BRPI0719885B1 - peptídeos peguilados como moduladores de receptores de pth, seus usos, e composição. - Google Patents

peptídeos peguilados como moduladores de receptores de pth, seus usos, e composição. Download PDF

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Lea Brown-Augsburger Patricia
David Kohn Wayne
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Lilly Co Eli
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Description

(54) Título: PEPTÍDEOS PEGUILADOS COMO MODULADORES DE RECEPTORES DE PTH, SEUS USOS, E COMPOSIÇÃO.
(73) Titular: ELI LILLY AND COMPANY, Sociedade Norte Americana. Endereço: Lilly Corporate Center, Indianapolis, IN 46285, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: PATRÍCIA LEA BROWN-AUGSBURGER; WAYNE DAVID KOHN.
Código de Controle: 61F04901D95ED94C 24175A15F1022A67
Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 11/12/2018, observadas as condições legais
Expedida em: 11/12/2018
Assinado digitalmente por:
Liane Elizabeth Caldeira Lage
Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados
1/37
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PEPTÍDEOS PEGUILADOS COMO MODULADORES DE RECEPTORES DE PTH, SEUS USOS, E COMPOSIÇÃO.
[001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US N° 60/829.383 depositado em 13 de outubro de 2006.
Campo da Invenção [002] A presente invenção se refere a compostos moduladores de receptores do hormônio paratireóideo (PTHR) e a métodos de produção e uso dos mesmos.
Fundamentos da Invenção [003] Doenças degenerativas de ossos tais como osteoporose ocorrem uma parcela substancial da população adulta idosa. Osteoporose abrange um grupo heterogêneo de distúrbios que representam um grande risco para fraturas ósseas, e um ônus significativa para o sistema de saúde. São gastos bilhões de dólares anualmente em serviços médicos para o tratamento de osteoporose. Clinicamente, a osteoporose caracteriza-se por massa óssea diminuída, densidade mineral óssea (BMD) e teor mineral ósseo (BMC) reduzidos, e perda da arquitetura óssea resultando em resistência óssea diminuída e risco de fratura óssea aumentado.
[004] Embora inúmeros agentes antirresortivos que incluem calcitonina, bifosfonatos, estrogênio, e SERMs previnam mais perda óssea, eles não reconstroem osso depois de perdido. O primeiro agente reconstrutor de osso anabólico aprovado pelo FDA para o tratamento de osteoporose é PTH(1-34) humano, também conhecido como teriparatida, que é comercializada sob o nome comercial FORTEO® (Eli Lilly e Company, Indianápolis, IN). Acredita-se que o PTH ou PTH(1-34) exerce seus efeitos através da ativação mediada por receptores de duas vias de sinalização intracelulares por meio de (1) adenilato ci
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2/37 clase e quinase proteica A, e (2) fosfolipase C e quinase proteica C. O PTH(1-34) cria massa óssea, restaura a arquitetura óssea, e reduz o risco de fraturas ósseas vertebrais e não-vertebrais em pacientes osteoporóticos que correm alto risco de fratura. (R. Neer, NEJM, 344:1434, 2001). Como um produto peptídico, o PTH(1-34) requer injeções subcutâneas diárias. A Publicação Internacional WO2004/060386 apresenta um gênero enorme de moduladores de PTH/PTHrP compreendendo um veículo que causam maior resposta hipercalcêmica que o PTH(1-34).
[005] Ainda são necessários novos análogos de PTH terapêuticos que demonstrem eficácia em criação de osso refletida por um teor mineral ósseo (BMC) e/ou resistência óssea aumentados ao mesmo tempo em que de preferência mantenham um efeito de hipercalcemia semelhante, ou menor, que o do PTH(1-34) terapêutico atual e que requeiram administração menos frequente que o PTH(1-34). Os compostos da presente invenção satisfazem essas necessidades e oferecem vantagens associadas.
Sumário da Invenção [006] Um composto peguilado da invenção é um composto com uma sequência selecionada do grupo que consiste em:
a) Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu Arg
O mPEG
Figure BRPI0719885B1_D0001
Figure BRPI0719885B1_D0002
Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe - NH2 (SEQ ID N° 1),
b) Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg
O mPEG
Figure BRPI0719885B1_D0003
Figure BRPI0719885B1_D0004
Leu Leu Gln Glu Val -NH2 (SEQ ID N° 2),
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3/37
c) Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu Arg
O mPEG
Figure BRPI0719885B1_D0005
O
Val Glu Trp Leu Arg
Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe - NH2 (SEQ ID N° 3),
d) Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg
O mPEG
Figure BRPI0719885B1_D0006
O
Val Glu Trp Leu Arg
Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe -NH2 (SEQ ID N°4), e
e) Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg
Figure BRPI0719885B1_D0007
Figure BRPI0719885B1_D0008
mPEG
Val Glu Trp Leu Arg
Leu Leu Gln Glu Val His Gln Phe -NH2 (SEQ ID N° 5);
em que mPEG é monometóxi-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000
Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[007] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um composto com a sequência de:
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu Arg
Figure BRPI0719885B1_D0009
Figure BRPI0719885B1_D0010
mPEG
Val Glu Trp Leu Arg
Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe - NH2 (SEQ ID N°1), em que mPEG é monometóxi-polietileno glicol com um peso molecular
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4/37 médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[008] Em uma outra modalidade preferida, a invenção fornece um composto com a sequência de:
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg
Figure BRPI0719885B1_D0011
Figure BRPI0719885B1_D0012
mPEG
Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe -NH2 (SEQ ID N°4), em que mPEG é monometóxi-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000
Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[009] Em uma modalidade, a invenção fornece um composto com a sequência de:
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa8 His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Xaa18 Glu Arg
Figure BRPI0719885B1_D0013
Figure BRPI0719885B1_D0014
mPEG
Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe - NH2 (SEQ ID N° 6);
em que Xaa8 e Xaa18 são Met ou Xaa8 e Xaa18 são Nle; e em que mPEG é monometóxi-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0010] Em uma modalidade, a invenção fornece um intermediário com uma sequência selecionada do grupo que consiste em:
a) Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu Arg Val
Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe (SEQ ID N° 8),
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5/37
b) Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Glu Val (SEQ ID N° 9),
c) Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe (SEQ ID N° 10),
d) Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe (SEQ ID N°11), e
e) Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Glu Val His Gln Phe (SEQ ID N° 12);
ou a amida C-terminal das mesmas.
[0011] A invenção fornece um método para induzir a formação óssea em um mamífero compreendendo administrar a um mamífero com necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um composto de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 em que mPEG é monometóxipolietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0012] A invenção fornece um método para tratar uma doença ou condição na qual formação de novos ossos e/ou um aumento na massa óssea e na resistência óssea biomecânica seria vantajoso em um mamífero, que inclui osteoporose, osteopenia, fratura óssea, fusões espinhais, implantes ósseos, implantes articulares, implantes dentários, e doenças periodontais, compreendendo administrar a um mamífero com necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um composto de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 em que m PEG é monometóxi-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0013] A invenção fornece um método para o tratamento de osteoporose ou osteopenia em um paciente que compreende administrar a um paciente com necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz
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6/37 de um composto de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 em que mPEG é monometóxi-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a
5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0014] A presente invenção também fornece um método para a prevenção de osteoporose ou osteopenia em um mamífero que compreende administrar a um paciente com necessidade de tal prevenção uma quantidade eficaz de um composto de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 em que mPEG é monometóxi-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0015] A invenção fornece método para o tratamento de uma fratura óssea em um paciente que compreende administrar a um paciente com necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um composto de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 em que m PEG é monometóxi-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0016] Em uma modalidade, a invenção fornece uma formulação farmacêutica compreendendo um composto de SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 em que mPEG é monometóxi-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em combinação com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0017] Em uma modalidade, esta invenção fornece um composto de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 em que mPEG é monometóxiPetição 870180000782, de 04/01/2018, pág. 10/51
7/37 polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso em terapia.
[0018] Em uma modalidade, esta invenção fornece um composto de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 em que mPEG é monometóxipolietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso na indução de formação óssea em um mamífero, de preferência um ser humano.
