ES2343917T3 - Pth pegilados como moduladores del receptor pth y uso de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto con la secuencia de: **(Ver fórmula)** en la que Xaa8 y Xaa18 son Met o Xaa8 y Xaa18 son Nle; y en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.
Description
PTH pegilados como moduladores del receptor PTH
y uso de los mismos.
La presente invención se refiere a compuestos
moduladores del receptor de la hormona paratiroide (PTHR) y a
procedimientos para la obtención y uso de los mismos.
Las enfermedades degenerativas óseas tales como
la osteoporosis se producen en una parte substancial de la
población adulta mayor. La osteoporosis abarca un grupo heterogéneo
de trastornos que representan un riesgo principal de fracturas
óseas, y una carga substancial sobre el sistema del cuidado de la
salud. Miles de millones de dólares se gastan anualmente en el
cuidado médico para el tratamiento de la osteoporosis. Clínicamente,
la osteoporosis se caracteriza por una masa ósea disminuida,
densidad mineral ósea (BDM) y contenido mineral óseo (BMC)
disminuidos, y pérdida de la estructura ósea como resultado de la
resistencia ósea disminuida y riesgo incrementado de
fractura
ósea.
ósea.
Aunque un cierto número de agente antiresorción
que incluyen la calcitonina, bisfosfonatos, estrógeno y SERMs
previenen una adicional pérdida ósea, estos no vuelven a formar masa
ósea una vez que esta se ha perdido. El primer agente de
construcción ósea anabólico aprobado por la FDA para el tratamiento
de la osteoporosis es la PTH(1-34) humano,
también conocida como teripadatida, la cual se comercializa bajo el
nombre de la serie FORTEO® (Eli Lilly and Company, Indianapolis,
IN). La PTH o PTH(1-34) se piensa que ejerce
sus efectos a través de la activación mediada por receptor de dos
vías de señalamiento intracelular a través de (1) adenilato ciclasa
y proteína quinasa A, y (2) fosfolipasa C y proteína quinasa C. El
PTH(1-34) forma masa ósea, restaura la
estructura ósea, y reduce el riesgo de fracturas óseas vertebral y
no vertebral en pacientes osteoporóticos que están en alto riesgo
de fractura. (R. Neer, NEJM, vol. 344, pág. 1434, (2001)).
Como un producto péptido, la PTH(1-34)
requiere inyecciones subcutáneas diariamente. La Publicación
Internacional Número WO 2004/060386 divulga un género enorme de
modulares PTH/PTHrP que comprenden un vehículo que causa una
respuesta hipercalcémica mayor que la
PTH(1-34).
PTH(1-34).
La Patente Europea EP 1477496 divulga derivados
hPTH pegilados.
Existe aún una necesidad de nuevos análogos de
PTH terapéuticos que demuestren buena eficacia de formación ósea
que se refleje en un contenido mineral óseo (BMC) y/o resistencia
ósea incrementadas, al tiempo que mantenga, preferiblemente, un
efecto de hipercalcemia similar, o menor, de la
PTH(1-34) terapéutica actual y que requiera
una administración menos frecuente que la
PTH(1-34). Los compuestos de la presente
invención satisfacen estas necesidades y proporcionan ventajas
relacionadas.
Un compuesto pegilado de la invención es un
compuesto con una secuencia seleccionada entre el grupo constituido
por:
a)
\newpage
b)
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\vskip1.000000\baselineskip
c)
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d)
\vskip1.000000\baselineskip
y
\newpage
e)
en el que mPG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del
mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, la invención
proporciona un compuesto con la secuencia de:
en el que mPG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del
mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización preferida, la invención
proporciona un compuesto con la secuencia de:
en el que mPG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del
mismo.
\newpage
En una realización, la invención proporciona un
compuesto con la secuencia de:
en la que Xaa_{8} y Xaa_{18}
son Met o Xaa_{8} y Xaa_{18} son Nle; y en el que mPG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del
mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, la invención proporciona un
producto intermedio con una secuencia seleccionada entre el grupo
constituido por:
a) Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu
Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu
Gln Asp Val His Asn Phe (SEC ID NO: 8),
b) Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle Hi Gln Arg
Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg Val Glu Trp Leu Ar Lys Leu Leu
Gln Glu Val (SEC ID NO: 9),
c) Pro Va Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu
Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu Arg Val Glu TrpLu Arg Lys Leu Leu
Gln Asp Val His Asn Phe SEC ID NO: 10),
d) Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Asn Leu
Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu
Gln Asp Val His Asn Phe (SEC ID NO: 11), y
e) Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Gln Arg
Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu
Gln Glu Val His Gln Phe (SEC ID NO: 12); o la amida
C-terminal de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, la invención proporciona una
formulación farmacéutica que comprende un compuesto de la SEC ID
NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del mismo; en combinación con un vehículo, diluyente o excipiente
aceptable farmacéuticamente.
En una realización, esta invención proporciona
un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del mismo, para uso en terapia.
En una realización, esta invención proporciona
un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del mismo, para uso en la inducción de la formación ósea en un
mamífero, preferiblemente un ser humano.
En una realización, esta invención proporciona
un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del mismo, para uso en el tratamiento de una enfermedad o estado en
el cual una nueva formación ósea y/o un incremento en la masa ósea
y la resistencia biomecánica ósea sería beneficiosa en un mamífero,
preferiblemente un humano, incluyendo la osteoporosis, osteopenia,
curación de fracturas óseas, fusión espinal, implantes óseos,
implantes de articulaciones, implantes dentales, y enfermedad
periodontal.
\newpage
En una realización, esta invención proporciona
un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del mismo, para uso en el tratamiento de la osteoporosis en un
mamífero, preferiblemente un ser humano.
En una realización, esta invención proporciona
un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del mismo, para uso en el tratamiento de la osteoporosis o la
osteopenia en un mamífero, preferiblemente un ser humano.
En una realización, esta invención proporciona
un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del mismo, para uso en el tratamiento de una fractura ósea en un
mamífero, preferiblemente un ser humano.
La invención proporciona el uso de un compuesto
de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del mismo, para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad o estado capaz de ser mejorado o
prevenido mediante la inducción de formación ósea.
La invención proporciona el uso de un compuesto
de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del mismo, para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de estados en los cuales una nueva formación ósea y/o
un incremento en la masa ósea y la resistencia biomecánica ósea
sería beneficiosa en un mamífero, preferiblemente un humano,
incluyendo la osteoporosis, osteopenia, curación de fracturas óseas,
fusión espinal, implantes óseos, implantes de articulaciones,
implantes dentales, y enfermedad periodontal.
La invención proporciona igualmente el uso de un
compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento
de la osteoporosis en un mamífero, preferiblemente un ser
humano.
La invención proporciona igualmente el uso de un
compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del mismo, para la fabricación de un medicamento para la prevención
de la osteoporosis o la osteopenia en un mamífero, preferiblemente
un ser humano.
La invención proporciona igualmente el uso de un
compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente
aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente
del mismo, para la fabricación de un medicamento para uso en el
tratamiento de una fractura ósea en un mamífero, preferiblemente un
ser humano.
