regulação para cima da expressão superficial de LY6A e LY6C. Células YAMC foram incubadas por 24 horas em placas recobertas 5 com o controle anti-KLH, antiLY6A ou antiLY6C e analisadas por citometria de fluxo para expressão de LY6C (Figura 27A) ou LY6A (Figura 27B). Célu- las foram pré-tratadas por 12 horas com 100 U/ml de IFNj e do mesmo modo plaqueadas em placas recobertas com anticorpo e analisadas para expres- são de LY6C (Figura 27C) ou LY6A (Figura 27D).
As Figuras 28A a 28C mostram que a ligação cruzada a LY6C,
mas não LY6A, induz secreção de quimiocinas. Figura 28A: Células YAMC foram pré-incubadas ou não, como indicado, com 100 U/ml de iFNj por 15 horas e cultivadas em placas recobertas de 10 μg/ml de antiLY6A (barras pretas) ou antiLY6C (barras hachuradas) ou controle anti-KLH (barras aber- 15 tas). O RNA foi isolado em 24 (esquerda), 48 (centro) e 72 (direita) horas e analisado para expressão de CXCL5 ou CCL7 (A). Os dados indicam que a média ± DP da modificação de vezes (como determinado pelo método 2'AACt) comparada às células com ligação cruzada isotípica não-tratadas. Figura 28B: Sobrenadantes foram coletados em 48 horas nas células com ligação 20 cruzada, como acima, com 1, 5 ou 10 pg/ml (como indicado) de anticorpo e a secreção de CXCL5 no sobrenadante foi determinada por ELISA. *<0,05. Figura 28C: Os níveis de ambos CXCL5 e CXCL2 em resposta à ligação cruzada a LY6C foram diminuídos quando os níveis de expressão de LY6C foram reduzidos com siRNA.
As Figuras 29A a 29B mostram que IEC na colite possuem um
padrão de expressão gênica de quimiocina similar. IEC em ambos IL10-/- (Figura 29A) e no modelo de colite de transferência de CD45RBH| (Figura 29B) foram isolados por LCM e o RNA foi purificado. A análise por microar- ranjo foi realizada e analisada como descrito nos Exemplos. Os números 30 representam a média da modificação de vezes comparada ao RNA-padrão universal de camundongos colíticos sobre camundongos saudáveis. Os nú- meros abaixo do mapa de calor indicam o escore de inflamação do camun- dongo individual.
As Figuras 30A a 30C mostram que a expressão de genes da família LY6 humana é regulada para cima em células do cólon tratadas com citoquinas. Células Colo-205 humanas foram tratadas com as citoquinas in- 5 dicadas, ou combinações de citoquinas, por 18 ou 24 horas. O aumento de vezes na expressão do LY6H humano (Figura 30A), LYPD3 humano (Figura 30B) e LYPD5 humano (Figura 30C) é mostrado em relação ao controle β- actina humana.
As Figuras 31A a 31B mostram que os pacientes com Doença 10 de Crohn tiveram níveis elevados de LYPD1 (Figura 31 A) e LYPD5 (Figura 31B) no cólon. Amostras de tecido a partir de pacientes humanos com IBD foram obtidas e a expressão gênica LYPDI e LYPD5 foi determinada. Au- mentos estatisticamente significantes na expressão de LYPD1 e LYPD5 fo- ram observados no tecido inflamado de pacientes com CD. Um aumento 15 estatisticamente significante na expressão de LYPD5 também foi observado no tecido inflamado de pacientes com UC. Os valores do eixo Y refletem a expressão gênica em relação a um RNA-padrão universal.
As Figuras 32A e 32B mostram células COS não-transfectadas (A), e (B) células COS transfectadas com o polipeptídeo GLG-1 (ESL-1) e marcadas com a proteína LYPD5-Fc.
A Figura 33A representa a estrutura de GLG-1 ou ESL-1 e vários fragmentos adequados para caracterização da ligação de LYPD5 e a Figura 33B mostra os resultados de um estudo de coimunoprecipitação que carac- teriza a ligação de LYPD5 e um Iigante de LYPD5.
A Figura 34A representa a estrutura de GLG-1 ou ESL-1 e vários
fragmentos adequados para caracterização da ligação de LYPD5 e a Figura 34B mostra os resultados de um estudo de coimunoprecipitação que carac- teriza a ligação de LYPD5 e um Iigante de LYPD5.
A Figura 35A representa a estrutura de GLG-1 ou ESL-1 e vários fragmentos adequados para caracterização da ligação de LYPD5 e a Figura 35B mostra os resultados de um estudo de coimunoprecipitação que carac- teriza a liqação de LYPD5 e um Iiqante de LYPD5. As Figuras 36A e 36B representam a seqüência de ácido nuclei- co (SEQ ID NO: 68) de codificação da integrina humana, beta 7, e a seqüên- cia de aminoácidos da integrina humana, polipeptídeo beta 7 (SEQ ID NO: 69).
5 DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
"Doença inflamatória intestinal" ou "IBD" é usada intercambia- velmente aqui para referir-se a doenças do intestino que causam a inflama- ção e/ou ulceração e inclui sem limitação doença de Crohn e colite ulcerati- va.
"Doença de Crohn (CD)" ou "colite ulcerativa (UC)" são doenças inflamatórias intestinais crônicas de etiologia desconhecida. Doença de Crohn, diferentemente da colite ulcerativa, pode afetar qualquer parte do intestino. A mais proeminente característica da doença de Crohn é o espes- 15 sarnento granular, edematoso avermelhado-purpúreo da parede intestinal. Com o desenvolvimento da inflamação, estes granulomas muitas vezes per- dem suas bordas circunscritas e integram-se com o tecido circundante. Diar- réia e obstrução de intestino são as características clínicas predominantes. Conforme a colite ulcerativa, o curso da doença de Crohn pode ser contínuo 20 ou com recaída, brando ou severo, mas diferentemente da colite ulcerativa, a doença de Crohn não é curável pela ressecção do segmento envolvido do intestino. A maioria dos pacientos com doença de Cronn necessitam de ci- rurgia em algum momento, mas a recaída subsequente é comum e o trata- mento médico contínuo é usual.
A doença de Crohn pode envolver qualquer parte do trato ali-
mentar a partir da boca ao ânus, embora tipicamente apareça nas regiões ileocólica, do intestino delgado e ou cólon-anorretal. Histopatologicamente, a doença manifesta por granulomatomas descontínuos, abcessos de cripta, fissuras e úlceras aftosas. A infiltração inflamatória é mista, composta de 30 linfócitos (ambas as células T e B), células plasmáticas, macrófagos e neu- trófilos. Há um aumento desproporcional nas células plasmáticas secretoras de IqM e IqG, macrófagos e neutrófilos. Fármacos anti-inflamatórios sulfassalazina e ácido 5- aminossalicílico (5-ASA) são úteis para tratamento da doença de Crohn co- lônica suavemente ativa e são comumente prescritos para manter a remis- são da doença. Metroidazol e ciprofloxacina são similares em eficácia à sul- 5 fassalazina e parecem ser particularmente úteis para tratamento da doença perianal. Em casos mais severos, corticosteroides são eficazes no tratamen- to de exacerbações ativas e podem até manter a remissão. Azatioprina e 6- mercaptopurina também mostraram sucesso em pacientes que necessitam de administração crônica de corticoesteroides. É também possível que estes 10 fármacos possam desempenhar um papel na profilaxia a longo prazo. Infe- lizmente, pode haver um atraso muito longo (até seis meses) antes do início da ação em alguns pacientes.
Fármacos antidiarreicos também podem fornecer alívio sintomá- tico em alguns pacientes. Terapia nutritiva ou dieta elementar podem melho- 15 rar a condição nutricional dos pacientes e induzir melhora sintomática da doença aguda, mas não induz remissões clínicas sustentadas. Antibióticos são usados no tratamento de crescimento bacteriano excessivo secundário no intestino delgado e no tratamento de complicações piogênicas.
"Colite ulcerativa (UC)" aflige o intestino grosso. O curso da do- 20 ença pode ser contínuo ou com recaída, brando ou severo. A lesão inicial é uma infiltração inflamatória com formação de abcesso na base das criptas de Lieberkühn. A coalescência destas criptas distendidas e rompidas tende a separar a mucosa sobrejacente do seu aporte sanguíneo, levando à ulcera- ção. Sintomas da doença incluem espasmos, dor abdominal inferior, hemor- 25 ragia retal, e diarréias freqüentes, consistindo principalmente em sangue, pus e muco com partículas fecais escassas. Uma colectomia total pode ser necessária para a colite ulcerativa aguda, severa ou crônica, não remitente.
As características clínicas de UC são altamente variáveis, e o início pode ser insidioso ou abrupto, e pode incluir diarréia, tenesmo e he- morragia retal recorrente. Com o envolvimento fulminante do cólon inteiro, megacólon tóxico, uma emergência com risco de morte, pode ocorrer. Mani- festações extraintestinais incluem artrite, pioderma gangrenoso, uveíte e eri- tema nodoso.
O tratamento para UC inclui sulfassalazina e fármacos relacio- nados contendo salicilato para casos brandos e fármacos corticosteroides em casos severos. Administração tópica de salicilatos ou de corticosteroides 5 é algumas vezes eficaz, particularmente quando a doença está limitada ao intestino distai, e está associada com efeitos colaterais reduzidos compara- dos com o uso sistêmico. Medidas de suporte, tais como administração de ferro e agentes antidiarreicos são algumas vezes indicadas. Azatioprina, 6- mercaptopurina e metotrexato são algumas vezes também prescritos para 10 uso em casos refratários dependentes de corticosteroides.
Como usado aqui, "membro da família gênica LY6" ou "super- membro da família gênica LY6" é usado intercambiavelmento aqui para refe- rir-se a um gene que tem homologia a membros da família gênica LY6, a maioria daqueles membros da família gênica são glicoproteínas de superfí- 15 cie celular ancoradas a GPI com ampla distribuição em células de origem hematopoiética e expressão mais limitada em células não-hematopoiéticas. Membros desta família gênica são usados como marcadores de diferencia- ção de células imunes (Sunderkotter, C. et al., J. Immunol. 172:4410-4417 (2004)). Genes da família LY6 foram examinados (Shevach, E.M. and P.E. 20 Korty, Immunol. Today 10:195-200 (1989)) e funções incluem ativação de célula T (Zhang, Z.X. et al., Eur. J. Immunol. 32:1584-1592 (2002) e Hender- son, S.C. et al., J. Immunol. 168:118-126 (2002), olfação (Chou, J.H. ei ai., Genetics 157:211-224 (2001) e adesão celular (Jaakkola, I. et al., J. Immu- nol. 170:1283-1290 (2003)). Membros da família gênica LY6 incluem sem 25 limitação, membros da família gênica LY6 de mamífero, tais como os genes de família LY6 de camundongo ou de ser humano. Como usado aqui, "gene LY6" refere-se a um membro da família gênica LY6 e "polipeptídeo LY6" re- fere-se ao polipeptídeo codificado por um gene LY6. Membros da família gênica LY6 murino incluem, sem limitação, LY6A (NM_010738, ácido nuclei- 30 co da SEQ ID NO:25 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO:26), LY6C (NM_010741, ácido nucleico da SEQ ID NO:27 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO:28), LY6D (NM_003695, ácido nucleico da SEQ ID NO:29 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID N0:30), LY6E (NM_002346, ácido nucleico da SEQ ID NO:31 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO:32), LY6F (NM_008530, ácido nucleico da SEQ ID NO:33 que codifica o polipep- tídeo da SEQ ID NO:34), LY6I (NM_020498, ácido nucleico da SEQ ID 5 NO:35 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO:36) e LY6K (NM_017527, ácido nucleico da SEQ ID NO:37 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO:38). Os membros da família gênica LY6 humana incluem, sem limitação, LY6H (NM_002347, ácido nucleico da SEQ ID NO:1 que codifica o polipeptí- deo da SEQ ID NO:2), LYPD1 (NM_144586, ácido nucleico das SEQ ID 10 NOS:3 ou 4 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO:5), LYPD3 (NM_014400, ácido nucleico da SEQ ID NO:6 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO:7), LYPD5 (NM_182573, ácido nucleico das SEQ ID NOS:8 ou 9 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID N0:10), LY6D (NM_003695, ácido nucleico da SEQ ID NO:11 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO:12), 15 LY6E (NMNM_002346, ácido nucleico da SEQ ID NO:13 que codifica o poli- peptídeo da SEQ ID NO:14), LYPD2 (NM_205545, ácido nucleico da SEQ ID NO:15 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO:16). Em modalidades, o polinucleotídeo de cada membro da família gênica LY6 descrito aqui com- preende pelo menos 15, pelo menos 25, pelo menos, pelo menos 50, pelo 20 menos 100, pelo menos 250, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, ou pelo menos 2040 nucleotídeos contíguos das SEQ !D NOs:1, 3, 4,
6, 8, 9, 11, 13, 15, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 45, 47, 49, 51, 53, 55 ou 57, ou
o polinucleotídeo membro da família gênica LY6 compreende as SEQ ID 25 NOS:1, 3, 4, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 45, 47, 49, 51, 53, 55 ou 57. Em uma modalidade, um polinucleotídeo que se liga a um polinu- cleotídeo membro da família gênica LY6 (SEQ ID NOs:1, 3, 4, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 45, 47, 49, 51, 53, 55 ou 57), ou fragmento do mesmo, tem identidade de seqüência de pelo menos 75%, pelo menos 80%, 30 pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou de 100% com o polipeptídeo LY6 ou fragmento do mesmo. Em uma modalidade, o polipeptídeo membro da família gênica LY6 compre- ende pelo menos 10, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275, pelo menos 300, ou pelo menos 325 aminoácidos contíguos das SEQ ID NOs:2, 5, 7, 10, 12, 14, 5 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 46, 48, 50, 52, 54, 56 ou 58, ou o polipeptídeo da família gênica LY6 compreende as SEQ ID NOs:2, 5, 7, 10, 12, 14, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 46, 48, 50, 52, 54, 56 ou 58).
Uma "seqüência polipeptídica natural" de quaisquer dos mem- bros da família gênica LY6 compreende um polipeptídeo que tem a mesma seqüência de aminoácidos conforme o polipeptídeo membro da família gêni- ca LY6 correspondente derivado da natureza. Tais seqüências polipeptídicas de LY6 naturais podem ser isoladas da natureza ou podem ser produzidas por meios recombinantes ou sintéticos. O termo "seqüência polipeptídica de LY6 natural" especificamente abrange formas truncadas ou secretadas do polipeptídeo LY6 específico que ocorrem naturalmente (por exemplo, uma seqüência de domínio extracelular), formas de variantes que ocorrem natu- ralmente (por exemplo, formas de junção ("splicing") alternativa)) e as vari- antes alélicas do polipeptídeo que ocorrem naturalmente. Em um aspecto específico, a seqüência natural dos polipeptídeos LY6 descritos aqui são polipeptídeos de seqüência natural de tamanho total ou maduros correspon- dendo às seqüências nas Figuras 1 a 7 e SEQ ID NOs:2, 5, 7, 10, 12, 14, 26, 28, 30, 32, 34, 36. 38, 46: 48, 50, 52, 54, 56 ou 58.
Como usado aqui, uma "variante polipeptídica de LY6" significa que um polipeptídeo LY6, preferencialmente formas biologicamente ativas 25 do mesmo, como definido aqui, tendo identidade de seqüência de aminoáci- do de pelo menos aproximadamente 80% com uma seqüência polipeptídica LY6 de seqüência natural de tamanho total, como descrito aqui, e formas variantes da mesma sem o peptídeo sinal, um domínio extracelular, ou qual- quer outro fragmento de uma seqüência polipeptídica de LY6 natural de ta- 30 manho total, tais como aquelas referenciadas aqui. Tais polipeptídeos vari- antes incluem, por exemplo, polipeptídeos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados, ou deletados, no N- ou C- terminal da se- quência de aminoácidos naturais de tamanho total. Em um aspecto específi- co, tais polipeptídeos variantes terão identidade de seqüência de aminoácido de pelo menos aproximadamente 80%, alternativamente identidade de se- qüência de aminoácido de pelo menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 5 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, a uma seqüência polipeptídica de LY6 da seqüência po- lipeptídica natural de tamanho total, como descrito aqui, e formas variantes dos mesmos sem um peptídeo sinal, um domínio extracelular, ou qualquer outro fragmento de uma seqüência polipeptídica de LY6 natural de tamanho 10 total, tal como aquelas descritas aqui.
"Porcentagem (%) de identidade de seqüência de aminoácido" com respeito a uma seqüência polipeptídica de LY6 identificada aqui é defi- nida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma seqüência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na seqüência po- 15 lipeptídica de LY6 específica, após alinhamento das seqüências e introdução de lacunas, se necessário, para alcançar a identidade de seqüência de por- centagem máxima, e não considerando qualquer substituição conservativa como parte da identidade de seqüência. Alinhamento para objetivos de de- terminação da porcentagem de identidade de seqüência de aminoácido pode 20 ser realizado de vários modos que estão dentro do conhecimento na técnica, por exemplo, usando programa de computador disponível publicamente, tal como programa BLAST, BLAST 2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueies versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para mensu- rar o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar 25 alinhamento máximo no tamanho total das seqüências que são comparadas. Para os objetivos aqui, entretanto, os valores da % de identidade de se- qüência de aminoácidos são gerados usando programa de computador de comparação de seqüência ALIGN-2, em que o código fonte completo para o programa ALIGN-2 é fornecido na Tabela 1 abaixo. O programa de compu- 30 tador de comparação de seqüência ALIGN-2 foi criado pela Genentech, Inc. e o código fonte mostrado na Tabela 1 abaixo foi arquivado com a documen- tação do usuário no Escritório Americano de Direitos autorais, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob Registro Americano de Direitos Auto- rais Número TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponí- vel através de Genentech1 Inc1 South San Francisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código fonte fornecido na Tabela 1 abaixo. O programa 5 ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, preferencialmente UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de seqüência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Como usado aqui "polinucleotídeo variante de LY6" ou "seqüên- cia de ácido nucleico variante de LY6" ou "gene LY6" referem-se a uma mo- 10 !écula de ácido nucieico que codifica um polipeptídeo membro da família gê- nica LY6, preferencialmente a forma biologicamente ativa da mesma, como definido aqui, e que têm a identidade de seqüência de ácido nucieico de peio menos aproximadamente 80% com uma seqüência de ácido de nucleotídeo que codifica uma seqüência natural de tamanho total seqüência polipeptídica 15 LY6 identificada aqui, ou qualquer outro fragmento da respectiva seqüência polipeptídica LY6 de tamanho total como identificada aqui (tal como aqueles codificados por um ácido nucleico que representa somente uma porção da seqüência de codificação completa de um polipeptídeo LY6 de de tamanho total). Ordinariamente, tais polinucleotídeos variantes terão identidade de 20 seqüência de ácido nucieico de pelo menos aproximadamente 80%, alterna- tivamente pelo menos aproximadamente identidade de seqüência de ácido nucleico de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com uma seqüência de áci- do nucleico que codifica a respectiva seqüência polipeptídica natural de ta- 25 manho total seqüência polipeptídica de LY6 ou qualquer outro fragmento da respectiva seqüência polipeptídica de LY6 de tamanho total identificada aqui. Tais polinucleotídeos variantes não abrangem a seqüência nucleotídica na- tural.
Geralmente, tais polinucleotídeos variantes variam pelo menos aproximadamente 50 nucleotídeos no tamanho da seqüência polipeptídica natural, alternativamente a variação pode ser pelo menos aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 5 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 ou 1000 nucleotídeos no tamanho, em que neste contexto o termo "aproximadamente" significa o tamanho de seqüência nucleotídica referida mais ou menos 10% daquele tamanho referido.
"Porcentagem (%) de identidade de seqüência de ácido nuclei-
co" com respeito a uma seqüência de ácido nucleico de codificação do poli- peptídeo do gene LY6 identificada aqui é definida como a porcentagem de nucleotídeos em uma seqüência candidata que são idênticos aos nucleotí- deos na seqüência de ácido nucleico do gene LY6 de interesse, respectiva- 15 mente, após alinhamento das seqüências e introdução de lacunas, se ne- cessário, para alcançar a máxima porcentagem de identidade de seqüência.
0 alinhamento com objetivos de determinar a porcentagem de identidade de seqüência de ácido nucleico pode ser realizado de várias maneiras que es- tão dentro do conhecimento na técnica, por exemplo, usando programa de
computador disponível publicamente, tal como programa BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Para os objetivos aqui, entretanto, valores de % da identidade de seqüência de ácidos nucleicos são gerados usando o programa de computador de comparação de seqüência ALIGN-2, em que o código fonte completo do programa ALIGN-2 é fornecido na Tabela 1 abaixo. 25 O programa de computador ALIGN-2 de comparação de seqüência foi criado por Genentech, Inc. e o código fonte mostrado na Tabela 1 abaixo foi arqui- vado com documentação do usuário no Escritório Americano de Direitos au- torais, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob o Número de Re- gistro Americano de Direitos Autorais TXU510087. O programa ALIGN-2 es- 30 tá publicamente disponível através de Genentech, Inc, South San Francisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código fonte fornecido na Tabela
1 abaixo. Programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, preferencialmente UNIX digital V4.0D. Todos os parâme- tros de comparação de seqüência são definidos por programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações onde ALIGN-2 é empregado para comparações de 5 seqüência de ácidos nucleicos, a % de identidade de seqüência de ácido nucleico de uma dada seqüência de ácido nucleico C para a, com, ou contra uma dada seqüência de ácido nucleico dada D (que pode alternativamente ser expressa como uma dada seqüência de ácido nucleico C que tem ou compreende uma certa % de identidade de seqüência de ácido nucleico a, 10 com, ou contra uma dada seqüência de ácido nucleico D) é calculada como se segue:
100 vezes a fração W/Z
onde W é o número de nucleotídeos classificados como combinações idênti- cas pelo programa de alinhamento de seqüência ALIGN-2 naqueles progra- 15 mas de alinhamento de C e D, e onde Z é o número total de nucleotídeos em D. Será apreciado que onde o tamanho da seqüência de ácido nucleico C não é igual ao tamanho da seqüência de ácido nucleico D, a % de identidade de seqüência de ácido nucleico de C para D não será igual à % de identida- de de seqüência de ácido nucleico de D para C. Como os exemplos de cál- 20 culos de % de identidade de seqüência de ácidos nucleicos, as Tabelas 4 e
5, demonstram como calcular a % de identidade de seqüência de ácido nu- cleico da seqüência de ácido nucleico designada "DNA de Comparação" pa- ra a seqüência de ácido nucleico designado "REF-DNA", em que "REF-DNA" representa uma seqüência de ácido nucleico de codificação do gene LY6 25 hipotética de interesse, " DNA de Comparação" representa a seqüência nu- cleotídica de uma molécula de ácido nucleico contra a qual a molécula de ácido nucleico "REF-DNA" de interesse está sendo comparada, e "N", "L" e "V" cada um representam nucleotídeos hipotéticos diferentes. A menos que especificamente afirmado de outra maneira, todos os valores de % de identi- 30 dade de seqüência de ácidos nucleicos usados aqui são obtidos como des- crito no parágrafo imediatamente precedente usando programa de computa- dor ALIGN-2. Em outras modalidades, polinucleotídeos variantes do gene LY6 são moléculas de ácido nucleico que codificam o polipeptídeo LY6, respecti- vamente, e que são capazes de hibridização, preferencialmente sob condi- ções estringentes de hibridização e lavagem, a seqüências nucleotídicas que 5 codificam um polipeptídeo LY6 de tamanho total, respectivamente, como descrito aqui. Tais polipeptídeos variantes podem ser aqueles que são codi- ficados por tais polinucleotídeos variantes.
"Isolado", quando usado para descrever vários polipeptídeos LY6 descritos aqui, significa o polipeptídeo que foi identificado e separado 10 e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente natural. Com- ponentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que tipica- mente interfeririam em usos diagnósticos ou terapêuticos do polipeptídeo e podem incluir enzimas, hormônios e outro solutos proteicos ou não- protéicos. Em modalidades preferenciais, tais polipeptídeos serão purifica- 15 dos (1) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da seqüên- cia de aminoácidos interna ou N-terminal pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (2) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições não-redutoras ou redutoras usando coloração por azul de Coomassie ou, preferencialmente, prata. Tais polipeptídeos isolados incluem os polipeptí- 20 deos correspondentes in situ nas células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do polipeptídeo LY6 a partir de seu ambiente natural não estará presente. Geralmente, entretanto, tais poüpepiídeos isoiaaos se- rão preparados por pelo menos uma etapa de purificação.
Um ácido nucleico LY6 "isolado" que codifica o polipeptídeo é 25 uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo me- nos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está geral- mente associada na fonte natural do ácido nucleico que codifica o polipeptí- deo. Qualquer uma das moléculas de ácido nucleico isolada acima é diferen- te da forma ou configuração em que é encontrada na natureza. Quaisquer 30 moléculas de ácido nucleico, por isso, são distintas da molécula de ácido nucleico específica que codifica o polipeptídeo como existe em células natu- rais. O termo "seqüências controle" refere-se a seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência de codificação operacio- nalmente ligada em um determinado organismo hospedeiro. As seqüências de controle que são adequadas para procariontes, por exemplo, incluem um 5 promotor, opcionalmente uma seqüência operadora, e um sítio de ligação ribossomal. Células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, si- nais de poliadenilação, e potencializadores.
O ácido nucleico está "operacionalmente ligado" quando é colo- cado em uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA de uma pré-sequência ou líder secretário está operacional- mente ligado ao DNA de um polipeptídeo se for expresso como uma pré- proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou potenci- alizador está operacionalmente ligado a uma seqüência de codificação se afeta a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação ribossomal está o- peracionalmente ligado a uma seqüência de codificação se estiver posicio- nada para facilitar a tradução. Geralmente, "operacionalmente ligado" signifi- ca que as seqüências de DNA que são ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretário, contíguas e na fase de leitura. Entretanto, potencializa- dores não têm que ser contíguos. A ligação é efetuada pela ligação a sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, os adaptadores de oli- gonucleotídeo sintéticos ou Iigadores são usados conforme a prática con- vencional.
Como usada aqui, "expressão" quando aplicada à expressão gênica, refere-se à transcrição de um gene que codifica uma proteína para 25 produzir mRNA bem como a tradução do mRNA para produzir a proteína codificada pelo gene. Dessa maneira, expressão aumentada ou reduzida refere-se à transcrição aumentada ou reduzida de um gene e/ou tradução aumentada ou reduzida de mRNA resultante da transcrição.
"Estringência" das reações de hibridização é prontamente de- terminável por um versado ordinário na técnica, e geralmente é um cálculo empírico dependente do tamanho de sonda, temperatura de lavagem e con- centração de sal. Em geral, sondas mais longas requerem temperaturas maiores para anelamento adequado, enquanto sondas menores requerem menores temperaturas. A hibridização geralmente depende da capacidade do DNA desnaturado reanelar quando as fitas complementares estão pre- sentes em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quanto maior 5 o grau de homologia desejada entre a sonda e a seqüência hibridizável, maior temperatura relativa que pode ser usada. Como resultado, daí resulta que as temperaturas relativas mais altas tenderiam a fazer as condições de reação mais estrigentes, enquanto menores temperaturas menos ainda. Pa- ra detalhes e explicação adicionais da estringência das reações de hibridiza- 10 ção, vide Ausubel et al. Current Protocols in Moiecuiar Bioiogy, Wiiey Inters- cience Publishers, (1995).
"Condições estrigentes" ou "condições de alta estringência", co- mo definido aqui, podem ser identificadas por aquelas que: (1) empregam baixa força iônica e alta temperatura da lavagem, por exemplo, cloreto de 15 sódio a 0,015 M/citrato de sódio a 0,0015 M/dodecil sulfato de sódio a 0,1% a 50 EC; (2) empregam durante a hibridização um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, formamida a 50% (v/v) com albumina sérica bovina a 0,1 %/Ficoll a 0,1 %/poliviniIpirrolidona a 0,1%/ tampão de fosfato de sódio a 50mM em pH 6,5 com cloreto de sódio a 750 mM, citrato de sódio a 20 75 mM a 42EC; ou (3) hibridização durante a noite em uma solução que em- prega formamida a 50%, SSC 5x (NaCI a 0,75 M, citrato de sódio a 0,075 MV fosfato de sódio a 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%, solução de Denhardt 5x, DNA de esperma de salmão sonicado (50 μg/ml), SDS a 0,1% e sulfato de dextrana a 10% em 42EC, com uma lavagem de 10 minu- 25 tos a 42EC em SSC 0,2 x (cloreto de sódio/citrato de sódio) seguida por la- vagem de alta estringência por 10 minutos consistindo em SSC 0,1 x con- tendo EDTA a 55EC.
"Condições moderadamente estrigentes" podem ser identifica- das como descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Ma- nual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e inclui o uso de solução de lavagem e condições de hibridização (por exemplo, temperatura, força iônica e % de SDS) menos estrinqentes que os descritos acima. Um exem- pio de condições moderadamente estringentes é a incubação durante a noite a 37EC em uma solução compreendendo: formamida a 20%, SSC 5 x (NaCI a 150 mM, citrato trissódico a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5 x, sulfato de dextrana a 10%, e 20 mg/ml de DNA de 5 esperma de salmão desnaturado cortado, seguido por lavagem dos filtros em SSC 1 x a aproximadamente 37 a 50EC. O versado ordinariamente re- conhecerá como ajustar a temperatura, força iônica, etc. segundo a necessi- dade de acomodar fatores, tais como tamanho de sonda e similares.
O termo "epitopo marcado" quando usado aqui refere-se a um polipeptídeo quimérico compreendendo um polipeptídeo LY6, ou agente de ligação a polipeptídeo LY6 fusionado "a um polipeptídeo de marcação". O polipeptídeo de marcação tem resíduos suficientes para fornecer um epitopo contra o qual um anticorpo pode ser feito, ainda é bastante curto tal que não interfere na atividade do polipeptídeo ao qual está fusionado. O polipeptídeo de marcação preferencialmente também é suficientemente único de forma que que anticorpo não reaja cruzadamente substancialmente com outros epitopos. Polipeptídeos de marcação adequados geralmente têm pelo me- nos seis resíduos de aminoácidos e normalmente entre aproximadamente 8 e 50 resíduos de aminoácidos (preferencialmente, entre aproximadamente 10 e 20 resíduos de aminoácidos).
"Ativo" ou "atividade" para os objetivos aqui refere-se à forma(s) de polipeptídeos que conservam uma aiividade biológica e/ou imunológica do polipeptídeo natural ou que ocorre naturalmente, em que a atividade "bio- lógica" refere-se a uma função biológica (inibitória ou estimulatória) causada 25 por um polipeptídeo natural ou que ocorre naturalmente diferente da capaci- dade de induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigênico possuída por um polipeptídeo natural ou que ocorre naturalmente, e uma atividade "imunológica" refere-se à capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigênico possuído por um polipeptídeo natural 30 ou que ocorre naturalmente. Um polipeptídeo ativo, como usado aqui, é um antígeno que é diferencialmente expresso, de uma perspectiva qualitativa ou quantitativa, em tecido de IBD, em relação à sua expressão em tecido similar que não está afligido por IBD. O termo "antagonista" é usado no sentido mais amplo, e inclui qualquer molécula que bloqueia, inibe ou neutraliza parcialmente ou total- mente uma atividade biológica de um polipeptídeo natural descrito aqui. Mo- léculas antagonistas adequadas incluem especificamente anticorpos de ou fragmentos de anticorpos antagonistas, fragmentos ou seqüências de ami- noácidos variantes de polipeptídeos naturais, peptídeos, oligonucleotídeos antissenso, pequenas moléculas orgânicas, etc. Métodos para identificação de antagonistas podem compreender contato de um polipeptídeo, incluindo uma célula que o expressa, com um agonista candidato ou moiécuia anta- gonista e mensuração de uma modificação detectável em uma ou mais ativi- dades biológicas normalmente associadas com tal polipeptídeo.
"Tratar" ou "tratamento" ou "alívio" refere-se a ambas medidas de tratamento terapêutico e profilático ou preventivo, em que o objetivo é prevenir ou diminuir a velocidade (moderar) a progressão de uma doença. Tratamento também pode referir-se à modificação da progressão de uma IBD.
"Diagnosticar" refere-se ao processo de identificação ou deter- minação das características distintas de uma doença incluindo, sem limita- ção, IBD, UC e/ou Doença de Crohn. O processo de diagnóstico muitas ve- zes também é expresso como estadiamento ou classificação da doença com base na gravidade ou progressão da doença bem corno na posição (tai co- mo, por exemplo, posição dentro de ou ao longo do trato gastrointestinal no qual a inflamação e/ou expressão gênica alterada é encontrada).
Indivíduos em necessidade de diagnóstico incluem aqueles que já sofrem com expressão aberrante de LY6 bem como aqueles propensos a ter ou aqueles em que a expressão aberrante de LY6 deve ser prevenida. Consequentemente, um aspecto da invenção é a detecção de uma resposta terapêutica a fármaco em um mamífero tratado com um agente terapêutico para o tratamento de IBD, em que o método compreende determinação da expressão de Ih LY6 no tecido gastrointestinal de um mamífero de teste em relação a um de controle e a determinação daqueles níveis de expressão de LY6 são não significativamente diferentes dos níveis de expressão normais do controle. Em uma modalidade, uma resposta terapêutica é determinada quando os níveis de expressão de LY6 do mamífero tratado com um agente terapêutico são diferentes (expressão é mais similar ao controle normal, isto 5 é, os níveis de expressão de LY6 são menores que os níveis de expressão de LY6 no mamífero antes do tratamento).
Os parâmetros acima para avaliação do tratamento bem- sucedido e melhora na doença são prontamente mensuráveis por procedi- mentos de rotina familiares a um médico. Para a terapia de IBD, a eficácia 10 pode ser medida, por exemplo, pela avaliação do tempo de progressão da doença (TTP) e/ou determinação da taxa de resposta (RR). Biópsias podem ser feitas para avaliar a expressão gênica e observar a histopatologia do te- cido gastrointestinal do paciente. A invenção descrita aqui relativa ao pro- cesso de prognóstico e/ou diagnóstico envolve a determinação e a avaliação 15 da regulação para cima da expressão gênica de LY6.
"Mamífero" ou "indivíduo mamífero" para objetivos de tratamen- to, alívio dos sintomas ou diagnóstico de uma IBD referem-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de fazenda, e animais de zoológico, esportes ou estimação, 20 tais como cães, gatos, gado, cavalos, ovelhas, porcos, cabras, coelhos, fu- rões, etc. Preferencialmente, o mamífero é ser humano.
A administração "em combinação com" um ou mais agentes te- rapêuticos adicionais inclui a administração simultânea (concorrente) e con- secutiva em qualquer ordem.
"Veículos" como usado aqui incluem veículos, excipientes ou
estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis que são não-tóxicos para célu- la ou mamífero que é exposto a eles nas dosagens e concentrações empre- gadas. Muitas vezes, o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução a- quosa de pH tamponado. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis 30 incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antio- xidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (menos de aproximadamente 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivi- nilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, argini- na ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; álcoois 5 de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal, tais como sódio; e/ou tensoativos não-iônicos, tais como TWEEN7, polietileno glicol (PEG), e PLUR0NICS7.
Por "fase sólida" ou "suporte sólido" é indicada uma matriz não- aquosa à qual um polipeptídeo, ácido nucleico, anticorpo ou agente de Iiga- 10 ção a LY6 pode se aderir ou ligar. Exernplos de fases sólidas abrangidas aqui incluem aquelas formadas parcialmente ou inteiramente de vidro (por exemplo, vidro de poro controlado), polissacarídeos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas, poliestireno, álcool polivinílico e silicones. Em certas modali- dades, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender o poço de 15 uma placa de ensaio; em outros é uma coluna de purificação (por exemplo, uma coluna de cromatografia por afinidade). Este termo também inclui uma fase sólida descontínua de partículas discretas, tais como aquelas descritas na Patente Norte-americana Número 4.275.149.
Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta de vários tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativo que é útil para a entrega de um fármaco a um mamífero. Os componentes do lipossoma são comumente arranjados em uma formação de bicamada, simiiar ao arranjo iipidico de membranas biológicas.
Uma "pequena molécula" ou "pequena molécula orgânica" é de- finida aqui tendo um peso molecular abaixo de aproximadamente 500 Dál- tons.
Uma "quantidade eficaz" de um agente antagonista é uma quan- tidade suficiente para ocasionar um efeito fisiológico, tal como sem limitação para inibir, parcialmente ou inteiramente, a função do gene ou sua proteína codificada. Uma "quantidade eficaz" pode ser determinada empiricamente e de uma maneira rotineira, em relação a este objetivo.
O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a um antagonista ou outro fármaco eficaz para "tratar" uma doença ou distúrbio em um indivíduo ou mamífero. No caso de IBD, a quantidade terapeutica- mente eficaz do fármaco restituirá a expressão aberrante de LY6 a níveis fisiológicos normais; reduzirá a inflamação gastrointestinal; reduzirá o núme- 5 ro de lesões gastrointestinais; e/ou aliviará até certo ponto um ou mais dos sintomas associados com IBD, UC e/ou CD. Ver definição aqui de "tratamen- to".
Uma "quantidade inibitória de crescimento" de um antagonista é uma quantidade capaz de inibir o crescimento de uma célula, especialmente tumor, por exemplo, célula de câncer, in vitro ou in vivo. Para objetivos de inibir o crescimento de célula neoplásica, tal quantidade pode ser determina- da empiricamente e de uma maneira rotineira.
Uma "quantidade citotóxica" de um antagonista é uma quantida- de capaz de causar a destruição de uma célula, especialmente uma célula proliferativa, por exemplo, célula de câncer, in vitro ou in vivo. Para objetivos de inibição do crescimento celular neoplásico pode ser determinada empiri- camente e de uma maneira rotineira.
O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e especifi- camente cobre, por exemplo, anticorpos monoclonais antiLY6 (incluindo an- 20 ticorpos antagonista e de neutralização), composições de anticorpo antiLY6 com especificidade poliepitópica, anticorpos policlonais, anticorpos de cadeia única antiLY6, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos) e fragmentos de ligação a antígeno (veja abaixo) de todos os anticorpos acima listados enquanto exibem a atividade biológica ou imunológica desejada. O 25 termo "imunoglobulina" (Ig) é usado intercambiavelmente com o anticorpo aqui.
Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente natural. Com- ponentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interferi- 30 riam em usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outro solutos proteicos ou não-protéicos. Em modali- dades preferenciais, o anticorpo será purificado (1) para o maior que 95% por peso do anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e ainda mais preferencialmente mais de 99% por peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da seqüência de aminoácido N-terminal ou interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) à homogenei- 5 dade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não-redutoras usando co- loração por azul de Coomassie ou, preferencialmente, prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presen- te. Geralmente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo me- 10 nos uma etapa de purificação.
A unidade de anticorpo de 4 cadeias básicas é uma glicoproteí- na heterotetramérica composta de duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H) (um anticorpo IgM é composto de 5 unidades heterotetraméricas básicas junto com um polipeptídeo adicional chamado 15 cadeia J, e por isso contêm 10 sítios de ligação a antígeno, enquanto anti- corpos IgA secretados podem polimerizar para formar junções polivalentes compreendendo de 2 a 5 das unidades de 4 cadeias básicas junto com a cadeia J). No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeias é geralmente de apro- ximadamente 150.000 daltons. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por 20 uma ligação covalente dissulfeto, enquanto duas cadeias H são ligadas uma à outra por uma ou mais ligações dissulfeto dependendo do isotipo da ca- deia H. Cada cadeia HeL também têrn pontes dissuifeto intracadeia regu- larmente espaçadas. Cada cadeia H tem no N-terminal, um domínio variável (Vh) seguido por três domínios constantes (Ch) para cada uma das cadeias 25 α e γ e quatro domínios Ch de isotipos μ e ε. Cada cadeia L tem no N- terminal, um domínio variável (Vl) seguido por um domínio constante (Cl) em sua outra extremidade. A Vl é alinhada com Vh e Cl é alinhada com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Acredita-se que deter- minados resíduos de aminoácidos formam uma interface entre domínios va- 30 riáveis da cadeia leve e cadeia pesada. A junção de uma Vh e Vl em conjun- to forma um sítio de ligação a antígeno único. Para a estrutura e proprieda- des das classes diferentes de anticorpos, ver, por exemplo, Basic and Ciini- cal Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 e Capítulo 6.
A cadeia L de qualquer espécie vertebrada pode ser destinada a 5 um dos dois tipos claramente distintos, chamados kappa e lambda, com ba- se nas seqüências de aminoácidos de seus domínios constantes. Depen- dendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser destinadas a classes ou isoti- pos diferentes. Há cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e 10 !g.M, tendo as cadeias pesadas designadas α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As classes γ e α são ainda divididas em subclasses com base em diferenças relativamente menores na seqüência Ch e função, por exempio, seres hu- manos expressam as seguintes subclasses: IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2.
O termo "variável" refere-se ao fato que certos segmentos dos
domínios variáveis se diferenciam extensivamente na seqüência entre anti- corpos. O domínio V medeia a ligação a antígeno e define a especificidade de um anticorpo particular por seu antígeno particular. Entretanto, a variabili- dade não é exatamente distribuída através de aproximadamente 110 amino- 20 ácidos de extensão dos domínios variáveis. Em vez disso, as regiões V con- sistem em intervalos relativamente invariáveis chamados regiões conserva- das (FRs) de 15 a 30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade chamadas "regiões hipervariáveis" que são cada uma de comprimento de 9 a 12 aminoácidos. Os domínios variáveis das cadeias 25 pesadas e leves naturais cada uma compreende quatro FRs, basicamente adotando uma configuração de folha β, conectada por três regiões hipervari- áveis, que formam alças de conexão, e em alguns casos que fazem parte da estrutura da folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas próximas pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis de outra cadeia, contri- 30 buem para a formação do sítio de ligação a antígeno de anticorpos (vide Ka- bat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os do- mínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anti- corpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como a parti- cipação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).
5 O termo "região hipervariável" quando usado aqui refere-se aos
resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de a- minoácidos de uma "região de determinação de complementaridade" ou "C- DR" (por exemplo, por volta de aproximadamente 24 a 34 resíduos Kabat 10 (LI), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no VL, e por voita de aproximadamente 31 a 35B resíduos Kabat (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no Vh (Kabat et ai, Seauences of Proteins of Immunological Interest, 5th Eu. Fubiic Health Ser- vice, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resí- duos "de uma alça hipervariável" (por exemplo, por volta de aproximamente 15 26 a 32 resíduos Chothia (L1), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) na VL, e 26 a 32 (H1), 52A a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) na Vh (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)).
O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui refere-se a um anticorpo a partir de uma população de anticorpos substancialmente homo- gêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou ligam-se ao mesmo epitopo(s), exceto por possíveis variantes que podem surgir durante a produção do anticorpo monocionai, tais varian- tes geralmente estão presentes em menores quantidades. Tal anticorpo mo- noclonal inclui tipicamente um anticorpo compreendendo uma seqüência polipeptídica que se liga a um alvo, em que a seqüência polipeptídica de li- gação ao alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma se- qüência polipeptídica de ligação ao alvo único de uma pluralidade de se- qüências polipeptídicas. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a se- leção de um único clone a partir de uma pluralidade de clones, tal como um agrupamento de clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA re- combinante. Deve ser entendido que a seqüência de ligação ao alvo sele- cionado pode ser ainda alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade pelo alvo, para humanizar seqüência de ligação ao alvo, para melhorar sua produção em cultura celular, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecífico, etc., e que um anticorpo compreendendo a seqüência de ligação ao alvo alterada é também um anticorpo monoclonal 5 desta invenção. Em contraste a preparações de anticorpo policlonais que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes de- terminantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Além de sua especificidade, as preparações de anticorpo mono- 10 clonal são vantajosas em que são tipicamente não contaminadas por outras imunoglobulinas. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como requerimento da produção do anticorpo por nenhum método particular. Por exemplo, os anticorpos mo- 15 noclonais usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler et ai., Nature, 256:495 (1975); Harlow et ai., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et ai., em: Monoclonal Antibodies e T-cell Hibridomas 563-681, (Elsevier, 20 N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, Patente Norte-americana Número 4.816.567), tecnologias de exposição de fago (vi- de, por exemplo, Clackson et a!., Nature, 352:624-628 (1991); Marks ei ai., J. Moi Bioi, 222:581-597 (1991); Sidhu et ai, J. Mol. Biol. 338 (2):299-310 (2004); Lee et al. J.Mol. β/ο/.340 (5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. 25 Acad. Sei. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); e Lee et ai J. Immunoi Me- thods 284 (1 -2):119-132 (2004), e tecnologias para produção de anticorpos humanos ou similares a humanos em animais que têm partes ou todos os Ioci da imunoglobulina humana ou genes que codificam seqüências de imu- noglobulina humana (vide, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; 30 WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et ai, Nature, 362:255-258 (1993); Brug- gemann et ai, Year in Immuno., 7:33 (1993); Patentes U.S. Números 5.545.806; 5.569.825; 5.591.669 (todos da GenPharm); 5.545.807; WO 1997/17852; Patentes U.S. Números 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology, 10: 779- 783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 5 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); e Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).
Anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) têm uma porção da cadeia pesada e/ou leve idêntica ou homóloga a seqüências corresponden- 10 tes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencendo a uma determinada classe ou subclasse de anticorpo, enquanto o resto da cadeia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências correspondentes ern anticor- pos derivados de outras espécies ou pertencendo a outra classe ou subclas- se de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que exi- 15 bam a atividade biológica desejada (Patente Norte-americana Número 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)). Anticorpo humanizado como usado aqui é um subconjunto de anti- corpos quiméricos.
Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exem- pio, murino) são anticorpos quiméricos que contêm a seqüência mínima de- rivada da imunoglobulina não-humana. Em sua maioria, anticorpos humani- zados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipieníe ou aceptor) em que os resíduos da região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos da região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo do- ador), tais como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano tendo a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, os resíduos da estrutura de Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituí- dos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinamento adicional do desempenho do anticorpo, tal como afinidade de ligação. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substanci- almente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis corres- pondem àquelas de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substanci- almente todas as regiões conservadas são aquelas de uma seqüência de 5 imunoglobulina humana embora as regiões conservadas possam incluir uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação. O número destas substituições de aminoácidos na estrutura é tipicamente não mais do que 6 na cadeia H, e na cadeia L, não mais do que 3. O anti- corpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma 10 porção de uma região constante da imunoglobulina (Fe), tipicamente aqueia de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al., Nature 321:522-525 (1986): Reichmann et a!., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um 15 anticorpo intacto, preferencialmente a região de ligação a antígeno ou variá- vel do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2, e fragmentos Fv; diacorpos; anticorpos lineares (vide Patente Norte-americana Número 5.641.870, Exemplo 2; Zapata et al., Protein Enq. 8 (10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticorpo de cadeia única; e anti- 20 corpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.
A digestão por papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação a antígeno idêntico, chamados fragmentos "Fab", e um fragmento "Fe" residual, uma designação que reflete a capacidade de cristalizar-se prontamente. O fragmento Fab consistem em uma cadeia L inteira junto com 25 o domínio de região variável da cadeia H (VH), e o primeiro domínio cons- tante de uma cadeia pesada (Ch1). Cada fragmento Fab é monovalente com respeito à ligação ao antígeno, isto é, tem um sítio de ligação único ao antí- geno. O tratamento por pepsina de um anticorpo produz um grande fragmen- to F(ab')2 único que a grosso modo corresponde a dois fragmentos Fab Iiga- 30 dos por dissulfeto que têm atividade divalente de ligação ao antígeno e é ainda capaz de ligação cruzada com antígeno. Fragmentos Fab' diferenci- am-se de fragmentos Fab por terem poucos resíduos adicionais no terminal carbóxi do domínio CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobra- diça do anticorpo. Fab1-SH é a designação aqui de Fab’ em que o resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Fragmen- tos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de 5 fragmentos Fab1 que têm cisteínas de dobradiça entre eles. Outras ligações químicas de fragmentos de anticorpo também são conhecidas.
O fragmento Fc compreende as porções carbóxi-terminais de ambas cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras de anticorpos são determinadas por seqüências na região Fc1 região a qual também é parte reconhecida pelos receptores de Fe (FcR) encontrados em certos tipos de células.
"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio completo de reconhecimento e de ligação ao antígeno. Este fragmento con- sistem em um dímero e de um domínio de região variável da cadeia leve e 15 pesada em associação estreita, não-covalente. A partir da dobra destes dois domínios originam-se seis alças hipervariáveis (3 alças cada uma da cadeia HeL) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para ligação ao an- tígeno e conferem especificidade de ligação ao antígeno para o anticorpo. Entretanto, até um domínio variável único (ou porção de um Fv compreen- 20 dendo somente três CDRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar-se ao antígeno, embora em uma menor afinidade do que o sítio de ligação inteiro.
"Cadeia única Fv" também abreviada como "sFv" ou "scFv" são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios de anticorpo Vh e 25 Vl conectados em uma cadeia polipeptídica única. Preferencialmente, o po- lipeptídeo sFv compreende ainda um Iigador polipeptídico entre os domínios Vh e Vl que permite ao sFv formar a estrutura desejada para ligação ao an- tígeno. Para uma revisão de sFv, vide Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- 30 Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.
Como usado aqui "polipeptídeo de ligação a LY6" é um oligopep- tídeo que se liga, preferencialmente especificamente, a um polipeptídeo Ii- gante ou componente de sinalização LY6, respectivamente, ou uma porção de ligação a LY6 ou fragmento do mesmo. Tais oügopeptídeos podem ser quimicamente sintetizados usando metodologia de síntese de oligopeptídeo conhecida ou podem ser preparados e purificados usando tecnologia recom- 5 binante. Tais oügopeptídeos são normalmente de pelo menos aproximada- mente 5 aminoácidos em tamanho, alternativamente pelo menos aproxima- damente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 10 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 aminoácidos em tamanho ou mais. Tais oügopeptídeos podem ser identificados sem ex- perimentação indevida usando técnicas bem-conhecidas. Neste sentido, é observado que as técnicas para selecionar bibliotecas de oügopeptídeos que 15 são capazes de ligação especificamente a um polipeptídeo-alvo são bem- conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Patente Norte-americana Número 5.556.762, 5.750.373, 4.708.871, 4.833.092, 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689, 5.663.143; Publicação PCT Números WO 84/03506 e W084/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81:3998-4002 20 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 82:178-182 (1985); Gey- sen et al., em Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. !mmuno!. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs ei al., J. immunoi., 140:611- 616 (1988), Cwirla, S. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6378 (1990); Lowman, H.B. et al. Biochemistry, 30:10832 (1991); Clackson, T. et al. Natu- 25 re, 352: 624 (1991); Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Kang, A.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:8363 (1991), e Smith, G. P., Cur- rent Opin. Biotechnol., 2:668 (1991).
Um antagonista de LY6 (por exemplo, anticorpo, polipeptídeo, oligopeptídeo ou pequena molécula) "que se liga" a um antígeno-alvo de interesse, por exemplo, LY6 é aquele que se liga ao alvo com afinidade sufi- ciente para ser um agente diagnóstico, prognóstico e/ou terapêutico útil no direcionamento a uma célula ou tecido expressando antíqeno, e não reaqe cruzadamente significativamente com outras proteínas. A extensão de liga- ção a um marcador polipeptídico não desejado será menos de aproximada- mente 10% da ligação ao determinado alvo desejado, como determinável por técnicas comuns, tais como análise por sorteamento de células com fluo- 5 rescência ativada (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA).
Além disso, o termo "ligação específica" ou "liga-se especifica- mente a" ou é "específico para" um determinado polipeptídeo LY6 ou um epitopo em um determinado polipeptídeo-LY6 alvo significa ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não-específica. A ligação es- 10 pecífica pode ser medida, por exemplo, peia determinação da ligação de uma molécula comparada com a ligação de uma molécula controle, que ge- ralmente é uma molécula de estrutura similar que não tem atividade de liga- ção. Por exemplo, ligação específica pode ser determinada pela competição com uma molécula controle que é similar ao alvo, por exemplo, um excesso 15 de alvo não-marcado. Neste caso, a ligação específica é indicada se a liga- ção do alvo marcado a uma sonda for competitivamente inibida pelo excesso de alvo não-marcado. Em uma modalidade, tais termos referem-se à ligação onde uma molécula se liga a um polipeptídeo ou epitopo particular em um determinado polipeptídeo sem ligar-se substancialmente a qualquer outro 20 polipeptídeo ou epitopo polipeptídico. Alternativamente, tais termos podem ser descritos por uma molécula tendo um Kd para o alvo de pelo menos a- nroximadamente IO'4 Μ, IO'5 Μ, ΙΟ’6 Μ, IO'7 ivl, Iu'8 fvi, IO'9 M, IO ic Μ, 10'11 Μ, 10"12 M, ou maior.
Uma célula ou tecido gastrointestinal que "superexpressa" LY6 25 se aquela célula ou tecido mostra ter ácido nucleico de codificação de LY6 aumentado em células ou se aquela célula ou tecido superproduzem e se- cretam a proteína LY6, comparado a uma célula gastrointestinal normal ou tecido do mesmo tipo tecidual. Tal superexpressão pode resultar de amplifi- cação gênica ou pela transcrição ou tradução aumentadas. São conhecidos 30 vários ensaios diagnósticos ou prognósticos que medem níveis de expres- são alterados resultando em níveis aumentados ou reduzidos na superfície celular ou níveis aumentados ou reduzidos da proteína secretada e incluem sem limitação, ensaio imuno-histoquímico usando anticorpos antiLY6, análi- se por FACS, etc. Alternativamente, os níveis de ácido nucleico de codifica- ção de LY6 ou mRNA podem ser medidos na célula, por exemplo, através de hibridização in situ fluorescente usando uma sonda baseada em ácido 5 nucleico correspondendo a um ácido nucleico de codificação de LY6 ou complemento do mesmo; (FISH; vide W098/45479 publicado em outubro de 1998), técnicas de Southern blotting, Northern blotting ou reação da polime- rase em cadeia (PCR), tais como PCR quantitativa em tempo real (RT-PCR). Alternativamente, a superexpressão de polipeptídeo LY6 é determinável pela 10 mensuração do antígeno presente em um fluido biológico, tal como soro, por exemplo, usando ensaios baseados em anticorpo (vide também, por exem- plo, Patente Norte-americana Número 4,93-3.294 emitida em 12 de junho de 1990; W091/05264 publicado em 18 de abril de 1991; Patente Norte- americana Número 5.401.638 emitida em 28 de março de 1995; e Sias et ai, 15 J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Além dos ensaios acima, vários en- saios in vivo estão disponíveis para o profissional versado. Por exemplo, ele pode expor células no corpo do paciente a um anticorpo que é opcionalmen- te marcado com um marcador detectável, por exemplo, um isótopo radioati- vo, e a ligação do anticorpo às células no paciente pode ser avaliada, por 20 exemplo, pela varredura externa da radioatividade ou pela análise de uma biópsia tomada de um paciente anteriormente exposto ao agente terapêuti- co.
Como usado aqui, o termo "imunoadesina" indica moléculas si- milares a anticorpo que combinam a especificidade de ligação de uma prote- 25 ína heteróloga (uma "adesina") com as funções efetoras de domínios cons- tantes da imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma seqüência de aminoácidos com a especificidade de liga- ção desejada que é diferente do sítio de reconhecimento e ligação ao antí- geno de um anticorpo (isto é, é "heterólogo"), e uma seqüência do domínio 30 constante da imunoglobulina. A parte adesina de uma molécula de imunoa- desina tipicamente é uma seqüência de aminoácido contígua compreenden- do pelo menos o sítio de ligação de um receptor ou um ligante. A seqüência do domínio constante da imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como subtipos lgG-1, lgG-2, lgG-3, ou lgG-4, IgA (incluindo lgA-1 e lgA-2), IgE, IgD ou IgM.
A palavra "marcador" quando usada aqui refere-se a um com- 5 posto ou composição detectável que é conjugada diretamente ou indireta- mente ao anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica para gerar um anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica "marcada". O marcador pode ser detectável por si mesmo (por exemplo, marcadores de radioisóto- pos ou marcadores fluorescentes) ou, em caso de um marcador enzimático, 10 pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de subs- trato que é detectável.
O termo "agente citotóxico" como usado aqui refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa destruição de células. O termo é destinado a incluir isótopos radioativos (por exemplo, 15 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos, enzimas e fragmentos dos mesmos, tais como enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas, tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos, e vários 20 agentes antitumorais ou anticâncer descritos abaixo. Outros agentes citotó- xicos são descritos abaixo. Um agente tumoricida causa destruição de célu- las tumorais.
Um "agente quimioterápico" ou "agente terapêutico" é um com- posto químico útil no tratamento de um distúrbio ou doença. Exemplos de 25 agentes quimioterápicos ou terapêuticos para o tratamento de IBD incluem sem limitação fármacos anti-inflamatórios sulfassalazina e ácido 5- aminossalicílico (5-ASA); metroidazol e ciprofloxacina são similares em efi- cácia a sulfassalazina e parecem ser particularmente úteis para o tratamento doença perianal; em casos mais severos, corticosteroides são eficazes no 30 tratamento de exacerbações ativas e podem até manter a remissão; azatio- prina, 6-mercaptopurina e metotrexato têm também mostrado êxito em paci- entes que requerem administração crônica de corticoesteroides; fármacos antidiarreicos podem também fornecer alívio sintomático em alguns pacien- tes; terapia nutricional ou dieta elementar podem melhorar a condição nutri- cional de pacientes e induzir melhora sintomática da doença aguda; antibió- ticos são usados no tratamento de crescimento excessivo secundário bacte- 5 riano no intestino delgado e no tratamento de complicações piogênicas. A- gentes quimioterápicos para IBD incluem ainda agentes biológicos e outros como segue: anticorpos anti-beta7 (vide, por exemplo, W02006026759), anticorpos anti-alfa4 (tais como ANTEGEN®), anticorpo anti-TNF (REMICA- DE®)) ou compostos não-protéicos incluindo sem limitação os compostos de
5-ASA ASACOL®, PENTASA®, ROWASA®, COLAZAL®, e outros compostos, tais como Purinetol e esteroides, tais como prednisona. Exemplos de agen- tes quimioterápicos para tratamento do câncer incluem hidroxiureiataxanos (tal como paclitaxel e doxetaxel) e/ou antibióticos antraciclina; agentes alqui- lantes, tais como tiotepa e CYTOXAN7 ciclosfosfamida; alquil sulfonatos, tais 15 como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas, tais como benzo- dopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotio- fosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9-tetra-hidrocanabinol (dronabinol, MARIN0L7); beta- 20 lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; uma camptotequina (inclu- indo o análogo sintético topotecano (HYCAMTIN7), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR7), acetücamptotequina, escopoiectina, e 9-aminocampto- tequina); briostatina; calistatina; CC 1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; te- 25 niposídeo; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolas- tatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos KW 2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas nitrogenadas, tais como clorambucil, clornafazina, clorofosfamida, estramus- tina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloreto de óxido de mecloretamina, 30 melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, uracil mostarda; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, tais como os antibióticos enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama
Il e caliqueamicina ômega Il (vide, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. En- gl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperami- cina; bem como neocarzinostatina cromófora e antibióticos cromóforos rela- 5 cionados a cromoproteína enedina), aclacinomisinas, actinomicina, autrami- cina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, car- zinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6- diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMICINA7 (incluindo morfoli- no-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e 10 deoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicína, marcelomicina, mitomicinas, tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, oli- vomicinas, peplomicina, potíircmicina, puromicina, queiamicina, rodorrubici- na, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zor- rubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); aná- 15 Iogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, tri- metrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azaciti- dina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enoci- tabina, floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dro- 20 mostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais, tais co- mo aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aidoíosíamida; ácido aminolevulíni- co; eniluracil; ansacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; eto- 25 glucide; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidainina; maitansinoides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopi- danmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etil- hidrazida; procarbazina; complexo polissacarídico PSK7 (JHS Natural Pro- ducts, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido te- 30 nuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmen- te toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretana; vindesina (EL- DISINA7, FILDESINA7); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por e- xemplo, TAXOL7 paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANETM livre de Cremophor1 formulação de paclitaxel em nanopartí- cula projetada em albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaum- 5 berg, Illinois), e TAX0TERE7 doxetaxel (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); clorambucil; gencitabina (GEMZAR7); 6-tioguanina; mercaptopuri- na; metotrexato; análogos de platina, tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN7); platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantro- na; vincristina (ONCOVIN7); oxaliplatina; leucovovina; vinorrelbina (NAVEL- 10 BINE7); novantrona; edaírexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoi- des, tais como ácido retinoico; capecitabina (XELODA7); sais, ácidos ou de- rivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos acima, tal como CHOP, uma abreviação 15 para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviatura para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATINTM) combinado com 5-FU e leucovovin.
O termo "citoquina" é um termo genérico para proteínas libera- das por uma população celular que atuam em outras células como mediado- res intercelulares. Exemplos de tais citoquinas são linfocinas, monocinas e hormônios polipeptídicos tradicionais. Incluídos entre as citoquinas estão o hormônio dc crescimento, tal como hormônio de crescimento humano, hor- mônio de crescimento humano N-metionil, e hormônio de crescimento bovi- no; hormônio da paratiróide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; prorela- xina; hormônios glicoproteicos, tais como hormônio estimulante de folículo (FSH), hormônio estimulante da tireóide (TSH) e hormônio Iuteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; prolactina; lactogênio placentário; fator de necrose tumoral -a e -β; substância inibidora mulleriana; peptídeo associado à gonadotropina de camundongo; inibina; ativina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento nervosos, tais como NGF-β; fator de cresci- mento plaquetário; fatores de transformação de crescimento (TGFs), tais como TGF-α e TGF-β; fator de crescimento similar a insulina -I e -II; eritro- poietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferons, tais como interferon -α, -β e -γ; fatores estimulantes de colônia (CSFs)1 tais como CSF de macrófago (M-CSF); CSF de granulócito e macrófago (GM-CSF); e CSF de granulócito 5 (G-CSF); interleucinas (ILs)1 tais como IL-1, IL-Ia1 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; um fator de necrose tumoral, tal como TNF-aou TNF-β; e outros fatores polipeptídicos incluindo LIF e Iigante a kit (KL). Como usado aqui, o termo citoquina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultu- ra de célula recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citoqui- 10 nas de seqüência natural.
O termo "inserção de pacote" é usado para referir-se a instru- ções habitualmente incluídas em pacotes comerciais de produtos terapêuti- cos, que contêm informação sobre as indicações, uso, dosagem, administra- ção, contra-indicações e/ou avisos acerca do uso de tais produtos terapêuti- cos.
"Epitélios", "epitelial" e "epitélio" referem-se à cobertura celular de superfícies corporais internas e externas (cutânea, mucosa e serosa), incluindo as glândulas e outras estruturas derivadas das mesmas, por e- xemplo, corneana, esofageana, epidérmica, e células epiteliais do folículo capilar. Outro tecido epitelial exemplar inclui: epitélio olfatório - o epitélio pseudoestratificado de revestimento da região olfatória da cavidade nasal, e contendo os receptores para o sentido do oiíaio; epitélio glandular - o epitélio composto de células epiteliais escamosas secretoras; epitélio escamoso - o epitélio compreendendo uma ou mais camadas celulares, a mais superficial das quais é composta de células achatadas, similares a uma escala ou simi- lares a uma placa. O epitélio também pode referir-se ao epitélio transicional, como aquele que é caracteristicamente encontrado revestindo órgãos ocos que estão sujeitos a grandes modificações mecânicas devido à contração e distenção, por exemplo, tecido que representa uma transição entre o epitélio escamoso estratificado e colunar.
O "estado de crescimento" de uma célula refere-se à taxa da proliferação da célula e/ou o estado da diferenciação da célula. Um "estado de crescimento alterado" é um estado de crescimento caracterizado por uma taxa anormal de proliferação, por exemplo, uma célula que exibe uma taxa de proliferação aumentada ou reduzida em relação a uma célula normal.
O termo "LY6" ou "polipeptídeo LY6" é usado aqui para referir-se 5 genericamente a qualquer dos homólogos mamíferos da família gênica LY6 mamífera. O termo "LY6" pode ser usado para descrever proteína ou ácido nucleico.
O termo "superexpressão" como usado aqui, refere-se a níveis de expressão gênica celular de um tecido que é maior que os níveis de ex- 10 pressão normais daquele tecido. O termo "subexpressão" como usado aqui, refere-se a níveis de expressão gênica celular de um tecido que é menor que os níveis de expressão normais para aquele tecido. No caso, a expres- são maior ou menor é significativamente diferente da expressão normal sob condições controladas do estudo.
Um "controle" inclui uma amostra obtida para uso na determina-
ção expressão de base ou normal ou atividade em um mamífero que não está experimentando IBD. Consequentemente, uma amostra de controle po- de ser obtida por vários meios incluindo a partir de tecido ou células não afe- tadas por inflamação e/ou IBD, UC ou CD (como determinado por técnicas- 20 padrão); células ou tecido não-IBD, por exemplo, de células de um indivíduo não experimentando IBD; de indivíduos que não têm uma IBD, doença de Crohn ou distúrbio de coüte ulcerativa; de indivíduos não-suspeitos de estar em risco de uma IBD, CD ou UC; ou de células ou linhagens celulares deri- vadas de tais indivíduos. Um controle também inclui um padrão anteriormen- 25 te estabelecido. Para ensaios, tais como ensaios de mRNA, incluindo ensai- os de microarranjo, um controle pode ser um controle universal. Tal controle universal refere-se à informação da expressão de RNA de um determinado gene LY6 obtido a partir de RNA isolado de uma mistura de tecidos saudá- veis ou de uma mistura de linhagens celulares derivadas de vários tecidos 30 tais como, sem limitação, RNAs de referência universais descritos aqui. Consequentemente, qualquer teste ou ensaio conduzido de acordo com a invenção pode ser comparado com padrão estabelecido e pode não ser ne- cessário obter uma amostra de controle para comparação cada tempo. Tabela 1
Tabk I
P
4
* C-C incrcased from 12 to 15
* Z is average of EQ
* B is avcrage of ND
* üiaich with stop is _M; stop-stop C0;J (jokcr) match ** O Adefine _M -8 P valuc of a malch wilh a stop *í int day(26]|26j - (
/* ABCDEFOHIJKLMNOPQRSTUVWXY.Z·/ PAV j2, 0.-2, 0. 0.-4, l,-l,-!,0.-l.-2.-l,0. Μ, I.0.-2, I. l.0.0,-6,0,-3.0). PBV (0,3,-4. 3,2.-5, 0.1.-2,0,0,-3,-2,2,Td1-1.1,0,0,0, 0,-2,-5,0,-3, 1),
P C V (-2.-4,1 S.-5.-5,-4,-3,-3,-2,0,-5.-6,-5.-4, M,-3.-5,-4,0,-2. 0,-2.-8,0,0,-5}, PDV 10.3,-5,4, 3,-6. 1.1,-2,0,0,-4,·3, 2, Μ.-Ϊ, 2.-1,0,0, 0,-2,-?, 0.-4,2),
P E V ( 0,2,-5, 3. 4,-5. 0. 1,-2,0,0,-3, -2.I.>1,-1,2,-1,0,0, 0.-2.-7,0,-4,3), PfV (-4.-5.-4,-6,-5, 9,-5,-2, 1,0,-5,2.0,-4, Μ,-5,-5,-4,-3,-3.0,-1,0, 0,7,-5). PGV ( 1,0,-3.1,0,-5, 5,-2,-3,0,-2.-4,-3, 0. jvl-l,-l.-3,1,0, 0.-I.-7,0,-5.0),
Γ H*/ (-1.1.-3.1, 1 ,-2.-2,6,-2,0.0.-2.-2.2, M, 0,3,2,-1,-1,0.-2.-3,0,0,21,
P 1 v (-1.-2.-2.-2.-2.1,-3,-2. 5,0,-2.2,2,-2ΓΜ.-2,-2,-2.-1,0,0,4,-5.0,-1,-2). P J V (0.0. 0.0.0. 0,0.0,0.0,0.0,0,0, M. 0.0. 0.0.0.0. 0. 0 n 0,0J, "S'| 0,-i. u. u,-i,-2, 0,-2,0, 5,-3,0. t; M1-I. 1.3.0, 0,0,-2.-3,0,-4,0}.
PLV (-2,-3,-6.-4,-3,2,-4,-2,2,0,-3,6.4.-3? M.-3,-2,-3,-3.-1, 0,2,-2,0,-1, -2j. P M V {-1 ,-2,-5,-3,-2,0,O,-2,2,0,0,4,6,-2,~M.-2,-1.0,-2,-1,0,2,-4,0,-2,-!).
P N V (0.2,-4, 2.1.-4, 0,2,-2,0,1.-3,-2,2, X-l, 1.0, 1. 0. 0,-2,-4,0,-2,1),
P O V (Μ. Μ, Μ, Μ, Μ. M, M._M, Μ, Μ, Μ. Μ, Μ, M,
0, "M, “M, "Mi."
PPV ( l,-l,-3.-l,-l,-5,-1,0,-2,0,-1,-3 ,-2,-1, M.6,0.0. 1,0. 0,-1,-6, 0,-5,0), PQV {0. 1.-5,2, 2.-5.-1,3.-2,0, I .-2,-1, 1,_M. 0,4. Ι,-Ι,-Ι, 0.-2.-5.0.-4,3!, PRV (-2,0.-4,-1.-1 .-4,-3,2,-2,0, 3,-3,0, 0, M1O1 1,<5.0,-1,0,-2,2,0,-4,0}. /*S*/ ( 1, 0,0,0.0.-3. 0.0.-3,-2. I. _M, 1,-1,0,2, 1,0,-1,-2,0,-3,0). PT/ ( 1,0.-2.0,0,-3.0,-1,0,0,0,-1,- i. 0,>1 0,-1,-1, I, 3. 0, 0.-5,0.-3,0).
P U V ) 0. 0, 0,0. 0.0,0.0,0,0,0, 0.0, 0, M. 0.0.0. 0.0,0, 0,0.0, 0,0). PVI 10.-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2,4,0.-2,2,2,-2, M.-l,-2,-2,-l, 0. 0,4,-6,0,-2,-2).
P W ·/ (-6,-5,-8,-7,-7, 0,-7.-3,-5.0,-3,-2,-4,-4!>!,-4.-5, 2,-2,-S, 0,-6,17.0,0.-6). P X */ (0.0,0.0,0,0.0,0.0,0,0.0,0,0, M. 0, 0,0,0,0,0,0,0.0,0,0),
P V V (-3,-3. 0.-4.-4.7,-5, Ó.-S, 0.-4,-1,-2,-5,_M,-í,-4.-4,-3,-3,0.-2,0, 0,10,-4), P ZV (0,1.-5.2. 3,-5.0,2.-2. 0. 0.-2.-1,1, M, 0,3.0, 0,0.0.-2,-6, 0,-4.4) Tabela 1 (cont.1)
Siiichide <stdto.h> Winclude <ctype.h>
Sdtfme MAXJMP Sdefine MAXGAP «define JMPS «define MX
Pdefine DMAT «define DMlS «define DlNSO Mtfme DINSl Wefmt PINSO Sdefine PINSl
16 /* max jumps in a dtag */
24 /* donl continue Io penalize gaps larger Ihan Ihis */
1024 /* max jmps in an path */
4 /* save if there‘s at least MX-1 bas.es since Iast jmp */
3 /* value of matching bases */
0 /* penalty for mismatched bases '1 8 /* penalty for a gap */
1 /* penalty per base V 8 /* penalty for a gap V
4 Λ penalty per residue ·/
struet jmp { short
n(MAXJMP); unsigned short x(MAXJMP);
/· size ofjmp (neg for dely) */ /* base no. of jmp in seq x */ /· Iiniitsseq to2Λ16-Ι ·/
siruct diag { int Iong shori
strueijmp
score: /* score at Iast jmp */
offset; /* oflset of prev block */
ijmp; /* current jmp index */
jp; /* Iist of jmps */
slruet path {
int spc: /* number Of Icading spaces *V short n|JMPS): /♦ size ofjmp (gap) ·:’ 3; int x(JMPS}; /* Ioc ofjmp (last elem before gap) ·/ char *ofile: /* output file name '/ char *namex(2]; /* seq nanies: getseqs( ) V char *prog; /* prog name forerr msgs */ char *seqx(2); /* seqs: getseqs() */ int dmax; /* bcstdiag: nw() */ int dmaxO: /* final diag V int dna; /* set tf dna: main() */ int endgaps; /· set if penalizing end gaps */ int gapx, gapy; t* total gaps in seqs */ int IcnO, Ienl: /* seq Iens */ IRt ngapx,ngapy; /* total size of gaps V int smax; Λ max score: nw( ) */ int *xbm; Λ bilmap for matching */ Iong offset; /* current offset in jmp file */ strurf flifX* r noids diagonais V ---c struet path PPÍ2); /* holds path for seqs ·/ char *cftüoc( ). *malloc(), *index(), *Strcpyí ): char *getseq(), *g_calloc(); Tabela 1(cont.2)
/* Ncedlcman-Wunsch alignment program “ usage: progs file I file2
* wbcrc file) and file2 are two dna ortwo proteinscquences.
* Tbc scquencts can bc in upper* «r kmer-case an may coniain ambiguity
* Any Iines bctimning Nvith *>' or V are ignorcd
* Max file Icngth is 65535 (Itmited by unsigned short x in the jmp struet)
* A sequence wiih 1/3 ca more of its dements ACOTU is assumed to be DNA
* Output is in thc file "ai ign. out~
*
* Hic program mny creaíé n tmp file in /tmp to hold inf© ahcwi frocebacfc.
* Original vcrsíon deveioped iinder BSD 4.3 On a vax 8650 ·/
#i»ciutie "nw.h" flíndude "dfly.h"
jtjitic dbvalj26) *· (
T.l4,2,13.0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,?,9,0,10,0
Ϊ;
slattc pbval|26]~{
T, 2|( 1«('DVA'))|Í l <<(’N’*'A*))> 4,8,16,32,64,
128,256,0xFFFFFFF, i«50,1<<UJ<<12. )«13, l«)4,
]«I5. 1«I6, l«17, !«18, )«I9, l«20. I«2l, l«22,
I «23. I «24, Ι«25|(1«ΓΕ-1A'»!n«(‘Q-1A'))
};
mmn(ac, av)
int ac; char *av(l·
i
prog * av[0j; íf (ac !«3){
rprintRstdm^usagc: %s filei filc2\n*\ prog);
iprimftstderr^vvhere íilcl and fric2 are two dna or fwo protein sequences.Sn"); íprimll stíterr.Tlic sequences Can bc ín upper- or lower-caseta**); íprintffstdeiT^Any Iines bcginning with Y or *<* are ignoredW); íprimflstdcn^Output is in Hie file V'aVign.ou\Wi,‘); exH(l);
\
namexfO] * av(I];
namcx[l]- av(2]:
seqxfO] β gctseq(naniex{0). AlenO);
scqxj I ] * getseq( namexj 1 j, Akm I);
xbrn ** (dna)? .dbval: .pbvah
cndgaps «0; f* 1 io pcnaJizc cudgaps */
ofile - “align.our; Λ ouipúi file */
nw(); f* fill in the motrix. gct lhe poasibic jmps */
readjmpM ): /* get the actual jmps ·.* print(); /* print xtais, alignment *í
ciean«p<0); /* unÍinfc any tmp files ·/
main Tabela 1 (cont.3)
/* do lhe alignment. renmi besl score: main()
* dna: valucs in Fitch and Smith, PNAS, 80, 1382-1386, 1983
* pro: ΡΛΜ 250 values
* Wlien scores arc equal, we prefer misroatchcs Io any gap, prefer
* a new gap Io exiending an ongoing gap. and prefer a gap in secjx
* Ia a gap in seq y.
*/
nw() nw
(
char *px, *py; /* seqs and ptrs */ int 'ndely, *<kly; mt ndclx, delx; /* keep track of delx ·/ int •tmp; P for swapping rowO, rowl ·/ JJJt mis; t" score for each type */ int insO, ins I; P insertion pennltjes */ regisier id: /· diagonal index */ r cgisier ü; P jmp index */ register *colO. “coll; P score for curr, Iasl row V register xx. yy; P index imo seqs ·/ dx *■ (Sirucl diag *)g_eaIloc(”co get diaRs", lenO-Henl+1, M*«if(struet disg));
ndely - (in* *)g_c.ilIoc(''ici gct ndely“, lenl+l, $i«of(inl)); dely ® (int *)g_calloc{"K> gel dely”, lenl+l. Sizeof(Int)): colO = (int *)g_calloc(Mto gel colO”. lenl + l, siieoflint)): coll = (int *)g_calloc("togeicoll", lenl+l, sizcoffínt)); insO = (dna)? DINSO : PINSO; insl-(dna)?DINSi : PrNSI;
sniax - -10000;
if (endgaps) (
for (colOfOJ» dely(O) - -insO, yy = 1; yy <- Ien I; yy++) { eolOfyy] * dcly[yy) «■ col0[yy-l J · insl; ndely(yy) «yy;
}
colO(O) = 0; /* Waterman Bull Matli Biol 84 */
i
else
for (yy **1; yy <= Ienl; yy++) dely[yy] = -insO;
/* fill in match matrix *7
for (px - Seqx(O), xx = 1; xx <* IenO; px++, xx++) {
Λ inilializc first entry in col */
if (endgaps) {
if(xx-» I)
col 1(01 ss (IiiK- Mr -(í««o+ir.sl);
el»
eolIfO) « delx = eolOfO] - insl; ndelx c' xx;
)
ebe {
col l(0] = 0: delx »> -insO; ndelx = 0;
) Tabela 1 (cont.4)
for (py - scqx[ 1J, yy * }; yy <« Ien I; py++, yy*-+) { mis * coiO[yy-]J;
If (dna)
mis +«*{xbfní*px-*A lJ^bcbmfePy-tA*])? DMAT: DMIS;
cise
mis +· _day [*px -’A'J [* py-'Λ');
/* updaic penalty for dei in x seq;
* favor new dei over ongong dei
* ignore MAXGAP ifweíghting endgaps ·/
if (endgaps f! ndelytyy] < MAXGAP) {
If (coK>lyyJ - insO >= delylyyj) {
dtly(yy) * coíO(yy] * (imO+insl); ndelyfyyj» I;
) ebe í
dclyíyy] -* Insl; ndclyfyyj++;
)
J else \
if <colO[yy] - (insCH-jns l) >- dcly(yyj) {
delylyyj **· cofOjyy] · (ínsíHinsl); ndelylyy) * 1;
} eta
ndelvlwl++’
Ϊ
/· updatc penalty for dei in y seq;
* favor new dei over ongong de!
*/
if (endgaps || ndelx < MAXGAP) {
if (collJyy-1] - insO >* delx) {
delx » eoll[yy*lJ - (insCH-insl); ndelx - J;
}else{
delx insl; ndelx
}
) {
If (col 1 [yy-13 * Ons(HinsJ) >* delx) {
delx * col 1 |yy- IJ «·CinsO-Hns I); ndelx ■* 1;
) the
ndelx+*;
}
/· pick Uk maximum score; wcVe favoring
* mis nver «ny dei and delx over dely ·/ Tabela 1 (cont.5) id “ xx -yv+ Ienl - 1;
If (mis >” delx && mis >= dcly(yyj) coll(yy) * mis; else if (delx >=■ dely(yyj) { col Ifyy)*1 delx; íj “dxfidj.ijmp;
if (dx(W].jp.n[0J && (!dna g (ndelx >= MAXJMP && xx > dxjid).jp.x{ij]+MX) Il mis > dxjid).score+DINSO)) ( dx[id].ijmp++; if (++ij >- MAXJMP) { writejmps(id); ij - dx[id).íjnip « 0; dxjidj.offsct = offset;
offset +* siztof(struct jmp) + sizeoí(offeet);
)
)
dx[id].jp.nfij) = ndelx; dx|id]\jp.x|ijj - xx: dxjídj .score - delx;
)
else j
col IjvyJ * /|e?y[yy];
ij“dx(id).ijmp; if (dx|id].jp.n[0j && (!dna || (ndely[yy) >- MAXJMP
&& xx > dx[idJ.jp.x[ij]+MX) I mis > dx[id].score+DlNSO)) (
dx(id].ijmpW;
if (++ij >» MAXJMP) ( writejmpsíid); ij *> dx|id).ijmp ■ 0; dx[id].oflset - offset;
offset +*■ sizeoftstructjmp) + sizeofíoffset);
)
)
dx|id)jp.n[ij] - -ndelylyy); dxftdj.jp.xf ijj - xx; dx(idj.scorc = delyjyy);
If (xx — IenO && yy < lenl) {
/* Iest col */
If (endgaps)
colI[yy] -* insOrinst*(lenl-yy); if (col Ifyy ] > smax) (
smax = coll(yy); dmax «id;
>
>
if (endgaps && xx < IenO)
co!! [yy- j J -" insO+ins IiOenO-XX); if (col I (yy-1) > smax) {
smax *= col I [yy-1}; dmax = id;
}
tmp = colO; colO = col I; col I = tmp;
(void) frce((char *)ndcly);
(void) free((cbar *)dely);
(void) frce((char *)co!0);
(void) trce((chor *)cell); Tabela 1 (cont.6)
* print() -- only roulinc visible outside this module
*
* slalíc:
* geima<() — trace back bcsi path, count matches: print{ )
* pr_align() -- print alignment of described in array p[]: print( )
* dumpblock( ) - dump a block of Iines with numbers, stars: pr_align()
* nums( ) - put out a number line: dumpblockf)
* puiiinef ) - pul out a Iine (name, (num], seq, |num]): dumpblock( )
* star$( ) - -put a line of stars: dumpblock( )
* siripnamef ) - strip any path and prefix from a seqname */
#include "nw.li"
Stlcfine SPC 3
Sdefme P^LINE 256 /* maximum output Iinc */
Mdefme P SPC 3 !* space between name or num and seq ·/
extern
int oleií; /* set output line Iength V
FILE *fx; /' output file */
printl ) print
int Ix, ly, firslgap, Iastgap; /* overlap */
If ((fic “ fopenfolik·, "w*)) — 0) (
fprintflsidenr,"%s: can’i wrilc %s\n”, prog. ofíle); cleanup( I);
)
fprimfffx. "<first sequence: %s (Ienglh «= %d)\n". namcx(0], IenO): fprímflfx. "<second sequence: %s (length *= %d)\n", namcxjl], Icnl); olen · 60;
Ix *>IenO;
Iy « Ien I:
(irsigap - Iastgap * 0:
if(dmax <lenl - 1) { /'Ieadinggapinxlt/ pp|0].spc ~ firstgap = Ienl - dmax - 1;
Iy -= ppjOJ.spc;
else if (dmax > tent - I) ( /* Ieading gap in y */ ppf i j.spe * firstgup = dmax * (lent - 1);
Ix -*> pp[l].spc;
)
if (dnrnxO < IenO - 1) i !' trailing gap in x */ lastgap - IenO * dmaxO -1; ix lastgap;
)
else if (dmaxO > IenO - I) { /* trailing gap in y */
lastgap «=■ dmaxO - (IenO - I);
Iy -= lastgap;
!
getmatílx. Iy, ftrstgap, lastgap); praligní); Tabelai (cont.7)
/*
• trace back the bes< path, counl malchcs */
staríc
Ecimatdx, |y, firslgip, lastgap) geimai
Inl Ix, ly; /* "core” (minus endgaps) ·/
int firsigap, lastgap; /* Icading trailing overlap *7
{
inl nm. iO, il, sizO, sizl;
char om,x[32);
double pet;
register nO, nl;
register char *pO, *pl;
/* gel total matches, score
iO «i I - sizO = sizl * 0; pO = scqxJO) + ppf I].spc; p! =Seqxjl] ·< ppj0j.spc; nO » pp! 1 J.spe + 1; nl « ppjOj.spc + I;
nm *> 0;
whilt ( *p0 && *pl ) {
If(sizO) {
pl++;
nl++;
&ízO~;
)
else if (sizl) { pO-H-;
}
else {
nÕ++;
sizl*-;
If (xbm[*pO-'A‘)&xbm|*pI-'A’J) nm++; if (nO++ ·= pp[0|.x{iO))
sizO = pplO].n[iO++]; if(nl++*”pp(ljjt(ilj)
sizl * pp[!].n[iH-t-];
pO++;
pl++;
/* pet hnmoiogv:
■ if penalizing endgaps, base is lhe shorter seq
* else. knock ofiT werhangs and take shorter core
if (endgaps)
Ix ■>(IcnO < lenl)? IenO : Icnl;
else
Ix => (Ix < ly)? Ix : Iy; pcl <* I00.*(double)nm/(double)lx; fprimfffx. kUi");
fprintfffx, "<%d match%s in an overlap of%d: %.2f percenl similanlyln'1 nm, (nm “ 1)? "" ; "es", Ix, pcl); Tabela 1 (cont.8)
fprinií(fx, "<gaps in firsi Scquence: %d”, gapx); if(gapx) (
(void) sprinrfíouK, * <%d %s%s)',
ngapx, (dna)? "base':"residue*, (ngapx * fprmt(ífx,“%sH, outx);
• 1)?
fprintflfic.", gaps in second sequence: %d", gapy); if(gapy)!
( void) sprintfloutx, * (%d %s%s)”,
ngapy, (dna)? "baseTrcsidue", (ngapy «*= 1)?
(PrinIflfxj1Tifi", outx);
if (dna)
fprintf?fx,
"\n<5t'orc: %d (match ~ 54d, mismalcb * %d, gap penaltv * /W + %d per base)W, smax, DMAT, DM1S, 01NSO, DINS1);
d»
fprintflfx,
"\n<score: %d (DavhoffPAM 250 matrix, gap penalty *■ %d + %d per Tesidue)W, smax, P INSO. PINSl); if (endgaps)
fprintl(íx,
"«endeans prnsüíed. !efi cr.dgap: %ü tístís, rígm endgap: %d %s%s\n", firstgap,(dna)? “base* : "tcsidut",(firstgap“])?**: V. lastgap, (dna)? "base" : "residue*. (lastgap «“ 1)? : V);
else
fprimtifx, *<ctidg»ps not penatoed\n*)',
ítatic nm: P matches in core --- for checkmg ·/ St*ti< Imax; Λ lengths of stripped file names */ statíc Ut2I: Static nc[2]; f* number at start of current line ·/ static m{2j-. f* currtnt ciem number - for gapping *- Jtatic siz{2); static char *ps[2J; f* ptr to current denient */ static char •pof2|; f* ptr to next output char slot */ static char out|2][P_LrNl:j; /* output Iinc V static char $tar(P_L!NEJ; t* set by star$() V * print alignment of described in souct path pp[ J
stalic
pr aligní) i
ml
int
register for (i«
nn;
more;
i;
/* char count *
0, Imax « 0; i < 2; i++) { nn = Stripnamcf namcx(ij); if (nn > Imax)
imax - nn;
nc[i} = 1; ni[i) = l; siz[i]» ijlt) = 0; ps|i)- sctjxfi]; poli) = outfi];
...Rctmat
pralign Tabela 1 (cont.9)
for (nn * nm * 0, more - I; more;) { for (i* more * 0; i < 2; t++) {
/♦
* 4o wt havt more of thü scquence?
V
if (!*psfi I)
coorioer,
more++*
if(ppfij.spc) I /· Icadíng spece *t
•poí*}++ = ’ *i PPijJ-sPc-S
else if fsi2{s]) { f* in a *ap V "fcPOMhw- * v;
SizfO**;
}
else { /* «vc're pulling a seq elemeni
•poli) = 'psli);
If (islowert-psfiJ»
*ps[i)»touppcrt*ps[i]):
po[i)+-r;
ps[i]+*;
1'
* are wc al nexi gap for Ihis seq?