[0019] Em uma modalidade, esta invenção fornece um composto de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 em que mPEG é monometóxipolietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso no tratamento de uma doença ou condição na qual formação de novos ossos e/ou um aumento na massa óssea e na resistência óssea biomecânica seria vantajoso em um mamífero, de preferência um ser humano, que inclui osteoporose, osteopenia, cicatrização de fratura óssea, fusão espinhal, implantes ósseos, implantes articulares, implantes dentários, e doenças periodontais.
[0020] Em uma modalidade, esta invenção fornece um composto de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 em que mPEG é monometóxipolietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso no tratamento de osteoporose em um mamífero, de preferência um ser humano.
[0021] Em uma modalidade, esta invenção fornece um composto
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8/37 de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, em que mPEG é monometóxipolietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso na prevenção de osteoporose em um mamífero, de preferência um ser humano.
[0022] Em uma modalidade, a invenção fornece um composto de S SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, em que mPEG é monometóxipolietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para uso no tratamento de uma fratura óssea em um mamífero, de preferência um ser humano.
[0023] A invenção fornece o uso de um composto de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, em que mPEG é monometóxi-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; para a produção de um medicamento para tratar uma doença ou condição que pode ser melhorada ou prevenida pela indução de formação óssea.
[0024] A invenção fornece o uso de um composto de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, em que mPEG é monometóxi-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; para a produção de um medicamento para o tratamento de condições nas quais formação de novos ossos e/ou um aumento na massa óssea e na resistência óssea biomecânica seria vantajoso em um mamífero, de preferência um ser humano, que inclui osteoporose, osteopenia, cicatrização de fratura óssea, fusão espinhal, implantes ósseos, implantes arti
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9/37 culares, implantes dentários, e doenças periodontais.
[0025] A invenção também fornece o uso de um composto de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, em que mPEG é monometóx i-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; para a produção de um medicamento para tratamento de osteoporose em um mamífero, de preferência um ser humano.
[0026] A invenção também fornece o uso de um composto de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, em que mPEG é monometóx i-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; para a produção de um medicamento para prevenção de osteoporose ou osteopenia em um mamífero, de preferência um ser humano.
[0027] A invenção também fornece o uso de um composto de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, em que mPEG é monometóx i-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2000 Dáltons; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; para a produção de um medicamento para uso no tratamento de uma fratura óssea em um mamífero, de preferência um ser humano.
Descrição Detalhada da Invenção [0028] A formação óssea ocorre durante o desenvolvimento fetal e o crescimento pós-natal e também durante a vida adulta seja a uma lenta como parte da remodelagem óssea normal seja a uma taxa acelerada em resposta à lesão ou perda óssea anormal. A formação óssea envolve inúmeros processos, que incluem proliferação de células progenitoras de osteoblastos, diferenciação de osteoblastos de células progenitoras e mineralização da matriz produzida pelos osteoblastos.
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O termo induzindo formação óssea ou induzindo a formação de novos ossos significa um aumento líquido na massa óssea (por exemplo, demonstrado por um aumento no teor mineral ósseo (BMC) e/ou na resistência óssea biomecânica determinado usando o método do
Exemplo 4B deste relatório.
[0029] O termo quantidade eficaz conforme usado neste relatório é uma dose de um composto da invenção necessária para obter o efeito farmacológico desejado.
[0030] O termo atividade in vitro se refere à atividade de um composto da invenção em um ou mais ensaios in vitro adequados que incluem, por exemplo, a capacidade de ativar um receptor de PTH em um ensaio à base de células. A atividade pode ser expressa como EC50 que identifica uma concentração eficaz de um composto que resulta em 50% da ativação máxima no ensaio escolhido. Qualquer ensaio in vitro adequado pode ser usado para testar a ligação e a ativação do receptor de PTH, inclusive ativação de adenilato ciclase resultando em níveis aumentados de AMP cíclico (cAMP) (vide Exemplo 3 desta invenção). Os compostos da invenção têm atividade agonística variável o que leva a um aumento no cAMP intracelular.
[0031] Em sua forma típica, mPEG (monometóxi polietileno glicol) é um polímero linear com grupos terminais hidroxil tendo a fórmula CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH, em que n varia de cerca de 8 a cerca de 4000. O mPEG usado na presente invenção apresenta um peso molecular médio de 1.500 a 5.500 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2.000 a 5.000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 2.000 a 2.300, ainda mais preferivelmente cerca de 2.000 Dáltons. Reagentes à base de mPEG comercialmente disponíveis (por exemplo, NOF SUNBRIGHT® ME-020AS) geralmente têm um certo grau de polidispersidade, o que significa que n varia em uma faixa em uma distribuição aproximadamente gaussiana, de preferência em uma faixa es
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11/37 treita. O hidrogênio terminal geralmente pode ser substituído por um grupo terminal tal como um grupo alquila ou aromático. Embora na molécula de mPEG o hidrogênio terminal seja substituído por um grupo metóxi, contempla-se que o hidrogênio terminal pode ser substituído por uma cadeia de carbonos de comprimento variável, por exemplo uma cadeia de até 10 carbonos, linear ou ramificada, e ainda se enquadrar na invenção.
[0032] Um composto com uma sequência como aquela mostrada nas SEQ ID N°s: 8-12 pode ser usado como um intermediário na síntese de um composto peguilado da invenção. De preferência um composto com uma sequência como aquela mostrada nas SEQ ID N°s: 812 está na forma de amida no terminal carbóxi do composto.
[0033] Os termos ligador, porção ligadora, e espaçador são nesta invenção referem-se a um átomo ou a um conjunto de átomos opcionalmente usados para ligar porções interconectantes tais como um terminal de um segmento de polímero e um peptídio. A porção ligadora é a porção do polímero total que contém uma porção reativa para possibilitar a ligação covalente a um ponto mutuamente reativo em um peptídio.
[0034] O termo conjugado (ou intercambiavelmente peptídio conjugado) nesta invenção indicam uma molécula heterogênea formada pela ligação covalente de um peptídio a uma molécula de PEG.
[0035] O termo ligação covalente significa que um peptídio e uma molécula de polietileno glicol ou são diretamente ligados covalentemente um ao outro, ou ainda são indiretamente ligados covalentemente um ao outro através de uma porção ou porções intervenientes, tal como um ligador, uma porção ligadora, ou um espaçador.
[0036] Os compostos peguilados da presente invenção podem reagir com qualquer um de inúmeros ácidos ou bases inorgânicos e orgânicos para formar sais farmaceuticamente aceitáveis. Sais farmaPetição 870180000782, de 04/01/2018, pág. 15/51
12/37 ceuticamente aceitáveis preferidos são aqueles formados com ácido de acetato, ácido cítrico e ácido clorídrico. Especialmente preferidos são os sais de acetato dos compostos de SEQ ID N° 1, 2, 3, 4 ou 5, em que mPEG é monometóxi-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons, de preferência cerca de 2000 a 5000 Dáltons, mais preferivelmente 2000 Dáltons. Métodos para a preparação de sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da presente invenção são bastante conhecidos pelo especialista na técnica (vide: Stahl et al., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, VCHA/Wiley-VCH (2002); e Berge et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 66:1-19, 1977).
[0037] Doenças ósseas degenerativas, tal como osteoporose, caracterizam-se por massa óssea diminuída, BMD diminuída, e perda da arquitetura óssea resultando em resistência óssea diminuída, e risco de fratura óssea aumentado. Os compostos peguilados da invenção podem criar massa óssea, aumentar a resistência óssea biomecânica, restaura a arquitetura óssea, e reduzir o rico de fraturas ósseas vertebrais e não-vertebrais em pacientes osteoporóticos que correm grande risco de fatura. Por conseguinte, os compostos peguilados da invenção são úteis como agentes formadores de osso para tratar ou prevenir doenças ósseas degenerativas, tal como osteoporose. Além disso, os compostos peguilados da invenção são úteis como agentes formadores de osso para melhorar a cicatrização de fraturas e estimular o crescimento ósseo no local de implantes ósseos, implantes articulares ou implantes dentários, ou para tratamento de doenças periodontais.