La formación ósea se produce durante el
desarrollo fetal y el crecimiento post-natal y
también durante la vida del adulto o bien a un ritmo bajo como
parte del remodelado óseo normal o bien a un ritmo acelerado en
respuesta a una lesión o pérdida ósea anormal. La formación ósea
implica un cierto número de procesos, incluyendo la proliferación
de células progenitoras del osteoblasto, la diferenciación del
osteoblasto a partir de las células progenitoras y la
mineralización de la matriz producida por los osteoblastos. El
término "inducción de formación ósea" o "inducción de nueva
formación ósea" se adopta para indicar un incremento neto en la
masa ósea (por ejemplo, tal como se demuestra mediante un
incremento en el contenido mineral óseo ("BMC") y/o resistencia
biomecánica ósea tal como se determina usando el procedimiento del
Ejemplo 4B de la presente memoria.
El término "cantidad eficaz" tal como se
usa en la presente memoria, es una dosis de un compuesto de la
invención necesaria para lograr el efecto farmacológico
deseado.
El término "actividad in vitro" se
refiere a la actividad de un compuesto de la invención en uno o más
ensayos in vitro adecuados incluyendo, por ejemplo, la
capacidad para activar un receptor de PTH en un ensayo a base de
células. La actividad puede expresarse como "EC_{50}" que
identifica una concentración eficaz de un compuesto que da como
resultado un 50% de actividad máxima en el ensayo elegido. Cualquier
ensayo in vitro adecuado puede usarse para ensayar la unión
y la activación del receptor de la PTH, incluyendo la activación de
adenilato ciclasa que da como resultado unos niveles de AMP cíclica
(cAMP) incrementados (véase Ejemplo 3 de la presente memoria). Los
compuestos de la invención tienen actividad agonística variable que
conduce a un incremento en la cAMP intracelular.
En su forma típica, el mPEG (monometoxi
polietileno glicol) es un polímero lineal con grupos hidroxilo
terminales que tiene la fórmula
CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-OH
en la que n es desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 4000.
El mPEG usado en la presente invención tiene un peso molecular
promedio de desde 1.500 hasta 5.500 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2.000 hasta 5.000 Daltons, más preferiblemente
aproximadamente 2.000 hasta 2.300, incluso más preferiblemente
aproximadamente 2.000 Daltons. Los reactivos mPEG disponibles
comercialmente (por ejemplo, NOF SUNBRIGTH®
ME-020AS) tienen, generalmente, algún grado de
polidispersión, lo que significa que "n" varía dentro de un
intervalo en una distribución groseramente Gaussiana,
preferiblemente dentro de un intervalo estrecho. Generalmente, el
hidrógeno terminal puede sustituirse con un grupo de terminación
tal como un grupo alquilo o aromático. Aunque en la molécula mPEG el
hidrógeno terminal esté substituido con un grupo metoxi, se
contempla que el hidrógeno terminal pueda ser substituido con una
cadena de carbono de longitud variable, por ejemplo una cadena de
hasta 10 carbonos, lineal o ramificada, y se incluye igualmente
dentro de la invención.
Un compuesto con una secuencia tal como se
muestra en las SEC ID NOs: 8-12 puede usarse como un
producto intermedio en la síntesis de un compuesto pegilado de la
invención. Preferiblemente un compuesto tal como se muestra en las
SEC ID Nos: 8-12 está en la forma amida en la
terminación carboxi del compuesto.
Los términos "ligador", "resto
ligador", y "espaciador" se adoptan en la presente memoria
para referirse a un átomo o una colección de átomos opcionalmente
usados para ligar restos de interconexión tales como una
terminación de un segmento de polímero y un péptido. El resto
ligador es la porción del polímero total que contiene un resto
reactivo para permitir la unión covalente a un sitio mutuamente
reactivo sobre un péptido.
El término "conjugado" (o alternativamente
"péptido conjugado") se adopta en la presente memoria para
indicar una molécula heterogénea formada por la unión covalente de
un péptido a una molécula PEG.
El término "unión covalente" significa que
un péptido y una molécula de polietileno glicol están o bien
directamente unidos covalentemente entre sí, o en su lugar están
indirectamente unidos covalentemente a otro a través de un resto o
restos intervinientes, tal como un ligador, resto ligador, o
espaciador.
Los compuestos pegilados de la presente
invención pueden reaccionar con cualquiera de entre un cierto número
de ácidos o bases inorgánicas u orgánicas para formar sales
aceptables farmacéuticamente. Las sales aceptables
farmacéuticamente preferidas son las formadas con ácido acetato,
ácido citrato y ácido clorhídrico. Son especialmente preferidas las
sales acetato de los compuestos de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, ó 5, en
el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un
peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons,
preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más
preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons. Los procedimientos
para la preparación de sales aceptables farmacéuticamente de
compuestos de la presente invención son bien conocidos para el
técnico experto (Sec: Stahl y otros, Handbook of Pharmaceutical
Salts: Properties, Selection and Use,
VCHA-Wiley-VCH (202); y Berge y
otros, Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 66, págs.
1-19, (1977)).
Las enfermedades degenerativas óseas, tal como
osteoporosis, se caracterizan por una masa ósea disminuida, BMD
disminuida, y pérdida de estructura ósea resultante de una
resistencia ósea disminuida, y riesgo incrementado de fractura
ósea. Los compuestos pegilados de la invención pueden formar masa
ósea, incrementar la resistencia biomecánica ósea, restaurar la
estructura ósea, y reducir el riesgo de fracturas vertebrales y no
vertebrales en pacientes osteoporóticos que está en alto riesgo de
fractura. Por ello, los compuestos pegilados de la invención son
útiles como agentes de formación ósea para tratar o prevenir
enfermedades degenerativas óseas, tal como osteoporosis. Más aún,
los compuestos pegilados de la invención son útiles como agentes de
formación ósea para potenciar la curación de fracturas y estimular
el desarrollo óseo en el lugar de implantes óseos, implantes de
articulaciones o implantes dentales, o para el tratamiento de
enfermedad periodontal.
Los pacientes adecuados incluyen hombres,
mujeres, y niños que sufren de estados de pérdida ósea o traumas
óseos, por ejemplo, fractura ósea, en los cuales sería beneficiosa
una nueva formación ósea, un incremento en la masa ósea, y/o un
incremento en la resistencia biomecánica ósea. Por ejemplo, los
compuestos de la invención pueden administrarse como un medio para
inducir la formación ósea y/o incremento de la masa y resistencia
ósea, reduciendo, de esta forma, el riesgo de fractura ósea
vertebral y no vertebral en un paciente en riesgo de dichas
fracturas, incluyendo pacientes que sufren de osteoporosis u
osteopenia, por ejemplo pacientes que tienen osteoporosis
relacionada con la edad, osteoporosis inducida por esteroides,
osteoporosis post-menopáusica, osteoporosis
idiopática, y osteoporosis primaria o secundaria. Los sitios no
vertebrales incluyen, por ejemplo, cadera, antebrazo, húmero,
tibia, radio, tobillo, costilla, pié, pelvis, y fémur.
Los compuestos pegilados de la invención pueden
suministrase también a un paciente para potenciar o acelerar la
curación de fractura vertebral o no vertebral, por ejemplo, en un
paciente que ha sufrido un trauma como resultado de una fractura
ósea, por ejemplo debido a un accidente o lesión deportiva, o que ha
sufrido una fractura por fragilidad asociada con una baja masa
ósea, incluyendo cadera, antebrazo, húmero, tibia, radio, tobillo,
costilla, pié, pelvis, y fémur.