V
if (ni|i] «*« ppfi].x|ijIijJH r*
* vw need to merge ai! gaps
* at chis Iocaiion *1
S«W * ppf'l-n|ij|i|»+j;
"hilt (níjii -» pp[i].*lij[i)l)
SizfO *« pp[i]-ntÜ(')4H i;
)
η»!»]+*:
)
}
If (++nn “ olcn || !more &&. nn) { dumpblockf); for (í * 0; i < 2; H·*) pò|i) eOutJi];
nn« 0;
}
)
f*
* dump a Wock of Jines. inchxting numbets, stars: pr al»gn{ ) */
static
r”r””
regbter i:
for(Í « 0; i < 2; í++)
•po[ij- « VK;
.~pr_aligo
üumpb)oel< Tabela 1 (cont.10)
ϊ
(void) pulei’'n'. íx); for (i = 0: i < 2: i·*-*·) {
If (*out|í) && (-Outfi]!- ” j *(eofiJ) !-··))! if<i —0)
nuets(i): if(i — 0&&*ous[)}) uars(): putline(i);
If (í ■=“ 6&ic
fprintfffx, siar); íf fi — t)
noms(i);
5
)
P
* pul CTII a mrnibcr line; dumpbk>ck( )
*-/
stalk
num$(w)
ml ix: P írKlcx in oul{) holding jcq line *V
i
chur nlinefP_LINEJ:
rt£is«cr i. j;
ritiil« ffhas *pn, 'jK, “py;
for (pn *■ γ line, i -1); i < ImaxHjSI1C; i·*·+, pn+·*) *pn ~
for 0 * nc|ixj. py = ouijtxj; *py; py-*+, pn^-+) {
If (*p.v = ’· I! *py «*-·)
*pft - · *;
eteí (
)
if <5%I0 — 0 IHi *· 1 && ncjixj !«!))( j = (i <d)?-í ;i; for (px = pn;j;j/= 10, px·-) •px»j%IO + O·;
tf(i <0)
■px - V;
Hsc
•pn - ’ *;
í*+:
•pn - "C; nc|btj * fe
for (pn = nlinc: *pn; pn-·-+)
(void) putc( *pn, fsí);
I void) putcT«i\ ft>;
)
P
~ pui ou! â line (na.Dc. [num), seq, [num]): dumpblockf)
V
static
ptillinrfix) putlinr
ínl ix:
í Tabela 1 (cont.11)
...putlinc
int í;
regist«r cbar *px;
for (px » namexfix}, i * 0; *px && ·ρχ != px++, i++)
(void) puic(*px, fx);
for (: i < jmax+F_SPC; i++)
(void) pütc(‘ \ fx);
/* these count from 1:
* ni() is currait clcmcnl (from t)
• nc[] is number at stan of ciinent tine
»/
for (px ** out(ix); *px; px++)
(void) putc(*px&0x7F. Jk);
(void) putc('Hn\ fx);
/·
* put a line of stars (seos alwavs in om[0], etüj!]): dísmpbÍoeW)
♦/
siatic
starsf) stars
{
inl i;
register char *p0, *pl, cx, *px;
if(!*oul(0] (I Cout(O) =» * ’ && *(po[0J) —'') Il !•outfi) S Coiitl I) — * · && *(pofl]) —' ·)) return; px *> star;
for (i = Imax+PJSPC: i; i--)
•px++=
for (pO « out(O). p! =oul[i}; *pO&& ·ρ1; pO++, pl++) { if (isalpha(*pO) && isalpba(*pl)) (
if (xbm(*pO-'A*)&xbm(*pl-"A'J) { cx « nni++;
)
rlse If (!dna AA _day(*pO-'A'j[*pl-'A') > 0) cx “ ”
else
cx «*'
!
else
Ca - j *px+-*- - cx;
}
♦px++ = ·\η';
•px = *\(T; Tabela 1 (cont.12)
/*
* strip path or prefix from pn, retum len: pr altgn()
*/
stalíc
stripnamc(pn) jiripnamt
ch*r *pn: t* file name (mav be path) */
f
rcgister char *px, *py; py - 0;
for (px « pn; *px; px++) if Cpx-=V)
py ”px + 1;
»*(py)
(void) strcpytpn. py); rcturn(strlen(pn));
) Tabela 1 (cont.13)
* cleanup( ) — cleanup my tmp file
* gctseqí) -- read in seq, set dna, len, max Icn
* g_calloc( ) - calloc{ ) witli mor checkin
* rcadjmps() -- gel lhe good jmps, from tmp file if ncccssary
* writejinps( ) - write a filled anay of jmps to a tmp file: nw( ) */
#include "nw.h"
Oinclude <sys/file.h>
char 'jname = 7tmp/homgXXXXXX“;
FiLE *(};
int clcanup();
Iong lseek():
It tmp file for jmps ·/ /* clcanup tmp file */
* remove anv tmp file if we blow
cle,inup(í)
int i;
<
■f(fj)
«xit(i);
(void) unlink(j»aine);
* read, retum ptr to seq. set dna. len. maxlen
* skip Iines starting with or >'
* seq in upper or Iower case */
char * geueq(file, len)
char *file; /* file name V inl *len; f* seq Ien */
char
reguter char int
FlLE
IineJ 1024), *pseq;
*px. *py:
naigc. tlen;
•fp:
if ((fp « fopen(file,"r")) 0) (
- - fprintHstderr,"%s: can’t read Ves1W", prog. file); exit(l);
)
tlen “ natgc 0;
while (fgetsfline. 1024, fp)) j
if Clinr -B ·;· jj *Hr- — '<* g ~ V) continue: for (px « line; *px != W; px··-+)
if (isuppcrÇpx) j| islower(*px)) tlen++;
í
if Upscq = malloc((unsignedXtlen+6))) == 0) {
íprintf)stderr."%s: malloc() failed to get %á bytes for %s\n", prog. tlen+6, file); e.\it(l):
I
pscq[0) - pscq[ 1) - pscq[2) - pseq(3) - W;
Page I of nwsubr.c
clcanup
getseq Tabela 1 (cont.14)
py« pseq + 4:
’len * tlen; rewind(lp);
wbile (fgctsfltnc, 1024, fp)) {
if CJine «= || Mine — '<' || Mine «= V) continue; for (px « line; *px !»rVn'; px-*-+·) { if (isupperCpx))
*py++ »*px;
else if (islowetCpx))
*py++ *= Ioupper(iPx);
if (in<tex("ATGCUVCpy-1)))
natgc++;
(
}
♦pv++ * ·\0';
*py«W;
(void) Ielose(Ip); dna ■> natgc > (tlen/3); rclurn(pscq+4);
)
cbar *
g_calloc(msg. nx. st)
clier ’ msg; /* program, calling routine */
int nx, sz; !' number and sizeof elentents ·/
f
ch»r *px. *calloc();
if ((px = ca!loc((unsign«d)nx, (unsigned)sz)) — 0) { if Cmsg) (
fprintttsldcn, "%s: g_ca!loc() failed %s (n=%d, sz*%d)'ui”. prog. msg. exit(l);
)
)
relurn(px);
)
/·
* get final jmps from dxf) or tmp file, set pp[), reset dmax; main()
♦/
readjmpsí)
(
int fd = -l;
int siz, tO.il ;
regisler i, j. xx;
(ij) ί
( void) fcloseflj);
if ((fd - opcn<jname. 0_RD0NLY, 0)) < 0) (
fprintffsldcrr, "%s: can't opcn() %s\n", prog. jname); cleanup^l);
}
i
for (i = iO = il = 0, dmaxO · dmax, xx <= IenO;; i+·+) {
Whilc(I)!
for (j ** dxfdmaxj.ijmp; j >*> 0 && dx(dmaxj.jp.x[j] >- xx; j~)
g.calloc
nx, sz);
readjmps Tabela 1 (cont.15)
...readjmps
if (> < O SíSí dx [dmax],offset && fj) {
(void) IsceMfd, dx(dmax].oflset, 0);
(void) read(fd, (char *)&dx(dmaxj.j|>, sizeofiMruci imp));
(void) iead(fd, (char *)àdx[dmax].oflfeeU siz*orçdxfdmax).otTs«»; dx(dmax] .ijmp * MAXJMP* 1;
i
che
break;
)
if (i >» JMPS) {
fprimflstdcTT, "%s: too many gaps in alignmtntArT. prog); cleanup(1);
}
if(Í>-0)í
siz * dx{dmax]jp.n[j}: xx “ dx(dmax).jp.x(j}; dmax +» siz:
if (siz < 0) { P gap in second */
pp[l|-n|il] = -si2. xx +« sÍ7.:
P id * xx * yy + 1 * I
V
pp[l}.x[» IJ * xx · dmax + Ienl- I;
gapy++;
ngapy -» siz.;
P ignore MAXGAP 'vhen doing endgaps V
siz * (-jáz < MAXGAP jj endgaps)? -siz: MAXGAP; il++;
)
else If (siz > 0) { P gap in firsi seq */ pp[0].nfiÔl * siz; pp[0].x[i0]« xx; gapx++; ngapx *» siz;
P ignore MAXGAP when doing endgaps */
siz * (siz < MAXGAP Il endgaps)? siz: MAXGAP; iO++;
}
*
ebt
break;
J
P reverse lhe order of jmps
for (j» 0, i0~; i < iO; j++, iO**) {
i ciIVlOj np); ppíO].n[jj - pp(0j.nji0j; pp(0].n{»0J «i; i ' PP(0j.itü|: PPlOj.xü] - pp(0).x|i0|; pp(0].x[i0) - i;
}
íor(j « 0, i)—; j <il;j++, »!--){
i = pp[lj.n(j]; pp(l).nU) - pp()].njilj; pp[l]ji(il) - U
'" pplO*ül; ρρΠ1·*ϋ) * ρρΗΜ'Ι J: ppM W'0 “ i:
)
Ifffd >■= 0)
(void) close(fd);
if (5) (
(VOin) unltnküna·™); fj-0; offset = 0;
t Tabela 1 (cont.16)
/*
• wtite * Itlltd imp struet oflscl of Jhc prev onc (if tny): nw( }
V
vvriíejmpsOx)
int ix:
ch»r ‘mlctcmpí);
Sf(O) i
if (mkiemptjnamc) < 0) (
fprinlflstdcrr,"%»: can’i mktcmpí} %s\n’, firog, jnvne):
Ckanup(I);
tí((lj« fopcnCínanw, 1V*))- 0) {
fpnntfiíidcrr, "%s: c»n*t writt prog. jname); cxii( I )'■
}
i
(void) íwrite((ch»r * )&dxjix].jp. sÍMOÍ(struct jmp), 1.0);
(void) t'vritc((ch»r *)&dxjix].oftsct, «ii«if(dx[íx|.<>fí5tt), 1, fj),
3
Tabela 2
Referência XXXXXXXXXXXXXXX (Tamanho = 15 aminoá-
cidos)
Proteína de Comparação XXXXXYYYYYYY (Tamanho = 12 aminoá- cidos)
% identidade da seqüência de aminoácidos =
(o número de resíduos de aminoácidos identicamente combinados entre as duas seqüências polipeptídicas como determinado por ALIGN-2) dividido (pelo número total de resíduos de aminoácidos do polipeptídeo de referên- cia)
= 5 dividido por 15 = 33,3%
Tabela 3
Referência XXXXXXXXXX (Tamanho = 10 aminoá-
cidos)
Proteína de Comparação XXXXXYYYYYYZZYZ (Tamanho = 15 aminoá- cidos)
% identidade da seqüência de aminoácidos =
(número de resíduos de aminoácidos identicamente combinados entre as duas seqüências polipeptídicas como determinado por ALIGN-2) dividido (pelo número total de resíduos de aminoácidos do polipeptídeo de referên- cia)
= 5 dividido por 10 = 50%
Tabela 4
DNA de referência NNNNNNNNNNNNNN (Tamanho = 14 nucleotí- deos)
DNA de comparação NNNNNNLLLLLLLLLL (Tamanho = 16 nucleotí-
deos)
% identidade da seqüência de ácido nucleico =
(número de nucleotídeos identicamente combinados entre as duas seqüên- cias de ácidos nucleicos como determinado por ALIGN-2) dividido (pelo nú- mero total de nucleotídeos do DNA da seqüência de referência de ácido nu- cleico)
= 6 dividido por 14 = 42,9%
Tabela 5
DNA de referência NNNNNNNNNNNN (Tamanho = 12 nucleotí-
deos)
DNA de comparação NNNNLLLVV (Tamanho = 9 nucleotí-
deos)
% identidade da seqüência de ácido nucleico =
(número de nucleotídeos identicamente combinados entre as duas seqüên- cias de ácidos nucleicos como determinado por ALIGN-2) dividido (pelo nú- mero total de nucleotídeos do DNA da seqüência de referência de ácido nu- cleico)
= 4 dividido por 12 = 33,3%
Métodos Diagnósticos da Invenção
É ainda contemplado que o uso de agentes terapêuticos para IBD pode ser especificamente direcionado o distúrbios onde o tecido e/ou células afetados exibindo expressão aumentada de LY6 em relação ao con- 25 trole. Consequentemente, é contemplado que a detecção da expressão au- mentada de LY6 pode ser usada para detectar IBD, tal como CD ou UC, no tecido gastrointestinal de um mamífero e/ou identificar tecidos e distúrbios que se beneficiarão particularmente do tratamento com um agente terapêuti- co para IBD, incluindo um agente quimioterápico, útil para melhorar IBD, UC 30 e/ou CD em um paciente humano.
Em modalidades preferenciais, níveis de expressão de LY6 são detectados, pela detecção direta do transcrito qênico ou por detecção de níveis ou atividade proteicos. Transcritos podem ser detectados usando qualquer uma de uma ampla faixa de técnicas que dependem principalmente de hibridização ou sondas para os transcritos de mRNA de LY6, para cDNAs sintetizados a partir desse ponto, ou ao DNA onde a amplificação gênica de 5 LY6 está presente. Técnicas bem-conhecidas incluem Northern blotting, PCR por transcriptase reversa e análise por microarranjo dos níveis de transcrito. Métodos para detecção dos níveis de proteína LY6 incluem Wes- tern blotting, imunoprecipitação, eletroforese em gel de poliacrilamida em duas dimensões (2D SDS-PAGE - preferencialmente comparado contra um 10 padrão em que a posição das proteínas LY6 foram determinadas), e espec- troscopia de massa. Espectroscopia de massa pode ser ligada a uma série de etapas de purificação para permitir identificação de alto rendimento de muitos níveis proteicos diferentes em uma amostra particular. Espectrosco- pia de massa e 2D SDS-PAGE também podem ser usadas para identificar 15 modificações pós-transcricionais em proteínas incluindo eventos proteolíti- cos, ubiquitinação, fosforilação, modificação lipídica, etc. A atividade de LY6 também pode ser avaliada pela análise da ligação ao DNA substrato ou ati- vação transcricional in vitro de promotores alvo. Ensaio de mobilidade em gel, ensaios de footprinting de DNA e ensaios de ligação cruzada DNA- 20 proteína são todos métodos que podem ser usados para avaliar a presença de uma proteína capaz de ligação a sítios de ligação Gli no DNA. J Mol. Med 77 (6):459-68 (19S9); Ceil 100 (4): 423-34 (2000); Development 127 (19): 4923-4301 (2000).
Em certas modalidades, os níveis de transcrito de LY6 são me- 25 didos, e tecidos doentes ou desordenados que mostram significativamente níveis elevados de LY6 em relação ao controle são tratados com um com- posto terapêutico para IBD. Consequentemente, níveis de expressão de LY6 são uma medida diagnostica potente para determinação se um paciente está experimentando IBD e se aquele paciente deveria receber um agente tera- 30 pêutico para IBD.
Composições de Anticorpo para Uso nos Métodos da Invenção
A. Anticorpos AntiLY6 Em uma modalidade, a presente invenção fornece o uso de anti- corpos antiLY6, que podem encontrar uso aqui como agentes terapêuticos, diagnósticos e/ou prognósticos na determinação da existência, gravidade e/ou prognóstico do curso de doença de uma doença inflamatória intestinal, tal como UC. Anticorpos exemplares que podem ser usados com tais objeti- vos incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecífi- cos, e heteroconjugados. O termo "anticorpos" algumas vezes também inclui fragmentos de ligação ao antígeno. Anticorpos antiLY6 estão disponíveis comercialmente, tal como por exemplo, de R&D Systems, Minneapolis, MN. Anticorpos que ligam-se especificamente à LY6 como antígeno podem ser obtidos comercialmente ou preparados por métodos padrão conhecidos na técnica de química de anticorpo e proteína para uso no método da invenção. Anticorpos para LYPD1 são descritos, por exemplo, na Patente Norte- americana 7.144.990, a patente descritas por meio deste é incorporada por referência em sua totalidade.
1. Anticorpos Policlonais
Anticorpos policlonais são preferencialmente construídos em animais por injeções múltiplas subcutâneas (sc) ou intraperitoniais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno rele- 20 vante (especialmente quando peptídeos sintéticos são usados) a uma prote- ína que é imunogênica nas espécie a ser imunizada. Por exemplo, o antíge- no pode ser conjugado a hemocianina do molusco Keyhoie iimpet (KLH), albumina sérica, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja, usando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, éster maleimido- 25 benzoil sulfosuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N- hidroxisuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são diferentes grupos alquila.
Animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imuno- gênicos, ou derivados por combinação, por exemplo, 100 pg ou 5 pg da pro- teína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução intradermi- camente em múltiplos sítios. Um mês depois, os animais são estimulados com 1/5 a 1/10 da quantidade original do peptídeo ou conjugado em adju- vante completo de Freund pela injeção subcutânea em múltiplos sítios. Sete a 14 dias depois, os animais são sangrados e o soro é analisado para título de anticorpo. Animais são estimulados até os platôs de título. Conjugados 5 também podem ser feitos em cultura celular recombinante como fusões pro- teicas. Além disso, agentes de agregação, tais como alume são apropriada- mente usados para aumentar a resposta imune.
2. Anticorpos Monoclonais
Anticorpos monoclonais podem ser construídos usando o méto- do de hibridoma descrito primeiro por Kohier ei ai., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser contruídos por métodos de DNA recombinante (Patente Norte- americana Número 4.816.567).
No método de hibridoma, camundongo ou outro animal hospe- deiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado como descrito acima 15 para obter linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que ligar-seão especificamente à proteína usada para imunização. Alternati- vamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Após imunização, linfóci- tos são isolados e logo fusionados com uma linhagem celular de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol, para for- 20 mar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma preparadas dessa forma são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado meio o qual preferencialmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivên- 25 cia das células de mieloma não-fusionadas, parentais (também referida co- mo parceiro de fusão). Por exemplo, se as células de mieloma parentais sem enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT ou HPRT), meio de cultura seletivo para hibridomas tipicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, e timidina (meio HAT), substâncias que previnem o crescimen- 30 to de células deficientes em HGPRT.
Células de mieloma de parceiro de fusão preferenciais são aque- las que se fusionam eficientemente, suportam alto nível de produção estável do anticorpo por células produtoras de anticorpo selecionadas, e são sensí- veis a um meio seletivo que seleciona contra as células parentais não- fusionadas. Linhagens celulares de mieloma preferenciais são linhagens de mieloma murino, tais como aquelas derivadas de tumores de camundongo 5 MOPC-21 e MPC-11 disponíveis em Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia USA, e SP-2 e derivados, por exemplo, células X63- Ag8-653 disponíveis em American Type Culture Collection, USA. Linhagens celulares de mieloma humano e de heteromieloma camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais huma- 10 nos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur ei al., Monoclonal An- tibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Mareei Dekker, Inc, New York, 1987)).
Meio de cultura no qual células de hibridoma estão crescendo é analisado para produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antí- 15 geno. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos mono- clonais produzidos por células de hibridoma é determinada por imunoprecipi- tação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente de ligação enzimática (ELISA).
A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal, por exemplo, pode ser determinada pela análise Scatchard descrita em Munson et al., A- nal. Biochem., 107:220 (1980).
Uma vez que células de hibridoma que produzem anticorpos de especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas são identificadas, os clo- nes podem ser subclonados por procedimentos de diluição Iimitante e culti- 25 vados por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados com esta finalidade incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. A- lém disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumo- res ascíticos em um animal, por exemplo, pela injeção i.p. das células em 30 camundongos.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são a- propriadamente separados do meio de cultura, fluidos ascíticos ou soro por procedimentos de purificação de anticorpo convencionais tais como, por e- xemplo, cromatografia por afinidade (por exemplo, usando proteína A ou pro- teína G-Sefarose) ou cromatografia de troca iônica, cromatografia por hidro- xilapatita, eletroforese em gel, diálise, etc.
5 DNA de codificação dos anticorpos monoclonais é prontamente
isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de ligação especifica- mente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos mu- rinos). As células de hibridoma servem como uma fonte preferencial de tal 10 DNA, Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS símias, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), ou células de mieloma que não produzem de outra maneira proteína de anticor- po, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras 15 recombinantes. Artigos de revisão em expressão recombinante em bactérias do DNA que codifica o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Im- munol., 5:256-262 (1993) e Plückthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992).
Em uma modalidade adicional, anticorpos monoclonais ou frag- mentos de anticorpo podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago de anticorpo geradas usando técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al.. J. Mol. Biol,. 222:581-597 y 1 Ôvl j CiOoo revem o isolem lenio ue anticorpos murinos e humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fago. Publica- ções subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa nM) pela mistura de cadeias (Marks et al., Bio/Technoloqy. 10:779-783 (1992)), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construção de bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al·, Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Dessa maneira, estas técnicas são alternativas viáveis para técnicas de hibridoma para anticorpo monoclonal tradicional de isolamento de anticorpos monoclo- nais.
O DNA de codificação do anticorpo pode ser modificado para produzir polipeptídeos quiméricos ou de fusão a anticorpo, por exemplo, por substituição das seqüências do domínio constante da cadeia pesada e ca- deia leve humana (CH e CL) por seqüências murinos homólogas (Patente Norte-americana Número 4.816.567; e Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sei.
5 USA, 81:6851 (1984)), ou por fusão da seqüência de codificação da imuno- globulina com toda ou parte da seqüência de codificação de um polipeptídeo não-imunoglobulina (polipeptídeo heterólogo). As seqüências polipeptídicas não-imunoglobulina podem substituir pelos domínios constantes de um anti- corpo, ou são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio combinante 10 de antígeno de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um sítio de combinação a antígeno tendo especificidade por um antígeno e outro sítio de combinação a antígeno tendo especificidade por um antígeno diferente.
3. Anticorpos Humanos e Humanizados Os anticorpos antiLY6 úteis na prática da invenção podem com-
preender ainda anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Formas humanizadas de anticorpos não-humanos (por exemplo, murinos) são imu- nogiobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de anti- 20 corpos de ligação ao antígeno) que contêm a seqüência mínima derivada a partir da imunoglobulina não-humana. Anticorpos humanizados incluem imu- noglobulinas humanas (anticorpo recipiente) no qual os resíduos de uma região de determinação de complementariedade (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não-humana (anti- 25 corpo doador), tais como camundongo, rato ou coelho tendo a especificida- de, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, os resíduos da estrutura Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não- humanos correspondentes. Anticorpos humanizados também podem com- preender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recipiente 30 nem na CDR importada ou seqüências da estrutura. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondentes àquelas de uma imunoglobulina não- humana e todas ou substancialmente todas as regiões de FR são aquelas de uma seqüência consenso à imunoglobulina humana. O anticorpo humani- zado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma 5 região constante da imunoglobulina (Fe), tipicamente aquela de uma imuno- globulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struet. Biol., 2:593-596
(1992)].
Métodos para humanização de anticorpos não-humanos são bem-conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele a partir de uma fonte que é não-humana. Estes resíduos de aminoácidos não-humanos muitas vezes são referidos como resíduos "de importação", que são tipicamente tomados de um domínio variável "de importação". Humanização pode ser essencial- mente realizada seguindo método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), pela substituição das CDRs ou seqüências de CDR de roedores pelas seqüências corresponden- tes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos "humani- zados" são anticorpos quiméricos (Patente Norte-americana Número 4.816.567), em que substancialmente menos que um domínio variável hu- mano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, anticorpos humanizados são anticorpos tipicamen- te humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resí- duos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
A escolha de domínios variáveis humanos, ambos leve e pesa- do, para serem usados na criação dos anticorpos humanizados é muito im- portante para reduzir antigenicidade e resposta HAMA (anticorpo antica- 30 mundongo humano) quando o anticorpo é destinado para uso terapêutico humano. De acordo com o chamado método de melhor ajuste ("best-fit"), a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é classificada con- tra a biblioteca inteira de seqüências conhecidas de domínio variável huma- no. A seqüência de domínio V humano que é muito próxima àquela do roe- dor é identificada e a estrutura humana (FR) aceita pelo anticorpo humani- zado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 5 196:901 (1987)). Outro método usa uma estrutura particular derivada da se- qüência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particu- lar de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).
É ainda importante que anticorpos sejam humanizados com re-
tenção da alta afinidade de ligação ao antígeno e outras propriedades bioló- gicas favoráveis. Para alcançar esta meta, de acordo com um método prefe- rencial, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das seqüências parentais e vários produtos humanizados conceituais 15 usando modelos tridimensionais das seqüências parentais e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e são familiares para aqueles versados na técnica. Programas de computador estão disponíveis nos quais ilustram e expõem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de seqüências de imunoglobulina candidatas sele- 20 cionadas. Inspeção destas exposições permite análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, análise de resíduos que influem na capacidade da imunoglobulina candi- data de ligar-se a seu antígeno. Deste modo, resíduos de FR podem ser se- lecionados e combinados a partir do recipiente e seqüências de importação 25 de modo que a característica de anticorpo desejada, tal como afinidade au- mentada para o antígeno(s)-alvo, seja alcançada. Em geral, os resíduos de região hipervariável estão diretamente e ainda mais substancialmente envol- vidos na influência da ligação à antígeno.
Várias formas de anticorpos de anticorpo humanizado antiLY6 são contempladas. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser um frag- mento de anticorpo, tal como um Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agente(s) citotóxico a fim de qerar um imunoconjuaado. Alterna- tivamente, o anticorpo humanizado pode ser um anticorpo intacto, tal como um anticorpo IgGI intacto.
Como uma alternativa para humanização, anticorpos humanos podem ser gerados. Por exemplo, é possível agora produzir animais trans- gênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, na imunização, de produção de um repertório total de anticorpos humanos na ausência de pro- dução de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota do gene da região de junção da cadeia pesada de anticorpo (Jh) em camundongos mutantes de linhagem germinativa e quimérica resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógena. Transferência da ma- triz gênica de imunoglobulina de linhagem germinativa humana em tais ca- mundongos mutantes de linhagem germinativa resultará na produção de an- ticorpos humanos no desafio de antígeno. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); Pa- tentes U.S. Números 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.545.807; e WO 97/17852.
Alternativamente, tecnologia de exposição de fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990]) pode ser usada para produzir anticorpos e fragmentos de anticorpo humanos in vitro, a partir de repertórios gênicos de domínio variável (V) da imunoglobulina a partir de doadores não-imunizados. De acordo com esta técnica, genes do domínio V do anticorpo são cionados na estrutura em um maior ou menor gene de revestimento proteico de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e expostos como fragmentos de anticorpos funcionais na superfície da partícula do fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita simples do genoma de fago, seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resul- tam na seleção do gene de codificação do anticorpo exibindo aquelas pro- priedades. Dessa forma, o fago mimetiza algumas das propriedades da célu- la B. Exposição de fago pode ser realizada em uma variedade de formatos, revisados em, por exemplo, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Cur- rent Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Várias fontes de seg- mentos de gene de V podem ser usadas para exposição de fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolaram uma matriz diversa de anticorpos anti-oxazolona de uma pequena biblioteca combinatória randômica de genes de V derivados dos baços de camundongos imunizados. Um repertório de 5 genes de V de doadores humanos não-imunizados pode ser construído e anticorpos para uma matriz diversa de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados essencialmente após as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734
(1993). Ver, também, Patentes U.S. Números 5.565.332 e 5.573.905.
Como discutido acima, anticorpos humanos também podem ser
gerados por células B ativadas in vitro (vide Patentes U.S. Números 5.567.610 e 5.229.275).
4. Fragmentos de Anticorpo
Em certas circunstâncias, há vantagens do uso de fragmentos de anticorpo, em vez de anticorpos inteiros. O tamanho menor dos fragmen- tos leva em conta rápida depuração, enquanto mantém especificidade de ligação ao antígeno similar da molécula de tamanho total correspondente, e pode levar a acesso melhorado a tumores sólidos.
Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de frag- mentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, por exemplo, Morimoto ei al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Entretanto, estes fragmen- tos podem ser produzidos agora diretamente por células hospedeiras re- combinantes. Fragmentos de anticorpo Fab, Fv e scFv podem ser todos ex- pressos e secretados por E. coli, dessa forma permitindo a fácil produção de grandes quantidades destes fragmentos. Fragmentos de anticorpo podem ser isolados de bibliotecas de fago de anticorpo discutidas acima. Alternati- vamente, fragmentos Fab1-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente ligados para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bi- o/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, frag- mentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente da cultura celular hospedeira recombinante. Fragmento Fab e F(ab')2 com meia-vida aumentada in vivo compreendendo resíduos de epitopo de ligação a receptor de salvamento são descritos na Patente Norte-americana Número 5.869.046. Outras técni- cas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para o 5 profissional versado. Em outras modalidades, o anticorpo de escolha é um fragmento de Fv de cadeia única (scFv). Ver WO 93/16185; Patente Norte- americana Número 5.571.894; e Patente Norte-americana Número 5.587.458. Fv e sFv são as únicas espécies com sítios de combinação intac- tos que são destituídos de regiões constantes; dessa forma, são adequadas 10 para ligação não-específica reduzida durante uso in vivo. Proteínas de fusão sFv podem ser construídas para produzir fusão de uma proteína efetora no terminal amino ou carbóxi de um sFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borre- baeck, supra. O fragmento de anticorpo também pode ser um "anticorpo li- near", por exemplo, como descrito na Patente Norte-americana Número 15 5.641.870, por exemplo. Tais fragmentos lineares de anticorpo podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
5. Anticorpos Biespecíficos
Anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidades de ligação a pelo menos dois epitopos diferentes. Anticorpos biespecíficos 20 exemplares podem ligar-se a antígenos separados ou ligar-se a dois epito- pos diferentes de um determinado polipeptídeo LY6 descrito aqui. Outros anticorpos podem combinar o sítio de ligação LY6 acima com um sítio de ligação de outra proteína. Onde o anticorpo biespecíficos é útil no método diagnóstico da invenção, o segundo braço de anticorpo pode ligar-se a um 25 polipeptídeo detectável. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados co- mo anticorpos de tamanho total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2).
Métodos para construir anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Produção tradicional de anticorpos biespecíficos de tamanho to- tal é baseada na coexpressão de dois pares de cadeia Ievecadeia pesada de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm especificidades diferentes (Mills- tein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Por causa da classificação randômi- co das cadeias pesadas e leves da imunoglobulina, estes hibridomas (qua- dromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo dife- rentes, das quais só uma tem a estrutura biespecífica correta. Purificação da molécula correta, que é normalmente feita por etapas de cromatografia por 5 afinidade, é bastante trabalhosa, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos em WO 93/08829, e em Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659(1991).
De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combina- ção antígeno-anticorpo) são fusionados a seqüências de domínio constante da imunoglobulina. Preferencialmente, a fusão é com um domínio constante da cadeia pesada de Ig, compreendendo pelo menos parte das regiões de dobradiça, Ch2 e Ch3. É preferencial ter a primeira região constante da ca- deia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação da cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. DNAs de codificação das fusões da cadeia pesada da imunoglobulina, se desejada, a cadeia leve da imuno- globulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são cotrans- fectados em uma célula hospedeira adequada. Isto fornece maior flexibilida- de no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos em modalidades quando razões desiguais das três cadeias polipeptídicas usa- das na construção fornecem o rendimento ótimo do anticorpo biespecífico
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duas ou três cadeias polipeptídicas em um vetor de expressão único quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em razões iguais resulta em altos rendimentos ou quando as razões não afetam significativa- mente o rendimento da combinação de cadeia desejada.
Em uma modalidade preferencial desta abordagem, os anticor- pos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada da imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço, e um par 30 de cadeia Ievecadeia pesada da imunoglobulina híbrida (fornecimento de uma segunda especificidade de ligação) em outro braço. Foi encontrado que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico de- sejado a partir de combinações de cadeia da imunoglobulina não-desejadas, já que a presença de uma cadeia leve da imunoglobulina em somente uma metade da molécula biespecífica fornece uma maneira fácil de separação. Esta abordagem é descritas em WO 94/04690. Para detalhes adicionais pa- 5 ra geração de anticorpos biespecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Me- thods in Enzvmoloqy 121:210 (1986).
De acordo com outra abordagem descrita na Patente Norte- americana Número 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de an- ticorpo pode ser projetado para maximizar a porcentagem de heterodímeros 10 que são recuperados a partir da cultura celular recombinante. A interface preferencial compreende pelo menos uma parte do domínio Ch3. Neste mé- todo, uma ou mais cadeias laterais menores de aminoácido da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maio- res (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de ta- 15 manho idêntico ou similar à grande cadeia(s) lateral são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo pela substituição de grandes cadeias late- rais de aminoácido com menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isto fornece um mecanismo para aumento do rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais não desejados, tais como homodímeros.
Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos de ligação cruzada
ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado nnrlP! spr Iinadn à avirlina n nutrn à hintina. Tais anticornos. nor exemnlo.
f-----w.--- . . --------------r___, f _ ( ,
foram propostos para direcionar células do sistema imune a células não- desejadas (Patente Norte-americana Número 4.676.980), e para tratamento 25 da infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, e EP 03089). Anticorpos heteroconjugados também encontram uso no presente método da invenção pelo fornecimento de múltiplos marcadores detectáveis (diferentes ou os mesmos) em cada anticorpo para ensaio de detecção melhorado. Anticorpos heteroconjugados podem ser feitos usando quaisquer métodos de ligação 30 cruzada adequado. Agentes de ligação cruzada adequados são bem- conhecidos na técnica, e são descritos na Patente Norte-americana Número 4.676.980, junto com diversas técnicas de ligação cruzada. Técnicas para geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpo também foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Brennan et al., Science 229:81 (1985) descrevem um procedimento em que 5 os anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados então são conver- tidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB 10 então é reconvertido no Fab-tio! pela redução com mercaptoetiiamina e é misturado com uma quantidade equimolar de outro derivado Fab1-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos po- dem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.
Progresso recente facilitou a recuperação direta de fragmentos 15 de Fab1-SH de E. coli, que pode ser ligado quimicamente para formar anti- corpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) des- crevem a produção de uma molécula de anticorpo biespecífico totalmente humanizado F(ab’)2. Cada fragmento de Fab' foi separadamente secretado a partir de E. coli e submetido à ligação química dirigida in vitro para formar o 20 anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico dessa maneira formado foi capaz de ligar-se a células que superexpressam o receptor de ErbB2 e célu- las T humanas normais, bem como provocam a atividade Iitica de iiníócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humano.
Várias técnicas para construção e isolamento de fragmentos de 25 anticorpo biespecífico diretamente a partir da cultura celular recombinante também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram pro- duzidos usando zíperes de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5):1547- 1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina a partir de proteínas Fos e Jun foram ligados às porções de Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão 30 gênica. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de dobra- diça para formar monômeros e então reoxidado para formar os heterodíme- ros de anticorpo. Este método também pode ser utilizado para produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia "diacorpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para construção de fragmentos de anticorpo biespecífico. Os fragmentos compreendem um Vh unido a um Vl por um Iigador que é muito 5 curto para permitir união entre os dois domínios na mesma cadeia. Conse- quentemente, os domínios Vh e Vl de um fragmento são forçados a juntar-se com os domínios Vh e Vl complementares de outro fragmento, por meio dis- so formando dois sítios de ligação ao antígeno. Outra estratégia para produ- ção de fragmentos de anticorpo biespecífico pelo uso de dímeros de cadeia 10 única Fv (sFv) também foi relatada. Ver Gruber ei al., J. immunoi., 152:5368 (1994).
Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et al., J. Im- munol. 147:60 (1991).
6. Anticorpos Multivalentes
Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou cataboli- zado) mais rápido do que um anticorpo bivalente por uma célula que expres- sa um antígeno ao qual os anticorpos ligam-se. Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (que são diferentes da classe 20 IgM) com três ou mais sítios de ligação ao antígeno (por exemplo anticorpos tetravalentes), que podem ser prontamente produzidos pela expressão re- comhinante de ácido nuclsico que codifica as cadeias poiipeptídicas do anti- corpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimeriza- ção e três ou mais sítios de ligação ao antígeno. O domínio de dimerização 25 preferencial compreende (ou consistem em) uma região Fc ou uma região de dobradiça. Neste cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais sítios de ligação a antígenos amino-terminal para a região Fe. O anticorpo multivalente preferencial aqui compreende (ou consistem em) três a aproximadamente oito, mas preferencialmente quatro, sítios de ligação ao 30 antígeno. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia po- lipeptídica (e preferencialmente duas cadeias poiipeptídicas), em que a ca- deia(s) polipeptídica compreende dois ou mais domínios variáveis. Por e- xemplo, a cadeia(s) polipeptídica pode compreender vD1-(X1)n-VD2-(X2)n- Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fe, X1 e X2 represen- tam um aminoácido ou polípeptídeo, e n é 0 ou 1. Por exemplo, a cadeia(s) 5 polipeptídica pode compreender: região de cadeia VH-CHI-Iigador flexível- VH-CHI-Fc; ou região de cadeia VH-CH1-VH-CH1-Fc. O anticorpo multiva- lente aqui preferencialmente ainda compreende pelo menos dois (e prefe- rencialmente quatro) polipeptídeos de domínio variável da cadeia leve. O anticorpo multivalente aqui pode compreender, por exemplo, de aproxima- 10 damente dois a aproximadamente oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos de domínio variável da cadeia leve contempla- dos aqui compreendem um domínio variável da cadeia leve e, opcionalmen- te, compreendem um domínio CL adicional.
7. Construção da Função Efetora Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com res-
peito à função efetora, por exemplo, para aumentar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antígeno (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser alcançado pela introdu- ção de uma ou mais substituições de aminoácido em uma região Fc do anti- 20 corpo. Alternativamente ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína pode ser introduzido na região Fe, por meio disso permitindo formação de ligação in- tercadeis de dissulfeto nesta região. O anticorpo homodimérico gerado des- sa forma pode ter melhorado a capacidade de internalização e/ou aumenta- do a morte celular mediada por complemento e citotoxicidade celular depen- 25 dente de anticorpo (ADCC). Ver Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodi- méricos com atividade antitumoral aumentada também podem ser prepara- dos usando Iigadores cruzados heterobifuncionais como descrito em Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, um anticorpo 30 pode ser projetado tendo regiões Fc duais e pode ter aumentado por meio disso capacidade de Iise por complemento e ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para aumentar a meia-vida séri- ca do anticorpo, cada um pode incorporar um epitopo de ligação a receptor de salvamento no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) co- mo descrito na Patente U.S. 5.739.277, por exemplo. Como usado aqui, o termo "epitopo de ligação a receptor de salvamento" refere-se a um epitopo 5 da região Fc de uma molécula IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, lgG3, ou IgG4) que é responsável por aumentar a meia-vida sérica in vivo da molécula IgG.
8. Imunoconiuqados
A invenção também faz parte de imunoconjugados compreen- dendo um anticorpo conjugado a um agente citotóxico, tal como um agente 10 quimioterápico, um agente inibitório de crescimento, uma toxina (por exem- plo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos da mesma), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado) e/ou um marcador detectável.
a. Agentes Quimioterápicos Agentes quimioterápicos úteis na geração de tais imunoconjuga-
dos foram descritos acima. Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas que podem ser usadas incluem cadeia diftérica A, fragmentos ativos de não-ligação da toxina diftérica, cadeia de exotoxina A (a partir de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de 20 modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de mo- mordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, geloni- na, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos. Uma variedade de radionuclídeos estão disponíveis para a produção de anticor- 25 pos radioconjugados. Exemplos incluem 212Bi, 131I1 131In, 90Y, e 186Re. Conju- gados do anticorpo e agente citotóxico são feitos usando uma variedade de agentes de ligação de proteína bifuncional, tais como n-succinimidil-3- propionato (2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésters (tais como dimetil adipimidato HCL), ésteres ativos (tais como 30 disuccinimidil suberato), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis- azida (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis- diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tais como tolieno 2,6-di-isocianato) e compostos de flúor bis ativos (tais co- mo 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopenta-acético 5 (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Ver W094/11026.
Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, tais como uma caliqueamicina, maitansinoides, um tricoteno, e CC1065, e os derivados destas toxinas que têm atividade de toxina, também são contemplados aqui.
B. Oligopeptídeos de Ligação à LY6
Oligopeptídeos de ligação à LY6 da presente invenção são oli- gopeptídeos que ligam-se, preferencialmente especificamente, a um polipep- tídeo LY6 como descrito aqui. Oligopeptídeos de ligação à LY6 podem ser quimicamente sintetizados usando metodologia de síntese de oligopeptídeo conhecida ou podem ser preparados e purificados usando tecnologia recom- binante. Oligopeptídeos de ligação à LY6 são normalmente de pelo menos aproximadamente 5 aminoácidos em tamanho, alternativamente pelo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64. 65, 66: 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 ami- noácidos em tamanho ou mais, em que tais oligopeptídeos que são capazes de ligação, preferencialmente especificamente, a um polipeptídeo LY6 como descrito aqui. Oligopeptídeos de ligação à LY6 podem ser identificados sem experimentação indevida usando técnicas bem-conhecidas. Neste sentido, é observado que as técnicas para selecionar bibliotecas de oligopeptídeo para oligopeptídeos que são capazes de ligar-se especificamente a um alvo poli- peptídico são bem-conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Patentes U.S. Números 5.556.762, 5.750.373, 4.708.871, 4.833.092, 5.223.409, 5.403.484,
5.571.689, 5.663.143; Números de Publicação PCT. WO 84/03506 e W084/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 82:178-182 (1985); Gey- sen et al., em Synthetic Peptides as Antigens1 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611- 5 616 (1988), Cwirla1 S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA1 87:6378; Lowman1 H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:8363, e Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:688).
Neste sentido, exposição de bacteriófago (fago) é uma técnica
bem-conhecida que permite selecionar grandes bibliotecas de oligopeptídeo para identificar membro(s) daquelas bibliotecas que são capazes de ligar-se especificamente a um alvo polipeptídico. Exposição de fago é uma técnica pela qual os polipeptídeos variantes são expostos como proteína de fusão 15 na proteína de revestimento na superfície de partículas bacteriófagas (Scott, J.K. e Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). A utilidade da exposição de fago está situada no fato que as grandes bibliotecas de variantes proteicas randomizadas seletivamente (ou cDNAs clonados randomicamente) podem ser rapidamente e eficientemente classificadas por aquelas seqüências que 20 ligam-se a uma molécula-alvo com alta afinidade. Exposição de bibliotecas de peptídeo (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6378) ou proteína (Lcwman, H.B. ei al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:8363) em 25 fago foram usadas para selecionar milhões de polipeptídeos ou oligopeptí- deos com propriedades de ligação específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2). Sorteamento de bibliotecas de fago de mutantes ran- dômicos necessita de uma estratégia para construção e propagação de um grande número de variantes, um procedimento para purificação por afinidade 30 usando o receptor-alvo, e um meio de avaliação dos resultados de enrique- cimentos de ligação. Patentes U.S. Números 5.223.409, 5.403.484,
5.571.689, e 5.663.143. Embora a maioria dos métodos de exposição de fago tenham usado fago filamentoso, sistemas de exposição de fago Iambdoide (WO 95/34683; Patente U.S. 5.627.024), sistemas de exposição de fago T4 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cancer Research, 58 (15): 3209- 5 3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65 (11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195 (2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) e sistemas de exposição de fago T7 (Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); Patente U.S. 5.766.905) também são conhecidos.
Muitas outras meinorias e variações do conceito de exposição
de fago básico foram desenvolvidas agora. Estas melhorias aumentam a capacidade de sistemas de exposição para selecionar bibliotecas peptídicas para ligação a moléculas-alvo selecionadas e expor proteínas funcionais com potencial de selecionar esta proteína para propriedades desejadas. 15 Dispositivos de reação combinatórios para reações de exposição de fago foram desenvolvidos (WO 98/14277) e as bibliotecas de exposição de fago foram usadas para analisar e controlar interações bimoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) e propriedades de peptídeos helicoidais constrito (WO 98/20036). WO 97/35196 descreve um método de isolamento de um 20 Iigante de afinidade no qual uma biblioteca de exposição de fago é contatada com uma solução na qual o Iigante ligar-se-á a uma molécula-alvo e uma segunda solução na qual o liganie de afinidade não ligar-seá à molécula- alvo, para isolar seletivamente Iigantes de ligação. WO 97/46251 descreve um método de seleção por afinidade de uma biblioteca de exposição de fago 25 randômico com um anticorpo purificado por afinidade e então isolando fago de ligação, seguido por um processo de microsseleção de fago por afinidade usando poços de microplaca para isolar fago de ligação de alta afinidade. O uso de proteína A de Staphlylococcus aureus como um marcador de afinida- de também foi relatado (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9). WO 97/47314 des- 30 creve o uso de bibliotecas de subtração de substrato para distinguir especifi- cidades enzimáticas usando uma biblioteca combinatória que pode ser uma biblioteca de exposição de fago. Um método para seleção de enzimas ade- quadas para uso em detergentes usando exposição de fago é descrito em WO 97/09446. Métodos adicionais de seleção de proteína de ligação especí- fica são descritos nas Patentes U.S. Números 5.498.538, 5.432.018, e WO 98/15833.
5 Métodos para geração de bibliotecas de peptídeo e seleção des-
tas bibliotecas também são descritos nas Patentes U.S. Números 5.723.286, 5.432.018, 5.580.717, 5.427.908, 5.498.530, 5.770.434, 5.734.018, 5.698.426, 5.763.192, e 5.723.323.