[0038] Pacientes adequados incluem homens, mulheres, e crianças que apresentam condições de perda óssea ou trauma ósseo, por exemplo, fratura óssea, em que a formação de novos ossos, um aumento na massa óssea, e/ou um aumento na resistência óssea biomecânica seriam benéficos. Por exemplo, os compostos da invenção poPetição 870180000782, de 04/01/2018, pág. 16/51
13/37 dem ser administrados como um meio de induzir a formação de osso e/ou aumentar a massa e a resistência ósseas, reduzindo assim o risco de fratura óssea vertebral e não-vertebral em um paciente com risco de sofrer tais fraturas, incluindo pacientes que sofrem de osteoporose ou osteopenia, por exemplo com osteoporose associada à idade, osteoporose induzida por esteróides, osteoporose pós-menopáusica, osteoporose idiopática, e osteoporose primária ou secundária. Os locais não-vertebrais incluem, por exemplo, quadril, antebraço, úmero, tíbia, rádio, tornozelo, costela, pé, pélvis, e fêmur.
[0039] Os compostos peguilados da invenção também podem ser administrados a um paciente para melhorar ou acelerar a cicatrização de fratura vertebral e/ou não-vertebral, por exemplo, em um paciente que tenha sofrido um trauma resultando em uma fratura óssea, por exemplo devido a um acidente ou uma lesão esportiva, ou que tenha sofrido uma fratura por fragilidade associada à massa óssea baixa, incluindo quadril, antebraço, úmero, tíbia, rádio, tornozelo, costela, pé, pélvis, e fêmur.
Síntese dos compostos [0040] Os compostos da invenção podem ser preparados da maneira descrita no esquema a seguir exemplificando a síntese de um composto com a SEQ ID Na 1:
H2N-resina de amida de Rink e poliestireno Síntese de peptídio em fase sólida estratégia de Fmoc, ativação com
DIC/HOBt activation
Fmoc-Ser-Val-Ser-Glu-lle-GIn-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Arg-His-Leu-Ala-Ser-Met-Glu-ArgVal-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-Val-His-Asn-Phe (SEQ ID Nf 7)-resina de amida de Rink (grupos protetores da cadeia lateral: Boc para Lys e Trp; Pbf para Arg; tBu para Ser,
Asp, e Glu; Trt para Gin, His, e Asn)
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1. divagem com TFA
2. purificação por rp-HPLC
Fmoc-Ser-Val-Ser-Glu-lle-GIn-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Arg-His-Leu-Ala-Ser-Met-Glu-ArgVal-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-NH2 (SEQ ID N? 7)
1. mPEG-NHS
2. piperidina (remoção de Fmoc)
3. acidificar
4. purificação por HPLC de fase reversa
Ser-Val-Ser-Glu-lle-GIn-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Arg-His-Leu-Ala-Ser-Met-Glu-Arg-ValGlu-Trp-Leu-Arg (SEQ ID N? 1)
Figure BRPI0719885B1_D0015
Leu-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-NH2 [0041] A cadeia peptídica dos compostos da presente invenção pode ser sintetizada usando procedimentos tradicionais de síntese em fase sólida manual ou automática. Sintetizadores automáticos de pep tídio encontram-se comercialmente disponíveis, por exemplo, na Ap plied Biosystems (Foster City, CA) e Protein Technologies Inc. (Tuc son, AZ). Reagentes para síntese em fase sólida encontram-se facilmente disponíveis em fontes comerciais. Os sintetizadores de fase sólida podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante para bloquear grupos interferentes, aminoácidos protetores durante a reação, acoplamento, desproteção, e capeamento de aminoácidos não reagidos.
[0042] Tipicamente, um aminoácido protegido com N“-carbamoil e o aminoácido N-terminal na cadeia peptídica em desenvolvimento presa a uma resina são acoplados à temperatura ambiente em um solvente inerte tal como dimetilformamida, N-metilpirrolidona ou cloreto de
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15/37 metileno na presença de agentes de acoplamento tais como diisopropil-carbodiimida (DIC) e
1- hidroxibenzotriazol (HOBt). O grupo protetor Na-carbamoil é removido da resina peptídica resultante usando um reagente tal como ácido trifluoracético (TFA) ou piperidina, e a a reação de acoplamento é repetida com o aminoácido Na-protegido desejado seguinte a ser adicionado à cadeia peptídica. Grupos protetores de amina adequados são bastante conhecidos na literatura e estão descritos, por exemplo, em Green & Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1991. Os exemplos mais comumente usados incluem tBoc e fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc). Depois de terminada a síntese, os peptídios são clivados do suporte em fase sólida com desproteção simultânea das cadeias laterais usando métodos de tratamento tradicionais em condições ácidas.
[0043] O especialista na técnica vai perceber que a cadeia peptídica dos compostos da invenção podem ser sintetizadas com um ácido livre C-terminal ou carboxamida. O tipo de resina de poliestireno derivatizada usada para a síntese vai determinar a porção C-terminal depois da clivagem. Inúmeros ligadores são conhecidos e rotineiramente usados na técnica. Para a síntese de peptídios do tipo amida Cterminais, resinas que incorporam ligadores de amida de Rink MBHA ou de amida de Rink AM são tipicamente usadas com a síntese com Fmoc, ao passo que a resina de MBHA geralmente é usada com a síntese com tBoc. Para a geração de peptídios do tipo ácido C-terminais,
2- clorotritil ou resina de Wang é tipicamente usada para a síntese com Fmoc, ao passo que a síntese com tBoc geralmente emprega a resina PAM. Métodos para carregar o primeiro aminoácido na resina são bastante conhecidos na litetarura.
[0044] Os peptídios brutos são tipicamente purificados usando cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (rp-HPLC)
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16/37 em colunas C8 ou C18 usando gradientes de água-acetonitrila em
0,05 a 0,1% de TFA. A pureza pode ser verificada por rp-HPLC analítica. A identidade dos peptídios pode ser verificada por espectrometria de massa. Os peptídios podem ser solubilizados em tampões aquosos em uma ampla faixa de pH.
[0045] A conjugação de mPEG a um peptídio pode ser efetuada usando reações de síntese química bem caracterizadas (vide: Roberts et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 459-476 (2002) e Veronese, F.M., Biomaterials 22:405-417 (2001) ou de acordo com as recomendações do fabricante. É preferível que o procedimento utilize um excesso molar de um polímero em relação ao peptídio para conduzir a reação até seu término. O excesso do reagente mPEG é separado dos produtos peptídicos conjugados por métodos de separação convencionais tais como rp-HPLC.
[0046] A química de conjugação usada na preparação dos compostos peguilados da invenção é a formação de uma ligação amida entre um carboxilato de mPEG ativado, por exemplo, como um éster de NHS (N-hidroxissuccinimida) e um grupo amino no peptídio. O ligador entre o mPEG e o peptídio é CO-CH2 (carbóxi metil). A sequência peptídica da invenção é criada de modo a conter uma única cadeia lateral Lys para permitir a reação seletiva com o mPEG-NHS éster entrante. Geralmente isto também envolve a derivatização do terminal amino com um grupo protetor tal como Fmoc ou trifluoracetil, que é subsequentemente removido. Alternativamente, o terminal amino pode ser deixado desprotegido e uma acilação parcialmente seletiva da cadeia lateral Lys pode ser obtida em condições de pH e solvente ótimos (vide Patente US N° 5.646.242). A conjugação com amida é de preferência efetuada com um derivado de mPEG-NHS éster e um peptídio Fmoc-protegido N-terminal contendo um único resíduo Lys (ou outro aminoácido contendo amina) em uma mistura aquosa a um pH
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17/37 de 9 a 10 e à temperatura ambiente por 20 a 60 minutos. Subsequente à conjugação, o peptídio conjugado desejado é recuperado e purificado por métodos de separação convencionais tal como rp-HPLC. Composição [0047] Um composto peguilado da invenção pode ser incorporado em composições farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo, particularmente a um ser humano. Um composto peguilado da invenção pode ser administrado isolado ou em combinação com um veículo, diluente e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Especificamente, um composto peguilado da invenção pode ser administrado em um veículo de NaH2PO4 20 mM em 0,9% de NaCl, 3 mg/ml de manitol, pH 5. As composições para administração são criadas para serem apropriadas para o modo de administração selecionado, e diluentes, veículoes, e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes dispersantes, tampões, tensoativos, preservativos, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidade, agentes estabilizantes entre outros são usados conforme apropriado. Tais composições são criadas de acordo com técnicas convencionais como por exemplo em Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995 que oferece um compêndio de técnicas de formulação geralmente conhecidas pelos especialistas.