Los compuestos de la invención pueden prepararse
tal como se describe en el esquema siguiente ejemplificado por la
síntesis de un compuesto con la SEC ID NO:1:
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\vskip1.000000\baselineskip
La cadena péptida de los compuestos de la
presente invención puede sintetizarse usando procedimientos de
síntesis en fase sólida manuales o automatizados convencionales.
Los sintetizadores de péptidos automatizados se encuentran
disponibles comercialmente, por ejemplo, de Applied Biosystems
(Forster City, CA) y de Protein Technologies Inc. (Tucson, AZ). Los
reactivos para la síntesis en fase sólida se encuentran fácilmente
disponibles a partir de fuentes comerciales. Los sintetizadores en
fase sólida pueden usarse de acuerdo con las instrucciones del
fabricante para el bloqueo de grupos interferentes, protección de
aminoácidos durante la reacción, acoplamiento, desprotección y
terminación de aminoácidos sin reaccionar.
Típicamente, un aminoácido
N^{\alpha}-carbamoil protegido y el aminoácido
N-terminal sobre a cadena péptida en desarrollo
unido a una resina se acoplan a temperatura ambiente en un
disolvente inerte tal como dimetilformamida,
N-metilpirrolidona o cloruro de metileno en la
presencia de agentes de acoplamiento tal como
diisopropil-carbodiimida (DIC) y
1-hidroxibenzotriazol (HOBt). El grupo de protección
N^{\alpha}-carbamoilo se separa de la resina
péptida resultante usando un reactivo tal como ácido
trifluoroacético (TFA) o piperidina, y la reacción de acoplamiento
se repite con el siguiente aminoácido
N^{\alpha}-protegido deseado a agregar a la cadena
péptida. Los grupos de protección amina adecuados son bien
conocidos en la técnica y se encuentran descritos, por ejemplo, en
Green y Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, John
Wiley and Sons, (1991). Los ejemplos los más comúnmente usados
incluyen tBOC y fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Después de
completarse la síntesis, los péptidos se escinden del soporte de
fase sólida con desprotección simultánea de la cadena lateral usando
procedimientos de tratamiento convencionales bajo condiciones
ácidas.
El técnico experto valorará el que la cadena
péptida de los compuestos de la invención pueda sintetizarse o bien
con un ácido libre C-terminal o bien carboxamida. El
tipo de resina de poliestireno modificada usada para la síntesis
determinará el resto C-terminal después de la
escisión. En la técnica se conocen y usan de manera rutinaria un
cierto número de ligadores. Para la síntesis de péptidos de amida
C-terminal, se usan típicamente resinas que
incorporan ligadores amida de Rink-MBHA o amida de
Rink-AM con síntesis Fmoc, en tanto que la resina
MBHA se usa generalmente con síntesis tBOC. Para a generación de
péptidos de ácido C-terminal, se usa típicamente
2-clorotritilo o resina de Wang para la síntesis
Fmoc, en tanto que la síntesis tBOC generalmente usa resina PAM.
Los procedimientos para la carga del primer aminoácido a la resina
son bien conocidos en la técnica.
Típicamente los péptidos brutos se purifican
usando Cromatografía Líquida de Alta Eficacia de Fase Inversa
(rp-HPLC) sobre columnas C8 ó C18 usando gradientes
de agua-acetonitrilo en TFA del 0,05 al 0,1%. La
pureza puede verificarse mediante rp-HPLC
analítica. La identidad de los péptidos puede verificarse mediante
espectrometría de masa. Los péptidos pueden solubilizarse en
tampones acuosos dentro de un amplio intervalo de pH.
La conjugación de mPEG a un péptido puede
realizarse usando reacciones de síntesis químicas bien
caracterizadas (Véanse: Roberts y otros, Adv. Drug Deliv.
Rev., vol. 54, págs. 459-476, (2002) y Veronese,
F.M., Biomaterials, vol. 22, págs. 405-417,
(2001)) o de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Es
preferible que el procedimiento use un exceso molar de un polímero
con respecto al péptido para conducir la reacción hacia su
terminación. El exceso de reactivo mPEG se separa de los productos
péptidos conjugados mediante procedimientos de separación
convencionales tal como rp-HPLC.
La química de conjugación usada en la reparación
de compuestos pegilados de la invención es la formación de enlace
amida entre un mPG-carboxilato activado tal como,
por ejemplo, éster NHS (N-hidroxisuccinimida) y un
grupo amido sobre el péptido. El ligador entre mPEG y el péptido es
CO-CH2 (carboxi metilo). La secuencia péptida de la
invención está diseñada para contener una cadena lateral Lys única
con el fin de permitir la reacción selectiva con el mPEG-éster NHS
entrante. Generalmente, esto implica igualmente la substitución del
amino-terminal con un grupo de protección tal como
Fmoc o trifluoroacetilo, el cual se separa posteriormente. Como
alternativa, el amino-terminal puede dejarse sin
proteger y la acilación parcialmente selectiva de la cadena lateral
Lys puede obtenerse bajo condiciones de disolvente y pH óptimas
(Véase, Patente de EE.UU. No. 5.646.242). La conjugación amida se
lleva a cabo, preferiblemente, con un mPEG-derivado
de éster NHS y un péptido Fmoc-protegido
N-terminal que contiene un Lys única (u otro
aminoácido que contenga amina) en una mezcla acuosa a pH de 9 a 10
y a temperatura ambiente durante 20 a 60 minutos. Después de la
conjugación, el péptido conjugado deseado se recupera y purifica
mediante procedimientos de separación convencionales tal como
rp-HPLC.
Un compuesto pegilado de la invención puede
incorporarse dentro de composiciones farmacéuticas adecuadas para
administración a un sujeto, particularmente a un humano. Un
compuesto pegilado de la invención puede administrarse solo o en
combinación con un vehículo, diluyente y/o excipientes aceptables
farmacéuticamente. Específicamente, un compuesto pegilado de a
invención puede administrarse en un vehículo de NaH_{2}PO_{4} 20
mM en NaCl al 0,9%, 3 mg/ml de manitol, pH 5. Las composiciones
para administración se diseñan para ser apropiada para el modo
seleccionado de administración, y se usan diluyentes, vehículo, y/o
excipientes aceptables farmacéuticamente, tales como agentes de
dispersión, tampones, tensioactivos, conservantes_{,} agentes
solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes estabilizantes y
similares, según sea apropiado. Dichas composiciones se diseñan de
acuerdo con técnicas convencionales tales como, por ejemplo, en
Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 9th
Edition, Gennaro, Ed. Mack Publishing Co., Easton, PA, (1995), el
cual proporciona un compendio de técnica de formulación tal como
son generalmente conocidas por los que las llevan a cabo.
Una composición que comprende un compuesto
pegilado de la invención puede administrarse a un sujeto en riesgo,
o que muestre patologías tal como se han descrito en la presente
memoria, usando técnicas de administración convencionales que
incluyen la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea,
pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal,
sublingual, o mediante supositorios.
La vía de administración de un compuesto
pegilado de la invención puede ser parenteral, oral, o mediante
inhalación o suministro transdérmico. Preferiblemente, los
compuestos pegilados de la invención pueden incorporarse dentro de
una composición farmacéutica adecuada para administración
parenteral. El término parenteral tal como se usa en la presente
memoria incluye la administración intravenosa, intramuscular,
subcutánea, rectal, vaginal, o intraperitoneal. Se prefiere el
suministro sistémico periférico mediante inyección intravenosa o
intraperitoneal o subcutánea.