No aspecto, a presente invenção refere-se a Iigantes do polipep- tídeo LYPD5. A figura 32 demonstra isso mostrando células COS não- transfectadas (A) e células COS transfectadas com GLG-1 e marcadas com a proteína LYPD5-Fc. Em uma modalidade, o Iigante de LYPD5 é a glicopro- teína 1 localizada no complexo golgi (GLG-1) ou polipeptídeo e-selectina 1 (ESL-1) como mostrado nas SEQ ID NOS:18, 20, 22, ou 24, codificadas pelo ácido nucleico mostrado como SEQ ID NOS:17, 19, 21, ou 23, respectiva- mente. Em outra modalidade, o polinucleotídeo codificação de um polipeptí- deo GLG-1 compreende pelo menos 15, pelo menos 25, pelo menos, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 250, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2040, pelo menos 2090, pelo menos 2150, pelo menos 2200, pelo menos 2300, pelo menos 2400, pelo menos 2500, pelo menus 2600, peio menos 2700, pelo menos 2800, pelo menos 2900, pelo menos 3000, pelo menos 3100, pelo menos 3200, pelo menos 3300, pelo menos 3400, pelo menos 3500, pelo menos 3600, pelo menos 3700, ou pelo menos 3720 nucleotídeos contíguos das SEQ ID NOs 17, 19, 21, ou 23, ou o polinucleotídeo de codificação de um GLG-1 compreende SEQ ID NOs:17, 19, 21, ou 23. Em uma modalidade, um polinucleotídeo que se liga a um polinucleotídeo de codificação de um GLG-1 (SEQ ID NOs:17, 19, 21, ou 23), ou fragmento do mesmo, tem identidade de seqüência de pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, de pelo menos 99% ou de 100% com o poli- peptídeo GLG-1 ou fragmento do mesmo. Em uma modalidade, o polipeptí- deo GLG-1 compreende pelo menos 10, pelo menos 25, pelo menos 50, pe- lo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275, pelo menos 300, pelo menos 325, pelo menos 350, pelo menos 400, pelo 5 menos 450, pelo menos 500, pelo menos 550, pelo menos 600, pelo menos 650, pelo menos 700, pelo menos 750, pelo menos 800, pelo menos 850, pelo menos 900, pelo menos 950, pelo menos 1000, pelo menos 1050, pelo menos 1100, pelo menos 1150, ou pelo menos 1200 aminoácidos contíguos das SEQ ID NOS: 18, 20, 22, ou 24, ou o polipeptídeo GLG-1 compreende 10 as SEQ ID NOS: 18, 20, 22, ou 24. GLG-1 ou ESL-1 são expressos em neu- trófilos, acredita-se estar envolvidos no extravasamento de neutrófilos em tecidos, e pensa-se que desempenham um papel importante na inflamação (vide Hidalgo et al. (2007) Immunity, 26 (4): 477-489 incorporado aqui por referência em sua totalidade). GLG-1 ou ESL-1 têm 14 domínios de GLG1 15 ricos em cisteína. O domínio extracelular (ECD) é longo e como descrito a- baixo, e variantes ou fragmentos do ECD de GLG-1 foram enconrados tendo capacidade de ligar-se a LYPD5.
Em outra modalidade, o Iigante de LYPD5 é uma variante ou fragmento de uma molécula GLG-1 ou ESL-1 descrita aqui. Como mostrado na Figura 33A a B, GLG-1 ou ESL-1 podem ser vistos como fragmentos 1, 2, 3 e 4 e como descrito no Exemplo 11, qualquer um dos 4 fragmentos são suficientes pcjid d ngaçao a LYVUb.
Em outra modalidade, o Iigante de LYPD5 é uma variante ou fragmento de GLG-1 ou ESL-1 que é um domínio GLG-1 único. Como mos- trado na Figura 34A a B, GLG-1 é composto de múltiplos domínios GLG-1 e como descrito no Exemplo 11, os domínios GLG-1 únicos são suficientes para a ligação à LYPD5.
Em outra modalidade, o Iigante de LYPD5 é uma variante ou fragmento de GLG-1 ou ESL-1 que é específico para LYPD5. Como mostra- do na Figura 35A a B, GLG-1 inclui domínios de 26 a 114, domínio 115, e domínio 150 e como descrito no Exemplo 11, o domínio 115 se liga a LYPD5 mas os domínios de 26 a 114 não ligam-se à LYPD5. A presente invenção contempla variantes de GLG-1 na mesma maneira que contempla variantes de membros da família LY6.
C. Variantes Poiipeptídicas
Além dos polipeptídeos, anticorpos e polipeptídeos de ligação à 5 LY6 descritos aqui, é contemplado que as variantes de tais moléculas po- dem ser preparadas para uso com a invenção aqui. Tais variantes podem ser preparadas pela introdução de modificações nucleotídicas apropriadas no DNA de codificação, e/ou pela síntese do anticorpo ou polipeptídeo dese- jado. Aqueles versados na técnica apreciarão que modificações de aminoá- 10 cido pode alterar processos pós-traducionais destas moléculas, tais como modificação do número ou posição de sítios de glicosilação ou alteração das características de ancoragem à membrana.
Variações na seqüência de aminoácido podem ser feitas, por exemplo, usando quaisquer das técnicas e diretrizes de mutações conserva- tivas e não-conservativas apresentadas, por exemplo, na Patente Norte- americana Número 5.364.934. Variações podem ser uma substituição, dele- ção ou inserção de um ou mais códons que codificam a seqüência de ami- noácidos e resultam em uma modificação na seqüência de aminoácidos quando comparado com a seqüência natural. Opcionalmente a variação é pela substituição de pelo menos um aminoácido com qualquer outro amino- ácido em um ou mais dos domínios da seqüência de aminoácido de interes- se. A orientação na determinação a quai residuo de aminoácido pode ser inserido, substituído ou deletado sem afetar adversamente a atividade dese- jada pode ser considerado pela comparação da seqüência da seqüência de aminoácidos de interesse com moléculas de proteína conhecidas homólogas e minimizando o número de modificações de seqüência de aminoácido feitas em regiões de alta homologia. Substituições de aminoácido podem ser o resultado da substituição de um aminoácido com outro aminoácido que tem propriedades estruturais e/ou químicas similares, tal como a substituição de uma leucina por uma serina, isto é, substituições de aminoácido conservati- vas. Inserções ou deleções podem estar opcionalmente na faixa de aproxi- madamente 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada fazendo sistematicamente inserções, deleções ou substituições de aminoá- cidos na seqüência e testando as variantes resultantes para a atividade exi- bida pela seqüência natural de tamanho total ou madura.
Os fragmentos dos vários polipeptídeos são fornecidos aqui.
5 Tais fragmentos podem ser truncados no N-terminal ou C-terminal, ou po- dem perder resíduos internos, por exemplo, quando comparado com um an- ticorpo ou proteína natural de tamanho total. Tais fragmentos que perderam resíduos de aminoácidos que não são essenciais para uma atividade bioló- gica desejada são também úteis com os métodos descritos.
Os fragmentos polipeptídicos acima podem ser preparados por
qualquer uma das diversas técnicas convencionais. Fragmentos peptídicos desejados podem ser quimicamente sintetizados. Uma abordagem alternati- va envolve geração de tais fragmentos por digestão enzimática, por exem- plo, pelo tratamento da proteína com uma enzima conhecida por clivar prote- 15 ínas em sítios definidos por determinados resíduos de aminoácidos, ou pela digestão do DNA com enzimas de restrição adequadas e isolamento do fragmento desejado. Ainda outra técnica adequada envolve o isolamento e a amplificação de um fragmento de DNA de codificação do fragmento deseja- do pela reação de polimerase em cadeia (PCR). Oligonucleotídeos que defi- 20 nem os terminais desejados do fragmento de DNA são empregados nos ini- ciadores 5' e 3' na PCR. Preferencialmente, tais fragmentos compartilham peln menos uma atividade biológica e/ou imunoiógica com a molécula de tamanho total correspondente.
Em determinadas modalidades, substituições conservativas do 25 interesse são mostradas na Tabela 6 sob o título de substituições preferen- ciais. Se tais substituições resultam em uma modificação na atividade bioló- gica, então modificações mais substanciais, denominadas substituições e- xemplares na Tabela 6, ou como ainda descrito abaixo em referência a clas- ses de aminoácidos, são introduzidas e os produtos selecionados a fim de 30 identificar a variante desejada. Resíduo Substituições Substituições Original Exemplares Preferenciais AIa (A) Vai; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gin; Asn Lys Asn (N) Gin; His; Asp; Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser, Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp, Gln Asp Gly (G) Pro; Ala Ala His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg He (I) Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Leu Norleucine Leu (L) Norleucine; Ile; Vai; Ile Met; Ala; Phe Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe(F) Trp; Leu; Vai; He; Ala; Tyr Leu Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Vai; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Leu Ala; Norleucine Modificações substanciais na função ou identidade imunológica do polipeptídeo LY6 são realizadas pela seleção de substituições que se 5 diferenciam significativamente no seu efeito na manutenção (a) a estrutura do esqueleto polipeptídico na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molé- cula no sítio-alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os resíduos que ocor- rem naturalmente são divididos em grupos com base nas propriedades co- 10 muns de cadeia lateral:
(1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;
(2) neutro hidrofílico: Cys, Ser, Thr; Asn; Gln
(3) acídico: Asp, Glu;
(4) básico: His, Lys, Arg;
(5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: Gly, Pro; e (6) aromático: Trp, Tyr, Phe. Substituições não-conservativas envolverão a troca de um membro de uma destas classes por outra classe. Tais resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos sítios de substituição conservativa ou, mais preferencialmente, em sítios remanescente (não-conservados).
5 As variações podem ser feitas usando métodos conhecidos na
técnica tais como mutagênese mediada por oligonucleotídeo (sítio dirigida), varredura de alanina, e mutagênese por PCR. Mutagênese sítio dirigida (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), mutagênese de cassete (Wells et al., Gene, 34:315 10 (1985)), mutagênese por seleção de restrição (Poços et al., Philos. Trans. R. Soc. London Sera, 317:415 (1986)) ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir a molécula antiLY6.
Análise por varredura de aminoácido também pode ser empre- gada para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma seqüência contígua. Entre os aminoácidos preferenciais para varredura, estão aminoá- cidos relativamente pequenos, neutros. Tais aminoácidos incluem alanina, glicina, serina, e cisteína. Alanina é tipicamente um aminoácido de varredura preferencial entre este grupo porque elimina a cadeia lateral além do carbo- no beta e menos provavelmente altera a conformação de cadeia principal do variante (Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)). Alanina também é tipicamente preferencial porque é o aminoácido mais comum. A- lém disso, é frequentemente enconirada em ambas as posições enterrada e exposta (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co, N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Se a substituição de alanina não produzir quantida- des adequadas do variante, um aminoácido isotérico pode ser usado.
Qualquer resíduo de cisteína não-envolvido na manutenção da conformação própria do polipeptídeo LY6 também pode ser substituído, ge- ralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir ligação cruzada aberrante. De modo inverso, ligação(ões) de cisteí- 30 na pode ser adicionada a tal molécula para melhorar sua estabilidade (parti- cularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv). Um tipo particularmente preferencial de variante substituinte en- volve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Ge- ralmente, a variante (s) resultante selecionada para desenvolvimento adicio- nal terá propriedades biológicas melhoradas em relação ao anticorpo paren- tal a partir do qual são gerados. Uma maneira conveniente para gerar tais variantes substituintes envolve maturação de afinidade usando exposição de fago. Resumidamente, vários sítios de região hipervariável (por exemplo, 6 a 7 sítios) são mutados para gerar todas as substituições amino possíveis em cada sítio. As variantes de anticorpo geradas dessa forma são expostas de uma maneira monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusões ao produto do gene Ill de M13 empacotado em cada partícula. As variantes expostas em fago então são selecionadas por sua atividade bioló- gica (por exemplo, afinidade de ligação) como descrito aqui. A fim de identi- ficar sítios da região hipervariável candidatos para modificação, mutagênese por varredura de alanina pode ser realizadas para identificar resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente para a ligação ao an- tígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico para analisar uma estrutura cristalina do complexo anticorpo-antígeno identificar pontos de contato entre o anticorpo e o polipeptídeo-alvo. Tais resíduos de contato e os resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas aqui. Urna vez que tais variantes são geradas, o painel de variantes é submetido à seleção como descrito aqui e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser sele- cionados para desenvolvimento adicional.
Moléculas de ácidos nucleicos que codificam as variantes de seqüência de aminoácido dos polipeptídeos LY6 são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não são limitados a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de 30 variantes de seqüência de aminoácido que ocorrem naturalmente) ou prepa- ração por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio dirigida), mu- tagênese porPCR, e mutagênese de cassete de uma seqüência natural ou uma variante preparada mais anteriormente.
D. Modificações de Polipeptídeos
Polipeptídeos e/ou anticorpos que foram covalentemente modifi- cados também podem ser adequados para uso dentro do escopo desta in- 5 venção. Um tipo de modificação covalente inclui reação de resíduos de ami- noácidos direcionados de tais anticorpos e polipeptídeos com um agente derivatizante orgânico que é capaz de reação com cadeias laterais selecio- nadas ou resíduos N- ou C-terminais de tais anticorpos e polipeptídeos. De- rivatização com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para ligação cruza-
da das moléculas precedentes a uma matriz de suporte aquoso insolúvel ou superfície para uso em purificação. Agentes de ligação cruzada comumente usados incluem, por exemplo 1,1-bis (diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4- azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres disuccini- 15 midil, tais como 3,3‘-ditiobis (succinimidilpropionato), maleimidos bifuncio- nais, tais como bis-N-maleimido-1,8-octano e agentes, tais como metil-3-[(p- azidofenil)ditio] propioimidato.
Outras modificações incluem desamidação de resíduos de glu- taminila e asparaginila para os resíduos de glutamila e aspartila correspon- 20 dentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de gru- pos hidroxila de resíduos serila ou treonila, metilação dos grupos a-amino das cadeias laterais de iisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co, San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilação da amina do grupo N-terminal e amidação de qual- 25 quer carboxila do C-terminal.
Outro tipo de modificação covalente dos polipeptídeos ou anti- corpos compreende a alteração do padrão de glicosilação natural do anticor- po ou polipeptídeo. "Alteração do modelo de glicosilação natural" é destina- do para os objetivos aqui a significar deleção de uma ou mais porções de 30 carboidratos encontradas na seqüência natural (pela remoção do sítio de glicosilação subjacente ou pela deleção da glicosilação por meios químicos e/ou enzimáticos), e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes na respectiva seqüência natural. Além disso, a frase inclui modificações qualitativas na glicosilação das proteínas naturais, envolvendo uma modificação na natureza e proporções das várias porções de carboidra- to presentes.
5 Glicosilação de anticorpos e outros polipeptídeos é tipicamente
N-Iigada ou O-ligada. N-Iigada refere-se à ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As seqüências tripeptídicas de as- paragina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento da ligação enzimática 10 da porção de carboidrato à cadeia iaterai de asparagina. Dessa forma, a presença de qualquer destas seqüências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um potencial sítio de glicosilação. Glicosilação O-Iigado refere-se à liga- ção de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um ácido hidroxiamina, mais comumente serina ou treonina, embora 5- 15 hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados.
Adição de sítios de glicosilação pode ser realizada pela altera- ção da seqüência de aminoácidos tal que contenha uma ou mais das se- qüências tripeptídicas descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração também pode ser feita pela adição ou substituição, de um ou 20 mais resíduos serina ou treonina da seqüência do anticorpo ou polipeptídeo original (para sítios de glicosilação O-ligados). Tal seqüência anticorpo ou polipeptídica pode ser opcionalmente aiieraaa através de modificações ao nível de DNA, particularmente pela mutação do DNA de codificação ads se- qüências de aminoácidos precedentes em bases pré-selecionadas tal que 25 códons que são gerados traduzirão os aminoácidos desejados.
Outro meio de aumentar o número de porções de carboidrato é pela ligação química ou enzimática de glicosídeos ao polipeptídeo. Tais mé- todos são descritos na técnica, por exemplo, em WO 87/05330 publicado em
11 de setembro de 1987, e em Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).
Remoção de porções de carboidrato pode ser realizada quimi- camente ou enzimaticamente ou pela substituição mutacional dos códons de codificação dos resíduos de aminoácidos que servem como alvo para glico- silação. Técnicas deglicosilação químicas são conhecidas na técnica e des- critas, por exemplo, por Hakimuddin, et al., Arc. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) e por Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). Clivagem enzimá- 5 tica de porções de carboidratos em polipeptídeos pode ser realizada pelo uso de várias endo- e exo-glicosidases como descrito por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Outro tipo de modificação covalente compreende ligação a um de vários dos polímero não-protéicos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), 10 polipropileno glicol, ou polioxialkilenos, da maneira apresentada nas Paten- tes U.S. Números 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337. O polipeptídeo LY6 também pode ser capturado em microcápsu- Ias preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimeri- zação interfacial (por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou ge- 15 latina e microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente), em siste- mas de entrega de fármaco coloidais (por exemplo, lipossomas, microesfe- ras de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritass em Reminqton1S Pharmaceuti- cal Sciences. 16th edition, Oslo, A., ed., (1980).
Modificações na formação de moléculas quiméricas resultam de
fusões de um polipeptídeo ao outro, polipeptídeo heterólogo ou seqüência de aminoácido são contemplados para uso com os presentes métodos.
Em uma modalidade, uma molécula quimérica compreende uma fusão de um polipeptídeo com um polipeptídeo marcador que fornece um 25 epitopo ao qual um anticorpo antimarcador pode ligar-se seletivamente. O epitopo marcador é geralmente colocado nos terminais amino ou carboxila de tal anticorpo ou polipeptídeo. A presença de tais formas com epitopo marcado de tais anticorpos ou polipeptídeos podem ser detectadas usando um anticorpo contra o polipeptídeo marcador. Além disso, fornecimento do 30 epitope marcado permite a tais anticorpos ou polipeptídeos ser prontamente purificados pela purificação por afinidade usando um anticorpo antimarcador ou outro tipo da matriz de afinidade que se liga ao epitopo marcador. Vários polipeptídeos marcadores e seus respectivos anticorpos são bem- conhecidos na técnica. Exemplos incluem marcadores poli-histidina (poli His) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly); polipeptídeo marcador de influenza HA e seu anticorpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)); o 5 marcador de c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 do mesmo (Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)); e o marcador glicoproteína D do vírus de Herpes Simplex (gD) e seu anticorpo (Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6):547-553 (1990)). Outros polipep- tídeos marcadores incluem o peptídeo marcador (Hopp et al., Biotechnology, 10 6:1204-1210 (1988)); o peptídeo do epitopo KT3 (Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)); um peptídeo do epitopo α-tubulina (Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)); e o marcador peptídico da proteína do gene T7 10 (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6393- 6397 (1990)).
Em uma modalidade alternativa, a molécula quimérica pode
compreender uma fusão de um polipeptídeo com uma imunoglobulina ou uma determinada região de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da molécula quimérica (também referida como um "imunoadesina"), tal fusão poderia ser à região Fc de uma molécula IgG. As fusões de Ig preferencial- 20 mente incluem a substituição de uma forma solúvel (domínio transmembrana deletado ou inativado) de um anticorpo ou polipeptídeo precedente no lugar de pelo menos uma região variávei em uma molécula de lg. Em uma moda- lidade particularmente preferencial, a fusão de imunoglobulina inclui a regi- ões de dobradiça, CH2 e CH3, ou dobradiça, CH1, CH2 e CH3 da molécula de 25 IgGI. Para a produção de fusões de imunoglobulina vide também Patente Norte-americana Número 5.428.130 emitido em 27 de junho de 1995.
E. Preparação de Polipeptídeos
A descrição abaixo refere-se principalmente à produção de poli- peptídeos pelo cultivo de células transformadas ou transfectadas com um vetor contendo ácido nucleico de tais anticorpos, polipeptídeos e oligopeptí- deos. O termo "polipeptídeos" pode incluir anticorpos, polipeptídeos e oligo- peptídeos. É, naturalmente, contemplado que métodos alternativos, que são bem-conhecidos na técnica, podem ser empregados para preparar tais anti- corpos, polipeptídeos e oligopeptídeos. Por exemplo, a seqüência de amino- ácidos apropriada, ou porções da mesma, pode ser produzida pela síntese peptídica direta usando técnicas de fase sólida [ver, por exemplo, Stewart et 5 al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc.. 85:2149-2154 (1963)]. Síntese protei- ca in vitro pode ser realizada usando técnicas manuais ou pela automação. Síntese automatizada pode ser realizada, por exemplo, usando um Sinteti- zador de Peptídeo da Applied Biosystems (Foster City, CA) usando instru- iu ções do fabricante. Várias porções de tais anticorpos, polipeptídeos ou oli- gopeptídeos podem ser quimicamente sintetizadas separadamente e combi- nadas usando métodos químicos ou enzimáticos para produzir o produto desejado.
1. Isolamento de DNA de Codificação de um Polipeptídeo O DNA de codificação de um polipeptídeo pode ser obtido a par-
tir de uma biblioteca de cDNA preparada a partir do tecido acreditado possuir mRNA de tal anticorpo, polipeptídeo ou oligopeptídeo e expressá-lo a um nível detectável. Consequentemente, o DNA de codificação de tais polipeptí- deos pode ser convenientemente obtido a partir de uma biblioteca de cDNA 20 preparada de tecido humano, uma biblioteca genômica ou por procedimen- tos sintéticos conhecidos (por exemplo, síntese de ácido nucleico automati-
ZLdUd).
Bibliotecas podem ser selecionadas com sondas (tais como oli- gonucleotídeos depelo menos aproximadamente 20 a 80 bases) desenhadas 25 para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada por ele. Seleção da biblioteca de cDNA ou genômica com a sonda selecionada pode ser con- duzida usando procedimentos-padrão, tal como descrito em Sambrook et al., Molecular Cloninq: a Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor La- boratory Press, 1989). Alternativamente, a metodologia de PCR pode ser 30 usada. [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Técnicas para seleção de uma biblioteca de cDNA são bem- conhecidas na técnica. As seqüências de oligonucleotídeo selecionadas co- mo sondas devem ser de tamanho suficiente e suficientemente inequívocas que falsos positivos sejam minimizados. O oligonucleotídeo é preferencial- mente marcado tal que possa ser detectado na hibridização ao DNA na bi- 5 blioteca que é selecionada. Métodos de marcação são bem-conhecidos na técnica, e incluem uso de radiomarcadores como ATP marcado com 32P, biotinilação ou marcação enzimática. Condições de hibridização, incluindo estringência moderada e alta estringência, são fornecidas em Sambrook et al., supra.
As seqüências identificadas em tais métodos de seleção de bi-
blioteca podem ser comparadas e alinhadas a outras seqüências conhecidas depositadas e disponíveis em bancos de dados públicos, tais como Gen- Bank ou outros bancos de dados de seqüência privados. A identidade de seqüência (no nível de aminoácido ou nucleotídico) dentro de regiões defini- 15 das da molécula ou através da seqüência de tamanho total pode ser deter- minada usando métodos conhecidos na técnica e como descrito aqui.
O ácido nucleico tendo a seqüência de codificação de proteína pode ser obtido pela seleção de bibliotecas de cDNA ou genômicas selecio- nadas usando a seqüência de aminoácido deduzida descritas aqui pela pri- 20 meira vez, e, se necessário, usando procedimentos de extensão com inicia- dor convencionais como descrito em Sambrook et al., supra, para detectar precursores e processadores intermediários de mRNA que podem não ter sido transcrito reversamente em cDNA.
2. Seleção e Transformação de Células Hospedeiras Células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com
vetores de expressão ou clonagem descritos aqui para a produção de poli- peptídeo LY6 e cultivado em meios nutritivos convencionais modificados como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes, ou amplificar os genes de codificação das seqüências desejadas. As condições 30 de cultura, tais como meios, temperatura, pH e similares, podem ser selecio- nadas pelo versado na técnica semexperimentação indevida. Em geral, prin- cípios, protocolos e as técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas celulares podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechno- loqy: A Practical Approach. M. Butler1 ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et al., supra.
Métodos de transfecção celular eucariótica e transformação ce- 5 Iular procariótica são conhecidos ao versado na técnica ordinariamente, por exemplo, CaCI2, CaPO4, mediado por Iipossoma e eletroporação. Depen- dendo da célula hospedeira usada, a transformação é realizada usando téc- nicas-padrão apropriadas para tais células. O tratamento com cálcio empre- gando cloreto de cálcio, como descrito em Sambrook et al., supra, ou eletro- 10 poração é geralmenie usada para procariontes. infecção com Agrobacterium tumefaciens é usada para transformação de certas células vegetais, como descrito por Shaw et al., Gene. 23:315 (1983) e WO 89/05859 publicado em
29 de junho de 1989. Para células de mamífero sem tais paredes celulares, o método de precipitação por fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Vi1 roloqy, 52:456-457 (1978) pode ser empregado. Aspectos gerais de sistema de transfecções de célula hospedeira de mamífero foram descritos em Pa- tente Norte-americana Número 4.399.216. Transformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com os métodos de Van Solingen et al., J1 Bact.. 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 76:3829 (1979). Entretanto, outros métodos para introdução de DNA em células, tal como pela microinjeção nuclear, eletroporação, fusão protoplástica bacteria- na com células intactas, ou poiicátions, por exempio, poíibreno, poliornitina, também podem ser usados. Para várias técnicas para transformação de cé- lulas de mamífero, vide Keown et al., Methods in Enzymoloqy, 185:527-537 (1990) e Mansour et al.. Nature. 336:348-352 (1988).
Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de DNA nos vetores aqui incluem procariotas, levedura, ou células eucariotas superiores. Procariontes adequados incluem mas não são limitados a eubac- teria, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exem- 30 pio, Enterobacteriaceae, tal como E. coli. Várias cepas de E. coli estão publi- camente disponíveis, tais como a cepa E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446);
E. coli X1776 (ATCC 31.537); cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325) e K5 772 (ATCC 53.635). Outras células hospedeiras procarióticas adequadas incluem Enterobacteriaceae1 tal como Escherichia, por exemplo, E. coli, En- terobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli, tais como B. subtilis e B. Iicheniformis (por exemplo, B. Iicheni- formis 41P descrito em DD 266.710 publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitativos. A cepa W3110 é um hospedeiro parti- cularmente preferencial ou hospedeiro parental porque é uma cepa hospe- deira comum para fermentações de produto de DNA recombinante. Prefe- rencialmente, a célula hospedeira secreta quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a cepa W3110 pode ser modificada para efetuar uma mutação genética nos genes que codificam proteínas endógenas no hospedeiro, com exemplos de tais hospedeiros incluindo E. coli W3110 cepa 1A2, que tem o genótipo completo tonA\ cepa de E. co//W3110 9E4, que tem o genótipo completo tonA ptr3\ cepa de E. coli W3110 27C7 (ATCC 55.244), que tem o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT karí\ cepa de E. coli W3110 37D6, que tem o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompTrbs7 HvG karí\ cepa de E. coli W3110 40B4, que é a cepa 37D6 com uma mutação de deleção degP resis- tente não a kanamicina; e uma cepa de E. coli que tem uma protease peri- plasmática mutante descritas em Patenie Norie-americana Número 4.946.783 emitida em 7 de agosto de 1990. Alternativamente, em métodos de clonagem in vitro, por exemplo, PCR ou outras reações de polimerase de ácidos nucleicos, são adequados.
Anticorpo de tamanho total, os fragmentos de anticorpo, e a pro- teína de fusão de anticorpo podem ser produzidos em bactérias, especial- mente quando a glicosilação e função efetora de Fc não são necessárias, tal como quando o anticorpo terapêutico é conjugado a um agente citotóxico 30 (por exemplo, uma toxina) e o imunoconjugado por si mesmo mostra a eficá- cia na destruição de célula tumoral. Anticorpos de tamanho total têm a maior meia-vida na circulação. A produção em E. coli é mais rápida e com custo mais eficiente. Para a expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, ver, por exemplo, Patente U.S. 5.648.237 (Carter et. al.), Pa- tente U.S. 5.789.199 (Joly et al.), e Patente U.S. 5.840.523 (Simmons et al.) que descrevem a região de iniciação de tradução (TIR) e seqüências de si- 5 nal para otimizar a expressão e a secreção, estas patentes incorporadas aqui por referência. Após expressão, o anticorpo é isolado a partir de pasta celular de E. coli em uma fração solúvel e pode ser purificada através de, por exemplo, uma coluna de proteína A ou G dependendo do isotipo. Purificação final pode ser realizada similar ao processo de purificação do anticorpo ex- 10 presso em células adequadas (por exemplo, células CHO).
Além de procariontes, micróbios eucarióticos, tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão de vetores de codificação dos polipeptídeos desejados. Saeeha- romyces cerevisiae é um microrganismo hospedeiro eucariótico inferior co- 15 mumente usado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature. 290: 140 [1981]; EP 139.383 publicada em 2 de maio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (Patente Norte-americana Número 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como, por e- xemplo, K. Iaetis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bac- 20 teriol.. 154 (2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgarieus (ATCC 16.045), K. wiekeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg ei al., pio/Technolüqy. 8:135 (1990)), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Piehia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28:265-278 25 [1988]); Candida; Triehoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Ca- se et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomy- ces, tais como Schwanniomyees oeeidentalis (EP 394.538 publicado em 31 de outubro de 1990); e fungos filamentosos tais como, por exemplo, Neuros- pora, Penieillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado em 10 de janeiro 30 de 1991), e hospedeiros Aspergillus, tais como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene. 26:205-221 [19831; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 1470-1474 [1984]) e A. Niger (Kelly and Hynes1 EMBO J., 4:475-479 [1985]). Leveduras metilotrópicas são adequadas aqui e incluem, mas não são limitadas a, le- vedura capaz de crescimento em metanol selecionado a partir dos gêneros compostos de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, To- 5 rulopsis, e Rhodotorula. Uma lista de espécies específicas que são exempla- res desta classe de leveduras pode ser considerada em C. Anthony1 The Biochemistry of Metilotrophs, 269 (1982).
Células hospedeiras adequadas para expressão da produção de de polipeptídeos glicosilados são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de céiuias de invertebrados incluem células de inseto, tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, bem como células vegetais, tais como cul- turas celulares de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, e tabaco. Numerosas cepas baculovirais e variantes e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes a partir de hospedeiros, tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de fruta), e Bombyx mori foram identifica- das. Uma variedade de cepas virais para transfecção estão publicamente disponíveis, por exemplo, a variante 1-1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser usados como o ví- rus aqui de acordo com a presente invenção, particularmente para a trans- fecção de células de Spodoptera frugiperda.
Entretanio, o interesse foi ainda maior em células de vertebra- dos, e a propagação de cultura de células de vertebrados (cultura de tecido) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens celulares hos- 25 pedeira de mamíferos úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transfor- mada por SV40 (COS 7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humana (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK1 ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/- 30 DHFR (CHO1 Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); célu- las de sertoli de camundongo (TM4, Mather1 Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canina (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); célu- las de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano 5 (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
Células hospedeiras são transformadas com vetores de clona- gem ou expressão descritos acima para produção de polipeptídeo desejado e cultivadas em meios nutritivos convencionais modificados como apropriado para indução de promotores, seleção de transformantes, ou amplificação de genes de codificação das seqüências desejadas.
3. Seleção e Uso de um Vetor Replicável O ácido nucleico (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) de co-
dificação do respectivo polipeptídeo LY6 pode ser inserido em um vetor re- plicável para clonagem (amplificação do DNA) ou para a expressão. Vários vetores estão publicamente disponíveis. Vetor, por exemplo, pode estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula viral, ou fago. A seqüência de 20 ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vetor por vários procedimen- tos. Em geral, o DNA é inserido em um sítio(s) de restrição de endonuclease usando técnicas conhecidas de limitação apropriadas conhecidas na técnica. Componentes de vetor geralmente incluem, mas não são limitados a, uma ou mais de uma seqüência sinal, uma origem de replicação, um ou mais 25 marcadores gênicos, um elemento potencializador, um promotor, e uma se- qüência de terminação de transcrição. A construção de vetores adequados contendo um ou mais destes componentes emprega técnicas de ligação pa- drão que são conhecidas ao versado na técnica.
O polipeptídeo desejado pode ser produzido recombinantemente não só diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma seqüência sinal ou outro polipep- tídeo tendo um sítio de clivaqem específico no N-terminal da proteína ou do- lipeptídeo maduros. Em geral, a seqüência sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser uma parte do DNA de codificação da seqüência madu- ra que é inserido no vetor. A seqüência sinal pode ser uma seqüência sinal procariótica selecionada, por exemplo, a partir dos líderes do grupo fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou enterotoxina Il estável ao calor. Para secreção de levedura, a seqüência sinal pode ser, por exemplo, o líder invertase de levedura, líder de fator alfa (incluindo líderes de fator α Saccharomyces e Kluyveromyees, o último descrito em Patente Norte-americana Número 5.010.182), ou líder de fosfatase ácida, o líder de glicoamilase de C. albieans (EP 362.179 publicada em 4 de abril de 1990), ou o sinal descrito em WO 90/13646 publicado em 15 de novembro de 1990. Na expressão de célula de mamífero, seqüências de sinal de mamífero podem ser usadas para direcio- nar a secreção da proteína, tal como seqüências de sinal a partir de polipep- tídeos secretados das mesma ou espécie relacionada, bem como líderes secretórios virais.
Ambos vetores de expressão e clonagem contêm uma seqüên- cia de ácido nucleico que permite ao vetor replicar-se em uma ou mais célu- las hospedeiras selecionadas. Tais seqüências são bem-conhecidas por vá- rias bactérias, levedura, e vírus. A origem de replicação do plasmídeo p- 20 BR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2μ é adequada para a levedura, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSv ou 6PV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos.
Vetores de expressão e clonagem conterão tipicamente um gene 25 de seleção, também chamado um marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraci- clina, (b) complemento a deficiências auxotróficas, ou (c) fornece nutrientes críticos não-disponíveis a partir meios complexos, por exemplo, o gene de 30 codificação da racemase D-alanina de Bacilli.
Um exemplo de marcadores selecionáveis adequados para célu- las de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células com- petentes em iniciar a codificação de ácido nucleico da proteína desejada, tal como DHFR ou timidina quinase. Uma célula hospedeira apropriada quando DHFR de tipo selvagem é empregada é a linhagem celular CHO deficiente na atividade DHFR, preparada e propagada como descrito por Urlaub et al., 5 Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 77:4216 (1980). Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene frpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature. 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. O gene frpl fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante da levedura sem capaci- 10 uade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N. 44076 ou PEP4-1 [Jo- nes, Genetics, 85:12 (1977)].
Expressão e vetores de clonagem normalmente contêm um promotor operacionalmente ligado à seqüência de ácido nucleico de codifi- cação da seqüência de aminoácido desejada, a fim de direcionar a síntese 15 mRNA. Promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem-conhecidos. Promotores adequados para uso com hos- pedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores de β-lactamase e Iactose [Chang et al., Nature. 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema de promotor de triptofano 20 (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res.. 8:4057 (1980); EP 36.776], e promotores híbridos, tais como o promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 80:21-25 (1983)]. Promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão um seqüência Shine-Dalgarno (S.D.) operacionalmente ligada ao DNA de codificação da seqüência proteica desejada.
Exemplos de seqüências promotoras adequadas para uso com
leveduras hospedeiras incluem os promotores para 3-fosfoglicerato quinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem.. 255:2073 (1980)] ou outras enzimas glicolíti- cas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Req.. 7:149 (1968); Holland, Biochemistry. 17:4900 (1978)], tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, 30 hexoquinase, piruvato decarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomera- se, fosfoglicose isomerase, e glicoquinase. Outros promotores de levedura, que são promotores induzíveis tendo vantagem adicional de transcrição controlada por condições de cultivo, são as regiões promotoras da álcool desidrogenase 2, isocitocromo C1 fosfa- tase ácida, enzimas degradativas associadas com o metabolismo de nitro- gênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, e enzimas res- ponsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores a- dequados para uso na expressão de levedura são ainda descritos em EP 73.657.
A transcrição de DNA em células hospedeiras mamíferas é con- trolada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus, tais como polioma vírus, poxvírus (Patente Britânica 2.211.504 publicada em de julho de 1989), adenovírus (tais como Adenovirus 2), papilomavírus bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus de hepatite-B e Vírus Simian 40 (SV40), a partir de promotores mamíferos hete- rólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobuli- na, e de promotores de choque do calor, contanto que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira.
A transcrição de um DNA de codificação do polipeptídeo deseja- do pode ser aumentada inserindo uma seqüência potencializadora no vetor. Elementos potencializadores são elementos de atuação cis do DNA, nor- malmente aproximadamente de 10 a 300 bp, que atuam em um promotor para aumentar sua transcrição. Muitas seqüências potencializadoras são conhecidas agora para genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, a- fetoproteína, e insulina). Tipicamente, entretanto, cada um usará um poten- cializador para um virus de célula eucariótica. Exemplos incluem potenciali- zador SV40 no lado tardio da origem de replicação (bp 100 a 270), o poten- cializador do promotor precoce do cytomegalovirus, o potencializador de po- lioma no lado tardio da origem de replicação, e potencializador de adenoví- rus. O potencializador pode ser unido ao vetor na posição 5' ou 3' à seqüên- cia de codificação das seqüências de aminoácidos precedentes, mas é pre- ferencialmente localizado em um sítio 5' do promotor.
Vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióti- cas (levedura, fungos, inseto, planta, animal, humano, ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão seqüências necessá- rias para a terminação da transcrição e para estabilização do mRNA. Tais seqüências estão comumente disponíveis a partir de 5' e, ocasionalmente 3’, 5 regiões não-traduzidas de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Estas re- giões contêm segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliade- nilados na porção não-traduzida do mRNA de codificação do respectivo anti- corpo, polipeptídeo ou oligopeptídeo descrito nesta seção.
Ainda em outros métodos, vetores, e células hospedeiras ade- quadas para a adaptação à síntese do respectivo anticorpo, polipeptídeo ou oligopeptídeo na cultura celular de vertebrado recombinante são descritos em Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature. 281:40- 46 (1979); EP 117.060; e EP 117.058.
4. Cultivo de Células Hospedeiras As células hospedeiras usadas para produzir o polipeptídeo LY6
podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Os meios comercialmen- te disponíveis, tais como Ham's F10 (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Dulbecco's Modified EagIe1S Médi- um ((DMEM), Sigma) são adequados para cultivo de células hospedeiras. 20 Além disso, qualquer dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980), Patentes U.S. Números 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente U.S. Re. 30.985 podem ser usadas como meios de cultura para células hospedeiras. Quaisquer destes meios podem ser su- 25 plementado quando necessário com hormônios e/ou outros fatores de cres- cimento (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmi- co), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióti- cos (tais como fármaco GENTAMICINAJ), elementos traço (definidos como 30 compostos inorgânicos normalmente apresentam em concentrações finais na faixa de micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidas por aqueles versados na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são aquelas anteriormente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para ao versado ordinariamente.
5 5. Detecção da Amplificação/Expressão Gênica
Amplificação genética e/ou expressão pode ser medida em uma amostra diretamente, por exemplo, por Southern blotting, Northern blotting convencionais para quantificar a transcrição de mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:5201-5205 (1980)], Dot blotting (análise de DNA), ou hi- 10 bridização in siiu, usando uma sonda apropriadamente marcada, com base nas seqüências fornecidas aqui. Alternativamente, anticorpos podem ser empregados que podem reconhecer duplexes específicos, incluindo duple- xes de DNA, duplexes de RNA, e duplexes híbridos de DNA-RNA ou duple- xes DNA-proteína. Os anticorpos por sua vez podem ser marcados e o en- 15 saio pode ser realizado onde o dúplex é ligado a uma superfície, para que na formação de dúplexes na superfície, a presença de anticorpo ligado ao dú- plex possa ser detectada.
Expressão gênica, alternativamente, pode ser medida por méto- dos imunológicos, tais como marcação imuno-histoquímica de células ou 20 seções de tecido e ensaio de cultura celular ou fluidos corporais, para quan- tificar diretamente a expressão do produto gênico. Anticorpos úteis para marcação e/ou ensaio imuno-histoquímico de amostras fluidas podem ser monoclonais ou policlonais, e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos adequados para o presente método po- 25 dem ser preparados contra um polipeptídeo ou oligopeptídeo de seqüência natural, ou contra a seqüência exógena fusionada a DNA e de codificação de um epitopo de anticorpo específico de um polipeptídeo ou oligopeptídeo.
6. Purificação Proteica
Polipeptídeos podem ser recuperados do meio de cultura ou Ii- sados da célula hospedeira. Se ligada à membrana, pode ser liberada da membrana usando uma solução detergente adequada (por exemplo Triton-X 100) ou por clivaqem enzimática. Células empregadas na expressão da pre- cedente podem ser rompidas por vários meios físicos ou químicos, tais como ciclo congelamento-descongelamento, sonicação, rompimento mecânica, ou agentes de Iise celular.
Pode ser desejável para purificar a precedente a partir de proteí- 5 nas ou polipeptídeos de célula recombinante. Os seguintes procedimentos são exemplares de procedimentos de purificação adequados: por fraciona- mento em uma coluna de troca iônica; precipitação de etanol; HPLC em fase reversa; cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica, tal como DEAE; cromatofocalização; SDS-PAGE; precipitação em sulfato de 10 amônio; gel de filtração usando, por exempio, Sephadex G-75; colunas Se- pharose em proteína A para remover contaminantes, tais como IgG; e colu- nas quelantes metálicas para ligar-se a formas marcadas de epitopo das moléculas desejadas. Vários métodos de purificação proteica podem ser empregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos por e- 15 xemplo em Deutscher, Methods in Enzymoloqy. 182 (1990); Escopes, Prote- in Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). A etapa(s) de purificação selecionada dependerá, por exemplo, da natureza do processo de produção usado e anticorpo, polipeptídeo ou oligopeptídeo par- ticular produzidos pelos métodos reivindicados.
Usando técnicas recombinantes, o polipeptídeo LY6 pode ser
produzido intracelularmente, no espaço periplasmático, ou secretado direta- mente no meio. Se tais moléculas forem produzidas intracelularmente, como uma primeira etapa, os debris particulados, células hospedeiras ou fragmen- tos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. 25 Carter et al., Bio/Technoloqy 10:163-167 (1992) descrevem um procedimen- to para isolar anticorpos que são secretados no espaço periplasmático de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de aceta- to de sódio (pH 3,5), EDTA, e fenilmetilssulfonilfluoreto (PMSF) por aproxi- madamente 30 minutos. Debris celulares podem ser removidos por centrifu- 30 gação. Onde o anticorpo é secretado no meio, sobrenadantes de tais siste- mas de expressão são geralmente primeiro concentrados usando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de uItrafiItração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protea- se, tal como PMSF pode ser incluído em qualquer das etapas precedentes para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios.
5 A purificação pode ocorrer usando, por exemplo, cromatografia
em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, e cromatografia por afinidade, com a cromatografia por afinidade sendo a técnica de purificação preferenci- al. A conveniência da proteína A como um Iigante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio de Fc da imunoglobulina que este- 10 ja presente no anticorpo. A Proteína A pode ser usada para purificar anticor- pos que são baseados a cadeias pesadas humanas γ1, γ 2 ou γ 4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). A Proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongo e para γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). A matriz à qual o Iigante de afinidade é ligado é muitas 15 vezes agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanica- mente estáveis, tais como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil) benzeno considera velocidades de fluxo mais rápidas e tempos menores de processamento mais curtos do que pode ser realizado com agarose. Onde o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABXj (J. T. Ba- 20 ker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas de purificação proteica, tais como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipita- ção em etanol, HrLC em Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromato- grafia em heparina SEPHAROSEJ cromatografia em uma resina de troca catiônica ou aniônica (tais como uma coluna de ácido poliaspártico), croma- 25 tofocalização, SDS-PAGE, e precipitação em sulfato de amônio estão tam- bém disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.
Após qualquer etapa de purificação preliminar, a mistura com- preendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida cromatografia de interação hidrofóbica em baixo pH usando um tampão de 30 eluição em um pH entre aproximadamente 2,5 e 4,5, preferencialmente rea- lizado em baixas concentrações de sal (por exemplo, de aproximadamente 0 a 0,25M de sal). H. Formulações Farmacêuticas
As formulações terapêuticas ("agente terapêutico") usado con- forme a presente invenção podem ser preparadas para armazenamento pela mistura de agente(s) terapêutico tendo o grau desejado da pureza com veí- 5 culos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Reminqton: The Science of Practice of Pharmacv. 20a edição, Gennaro, A. et al., Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000)), na forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não-tóxicos a recipientes nas dosagens e 10 concentrações empregadas, e inciuem tampões, tais como acetato, Tris, fos- fato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbi- co e metionina; conservantes (tais como cloreto de amônio de octadecildime- tilbenzil; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetô- nio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, tais como metil ou 15 propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de aproximadamente 10 resí- duos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, 20 dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; modificadores de tonicidade, tais como trehalose e cloreto de sódio; açúcares, tais como sacarose, manitol, trehalo- se ou sorbitol; tensoativos, tais como polissorbato; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de 25 Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iônicos, tais como TWEEN7, PLURO- NICS7 ou polietileno glicol (PEG). O anticorpo preferencialmente compreen- de o anticorpo em uma concentração entre 5 a 200 mg/ml, preferencialmente entre 10 a 100 mg/ml.
As formulações aqui também podem conter mais de um compos- to ativo segundo a necessidade de determinada indicação sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. Por exemplo, além do agente(s) terapêutico pre- cedente, pode ser desejável incluir na formulação, um anticorpo adicional, por exemplo, um segundo agente terapêutico, ou um anticorpo a qualquer outro alvo, tal como um fator de crescimento que afeta o crescimento do gli- oma. Alternativamente, ou adicionalmente, a composição pode compreender 5 ainda um agente quimioterápico, agente citotóxico, citoquina, agente inibidor de crescimento, agente anti-hormonal, e/ou cardioprotetor. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes com o objetivo destinado.