[0048] Uma composição que compreende um composto peguilado da invenção pode ser administrada a um indivíduo com risco ou apresentando patologias como aquelas descritas neste relatório usando técnicas de administração tradicionais que incluem administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual, ou supositório.
[0049] A via de administração de um composto peguilado da invenção pode ser parenteral, oral, ou por distribuição por inalação ou
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18/37 transdérmica. De preferência, os compostos peguilados da invenção podem ser incorporados em uma composição farmacêutica adequada para administração parenteral. O termo parenteral conforme usado neste relatório inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, retal, vaginal, ou intraperitoneal. A distribuição sistêmica periférica por injeção intravenosa ou intraperitoneal ou subcutânea é preferida.
[0050] Um composto peguilado da invenção pode ser administrado como um aerosol para fins terapêuticos, que deve ser administrado com dispositivos de inalação e que contêm um composto da presente invenção. Aerosóis e métodos para a síntese dos mesmos estão descritos na literatura.
[0051] Um composto peguilado da invenção pode ser administrado regularmente, por exemplo, uma vez ao dia ou uma vez por semana. Alternativamente, um composto peguilado da invenção pode ser administrado, por exemplo duas vezes por semana, ou 3 vezes por semana. Alternativamente, os compostos da invenção podem ser administrados de forma cíclica (por exemplo regularmente por um período de dias ou semanas seguido de um período sem administração). De preferência um composto peguilado da invenção é administrado uma vez por semana por um período que varia de 3 meses a 3 anos.
[0052] A composição tipicamente deve ser estéril e estável nas condições e produção e armazenamento no recipiente fornecido, que inclui por exemplo, um frasco vedado ou uma seringa. Portanto, as composições devem ser filtradas estéreis depois de feita a formulação, ou de alguma forma tornadas microbiologicamente aceitáveis. Para administração parenteral uma faixa de doses típica para um composto da invenção varia de cerca de 1 mg por semana a cerca de 10 mg por semana. De preferência a dose humana variam na faixa de 5 mg por semana a cerca de 1000 mg por semana. Mais preferivelmente a dose
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19/37 varia na faixa de 10 mg por semana a 1000 mg por semana que inclui a administração de 10 mg, 15 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg, 50 mg, 55 mg, 60 mg, 65 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 85 mg, 90 mg, 95 mg, ou 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 500 mg, 750 mg, ou 1000 mg uma vez por semana. Embora estas faixas de dose estejam dadas em unidades por semana, contempla-se que outros intervalos de tempo podem ser usados.
[0053] Essas quantidades sugeridas de um composto estão sujeitas a vários critérios terapêuticos. O fator essencial na escolha de uma dose e um programa apropriados é o resultado clínico obtido. Fatores a serem considerados neste contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente particular, a causa do distúrbio, o local de distribuição do composto, o método de administração, o programa de administração, e outros fatores conhecidos pelos profissionais da área médica.
[0054] Os agentes terapêuticos da invenção podem ser congelados ou liofilizados para armazenamento e reconstituídos em um veículo estéril adequado antes do uso. Liofilização e reconstituição podem levar a graus variáveis de perda de atividade do composto. Pode ser preciso ajustar as dosagens para compensar. Geralmente, o pH da preparação entre 4 e 8 é preferido.
[0055] Um composto da invenção pode ser administrado isolado ou em combinação com outros agentes, por exemplo, agentes antirreabsorção óssea, que incluem calcitonina, bifosfonatos, SERMs (por exemplo raloxifeno), terapia de reposição hormonal (HRT), cálcio, Vitamina D1, Vitamina D2, Vitamina D3, Vitamina D4 e estrogênio. Um composto da invenção pode ser co-administrado com um outro agente. Alternativamente um composto da invenção pode ser administrado sequencialmente com um outro agente; por exemplo um composto da invenção é administrado isolado por um período de uma semana a um
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20/37 ano seguido da administração de um outro agente, seja junto com o referido composto ou na ausência do referido composto.
Artigos manufaturados [0056] Em uma outra modalidade da invenção, é fornecido um artigo manufaturado contendo materiais úteis para o tratamento ou a prevenção das doenças ou condições descritas acima. O artigo manufaturado compreende um recipiente e um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, canetas (pens), inaladores, emplastros e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados de diversos materiais tais como vidro, metal ou plástico. O recipiente contém uma composição da invenção que é eficaz para prevenção ou o tratamento das doenças ou condições e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O agente ativo no recipiente é uma composição da invenção. O rótulo no recipiente, ou associado ao mesmo, indica que a composição é usado para tratamento da condição desejada. O artigo manufaturado pode compreender ainda um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer, e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial ou do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e bulas com instruções de uso.
[0057] Os exemplos a seguir são oferecidos a título ilustrativo apenas, e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de forma alguma.
Exemplo 1: Síntese de peptídios [0058] A síntese de peptídios é realizada em uma resina de Rapp AM RAM Fmoc-amida poliestireno (Rapp Polymere Tubingen, Alema
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21/37 nha) (substituição de 0,6 a 0,7 mmol/g). A síntese é realizada usando a estratégia do grupo protetor de cadeia principal Fmoc. Além disso, quaisquer cadeias laterais de aminoácidos que sejam aromáticas, ácidas, básicas ou altamente polares são provavelmente reativas. Estas também devem ser protegidas para prevenir a formação de cadeias ramificadas indesejadas. Existem quatro grupo principais usados desta maneira: tBoc (um butiloxicarbonil terciário) para Lys e Trp; Pbf (um grupo 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonil) para Arg; tBu (um grupo butil terciário) para Ser, Asp, e Glu; Trt (um grupo trifenilmetil) para Gln, His, e Asn). Os derivados de cadeia lateral de aminoácidos usados são: Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OtBu), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Ser(OtBu), Trp(Boc). O acoplamento é realizado com aproximadamente 10 equivalentes de aminoácido ativado com diisopropilcarbodiimida (DIC) e hidroxibenzotriazol (HOBt) (proporção molar de 1:1:1) em dimetilformamida (DMF). O grupo protetor Fmoc do aminoácido na posição 1 é deixado em que está para permitir a conjugação seletiva de uma cadeia lateral de lisina (vide exemplo 2 abaixo).
[0059] Concomitante clivagem da resina e remoção do grupo protetor de cadeia lateral é realizada em uma solução contendo ácido trifluoracético: triisopropilsilano: metanol: anisol 90:5:2,5:2,5 por 1,5 a duas horas à temperatura ambiente. A clivagem do peptídio da resina de amida de Rink gera a forma carboxamida C-terminal do peptídio. Os peptídios são precipitados com éter dietílico, redissolvidos em 3040 mL de acetonitrila a 10% e purificados em uma coluna de HPLC de fase reversa C18 a uma taxa de fluxo de 12-15 mL/min com um gradiente AB linear onde A = 0,05% TFA/água e B = 0,05% TFA/acetonitrila. A coluna usada é ou uma Waters SymmetryPrep 7 um, 19 x 300 mm ou uma Kromasil 10 um, 22 x 250 mm. A pureza dos peptídios e o peso molecular é confirmado em um sistema LC-MS Sé
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22/37 rie 1100 Agilent com um único detector de MS quadrupolar. A separação de HPLC analítica é feita em uma coluna Zorbax Eclipse XDB-C8, 5 microns, 4.6 mm i.d. x 15 cm com um gradiente AB linear de 10 a 100% B durante 15 minutos em que A = 0,05% de TFA/H2O e B = 0,05% de TFA em CH3CN:H2O 60:40 e a taxa de fluxo é 1 ml/min. Todos os peptídios são purificados até > 95% de pureza e foi confirmado que têm peso molecular correspondente ao valor calculado dentro de 1 amu.