Un compuesto pegilado de la invención puede
administrarse en forma de un aerosol para fines terapéuticos, los
cuales han de administrarse con aplicadores de inhalación y que
contengan un compuesto de la presente invención. Los aerosoles y
los procedimientos para la síntesis de los mismos se encentran
descritos en la técnica.
Un compuesto pegilado de la invención puede
administrarse regularmente, por ejemplo, una vez al día o una vez a
la semana. Como alternativa, un compuesto pegilado de la invención
puede administrarse, por ejemplo, dos veces a la semana, o 3 veces
a la semana. Como alternativa, los compuestos de la invención pueden
administrarse cíclicamente (por ejemplo, regularmente durante un
período de días o de semanas seguido de un período sin
administración). Preferiblemente, un compuesto pegilado de la
invención se administra una vez a la semana durante un período que
varía desde 3 meses hasta 3 años.
La composición típicamente debe ser estéril y
estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento en el
envase suministrado, incluyendo por ejemplo, un vial sellado o una
jeringuilla. De acuerdo con ello, las composiciones deben filtrarse
de forma estéril después de la fabricación de la formulación, o bien
hacerse microbiológicamente aceptable. Para administración
parenteral, un intervalo de dosis típico para un compuesto de la
invención es aproximadamente 1 \mug por semana hasta
aproximadamente 10 mg por semana. Preferiblemente, la dosis humana
está en el intervalo de 5 \mug por semana hasta aproximadamente
1000 \mug por semana. Más preferiblemente, la dosis está en el
intervalo de 10 \mug por semana hasta 1000 \mug por semana,
incluyendo la administración de 10 \mug, 15 \mug, 20 \mug, 25
\mug, 30 \mug, 35 \mug, 40 \mug, 45 \mug, 50 \mug, 55
\mug, 60 \mug, 65 \mug, 70 \mug, 75 \mug, 80 \mug, 85
\mug, 90 \mug, 95 \mug, ó 100 \mug, 150 \mug, 200 \mug,
250 \mug, 300 \mug, 500 \mug, 750 \mug, ó 1000 \mug una
vez por semana. Aunque estos intervalos de dosis se establecen en
unidades por semana, se contempla que puedan usarse otros
intervalos de tiempo.
Estas cantidades sugeridas de un compuesto están
sujetas en gran parte a la discreción terapéutica. El factor clave
en la selección de una dosis y programación apropiadas es el
resultado clínico obtenido. Los factores a considerar en este
contexto incluyen el trastorno particular a tratar, el mamífero en
particular a tratar, el estado clínico del paciente individual, la
causa del trastorno, el sitio de suministro del compuesto, el
procedimiento de administración, la programación de administración,
y otros factores conocidos para los médicos.
Los agentes terapéuticos de la invención pueden
congelarse o liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en
un vehículo estéril adecuado antes de su uso. La liofilización y
reconstitución puede conducir a grados variables de pérdida de
actividad del compuesto. Las dosificaciones pueden tener que
ajustarse para compensarla. Generalmente, se prefiere el pH de la
preparación entre 4 y 8.
Un compuesto de la invención puede administrarse
solo o en combinación con otros agentes, por ejemplo, agentes
antiresortivos óseos, incluyendo la calcitonina, bisfosfonatos,
SERMs (por ejemplo, raloxifeno), terapia de substitución de
hormonas (HRT), calcio, Vitamina D1, Vitamina D2, Vitamina D3,
Vitamina D4 y estrógeno. Un compuesto de la invención puede
co-administrarse con otro agente. Como alternativa,
un compuesto de la invención puede administrarse secuencialmente
con otro agente; por ejemplo, un compuesto de la invención se
administra solo durante un período de una semana a un año seguido
de la administración de otro agente, bien conjuntamente con dicho
compuesto o bien en la ausencia de dicho compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización de la invención, se
proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales
útiles para el tratamiento o prevención de las enfermedades o
estados descritos anteriormente. El artículo de fabricación
comprende un envase y una etiqueta. Los envases adecuados incluyen,
por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas, plumillas,
inhaladores, parches y tubos de ensayo. Los envases pueden estar
formados a partir de una diversidad de materiales tales como
vidrio, metal o plástico. El envase contiene una composición de la
invención que es eficaz para la prevención o tratamiento de las
enfermedades o condiciones y puede tener una entrada de acceso
estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución
intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una
aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en el envase es
una composición de la invención. La etiqueta sobre, o asociada con,
el envase indica que la composición se use para tratar el estado
elegido. El artículo de fabricación puede comprender además un
segundo envase comprendiendo un tampón aceptable farmacéuticamente,
tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y
solución de dextrosa. Además, puede comprender otros materiales
deseables desde un punto de vista comercial y del usuario,
incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas, e
insertos de envasado con instrucciones para su uso.
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La síntesis de péptidos se llevó a cabo sobre
Fmoc-amida-resina de poliestireno
Rapp AM RAM (Rapp Polymere Tubingen, Alemania) (substitución: 0,6 a
0,7 mmol/g). La síntesis se llevó a cabo usando la estrategia del
grupo de protección de la cadena principal Fmoc. Además, cualquier
cadena lateral de aminoácido que sea aromática, ácida, básica o
altamente polar tiene probabilidad de ser reactiva. Estas deben
igualmente ser protegidas para prevenir la formación de cadenas
laterales no deseadas. Existen cuatro grupos principales usados en
esta vía: tBoc (un grupo butiloxicarbonilo terciario) para Lys y
Trp; Pbf (un grupo
2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo)
para Arg; tBu (un grupo butilo terciario) para Ser, Asp, y Glu; Trt
(un grupo trifenilmetilo) para Gln, His, y Asn. Los derivados de
cadena lateral de aminoácido usados son: Arg(Pbf),
Asn(Trt), Asp(OtBu), Cys(Trt),
Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc),
Ser(OtBu), Trp(Boc). El acoplamiento se llevó a cabo
con aproximadamente 10 equivalentes de aminoácido activado con
diisopropilcarbodiimida (DIC) e hidroxibenzotriazol (HOBt) (relación
molar 1:1:1) en dimetilformamida (DMF). El grupo de protección Fmoc
del aminoácido en la posición 1 se dejó en su lugar para permitir
la conjugación selectiva de una cadena lateral de Lisina (véase
Ejemplo 2, más adelante).