Os ingredientes ativos também podem ser capturados em micro- 10 cápsulas preparadas, por exempio, por técnicas de coacervação ou por po- limerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármaco coloidais (por exemplo, lipossomas, micro- esferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em 15 macroemulsões. Tais técnicas são descritass em Reminqton: The Science and Practice of Pharmacv, supra.
Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem ma- trizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo anticorpo, 20 matrizes as quais estão na forma de artigos formados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. Exemplos do matrizes de liberação sustentada incluem o poliéster, hidrogéis (por exemplo, poii(2-hidroxietil-metacrilato), ou po- li(vinilálcool)), poliolactídeos (Patente Norte-americana Número 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, acetato de etilenovinil 25 não-degradável, copolímeros de ácidos láctico-ácidos glicólico degradáveis, tais como o LUPRON DEPOT7 (microesferas injetáveis compostas de copo- límero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D- (-)-3-hidroxibutírico.
As formulações a serem usadas em administração in vivo devem ser estéreis. Isto é prontamente realizado pela filtração através membranas de filtração estéreis.
Métodos para Diagnóstico e/ou Tratamento de Doença Inflamatória Intestinal Para determinar a expressão LY6 em tecido ou células gastroin- testinais de um mamífero, tais como um mamífero experimentando IBD1 vá- rios ensaios diagnósticos estão disponíveis. Em uma modalidade, a super- expressão de polipeptídeo LY6 pode ser analisada por RT-PCR, em hibridi- zação in situ, análise por microarranjo e/ou imuno-histoquímica (IHC). Se- ções de tecido frescas, congeladas e/ou incluídas em parafina a partir de uma biópsia gastrointestinal (tal como do cólon ou, mais especificamente, do cólon sigmoide) de um mamífero (tal como sem limitação um ser humano) podem ser submetidas à RT-PCR, hibridização in situ, análise por microar- ranjo e/ou ensaio de !HC.
Alternativamente, ou adicionalmente, ensaios de FISH, tais co- mo o INFORM7 (vendido por Ventana, Arizona) ou PATHVISION7 (Vysis, Illinois) podem ser realizados em tecido fixado com formalina, e incluído em parafina e para determinar a extensão da expressão de LY6 (se houver) e/ou regulação para cima em uma amostra de tecido ou biópsia.
Expressão de LY6 pode ser avaliada usando um ensaio de diag- nostico in vivo, por exemplo, pela administração de uma molécula (tal como um anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica) que se liga à molécula para ser detectada e é marcada com um marcador detectável (por exemplo, um isótopo radioativo ou um marcador fluorescente) e rastreado externa- mente no paciente para localização do marcador.
Atualmente, dependendo do estágio ua iBD, o tratamento envol- ve um ou uma combinação das seguintes terapias: cirurgia para remoção do tecido intestinal afetado, administração de agentes terapêuticos, incluindo sem limitação quimioterapia; modificações dietéticas, e administração do estilo de vida. Agentes terapêuticos ou agentes quimioterápicos úteis no tra- tamento de IBD são conhecidos na técnica e agentes terapêuticos e quimio- terápicos representativos e são descritos aqui.
Em particular, terapia de combinação com palictaxel e derivados modificados (vide, por exemplo, EP0600517) é contemplada. O anticorpo, polipeptídeo, oligopeptídeo ou molécula orgânica precedente será adminis- trada com uma dose terapeuticamente eficaz do agente quimioterápico. Em outra modalidade, tal anticorpo, polipeptídeo, oligopeptídeo ou molécula or- gânica é administrada em conjunto com a quimioterapia para aumentar a atividade e eficácia do agente quimioterápico, por exemplo, paclitaxel. O Physician's Desk Reference(PDR) revela dosagens destes agentes que fo- 5 ram usados no tratamento de vários cânceres. O regime de dosagem e as doses destes fármacos quimioterápicos supracitados que são terapeutica- mente eficazes dependerão do câncer particular sendo tratado, extensão da doença e outros fatores familiares ao médico versado na técnica e pode ser determinada pelo médico.
Agentes terapêuticos ou agentes quimioterápicos são adminis-
trados a um paciente humano, de acordo com métodos conhecidos, tais co- mo administração intravenosa, por exemplo, como um bolus ou pela infusão contínua durante o período de tempo, por vias intracraniana, intracerebros- pinhal, intra-articular, intratecal, intravenosa, intra-arterial, subcutâneo, oral, tópica, ou inalatória.
A presente invenção fornece métodos que envolvem uma etapa de diagnóstico e uma etapa de tratamento terapêutico. Em uma modalidade, a presente invenção fornece métodos de detecção de doença inflamatória intestinal (IBD) em um indivíduo mamífero que incluem as etapas de (1) de- 20 tecção do nível da expressão de um ácido nucleico ou um gene de codifica- ção de um polipeptídeo LY6 (a) em uma amostra de teste de tecido ou célu- las Obtidas υΟ iPidiVidUO, 6 (b) ΘΓΠ Uma aiTiOSÍrS de CCntroIS Onde UiTi ΓΠ3ϊΟΓ nível da expressão do ácido nucleico ou gene de LY6 na amostra de teste, quando comparada com a amostra de controle, indica a presença de uma 25 IBD no indivíduo do qual a amostra de teste foi obtida; e (2) administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico para IBD. Em uma modalidade, o agente terapêutico para IBD é um antagonista de outra molécula associada à IBD. A presente invenção contempla várias mo- léculas associadas à IBD que são diferencialmente expressas em IBD. Em 30 uma modalidade, a molécula associada à IBD é uma molécula que é dife- rencialmente expressa em uma IBD. Em outra modalidade, a molécula asso- ciada à IBD está superexpressa em uma IBD. Ainda em outra modalidade, a molécula associada à IBD superexpressa é uma integrina. Em uma outra modalidade, a molécula associada à IBD é integrina, beta 7 (ITGB2) (vide WO 2006/026759, que está incorporado aqui por referência em sua totalida- de) o termo "agente terapêutico para IBD" como usado aqui refere-se a um 5 antagonista de uma molécula associada à IBD. Em uma modalidade, o a- gente terapêutico para IBD é antagonista de um integrina. Em outra modali- dade, o agente terapêutico para IBD é antagonista de ITGB7. Em ainda ou- tra modalidade, o agente terapêutico paraDIl é antagonista do polipeptídeo conhecido como SEQ ID NO: 69 codificado pela seqüência de ácido nucleico 10 mostrada como SEQ ID NO: 68.
J. Artigos de Produção e Conjuntos
Para aplicações diagnosticas, o artigo de produção compreende um recipiente e uma marca ou inserção no pacote ou associado ao recipien- te indicando um uso para detecção e expressão de LY6 (tal como, sem Iimi- tação LY6, LYPD1, LYPD3, e/ou LYPD5) em um tecido gastrointestinal ou célula de um mamífero. Em uma modalidade, o mamífero é ser humano. Em uma modalidade, o tecido ou célula é tecido ou célula gastrointestinal. Em uma modalidade, detecção inclui quantificação em relação a uma amostra de controle. Em uma modalidade, recipiente, marca ou inserção de pacote indica que o tecido ou células gastrointestinais são do cólon de um mamífe- ro. Em uma modalidade, recipiente, marca ou inserção no pacote indicando a expressão de LY6 aumentada em relação a uma amostra de controle é indicativa de IBD, incluindo sem limitação CD e/ou UC, no mamífero. Recipi- entes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados de vários materiais, tais como vidro ou plás- tico. Adicionalmente, o artigo de produção pode compreender ainda um se- gundo recipiente compreendendo um tampão ou outro reagente (tal como marcador detectável) útil para realizar a detecção. Pode incluir ainda outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, e corantes.
Para isolação e purificação do polipeptídeo LY6, o conjunto pode conter o reagente de ligação à LY6 ligado a contas (por exemplo, contas de sefarose). Os conjuntos que podem ser fornecidos contêm tais moléculas da detecção e quantificação do polipeptídeo LY6 in vitro, por exemplo, em um ELISA ou um Western blot. Como com o artigo de produção, o conjunto compreende um recipiente e uma marca ou inserção no pacote ou associado 5 ao recipiente. O recipiente mantém uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica de ligação à LY6 usável com a invenção. Os recipientes adicionais podem ser incluídos con- tendo, por exemplo, diluentes e tampões, anticorpos controle. A marca ou inserção no pacote podem fornecer uma descrição da composição bem co- 10 mo instruções para o uso in vitro ou diagnóstico desejado.
K. Ácidos Nucleicos de Senso e Antissenso que Codificação de LY6
Moléculas que seriam esperadas ligar-se a ácidos nucleicos co- dificadores de um gene LY6 incluem oligonucleotídeos de senso e antissen- so, que compreendem uma seqüência de ácido nucleico de fita simples 15 (RNA ou DNA) capaz de ligação às seqüências de DNA ou mRNA de LY6 alvo. Oligonucleotídeos senso ou antissenso, segundo a presente invenção, compreendem um fragmento da região de codificação do DNA de LY6 ou seu complemento. A capacidade de derivar um oligonucleotídeo antissenso ou senso, baseado em uma seqüência de cDNA de codificação uma dada 20 proteína é descrita em, por exemplo, Stein and Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) e van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).
Os oligonucleotídeos senso e/ou antissenso hibridizáveis a um gene de LY6 são úteis, por exemplo, para detecção da presença do DNA ou mRNA de LY6 em uma amostra de tecido ou células gastrointestinais de 25 mamífero de acordo com a invenção. Os compostos de senso ou antissenso usados de acordo com esta invenção podem ser convenientemente e rotinei- ramente feitos através de técnica bem-conhecida de síntese em fase sólida. Equipamento de tal síntese é vendido por vários vendedores incluindo, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Quaisquer outros meios 30 para tais sínteses conhecida na técnica pode ser adicionalmente ou alterna- tivamente empregados. É bem-conhecido usar técnicas similares para pre- parar oligonucleotídeos, tais como fosforotioatos e derivados alquilados. Os compostos da invenção também podem ser misturados, encapsulados, con- jugados ou de outra maneira associados a outras moléculas, estruturas mo- leculares ou misturas de compostos, como por exemplo, lipossomas, molé- culas direcionadas ao receptor, formulações orais, retais, tópicas ou outras, 5 para auxiliar na ingestão, distribuição e/ou absorção. Patentes que ensinam a preparação de tais formulações que auxiliam na ingestão, distribuição e/ou absorção incluem, mas não são limitadas a, Patentes U.S. Números
5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127 5.521.291; 5.543.158; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 5.462.854; 5.469.854 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5 556.948; 5.580.575; e 5.595.756, tal que cada uma está incorporada aqui por referência.
Oligonucleotídeos senso ou reverso incluem sem limitação inici- adores e sondas úteis em PCR, RT-PCR, métodos de hibridização, hibridi- zação in situ, e similares.
Outros exemplos de oligonucleotídeos senso ou reverso incluem aqueles oligonucleotídeos que são covalentemente ligados a porções orgâ- nicas, tais como aquelas descritas em WO 90/10048, e outras porções que 20 aumentam a afinidade do oligonucleotídeo de uma seqüência de ácido nu- cleico-alvo, tal como poli-(L-lisina). Mais ainda, agentes intercalantes, tais como elipticina, e agentes alquilantes ou complexos metálicos podem ser ligados aos oligonucleotídeos senso ou antissenso para modificar as especi- ficidades de ligação do oligonucleotídeo senso ou antissenso à seqüência 25 nucleotídica alvo.
Moléculas de RNA ou DNA de antissenso ou senso são geral- mente pelo menos aproximadamente 5 nucleotídeos em tamanho, alternati- vamente pelo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 30 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 5 ou 1000 nucleotídeos em tamanho, em que neste contexto o termo aproxi- madamente significa o tamanho da seqüência nucleotídica referido mais ou menos 10% daquele tamanho referido.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos não-limitantes são fornecidos com obje- 10 tivos ilustrativos e não são destinados para limitar o escopo da invenção. Reagentes comercialmente disponíveis mencionados nos exemplos foram usados de acordo com instruções do fabricante a menos que indicado de outra maneira. A fonte daquelas linhagens celulares identificadas nos exem- plos seguintes, e/ou em todas as partes do pedido de patente, por números 15 de acesso ATCC é a American Type Culture Collection, Manassas, VA. Exemplo 1: Materiais e Métodos
Reagentes, células e camundongos: IFNy, TNFa, e IL1 β foram obtidos de Peprotech® (Rocky Hill, NJ). IFNa foi obtido de Hycult Biotechno- logy® (The Netherlands). Para experimentos de ligação cruzada, anticorpo 20 anti-KLH controle, antiLY6A (clone E13-161.7 ou D7) foram obtidos de Pharmingen® (San Diego, Ca). AntiLY6C (clone HK1.4) foi obtido de Sou- thern Biotech ® (Birmingham, AL).
Colite de transferência de CD45RBalta crônica foi induzida como descrito anteriormente em camundongos SCID em um contexto Balb/c (Po- 25 wrie, F. et al., (1994) Immunity 1:553-562). Camundongos IL10-/-(Kuhn, R. et al., (1993) Cell 75:263-274) em uma procedência 129, que desenvolvem coli- te espontânea, foram sacrificados entre 11 e 13 semanas de idade. Os có- lons foram instantaneamente congelados em OCT até o uso nos experimen- tos como descrito. O cólon proximal, cólon médio, cólon distai e reto foram 30 classificados usando uma escala de 0 a 5 (0 = intestino normal, 5 = doença severa). Os escores foram somado para alcançar um escore de severidade de colite total de cada animal. A linhagem celular de colonócito de camundongo adulto jovem (YAMC) (fornecido por Robert Whitehead, Vanderbilt University Medicai Cen- ter, Nahville1 TN) foi derivada do Immortomouse® um animal transgênico contendo um antígeno T sensível à temperatura (tsTag) sob controle de um 5 promotor dependente de interferon γ, como previamente descrito (Whitehe- ad, R.H. et al, (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:587-591). Células YAMC proliferam sob condições permissivas de 32°C na presença de 5 unidades/ml de IFN-γ (Peprotech®, New Jersey), mas não proliferam na remoção de IFN-γ em 37°C (condições não-permissivas).
Células YAMC foram cultivadas em RPMI contendo SFB 5%, L-
glutamina 2 mM, penicilina/estreptomicina, IFNy 5 U/ml e suplemento N-2 (Invitrogen®, Carlsbad, CA). Células foram cultivadas sob condições não- permissivas por 24 horas antes dos experimentos, e na duração dos experi- mentos.
Células CMT93 foram obtidas de ATCC (ATCC Número® CCL-
223, ATCC, Manassas, VA) cultivado em DMEM contendo 10% de SFB, L- glutamina 2 mM, e penicilina/estreptomicina.
Microscopia de captura por laser e purificação de RNA: Seções 10 a 12 pm foram aplicadas na membrane de lâminas LCM (Moleculars Ma- 20 chines®, Glattbrugg, Switzerland). As lâminas foram submetida a uma colo- ração por H&E abreviada (tempo total de aproximadamente cinco minutos) antes das células das criptas epiteliais foram histologicamente identificadas e dissecadas usando um microscópio MMI Cellcut® (Molecular Machines, Glattbrugg, a Suíça). RNA foi purificado das células dissecadas usando o 25 conjunto de purificação de RNA Arcturus® Picopure® e protocolos do fabri- cante (Arcturus®, Sunnyvale, CA) e quantificado utilizando espectrofotômetro NanoDrop ND-1000® (NanoDrop Technologies® , Wilmington, DE).
Hibridização de microarranjo e análise dos dados: a quantidade e a qualidade de amostras de RNA total de entrada foram determinadas u- sando espectrofotômetro ND-1000 (NanoDrop® Technologies, Montchanin, DE) e Bioanalyzer 2100® (Agilent® Technologies, Palo Alto, CA), respectiva- mente. O método para preparação de cRNA marcado com corante e a hibri- dização do arranjo foi fornecida por Agilent® Technologies (Paio Alto, CA). Resumidamente, o RNA total da amostra foi convertido em cDNA dupla fita e então em cRNA marcado usando um conjunto Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification® (Agilent®, Número de Produto 5184-3523). O cRNA 5 marcado foi purificado usando o miniconjunto RNeasy® (Qiagen®, San Die- go, CA) e logo quantificado utilizadno espectrofotômetro ND-1000® (Nano- drop® Technologies). A incorporação do corante Cy foi determinada pela cor- rida do cRNA marcado em um gel de TBE-uréia Novex® (Invitrogen®, Carls- bad, CA) seguido pela varredura em gel em um scanner TYphoon® (GE He- 10 althCare®, Piscataway, NJ). Para determinar a quantidade de contagem fluo- rescente do corante Cy, as imagens de gel foram analisadas usando o pro- grama ImageQuant ® (GE Healthcare®). Aproximadamente contagens 500.000 cRNA marcado com corante Cy foram fragmentados e hibridizado ao arranjo genômico de camundongo total de Agilent como descrito no con- 15 junto de hibridização in situ da Agilent (Agilent®, Número do Produto 5184- 3568). Amostras de LCM foram marcadas com corante de Cy5 e hibridiza- das contra a referência a camundongo universal marcada com corante Cy3 (Stratagene®, La Jolla, CA). Seguinte a hibridização, os arranjos foram lava- dos, secos com acetonitrila e escaneados em um scanner de microarranjo 20 de DNA Agilent®. Os arquivos de imagem do arranjo foram analisados usan- do programa da Agilent® Feature Extraction® 7.5 e análise de dados adicio- nal foi realizada usando Resolver® (Merck ®, Seattle, WA).
O dado foi analisado usando programa Rosetta Resolver® (Ro- setta Biosoftware®, Seattle, WA). Resumidamente, amostras saudáveis e 25 colíticas foram agrupadas separadamente e sondas que passaram por ano- va bicaudal (p <0,05) foram selecionadas. Estas sondas foram analisadas ainda para sondas que demonstraram uma mudança de duas vezes ou mai- or em amostras colíticas versus amostras saudáveis.
RT-PCR quantitativa em tempo real: RT-PCR foi realizada em RNA extraído usando o conjunto Taqman® Gold® RT-PCR e reagentes (Ap- plied Biosystems®, Foster City, CA). Todas as amostras foram corridas com iniciadores gene-específicos usando sondas internas marcadas 5-FAM e 3‘- TAMRA. A análise foi realizada comparada ao gene endógeno, SPF31, inici- adores específicos pelo método 2'ΔΔ Ct como descrito (Livak, K.J., and T.D. Schmittgen (2001) Methods 25:402-408). Iniciadores e sondas foram dese- nhados usando o programa Primer3® (Rozen, S., and H. Skaletsky (2000) 5 Methods Mol Biol 132:365-386) ou obtidos comercialmente de (Applied Bi- osystems®). Iniciadores e sondas usadas para estes ensaios foram os se- guintes, mostrados na direção 5'-3':
LY6A:
Sentido direto: CTT ACC CAT CTG CCC TCC TA (SEQ ID NO:39)
Antissenso: CCT CCA TTG GGA ACT GCT AC (SEQ ID N0:40)
Sonda: TCC TGT TGC CAG GAA GAC CTC TGC (SEQ ID NO:41)
LY6C:
Sentido direto: ACT TCC TGC CCA GCA GTT AC (SEQ ID NO:42) Antissenso: GGC ACT GAC GGG TCT TTA GT (SEQ ID NO:43)
Sonda: CTG CCG CGC CTC TGA TGG (SEQ ID NO:44)
Marcação Imunofluorescente: tecidos congelados foram corta- dos em seções de 5 pm e marcados com antiLY6C biotinilado (Southern Bio- tech®, Birmingham, AL) ou anti-SCA-1 a 2,5 ng/ml (R&D Systems®, Minnea- polis, MN). As lâminas foram lavadas e marcadas com Alexa Fluor® 488 con- 20 jugado a estreptavidina, usando montada Prolong Gold® com DAPI (Invitro- gen®, Carlsbad, CA) e visualizado em microscopia confocal.
Ligação cruzada de Moléculas LY6: a capacidade de polipeptí- deo LY6 ligado cruzadamente para efetuar a produção de quimiocina foi tes- tada pela incubação de células YAMC com anticorpos ligados à placa an- 25 tiLY6C ou anti-KLH (controle) e medindo a produção das quimiocinas CX- CL2, CXCL5, e CCL7. Porque a formação de jangadas lipídicas na membra- na celular é requerida para ligação cruzada, a produção de quimiocina foi testada sob condições de formação de jangada normal (não-depleção de colesterol) e sob condições de depleção de colesterol.
Para ligação cruzada usando anticorpos ligados à placa, 100 μΙ
de anticorpo antiLY6C ou anti-KLH (controle) em concentração de 5 pg/mL foi adicionado a uma placa 96 poços, ou 2 mL foram adicionados a uma pia- ca de 60 mm2 e permitido ligar à placa por 15 horas a 4 °C. Células YAMC1 cultivadas no em condições de depleção ou não-depleção decolesterol (con- forme Exemplo 5, aqui) foram incubadas com os anticorpos ligados à placa por 15 horas a 32°C sob condições de não-depleção de colesterol RNA foi 5 coletado e níveis de expressão de CXCL2, CXCL5, e CCL7 foram determi- nados. O ensaio é ainda descrito e os resultados são mostrados no Exemplo
5, aqui.
Inibição por siRNA: siRNA individual direcionado contra LY6C murino foram obtidos de Dharmacon (Lafayette, CO). SiRNA foi transfectado 10 em células YAMC usando Iipofectamina 2000 (Invitrogen) e protocolos- padrão. 72 horas após transfecção, as células foram coletadas para deter- minar a eficiência da redução da expressão. Um siRNA foi escolhido para experimentos de ligação cruzada com base na eficiência de redução da ex- pressão superior (95% de inibição por RT-PCR quantitativa).
Secreção de CXCL5: Sobrenadantes CXCL5 foram coletados no
ponto de tempo indicado de células estimuladas e concentrações de citoqui- na foram determinadas por ELISA usando um conjunto comercialmente dis- ponível de R&D Systems® e os protocolos de fabricante. O nível da detecção foi 15 pg/ml de CXCL5.
Depleção de colesterol: células YAMC foram cultivadas por 72
horas em meio livre de soro a 37°C na presença de Iovastatina 4 μΜ e me- valonato 250 μΜ (Sigma). Células foram plaqueadas e mantidas em Iovasta- tina e mevalonato em todas as partes do experimento.
Estatística: o teste de t de Student foi usado para comparação entre grupos (* indica p <0,05).
Exemplo 2: padrões de expressão gênica de IEC são alterados durante coli- te
Estudos indicaram que os padrões de expressão gênica de IEC estão significativamente alterados nos modelos de colite em camundongo, bem como IBD humana (Fahlgren, A., et al. (2004) Clin Exp Immunol 137:379-385; Brand, S. et al. (2006) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 290:G827-838; Ruiz, P.A. et al. (2005) Immunol J 174:2990-2999). Neste exemplo, os padrões de expressão gênica avaliados em IEC de camundon- gos saudáveis e colíticos foram examinados a fim de iluminar novos genes e vias alteradas em IBD.
A identificação de genes envolvidos na imunopatologia de IBD foi buscada pela avaliação de células epiteliais intestinais (IEC) a partir do modelo de colite de camundongo e transferência de célula T CD45RBhl bem como o modelo de camundongo IL10_/", ambos dos quais resultam da desre- gulação Th1 e compartilham muitas características da doença de Crohn hu- mana (Elson, C.O. et al. (2005) Immunol Rev 206:260-276; Bouma, G., and W. Strober (2003) Nat Rev Immunol 3:521-533). Microdissecção de captura por laser (LCM) foi usada para isolar as cripta de IEC dos cólons de camun- dongos saudáveis e colíticos nos dois modelos de IBD murino. RNA foi ex- traído destas amostras e analisado por tecnologia de microarranjo como descrito aqui no Exemplo 1. O perfil de expressão gênica de IEC de camun- dongos colíticos no modelo de colite de transferência identificou 1770 son- das com modificações de expressão > 2 vezes comparado aos camundon- gos controle, enquanto o modelo IL10-/- identificou 1140 sondas. Sobrepon- do ambos os modelos, houve 540 sondas com modificações na expressão >
2 vezes, correspondente a aproximadamente 400 genes diferentes (dados não-mostrados).
Exemplo 3: Vias e Genes Afetados em IEC Durante Colite
Dos aproximadamente 400 genes afetados em ambos os mode- los, os genes envolvidos na apresentação de antígeno, de sinalização de TLR e migração celular foram superexpressos (Tabela 7). Na Tabela 7, os 25 números representam a média com desvio-padrão da modificação de vezes comparada ao RNA-padrão universal de camundongos colíticos contra ca- mundongos saudáveis no modelo IL10-/- de colite ou no modelo CD45RBH| de colite, como indicado. Os resultados indicaram que alguns genes expres- sos em IEC alteraram os padrões de expressão em modelos de IBD murino. 30 Muitos destes genes, incluindo TLR2, CCL7, CXCL5 e ICAM-1 foram descri- tos previamente como tendo expressão epitelial aumentada durante a colite (Breider, M.A. et al. (1997) Vet Pathol 34:598-604; Uguccioni, M. et al. (1999) Am J Pathol 155:331-336; Z1Graggen1 K. et al. (1997) Gastroenterology 113:808-816; Singh1 J.C. et al. (2005) Am J Physiol Gastrointest Liver Physi-
ol 288.G514-524), sugerindo que o padrão de expressão gênico obtido nes- tes microarranjos são uma reflexão exata da biologia de IEC na colite.
Tabela 7
Modificação de vezes (valor de p)
Migração Celular Modelo IL10 -/- Modelo CD45RBhi CXCL1 +3,89 (<0,0001) +2,09 (<0,0001) CXCL5 +21,82 (<0,0001) +23,34 (<0,0001) CXCL13 +3,01 (<0,0001) +2,85 (<0,0001) CCL6 -3,47 (<0,0001) -2,5 (<0,0001) CCL7 +4,2 (<0,0001) +5,54 (<0,0001) CCL11 -3,43 (<0,0001) -3,6 (<0,0001) Sinalização de TLR
TLR2 +2,15 (<0,0001) +2,68 (<0,0001) Fos +3,64 (<0,0001) +2,03 (<0,0001) LBP +2,34 (<0,0001) +2,57 (<0,0001) NFKBIA +2,37 (<0,0001) +2,15 (<0,0001) Apresentação de Antígeno
H2-D1 +2,77 (<0,0001) +2,23 (<0,0001) HLA-A +2,83 (<0,0001) +2,40 (<0,0001) HLA-B +2,71 (<0,0001) +2,44 (<0,0001) HLA-E +2,31 (<0,0001) +2,34 (<0,0001) ICAM-1 +2,51 (<0,0001) +2,587 (<0,0001) PSMB8 +8,10 (<0,0001) +3,09 (<0,0001) PSMB9 +6,61 (<0,0001) +2,72 (<0,0001) TAP1 +4,05 (<0,0001) +4,10 (<0,0001) TAP2 +2,08 (<0,0001) +2,18 (<0,0001) IEC pode funcionar como APC não-profissional (Snoeck, V. et al., (2005) Microbes infect 7:997-1004; e Shao, L et al., (2005) Immunol Rev 206:160-176), e o padrão de expressão gênico obtido nestes microarranjos indica que estas funções estão aumentadas durante a colite pela regulação para cima nos genes associados ao processamento de antígeno, tais como LMP7 e TAP1, bem como genes de MHC de classe I e Il que serviriam para aumentar a apresentação de antígenos na superfície da IEC.
5 Os dados do microarranjo apoiam o conceito que IEC colítica
atrae células imunes para cólon através da expressão alterada de quimioci- nas, e podem apresentar antígeno para células T infiltrantes pela regulação para cima da expressão de genes associados com a apresentação de antí- geno.
Exemplo 4: Expressão de Membros da Família LY6 é Fortemente Regulada para Cima na Superfície de IEC Colítica
Membros da família de moléculas LY6 de camundongo foram superrepresentadas em número bem como grau de regulação para cima em ambos modelo de colite de transferência de camundongo e modelo de ca- 15 mundongo IL10-/- (Figuras 23A e 23B). Estes resultados foram confirmados por RT-PCR quantitativa em tempo real do RNA de IEC agrupado e amplifi- cado no modelo de colite de transferência (dado não-mostrado). A expres- são dos membros da família LY6 foi única para o estado de doença, portanto nenhum camundongo saudável expressou níveis apreciáveis de algum des- 20 tes membros da família LY6.
Enquanto a expressão de moléculas de LY6 murinos na superfí- cie de células de origem hematopoiética é conhecida, a expressão em IEC não foi anteriormente descrita (Bamezai, A. (2004) Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 52:255-266; e Rock, K.L. et al. (1989) Immunol Rev 111:195-224). A 25 expressão de LY6A e LY6C murino é detectável em muitas células não- epiteliais presentes no cólon, tais como células T e granulócitos. Marcação imunofluorescente foi realizada para ambos LY6A e LY6C murino em colons saudáveis e colíticos. Os níveis de LY6A e LY6C murino foram mínimos ou ausentes na superfície de IEC saudável (Figura 24A e 24C, respectivamen- 30 te). A expressão de ambas LY6A e LY6C murino foi detectável na superfície de IEC em todas as partes do cólon de camundongos colíticos (Figura 24B e 24D, respectivamente). Não houve evidência de polarização de LY6A ou LY6C, e marcação esteve presente e mambas membranas apical e basola- teral, fazendo moléculas de LY6 potencialmente acessíveis aos Iigantes em qualquer superfície. Estes resultados indicam que os resultados de análise por microarranjo mostrando a regulação para cima de LY6A e LY6C murino 5 em modelos colíticos murinos não foi devido ao influxo de células imunes contaminantes.
Exemplo 4: Transcrição de genes LY6 é estimulada por citoquinas inflamató- rias
A expressão de LY6 em células T é induzida e aumentada por 10 ambos os IFNs tipo I e tipo Il (Khodadoust, M.M., K.D. Khan, e A.L. Bothwell. 1999. Complex Regulation of Ly-6E Gene Transcription in the Cells by IFNs. J Immunol 163:811-819). Além disso, a expressão de diversas citoquinas, está elevada no cólon durante a colite ativa (Niessner, M., e B.A. Volk. 1995. Citocina Th1/Th2 alterada nos perfis na mucosa intestinal de paciente com 15 doença inflamatória intestinal como avaliado através da transcrição reversa quantitativa-reação em cadeia polimerase (RT-POR) Altered Th1/Th2 Cyto- kine in the profiles in the intestinal mucosa of patients with inflammatory bo- wel disease as assessed by quantitative reversed transcribed polymerase chain reaction (RT-PCR). Clin Exp Immunol 101:428-435).
Para determinar se citoquinas presentes durante a colite afetam
a transcrição de membros da família LY6 em IEC, tratamos células YAMC, um linhagem celular de IEC murino condicionalmente imortalizada, com IL-1 β, IFN α, TNF α, IFNy ou a combinação de TNF α e IFNy e analisamos a transcrição de todos genes LY6 murinos identificados por RT-PCR quantita- 25 tivo em tempo real (Tabela 8). Resumidamente, os níveis de mRNA do membro da família LY6 indicado em IEC foi determinado por RT-PCR quanti- tativa em tempo real após 15 horas de tratamento com a citoquina indicada. O número representa a modificação de vezes (determinado pelo método 2' AACt) versus os meios não-tratados do controle. *, P <0,05 versus as medias
do controle não-tratado. t, P <0,05 versus células tratadas IFNy. Os mem- bros seguintes da família LY6 foram testados, mas não detectados nas a- mostras, apesar do tratamento: LY6K, LYPD3, LYPD4, LYPD5, LY6g5b, Ly6g6d, Ly6g6e, Slurpl. Os resultados indicam que IEC regula para cima membros da família LY6 em resposta a citoquinas inflamatórias.
Tabela 8
Médias IL1 β TNFa IFNa IFNy IFNy & TNFa Ly6A 1,0 1,8* 2,2* 2,8* 33,1* 65,4*f Ly6C 1,0 1,6* 1,2* 2,4* 65,6* 63,6* Ly6D 1,0 2,7* 2,1* 1,5* 1,0 0,9 Ly6E 1,0 1,4* 1,5* 2,1* 1,9* 2,9*f Ly6F 1,0 2,5* 0,6* 7,1* 108,2* 169,7*f Ly6H 1,0 1,0 1,1 1,2 3,7* 1 At Lypdl 1,0 1,5* 2,1* 1,3* 1,3* 2,9*t Lypd2 1,0 0,1* ND 0,4* 0,1* ND Ly6g5c 1,1 1,3 0,8 0,9 1,3 1,1 Ly6g6c 1,0 0,7 0,7 0,6 0,6* 0,3*t Slurp2/Lynx1 1,1 0,7 0,4 0,7 1,5 0,4* Enquanto muitos dos membros da família LY6 não foram detec-
5 tados na presença ou ausência de citoquinas inflamatórias, detectamos uma forte regulação para cima na transcrição de LY6A, LY6C e LY6F murinos em resposta à maioria das citoquinas testadas regulação para cima mais mode- rada de LY6E, LY6H e LYPD1 murinos em resposta a algumas citoquinas testadas. Entretanto, IFNy foi de longe a citoquina mais potente na indução 10 de regulação para cima de LY6. Além disso, TNF a aumentou os efeitos de IFNy na expressão de LY6A, LY6F, LY6E e LYPD1. Regulação para cima similar dos membros da família LY6 foram vistos em outra linhagem IEC mu- rino, CMT93 (dado não-mostrado).
Para examinar a expressão superficial de membros da família 15 LY6 em resposta a citoquinas, células YAMC foram expostas às citoquinas acima e analisadas por citometria de fluxo para expressão das LY6A e LY6C murinos, para as quais os anticorpos comerciais estão disponíveis, como descrito aqui no Exemplo 1. Altos níveis de LY6A murino foram expressos em células YAMC até na ausência de citoquinas adicionadas (Figura 25B, 20 médias). Expressão de LY6C murino (Figura 25A, médias) foi considerável- mente menor do que a expressão de LY6A.
IL-1 β e TNF α induziram leves aumentos na expressão superfi- cial de ambas LY6A e LY6C murinos, em concordância com a expressão de RNA (Figuras 25A e 25B). Um aumento mais moderado na expressão foi 5 observado quando IFNa foi adicionado às células, enquanto IFNy induziu aumentos dramáticos na expressão superficial de ambas LY6A e LY6C (Fi- gura 25A e 25B). A expressão proteica superficial refletiu estreitamente a expressão de RNA. Citocinas Th2, tais como IL4, IL10 ou IL13 não tiveram efeito na expressão superficial de LY6A ou LY6C (dado não-mostrado).
A indução de ambas LY6A (Figura 25D) e LY6C (Figura 25C)
por IFNy foi dose-dependente. As doses tão baixo como 6,25 unidades/ml de IFNy resultaram em aumentos detectáveis em ambas moléculas LY6 por ci- tometria de fluxo. Além disso, o aumento da expressão superficial em ambas LY6A (Figura 25F) e LY6C (Figura 25E) ficou evidente entre 2 e 4 horas a- 15 pós tratamento com IFNy, e manteve-se aumentada por pelo menos 24 ho- ras após tratamento com IFNy. Estes dados indicam que concentrações rela- tivamente baixas de IFNy são suficientes para aumentar a expressão super- ficial de moléculas LY6 em horas.
Há evidência que IL-22, que é secretado principalmente por cé- 20 lulas T ativadas, funciona através do complexo IL-22R, presente na IEC para promover a produção de citoquina e um fenótipo inflamatório (Brand, S.F. et al. Am J Phisiol Gastrointest Liver Physiol 290:G827-838 (2006)). Além dis- so, IL-22 está envolvida no immunopatogênese da Doença de Crohn. Para examinar se IL-22 afeta a expressão da molécula LY6 em IEC murino, célu- 25 Ias YAMC foram cultivadas na presença de IL-22 e analisadas para expres- são do LY6C (Figura 25G) e LY6A ((Figura 25H). Ambas moléculas LY6 fo- ram substancialmente aumentados na presença de IL-22 a níveis compará- veis à indução providenciada após tratamento com IFNy.
Para assegurar que a regulação para cima de moléculas LY6 não foi específica para a linhagem celular YAMC, os níveis de RNA de LY6A e LY6C murinos na linhagem celular de tumor epitelial colônico murino CMT93 foram examinados. Os níveis de ambos LY6A murino e LY6C murino foram regulados para cima no tratamento com IFNy (Figura 25I). Embora os níveis de regulação para cima de moléculas LY6 fossem mais modestos em células CMT93, a análise por citometria de fluxo indicou que os níveis foram bastantes altos até em células não-tratadas (dado não-mostrado), que é pro- 5 vávelmente um resultado do fenótipo tumoral de células CMT93.
Este dado suporta os dados obtidos por RT-PCR quantitativa em tempo real na confirmação de que IEC regula para cima os membros da fa- mília LY6 em resposta a citoquinas inflamatórias.
Exemplo 5: estimulação de LY6 de IEC associada com a formação de jan- gada lipídica
Como proteína ancoradas por GPI, os membros da família de LY6 não possuem um domínio intracelular único associado à tradicional si- nalização para fora. Particularmente estão presentes nos microdomínios da jangada lipídica (Bohuslav, J. et al. Eur J Immunol 23:825-831 (1993)). En- 15 tretanto, foi sugerido que ligação cruzada de membros da família LY6 na superfície das células resulte em redistribuição de outras moléculas de su- perfície celular bem como reorganização de estruturas de jangada lipídica, sugerindo um mecanismo pelo qual as moléculas LY6 podem afetar a trans- dução de sinal e funções celulares a jusante (Simons, K. et al., Nat Rev Mol 20 CeIIBioI 1:31-39(2000)).
Alguns Iigantes da proteína LY6 foram identificados até agora, e nenhum Iigante para LY6A ou LY6C é atualmente conhecido (Paret, C. et al., (2005) Int J Cancer 115:724-733; Apostolopoulos, J. et al., (2000) Immunity 12:223-232; e Classon1 B.J. (2001) Trends Immunol 22:126-127). Colesterol 25 é requerido para manter a integridade de jangada lipídica. (Simons, K., et al. J Clin Invest 110:597-603 (2002)), e a depleção de colesterol é muitas vezes usada para inibir a biossíntese de jangada lipídica in vitro (von Tresckow1 B. etal. J Immunol 172:4324-4331 (2004)).
Para analisar se a reorganização de jangada lipídica ocorre em IEC em resposta a ligação cruzada a LY6, células YAMC foram cultivadas em condições de depleção de colesterol (condições sob as quais as janga- das lipídicas são depletadas das células) e condições de não-depleção de colesterol (condições permissivas para formação de jangada lipídicas). Em condições de depleção de colesterol, as células YAMC foram cultivadas na ausência de soro e na presença de Iovastatina 4 μΜ e mevalonato 0,25 mM (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) por 72 horas a 37 °C. As mesmas con- 5 dições de cultura foram usadas para células YAMC sob condições de não- depleção de colesterol, exceto que nem Iovastatina nem mevalonato foram adicionados ao meio de crescimento. As células então foram suspensas e LY6C foi ligada cruzadamente como descrito acima no Exemplo 1. RNA foi coletado e os níveis de expressão de CXCL2, CXCL5, e CCL7 foram deter- 10 minados.
Os resultados destes estudos indicaram que a depleção de jan- gada lipídica resulta em uma inibição da produção quimiocina mediada por LY6C. As figuras 26A a 26C mostram que células YAMC com colesterol de- pletado(barras escuras) produziram menos quimiocina do que células que 15 não foram depletadas de colesterol (barras abertas). A depleção de coleste- rol afetou a produção de quimiocina nos grupos controle anti-KLH estimula- dos, independente da estimulação por LY6C, entretanto a resposta foi míni- ma e não em uma direção consistente. Para examinar se a depleção de co- lesterol globalmente afetou a viabilidade celular, medimos a morte celular, 20 por exclusão de 7AAD, e decidimos que a depleção de colesterol não afetou significantemente a viabilidade das células YAMC (viabilidade de 92% ver- sus 86% nas células depletadas de colesterol, dado não-mostrado). A ex- pressão superficial ambas LY6A (Figura 26D) e LY6C (Figura 26E) foram ambas significativamente menores nas células YAMC depletadas de coleste- 25 rol, sugerindo que os níveis de colesterol da membrana plasmática e integri- dade de jangada lipídica afetem os níveis da expressão de LY6 na superfície das células. Este dado sugere que a integridade da jangada lipídica, influen- ciada pela biossíntese de colesterol, leva considera a expressão de molécu- las LY6 na superfície, e está potencialmente envolvida na indução mediada 30 por LY6C de quimiocinas. Dessa forma, o aumento da produção de quimio- cina mediada pela interação dos polipeptídeos LY6C na membrana celular requer a presença de jangadas lipídicas na superfície celular. Exemplo 6: Ligação cruzada à LY6C resulta na expressão superficial aumen- tada de moléculas LY6
Foi relatado que ligação cruzada à LY6C na superfície de células T resulta na queda de LY6C (Jaakkola, I. et al. (2003) J Immunol 170:1283- 5 1290). Entretanto, diferentemente de células T, quando LY6C murino foi li- gada cruzadamente na superfície de IEC1 nenhuma queda de LY6A ou de LY6C ocorreu (Figura 27A e 27B, respectivamente). Ao contrário, a ausência de IFNy, os níveis de expressão superficial de ambas LY6A e LY6C foram aumentados em IEC com ligação cruzada à LY6C, mas não LY6A. Quando 10 IEC foram pré-incubadas com IFNy, a maior parte deste efeito foi abolido (Figura 27C), entretanto, uma leve regulação para cima de LY6A foi ainda detectada (Figura 27a).
Estes dados indicam uma alça de retroalimentação positiva pela qual a estimulação por LY6C em IEC resulta na expressão superficial au- mentada de moléculas LY6.
Exemplo 7: Estimulação de LY6A resulta na secreção aumentada de quimio- cinas
As funções de moléculas LY6 não foram totalmente elucidadas. Para examinar o papel de moléculas LY6 na imunopatologia da colite, esti- mulação de moléculas LY6 foi estudada por afetar na transcrição e na se- creção de quimiocinas em IEC.
Para analisar a produção de quimiocinas de IEC em resposta a ligação cruzada de moléculas LY6 murinos, células YAMC, pré-tratadas com IFNy ou não-tratadas, foram cultivadas em placas recobertas com anticorpo 25 controle anti-KLH, antiLY6A ou antiLY6C. Vinte e quatro horas depois, mR- NA destas células foi obtido e analisado por RT-PCR quantitativa da expres- são de CCL2, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL25, CXCL1, CXCL2, CXCL5, CXCL10, CXCL12 e CX3CL1, que são quimiocinas que foram envolvidos na colite (Tabela 9) (Papadakis, K.A. (2004) Curr Allergy Asthma Rep 4:83-89; 30 Banks, C. et al., (2003) J Pathol 199:28-35; e Papadakis, K.A., and S.R. Tar- gan (2000) Inflamm Bowel Dis 6:303-313). O ensaio foi realizado sob condi- ções de crescimento não-permissivas (37°C na ausência de IFNy) para ex- cluir a possibilidade da proliferação aumentada de IEC em resposta a esti- mulação por IFNy.
Tabela 9
Pré- Médias IFN tratamento > Ligação Anti- An- An- Anti- An- AntiLY6C Cruzada > KLH tiLY6A tiLY6C KLH tiLY6A CCL2 1,01 -1,38 8,81 3,53 2,83 16,12 (0,14) (0,13) (0,72) (0,21) (0,21) (0,56) CCL4 1,31 1,83 3,15 5,35 3,65 16,12 (1,14) (0,49) (1,17) (0,48) (0,69) (0,56) CCL5 1,00 1,09 3,31 2,73 2,76 10,13 (0,10) (0,02) (0,15) (0,13) (0,23) (0,27) CCL7 1,00 1,06 3,37 2,82 1,39 5,81 (0,11) (0,08) (0,15) (0,44) (0,33) (0,51) CCL8 1,03 2,05 12,78 74,22 74,44 110,44 (0,30) (0,37) (3,14) (8,94) (9,81) (3,36) CCL25 1,01 1,06 1,16 1,38 1,32 1,46 (0,16) (0,11) (0,00) (0,36) (0,15) (0,19) CXCL1 1,00 -3,17 11,58 -1,13 -1,64 13,36 (0,07) (0,11) (0,12) (0,10) (0,17) (0,35) CXCL2 1,33 ND 21,81 14,30 10,95 113,20 (1,10) (3,13) (3,30) (3,05) (16,23) CXCL5 1,08 ND 118,45 1,70 ND 150,99 (0,53) (65,14) (1,15) (55,50) CXCL10 1,00 1,02 5,11 5,68 5,22 12,22 (0,05) (0,06) (0,19) (0,31) (0,22) (0,51) CXCL12 1,01 1,12 -1,99 -1,11 -1,23 -3,02 (0,14) (0,05) (0,14) (0,05) (0,21) (0,06) CX3CL1 1,00 -1,18 1,92 2,21 1,87 3,22 (0,08) (0,15) (0,07) (0,11) (0,16) (0,42) As células pré-tratadas com IFNy mostraram regulação para ci-
ma de muitos destes genes de quimiocina (vide médias, grupo Anti-KLH ver- sus IFNy, grupo Anti-KLH da Tabela 9). Entretanto, com a exceção de uma regulação para cima de CCL8 e um regulação para baixo de CXCL1, an- tiLY6A estimulou células YAMC mostrou similares padrões de expressão gênica conforme células YAMC estimuiadas por anti-KLH. Entretanto, célu- Ias YAMC estimuladas com antiLY6C mostraram a expressão aumentada de todas as quimiocinas analisadas exceto CCL25, que permaneceu essenci- almente inalterada, e CXCL12, que foi regulada para baixo em resposta à estimulação de LY6C. Enquanto a expressão gênica aumentada de quimio- 5 cinas induzida pela ligação cruzada à LY6C não foi dependente de IFNy, células pré-tratadas com IFNy mostraram a expressão aumentada de quimi- ocinas versus células que não foram pré-tratadas com IFNy.