Exemplo 2: Conjugação de peptídios [0060] Um peptídio não conjugado com um grupo Fmoc N-terminal no lugar é dissolvido em 1 mL de água/acetonitrila 50/50 (36,8 mg, 4272,9 g/mol, 0,0086 mmol). Um excesso molar de 1,5 a 2 vezes de mPEG-2kDa NHS éster (NOF Sunbright ME-020AS) é pesado (39,7 mg, PM médio 2280, 0,017 mmol). A solução de peptídio é diluída com 2 mL de tampão borato de sódio 40 mM, pH 9,8 e 2 mL de acetonitrila e em seguida adicionada à solução de mPEG. A mistura resultante é turbilhonada e em seguida agitada à temperatura ambiente. A mistura reacional é monitorada por HPLC analítica de fase reversa (método conforme descrito no Exemplo 1), e tipicamente depois de um tempo de reação de 20 a 30 minutos, mostra desaparecimento completo do pico de peptídio (em cerca de 14,5 minutos) e o surgimento de um pico devido ao conjugado peptídio-PEG (em cerca de 15,7 minutos). A mistura é resfriada em gelo seco, e 2 mL de piperidina são adicionados para remover o grupo Fmoc N-terminal. A mistura é agitada à temperatura ambiente por 30 minutos, e em seguida resfriada em gelo seco e neutralizada com 2 mL de ácido acético glacial (pH final = aproximadamente 6-7). Por HPLC analítica deve haver agora um pico a cerca de 13,2 minutos devido ao aduto de piperidina -fluoreno e um pico a cerca de 14,25 minutos devido ao conjugado peptídio-mPEG desprotegido. A mistura é diluída até cerca de 40 ml com água e purifiPetição 870180000782, de 04/01/2018, pág. 26/51
23/37 cada em uma coluna Waters SymmetryPrep 7 mm, 19 x 300 mm ou em uma coluna Kromasil 10 mm, 22 x 250 mm a 12 mL/min com um gradiente AB linear de 2 estágios de 0 a 30% de B durante 20 minutos seguido de 30 a 80% de B durante 100 minutos em que A = 0,05% de
TFA/água e B = 0,05% de TFA/ acetonitrila.
[0061] As frações combinadas contendo o produto são liofilizadas para obter a forma de sal de trifluoracetato do peptídio. O produto pode ser subsequentemente convertido em uma outra forma de sal desejada por procedimentos conhecidos na literatura. O peptídio purificado é quantificado por absorvência de UV a 280 nm usando um coeficiente de extinção molar calculado baseado na sequência do peptídio. O peso molecular médio do conjugado é (PM médio de PEG-NHS MW + PM de Fmoc-Peptídio- PM de Fmoc- PM de NHS) = 2280 + 4273 115 - 222 = 6216. Para o exemplo no qual são usados 36,8 mg de um peptídio não conjugado, é possível obter 34,8 mg do peptídio peguilado. A conjugação de outros peptídios descritos nesta invenção, em que é usado mPEG-NHS éster, é realizada essencialmente da maneira descrita acima.
[0062] Todos os dados nos Exemplos abaixo usam compostos da invenção são amida peptídios C-terminais que são conjugados com mPEG no resíduo Lys da posição 26 do esqueleto de peptídio da invenção e são sais de trifluoracetato (vide, por exemplo, SEQ ID N°s: 1-
5).
Exemplo 3: Ensaio in vitro de indução de cAMP [0063] Células de osteossarcoma SaOS-2 são ressuspensas a 5 x 105 células/mL em tampão de estimulação [1 M HEPES/10% BSA/250 mM IBMX (3-isobutil-1-metilxantina, MP Biomedicals)/HBSS]. São adicionados 20 mL/compartimento da suspensão de células por compartimento de uma placa de ensaio de 96 compartimentos, com metade da área preta, (Costar) para produzir 1 x 104 células/compartimento.
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Em seguida 20 mL de composto de teste diluído (por exemplo, análogo de PTH da invenção, n = 2) são imediatamente adicionados às células. Os compostos de teste são preparados como diluições 1Z> log e analisados por uma faixa de titulação de 3 mM a 0,1 nM. As placas são incubadas por uma hora à temperatura ambiente. Uma placa de ensaio de 96 compartimentos separada também é preparada contendo cAMP como curva padrão. O padrão de cAMP é preparado como diluições ½ log em tampão de estimulação por uma faixa de titulação de 400 a 0,0012 pmols/compartimento (40 mL/compartimento) (n = 6). Depois da etapa de incubação de uma hora, o cAMP é analisado usando o kit HTRF® (fluorescência homogênea resolvida no tempo) cAMP dynamic 2 (Cisbio) conforme instruções do fabricante.
[0064] Quando os compostos a seguir são testados essencialmente da maneira descrita acima, verifica-se que eles induzem a produção de cAMP como mostrado na tabela abaixo. Esses dados demonstram que esses compostos possuem uma capacidade potente para ativar o receptor de PTH (PTHR1) de maneira não diferente de PTH.
Tabela 1
Compostos EC50 médio (nM) (n=2)
SEQ ID N° 1 com mPEG de 2kD 7,7
SEQ ID N° 2 com mPEG de 2kD 2,1
SEQ ID N° 4 com mPEG de 2kD 6,9
SEQ ID N° 5 com mPEG de 2kD 2,6
Exemplo 4: Avaliação in vivo de compostos conjugados
A. Ratas ovariectomizadas osteopênicas adultas jovens [0065] Ratas Sprague-Dawley com cerca de 3 meses de idade são ovariectomizadas, exceto para controles simulados, e mantidas em um ciclo de luz/escuridão de 12 horas a 22°C com acesso ad lib à comida (TD 89222 com 0,5% de Ca e 0,4% de P, Teklad, Madison, WI) e água. Deixa-se as ratas ovariectomizadas (Ovx) perderem osso duranPetição 870180000782, de 04/01/2018, pág. 28/51
25/37 te 25 dias, e em seguida elas foram pesadas e distribuídas aleatoriamente em grupos de tratamento. O tratamento é feito por injeção subcutânea de um composto da invenção em várias doses (como indicado na Tabela 2 abaixo) por 1 mês em um veículo de NaH2PO4 20 mM em 0,9% de NaCl, 3 mg/ml de manitol, pH 5. As ratas são injetadas com os compostos a cada três ou quatro dias para se assemelhar com uma administração semanal a um ser humano. Os controles simulados e Ovx são tratados somente com o veículo (controle simulado com veículo e controle ovx com veículo). Os soros são coletados por punção cardíaca aproximadamente 24 horas depois da injeção final sob anestesia com isoflurano na necrópsia (aproximadamente 24 horas depois da injeção final), e analisados usando um analisador de química clínica (Hitachi 917, Tóquio, Japão).
[0066] Na necrópsia, os fêmures esquerdos são retirados, o tecido mole é removido e os fêmures são guardados em 50% de etanol/solução salina a 4°C. À temperatura ambiente, os fêmures em 50% de EtOH/solução salina são embalados em Parafilme e centralizados em relação ao pórtico para tomografia computadorizada quantitativa (QCT) (Research M, Stratec). Uma imagem de exploração coronal (coronal scout scan) da metáfise do fêmur distal é gerada em 2D antes da análise 3D. Os parâmetros de QCT são medidos, inclusive a densidade mineral óssea (BMD, mg/ml de hidroxil apatita) o teor mineral ósseo (BMC, mg hidroxil apatita), e a área transversal (mm2) como já explicado em detalhes (Sato, et al., JPET , 272:1252-1259, 1995).
[0067] Hipercalcemia é definida neste relatório como o valor de cálcio sérico de percentil superior 97,5 de controles com veículo ovariectomizados normais para o tipo de animal usado, usando dados de química clínica e soros coletados por punção cardíaca (International
Federation of Clinical Chemistry, HE Solberg in Tietz Fundamentals of
Clinical Chemistry, 5th edition, Burtis CA & Ashwood ER, editors, 2001,
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26/37 páginas. 251-261). O valor que reflete o percentil 97,5 é 11,2 mg de cálcio por dL de soro de controle com veículo ovx. A Dose Hipercâlcemica, isto é, a dose à qual a hipercalcemia é observada 24 horas após a injeção do composto de teste usando dados de química clínica e soros coletados por punção cardíaca, é determinada por interpolação, usando análise de regressão para ajustar a resposta à dose calcêmica observada 24 horas depois de administrado o composto às ratas ovariectomizadas.