La escisión simultánea de la resina y la
separación del grupo de protección de la cadena lateral se llevó a
cabo en un solución conteniendo ácido
tifluoroacético:triisopropilsilano:metanol:anisol, 90:5:2,5:2,5
durante 1,5 a 2 horas a temperatura ambiente. La escisión del
péptido de la resina de amida de Rink genera la forma carboxamida
C-terminal del péptido Los péptidos se precipitaron
con éter dietílico, se redisolvieron en 30-40 ml de
acetonitrilo al 10% y s purificaron sobre una columna de HPLC de
fase inversa de C_{18} a una velocidad de flujo
12-15 ml/min con un gradiente lineal AB en el que A
= TFA al 0,05%/agua y B = TFA al 0,05%/acetonitrilo. La columna
usada es o bien una Waters SymmtryPrep de 7 um, de 19x300 mm, o bien
una Kromasil de 10 um, de 22x250 mm. La pureza del péptido y el
peso molecular se confirmó sobre un sistema Agilent 1100 Series
LC-MS con un detector MS cuatripolar único. La
separación mediante HPLC analítica se realizó sobre una columna
Zorbax Eclipse XDB-C8, de 5 micrómetros, 4,6 mm de
diámetro interno x 15 cm, con un gradiente lineal AB de 10 al 100%
de B durante 15 minutos, en el cual A = TFA al 0,05%/H_{2}O y B =
TFA al 0,05% en CH_{3}CN:H_{2}O al 60:40 y una velocidad de
flujo de 1 ml/min. Todos los péptidos se purificaron a >95% de
pureza y se confirmó que tenían un peso molecular correspondiente
al valor calculado dentro de 1 unidad de masa atómica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió péptido no conjugado con un grupo
Fmoc N-terminal in situ en 1 ml de
agua/acetonitrilo 50/50 (36,8 mg, 4272,9 g/mol, 0,0086 mmol). Se
pesó un exceso 1,5 a 2 veces molar de éster NHS-mPEG
de 2kDa (NOF Sunbright ME-020AS) (39,7 mg, 2280 de
p.mol. promedio, 0,017 mmol). La solución péptida se diluyó con 2 ml
de tampón de borato sódico 40 mM, pH 9,8 y 2 ml de acetonitrilo y,
a continuación, se agregó a la solución de mPEG. La mezcla
resultante se batió y, a continuación, se agitó a temperatura
ambiente. La mezcla de reacción se controló mediante HPLC de fase
inversa analítica (procedimiento tal como se describe en el Ejemplo
1), y típicamente después de 20 a 30 minutos de tiempo de reacción,
mostró completa desaparición del pico péptido (a aproximadamente
14,5 minutos) y emergió un pico debido al conjugado de
péptido-PEG (a aproximadamente 15,7 minutos) La
mezcla se enfrió sobre hielo seco, y se agregaron 2 ml de piperidina
para separar el grupo Fmoc N-terminal. La mezcla se
agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y, a continuación,
se enfrió sobre hielo seco y se neutralizó con 2 ml de ácido
acético glacial (pH final = aproximadamente 6-7). A
partir de la HPLC analítica debería aparecer un pico a
aproximadamente 13,2 minutos debido al aducto
piperidina-fluoreno y un pico a aproximadamente
14,25 minutos debido al conjugado péptido-mPEG
desprotegido. La mezcla se diluyó a aproximadamente 40 ml con agua
y se purificó sobre o bien una columna Waters SymmetryPrep de 7
\mum, y 19x300 mm o bien una Kromasil de 10 \mum, y 22x250 mm a
12 ml/min con un gradiente AB lineal de dos fases de 0 a 30% de B
durante 20 minutos, seguido de 30 a 80% de B durante 100 minutos, en
donde A = TFA al 0,05%/agua y B = TFA al 0,05%/acetonitrilo.
Las fracciones combinadas conteniendo el
producto se liofilizaron para obtener la forma de sal de
trifluoroacetato del péptido. El producto puede posteriormente
convertirse en otra forma de sal deseada mediante procedimientos
conocidos en la técnica. El péptido purificado se cuantificó
mediante absorbancia UV a 280 nm usando un coeficiente de extinción
molar calculado en base a la secuencia péptida. El p.mol. promedio
del conjugado es (promedio de p.mol. de PEG-NHS +
p.mol. de Fmoc-péptido - p.mol. de Fmoc - p.mol. de
NHS) = 2280 + 4273 - 115 - 222 = 6216. Para el ejemplo en el cual
se usaron 36,8 mg de un péptido no conjugado, pueden obtenerse 34,8
mg del péptido pegilado. La conjugación de otros péptidos descritos
en esta invención, en los cuales se usa mPEG-éster NHS, se llevó
cabo esencialmente tal como se ha descrito anteriormente.
Todos los datos en los Ejemplos más adelante
usan compuestos de la invención que son péptidos de amida
C-terminal que están
mPEG-conjugados en el resto Lys de la posición 26 de
la cadena principal péptida de la invención y son sales
trifluoroacetato (véanse, por ejemplo, las SEC ID NOs:
1-5).
\vskip1.000000\baselineskip
Se resuspendieron células de osteosarcoma
SaOS-2 a una concentración de 5x10^{5} células/ml
en tampón de estimulación [HEPES 1 M/BSA al 10%/IBMX
(3-isobutil-1-metilxantina,
MB Biomedicals) 250 \muM/HBSS]. Se agregaron 20 \mul/pocillo de
suspensión de células por pocillo de una placa de ensayo de
semi-área negra de 96 pocillos (Costar) para proporcionar
1x10^{4} células/pocillo. A continuación, se agregaron
inmediatamente a las células 20 \mul del compuesto de ensayo
diluido (por ejemplo, análogo de PTH de la invención, n = 2). Los
compuestos de ensayo se prepararon como diluciones ½ log y se
ensayaron a lo largo de un intervalo de valoración de 3 \muM a
0,1 nM. Las placas se incubaron durante una hora a temperatura
ambiente. Así mismo, se preparó una placa de ensayo de 96 pocillos
separada conteniendo cAMP como una curva patrón. La cAMP patrón se
preparó como diluciones ½ log en tampón de estimulación a lo largo
de un intervalo de valoración de 400 a 0,0012 pmoles/pocillo (40
\mul/pocillo) (n = 6). Después de la etapa de incubación de una
hora, la cAMP se ensayó usando el kit cAMP dynamic 2 HTRF®
(fluorescencia resuelta en tiempo homogéneo) (Cisbio) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante.
Cuando los compuestos siguientes se ensayaron
esencialmente tal como se ha descrito anteriormente, se encontró
que inducían la producción de cAMP tal como se ha tabulado a
continuación. Estos datos demuestran que estos compuestos tienen la
potente capacidad para activar el receptor de PTH (PTHR1) de una
manera no diferente a PTH.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se ovariectomizaron ratas
Sprague-Dawley hembras de aproximadamente 3 meses de
edad, excepto para los controles falsos, y se mantuvieron en un
ciclo de 12 horas de luz/oscuridad a 22ºC con acceso ad
libitum a alimento (TD 89222 con Ca al 0,5% y P al 0,4%,
Teklad, Madison, WI) y agua. Las ratas ovariectomizadas (Ovx) se
dejaron que perdieran masa ósea durante 25 días y, a continuación,
se pesaron y separaron aleatoriamente en grupos de tratamiento. El
tratamiento fue mediante inyección subcutánea de un compuesto de la
invención a diversas dosis (tal como se indica en la Tabla 2 más
adelante) durante 1 mes en un vehículo de NaH_{2}PO_{4} 20 mM
en NaCl al 0,9%, 3 mg/ml de manitol, pH 5. Las ratas se inyectaron
con los compuestos cada tercer o cuarto día para aproximarse a una
administración de una vez a la semana para un humano. Los controles
falsos y Ovx se trataron con el vehículo solamente ("control de
vehículo falso" y "control de vehículo Ovx"). Los sueros se
recogieron mediante punción cardíaca aproximadamente 24 horas
después de la inyección final bajo anestesia con isofurano a la
necropsia (aproximadamente 24 horas después de la inyección final),
y se analizaron usando un analizador químico clínico (Hitachi 917,
Tokio, Japón).