Para analisar a cinética da indução de quimiocina induzida por estimulação de LY6C murino, placas de 96 poços foram recobertas com an- 10 ticorpo anti-KLH ou antiLY6A ou anticorpos monoclonais antiLY6C. Células YAMC, pré-tratadas ou não com IFNy, foram adicionadas por 24, 48 ou 72 horas. No ponto de tempo indicado, o RNA foi coletado para análise por RT- PCR quantitativa e sobrenadantes foram coletados para ELISA.
Em 24 horas, um pico de transcrição de ambos CXCL5 e CCL7 15 foi detectado em células com ligação cruzada LY6C, mas não LY6A (Figura 28A). Expressão aumentada de CXCL5 e CCL7 diminuíram ao longo do tempo mas foram ainda detectáveis após 72 horas em cultura. Apesar de IFNy não ser requerido para aumentar a transcrição de quimiocina, IFNy atu- ou sinergisticamente com a estimulação de LY6C na indução da transcrição 20 de ambos CXCL5 e CCL7 em pontos de tempo mais precoces.
Em paralelo com a expressão gênica, sobrenadantes de LY6C, mas não LY6A, células com ligação cruzada continham concentrações signi- ficativamente maiores de CXCL5 em 48 horas (Figura 28B). O efeito foi do- se-dependente, e detectável tão pouco como 1 μg/ml de antiLY6C revestido. 25 Como na transcrição, a secreção de CXCL5 foi aumentada quando as célu- las foram pré-tratadas com IFNy, mas IFNy não foi necessário para o efeito. A secreção aumentada de CXCL5 foi observada em ambos os pontos de tempo 24 e 72 horas também.
Para assegurar que LY6C esteve envolvida na regulação para cima observada de quimiocinas, usamos siRNA para reduzir a expressão de LY6C. O transcrito de LY6C foi inibido em 95% na ausência de IFNy e apro- ximadamente 90% na presença de IFNy por RT-PCR quantitativa em tempo real que corresponde a níveis significativamente menores de LY6C na super- fície das células YAMC (dado não-mostrado). Células com níveis reduzidos de LY6C na superfície mostraram uma resposta diminuída a ligação cruzada à LY6C com relação à transcrição do quimiocinas (Figura 28C). A secreção 5 de CXCL5 foi marcadamente inibida pela redução da expressão de LY6C também (dado não-mostrado).
Estes resultados indicam que ligação cruzada de LY6C, mas não LY6A, na superfície de IEC resulta na secreção aumentada de quimiocinas. Exemplo 8: IEC in vivo mostram uma expressão gênica de quimiocina similar a células estimuladas por LY6C
Os dados acima estabelecem um modelo pelo qual IEC estimu- ladas através de LY6C murino regula para cima significativamente a expres- são de genes de quimiocina.
A análise dos dados de microarranjo de IEC microdissecadas por captura em laser em modelos murinos de colite, a expressão dos mes- mos 12 genes de quimiocina em camundongos saudáveis e colíticos nos dois modelos murinos da colite foi examinada para determinar se as quimio- cinas estimuladas pela ligação cruzada à LY6C in vitro correlacionam-se com as quimiocinas secretadas por IEC in vivo (Figuras 29A e 29B). Embora o padrão de expressão não seja idêntico ao regulação para cima de quimio- cinas resultante da estimulação por LY6C, expressão de CXCL5, que foi o gene de quimiocina mais altamente regulada para cima em estudos in vitro, foi também a maior quimiocina regulada para cima em modelos murinos da colite. Foi visto regulação para cima significante na expressão de CXCL1, CXCL10, CCL5 e CCL7 em ambos os modelos de colite. Além disso, foi vis- to regulação para cima de CCL4 e CCL8 no modelo de colite de transferên- cia ou modelo IL10-/-, respectivamente.
Interessantemente, a única quimiocina que foi regulado para baixo como um resultado de estimulação de LY6C murino in vitro, CXCL12 foi também a única destas quimiocinas reguladas para baixo in vivo.
Exemplo 9: Expressão de genes LY6 humanos em células de cólon
A expressão de LY6H, LYPD1, LYPD3, e LYPD5 humanas em uma linhagem celular do cólon humana, células Colo 205 (uma linhagem celular derivada de carcinoma do cólon humano, ATCC® número de acesso CCL-222®), foi examinado. Células Colo 205 humanas foram tratadas com as citoquinas IFN-r, LPS, TNF a, IFN-r + TNF a, IFN-r + LPS, ou LPS + TNF 5 a (todos em 100 ng/ml, exceto LPS a 1 ug/ml) por 18 horas (LYPD3) ou 24 horas (LY6H ou LYPD5). RNA foi coletado e purificado e a expressão do membro da família LY6 indicado foi determinado por RT-PCR quantitativa usando de reagentes da Applied Biosystems® de acordo com instruções do fabricante. Iniciadores e sondas usadas para a análise RT-PCR foram os 10 seguintes:
LYPD1:
Sentido direto: CAT GAT CCT CCG AAT CTG GT (SEQ ID NO:59) Antissenso: AGC ACA GAA CAG AGG GGC TA (SEQ ID N0:60)
Sonda: ATA CGG CCA ATG TCA CACA (SEQ ID NO:61)
LYPD3:
Sentido direto: ACT TCC TGT TCC CAC CAC TG (SEQ ID NO:62) Antissenso: AGA GGA CAA GCG GAG AGA CA (SEQ ID NO:63)
Sonda: TTC TGG CAG GGG TGT TCT AG (SEQ ID NO:64)
LY6H:
Sentido direto: AGC AGC AGC AGG AAG GAT (SEQ ID NO:65) Antissenso: AAA AGT GCC GCT TAA CGA AG (SEQ ID NO:66)
Sonda: CAA GAT GTG TGC TTC CTC CTG CGA (SEQ ID NO:67)
Iniciadores e sondas para LYPD5 foram adquiridas de Applied Biosysems® (número de catálogo HS00289062_m1).
Os resultados plotados nas Figuras 30A a 30C indicam aumen-
tos de vezes na expressão destes genes LY6 humanos em relação ao con- trole de B-actina humana. Aumentos significantes na expressão de LY6H, LYPD3, e LYPD5 humanas foram observados seguintes ao tratamento com as citoquinas indicadas.
Exemplo 10: Expressão de genes LY6 humanos em tecido de biópsia do cólon
Para investigar ainda a fonte do LYPD1 aumentado e expressão de LYPD5 no cólon de pacientes com CD e UC, foi combinado em uma coor- te de biópsias de pacientes com UC, CD e controles. Análise por microarran- jo para expressão de LYPD1 usando RNA extraído de biópsias de cólon mostraram expressão estatisticamente aumentada tecido de cólon inflamado 5 de pacientes com CD (Figura 31 A). Nas biópsias de UC e CD tomadas de cólon, a expressão de LYPD5 estatisticamente aumentada foi observada em pacientes com UC e CD inflamados (Figura 31B). Isto não foi observado nas biópsias do controle não-inflamadas.
A expressão de LY6H humano nas biópsias de íleo terminal de tecido com IBD inflamado foi analisada em relação ao biópsias de íleo termi- nal controle (não-IBD) usando análise por RT-PCR (Taqman®). A expressão de LY6H humana foi pelo menos 1,5 vezes maior nas biópsias de IBD infla- madas em relação ao controle.
A expressão de LYPD3 humana em biópsias de cólon de UC inflamadas foi regulada para cima e pelo menos de 2 vezes maior nas bióp- sias de IBD inflamadas em relação ao controle.
Os resultados destes exemplos demonstraram a expressão de moléculas LY6 na superfície de IEC, e ainda indicaram que a expressão é única para IEC no contexto da inflamação. Além disso, os níveis de expres- 20 são superficiais de LY6A e LY6C foram altos em IEC de camundongos colíti- cos, e quase universais em todas as partes do cólon. Como moléculas am- bas específicas para o estado doente, expressos em toda parte durante a doença, a detecção do gene LY6 humano ou expressão gênica ou polipeptí- dica, particularmente LY6H, LYPD1, LYPD3, e LYPD5 humanas, como mé- 25 todo útil para detecção de IBD, incluindo UC e/ou CD em humanos. Adicio- nalmente, o método de detecção da expressão de LY6 humana é útil para diagnosticar IBD1 UC e/ou CD em um ser humano e monitorar a resposta a agentes terapêuticos para IBD.
Nos Exemplos descritos aqui, a significação funcional da ex- pressão de LY6 em IEC foi demonstrada. Células YAMC foram fortemente positivas para LY6A, e expressaram níveis menores de LY6C. Entretanto, sob estímulo com diversas citoquinas presentes no cólon durante a colite, incluindo IL-1 β, TNF α, IFN α, e em particular IL-22 e IFNy. os níveis de ex- pressão de ambas as moléculas LY6 foram grandemente aumentadas. Célu- las YAMC pré-tratadas com IFNy à expressão reguladas para cima de molé- culas LY6, foram um modelo in vitro útil para analisar a significação funcional 5 da expressão de LY6.
A natureza condicionalmente imortalizada das células YAMC vem do promotor de MHC Il dirigida pela expressão do grande antígeno T de SV40; baixos níveis (2,5 a 5 U/ml) de IFNy são usados para dirigir a prolife- ração destas células (Whitehead, R.H. et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:587-591; Whitehead, R.H., e J.L. Joseph. (1994) Epithelial Cell Biol 3:119-125). Células YAMC são muitas vezes usadas como um modelo in vitro para tratamentos com citoquina de IEC murino (Mei, J.M. et al. (2000) Faseb J 14:1188-1201; Yan1 F., and D.B. Polk (2002) J Biol Chem 277:50959-50965). O grande antígeno T de SV40 que estas células contêm são sensíveis à temperatura, e é não-funcional a 37°C. Todos os experimen- tos realizados aqui envolveram tratamento com IFNy sob estas condições não-permissivas. Além disso, células YAMC foram privadas de soro (e priva- das de IFNy) a 37°C por 24 horas antes dos experimentos. Sob tais condi- ções, efeitos indicando a expressão residual de antígeno T, tais como proli- feração de células, não foram observados. Por conseguinte, efeitos de tra- tamento com IFNy foram devidos a efeitos inerentes de IFNy em vez de efei- tos que se originam pelo direcionamento da expressão do antígeno T. Além disso, a regulação para cima dos membros da família LY6 foi detectada em uma segunda linhagem celular murino, CMT93, confirmando que este efeito é largamente aplicável a IEC.
Além disso, IFNy não foi a única entre as citoquinas para indu- ção de moléculas LY6 como regulação para cima modesta da expressão de LY6 foi notada após tratamento com TNF a, IL-1 β e IL-22. A regulação para cima de moléculas LY6 em IEC na resposta à IL-22 é interessante à Iuz de 30 dados recentes que demonstrando um papel potencial de IL-22 na Doença de Crohn (Wolk, K., et al. J Immunol 178:5973-5981 (2007)). Embora a ho- mologia entre moléculas LY6 de camundongo e humanas muitas vezes seja complicada, há evidência para sugerir que a regulação para cima de molécu- las LY6 não seja restrita a camundongos. Estudos prévios em ratos sugeri- ram regulação para cima de moléculas LY6 no intestino delgado em modelos de colite, e foi sugerido que tal expressão esteja envolvida em inflamação, 5 interações de célula/célula bem como sinalização nas IEC de rato (Bakshe- ev, L. et al. J Gastroenterol 41:1041-1052 (2006)).
Os dados descritos acima indicam que há uma possibilidade que a integridade de jangada lipídica esteja envolvida na transdução de sinal mediada por LY6C em IEC. Isto implica que a alteração das jangadas lipídi- cas poderia servir atenuar a jusante da estimulação de LY6C ambas por re- gulação para baixo da expressão LY6C e alteração dos componentes estru- turais da sinalização de LY6C. Recentemente, foi determinado que a deple- ção de colesterol de IEC com estatinas inibe a expressão gênica pró- inflamatória através de modulação de NF-κ B (Lee, J. et al., Int Immuno- pharmacol 7:241-248 (2007)). Além disso, as estatinas foram terapeutica- mente eficazes em modelos murinos da colite (Naito, Y., et al. Int J Mol Med 17:997-1004 (2006)). O mecanismo de motilidade das jangada lipídica e blo- queio de NF-κ B permanece indeterminado, mas os nossos dados sugerem que ativação através de LY6C possa ser uma hipótese para explicar o me- canismo de ação.
Neste estudo, identifica-se moléculas LY6 como um potencial regulador a montante na expressão de genes de quimiocina. A ligação cru- zada do receptor LY6C com anticorpos monoclonais resultou em regulação para cima dramática de quase todas as quimiocinas analisadas, incluindo 25 CXCL5. Confirma-se ainda que a secreção de CXCL5 é grandemente au- mentada em ligação cruzada à LY6C de IEC. É interessante que embora ambas LY6A e LY6C estejam ancoradas a superfície celular por uma porção GPI, e apesar dos níveis maiores da expressão de LY6A do que LY6C na superfície de IEC, que os efeitos a jusante na secreção de quimiocina sejam 30 vistos com ligação cruzada à LY6C e não consistentemente com ligação cruzada à LY6A.
Exemplo 11: Identificação de um Iigante para LYPD5 Neste estudo, uma pesquisa por Iigantes de LYPD5 foi realizada por técnicas bem-conhecidas àqueles versados na técnica, ou seja pela ex- pressão por clonagem de aproximadamente 14.000 genes humanos sob o promotor CMV em células COS. Grupos de 100 genes foram transfectados 5 nas células COS cultivadas em 140 poços em placas 12 poços. Seguinte a transfecção, as células foram marcadas com proteína LYPD5-Fc (vide a Fi- gura 32). Poços com marcação positiva foram identificados e clones indivi- duais foram transfectados em células COS. Um único poço expressando uma única proteína, GLG-1 (ESL-1) foi identificado como um Iigante para 10 LYPD5. GLG-1 é caracterizado por um domínio extracelular longo (ECD), um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático. Uma série de estudos de coimunoprecipitação foi conduzida usando técnicas conhecidas por aque- les versados na técnica para avaliar a capacidade de várias regiões da ECD de GLG-1 para ligar-se à LYPD5. Foi encontrado que variantes ou fragmen- 15 tos do ECD de GLG-1 (vide Figuras 33 a 35) foram capazes de servir como um Iigante para LYPD5. A figura 33B mostra os resultados dos estudos de coimunoprecipitação usando Fragmentos 1, 2, 3, ou 4 como representado na Figura 33A e demonstra que qualquer um dos fragmentos é suficiente para ligação à LYPD5.
Além disso, um domínio de ECD de GLG-1 foi considerado ser
suficiente por si mesmo para ligação à LYPD5. Como mostrado na Figura 33, GLG-1 é composto de múltiplos domínios GLG-1 e domínios GLG-1 úni- cos podem ligar-se à LYPD5. A figura 34B mostra os resultados de uma co- imunoprecipitação demonstrando Fragmentos 1, 2, 3, e 4, bem como domí- 25 nios únicos GLG-1 115, 150, 215, 538, 609, 670, 729, e 858 (como mostrado na Figura 34A) foram capazes de ligar-se à LYPD5.
Através de outro estudo de coimunoprecipitação, a ligação foi mostrada ser específica com base nos fragmentos de LYPD5 (vide Figura 35A) em que foi verificado LYPD5 não ligar-se ao controle negativo BAP, um 30 controle negativo FN14 foi verificado não ligar-se ao fragmento 2 de GLG-1, o domínio humano GLG-1 115 se liga à LYPD5, o domínio 115 não é sempre expresso em níveis detectáveis mas ainda reduz LYPD5, e a fração do fragmento 1 de GLG-1 humano que não tem do domínio 115 (resíduos 26 a 114) não se liga à LYPD5 (Figura 35B).
O nas Figuras 34A e 35A indica um potencial sítio de fucosi-
lação.
Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum
detalhe por meio de ilustração e exemplos com objetivos de clarear o enten- dimento, as descrições e exemplos não devem ser interpretados como Iimi- tante ao escopo da invenção. As revelações de todas as literaturas de paten- tes e científicas citadas aqui são expressamente incorporadas em sua totali- dade por referência.
Listagem de Seqüência
<110> Diehl, Lauri;
Flanagan, Kenneth;
Mo, Lian;
Genentech Inc.,
<120> MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL <130> 39766-0296.PCT <140> Ainda não atribuído <141> Com a presente 20 <I50> US 60/891,196 <151> 2007-02-22 <150> US 60/987,752 <151> 2007-11-13 <150> US 61/024,170 25 <151> 2008-01-28 <160> 69
<170> FastSEQ for Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 957 <212> DNA
<213> Homo Sapiens <400> 1 cgcgtctgcg gctgcgttcc ccgaaagacg aggctgcgcc cggattccgg tccgcaggga 60
gaccgaaggg cacagctccc cgcgccgcgc acgccgcccg agcccggagt gcggacaccc 120
ccgggatgct tgcgccccag aggacccgcg ccccaagccc ccgcgccgcc cccaggccca 180
cccggagcat gctgcctgca gccatgaagg gcctcggcct ggcgctgctg gccgtcctgc 240
tgtgctcggc gcccgctcat ggcctgtggt gccaggactg caccctgacc accaactcca 300
gccattgcac cccaaagcag tgccagccgt ccgacacggt gtgtgccagt gtccgaatca 360
ccgatcccag cagcagcagg aaggatcact cggtgaacaa gatgtgtgcc tcctcctgtg 420
acttcgttaa gcgacacttt ttctcagact atctgatggg gtttattaac tctgggatct 480
taaaggtcga cgtggactgc tgcgagaagg atttgtgcaa tggggcggca ggggcagggc 54 0
acagcccctg ggccctggcc ggggggctcc tgctcagcct ggggcctgcc ctcctctggg 600
ctgggccetg atgtctcctc cttcccacgg ggcttctgag cttgctcccc tgagcctgtg 660
gctgccctct ccccagcctg gcgtggctgg ggctgggggc agccttggcc cagctccgtg 720
gctgtggcct gtggctctca ctcctccccc gacgtgaagc ctccctgtct ctccgccagc 780
tctgagtccc aggcagctgg acatctccag gaaaccaggc catctgggca ggaggcctgg 84 0
ggatgagggt ggggggggac ccccaggtcc cggaggggaa gtgaagcaac agcccagctg 900
gaagggcgtc ttctgcggag aaataaagtc acttttgagt cctgagaaaa aaaaaaa 957 <210> 2 <211> 140 <212> PRT 20 <213> Homo Sapiens <400> 2
Met Leu Pro Ala Ala Met Lys 1 5
Leu Leu Cys Ser Ala Pro Ala
2ο
Leu Thr Thr Asn Ser Ser His 35
Asp Thr Val Cys Ala Ser Val 50 55
Lys Asp His Ser Val Asn Lys 65 70
Lys Arg His Phe Phe Ser Asp
Gly Leu Gly Leu Ala 10
His Gly Leu Trp Cys 25
Cys Thr Pro Lys Gln 40
Arg He Thr Asp Pro 60
Met Cys Ala Ser Ser 75
Tyr Leu Met Gly Phe
Leu Leu Ala Val 15
Gln Asp Cys Thr 30
Cys Gln Pro Ser 45
Ser Ser Ser Arg
Cys Asp Phe Val 80
He Asn Ser Gly 85 90 95
He Leu Lys Val Asp Val Asp Cys Cys Glu Lys Asp Leu Cys Asn Gly IOO 105 110
Ala Ala Gly Ala Gly His Ser Pro Trp Ala Leu Ala Gly Gly Leu Leu 5 115 120 125
Leu Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Trp Ala Gly Pro 130 135 140
<210> 3 <211> 2683 <212> DNA
<213> Homo Sapiens <400> 3
agggcggtgt caatgcaccc tccagcggtg cgcgcaggcg ggagaaggga gggcggcccg 60 ggcaagtgag acagttaagg cagtgtcccc accacacccc cacccagatt ggccacgccg 120 agctggttct tgacagaagg ccttcgcgga ggaagagggg gcacagctgc acaggacacc 180 ctacggagcc tgcgggcgtg gaactttgcc aggcgcacgg gaacgcgcgc ccttcctgtc 240 agcctcccgg ggcgccaggc tcccgcggcc cgcagcggga cagcctcagt tgtgtgggct 300 ggacccagtc gctggggtac cgaccagtcc tggaaggcgc agaggacgtg gagtggggag 360 gctgccttcc tatgtgcgaa gggccagccg ggcacgcagt cctcagaccc tagtccgcac 420 ccggcaggtc cccacggcac ctgctgcgcc ctcctcgccg ctcccccaac ctccccatct 480 cagaaaacta ccagttctct cccgcccccc ggcgcccctt tcccaggaac gtgcggaggc 540 gggagaagag gaagacagga agggggtggg gatgtgaagc gaccgtccca gccttccccg 600 cccgccaccc ccaccccaac tcggcagccg tcacgtgatg cctggagtgg gaggtgggga 660 gaaaaggcga gacttttgtg ggtgctcccg atcgccagta gttccttcag tctcagccgc 720 caactccgga ggcgcggtgc tcggcccggg agcgcgagcg ggaggagcag agacccgcag 780 ccgggagccc gagcgcgggc gatgcaggct ccgcgagcgg cacctgcggc tcctctaagc 840 tacgaccgtc gtctccgcgg cagcagcgcg ggccccagca gcctcggcag ccacagccgc 900 tgcagccggg gcagcctccg ctgctgtcgc ctcctctgat gcgcttgccc tctcccggcc 960 ccgggactcc gggagaatgt gggtcctagg catcgcggca actttttgcg gattgttctt 1020 gcttccaggc tttgcgctgc aaatccagtg ctaccagtgt gaagaattcc agctgaacaa 1080 cgactgctcc tcccccgagt tcattgtgaa ttgcacggtg aacgttcaag acatgtgtca 1140 gaaagaagtg atggagcaaa gtgccgggat catgtaccgc aagtcctgtg catcatcagc 1200 ggcctgtctc atcgcctctg ccgggtacca gtccttctgc tccccaggga aactgaactc 1260 agtttgcatc agctgctgca acacccctct ttgtaacggg ccaaggccca agaaaagggg 1320 aagttctgcc tcggccctca ggccagggct ccgcaccacc atcctgttcc tcaaattagc 1380 cctcttctcg gcacactgct gaagctgaag gagatgccac cccctcctgc attgttcttc 1440 cagccctcgc ccccaacccc ccacctccct gagtgagttt cttctgggtg tccttttatt 1500 ctgggtaggg agcgggagtc cgtgttctct tttgttcctg tgcaaataat gaaagagctc 1560 ggtaaagcat tctgaataaa ttcagcctga ctgaattttc agtatgtact tgaaggaagg 1620 aggtggagtg aaagttcacc cccatgtctg tgtaaccgga gtcaaggcca ggctggcaga 1680 gtcagtcctt agaagtcact gaggtgggca tctgcctttt gtaaagcctc cagtgtccat 1740 tccatccctg atgggggcat agtttgagac tgcagagtga gagtgacgtt ttcttagggc 1800 tggagggcca gttcccactc aaggctccct cgcttgacat tcaaacttca tgctcctgaa 1860 aaccattctc tgcagcagaa ttggctggtt tcgcgcctga gttgggctct agtgactcga 1920 gactcaatga ctgggactta gactggggct cggcctcgct ctgaaaagtg cttaagaaaa 1980 tcttctcagt tctccttgca gaggactggc gccgggacgc gaagagcaac gggcgctgca 2040 caaagcgggc gctgtcggtg gtggagtgcg catgtacgcg caggcgcttc tcgtggttgg 2100 cgtgctgcag cgacaggcgg cagcacagca cctgcacgaa cacccgccga aactgctgcg 2160 aggacaccgt gtacaggagc gggttgatga ccgagctgag gtagaaaaac gtctccgaga 2220 aggggaggag gatcatgtac gcccggaagt aggacctcgt ccagtcgtgc ttgggtttgg 2280 ccgcagccat gatcctccga atctggttgg gcatccagca tacggccaat gtcacaacaa 2340 tcagccctgg gcagacacga gcaggaggga gagacagaga aaagaaaaac acagcatgag 2400 aacacagtaa atgaataaaa ccataaaata tttagcccct ctgttctgtg cttactggcc 2460 aggaaatggt accaattttt cagtgttgga cttgacagct tcttttgcca caagcaagag 2520 agaatttaac actgtttcaa acccggggga gttggctgtg ttaaagaaag accattaaat 2580 gctttagaca gtgtatttat accagttgat gtctgttaat tttaaaaaaa tgttttcatt 2640 ggtgtttgtt tgcgtatcca gaaagcagtt catgttatcc ata 2683
<210> 4 <211> 1959 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 4
gatgcctgga gtgggaggtg gggagaaaag gcgagacttt tgtgggtgct cccgatcgcc 60 agtagttcct tcagtctcag ccgccaactc cggaggcgcg gtgctcggcc cgggagcgcg 120 agcgggagga gcagagaccc gcagccggga gcccgagcgc gggcgatgca ggctccgcga 180
gcggcacctg cggctcctct aagctacgac agcagcctcg gcagccacag ccgctgcagc tgatgcgctt gccctctccc ggccccggga 5 ggcaactttt tgcggattgt tcttgcttcc gtgtgaagaa ttccagctga acaacgactg ggtgaacgtt caagacatgt gtcagaaaga ccgcaagtcc tgtgcatcat cagcggcctg ctgctcccca gggaaactga actcagtttg 10 cgggccaagg cccaagaaaa ggggaagttc caccatcctg ttcctcaaat tagccctctt ccaccccctc ctgcattgtt cttccagccc gtttcttctg ggtgtccttt tattctgggt cctgtgcaaa taatgaaaga gctcggtaaa 15 tttcagtatg tacttgaagg aaggaggtgg cggagtcaag gccaggctgg cagagtcagt ttttgtaaag cctccagtgt ccattccatc gtgagagtga cgttttctta gggctggagg acattcaaac ttcatgctcc tgaaaaccat 20 ctgagttggg ctctagtgac tcgagactca cgctctgaaa agtgcttaag aaaatcttct acgcgaagag caacgggcgc tgcacaaagc cgcgcaggcg cttctcgtgg ttggcgtgct cgaacacccg ccgaaactgc tgcgaggaca 25 tgaggtagaa aaacgtctcc gagaagggga tcgtccagtc gtgcttgggt ttggccgcag agcatacggc caatgtcaca acaatcagcc gagaaaagaa aaacacagca tgagaacaca ccctctgttc tgtgcttact ggccaggaaa 30 agcttctttt gccacaagca agagagaatt tgtgttaaag aaagaccatt aaatgcttta <210> 5
cgtcgtctcc gcggcagcag cgcgggcccc 240 cggggcagcc tccgctgctg tcgcctcctc 300 ctccgggaga atgtgggtcc taggcatcgc 360 aggctttgcg ctgcaaatcc agtgctacca 420 ctcctccccc gagttcattg tgaattgcac 480 agtgatggag caaagtgccg ggatcatgta 540 tctcatcgcc tctgccgggt accagtcctt 600 catcagctgc tgcaacaccc ctctttgtaa 660 tgcctcggcc ctcaggccag ggctccgcac 720 ctcggcacac tgctgaagct gaaggagatg 780 tcgcccccaa ccccccacct ccctgagtga 840 agggagcggg agtccgtgtt ctcttttgtt 900 gcattctgaa taaattcagc ctgactgaat 960 agtgaaagtt cacccccatg tctgtgtaac 1020 ccttagaagt cactgaggtg ggcatctgcc 1080 cctgatgggg gcatagtttg agactgcaga 1140 gccagttccc actcaaggct ccctcgcttg 1200 tctctgcagc agaattggct ggtttcgcgc 1260 atgactggga cttagactgg ggctcggcct 1320 cagttctcct tgcagaggac tggcgccggg 1380 gggcgctgtc ggtggtggag tgcgcatgta 1440 gcagcgacag gcggcagcac agcacctgca 1500 ccgtgtacag gagcgggttg atgaccgagc 1560 ggaggatcat gtacgcccgg aagtaggacc 1620 ccatgatcct ccgaatctgg ttgggcatcc 1680 ctgggcagac acgagcagga gggagagaca 1740 gtaaatgaat aaaaccataa aatatttagc 1800 tggtaccaat ttttcagtgt tggacttgac 1860 taacactgtt tcaaacccgg gggagttggc 1920 gacagtgta 1959 <211> 141
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 5
Met Trp Val Leu Gly Ile Ala Ala Thr Phe Cys Gly Leu Phe Leu Leu 15 10 15
Pro Gly Phe Ala Leu Gln Ile Gln Cys Tyr Gln Cys Glu Glu Phe Gln 20 ' 25 30
Leu Asn Asn Asp Cys Ser Ser Pro Glu Phe Ile Val Asn Cys Thr Val 35 40 45
Asn Val Gln Asp Met Cys Gln Lys Glu Val Met Glu Gln Ser Ala Gly 50 55 60
Ile Met Tyr Arg Lys Ser Cys Ala Ser Ser Ala Ala Cys Leu Ile Ala 65 70 75 80
Ser Ala Gly Tyr Gln Ser Phe Cys Ser Pro Gly Lys Leu Asn Ser Val
85 90 95
Cys Ile Ser Cys Cys Asn Thr Pro Leu Cys Asn Gly Pro Arg Pro Lys 100 105 110
Lys Arg Gly Ser Ser Ala Ser Ala Leu Arg Pro Gly Leu Arg Thr Thr 115 120 125
Ile Leu Phe Leu Lys Leu Ala Leu Phe Ser Ala His Cys 130 135 140
<210> 6 <211> 1745 <212> DNA
<213> Homo Sapiens <400> 6
aaggctgggg ttgcctgggg cgaggttact catcctgggc tcaggtaaga gggcccgagc 60 tcggaggcgg cacatccagg ggggacgcca agggagcagg acggagccat ggaccccgcc 120 aggaaagcag gtgcccaggc catgatctgg actgcaggct ggctgctgct gctgctgctt 180 cgcggaggag cgcaggccct ggagtgctac agctgcgtgc agaaagcaga tgacggatgc 240 tccccgaaca agatgaagac agtgaagtgc gcgccgggcg tggacgtctg caccgaggcc 300 gtgggggcgg tggagaccat ccacggacaa ttctcgctgg cagtgcgggg ttgcggttcg 360 ggactccccg gcaagaatga ccgcggcctg gatcttcacg ggcttctggc gttcatccag 420 ctgcagcaat gcgctcagga tcgctgcaac gccaagctca acctcacctc gcgggcgctc 480 gacccggcag gtaatgagag tgcatacccg cccaacggcg tggagtgcta cagctgtgtg 540 ggcctgagcc gggaggcgtg ccagggtaca tcgccgccgg tcgtgagctg ctacaacgcc 600 agcgatcatg tctacaaggg ctgcttcgac ggcaacgtca ccttgacggc agctaatgtg 660 actgtgtcct tgcctgtccg gggctgtgtc caggatgaat tctgcactcg ggatggagta 720 acaggcccag ggttcacgct cagtggctcc tgttgccagg ggtcccgctg taactctgac 780 ctccgcaaca agacctactt ctcccctcga atcccacccc ttgtccggct gccccctcca 840 gagcccacga ctgtggcctc aaccacatct gtcaccactt ctacctcggc cccagtgaga 900 cccacatcca ccaccaaacc catgccagcg ccaaccagtc agactccgag acagggagta 960 gaacacgagg cctcccggga tgaggagccc aggttgactg gaggcgccgc tggccaccag 1020 gaccgcagca attcagggca gtatcctgca aaaggggggc cccagcagcc ccataataaa 1080 ggctgtgtgg ctcccacagc tggattggca gcccttctgt tggccgtggc tgctggtgtc 1140 ctactgtgag cttctccacc tggaaatttc cctctcacct acttctctgg ccctgggtac 1200 CCCtCttCtC atcacttcct gttcccacca ctggactggg ctggcccagc ccctgttttt 1260 ccaacattcc ccagtatccc cagcttctgc tgcgctggtt tgcggctttg ggaaataaaa 1320 taccgttgta tatattctgc caggggtgtt ctagcttttt gaggacagct cctgtatcct 1380 tctcatcctt gtctctccgc ttgtcctctt gtgatgttag gacagagtga gagaagtcag 1440 ctgtcacggg gaaggtgaga gagaggatgc taagcttcct actcactttc tcctagccag 1500 cctggacttt ggagcgtggg gtgggtggga caatggctcc ccactctaag cactgcctcc 1560 cctactcccc gcatctttgg ggaatcggtt ccccatatgt cttccttact agactgtgag 1620 ctcctcgagg gcagggaccg tgccttatgt ctgtgtgtga tcagtttctg gcacataaat 1680 gcctcaataa agatttaatt actttgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaa 1745 <210> 7 <211> 346 <212> PRT
<213> Homo Sapiens <400> 7
Met Asp Pro Ala Arg Lys Ala Gly Ala Gln Ala Met Ile Trp Thr Ala 15 10 15 Gly Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Gly Ala Gln Ala Leu Glu 20 25 30
Cys Tyr Ser Cys Val Gln Lys Ala Asp Asp Gly Cys Ser Pro Asn Lys 35 40 45
Met Lys Thr Val Lys Cys Ala Pro Gly Val Asp Val Cys Thr Glu Ala 50 55 60
Val Gly Ala Val Glu Thr Ile His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Arg 65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Gly Leu Pro Gly Lys Asn Asp Arg Gly Leu Asp Leu 85 90 95
His Gly Leu Leu Ala Phe Ile Gln Leu Gln Gln Cys Ala Gln Asp Arg 100 105 110
Cys Asn Ala Lys Leu Asn Leu Thr Ser Arg Ala Leu Asp Pro Ala Gly 115 120 125
Asn Glu Ser Ala Tyr Pro Pro Asn Gly Val Glu Cys Tyr Ser Cys Val 130 135 140
Gly Leu Ser Arg Glu Ala Cys Gln Gly Thr Ser Pro Pro Val Val Ser 145 150 155 160
Cys Tyr Asn Ala Ser Asp His Val Tyr Lys Gly Cys Phe Asp Gly Asn 165 170 175
Val Thr Leu Thr Ala Ala Asn Val Thr Val Ser Leu Pro Val Arg Gly 180 185 190
Cys Val Gln Asp Glu Phe Cys Thr Arg Asp Gly Val Thr Gly Pro Gly 195 200 205
Phe Thr Leu Ser Gly Ser Cys Cys Gln Gly Ser Arg Cys Asn Ser Asp 210 215 220
Leu Arg Asn Lys Thr Tyr Phe Ser Pro Arg Ile Pro Pro Leu Val Arg 225 230 235 240
Leu Pro Pro Pro Glu Pro Thr Thr Val Ala Ser Thr Thr Ser Val Thr 245 250 255
Thr Ser Thr Ser Ala Pro Val Arg Pro Thr Ser Thr Thr Lys Pro Met 260 265 270 Pro Ala Pro Thr Ser Gln Thr Pro Arg Gln Gly Val Glu His Glu Ala 275 280 285
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Asp Arg Ser Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Ala Lys Gly Gly Pro Gln Gln 305 310 315 320
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Leu Leu Ala Val Ala Ala Gly Val Leu Leu 340 345
<210> 8 <211> 2490 <212> DNA <213> Homo Sapiens
<400> 8
gatccgcttt gcgcatccca gtgattcttg ggttccgcgt gtagtttcgg aaggagacat 60 cgaagcaggg cgaggcgcag agggcgttgc ggactcatgc cccagtcggc agtgcggggt 120 cccaagccct gcagtgctac agctttgagc acacctactt tggccccttt gacctcaggg 180
ccatgaagct gcccagcatc tcctgtcctc atgagtgctt tgaggctatc ctgtctctgg 240 acaccgggta tcgcgcgccg gtgaccctgg tgcggaaggg ctgctggacc gggcctcctg 300
cgggccagac gcaatcgaac gcggacgcgc tgccgccaga ctactcggtg gtgcgcggct 360
gcacaactga caaatgcaac gcccacctca tgactcatga cgccctcccc aacctgagcc 420
aagcacccga cccgccgacg ctcagcggcg ccgagtgcta cgcctgtatc ggggtccacc 480
aggatgactg cgctatcggc aggtcccgac gagtccagtg tcaccaggac cagaccgcct 540
gcttccaggg caatggcaga atgacagttg gcaatttctc agtccctgtg tacatcagaa 600
cctgccaccg gccctcctgc accaccgagg gcaccaccag cccctggaca gccatcgacc 660
tccagggctc ctgctgtgag gggtacctct gcaacaggaa atccatgacc cagcccttca 720
ccagtgcttc agccaccacc cctccccgag cactacaggt cctggccctg ctcctcccag 780
tcctcctgct ggtggggctc tcagcataga ccgcccctcc aggatgctgg ggacagggct 840
cacacacctc attcttgctg cttcagcccc tatcacatag ctcactggaa aatgatgtta 900
aagtaagaat tgcactcctg tccctctggc cttccatctc tcccgccctt gtgccccaca 960
acctggccaa cagtactgga agaaactgga cacagtcacc agcatccccg gggagggcaa 1020 aacagccatg tcgtgccccg atgaagagca attctgatca cagctgttac tcactgagca 1080 ccagccaggc accaggcacc ccataacacg gcttcctgtg ctctccctcc agagcctgtc 1140 gcagctctag gagggagcta tacaatgatg tctttattag tgtcatcatg agaagcccaa 1200 taagcagtat gccctaacag ttagtaggcc aggctctgga gctaagctgc atgggttcaa 1260 atcccagctc caccattcag cctgcagaga ccatgagcga gttacttaag ccaggctctg 1320 gagctaagct gcatgggttc aaatcccagc tccagcattc agcctacaga gaccatgggt 1380 gagttactta agccaggctc tggagctaag ctgcatgggt tcaaatccca gctccaccat 1440 tcagcctgca gagactgtgg gtgagttact tgagctctct gtgccaatat tttctcacct 1500 ataaggtgga ggtgaaaata aactctataa catgacaaga actacttcac agtagttgca 1560 gtgaggattc aacgagatga acatttagta cttgggacac agcagtggcc cagtgtaaat 1620 gggctacttg tcataagccc taagtcacag gtcaacaaac tgagaggcaa aagcacttgg 1680 ttgagcttgt gtatctagtg agtatggatt cagggaccag attcccagcc ccacgaactg 1740 ctaagcaacc ccacctccta aacacatgag tgccgattaa cttcacagaa aaacacacaa 1800 ggcaaagttc agcgaggtga aattctccaa gctataaaga tcagggaaga cttcctggag 1860 gaattcaccc ttgagcaaaa tcctaaagga tcaatagtag ctggcaaaaa gaagcaggag 1920 gaagcgcatt ctaggtagag gagacagcct ggacaaaggt ctgagggagg aaggagcaca 1980 aggagtgcag gacactttca tgagtgcagg acactttcat aactgcatga acttcataga 2040 gatgggatcc tttagcatgt tctctgtgca catgcttgac catgttcttt cacatgcttt 2100 ttgccacttg atctttccag caactcagtg agagaagcaa aaaagtaagt tgcatcctgc 2160 tattgtctga atgtttgtgt ctccccaaaa ttcatctttt gaaacctaat taccaaagtg 2220 atattactgg gaggtggggc ctttgggagg tggtgagatc atgagggtgg agcccccatg 2280 aataggatta gtgcccttat aaaagaggcc ctggagagct gccttgcccc ttccaccaca 2340 tgagaacaca gccagcaggt gcctataagc aagaaagtgg gttctcacca gccatcgaat 2400 ctgctggtgc attgattgca gacttcccag actccagagc tatgagacat aaatttctgt 2460 tgtgtataag ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2490
<210> 9 <211> 2118 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 9
gattcttggg ttccgcgcgt agtttcggaa ggagacatcg aagcagggcg aggcgcagag 60 ggcgttgcgg actcatgccc cagtcggcag tgcggggtcc caagccctgc agtgctacag 120 ctttgagcac acctactttg gcccctttga cctcagggcc atgaagctgc ccagcatctc 180 ctgtcctcat gagtgctttg aggctatcct gtctctggac accgggtatc gcgcgccggt 240 gaccctggtg cggaagggct gctggaccgg gcctcctgcg ggccagacgc aatcgaaccc 300 ggacgcgctg ccgccagact actcggtggt gcgcggctgc acaactgaca aatgcaacgc 360 ccacctcatg actcatgacg ccctccccaa cctgagccaa gcacccgacc cgccgacgct 420 cagcggcgcc gagtgctacg cctgtatcgg ggtccaccag gatgactgcg ctatcggcag 480 gtcccgacga gtccagtgtc accaggacca gaccgcctgc ttccagggca gtggcagaat 540 gacagttggc aatttctcag tccctgtgta catcagaacc tgccaccggc cctcctgcac 600 caccgagggc accaccagcc cctggacagc catcgacctc cagggctcct gctgtgaggg 660 gtacctctgc aacaggaaat ccatgaccca gcccttcacc agtgcttcag ccaccacccc 720 tccccgagca ctacaggtcc tggccctgct cctcccagtc ctcctgctgg tggggctctc 780 agcatagacc gcccctccag gatgctgggg acagggctca cacacctcat tcttgctgct 840 tcagccccta tcacatagct cactggaaaa tgatgttaaa gtaagaattg cactcctgtc 900 cctctggcct tccatctctc ctgcccttgt gccccacaac ctggccaaca gtactggaag 960 aaactggaca cagtcaccag catcccaggg gagggcaaaa cagccatgtc gtgccctgat 1020 gaagagcaat tctgatcaca gctgttactc actgagcacc agccaggcac caggcacccc 1080 ataacacggc ttcctgtgct ctccttccag agcctgtcgc agctctaggg gggagctata 1140 caatgatgtc tttattagtg tcatcatgag aagcccaata agcagtatgc cctaacagtt 1200 agtaggccag gctctggagc taagctgcat gggttcacat cccagctcca ccattcagcc 1260 tgcagagacc atgagcgagt tacttaagcc aggctctgga gctaagctgc atgggttcaa 1320 atcccagctc cagcattcag cctacagaga ccatgggtga gttacttaag ccaggctctg 1380 gagctaagct gcatgggttc aaatcccagc tccaccattc agcctgcaga gactgtgggt 1440 gagttacttg agctctctgt gccaatattt tctcacctat aaggtggagg tgaaaataaa 1500 ctctataaca tgacaagaac tacttcacag tagttgcagt gaggattcaa cgagatgaac 1560 atttagtact tgggacacag cagtggccca gtataaatgg gctacttgtc ataagcccta 1620 agtcacaggt caacaaactg agaggtaaaa gcacttggtt gagcttgtgt atctagtgag 1680 tatggattca gggaccagat tcccagcccc acgaactgct aagcaacccc acctcctaaa 1740 cacatgagtg ccgattaact tcacagaaaa acacacaagg caaagttcag cgaggtgaaa 1800 ttctccaagc tataaagatc agggaagact tcctggagga attcaccctt gagcaaaatc 1860 ctaaaggatc aatagtagct ggcaaaaaga agcaggagga agcacatttt aggtagagga 1920 gacagcctgg acaaaggtct gagggaggaa ggaacacaag gagtgcagga cactttcata 1980 actgcatgaa cttcatagag atgggatcct ttagcatgtt ctctgtgcac atgcttgacc 2040 atgttctttc acatgctttt tgccacttga tctttccagc aactcagtga gagaagcaaa 2100 aaagtaagtt gcatcctg 2118
<210> 10 <211> 208 <212> PRT