[0068] A ovariectomia reduz significativamente a BMD em ratos em relação aos controles simulados com veículo durante um período de 7,5 semanas (3,5 semanas de fase de pré-tratamento mais 4 semanas de fase de tratamento) (Sato et al. J.Med. Chem. 42:1-24, 1999). Os compostos peguilados da invenção são capazes de restaurar a BMD para os níveis dos controles simulados com veículo no final de 4 semanas de fase de tratamento. Para os compostos peguilados preferidos da invenção, testados dentro dos parâmetros deste ensaio, a dose requerida para restaurar a BMD para níveis dos controles simulados com veículo (Dose BMD) não é maior que a dose hipercalcêmica. Quando testados essencialmente da maneira descrita acima, os compostos listados na Tabela 2 abaixo são capazes de restaurar a BMD das ratas Ovx para o nível dos controles simulados com veículo depois de quatro semanas de tratamento com uma certa dosagem; mas, é necessária uma dose semelhante ou mais alta do composto para induzir a dose hipercalcêmica. Os fatores que afetam a dose hipercalcêmica/dose BMD incluem, porém sem limitação, a sequência de aminoácidos do esqueleto peptídico e a posição do aminoácido ao qual o PEG está preso. Os compostos preferidos da invenção testados dentro dos parâmetros deste ensaio apresentam uma proporção dose hipercalcêmica/dose BMD maior ou igual a cerca de 1,0 como mostrado na Tabela 2 abaixo.
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Tabela 2
Composto Dose BMD * (nmol/kg) (Mg/kg) Dose . + mica (Mg/kg) hipercalcê- (nmol/kg) Dose hipercalcêmica/ Dose BMD
SEQ ID N° 1 com mPEG de 5kD 3,7 34, 3 >32,5 >300 >8,8
SEQ ID N° 2 com mPEG de 5kD 6,7 59, 8 >34 >300 >5,1
SEQ ID N° 4 com mPEG de 5kD 31,8 297,9 >32 >300 >1,00
SEQ ID N° 5 com mPEG de 5kD 4,4 41, 0 >32,2 >300 >7,3
* dose para restaurar a BMD para o nível do controle simulado dentro dos parâmetros do ensaio (ajustado a uma linha de regressão e determinada por interpolação) + dose à qual hipercalcemia é observada 24 horas depois da administração do composto de teste dentro dos parâmetros do ensaio (ajustado a uma linha de regressão e determinada por interpolação) ** > indica que a dose mencionada foi a dose mais alta testada e que hipercalcemia, conforme definida nesta invenção, não foi atingida àquela dose.
B. Ratas Ovariectomizadas Osteopênicas Envelhecidas [0069] Neste exemplo, a capacidade dos compostos peguilados da invenção para aumentar a resistência óssea biomecânica, a BMD e a BMC das ratas Ovx para os níveis dos controles simulados com veículo é determinada. Espera-se que o efeito de um composto na resistência óssea biomecânica seja um indicativo da eficácia clínica melhor que a BMD. A BMD vertebral indica marginalmente a eficácia clínica das terapias contra osteoporose para reduzir a incidência de fraturas vertebrais (Cummings, et al. Am. Journal of Medicine, 112:281-289, 2002; Sarkar et al. J. Bone & Mineral Research 17:1-20, 2002). Como o PTH(1-34) reduz o risco de fraturas vertebrais e não-vertebrais (Neer et al. NEJM, 344:1434-1441, 2001), a eficácia dos compostos da invenção é analisada para demonstrar se eles aumentar a resistência óssea biomecânica na vértebra lombar e em dois locais não-vertebrais, isto é, o eixo médio femoral e o colo do fêmur.
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28/37 [0070] Ratas Sprague-Dawley com cerca de 6 meses de idade são ovariectomizadas, exceto para controles simulados, e mantidas em um ciclo de luz/escuridão de 12 horas a 22°C com acesso ad lib à comida (TD 89222 com 0,5% de Ca e 0,4% de P, Teklad, Madison, WI) e água. Deixa-se as ratas ovariectomizadas (Ovx) perderem osso durante um mês antes do tratamento com compostos da invenção por mais dois meses. O composto a ser testado é administrado por injeção subcutânea em várias doses (como indicado na Tabela 3 abaixo) em um veículo de NaH2PO4 20 mM em 0,9% de NaCl, 3 mg/ml de manitol, pH 5, a cada 6 ou 7 dias durante dois meses. Os controles simulados e Ovx são tratados somente com o veículo (controle simulado com veículo e controle ovx com veículo). Os soros são coletados por punção cardíaca sob anestesia com isoflurano na necrópsia, e analisados usando um analisador de química clínica. A vértebra lombar L4-6 e os fêmures esquerdos são retirados, o tecido mole é removido e os fêmures são guardados em são guardados em 50% de etanol/solução salina a 4°C. À temperatura ambiente, L-5 em 50% de EtOH/solução salina são embalados em Parafilme e centralizados em relação ao pórtico de QCT (Research M, Stratec). Uma imagem de exploração coronal (coronal scout scan) da vértebra L-5 é primeiro gerada em 2D antes da análise 3D. Os parâmetros de QCT são medidos incluindo a BMD (mg/cc), o BMC (mg) e a área transversal (mm2). A vértebra lombar L-5, o eixo médio femoral, e o eixo proximal são então preparados para exame biomecânico. A resistência mecânica (N) é avaliada colocando-se carga nos espécimes até a fadiga como já descrito (Sato, et al., Endocrinology, 10:4330-4337, 1997).
[0071] Os compostos peguilados da invenção são avaliados neste ensaio em relação a um controle positivo de 3-5 pg/kg/d PTH(1-38).
Foi verificado que o PTH(1-34) e o PTH(1-38) são indistinguíveis em termos de eficácia esquelética ou efeitos calcêmicos nas ratas ovariecPetição 870180000782, de 04/01/2018, pág. 32/51
29/37 tomizadas osteopênicas. Já foi demonstrado que ratos que receberam 5 μg/kg/d (1 nmol/kg/d) de PTH(1-34) têm uma exposição sistêmica que é cerca de vezes aquela do PTH(1-34) (isto é, FORTEO®) em seres humanos (Tashjian & Chabner, J. Bone Miner Res, 17:1151-1161, 2002; Tashjian & Gagel, J. Bone Miner Res, 21:354-365, 2006). Também já foi demonstrado que o PTH(1-34) 5 μg/kg/d restaura a BMD vertebral de Ovx para os níveis dos controles simulados com veículo no modelo de rata ovariectomizada osteopênica envelhecida (Kishi et al. Bone 22:515-522, 1998; Kimmel et al. Endocrinology 132:15771584, 1993). Isto é confirmado para PTH(1-38) neste modelo com uma dosagem de 3-5 μg/kg/d.
[0072] A ovariectomia reduz significativamente a BMD, a BMC e a resistência óssea em relação aos controles simulados com veículo por um período de três meses em ratas envelhecidas. Os compostos na Tabela 3 abaixo, quando testados essencialmente da maneira descrita acima, restauram a BMC das ratas Ovx para os níveis dos controles simulados com veículo quando tratadas por oito semanas com a dose listada na Tabela 3. Além disso, os compostos listados na Tabela 3, quando testados essencialmente da maneira descrita acima, restauram a resistência óssea biomecânica das ratas Ovx para o nível dos controles simulados com veículo em um, dois ou três dos locais testados vértebra, eixo médio e colo do fêmur.
[0073] Para certos compostos preferidos da invenção, testados dentro dos parâmetros deste ensaio, hipercalcemia não é observada até a dose máxima testada de aproximadamente 110 nmol/kg. Os compostos preferidos da invenção, testados dentro dos parâmetros deste ensaio, são capazes de restaurar a BMD e BMC para os níveis dos controles simulados com veículo enquanto também apresentam uma proporção dose hipercalcêmica/dose BMD maior ou igual a cerca de 1,0, 2,0, 3,0 ou 4,0, ou ainda mais preferivelmente, maior que cerca
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30/37 de 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 ou mais. Os compostos preferidos da invenção, testados dentro dos parâmetros deste ensaio, são capazes de restaurar a BMD e BMC para os níveis dos controles simulados com veículo enquanto também restauram a resistência óssea biomecânica em um, dois ou três dos locais testados vértebra, eixo médio e colo do fêmur para os níveis dos controles simulados com veículo. Ainda mais preferivelmente, os compostos da invenção, testados dentro dos parâmetros deste ensaio, são capazes de restaurar a BMC e a resistência óssea biomecânica em um, dois ou três dos locais testados vértebra, eixo médio e colo do fêmur para os níveis dos controles simulados com veículo enquanto também apresentam uma proporção dose hipercalcêmica/dose BMD maior ou igual a cerca de 1,0, 2,0, 3,0 ou 4,0, ou ainda mais preferivelmente, maior ou igual a cerca de 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 ou mais.