Al alcanzar la necropsia, se extrajeron el arco
del fémur izquierdo, se limpiaron con un tejido suave y se
almacenaron en etanol/solución salina al 50% a 4ºC. A temperatura
ambiente, los fémures en EOH/solución salina al 50% se arrollaron
en Parafilm y se centraron con respecto al soporte para la
tomografía computerizada cuantitativa (QCT) (Research M, Stratec).
Se generó un escáner de reconocimiento coronal de la metáfisis del
fémur distal primeramente en 2D antes del análisis en 3D. Los
parámetros QCT se midieron incluyendo la densidad mineral ósea
(BMD, mg/ml de hidroxil apatito), el contenido mineral óseo (BMC, mg
hidroxil apatito), y el área de sección trasversal (mm^{2}) tal
como se ha detallado previamente (Sato, y otros, JPET, vol.
272, págs. 1252-1259, (1995)).
La hipercalcemia se define en la presente
memoria como el valor de calcio en suero superior al percentil 97,5
de controles de vehículo oviarectomizados normales para el tipo de
animal usado, usando datos químico clínicos procedentes de la
punción cardíaca (International Federation of Clinical Chemistry, HE
Solberg en Tietz, Fundamentals of Clinical Chemistry, 5th
edition, Burtis CA y Ashwood ER. Editors, págs.
251-261, (2001)). El valor que refleja el percentil
de 97,5 es 11,2 mg de calcio por dl de suero procedente de vehículo
de control Ovx. La "Dosis hipercalcémica", es decir, la dosis
a la cual se observó hipercalcemia 20 horas después de la inyección
del compuesto de ensayo usando datos químico clínicos y sueros
recogidos procedentes de la punción cardíaca, se determinó mediante
interpolación, usando análisis de regresión para ajustar la
respuesta de dosis calcémica observada 24 horas después de la
administración del compuesto de ensayo a ratas ovariectomizadas.
La ovariectomía reduce significativamente la BMD
en ratas con relación a controles de vehículo falso durante un
período de 7,5 semanas (3,5 semanas de fase de
pre-tratamiento más 4 semanas de fase de
tratamiento) (Sato y otros, J. Med. Chem., vol. 42, págs.
1-24, (1999)). Los compuestos pegilados de la
invención son capaces de volver a restaurar la BMD a los niveles de
control de vehículo falso al final de las 4 semanas de la fase de
tratamiento. Para los compuestos pegilados preferidos de la
invención, ensayados con los parámetros de este ensayo, la dosis
requerida para restaurar la BMD a los niveles de control de vehículo
falso ("Dosis BMD") no es mayor que la Dosis hipercalcémica.
Cuando se ensayaron esencialmente tal como se ha descrito
anteriormente, los compuestos listados en la Tabla 2 más adelante,
son capaces de restaurar la BMD de ratas Ovx al nivel de control de
vehículo falso después de cuatro semanas de tratamiento con una
cierta dosificación; pero, es necesario una dosis similar o mayor
del compuesto para inducir la Dosis hipercalcémica. Los factores que
afectan a la relación Dosis hipercalcémica/Dosis BMD incluyen, pero
pueden no estar limitados a ellos, la secuencia de aminoácidos de
la cadena principal péptida y la posición del aminoácido al cual
está unido el PEG. Los compuestos preferidos de la invención
ensayados dentro de los parámetros de este ensayo tienen una
relación Dosis hipercalcémica/Dosis BMD igual o mayor de
aproximadamente 1,0 tal como se muestra en la Tabla 2 a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, se determinó la capacidad de
los compuestos pegilados de la invención para incrementar la
resistencia ósea biomecánica, la BMD y la BMC de ratas Ovx a niveles
de control de vehículo falso. El efecto de los compuestos sobre la
resistencia biomecánica ósea se espera que sea una predicción mejor
de la eficacia clínica que la BMD. La BMD vertebral predice
marginalmente la eficacia clínica de las terapias contra la
osteoporosis para reducir la incidencia de fracturas vertebrales
(Cummings, y otros, Am. Journal of Medicine, vol. 112, págs.
281-289, (2002); Sarkar y otros, J. Bone &
Mineral Research, vol. 17, págs. 1-20, (2002)).
Dado que la PTH(1-34) reduce el riesgo tanto
de fracturas vertebrales cono no vertebrales (Neer y otros,
NEJM, vol. 344, págs. 1434-1441, (2001)), se
analizó la eficacia de los compuestos de la invención para demostrar
si incrementan la resistencia biomecánica ósea en la vértebra
lumbar y en dos sitios no vertebrales, es decir, el tallo medio
femoral y el cuello femoral.
Se ovariectomizaron ratas
Sprague-Dawley hembras de aproximadamente 6 meses de
edad, excepto para los controles falsos, y se mantuvieron en un
ciclo de 12 horas de luz/oscuridad a 22ºC con acceso ad
libitum a alimento (TD 89222 con Ca al 0,5% y P al 0,4%,
Teklad, Madison, WI) y agua. Las ratas ovariectomizadas (Ovx) se
dejaron que perdieran masa ósea durante un mes antes de tratamiento
con compuestos de la invención durante dos meses más. El compuesto
a ensayar se administró subcutáneamente a diversas dosis (tal como
se indica en la Tabla 3 más adelante) en un vehículo de
NaH_{2}PO_{4} 20 mM en NaCl al 0,9%, 3 mg/ml de manitol, pH 5,
cada 6 ó 7 días durante dos meses. Los controles falsos y Ovx se
trataron con el vehículo solamente ("control de vehículo
falso" y "control de vehículo Ovx"). A continuación, se
recogieron los sueros mediante punción cardíaca bajo anestesia con
isofurano a la necropsia, y se analizaron usando un analizador
químico clínico. Se extrajeron la vértebra lumbar
L4-6 y los fémures izquierdos, se limpiaron con un
tejido suave y se almacenaron en etanol/solución salina al 50% a
4ºC. A temperatura ambiente, las L-5 en
EtOH/solución salina al 50% se arrollaron en Parafilm y se
centraron con respecto al soporte de QCT (Research M, Stratec). Se
generó un escáner de reconocimiento coronal de la vértebra
L-5 primeramente en 2D antes del análisis en 3D. Los
parámetros QCT se midieron incluyendo la BMD (mg/cc), la BMC (mg),
y el área de sección trasversal (mm^{2}). A continuación, se
prepararon la vertebra lumbar L-5, el tallo medio
femoral y el femoral proximal para el ensayo biomecánico. La
resistencia (N) se evaluó cargando las muestras hasta rotura, tal
como se ha descrito previamente (Sato, y otros,
Endocrinology, vol. 10, págs. 4330-4337,
(1997)).
Los compuestos preferidos de la invención se
evaluaron en este ensayo con relación a un control positivo de
3-5 \mug/k/d de PTH(1-38).
Se encontró que la PTH(1-34) y
PTH(1-38) eran indistinguibles en términos de
eficacia esquelética o efectos calcémicos en ratas oaviectomizadas
osteopénicas. Previamente se mostró que las ratas administradas con
5 \mug/kg/d (1 nmol/kg/d) de PTH(1-34)
tienen una exposición sistémica que es aproximadamente 3 veces la
de PTH(1-34) (es decir, FORTEO^{TM}) en
humanos (Tashjian y Chabner, J. Bone Miner. Res., vol. 17,
págs. 1151-1161, (2002); Tashjian y Gagel, J.