<213> Homo Sapiens <400> 10
Met Lys Leu Pro Ser Ile Ser Cys Pro His Glu Cys Phe Glu Ala Ile 15 10 15
Leu Ser Leu Asp Thr Gly Tyr Arg Ala Pro Val Thr Leu Val Arg Lys 20 25 30
Gly Cys Trp Thr Gly Pro Pro Ala Gly Gln Thr Gln Ser Asn Ala Asp 35 40 45
Ala Leu Pro Pro Asp Tyr Ser Val Val Arg Gly Cys Thr Thr Asp Lys 50 55 60
Cys Asn Ala His Leu Met Thr His Asp Ala Leu Pro Asn Leu Ser Gln 65 70 75 80
Ala Pro Asp Pro Pro Thr Leu Ser Gly Ala Glu Cys Tyr Ala Cys Ile 85 90 95
Gly Val His Gln Asp Asp Cys Ala Ile Gly Arg Ser Arg Arg Val Gln 100 105 110
Cys His Gln Asp Gln Thr Ala Cys Phe Gln Gly Asn Gly Arg Met Thr 115 120 125
Val Gly Asn Phe Ser Val Pro Val Tyr Ile Arg Thr Cys His Arg Pro 130 135 140
Ser Cys Thr Thr Glu Gly Thr Thr Ser Pro Trp Thr Ala Ile Asp Leu 145 150 155 160
Gln Gly Ser Cys Cys Glu Gly Tyr Leu Cys Asn Arg Lys Ser Met Thr 165 170 175
Gln Pro Phe Thr Ser Ala Ser Ala Thr Thr Pro Pro Arg Ala Leu Gln 180 185 190
Val Leu Ala Leu Leu Leu Pro Val Leu Leu Leu Val Gly Leu Ser Ala 195 200 205
<210> 11 <211> 806 <212> DNA
<213> Homo Sapiens <400> 11 gcccaccccc gcccagcccg tgcctataag gccttggcaa tgcaggggcc cgcactgctc 60 ccagacgaca tcagagatga ggacagcatt gctgctcctt gcagccctgg ctgtggctac 120 agggccagcc cttaccctgc gctgccacgt gtgcaccagc tccagcaact gcaagcattc 180 tgtggtctgc ccggccagct ctcgcttctg caagaccacg aacacagtgg agcctctgag 240 ggggaatctg gtgaagaagg actgtgcgga gtcgtgcaca cccagctaca ccctgcaagg 300 ccaggtcagc agcggcacca gctccaccca gtgctgccag gaggacctgt gcaatgagaa 360 gctgcacaac gctgcaccca cccgcaccgc cctcgcccac agtgccctca gcctggggct 420 ggccctgagc ctcctggccg tcatcttagc ccccagcctg tgaccttccc cccagggaag 480 gcccctcatg CCtttCCttC cctttctctg gggattccac acctctcttc cccagccgca 540 acgggggtgc caggagcccc aggctgaggg cttccccgaa agtctgggac caggtccagg 600 tgggcatgga atgctgatga cttggagcag gccccacaga ccccacagag gatgaagcca 660 ccccacagag gatgcagccc ccagctgcat ggaaggtgga ggacagaagc cctgtggatc 720 cccggatttc acactccttc tgttttgttg ccgtttattt ttgtactcaa atctctacat 780 ggagataaat gatttaaacc agaaaa 806 <210> 12 <211> 128 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 12
Met Arg Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Val Ala Thr Gly 15 10 15
Pro Ala Leu Thr Leu Arg Cys His Val Cys Thr Ser Ser Ser Asn Cys 20 25 30
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<210> 13
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<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 13
gctccggcca gccgcggtcc agagcgcgcg aggttcgggg agctccgcca ggctgctggt 60 acctgcgtcc gcccggcgag caggacaggc tgctttggtt tgtgacctcc aggcaggacg 120 gccatcctct ccagaatgaa gatcttcttg ccagtgctgc tggctgccct tctgggtgtg 180 gagcgagcca gctcgctgat gtgcttctcc tgcttgaacc agaagagcaa tctgtactgc 240 ctgaagccga ccatctgctc cgaccaggac aactactgcg tgactgtgtc tgctagtgcc 300 ggcattggga atctcgtgac atttggccac agcctgagca agacctgttc cccggcctgc 360 cccatcccag aaggcgtcaa tgttggtgtg gcttccatgg gcatcagctg ctgccagagc 420 tttctgtgca atttcagtgc ggccgatggc gggctgcggg caagcgtcac cctgctgggt 480 gccgggctgc tgctgagcct gctgccggcc ctgctgcggt ttggcccctg accgcccaga 540 ccctgtcccc cgatccccca gctcaggaag gaaagcccag ccctttctgg atcccacagt 600 gtatgggagc ccctgactcc tcacgtgcct gatctgtgcc cttggtccca ggtcaggccc 660 accccctgca cctccacctg ccccagcccc tgcctctgcc caagtgggcc agctgccctc 720 acttctgggg tggatgatgt gaccttcctt gggggactgc ggaagggacg agggttccct 780 ggagtcttac ggtccaacat cagaccaagt cccatggaca tgctgacagg gtccccaggg 840 agaccgtgtc agtagggatg tgtgcctggc tgtgtacgtg ggtgtgcagt gcacgtgaga 900 gcacgtggcg gcttctgggg gccatgtttg gggagggagg tgtgccagca gcctggagag 960 cctcagtccc tgtagccccc tgccctggca cagctgcatg cacttcaagg gcagcctttg 1020 ggggttgggg tttctgccac ttccgggtct aggccctgcc caaatccagc cagtcctgcc 1080 ccagcccacc cccacattgg agccctcctg ctgctttggt gcctcaaata aatacagatg 1140 tcccc 1145
<210> 14 <211> 131 <212> PRT
<213> Homo Sapiens <400> 14
Met Lys Ile Phe Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gly Val Glu 15 10 15
Arg Ala Ser Ser Leu Met Cys Phe Ser Cys Leu Asn Gln Lys Ser Asn 20 25 30
Leu Tyr Cys Leu Lys Pro Thr Ile Cys Ser Asp Gln Asp Asn Tyr Cys 35 40 45
Val Thr Val Ser Ala Ser Ala Gly Ile Gly Asn Leu Val Thr Phe Gly 50 55 60
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Val Asn Val Gly Val Ala Ser Met Gly Ile Ser Cys Cys Gln Ser Phe 85 90 95
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130
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<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 15
ccagtctgtc gccacctcac ttggtgtctg ctgtccccgc caggcaagcc tggggtgaga 60 gcacagagga gtgggccggg accatgcggg ggacgcggct ggcgctcctg gcgctggtgc 120 tggctgcctg cggagagctg gcgccggccc tgcgctgcta cgtctgtccg gagcccacag 180 gagtgtcgga ctgtgtcacc atcgccacct gcaccaccaa cgaaaccatg tgcaagacca 24 0 cactctactc ccgggagata gtgtacccct tccaggggga ctccacggtg accaagtcct 300 gtgccagcaa gtgtaagccc tcggatgtgg atggcatcgg ccagaccctg cccgtgtcct 360 5 gctgcaatac tgagctgtgc aatgtagacg gggcgcccgc tctgaacagc ctccactgcg 420 gggccctcac gctcctccca ctcttgagcc tccgactgta gagtccccgc ccacccccat 480 ggccctatgc ggcccagccc cgaatgcctt gaagaagtgc cccctgcacc aggaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa 550
<210> 16 <211> 125
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 16
Met Arg Gly Thr Arg Leu Ala Leu Leu Ala Leu Val Leu Ala Ala Cys 1 5 10 15
Gly Glu Leu Ala Pro Ala Leu Arg Cys Tyr Val Cys Pro Glu Pro Thr 20 25 30
Gly Val Ser Asp Cys Val Thr Ile Ala Thr Cys Thr Thr Asn Glu Thr 35 40 45
Met Cys Lys Thr Thr Leu Tyr Ser Arg Glu Ile Val Tyr Pro Phe Gln 50 55 60
Gly Asp Ser Thr Val Thr Lys Ser Cys Ala Ser Lys Cys Lys Pro Ser 65 70 75 80
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<210> 17
<211> 3901 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 17
aagatggcgg cgtgtggacg tgtacggagg atgttccgct tgtcggcggc gctgcatctg 60 ctgctgctat tcgcggccgg ggccgagaaa ctccccggcc atggcgtcca cagccagggc 120 cagggtcccg gggccaactt tgtgtccttc Stagggcagg ccggaggcgg cggcccggcg 180 ggtcagcagc tgccccagct gcttcagtca tcgcagcttc agcagcaaca gcagcagcag 240 caacagcaac agcagcttca gccgccgcag ccgcctttcc cggcgggtgg gcctccggcc 300 cggcggggag gagcgggggc tggtgggggc tggaagctgg cggaggaaga gtcctgcagg 360 gaggacgtga cccgcgtgtg ccctaagcac acctggagca acaacctggc ggtgctcgag 420 tgcctgcagg atgtgaggga gcctgaaaat gaaatttctt cagactgcaa tcatttgttg 480 tggaattata agctgaacct aactacagat cccaaatttg aatctgtggc cagagaggtt 540 tgcaaatcta ctataacaga gattaaagaa tgtgctgatg aaccggttgg aaaaggttac 600 atggtttcct gcttagtgga tcaccgaggc aacatcactg agtatcagtg tcaccagtac 660 attaccaaga tgacggccat catttttagt gattaccgtt taatctgtgg cttcatggat 720 gactgcaaaa atgacatcaa cattctgaaa tgtggcagta ttcggcttgg agaaaaggat 780 gcacattcac aaggtgaggt ggtatcatgc ttggagaaag gcctggtgaa agaagcagaa 840 gaaagagaac ccaagattca agtttctgaa ctctgcaaga aagccattct ccgggtggct 900 gagctgtcat cggatgactt tcacttagac cggcatttat attttgcttg ccgagatgat 960 cgggagcgtt tttgtgaaaa tacacaagct ggtgagggca gagtgtataa gtgcctcttt 1020 aaccataaat ttgaagaatc catgagtgaa aagtgtcgag aagcacttac aacccgccaa 1080 aagctgattg cccaggatta taaagtcagt tattcattgg ccaaatcctg taaaagtgac 1140 ttgaagaaat accggtgcaa tgtggaaaac cttccgcgat cgcgtgaagc caggctctcc 1200 tacttgttaa tgtgcctgga gtcagctgta cacagagggc gacaagtcag cagtgagtgc 1260 cagggggaga tgctggatta ccgacgcatg ttgatggaag acttttctct gagccctgag 1320 atcatcctaa gctgtcgggg ggagattgaa caccattgtt ccggattaca tcgaaaaggg 1380 cggaccctac actgtctgat gaaagtagtt cgaggggaga aggggaacct tggaatgaac 1440 tgccagcagg cgcttcaaac actgattcag gagactgacc ctggtgcaga ttaccgcatt 1500 gatcgagctt tgaatgaagc ttgtgaatct gtaatccaga cagcctgcaa acatataaga 1560 tctggagacc caatgatctt gtcgtgcctg atggaacatt tatacacaga gaagatggta 1620 gaagactgtg aacaccgtct cttagagctg cagtatttca tctcccggga ttggaagctg 1680 gaccctgtcc tgtaccgcaa gtgccaggga gacgcttctc gtctttgcca cacccacggt 1740 tggaatgaga ccagtgaatt tatgcctcag ggagctgtgt tctcttgttt atacagacac 1800 gcctaccgca . ctgaggaaca gggaaggagg ctctcacggg agtgccgagc tgaagtccaa 1860 aggatcctac accagcgtgc catggatgtc aagctggatc ctgccctcca ggataagtgc 1920 ctgattgatc tgggaaaatg gtgcagtgag aaaacagaga ctggacagga gctggagtgc 1980 cttcaggacc atctggatga cttggtggtg gagtgtagag atatagttgg caacctcact 2040 gagttagaat cagaggatat tcaaatagaa gccttgctga tgagagcctg tgagcccata 2100 attcagaact tctgccacga tgtggcagat aaccagatag actctgggga cctgatggag 2160 tgtctgatac agaacaaaca ccagaaggac atgaacgaga agtgtgccat cggagttacc 2220 cacttccagc tggtgcagat gaaggatttt cggttttctt acaagtttaa aatggcctgc 2280 aaggaggacg tgttgaagct ttgcccaaac ataaaaaaga aggtggacgt ggtgatctgc 2340 ctgagcacga ccgtgcgcaa tgacactctg caggaagcca aggagcacag ggtgtccctg 2400 aagtgccgca ggcagctccg tgtggaggag ctggagatga cggaggacat ccgcttggag 2460 ccagatctat acgaagcctg caagagtgac atcaaaaact tctgttccgc tgtgcaatat 2520 ggcaacgctc agattatcga atgtctgaaa gaaaacaaga agcagctaag cacccgctgc 2580 caccaaaaag tatttaagct gcaggagaca gagatgatgg acccagagct agactacacc 2640 ctcatgaggg tctgcaagca gatgataaag aggttctgtc cggaagcaga ttctaaaacc 2700 atgttgcagt gcttgaagca aaataaaaac agtgaattga tggatcccaa atgcaaacag 2760 atgataacca agcgccagat cacccagaac acagattacc gcttaaaccc catgttaaga 2820 aaagcctgta aagctgacat tcctaaattc tgtcacggta tcctgactaa ggccaaggat 2880 gattcagaat tagaaggaca agtcatctct tgcctgaagc tgagatatgc tgaccagcgc 2940 ctgtcttcag actgtgaaga ccagatccga atcattatcc aggagtccgc cctggactac 3000 cgcctggatc ctcagctcca gctgcactgc tcagacgaga tctccagtct atgtgctgaa 3060 gaagcagcag cccaagagca gacaggtcag gtggaggagt gcctcaaggt caacctgctc 3120 aagatcaaaa cagaattgtg taaaaaggaa gtgctaaaca tgctgaagga aagcaaagca 3180 gacatctttg ttgacccggt acttcatact gcttgtgccc tggacattaa acaccactgc 3240 gcagccatca cccctggccg cgggcgtcaa atgtcctgtc tcatggaagc actggaggat 3300 aagcgggtga ggttacagcc cgagtgcaaa aagcgcctca atgaccggat tgagatgtgg 3360 agttacgcag caaaggtggc cccagcagat ggcttctctg atcttgccat gcaagtaatg 3420 acgtctccat ctaagaacta cattctctct gtgatcagtg ggagcatctg tatattgttc 3480 ctgattggcc tgatgtgtgg acggatcacc aagcgagtga cacgagagct caaggacagg 3540 tagagccacc ttgaccacca aaggaactac ctatccagtg cccagtttgt acagccctct 3600 tgtatagcat ccccactcac ctcgctcttc tcagaagtga caccaacccc gtgttagagc 3660 attagcagat gtccactgcg ttgtcccatc cagcctccac tcgtgtccat ggtgtcctcc 3720 tcctcctcac cgtgcagcag cagcagctgg tcgctggggt tactgccttt gtttggcaaa 3780
cttgggttta cctgcctgta gacaagtctc tctcatacca acagaacttc cggtacttcc 3840
agaaccaact cacctgacct gcaactcaaa ggctttttta agaaaaccac caaaaaaaaa 3900
a 3901
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Phe Cys Ser Ala Val Gln Tyr Gly Asn Ala Gln Ile Ile Glu Cys Leu 835 840 845
Lys Glu Asn Lys Lys Gln Leu Ser Thr Arg Cys His Gln Lys Val Phe 850 855 860
Lys Leu Gln Glu Thr Glu Met Met Asp Pro Glu Leu Asp Tyr Thr Leu 865 870 875 880
Met Arg Val Cys Lys Gln Met Ile Lys Arg Phe Cys Pro Glu Ala Asp 885 890 895
Ser Lys Thr Met Leu Gln Cys Leu Lys Gln Asn Lys Asn Ser Glu Leu 900 905 910
Met Asp Pro Lys Cys Lys Gln Met Ile Thr Lys Arg Gln Ile Thr Gln 915 920 925
Asn Thr Asp Tyr Arg Leu Asn Pro Met Leu Arg Lys Ala Cys Lys Ala 930 935 940
Asp Ile Pro Lys Phe Cys His Gly Ile Leu Thr Lys Ala Lys Asp Asp 945 950 955 960
Ser Glu Leu Glu Gly Gln Val Ile Ser Cys Leu Lys Leu Arg Tyr Ala 965 970 975 Asp Gln Arg Leu Ser Ser Asp Cys Glu Asp Gln Ile Arg Ile Ile Ile 980 985 990
Gln Glu Ser Ala Leu Asp Tyr Arg Leu Asp Pro Gln Leu Gln Leu His 995 1000 1005
Cys Ser Asp Glu Ile Ser Ser Leu Cys Ala Glu Glu Ala Ala Ala Gln 1010 1015 1020
Glu Gln Thr Gly Gln Val Glu Glu Cys Leu Lys Val Asn Leu Leu Lys 1025 1030 1035 1040
Ile Lys Thr Glu Leu Cys Lys Lys Glu Val Leu Asn Met Leu Lys Glu 1045 1050 1055
Ser Lys Ala Asp Ile Phe Val Asp Pro Val Leu His Thr Ala Cys Ala 1060 1065 1070
Leu Asp Ile Lys His His Cys Ala Ala Ile Thr Pro Gly Arg Gly Arg 1075 1080 1085
Gln Met Ser Cys Leu Met Glu Ala Leu Glu Asp Lys Arg Val Arg Leu 1090 1095 1100
Gln Pro Glu Cys Lys Lys Arg Leu Asn Asp Arg Ile Glu Met Trp Ser 1105 1110 1115 1120
Tyr Ala Ala Lys Val Ala Pro Ala Asp Gly Phe Ser Asp Leu Ala Met 1125 1130 1135
Gln Val Met Thr Ser Pro Ser Lys Asn Tyr Ile Leu Ser Val Ile Ser 1140 1145 1150
Gly Ser Ile Cys Ile Leu Phe Leu Ile Gly Leu Met Cys Gly Arg Ile 1155 1160 1165
Thr Lys Arg Val Thr Arg Glu Leu Lys Asp Arg Leu Gln Tyr Arg Ser 1170 1175 1180
Glu Thr Met Ala Tyr Lys Gly Leu Val Trp Ser Gln Asp Val Thr Gly 1185 1190 1195 1200
Ser Pro Ala
30
<210> 21 <211> 2288 <212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 21
caaaaacttc tgttccgctg tgcaatatgg caacgctcag attatcgaat gtctgaaaga 60 aaacaagaag cagctaagca cccgctgcca ccaaaaagta tttaagctgc aggagacaga 120 gatgatggac ccagagctag actacaccct catgagggtc tgtaagcaga tgataaagag 180 gttctgtccg gaagcagatt ctaaaaccat gttgcagtgc ttgaagcaaa ataaaaacag 240 tgaattgatg gatcccaaat gcaaacagat gataaccaag cgccagatca cccagaacac 300 agattaccgc ttaaacccca tgttaagaaa agcctgtaaa gctgacattc ctaaattctg 360 tcacggtatc ctgactaagg ccaaggatga ttcagaatta gaaggacaag tcatctcttg 420 cctgaagctg agatatgctg accagcgcct gtcttcagac tgtgaagacc agatccgaat 480 cattatccag gagtccgccc tggactaccg cctggatcct cagctccagc tgcactgctc 540 agacgagatc tccagtctat gtgctgaaga agcagcagcc caagagcaga caggtcaggt 600 ggaggagtgc ctcaaggtca acctgctcaa gatcaaaaca gaattgtgta aaaaggaagt 660 gctaaacatg ctgaaggaaa gcaaagcaga catctttgtt gacccggtac ttcatactgc 720 ttgtgccctg gacattaaac accactgcgc agccatcacc cctggccgcg ggcgtcaaat 780 gtcctgtctc atggaagcac tggaggataa gcgggtgagg ttacagcccg agtgcaaaaa 840 gcgcctcaat gaccggattg agatgtggag ttacgcagca aaggtggccc cagcagatgg 900 cttctctgat cttgccatgc aagtaatgac gtctccatct aagaactaca ttctctctgt 960 gatcagtggg agcatctgta tattgttcct gattggcctg atgtgtggac ggatcaccaa 1020 gcgagtgaca cgagagctca aggacaggta gagccacctt gaccaccaaa ggaactacct 1080 atccagtgcc cagtttgtac agccctcttg tatagcatcc ccactcacct cgctcttctc 1140 agaagtgaca ccaaccccgt gttagagcat tagcagatgt ccactgcgtt gtcccatcca 1200 gcctccactc gtgtccatgg tgtcctcctc ctcctcaccg tgcagcagca gcagctggtc 1260 gctggggtta ctgcctttgt ttggcagact tggtttacct gcctgtagtc aagtctctct 1320 cataccaaca gaacttccgg tacttccaga accaactcac ctgacctgca actcaaaggc 1380 ttttttaaga aaaccaccaa aaaaaaaaat ttttttaaag aaaaaaatgt atatagtaac 1440 gcatctcctc caggcttgat ttgggcaatg gggttatgtc tttcatatga ctgtgtaaaa 1500 caaagacagg acttggaggg gaagcacacc acccagtgtg ccatgactga ggtgtctcgt 1560 tcatctctca gaagcgcctt ggggcctcgc cagggccgtg gtcttcaccg aggcgtgggt 1620 gggcagccgt tccccaggct gtgtggggtc ctgctttctt ctgctgagac agtgacgctt 1680 tccagtttcc accctaatca gccactgctg gtcacagccc cacagccatg ggtatttctg 1740 tggtctcctc gcttcattga agcaaagcat gagccttcct agacaagggc agctggggag gggaagggac cggaagtttg tgaagttgaa cagtccatcc atctgcactg agaggctgga tcctgagtcc cggggcagca ggatcccagg aaccttcctc ctccagggca gcacaggact cagccgtgtc tggaccggcc ctgctgaggc tacagtcact ctggaagctc tgcgcttcat 5 caggaggcag gactgtggcg ggaggggtcc ttgaagatgg gtgtggggag cagtgggtca ggaagtggga gccagaggtt tgactcactt tgctttattt ttcaggctac aatacaggtc agagacaatg gcttataaag gtttagtgtg gtctcaggat gtgacaggca gtccagcctg acctttctgc acactccaga caaacttccc agacaagctc ctttgtgcct ctacgtggag agggtgtgga aagttatcac attaaaagat ggaggattaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
10 3.3.3.3.3-3.3.3.
<210> 22
<211> 309
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 22
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Met Ile Lys Arg Phe Cys Pro Glu Ala Asp Ser Lys Thr Met Leu Gln 20 25 30
Cys Leu Lys Gln Asn Lys Asn Ser Glu Leu Met Asp Pro Lys Cys Lys 35 40 45
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Val Ile Ser Cys Leu Lys Leu Arg Tyr Ala Asp Gln Arg Leu Ser Ser 100 105 110
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1800
1860
1920
1980
2040
2100
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2280
2288 130 135 140
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<210> 23
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<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 23
aatttagcca gctgtggtgg cacatacctg taatcccagc tacttgagag actgaggcag 60 gagaatcact tgaaccggga gatggagttt gcagtgagcc gagatggtgc cactgtactc 120 cagcctgggt gacagagcaa gactctgtct ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 180 catttcaagc tggaagattt ggttccctaa ctttgagcct agctctttca ttaaagtaat 240 aataaaagta . gaactctaca tttatataat ggttttgact ttccaaagtg attttcacat 300 ctcagcagtc ctgtgaagga ctaaataagg tgtttcaggg tagacttggc attgtgtttt 360 gcaaagaagg tccaaggcca tgcagctatt tggtgacaga attgaaagta aagcctgatt 420 ctcttgctgc aaggcgactt tgctatctag aagccagggt cactagacaa gatgcagtca 480 acaaataagt ctccagaaca tatgacatct ccagcctaaa ccaagctcac ctttccatgc 540 tggctccctc atgcagacgg aggacatccg cttggagcca gatctatacg aagcctgcaa 600 gagtgacatc aaaaacttct gttccgctgt gcaatatggc aacgctcaga ttatcgaatg 660 tctgaaagaa aacaagaagc agctaagcac ccgctgccac caaaaagtat ttaagctgca 720 ggagacagag atgatggacc cagagctaga ctacaccctc atgagggtct gcaagcagat 780 gataaagagg ttctgtccgg aagcagattc taaaaccatg ttgcagtgct tgaagcaaaa 840 taaaaacagt gaattgatgg atcccaaatg caaacagatg ataaccaagc gccagatcac 900 ccagaacaca ggtaagatct tggcttggct ctcctggccc cgtggagtat ctgaaaagga 960 attcagtggc tgtagagtga cctgctcaaa ctcccagggc tttgttgcct gggaatttta 1020 agggaggagt ctgagtgtaa gcagggcctt cctcctttga ggagcatcca gaaaaatgga 1080 gggagagtca ggggagagag gaggccacaa gaaccagaaa actgccctaa aagaacgttc 1140 agaaggaatc aggccggcag tccttggaaa gaaaaatcta gaaattcaat aaaacttcat 1200 gagtgtgcca ggagaatgta cgggtaatct gattcggaac agaaacattt cacctctgag 1260 ttggaagacc tcgtaagtta atggtcacag tgagttggat attgtatttc tttttcagtg 1320 ttctcaaaag tgtctgttat ggggaaggtt gctgatgtcc ccttgatttt tctgaggact 1380 ccttagagta ttggagtctg cacaaaaccc cgcagagtag aaagattcct gaggacctcc 1440 agaagtactc gttaacaagt catattgctg attaaaaaca gtgtagtgag agctcagtaa 1500 atgtttattg aatagataaa tccatggttg tagtcatgat cattgacata atatgctccc 1560 tttaggaagg tggatatcta aaaatgtgtg aatcaggtgg aatgttttgt cacatgctca 1620 ctgctttcta ctctagatta ccgcttaaac cccatgttaa gaaaagcctg taaagctgac 1680 attcctaaat tctgtcacgg tatcctgact aaggccaagg atgattcaga attagaagga 1740 caagtcatct cttgcctgaa gctgagatat gctgaccagc gcctgtcttc agactgtgaa 1800 gaccagatcc gaatcattat ccaggagtcc gccctggact accgcctgga tcctcagctc 1860 cagctgcact gctcagacga ggtgggattt gcgtgcaaaa ctggttacgc acagagctgc 1920 tcagagaagt ttccactgga gaaaagttgt ttactttctc tcccttcagc cgtgaatgat 1980 ctggtgaatt gaaggccatc ttctaggctc tccatggtct gcattcctgt tctttgtaac 2040 actgaattca acttggcatt agtcctgaca ctctaaagcg ttgttccata tttctctgtt 2100 gaacaagggt gttctttcat tatagctctc tgtaaatttg ttcttccctt cttcttattc 2160 tggatggtaa acccaagacc tgccagaaag ataaaagtgc tttcagctgg gcacggtggc 2220 tcacgcctgt aatcccaaca ctttgggagg ccaaggaggg tggatcatct gaggtcagga 2280 gttcaagacc agcctggcta acatggagaa atctgtctct actaaaaata caaaaaatta 2340 gccaggcgtg gtggcgtgca ccagtaatct cagctactca ggaggctgag gcaggagaat 2400 cacttgaacc cgggaggcgg tggttgcagt gagctgagat catgccactg caccccagcc 2460 tgggcgacag aggaagactc tgtctc 2486 <210> 24 <211> 156 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 24
Met Gln Thr Glu Asp Ile Arg Leu Glu Pro Asp Leu Tyr Glu Ala Cys 15 10 15
Lys Ser Asp Ile Lys Asn Phe Cys Ser Ala Val Gln Tyr Gly Asn Ala 20 25 30
Gln Ile Ile Glu Cys Leu Lys Glu Asn Lys Lys Gln Leu Ser Thr Arg 35 40 45
Cys His Gln Lys Val Phe Lys Leu Gln Glu Thr Glu Met Met Asp Pro 50 55 60
Glu Leu Asp Tyr Thr Leu Met Arg Val Cys Lys Gln Met Ile Lys Arg 65 70 75 80
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Asn Lys Asn Ser Glu Leu Met Asp Pro Lys Cys Lys Gln Met Ile Thr 100 105 110
Lys Arg Gln Ile Thr Gln Asn Thr Gly Lys Ile Leu Ala Trp Leu Ser 115 120 125
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Ctgagaggaa gttttatctg tgcagccctt ctctgaggat ggacacttct cacactacaa agtcctgttt gctgattctt cttgtggccc tactgtgtgc agaaagagct cagggactgg agtgttacca gtgctatgga gtcccatttg agacttcttg cccatcaatt acctgcccct accctgatgg agtctgtgtt actcaggagg cagcagttat tgtggattct caaacaagga aagtaaagaa caatctttgc ttacccatct gccctcctaa tattgaaagt atggagatcc tgggtactaa ggtcaacgtg aagacttcct gttgccagga agacctctgc aatgtagcag ttcccaatgg aggcagcacc tggaccatgg caggggtgct tctgttcagc ctgagctcag tcctcctgca gaccttgctc tgatggtcct cccaatgacc tccacccttg tccttttatc ctcatgtgca acaattcttc ctggagccct ctagtgatga attatgagtt atagaagctc caaggtggga gtagtgtgtg aaataccatg ttttgccttt atagcccctg ctgggtaggt aggtgctcta atcctctcta gggctttcaa gtctgtactt cctagaatgt cattttgttg tggattgctg ctcatgaccc tggaggcaca cagccagcac agtgaagagg cagaattcca aggtattatg ctatcaccat ccacacataa gtatctgggg tcctgcaatg ttcccacatg tatcctgaat gtccccctgt tgagtccaat aaaccctttg ttctcccaaa aaaaaaaaaa aa
<210> 26 <211> 134 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 26
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780
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atctgacaga acttgccact gtgcctgcaa ccttgtctga gaggaaccct tctctgagga tggacacttc tcacactaca aagtcctgtg tgctcattct tcttgtggcc ctactgtgtg cagaaagagc tcagggactg cagtgctacg agtgctatgg agtgccaatt gagacttcct gcccagcagt tacctgccgc gcctctgatg gattctgcat tgctcaaaac atagaattga 20 ttgaggactc tcaaagaagg aaactaaaga cccgtcagtg cctttctttc tgccctgctg gtgtgccaat cagggatcct aacatcaggg agaggacttc ctgttgcagc gaagacctct gcaatgcagc agttcccact gcaggtagca cctggaccat ggcaggggtg cttctgttca gcctgagctc agtcgtcctg cagaccttgc tctgatggtc cttccaatga cccccaccct tttcctttta tcttcatgtg caaccactct ttcctggagt cctctagtga caaattatat 25 gttatagaag gtccaatgtg gggatagtgt gtggaacacc ctgtttcacc tttatagccc ctgctgggta agtgcccgac tcctctctag ggctttcaaa tctgtacttc ttgcaatgcc atttagttgt ggatttctat tcttggccct ggaggcatgt ggccagcaca tgcaacaggc agtattccaa ggtattatag tatcaccatc cacacataag tatctggggt cctgcagggt tcccatgtat gcctgtcaat gacccctgtt gagtccaata aaagctttgt tctcccagcc 30 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa <210> 28 <211> 131
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120
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660
720
780
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862 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 28
Met Asp Thr Ser His Thr Thr Lys Ser Cys Val Leu He Leu Leu Val 1 5 10 15
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Tyr Gly Val Pro He Glu Thr Ser Cys Pro Ala Val Thr Cys Arg Ala 35 40 45
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Ser Glu Asp Leu Cys Asn Ala Ala Val Pro Thr Ala Gly Ser Thr Trp 100 105 110
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gcccaccccc gcccagcccg tgcctataag gccttggcaa tgcaggggcc cgcactgctc 60 ccagacgaca tcagagatga ggacagcatt gctgctcctt gcagccctgg ctgtggctac 120 agggccagcc cttaccctgc gctgccacgt gtgcaccagc tccagcaact gcaagcattc 180 30 tgtggtctgc ccggccagct ctcgcttctg caagaccacg aacacagtgg agcctctgag 240 ggggaatctg gtgaagaagg actgtgcgga gtcgtgcaca cccagctaca ccctgcaagg 300 ccaggtcagc agcggcacca gctccaccca gtgctgccag gaggacctgt gcaatgagaa 36 0 gctgcacaac gctgcaccca cccgcaccgc cctcgcccac agtgccctca gcctggggct 420 ggccctgagc ctcctggccg tcatcttagc ccccagcctg tgaccttccc cccagggaag 480 gcccctcatg cctttccttc cctttctctg gggattccac acctctcttc cccagccgca 540 acgggggtgc caggagcccc aggctgaggg cttccccgaa agtctgggac caggtccagg 600 tgggcatgga atgctgatga cttggagcag gccccacaga ccccacagag gatgaagcca 660 ccccacagag gatgcagccc ccagctgcat ggaaggtgga ggacagaagc cctgtggatc 720 cccggatttc acactccttc tgttttgttg ccgtttattt ttgtactcaa atctctacat 780 ggagataaat gatttaaacc agaaaa 806 <210> 30 <211> 128 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30
Met Arg Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Pro Ala Leu Thr Leu Arg Cys His Val Cys Thr Ser Ser Ser Asn Cys 20 25 30
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<400> 31
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<213> Mus Musculus <400> 32
Met Lys He Phe Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gly Val Glu 15 10 15
Arg Ala Ser Ser Leu Met Cys Phe Ser Cys Leu Asn Gln Lys Ser Asn 20 25 30
Leu Tyr Cys Leu Lys Pro Thr He Cys Ser Asp Gln Asp Asn Tyr Cys 35 40 45
Val Thr Val Ser Ala Ser Ala Gly He Gly Asn Leu Val Thr Phe Gly 50 55 60
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Val Asn Val Gly Val Ala Ser Met Gly Ile Ser Cys Cys Gln Ser Phe 85 90 95
Leu Cys Asn Phe Ser Ala Ala Asp Gly Gly Leu Arg Ala Ser Val Thr 100 105 HO
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<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 33
actgtgcctg caacctggtc agagaggaag taaggactgg tgtcaggagg gagctgctag 60 gtttgatctg tgcagccctt ctccaaggat ggacagttgt cacactacaa agtcctgtgt 120 actcatcctt cttgtggtcc tattgtgtgc agaaagagct caggggctgg agtgctataa 180 ctgcctggga gtttcacttg gaattgcctg caaatcaatt acctgcccct accctgatgc 240 agtctgcatt tctcagcagg tagaacttat tgtggactct caaagaagga aagtaaagaa 300 caaactctgc tttcctttct gccctgctaa tcttgaaaat atggagatcc tgggtactac 360 tgtcaacgtg aatacttcct gttgcaagga agacctctgc aatgcaccat tttccactgg 420 aggcagcacc tggaccatga caagggtgct tctgttaaat ctgggctcgg tcttcctgca 480 gaccttgctg taaaaggtcc ttccaaggac ctccaccctt gttgttttat cctcatttgc 540 aactattcct tcctggagcc ctctagtgat gaattatgag atattgaagc tccaaggtgg 600 gagtagtgtt tgtggaatac gttgtttcaa ctttatagcc cctgcttggt aaatgcccca 660 ctcctctcta ggaatttcaa atatgtactt cctagaatgc cattttgttg tggcttgcta 720 atcttggccc tggaggcccg tggctagcag agggtagagg cagaattcca aggtattaag 780 ccatcaccat ccacacataa gtgtctgagg ttctgcagga ttctcatgta tgcggcttta 840 tgtccccttg ttgagtccaa taaacccttt gttctcc 877
<210> 34 <211> 134 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34
Met Asp Ser Cys His Thr Thr Lys Ser Cys Val Leu Ile Leu Leu Val 15 10 15
Val Leu Leu Cys Ala Glu Arg Ala Gln Gly Leu Glu Cys Tyr Asn Cys 20 25 30
Leu Gly Val Ser Leu Gly Ile Ala Cys Lys Ser Ile Thr Cys Pro Tyr 35 40 45
Pro Asp Ala Val Cys Ile Ser Gln Gln Val Glu Leu Ile Val Asp Ser 50 55 60
Gln Arg Arg Lys Val Lys Asn Lys Leu Cys Phe Pro Phe Cys Pro Ala 65 70 75 80
Asn Leu Glu Asn Met Glu Ile Leu Gly Thr Thr Val Asn Val Asn Thr 85 90 95
Ser Cys Cys Lys Glu Asp Leu Cys Asn Ala Pro Phe Ser Thr Gly Gly 100 105 110
Ser Thr Trp Thr Met Thr Arg Val Leu Leu Leu Asn Leu Gly Ser Val 115 120 125
Phe Leu Gln Thr Leu Leu 130
<210> 35
<211> 710 <212> DNA
<213> Mus musculus <400> 35
ctgcagccag gtctgagagg aagtaaggac tggtgtcagg agggagctgc taggtgacaa 60 agggaagaac cctcaggata gggctgtggt gggagtgaga ttaggaaaga agagctgggt 120 gggtggtgga tgagagaagt aggcagacat gtattcctca gggaaagctg tgtagagggt 180 tggagggagg gaatattgga tggctgagcc gtgtgagagc ccaggggtgt gatcaggggt 240 ctattaactg gctccaactt ccaaggtttt atctgtgcag cccttctcca aggatggaca 300 cttctcacga gataaagtcc tgtgtgctga tccttcttgt gaccctactc tgtgcagaaa 360 gagctcaggg actggagtgt taccagtgct atggagtccc atttgagact tcttgcccat 420 catttacctg cccctaccct gatggattct gtgttgctca ggaggaagaa tttattgcaa 480 actctcaaag aaagagagta aagagccgtt cttgccatcc tttctgccct gatgaaattg 540 aaaagaagtt tatcctggat cctaacacca agatgaatat ttcctgttgc caggaagacc 600 tctgcaatgc agcagttccc actggaggca gctcctggac cacggcaggg gtgcttctgt 660 tcagcctggg ctcagtcctc ctgcagaccc tgatgtgatg gtccccaccc 710 <210> 36
<211> 134
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 36
-Met Asp-Thr Ser His-Glu He Lys-Ser Cys-Val- Leu He-Leu Leu Val 15 10 15
Thr Leu Leu Cys Ala Glu Arg Ala Gln Gly Leu Glu Cys Tyr Gln Cys 20 25 30
Tyr Gly Val Pro Phe Glu Thr Ser Cys Pro Ser Phe Thr Cys Pro Tyr 35 40 45
Pro Asp Gly Phe Cys Val Ala Gln Glu Glu Glu Phe Ile Ala Asn Ser 50 55 60
Gln Arg Lys Arg Val Lys Ser Arg Ser Cys His Pro Phe Cys Pro Asp 65 70 75 80
Glu Ile Glu Lys Lys Phe Ile Leu Asp Pro Asn Thr Lys Met Asn Ile
85 90 95
Ser Cys Cys Gln Glu Asp Leu Cys Asn Ala Ala Val Pro Thr Gly Gly 100 105 110
Ser Ser Trp Thr Thr Ala Gly Val Leu Leu Phe Ser Leu Gly Ser Val 115 120 125
Leu Leu Gln Thr Leu Met 130 120
180
240
300
360
420
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540
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660
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1500
1560
1620
182
<210> 37
<211> 1735
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 37
gttatcagag gtgagcccgt ctttctgtgg gccgtggggt acacgcgcct ttcccagggc gcagcacaag gcgggactca gatgaggctc caaagacccc gcggggctcc ccctaccggc gaagggcggg gagggggcgc gctgctcgcc ttgctgctgg tgcgagacaa cgagatccag gtgtcatgtt tgtgagagag gacagagcca tactgcgtta gaagcagtgc tccgctggtt tctcctggaa gagcccatgc tttagagggg cca.ccta.tca gagctgtggt gggctgtggc cagcctgtct tgagccacgg cagaccgttg tcacctgttg tcccagggtc ttgggatggg gttctttaac tcacattcag tttttctctt tgaaatcaaa gactcccctc tgcctctgag atggagagta tgtgctgaga tctgaatgat tggggtgaag ggggcacacg ttagggctgc cctcaacctt tcctaccaga tagacttcac ccaccagctg tcaacatctg aaacttaggc
gctcttcagc ggagaagatc cctcaaggag acggcccttg tcccgcgccc gttcctgcct gaaccggcgt tcagggccgc gacaggcccc ggcgggtggg cagacccggg gagaggcgcg cgcgcgctga ccctccctgg tcgtggccct accgcgggtg aggactccca gcgaacggac aaaacacttt cgagtgccag tagcggccgt gaaaatattt gtgcagcgat ggagagaccc ccttctttta cctcaagtgt actcatcagt gttcaaagaa tggccatcct cctgctgctg gactgccaca gactgagcct cattaaactt gttttctgtt agagtgggga tcaggtgcag aggaagtcca gatctcctga ccttgtaact catttattgc ggcttcagta ttgatgggga tgcttccgac ctttcaggtg acatccctgg agtgaaggac ccccattcca gtggtggagg ttccaggagg cagaagataa gcacaggtgc acagattcat caagtagaga gcatcagggt
ccctacctgg ccgccggcca ggctcagggg ctgcgtttcc ggccgccggc cgctccaaca cagcggccgc gaggccctga aggcgcgcgc cccggggcgg cggaggctgc gaaggttcca gcaccgctgg ggacgatggc tggacagacg ccaacctgac gagggtgaca atagagtgtg aacccaagga ggtgcaaatg ccacgttttt tcatggttgc aagccagagg agaagcggtt tgtaaaattc gctactgcaa tatgctggga gcatgggtga gcctccattg cagccggcct tccggagcat ggactcgctc gattacctct tggtttgact ttggctctta accctcaagg gtagtgattt tggtgacaag tgatggccac tcttttcctt gggaggccta agtaccactc acgcaggaac actgggggag tcctcagcat ggggggcagt cgctgtggat ggctgctttt ctaattgtgt tgaagaaact aaattcccac acgtgtgtgt aaatggcgtt catttctctg ttaagatgca gccatccatg gggagctgag aaatcagact caaagttcca ccaaaaacaa 1680 atacaagggg acttcaaaag ttcacgaaaa aattgaatta aaagataaaa attaa 1735
<210> 38 <211> 223 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 38
Met Arg Leu Gln Arg Pro Arg Gln Ala Pro Ala Gly Gly Arg Arg Ala 15 10 15
Pro Arg Gly Gly Arg Gly Ser Pro Tyr Arg Pro Asp Pro Gly Arg Gly 20 25 30
Ala Arg Arg Leu Arg Arg Phe Gln Lys Gly Gly Glu Gly Ala Pro Arg 35 40 45
Ala Asp Pro Pro Trp Ala Pro Leu Gly Thr Met Ala Leu Leu Ala Leu 50 55 60
Leu Leu Val Val Ala Leu Pro Arg Val Trp Thr Asp Ala Asn Leu Thr 65 70 75 80
Ala Arg Gln Arg Asp Pro Glu Asp Ser Gln Arg Thr Asp Glu Gly Asp 85 90 95
Asn Arg Val Trp Cys His Val Cys Glu Arg Glu Asn Thr Phe Glu Cys 100 105 110
Gln Asn Pro Arg Arg Cys Lys Trp Thr Glu Pro Tyr Cys Val Ile Ala 115 120 125
Ala Val Lys Ile Phe Pro Arg Phe Phe Met Val Ala Lys Gln Cys Ser 130 135 140
Ala Gly Cys Ala Ala Met Glu Arg Pro Lys Pro Glu Glu Lys Arg Phe 145 150 155 160
Leu Leu Glu Glu Pro Met Pro Phe Phe Tyr Leu Lys Cys Cys Lys Ile 165 170 175
Arg Tyr Cys Asn Leu Glu Gly Pro Pro Ile Asn Ser Ser Val Phe Lys 180 185 190
Glu Tyr Ala Gly Ser Met Gly Glu Ser Cys Gly Gly Leu Trp Leu Ala 195
200
205
Ile Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ile Ala Ala Gly Leu Ser Leu Ser
210
215
220
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Seqüência Artificial <400> 39
cttacccatc tgccctccta 20
<210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Seqüência Artificial <400> 40
cctccattgg gaactgctac 20
<210> 41
<211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Seqüência Artificial
<210> 42 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<400> 41
tcctgttgcc aggaagacct ctgc
24 <223> Seqüência Artificial <400> 42
acttcctgcc cagcagttac 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Seqüência Artificial <400> 43
ggcactgacg ggtctttagt 20
<210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Seqüência Artificial <400> 44
ctgccgcgcc tctgatggat 20
<210> 45
<211> 1659 <212> DNA
<213> mus musculus <400> 45
ggagagagca ggacacagct atggatgccg ccaggagagg agatacacag ccagtgatgt 6 0
ggaccaccgg atggctgttg ctgctgccgc ttctgctgtg tgaaggagcg caagccctgg 120
agtgctacag ctgcgtgcag aaggcggacg atggatgctc tccgcacagg atgaagacag 180
tcaaatgtgg tcccggggtg gacgtctgta ccgaggccgt gggagcggta gagaccatcc 240
acgggcaatt ctctgtggcg gtgcggggct gcggttccgg aatcccgggc aagaacgacc 300
gcggactgga ccttcacggg ctcctggcct tctttcagct acagcagtgc tccgaggacc 360
gatgcaacgc caaactcaac ctcactttgc gaggcctcaa ccctgcaggc aatgagagtg 420
catatgagcc taacggtgca gagtgctaca gctgtgtggg tctgagccgc gagaagtgcc 480 agggctccat gccgccggtc gtgaactgct acaacgccag tggccgtgtc tacaagggct 540 gcttcgatgg taacgtcacc ctgacggcag ccaacgtgac cgtgtcctta cctgtccgag 600 gctgcgtcca ggacgagacc tgcacccggg atggggtgac gggtccagga ttcacactca 660 gcggctcttg ctgtcagggc ccccgctgta acgccgacct tcgcaacaag acctatttct 720 cccctcgaat cccaccccta gtcctgctgc cccctccaac caccgcagcc ccatccactc 780 gggcccagaa ctcctccagc acgacctcta cagcagcccc aaccacgacc acctccatca 840 tcaagcccac cacagcccaa gccagccaca cttctcccca tgaaatggat ctcgaagtca 900 tacaggaaga gggggcgtcg ttgagtggag gtgctgcggg ccatggaggt actgcgggcc 960 atggaggtgc tgcgggccac caagaccgca gcaatatgga gaagtatcca ggaaagggtg 1020 gggcccagat cccagctaaa ggaggctctg gcactctagg gtcctggttg tctgcagttc 1080 tgttgactgt ggttgctggc gcgatgctgt gaatgtctca tctcgaaaag tccatctcac 1140 tttgtttccc tggccccgtg gtaccaactc tttccatttc tcacttgact ggactggctc 1200 cgcccccatc cttcagcatt ctcagttccg actgcactgg tttgcagctt cggaaaacag 1260 tcctctgttg taaatattcc gctcgggtgg ccctactttt ttgatgcggc cacagcattc 1320 cccctgatgg tgaccaggac agagggaaga gacgtctact ggctgagaga ggcccagaga 1380 gtccacggca agcctcctct tcccgttttc ctgaccaggc tggaagatga ccaggcaggt 1440 agacaatgga tccatcctcc gagcactgtg cttgcctggc acattgtgcg gaaatctggt 1500 cgcctgtctt ccttaggaga ctgtgaacaa ctctacaaca gggtcttgtc tctggcctct 1560 ctatgtgttc tgtctggcac aggaaggtgt caataaagat ttagttactt tgtatagtga 1620 gttaactaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1659 <210> 46 <211> 363 <212> PRT