[0074] O composto com a SEQ ID N° 4 com mPEG de 2 kD (peso molecular médio) atinge a resistência de nível do controle simulado com veículo a uma dose de 11 nmols/kg para os locais vértebra, eixo médio e colo do fêmur, na ausência de hipercalcemia à dose mais alta testada. Portanto, este composto com apresenta uma proporção dose hipercalcêmica/dose de resistência biomecânica de >10 para todos os três locais. Da mesma forma, a SEQ ID N° 1 com mPE G de 2kD restaura a resistência da vértebra e do colo do fêmur para os níveis dos controles simulados com veículo a uma dose de 11 nmol/kg, na ausência de hipercalcemia à dose mais alta testada, e portanto apresenta uma proporção dose hipercalcêmica/dose de resistência biomecânica de >10 para estes dois locais. Estes dados indicam que a sequência do esqueleto peptídico de um composto da invenção assim como o tamanho do mPEG conjugado ao esqueleto peptídico do composto contribui para a eficácia esquelética (refletida pelas medidas de BMD, BMC e resistência) do composto.
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Tabela 3
Dose de Dose de BMD Dose de BMC Dose de resistên- Dose de resistên- Dose de resistência
Composto hipercal- vertebral vertebral cia ver- cia do do colo do
. + cemia + ++ tebral ** eixo mé- fêmur
(nmol/kg) (nmol/kg) (nmol/kg ) (nmol/kg) dio Λ (nmol/kg) (nmol/kg)
SEQ ID N° 1 com mPEG de 5kD >107 >108 32 108 108 11
SEQ ID N° 2 com mPEG de 5kD >112 112 34 32 108 32
SEQ ID N° 4 com mPEG de 5kD >110 >107 32 107 32 32
SEQ ID N° 5 com mPEG de 5kD >110 11 11 107 32 107
SEQ ID N° 1 com 2kD mPEG >110 110 32 11 32 11
SEQ ID N° 2 com mPEG de 2kD >117 34 34 >117 117 34
SEQ ID N° 4 com mPEG de 2kD >110 11 11 11 11 11
SEQ ID N° 3 com mPEG de 2kD 97 >110 11 >110 11 11
+ Dose à qual hipercalcemia é observada nos soros 24 horas depois da administração do composto de teste dentro dos parâmetros do ensaio (ajustado a uma linha de regressão e determinada por interpolação). > indica que a dose mencionada é a dose mais alta testada e que hipercalcemia, conforme definida nesta invenção, não é atingida àquela dose.
++ Dose à qual o nível simulado da densidade mineral óssea vertebral (BMD) é atingido dentro dos parâmetros do ensaio * Dose à qual o nível simulado do teor mineral ósseo vertebral (BMC) é atingido dentro dos parâmetros do ensaio ** Dose à qual resistência vertebral equiparável ao controle simulado e ao controle positivo (3-5 pg/kg/d PTH(1-38)) é atingida
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32/37 (dentro dos controles do ensaio) Λ Dose à qual resistência do eixo médio equiparável ao controle simulado e ao controle positivo de 3-5 μg/kg/d de PTH (1-38) é atingido λλ Dose à qual resistência do colo do fêmur equiparável ao controle simulado e ao controle positivo de 3-5 μg/kg/d de PTH (1-34) é atingido.
[0075] A Tabela 4 abaixo apresenta proporções de interesse que são derivados dos valores na Tabela 3. Os compostos preferidos da invenção têm uma proporção de dose hipercalcêmica/dose de BMD vertebral atingida dentro dos parâmetros do ensaio de cerca de 1,0 ou mais, mais preferivelmente maior ou igual a 3, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Os compostos preferidos da invenção têm uma proporção de dose hipercalcêmica/dose de BMC vertebral atingida dentro dos parâmetros do ensaio de cerca de 3,0 ou mais, mais preferivelmente maior que 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Os compostos preferidos da invenção têm uma proporção de dose hipercalcêmica/dose de resistência vertebral atingida dentro dos parâmetros do ensaio de cerca de 1,0 ou mais, mais preferivelmente 3, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais. Os compostos preferidos da invenção têm uma proporção de dose hipercalcêmica/dose de resistência do eixo médio atingida dentro dos parâmetros do ensaio de cerca de 1,0 ou mais, mais preferivelmente maior que 3, 5, 6, 7, 8, 9 ou
10. Os compostos preferidos da invenção têm uma proporção de dose hipercalcêmica/dose de resistência do colo do fêmur, atingida dentro dos parâmetros do ensaio, de cerca de 3,0 ou mais, mais preferivelmente cerca de 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais.
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Tabela 4
Composto Dose hipercalcêmica/dose de BMD vertebral Dose hipercalcêmica/dose de BMC vertebral Dose hipercalcêmica/dose de resistência vertebral Dose hipercalcêmica/dose de resistência do eixo médio Dose hipercalcêmica/dose de resistência do colo do fêmur
SEQ ID N° 1 com mPEG de 5kD >1,0 >3,34 >1,0 >1,0 >9,7
SEQ ID N° 2 com mPEG de 5kD >1,0 >3,14 >3,34 >1,0 >3,34
SEQ ID N° 4 com mPEG de 5kD >1,02 >3,43 >1,02 >3,43 >3,43
SEQ ID N° 5 com mPEG de 5kD >10,0 >10,0 >1,02 >3,43 >10,0
SEQ ID N° 1 com 2kD mPEG >1,0 >3,43 >10,0 >3,43 >10,0
SEQ ID N° 2 com mPEG de 2kD >3,4 >3,4 1 >1 >3,4
SEQ ID N° 4 com mPEG de 2kD >10,0 >10,0 >10,0 >10,0 >10,0
SEQ ID N° 3 com mPEG de 2kD <0,9 8,8 <0,9 8,8 8,8
Exemplo 5 [0076] Um composto da invenção com SEQ ID N° 1, em que o mPEG ao qual ele é conjugado é um mPEG de 2kD, é diretamente comparado a um composto da invenção com SEQ ID N° 1, em que o mPEG ao qual ele é conjugado é um mPEG de 5kD. Deixam-se ratas ovariectomizadas osteopênicas envelhecidas perderem osso por um mês antes de serem medicadas (nmol/kg como na Tabela 5 e 6) a cada 6 dias com veículo apenas, ou com o composto peguilado de 2 kD de SEQ ID N°1 ou com o composto peguilado de 5kD d e SEQ ID N°1 por 8 semanas. A Tabela 5 mostra os valores médios de cálcio sérico (mg/dL) 24 horas depois da medicação. A Tabela 6 mostra a BMD
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34/37 média (mg/cc).
[0077] Os animais medicados com qualquer um dos compostos apresentam níveis normais de cálcio sérico 24 horas depois da medicação. No entanto, o composto com o mPEG de 2kD apresenta um efeito menor no cálcio sérico embora apresente eficácia esquelética na BMD em doses baixas, intermediárias e altas maior que o composto com o mPEG de 5kD. Estes dados demonstram que o composto peguilado de 2 kD é semelhante ao composto peguilado de 5 kD na eficácia esquelética embora tenha efeitos menores no cálcio sérico.