Bone Miner. Res., vol. 21, págs. 354-365,
(2006)). Previamente, se había mostrado también que 5 \mug/kg/d de
PTH(1-34) restauran la BMD procedente de Ovx
a niveles de control de vehículo falso en el modelo de rata
ovariectomizada osteopénica vieja (Kishi y otros, Bone, vol.
22, págs. 515-522, (1988); Kimmel y otros,
Endocrinology, vol. 132, págs. 1577-1584,
(1993)). Esto se confirmó para PHT(1-38) en
este modelo con una dosificación de 3-5
\mug/kg/d.
La ovariectomía reduce significativamente la
BMD, la BMC y la resistencia ósea con relación a los controles de
vehículo falso a lo largo de un período de tres meses en ratas
viejas. Los compuestos en la Tabla 3 más delante, cuando se
ensayaron esencialmente tal como se ha descrito anteriormente,
restauran la BMC de ratas Ovx a los niveles de control de vehículo
falso cuando se trataron durante ocho semanas con la dosis listada
en la Tala 3. Además, los compuestos listados en la Tabla 3, cuando
se ensayaron esencialmente tal como se ha descrito anteriormente,
restauran la resistencia biomecánica de las ratas Ovx al nivel de
control de vehículo falso en uno, dos o tres de los lugares
vertebral, tallo medio y cuello femoral ensayados.
Para ciertos compuestos preferidos de la
invención, ensayados dentro de los parámetros de este ensayo, no se
observó hipercalcemia hasta la dosis máxima ensayada de
aproximadamente 110 nmol/kg. Los compuestos preferidos de la
invención, ensayados dentro de los parámetros de este ensayo, son
capaces de restaurar la BMD y la BMC a los niveles de control de
vehículo falso, al tiempo que tienen igualmente una relación de
Dosis hipercalcémica/Dosis BMD igual o mayor de aproximadamente
1,0, 2,0, 3,0 ó 4,0, o incluso más preferiblemente, mayor de
aproximadamente 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 o mayor. Los
compuestos preferidos de la invención, ensayados dentro de los
parámetros de este ensayo, son capaces de restaurar la BMD y la BMC
a los niveles de control de vehículo falso, al tiempo que
igualmente restauran la resistencia biomecánica en uno, dos o tres
de los lugares vertebral, tallo medio y cuello femoral a los
niveles de control de vehículo falso. Incluso más preferiblemente,
los compuestos de la invención, ensayados dentro de los parámetros
de este ensayo, son capaces de restaurar la BMD y la resistencia
biomecánica en uno, dos o tres de los lugares vertebral, tallo medio
y cuello femoral a los niveles de control de vehículo falso, al
tiempo que tienen igualmente una relación de Dosis
hipercalcémica/Dosis BMD igual o mayor de aproximadamente 1,0, 2,0,
3,0 ó 4,0, o incluso más preferiblemente, igual o mayor de
aproximadamente 5,0, 6,0, 7,0, 80, 9,0, 10,0 o mayor.
El compuesto con la SEC ID NO:4 con mPEG de 2 kD
(p.mol. promedio) alcanza la resistencia del nivel de control de
vehículo falso a una dosis de 11 nmol/kg para sitios vertebral,
tallo medio y cuello femoral, en la ausencia de hipercalcemia a la
dosis la más alta ensayada. En consecuencia, este compuesto tiene
una relación de Dosis hipercalcémica/Dosis BMD de >10 para los
tres sitios. De manera similar, la SEC ID NO:1 con mPEG de 2 kD
restaura la resistencia vertebral y cuello femoral a los niveles de
control de vehículo falso a una dosis de 11 nmol/kg, en la ausencia
de hipercalcemia a la dosis la más alta ensayada y, en consecuencia,
tiene una relación de Dosis hipercalcémica/Dosis de resistencia
biomecánica de >10 para estos dos sitios. Estos datos indican
que la secuencia de la cadena principal péptida de un compuesto de
la invención, así como el sitio del mPEG conjugado con la cadena
principal péptida del compuesto, contribuye a la eficacia
esquelética (tal como se refleja por las mediciones d BMD, BMC y de
resistencia) del compuesto.
\newpage
La Tabla 4 más adelante establece las relaciones
de interés obtenidas a partir de valores en la Tabla 3. Los
compuestos preferidos de la invención tienen una relación Dosis
hipercalcémica/Dosis DMB vertebral lograda dentro de los parámetros
del ensayo de aproximadamente 1,0 o mayor, más preferiblemente igual
o mayor de 3, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Los compuestos preferidos de la
invención tienen una relación Dosis hipercalcémica/Dosis BMC
vertebral lograda dentro de los parámetros del ensayo de
aproximadamente 3,0 o mayor, más preferiblemente mayor de 5, 6, 7,
8, 9 ó 10. Los compuestos preferidos de la invención tienen una
relación Dosis hipercalcémica/Dosis de resistencia vertebral
lograda dentro de los parámetros del ensayo de aproximadamente 1,0 o
mayor, más preferiblemente mayor de 3, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Los
compuestos preferidos de la invención tienen una relación Dosis
hipercalcémica/Dosis de resistencia de tallo medio lograda dentro
de los parámetros del ensayo de aproximadamente 1,0 o mayor, más
preferiblemente mayor de 3, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Los compuestos
preferidos de la invención tienen una relación Dosis
hipercalcémica/Dosis de resistencia de cuello femoral, lograda
dentro de los parámetros del ensayo, de aproximadamente 3,0 o
mayor, más preferiblemente mayor de 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o mayor.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Un compuesto de la invención con la SEC ID NO:1,
en el que el mPEG al cual está conjugado es un mPEG de 2 kD, se
comparó directamente con un compuesto de la invención con la SEC ID
NO:1, en el que el mPEG al cual está conjugado es un mPEG de 5 kD.
Las ratas ovariectomizadas osteopénicas viejas se las permitió que
perdieran masa ósea durante un mes antes de la dosificación
(nmol/kg tal como en la Tabla 5 y 6) cada 6 días con vehículo
solamente, o el compuesto de la SEC ID NO:2 pegilado con 2 kD o el
compuesto de la SEC ID NO:1 pegilado con 5 kD durante 8 semanas. La
Tabla 5 muestra los valores de calcio en suero promedio (mg/dl) 24
horas después de la dosificación. La Tabla 6 muestra la BMD
promedio (mg/cc).
Los animales dosificados con cualquier compuesto
tenían niveles de calcio en suero normales 24 horas después de la
dosificación. Sin embargo, el compuesto con el mPEG de 2 kD tuvo
menos efecto sobre el calcio en suero al tiempo que exhibió mejor
eficacia esquelética BMD a dosis baja, media y alta de lo que mostró
el compuesto con el mPEG de 5 kD. Estos datos demuestran que el
compuesto pegilado con 2 kD es similar al compuesto pegilado con 5
kD en cuanto a la eficacia esquelética al tiempo que tiene menores
efectos de calcio en suero.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se mantuvieron ratas
Sprague-Dawley ovariectomizadas de seis meses de
edad, bajo un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad a 22ºC con acceso
ad libitum a alimento (TD 89222 con Ca al 0,5% y P al 0,4%,
Teklad, Madison, WI) y agua. Las ratas ovariectomizadas se dejaron
que perdieran masa ósea durante 1 mes, antes de tratamiento con
rhPTH(1-34) durante los siguientes 3 meses.