<213> mus musculus <400> 46
Met Asp Ala Ala Arg Arg Gly Asp Thr Gln Pro Val Met Trp Thr Thr 15 10 15
Gly Trp Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Cys Glu Gly Ala Gln Ala 20 25 30
Leu Glu Cys Tyr Ser Cys Val Gln Lys Ala Asp Asp Gly Cys Ser Pro 35 40 45
His Arg Met Lys Thr Val Lys Cys Gly Pro Gly Val Asp Val Cys Thr 50 55 60
Glu Ala Val Gly Ala Val Glu Thr Ile His Gly Gln Phe Ser Val Ala 65 70 75 80
Val Arg Gly Cys Gly Ser Gly Ile Pro Gly Lys Asn Asp Arg Gly Leu 85 90 95
Asp Leu His Gly Leu Leu Ala Phe Phe Gln Leu Gln Gln Cys Ser Glu 100 105 110
Asp Arg Cys Asn Ala Lys Leu Asn Leu Thr Leu Arg Gly Leu Asn Pro 115 120 125
Ala Gly Asn Glu Ser Ala Tyr Glu Pro Asn Gly Ala Glu Cys Tyr Ser 130 135 140
Cys Val Gly Leu Ser Arg Glu Lys Cys Gln Gly Ser Met Pro Pro Val 145 150 155 160
Val Asn Cys Tyr Asn Ala Ser Gly Arg Val Tyr Lys Gly Cys Phe Asp 165 170 175
Gly Asn Val Thr Leu Thr Ala Ala Asn Val Thr Val Ser Leu Pro Val 180 185 190
Arg Gly Cys Val Gln Asp Glu Thr Cys Thr Arg Asp Gly Val Thr Gly 195 200 205
Pro Gly Phe Thr Leu Ser Gly Ser Cys Cys Gln Gly Pro Arg Cys Asn 210 215 220
Ala Asp Leu Arg Asn Lys Thr Tyr Phe Ser Pro Arg Ile Pro Pro Leu 225 230 235 240
Val Leu Leu Pro Pro Pro Thr Thr Ala Ala Pro Ser Thr Arg Ala Gln 245 250 255
Asn Ser Ser Ser Thr Thr Ser Thr Ala Ala Pro Thr Thr Thr Thr Ser 260 265 270
Ile Ile Lys Pro Thr Thr Ala Gln Ala Ser His Thr Ser Pro His Glu 275 280 285
Met Asp Leu Glu Val Ile Gln Glu Glu Gly Ala Ser Leu Ser Gly Gly 290 295 300
Ala Ala Gly His Gly Gly Thr Ala Gly His Gly Gly Ala Ala Gly His 305
310
315
320
Gln Asp Arg Ser Asn Met Glu Lys Tyr Pro Gly Lys Gly Gly Ala Gln
325
330
335
Ile Pro Ala Lys Gly Gly Ser Gly Thr Leu Gly Ser Trp Leu Ser Ala
5
340
345
350
Val Leu Leu Thr Val Val Ala Gly Ala Met Leu
355
360
<210> 47 <211> 934 <212> DNA
<213> mus musculus <400> 47
tcgctccccg cgccgtgccc gccgctgagc ccggagtgcg gacaccccag ggatgcctgc 60
gccccagagg acccccgcct gcagcccccg cgcctctttc aggccctatc ggagcatgct 120
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ggcccatggc ctgtggtgcc aggactgcac cctggccaat tccagccatt gcgctccgaa 240
gcagtgccag cccaccgata ccgtttgtgc cagcgtgcgg atcaccgacc ccagcagcag 300
caggaaggat cattctgtga acaagatgtg tgcttcctcc tgcgacttcg ttaagcggca 360
ctttttctca gactatctga tggggttcat taactctggg atcttaaaag tcgacgtgga 420
ctgctgcgag aaagatttgt gcaacggggc atcggtcgca ggacgcagcc cctgggccct 480
ggctgggggg ctcctgctca gcctggggcc tgctcttctc tgggctgggc cctaagaccc 540
ctccctccct cctgctgggc tttggagctt gtcccctaag cctgttgctg cccctcccca 600
gcctggcctg gctggggctg ggacagcaag ggtttggcat caaggtctga ggctctcaac 660
ctccctagat gtgagtgagc cttctccgtt tctccaccag ctccatatcc caagcagctg 720
aatatctcca ggagtccaga catcctggca ggaagctggg gtagggggga gggggagggc 780
aagggactga gaccctccag gtctccaagg ggagggaggt caagccaggg acagcccaac 84 0
agcctggcct gaggggcatt aactacagag aaataaagtc acttctgagt cttgtgaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 934 <210> 48
<211> 160
<212> PRT
<213> mus musculus <400> 48
Met Pro Ala Pro Gln Arg Thr Pro Ala Cys Ser Pro Arg Ala Ser Phe 15 10 15
Arg Pro Tyr Arg Ser Met Leu Pro Ala Ala Met Lys Ser Leu Gly Leu 20 25 30
Ala Leu Leu Ala Leu Leu Leu Cys Pro Ser Pro Ala His Gly Leu Trp 35 40 45
Cys Gln Asp Cys Thr Leu Ala Asn Ser Ser His Cys Ala Pro Lys Gln 50 55 60
Cys Gln Pro Thr Asp Thr Val Cys Ala Ser Val Arg Ile Thr Asp Pro 65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Lys Asp His Ser Val Asn Lys Met Cys Ala Ser Ser 85 90 95
Cys Asp Phe Val Lys Arg His Phe Phe Ser Asp Tyr Leu Met Gly Phe
100_ 105_ 110
Ile Asn Ser Gly Ile Leu Lys Val Asp Val Asp Cys Cys Glu Lys Asp 115 120 125
Leu Cys Asn Gly Ala Ser Val Ala Gly Arg Ser Pro Trp Ala Leu Ala 130 135 140
Gly Gly Leu Leu Leu Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Trp Ala Gly Pro 145 150 155 160
<210> 49 <211> 2047 <212> DNA <213> mus musculus <400> 49
agaagaggcg agactttttt gggtgctccg gatcgccagt agttcttcaa gcctcagcag 60 ccaactcctc cggaggcgct gcgctccgcc ccagggagcg cgaatccaag gagcctggga 120 ccagcctctg ggagcccccg gcgcgggcga tgcgggcgcc gcgggcgaca cctgcggctc 180 30 ctctcggtgg cagccgtcgc ttgggcggca gcagcgcgag cctcggcagc ctcggcagct 240 actgtcgccg cggccagaac agcctccgct gcggtcgtgg tctctgatgc tcttgcccgc 300 tcccggccct gccgatccgg gaggatgtgg gttctcggca tcgcagcaac tttttgcgga 360 ttgttctggc ttccagggct ggcgctgcaa attcagtgct accagtgtga agaattccag 420
ctgaacaacg attgctcatc ccctgagttc atcgtaaatt gcaccgtgaa cgttcaagac 480 atgtgtcaga aagaagtgat ggagcaaagt gctgggatca tgtaccggaa gtcgtgtgca 54 0 tcgtcagcag cctgtctcat tgcttcagct gggtaccagt ccttctgttc ccctgggaaa 600 ctgaactccg tgtgcatcag ctgctgcaac acccctcttt gcaatgggcc gaggcccaag 660
aagagaggca gctctgcctc ggccatcagg ccagggcttc tcaccactct cctgttcttc 720
cacttagccc tctgcttggc acactgctga agctaaagga gatgccaacc cctgctgcct 780
cacctgtctg gcccttcgtc tctcaccttc ccgagtctct tctgggtgtc cttttattct 840 gggtagacaa gggagtcttt ttgttccctc ctttcaagta acgcaagatt gccgtgcaca 900 aatacttttg taagctctga accaattcat tctgaatttc tgtgtgtagt tgaagaaaaa 960 agcatggagc agaaagtcca gaccctccca tcccaatctg gttaaccacc gccaaggcta 1020
gcctggaaga accagccctt agaagtcatt gagatacgca tctgcctttc ccaaagcctt 1080 gagcttccat tctgtcccag taggagtcac agtctattca gagactgctg ctgcgtgaag 1140 gtaactttgc ttttgcggga ggggagagcc agtttcggct caaggcttct gaacttgcca 1200 ttcatacttc ctgctcctgt aaactatttt ctggggtgga cccagctggt ttggtctctg 1260
agccagtctg tggtgactca ggactcaagg gctggggctt agcctctcca ggcttggcct 1320
cagtctgaaa agtgcttaag aaaaccttgt tagttctcct ggaggaagag ttactgcgcc 1380 gggaggctag gaagatgagg gggctgcggg ctgagctggt gctgtccttg gtggagatga 144 0 agcgggcacg ctggcgtttc tcttggttgg catgctgcag agtcaggcgg cagcagagca 1500
cctgccagaa caccttccgg aactgctgag aggacacgtt gtagaggaga gggttgacca 1560
cagagctgag gtagaagaag gtatcagaga agggcaggag gatcatgtat gccctgaagt 1620
acgttctggt ccagtcatgt ttgggttttg ctgcagccat gatccgtcgg atctgattgg 1680
gcatccaaca cacggccaac gtcaccacaa tcagtcctgg caggcaagaa caggagagaa 1740
aaggagacgg ggagagaaac agcatgagaa caaaaataaa taaataaaaa cccataaaat 1800
attaagcccc ttggttctgt tgcttactgg ccgagaaacg gtaccaatct ttcagctctg 1860
tgcttgtcgg cttctttttg ccactggcaa aggagaattt aatgctgctt caagctcagg 1920
ggacttggct atgttaaaaa gcgttaaatg ctttcgacag tgtatttata cttacggctg 1980
cctgttaatt ttcaaaatgt tttcattgtt gctcgtgtat ccagaaaata tctcacgttg 2040
gccaaaa 2047
<210> 50
<211> 141 <212> PRT <213> mus musculus <400> 50
Met Trp Val Leu Gly Ile Ala Ala Thr Phe Cys Gly Leu Phe Trp Leu 15 10 15
Pro Gly Leu Ala Leu Gln Ile Gln Cys Tyr Gln Cys Glu Glu Phe Gln 20 25 30
Leu Asn Asn Asp Cys Ser Ser Pro Glu Phe Ile Val Asn Cys Thr Val 35 40 45
Asn Val Gln Asp Met Cys Gln Lys Glu Val Met Glu Gln Ser Ala Gly 50 55 60
Ile Met Tyr Arg Lys Ser Cys Ala Ser Ser Ala Ala Cys Leu Ile Ala 65 70 75 80
Ser Ala Gly Tyr Gln Ser Phe Cys Ser Pro Gly Lys Leu Asn Ser Val 85 90 95
Cys Ile Ser Cys Cys Asn Thr Pro Leu Cys Asn Gly Pro Arg Pro Lys 100 105 110
Lys Arg Gly Ser Ser Ala Ser Ala Ile Arg Pro Gly Leu Leu Thr Thr 115 120 125
Leu Leu Phe Phe His Leu Ala Leu Cys Leu Ala His Cys 130 135 140
<210> 51 <211> 516 <212> DNA <213> mus musculus <400> 51
ggcaggcctg agtgaggacc tcgaccatgc aggggacctg gatggtgctg ttggcactga 60 tattgggcac cttcggggag cttgctatgg ccttacagtg ctacacctgt gcgaatcctg 120 tgagtgcatc caactgtgtc accaccaccc actgccacat caatgaaacc atgtgcaaga 180 ctacgctcta ctccctggag attgttttcc ctttcctggg ggactccacg gtgaccaagt 240 30 cctgcgccag caagtgtgag ccttcggatg tggatggcat tgggcaaacc cggccagtgt 3 00 cctgctgcaa ttctgaccta tgcaacgtgg atggggcacc cagcctgggc agtcctggtg 360 gcctgctcct tgccctggca cttttcttgc tcttgggtgt cctgctgtaa agccatggcc 420 atctagctcc actcccttgt ccctgacatc ccagttccct aatgcctaga agaaatacaa 480 tggccatctg caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 516
<210> 52 <211> 127 <212> PRT
<213> mus musculus <400> 52
Met Gln Gly Thr Trp Met Val Leu Leu Ala Leu Ile Leu Gly Thr Phe 15 10 15
Gly Glu Leu Ala Met Ala Leu Gln Cys Tyr Thr Cys Ala Asn Pro Val 20 25 30
Ser Ala Ser Asn Cys Val Thr Thr Thr His Cys His Ile Asn Glu Thr 35 40 45
Met Cys Lys Thr Thr Leu Tyr Ser Leu Glu Ile Val Phe Pro Phe Leu 50 55 60
Gly Asp Ser Thr Val Thr Lys Ser Cys Ala Ser Lys Cys Glu Pro Ser 65 70 75 80
Asp Val Asp Gly Ile Gly Gln Thr Arg Pro Val Ser Cys Cys Asn Ser 85 90 95
Asp Leu Cys Asn Val Asp Gly Ala Pro Ser Leu Gly Ser Pro Gly Gly 100 105 110
Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Phe Leu Leu Leu Gly Val Leu Leu 115 120 125
<210> 53
<211> 450
<212> DNA
<213> mus musculus <400> 53
atgcttttta tggcaggccc tgcagccagc tggtccctga ggcccctggg actccatggc 60 gtcccccaag ccttgtgtgc tgtcctctta acagtgctgg tcatgaagac cttggttctc 120 ggtgatacca agctcgagga ccttcaccct cagtccctcc cactaaacaa gtacctgaat 180 tgctaccgat gtctgctgga gaccgaagag ctggggtgcc tcctggggtc tgacacctgc 240 ctgacacctc tgggcagcag ctgtgtcacc ctgcacataa agaacagcag cggttttaat 300
gtcatggtga gcgactgcta cagcaaggag cagatggtcc attgttcata tacccgtgct 360
tccccggtgt ttggcttttg gatattctat cagtgttgct tcctggattt ctgcaacaat 420
ccggacaaca gaaagaatag catgcactag 450
<210> 54
<211> 149 <212> PRT <213> mus musculus <400> 54
Met Leu Phe Met Ala Gly Pro Ala Ala Ser Trp Ser Leu Arg Pro Leu 15 10 15
Gly Leu His Gly Val Pro Gln Ala Leu Cys Ala Val Leu Leu Thr Val 20 25 30
Leu Val Met Lys Thr Leu Val Leu Gly Asp Thr Lys Leu Glu Asp Leu 35 40 45
His Pro Gln Ser Leu Pro Leu Asn Lys Tyr Leu Asn Cys Tyr Arg Cys 50 55 60
Leu Leu Glu Thr Glu Glu Leu Gly Cys Leu Leu Gly Ser Asp Thr Cys 65 70 75 80
Leu Thr Pro Leu Gly Ser Ser Cys Val Thr Leu His Ile Lys Asn Ser
85 90 95
Ser Gly Phe Asn Val Met Val Ser Asp Cys Tyr Ser Lys Glu Gln Met 100 105 110
Val His Cys Ser Tyr Thr Arg Ala Ser Pro Val Phe Gly Phe Trp Ile 115 120 125
Phe Tyr Gln Cys Cys Phe Leu Asp Phe Cys Asn Asn Pro Asp Asn Arg 130 135 140
Lys Asn Ser Met His 145
<210> 55
<211> 960 <212> DNA <213> mus musculus <400> 55
agagctggag acctgggaat ctgctgtcaa tcaccatgaa acacctcctg ttgctcaccc ctgatactcg atgtcactcc tgctacaaag cctgccgcct ggagccgggc cacaaatgcc gggttttctc taacctgcgc tgcggcacac aaaccaacca taagctgggc ctgaactaca acagcccggc tccacggccc acacccgcac gcctcggcct ctggttattg cattgagact atagcctgag cctttctccc tgtgtcctca cccaccccct tcttctgaag atcatgtccc tacctggagt ggcctttcta gccaccgctc tccacccaca cacagacaca cagacacaca cacacacaca cccagtcctt tcccatttcc actgaaaggc tcccctcctt ggacgcacac aactcctgtc ttgtctccag ggagtgattc ggcttaccag accctctgct tgtccccttc <210> 56 <211> 126 <212> PRT
<213> mus musculus <400> 56
Met Lys His Leu Leu Leu Leu Thr
i 5
Val Ser Ala Asp Thr Arg Cys His 20
Gly Cys Val Asp Arg Gln Ser Cys 35 40
Leu Thr Thr Asn Val Tyr Leu Gly 50 55
Arg Cys Gly Thr Pro Glu Glu Pro
ctgctggggc tgtggacatt ctcaggaccc 60
tgtctgccct actctactgc tgggtctcag 120
tccctgtgct gggctgtgtg gatcgccagt 180
tgacaacaaa cgtgtacctt gggaagatgt 24 0
cagaagagcc ttgtcgggag gtcttcaacg 300
acaccacctg ctgtgacaag gataactgta 360
tggccctcat ctccctcacc tccttggctg 420
agctccatgg ctacaatctt accacctgct 480
gagctccagc tttccagaat cttctctcct 540
tagtcctata ccatttattt catgggactg 600
ctctccctca cttgtcacct tccactccat 660
gacacaaaga cacacacaca cacacacaca 720
ttctagaaca ctctacctcc tccactggcc 780
tgctgtgcct ctgggatcta agtctggaag 840
caaaaggcgc tggcctcatt gcatgggcct 900
tatcttgaga aataaacatc agtgtctaat 960
Leu Ser Ala Leu Leu Tyr Cys Trp 10 15
Ser Cys Tyr Lys Val Pro Val Leu 30
Arg Leu Glu Pro Gly His Lys Cys 45
Lys Met Trp Val Phe Ser Asn Leu 60
Cys Arg Glu Val Phe Asn Glu Thr 65 70 75 80
Asn His Lys Leu Gly Leu Asn Tyr Asn Thr Thr Cys Cys Asp Lys Asp 85 90 95
Asn Cys Asn Ser Pro Ala Pro Arg Pro Thr Pro Ala Leu Ala Leu Ile 5 100 105 110
Ser Leu Thr Ser Leu Ala Gly Leu Gly Leu Trp Leu Leu His 115 120 125
<210> 57 <211> 3952 <212> DNA
<213> mus musculus <400> 57
gcctacttgg cctgcctgcg atgcggtacc aacaccgcac gaagtgtgta cagattccca 60 gttagacagc aggagggacc tgggagcggc cagggggatg ttttatctct aagagaccaa 120 gagctcaggc agggcttctg tgccctgctt cctccctggc ttgagctgga tcctggacca 180 gctgctgacc tcctgttcac tctggcactg ccctcacgtc tccgtcatga cccatctgct 240 cacagtgttc ctggtggccc tgatgggcct gcctgtggcc caggctctgg agtgccacgt 300 gtgtgcctac aatggagaca actgcttcaa acccatgcgc tgcccagcca tggccaccta 360 ctgtatgacc acacgaactt acttcacccc ataccggatg aaggtgagga agtcctgtgt 420 ccccagctgc tttgaaaccg tgtacgatgg ctattccaag catgcatctg ccacctcctg 480 ttgccagtac tacctctgca acggtgctgg ctttgctacc ccggtgacct tggccctggt 540 cccagcactc ctagctacct tctggagctt gctgtaaagc tcggttcccc aagccagatc 600 cactcaaacg caacactctc aaaaaacaca gtttccctct ctctcccaat tcactccacc 660 caacgctctt ccttctgaca ctcctcaact accacgaggt cccatggcta cctacgaaag 720 aactgatggc atccagatac ctcactccaa ggtcattttc agaaggctga catgtggacc 780 tgtaatgtgc ccacccatgg gtggggcagg ctgggcttct cctctaccca agatcagggg 840 catctgggag aatgtttatg gaggaggggt catcactcaa gtcaaggagc actgatttga 900 tagaattagt agccaaactc caccttcaga accctgcctc agtctaccca gtagaggatg 960 ggtctgctag aggtgagggg aggagagcgg cggagaataa cgagctggct agaagcagag 1020 aaagactcag cagggctgtc tccgaagatc agcgcggctt gccagagcaa atgtgatgtg 1080 gaagccatgt gaggaagccc tttgtcattt ccacttatct gaggaactct gccagacctg 1140 atgttgggat agccattggc caagggttcc tagcaacggc gtcatttcca taggccactg 1200 aaatccctcc agccccagct : cagcaggccc cttgacctcc actacagtcc ttcattcaca 1260 caccagctgc tgggccttga I agttggcagg gacttgggag caggtgaccc atgctatttt 1320 ttgtctggcc : tgttattctg ggcatggcaa gaagggatca gacgcaggtc agagcagggc 1380 agtagggcga . ctgagacagg gaaacagact tcagccagtg gcttcccagg tcccgtaggc 1440 agctcctaca tccttcagtc tcttgttaca ttcccgggag acaaatatac agggagccaa 1500 gccgagtgct aggtgatgac tgcctgtgaa gtctattgtg gccacagact gctgggtacc 1560 aagtctcagg agaacccagc ctagatttag gagacacaga tctgcctttc atgcagtgta 1620 gctgtccttg ggagccttac catgctctct aactagtacc tcaactcaca tgtcactgag 1680 gaacccccta acactggccc agcccagggg tcgggatgct ggccaatgtc catggagtgg 1740 gactacccat ggagagtcct tgggtcatca catcacaaat gttttattcc aacctcccag 1800 tggtgagagc tcgggacaca aaggtccatc ctggggacct tcttcctggt tctaggcaga 1860 cctgaactct gtctgctgct agagctgatg tggttttccg cctcagtttc ctcctccggg 1920 gataggccac cggaggattt gggagggtgg ggagggcatc ctgctgatgg gctcgccgag 1980 gttctcagga acaggaacgg gcggggcttt agtacacagg tgagttgggt gggaactggc 2040 ccggagctga ggagacactg actgggcaga gggaagatga gtctcaaggg agggcaggaa 2100 aagggagggg gagcgcgcat gcacatgtgc actcagtgca ggctacagag cccaaaaggc 2160 agcactggct gtggtgtccc ctgaggccca ggcaagatgc taggaggaag ccaatgctgc 2220 ccccacctga gctcacatgg aacatgcaca ccaccagcag cagcagcaag cattgagact 2280 gacctgtgga cgccataggg cactggcaag gagggtcaga ggcgggtccc tgactcagtg 2340 ggtgaggccc gggaaacatt atcctgttac cctgcgtgtg caagatcatt gtccccagct 2400 agatggcgtc ctcaaccaaa actgagagga gccccagttc aggtcctccc tcctaccaca 2460 agggggtggt gtggaggagg cttgattgcc cttggagaag caccggtact gcagagctgg 2520 gggccagctt ctttcatctg tgtctagaca ccgaccagat aggccccaca gtggcaacac 2580 tgccacacag ccctacaaga agccctgtgc ctagctagca cagagcccca aaaggtgctc 2640 aattaataca gggccaagcc tgccagtggg ggggatgcag attaggggaa cagacccaga 2700 tggcctgtcc tgaaccctgt ctggggtggt gtgatgagca tctgtctagc ccactgcagg 2760 tggctctaca cactccacaa cagttctgca aaagtgtatg aggtggtcat tactgcgccc 2820 ctctcacagg taaaggcact gaggcacgga ggagtgaggc acttcatttt cctgggccat 2880 tcaactttcc aggaccaaca cattcaacta tgggtactac tccaatagct ggggttcttt 2940 gaggctgggc < cccctgaaga tgatagtggc ttcatcaacc agagaatttc agagtgcagt 3000 gttgtaggag < cctatgaacc tgaaatgtca gaactggagg tttgaggggc tgaggggtag 3060 gccaggggtg ' tctggcccct tgtgtggaga cagagagaga gggaacatgg gatggggtag 3120 tagagagaag tgcaaaggag cgtcagcctt tctcagggct aatgctgtca gggacgaggg 3180 ctcaagcctg tgagtgttct cacactgtga taaacagtgg cccctcaaca cagacggtgt 3240 ccagagtggc cggcagtggt tatctagagt tgcaatctgg aagcctcttg gtagtcactg 3300 gagagaggcc gcttgatggg acagcaccaa atgtgtgtgc ttctgtggga tgtgaggaag 3360 ctgggtcagc gcatgaagcc aaagcgtcct tcagagcaga ggggtggctg gtctagtcca 3420 ccagagacaa gctatccagt gagagtcata ctctgccacc gtctctgtga ttaccttacc 3480 ccaaagcaga cggggacggg atgcagagca cccgtgtctt catcttctgc ggcaagcacg 3540 tgagttcaca ttctgaaact ctagaaagat ttccaggagt ggggtgtgcc tttgctttgg 3600 tgcatggtta cttcctggca agcaccgtgg catcccgcag cactgagtga cctgggctcc 3660 tcaagccatc tcattggtga aatgacagtg ccagtaccct ctcagctggc tcttggaggc 3720 ctgtgcatgg ggtctgcaca gaggaggccc ccaaactatg catggacgga cacgtgatgc 3780 ctagcacttc ccttggttgt gtctctgcca accccaggct ctcacccagc aaggaaatga 3840 aatccacttt tatgacacat ctccctcccc cagccagctc cattcaccta tatgccaggg 3900 tggtcccttt caatgtctgt cccccattgg atgaataaac aagcgaagga ca 3952 <210> 58 <211> 116 <212> PRT
<213> mus musculus <400> 58
Met Thr His Leu Leu Thr Val Phe Leu Val Ala Leu Met Gly Leu Pro 15 10 15
Val Ala Gln Ala Leu Glu Cys His Val Cys Ala Tyr Asn Gly Asp Asn 20 25 30
Cys Phe Lys Pro Met Arg Cys Pro Ala Met Ala Thr Tyr Cys Met Thr 35 40 45
Thr Arg Thr Tyr Phe Thr Pro Tyr Arg Met Lys Val Arg Lys Ser Cys 50 55 60
Val Pro Ser Cys Phe Glu Thr Val Tyr Asp Gly Tyr Ser Lys His Ala 65 70 75 80
Ser Ala Thr Ser Cys Cys Gln Tyr Tyr Leu Cys Asn Gly Ala Gly Phe
85 90 95
Ala Thr Pro Val Thr Leu Ala Leu Val Pro Ala Leu Leu Ala Thr Phe 100 105 110
Trp Ser Leu Leu 115
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Seqüência Artificial <400> 59
catgatcctc cgaatctggt 20
<210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Seqüência Artificial <400> 60
agcacagaac agaggggcta 20
<210> 61 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Seqüência Artificial <400> 61
atacggccaa tgtcacaaca 20
<210> 62 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220> <223> Seqüência Artificial <400> 62
acttcctgtt cccaccactg <210> 63 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Seqüência Artificial <400> 63
agaggacaag cggagagaca <210> 64 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Seqüência Artificial <400> 64
ttctggcagg ggtgttctag <210> 65 <211> 18 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Seqüência Artificial <400> 65
agcagcagca ggaaggat <210> 66 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <223> Seqüência Artificial <400> 66
aaaagtgccg cttaacgaag 2 0
<210> 67 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Seqüência Artificial <400> 67
caagatgtgt gcttcctcct gcga 24
<210> 68 <211> 2798 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 68
cgttgctgtc gctctgcacg cacctatgtg gaaactaaag cccagagaga aagtctgact 60 tgccccacag ccagtgagtg actgcagcag caccagaatc tggtctgttt cctgtttggc 120 tcttctacca ctacggcttg ggatctcggg catggtggct ttgccaatgg tccttgtttt 180 gctgctggtc ctgagcagag gtgagagtga attggacgcc aagatcccat ccacagggga 240 tgccacagaa tggcggaatc ctcacctgtc catgctgggg tcctgccagc cagccccctc 300 ctgccagaag tgcatcctct cacaccccag ctgtgcatgg tgcaagcaac tgaacttcac 360 cgcgtcggga gaggcggagg cgcggcgctg cgcccgacga gaggagctgc tggctcgagg 420 ctgcccgctg gaggagctgg aggagccccg cggccagcag gaggtgctgc aggaccagcc 480 gctcagccag ggcgcccgcg gagagggtgc cacccagctg gcgccgcagc gggtccgggt 540 cacgctgcgg cctggggagc cccagcagct ccaggtccgc ttccttcgtg ctgagggata 600 cccggtggac ctgtactacc ttatggacct gagctactcc atgaaggacg acctggaacg 660 cgtgcgccag ctcgggcacg ctctgctggt ccggctgcag gaagtcaccc attctgtgcg 720 cattggtttt ggttcctttg tggacaaaac ggtgctgccc tttgtgagca cagtaccctc 780 caaactgcgc cacccctgcc ccacccggct ggagcgctgc cagtcaccat tcagctttca 840 ccatgtgctg tccctgacgg gggacgcaca agccttcgag cgggaggtgg ggcgccagag 900 tgtgtccggc aatctggact cgcctgaagg tggcttcgat gccattctgc aggctgcact 960 ctgccaggag cagattggct ggagaaatgt gtcccggctg ctggtgttca cttcagacga 1020 cacattccat acagctgggg acgggaagtt gggcggcatt ttcatgccca gtgatgggca 1080 ctgccacttg gacagcaatg gcctctacag tcgcagcaca gagtttgact acccttctgt 1140 gggtcaggta gcccaggccc tctctgcagc aaatatccag cccatctttg ctgtcaccag 1200 tgccgcactg cctgtctacc aggagctgag taaactgatt cctaagtctg cagttgggga 1260 gctgagtgag gactccagca acgtggtaca gctcatcatg gatgcttata atagcctgtc 1320 ttccaccgtg acccttgaac actcttcact ccctcctggg gtccacattt cttacgaatc 1380 ccagtgtgag ggtcctgaga agagggaggg taaggctgag gatcgaggac agtgcaacca 1440 cgtccgaatc aaccagacgg tgactttctg ggtttctctc caagccaccc actgcctccc 1500 agagccccat ctcctgaggc tccgggccct tggcttctca gaggagctga ttgtggagtt 1560 gcacacgctg tgtgactgta attgcagtga cacccagccc caggctcccc actgcagtga 1620 tggccaggga cacctacaat gtggtgtatg cagctgtgcc cctggccgcc taggtcggct 1680 ctgtgagtgc tctgtggcag agctgtcctc cccagacctg gaatctgggt gccgggctcc 1740 caatggcaca gggcccctgt gcagtggaaa gggtcactgt caatgtggac gctgcagctg 1800 cagtggacag agctctgggc atctgtgcga gtgtgacgat gccagctgtg agcgacatga 1860 gggcatcctc tgcggaggct ttggtcgctg ccaatgtgga gtatgtcact gtcatgccaa 1920 ccgcacgggc agagcatgcg aatgcagtgg ggacatggac agttgcatca gtcccgaggg 1980 agggctctgc agtgggcatg gacgctgcaa atgcaaccgc tgccagtgct tggacggcta 2040 ctatggtgct ctatgcgacc aatgcccagg ctgcaagaca ccatgcgaga gacaccggga 2100 ctgtgcagag tgtggggcct tcaggactgg cccactggcc accaactgca gtacagcttg 2160 tgcccatacc aatgtgaccc tggccttggc ccctatcttg gatgatggct ggtgcaaaga 2220 gcggaccctg gacaaccagc tgttcttctt cttggtggag gatgacgcca gaggcacggt 2280 cgtgctcaga gtgagacccc aagaaaaggg agcagaccac acgcaggcca ttgtgctggg 2340 ctgcgtaggg ggcatcgtgg cagtggggct ggggctggtc ctggcttacc ggctctcggt 2400 ggaaatctat gaccgccggg aatacagtcg ctttgagaag gagcagcaac aactcaactg 2460 gaagcaggac agtaatcctc tctacaaaag tgccatcacg accaccatca atcctcgctt 2520 tcaagaggca gacagtccca ctctctgaag gagggaggga cacttaccca aggctcttct 2580 ccttggagga cagtgggaac tggagggtga gaggaagggt gggtctgtaa gaccttggta 2640 ggggactaat tcactggcga ggtgcggcca ccaccctact tcattttcag agtgacaccc 2700 aagagggctg cttcccatgc ctgcaacctt gcatccatct gggctacccc acccaagtat 2760 acaataaagt cttacctcag aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2798 <211> 798 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 69
Met Val Ala Leu Pro Met Val Leu Val Leu Leu Leu Val Leu Ser Arg 15 10 15
Gly Glu Ser Glu Leu Asp Ala Lys Ile Pro Ser Thr Gly Asp Ala Thr 20 25 30
Glu Trp Arg Asn Pro His Leu Ser Met Leu Gly Ser Cys Gln Pro Ala 35 40 45
Pro Ser Cys Gln Lys Cys Ile Leu Ser His Pro Ser Cys Ala Trp Cys 50 55 60
Lys Gln Leu Asn Phe Thr Ala Ser Gly Glu Ala Glu Ala Arg Arg Cys 65 70 75 80
Ala Arg Arg Glu Glu Leu Leu Ala Arg Gly Cys Pro Leu Glu Glu Leu
85 90 95
Glu Glu Pro Arg Gly Gln Gln Glu Val Leu Gln Asp Gln Pro Leu Ser 100 105 110
Gln Gly Ala Arg Gly Glu Gly Ala Thr Gln Leu Ala Pro Gln Arg Val 115 120 125
Arg Val Thr Leu Arg Pro Gly Glu Pro Gln Gln Leu Gln Val Arg Phe 130 135 140
Leu Arg Ala Glu Gly Tyr Pro Val Asp Leu Tyr Tyr Leu Met Asp Leu 145 150 155 160
Ser Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu Glu Arg Val Arg Gln Leu Gly His
165 170 175
Ala Leu Leu Val Arg Leu Gln Glu Val Thr His Ser Val Arg Ile Gly 180 185 190
Phe Gly Ser Phe Val Asp Lys Thr Val Leu Pro Phe Val Ser Thr Val 195 200 205
Pro Ser Lys Leu Arg His Pro Cys Pro Thr Arg Leu Glu Arg Cys Gln 210 215 220 Ser Pro Phe Ser Phe His His Val Leu Ser Leu Thr Gly Asp Ala Gln 225 230 235 240
Ala Phe Glu Arg Glu Val Gly Arg Gln Ser Val Ser Gly Asn Leu Asp 245 250 255
Ser Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Ile Leu Gln Ala Ala Leu Cys Gln 260 265 270
Glu Gln Ile Gly Trp Arg Asn Val Ser Arg Leu Leu Val Phe Thr Ser 275 280 285
Asp Asp Thr Phe His Thr Ala Gly Asp Gly Lys Leu Gly Gly Ile Phe 290 295 300
Met Pro Ser Asp Gly His Cys His Leu Asp Ser Asn Gly Leu Tyr Ser 305 310 315 320
Arg Ser Thr Glu Phe Asp Tyr Pro Ser Val Gly Gln Val Ala Gln Ala 325 330 335
Leu Ser Ala Ala Asn Ile Gln Pro Ile Phe Ala Val Thr Ser Ala Ala 340 345 350
Leu Pro Val Tyr Gln Glu Leu Ser Lys Leu Ile Pro Lys Ser Ala Val 355 360 365
Gly Glu Leu Ser Glu Asp Ser Ser Asn Val Val Gln Leu Ile Met Asp 370 375 380
Ala Tyr Asn Ser Leu Ser Ser Thr Val Thr Leu Glu His Ser Ser Leu 385 390 395 400
Pro Pro Gly Val His Ile Ser Tyr Glu Ser Gln Cys Glu Gly Pro Glu 405 410 415
Lys Arg Glu Gly Lys Ala Glu Asp Arg Gly Gln Cys Asn His Val Arg 420 425 430
Ile Asn Gln Thr Val Thr Phe Trp Val Ser Leu Gln Ala Thr His Cys 435 440 445
Leu Pro Glu Pro His Leu Leu Arg Leu Arg Ala Leu Gly Phe Ser Glu 450 455 460
Glu Leu Ile Val Glu Leu His Thr Leu Cys Asp Cys Asn Cys Ser Asp 465 470 475 480 Thr Gln Pro Gln Ala Pro His Cys Ser Asp Gly Gln Gly His Leu Gln 485 490 495
Cys Gly Val Cys Ser Cys Ala Pro Gly Arg Leu Gly Arg Leu Cys Glu 500 505 510
Cys Ser Val Ala Glu Leu Ser Ser Pro Asp Leu Glu Ser Gly Cys Arg 515 520 525
Ala Pro Asn Gly Thr Gly Pro Leu Cys Ser Gly Lys Gly His Cys Gln 530 535 540
Cys Gly Arg Cys Ser Cys Ser Gly Gln Ser Ser Gly His Leu Cys Glu 545 550 555 560
Cys Asp Asp Ala Ser Cys Glu Arg His Glu Gly Ile Leu Cys Gly Gly 565 570 575
Phe Gly Arg Cys Gln Cys Gly Val Cys His Cys His Ala Asn Arg Thr 580 585 590
Gly Arg Ala Cys Glu Cys Ser Gly Asp Met Asp Ser Cys Ile Ser Pro 595 600 605
Glu Gly Gly Leu Cys Ser Gly His Gly Arg Cys Lys Cys Asn Arg Cys 610 615 620
Gln Cys Leu Asp Gly Tyr Tyr Gly Ala Leu Cys Asp Gln Cys Pro Gly 625 630 635 640
Cys Lys Thr Pro Cys Glu Arg His Arg Asp Cys Ala Glu Cys Gly Ala 645 650 655
Phe Arg Thr Gly Pro Leu Ala Thr Asn Cys Ser Thr Ala Cys Ala His 660 665 670
Thr Asn Val Thr Leu Ala Leu Ala Pro Ile Leu Asp Asp Gly Trp Cys 675 680 685
Lys Glu Arg Thr Leu Asp Asn Gln Leu Phe Phe Phe Leu Val Glu Asp 690 695 700
Asp Ala Arg Gly Thr Val Val Leu Arg Val Arg Pro Gln Glu Lys Gly 705 710 715 720
Ala Asp His Thr Gln Ala Ile Val Leu Gly Cys Val Gly Gly Ile Val 725 730 735 Ala Val Gly Leu Gly Leu Val Leu Ala Tyr Arg Leu Ser Val Glu Ile 740 745 750
Tyr Asp Arg Arg Glu Tyr Ser Arg Phe Glu Lys Glu Gln Gln Gln Leu 755 760 765
Asn Trp Lys Gln Asp Ser Asn Pro Leu Tyr Lys Ser Ala Ile Thr Thr 770 775 780
Thr Ile Asn Pro Arg Phe Gln Glu Ala Asp Ser Pro Thr Leu 785 790 795

Claims (37)

1. Método de detecção a doença inflamatória intestinal (IBD) em um mamífero, compreendendo detecção do nível de expressão de um gene de codificação de um polipeptídeo LY6 (a) em uma amostra de teste de teci- do ou células obtida a partir do dito mamífero, e (b) em uma amostra de con- trole, em que um nível maior de expressão do ácido nucleico ou polipeptídeo LY6 na amostra de teste, quando comparada com a amostra de controle, é indicativo da presença de IBD no mamífero a partir do qual a amostra de teste foi obtida.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o tecido ou células da amostra de teste são do trato gastrointestinal do mamífero.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que tecido ou células da amostra de teste são do cólon do mamífero.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra de controle é uma amostra de tecido ou células normais não-IBD da mesma origem ou tipo de tecido, ou múltiplas amostras de tecido ou células não-IBD da mesma origem ou tipo de tecido, dos quais os níveis de expressão tem a média calculada, ou um controle universal representando a expressão gêni- ca em amostras múltiplas do tecido normal, saudável da mesma espécie.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o tecido ou células da amostra de teste são inflamados.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que tecido ou células da amostra de teste não são inflamados.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo: (a) contato da amostra de teste com um agente detectável que se liga especificamente um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo LY6 ou fragmento do mesmo; (b) contato da amostra de controle com o agente detectável; e (c) detecção da formação de um complexo entre o agente e o polinucleotídeo da amostra de teste e amostra de controle, em que a forma- ção de menos complexo na amostra de teste em relação à amostra de con- trole é indicativa da presença de IBD no mamífero.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o polinu- cleotídeo compreende a seqüência de ácido nucleico de SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, ou um fragmento da mesma compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N0:1, 3, 5 ou 7.
9. Método de acordo com a reivindicação 7, em que tecido ou células da amostra de teste são do trato gastrointestinal do mamífero.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o tecido ou células da amostra de teste são de cólon do mamífero.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a amostra de controle é uma amostra do tecido ou células normais não-IBD da mesma origem ou tipo tecido, ou múltiplas amostras do tecido ou células não-IBD da mesma origem ou tipo de tecido, dos quais níveis de expressão tem a média calculada, ou um controle universal que representa a expressão gênica em múltiplas amostras de tecido normal, saudável da mesma espécie.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que tecido ou células da amostra de teste são inflamados.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o tecido ou células da amostra de teste são não-inflamados.
14. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o agente é um segundo polinucleotídeo que hibridiza a um polinucleotídeo tendo a se- quência SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 ou seus complementos.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o segun- do polinucleotídeo compreende um marcador detectável ou ligado a um su- porte sólido.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o marca- dor detectável é diretamente detectável.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o marca- dor detectável é indiretamente detectável.
18. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o marca- dor detectável é um marcador fluorescente.
19. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o método está no ensaio de hibridização in situ.
20. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o método é ensaio de reação de polimerase em cadeia em tempo real (RT-PCR).
21. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o método é ensaio de reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR).
22. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo: (a) contato da amostra de teste com um agente detectável que se liga especificamente um polipeptídeo ou fragmento do mesmo; (b) contato da amostra de controle com o agente detectável; e (c) detecção da formação de um complexo entre o agente e o polipeptídeo da amostra de teste e a- mostra de controle, em que a formação de menos complexo na amostra de teste em relação à amostra de controle é indicativa da presença de IBD no mamífero.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o polipep- tídeo LY6 compreende a SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 ou um fragmento da mesma compreendendo pelo menos 10 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO:2, 4, 6, ou 8.
24. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o tecido ou células da amostra de teste são do trato gastrointestinal do mamífero.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o tecido ou células da amostra de teste são do cólon do mamífero.
26. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 22, em que o tecido ou células da amostra de teste são inflamados.
27. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 22, em que teci- do ou células da amostra de teste são não-inflamados.
28. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o agente é um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o anticor- po ou fragmento de ligação do mesmo compreendem um marcador detectá- vel.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o marca- dor detectável é diretamente detectável.
31. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o marca- dor detectável é indiretamente detectável.
32. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o marca- dor detectável é um marcador fluorescente ou um radiomarcador.
33. Método de acordo com a reivindicação 1, 7 ou 22, em que a amostra de teste de tecido ou células é obtida de um mamífero suspeito de experimentar IBD.
34. Método de acordo com a reivindicação 1, 7, ou 22, em que a amostra de teste de tecido ou células é obtida de um mamífero suspeito de experimentar UC.
35. Método de acordo com a reivindicação 1, 7, ou 22, em que os tecidos ou as células do mamífero foram contatados com um agente tera- pêutico, e em que o nível da expressão de LY6 é indicativo da presença ou a ausência de uma resposta ao agente terapêutico no tecido ou células do mamífero.
36. Método de acordo com a reivindicação 1, 7, ou 22, em que os tecidos ou células do mamífero foram contactados com um agente tera- pêutico, em que a detecção é uma segunda ou subsequente detecção, e em que o nível da expressão de LY6 é indicativo da presença ou ausência de uma resposta ao agente terapêutico no tecido ou células do mamífero.
37. Método de acordo com a reivindicação 1, 7, ou 22, em que o aumento na expressão de LY6 na amostra de teste é pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, ou pelo menos 10 vezes maior que a amostra de controle.
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