Tabela 5 Cálcio sérico (mg/dL)
Dose (nmol/kg) Simulado Ovx PEG 2kD PEG 5kD
0 10,69 10,68
11 10,45 10,86
32 10,38 10,79
108 11,03
110 10,25
Tabela 6 BMD Vertebral (mg/cc)
Dose (nmol/kg) Simulado Ovx PEG 2kD PEG 5kD
10,3 625 544
11 590 567
32 603 589
108 612
110 623
Exemplo 6: PTH(1-34) em ratas ovariectomizadas osteopênicas envelhecidas [0078] Ratas Sprague-Dawley ovariectomizadas com seis meses de idade são mantidas em um ciclo de luz/escuridão de 12 horas a 22°C com acesso ad lib à comida (TD 89222 com 0,5% Ca e 0,4%P, Teklad, Madison, WI) e água. Deixam-se as ratas ovariectomizadas
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35/37 perderem osso durante 1 mês, antes do tratamento com rhPTH (1-34) pelos 3 meses seguintes. As ratas ovariectomizadas osteopênicas envelhecidas são injetadas por via subcutânea, semanalmente, com 0, 10 ou 30 pg/kg de PTH(1-34) humano por 12 semanas. Os controles simulados e ovx são injetados apenas com o veículo. As vértebras lombares são excisadas na necrópsia e analisadas por micro-CT (Stratec), e em seguida preparadas para exame biomecânico. A resistência em Newtons, (N), é avaliada colocando-se carga nos espécimes de vértebra até a fadiga. A significância em relação aos controles ovx com veículo está indicada por * na Tabela 7 abaixo (Fishers PLSD, P<0,05). Os dados do modelo estão apresentados na Tabela 7 abaixo.
[0079] Em relação aos controles ovx com veículo, o PTH(1-34) até 30 ug/kg (7 nmol/kg) não apresenta efeito significativo na BMD vertebral ou na resistência vertebral biomecânica nas ratas ovariectomizadas osteopênicas depois de 12 semanas de tratamento. O cálcio sérico é normal quando medido aproximadamente 24 horas depois da última dose. Em comparação com os dados mostrados acima, os compostos da invenção têm BMD vertebral e resistência vertebral biomecânica superiores em relação ao PTH (1-34) semanal.
Tabela 7: Eficácia esquelética da aplicação semanal de PTH(1-34)
BMD VERTEBRAL:
Grupo Dose (pg/kg) BMD média mg/mL
Simulado 0 605*
Ovx 0 512
PTH(1-34) 10 534
PTH(1-34) 30 529
RESISTÊNCIA VERTEBRAL:
Grupo Dose (ug/kg) Carga média para fadiga (N)
Simulado 0 277*
Ovx 0 210
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PTH(1-34) 10 222
PTH(1-34) 30 243
Exemplo 7 - Internalização de receptores de PTH [0080] A cinética de internalização de PTHR1 (Receptor 1 de PTH) para os compostos da invenção é determinada subsequente à ligação de ligando a receptores membranosos. Células HEK 293 são transfectadas com o plasmídio PTHR-emGFP (Invitrogen).
[0081] As células são semeadas a 7.000 células/compartimento, 100 pL/compartimento em uma placa de 96 compartimentos, preta, com fundo transparente revestida com poli-D lisina. 24 horas depois de serem semeadas na placa de 96 compartimentos, as células recebem 10 pL de um composto a ser testado, a concentrações finais de 100nM a intervalos de tempo a partir de 0 minuto até 3 horas. O meio é aspirado ao final de cada aplicação. As células são fixadas com 100 pL de Prefer (Anatech, Battle Creek, MI) por 30 minutos. O Prefer é aspirado das células, e as células são lavadas três vezes com 100 pL de 1XPBS. As células são coloridas com 100 pL de corante nuclear de Hoechst diluído (diluído em 1XPBS) por 30 minutos. O corante de Hoechst é aspirado e substituído por 1XPBS. As placas são guardadas no escuro a 4°C até serem examinadas. As células são examinadas em 48 horas usando um Cellomics® ArrayScan. Dados representativos de vários intervalos de tempo, apresentados como percentagem de controle somente com veículo (linha basal = 100%), estão apresentados na Tabela 8.
Tabela 8
Composto* 20 min 40 min 60 min 180 min
PTH(1-38) 166 177 224 175
SEQ ID N°4 porém não-peguilada e lisina no aminoácido 26 136 132 136 151
SEQ ID N°4 com mPEG de 2kD 154 167 186 163
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Composto* 20 min 40 min 60 min 180 min
SEQ ID N°4 com mPEG de 5kD 106 96 98 107
SEQ ID N°2 porém não-peguilada e lisina no aminoácido 26 126 114 139 139
SEQ ID N°2 com mPEG de 2kD 148 102 107 96
SEQ ID N°2 com mPEG de 5kD 128 95 108 102
SEQ ID N°1 porém não-peguilada e lisina no aminoácido 26 106 126 113 142
SEQ ID N°1 com mPEG de 2kD 160 120 104 102
SEQ ID N°1 com mPEG de 5kD 127 93 91 92
[0082] Esses dados mostram que os compostos da invenção têm uma cinética de internalização acentuadamente diferente daquela do PTH(1-38), dependendo da sequência do esqueleto peptídico, seja ela peguilada ou não, e do tamanho do PEG. Observe que as moléculas não-peguiladas têm o esqueleto da sequência mencionada com a diferença de que há um resíduo lisina na posição 26. A cinética de internalização mais lenta indica uma taxa reduzida de internalização do receptor de PTHR1 quando são formados complexos ligando-receptor de PTHR1 usando os compostos da invenção, resultando em uma maior amplitude de sinalização na célula depois da ligação do ligando. Esta é possivelmente parte da explicação para a eficácia esquelética melhorada observada para as formas dos compostos da invenção com PEG de 2 kD com aplicação semanal em relação àquela observada com aplicação semanal de PTH.
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1/4

Claims (17)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a sequência de:
    Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa8 His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Xaa18 Glu Arg mPEG
    Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe - NH2 (SEQ ID N° 6);
    sendo que
    Xaa8 e Xaa18 são Met ou Xaa8 e Xaa18 são Nle, e mPEG é monometóxi-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons;
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
  2. 2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a sequência de aminoácidos:
    Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu Arg
    Val Glu Trp Leu Arg
    O mPEG
    H
    Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe - NH2 (SEQ ID N°: 1).
  3. 3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que apresenta a sequência de aminoácidos:
    Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg
    Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe -NH2 (SEQ ID N°4).
    mPEG
    Petição 870180000782, de 04/01/2018, pág. 42/51
    2/4
  4. 4. Composto, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em:
    (a) Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg
    O mPEG
    Leu Leu Gln Glu Val -NH2 (SEQ ID N° 2);
    (b) Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu Arg
    O mPEG
    Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe - NH2 (SEQ ID N° 3); e (c) Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg
    O mPEG
    Leu Leu Gln Glu Val His Gln Phe -NH2 (SEQ ID N° 5);
    sendo que mPEG é monometóxi-polietileno glicol com um peso molecular médio de 1500 a 5500 Dáltons;
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
  5. 5. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que mPEG apresenta um peso molecular médio de 2000 a 5000 Dáltons.
  6. 6. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que mPEG apresenta um peso molecular médio de 2000 Dáltons.
  7. 7. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a
    Petição 870180000782, de 04/01/2018, pág. 43/51
    3/4
    4, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em combinação com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
  8. 8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que mPEG apresenta um peso molecular médio de 2000 a 5000 Dáltons.
  9. 9. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que mPEG apresenta um peso molecular médio de 2000 Dáltons.
  10. 10. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para produção de um medicamento para tratar uma doença ou condição que pode ser melhorada ou prevenida pela indução de formação óssea.
  11. 11. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para produção de um medicamento para o tratamento de condições selecionadas dentre osteoporose, osteopenia, fratura óssea, fusão espinhal, implantes ósseos, implantes articulares, implantes dentários ou doenças periodontais.
  12. 12. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para produção de um medicamento para tratamento de osteoporose ou osteopenia em um mamífero.
  13. 13. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para produção de um medicamento para prevenção de osteoporose ou osteopenia em um mamífero.
  14. 14. Uso de um composto, como definido em qualquer uma
    Petição 870180000782, de 04/01/2018, pág. 44/51
    4/4 das reivindicações 1 a 4, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para produção de um medicamento para uso no tratamento de uma fratura óssea em um mamífero.
  15. 15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que mPEG apresenta um peso molecular médio de 2000 a 5000 Dáltons.
  16. 16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que mPEG apresenta um peso molecular médio de 2000 Dáltons.
  17. 17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.
    Petição 870180000782, de 04/01/2018, pág. 45/51
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