Las ratas ovariectomizadas osteopénicas viejas se inyectaron
subcutáneamente, semanalmente, con 0, 10 ó 30 \mug/kg de
PTH(1-34) humano. Se inyectaron controles
falsos y Ovx con el vehículo solamente. Las vértebras lumbares se
extirparon a la necropsia y se analizaron mediante
micro-CT (Stratec) y, a continuación, se prepararon
para ensayo biomecánico. Se evaluó la resistencia en Newtons (N)
cargando las muestras hasta la rotura. La importancia con respecto
a los controles de vehículo Ovx se indica mediante * en la Tabla 7
más adelante (Fishers PLSD, P<0,05). Los datos del modelo se
proporcionan en la Tabla 7 más adelante.
Con relación a los controles de vehículo Ovx, la
PTH(1-34) no tiene efecto significativo hasta
30 ug/kg (7 nmol/kg) sobre la BMD vertebral o la resistencia
biomecánica vertebral en ratas ovariectomizadas osteopénicas
después de 12 semanas de tratamiento. El calcio en suero es normal
cuando se midió aproximadamente 24 horas después de la última
dosis. En comparación con los datos mostrados en la presente memoria
más adelante, los compuestos de la presente invención tienen BMD
vertebral y resistencia vertebral biomecánica superior con respecto
a la PTH(1-34) semanal.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cinéticas de internalización del PTHR1
(Receptor 1 de PTH) para los compuestos de la invención se
determinaron después de la unión de ligandos a receptores de
membrana. Las células HEK 293 se transfectaron con plásmido
PTHR-emGFP (Invitrogen).
Las células sembraron a una concentración de
7.000 células/pocillo, 100 \mul/pocillo en placa de 96 pocillos,
negra, de fondo claro recubierta con poli-D lisina.
24 horas después de sembrarlas en la placa de 96 pocillos, las
células se dosificaron con 10 \mul de un compuesto a ensayar, a
las concentraciones finales de 100 nM en puntos de tiempo
distribuidos aleatoriamente desde 0 minutos hasta 3 horas. El medio
se aspiró al llegar al punto final de dosificación. Las células se
fijaron con 100 \mul de Prefer (Anatech, Battle Creck, ML)
durante 30 minutos. El Prefer se aspiró de las células, y las
células se lavaron tres veces con 100 \mul de 1X PBS. Las células
se tiñeron con 100 \mul de tinte nuclear Hoechst diluido (diluido
en 1X PBS) durante 30 minutos. El tinte Hoechst se aspiró y
reemplazó con 1X PBS. Las placas se almacenaron en la oscuridad a
4ºC hasta su escaneado. Las células se escanearon dentro de las 48
horas usando un Cellomics® ArrayScan. Los datos representativos
procedentes de diversos puntos de tiempo establecidos como por
ciento de vehículo de control únicamente (línea basal = 100%), se
presentan la Tabla 8.
Estos datos muestran que los compuestos de la
invención tienen cinéticas de internalización marcadamente
diferentes de la PTH(1-38), dependiendo de
la secuencia de la cadena principal péptida, tanto esté pegilado
como no, y del tamaño del PEG. Es de señalar que las moléculas no
pegiladas tienen la cadena principal de la Secuencia nombrada con
la excepción de que existe un resto lisina en la posición 26. Las
cinéticas de internalización más lentas indican una proporción
reducida de internalización del receptor PTHR1 cuando se forman
complejos ligando-receptor PTHR1 que usan
compuestos de la invención, dando como resultado una magnitud
superior de señalización en la célula después de la unión del
ligando. Esto es probablemente parte de la explicación de la
eficacia esquelética mejorada observada para las formas de
compuestos de la invención con PEG de 2 kD con dosificación semanal
sobre la observada con dosificación de PTH semanal.
<110> Eli Lilly and Company
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MODULADORES DEL RECEPTOR PTH
PEGILADO Y USOS DE LOS MISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> X7107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCTUS0780367
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
04-10-2007
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 26 es una lisina
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es
norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 18 es
norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 26 es una lisina
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 26 es una lisina
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es
norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 18 es
norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 26 es una lisina
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es
norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 18 es
norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 26 es una lisina
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es Met si Xaa
en la posición 18 es también Met; o Xaa en la posición 8 es
norleucina si Xaa en la posición 18 es también norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es Met si Xaa
en la posición 18 es también Met; o Xaa en la posición 8 es
norleucina si Xaa en la posición 18 es también norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 26 es una lisina
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Modificada con FMOC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede estar o no amidada
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es
norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 18 es
norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede estar o no amidada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-REVS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede estar o no amidada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es
norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 18 es
norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede estar o no amidada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es
norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 18 es
norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede estar o no amidada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
Claims (15)
1. Un compuesto con la secuencia de:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Xaa_{8} y Xaa_{18}
son Met o Xaa_{8} y Xaa_{18} son Nle; y en el que mPEG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons; o una sal aceptable
farmacéuticamente del
mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un compuesto de la reivindicación 1 que tiene
la secuencia de aminoácidos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un compuesto de la reivindicación 1 que tiene
la secuencia de aminoácidos:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
4. Un compuesto seleccionado entre el grupo
constituido por:
a)
\vskip1.000000\baselineskip
b)
\vskip1.000000\baselineskip
y
c)
en el que mPEG es
monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular
promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons; o una sal aceptable
farmacéuticamente del
mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, o una sal aceptable farmacéuticamente del
mismo, en el que mPEG tiene un peso molecular promedio de desde 2000
hasta 5000 Daltons.
6. Un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, o una sal aceptable farmacéuticamente del
mismo, en el que mPEG tiene un peso molecular promedio de
aproximadamente 2000 Daltons.
7. Un producto intermedio con una secuencia
seleccionada entre el grupo constituido por la SEC ID NOs:
8-12.
8. Una composición que comprende un compuesto de
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una sal aceptable
farmacéuticamente del mismo; en combinación con un vehículo,
diluyente o excipiente aceptable farmacéuticamente.
9. Un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, o una sal aceptable farmacéuticamente del
mismo, para uso en terapia.
10. Un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, o una sal aceptable farmacéuticamente del
mismo, para uso en la inducción de la formación ósea en un
mamífero.
11. Un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, o una sal aceptable farmacéuticamente del
mismo, para uso en el tratamiento de una enfermedad o estado en el
cual una nueva formación y/o incremento en la masa ósea y
resistencia biomecánica ósea sería beneficiosa en un mamífero,
incluyendo la osteoporosis, osteopenia, fractura ósea, fusión
espinal, implantes óseos, implantes de articulaciones, implantes
dentales, y enfermedad periodontal.
12. Un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, o una sal aceptable farmacéuticamente del
mismo, para uso en el tratamiento de la osteoporosis en un
mamífero.
13. Un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, o una sal aceptable farmacéuticamente del
mismo, para uso en la prevención de la osteoporosis o la osteopenia
en un mamífero.
14. Un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, o una sal aceptable farmacéuticamente del
mismo, para uso en el tratamiento de una fractura ósea en un
mamífero.
15. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 14 en el que el mamífero es un ser humano.
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