ES2343917T3 - Pth pegilados como moduladores del receptor pth y uso de los mismos. - Google Patents

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Patricia Lea Brown-Augsburger
Wayne David Kohn
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Abstract

Un compuesto con la secuencia de: **(Ver fórmula)** en la que Xaa8 y Xaa18 son Met o Xaa8 y Xaa18 son Nle; y en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.

Description

PTH pegilados como moduladores del receptor PTH y uso de los mismos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a compuestos moduladores del receptor de la hormona paratiroide (PTHR) y a procedimientos para la obtención y uso de los mismos.
Antecedentes de la invención
Las enfermedades degenerativas óseas tales como la osteoporosis se producen en una parte substancial de la población adulta mayor. La osteoporosis abarca un grupo heterogéneo de trastornos que representan un riesgo principal de fracturas óseas, y una carga substancial sobre el sistema del cuidado de la salud. Miles de millones de dólares se gastan anualmente en el cuidado médico para el tratamiento de la osteoporosis. Clínicamente, la osteoporosis se caracteriza por una masa ósea disminuida, densidad mineral ósea (BDM) y contenido mineral óseo (BMC) disminuidos, y pérdida de la estructura ósea como resultado de la resistencia ósea disminuida y riesgo incrementado de fractura
ósea.
Aunque un cierto número de agente antiresorción que incluyen la calcitonina, bisfosfonatos, estrógeno y SERMs previenen una adicional pérdida ósea, estos no vuelven a formar masa ósea una vez que esta se ha perdido. El primer agente de construcción ósea anabólico aprobado por la FDA para el tratamiento de la osteoporosis es la PTH(1-34) humano, también conocida como teripadatida, la cual se comercializa bajo el nombre de la serie FORTEO® (Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN). La PTH o PTH(1-34) se piensa que ejerce sus efectos a través de la activación mediada por receptor de dos vías de señalamiento intracelular a través de (1) adenilato ciclasa y proteína quinasa A, y (2) fosfolipasa C y proteína quinasa C. El PTH(1-34) forma masa ósea, restaura la estructura ósea, y reduce el riesgo de fracturas óseas vertebral y no vertebral en pacientes osteoporóticos que están en alto riesgo de fractura. (R. Neer, NEJM, vol. 344, pág. 1434, (2001)). Como un producto péptido, la PTH(1-34) requiere inyecciones subcutáneas diariamente. La Publicación Internacional Número WO 2004/060386 divulga un género enorme de modulares PTH/PTHrP que comprenden un vehículo que causa una respuesta hipercalcémica mayor que la
PTH(1-34).
La Patente Europea EP 1477496 divulga derivados hPTH pegilados.
Existe aún una necesidad de nuevos análogos de PTH terapéuticos que demuestren buena eficacia de formación ósea que se refleje en un contenido mineral óseo (BMC) y/o resistencia ósea incrementadas, al tiempo que mantenga, preferiblemente, un efecto de hipercalcemia similar, o menor, de la PTH(1-34) terapéutica actual y que requiera una administración menos frecuente que la PTH(1-34). Los compuestos de la presente invención satisfacen estas necesidades y proporcionan ventajas relacionadas.
Sumario de la invención
Un compuesto pegilado de la invención es un compuesto con una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por:
a)
1
\newpage
b)
2
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c)
3
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\vskip1.000000\baselineskip
d)
4
\vskip1.000000\baselineskip
y
\newpage
e)
5
en el que mPG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, la invención proporciona un compuesto con la secuencia de:
6
en el que mPG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización preferida, la invención proporciona un compuesto con la secuencia de:
7
en el que mPG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.
\newpage
En una realización, la invención proporciona un compuesto con la secuencia de:
8
en la que Xaa_{8} y Xaa_{18} son Met o Xaa_{8} y Xaa_{18} son Nle; y en el que mPG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, la invención proporciona un producto intermedio con una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por:
a) Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe (SEC ID NO: 8),
b) Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle Hi Gln Arg Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg Val Glu Trp Leu Ar Lys Leu Leu Gln Glu Val (SEC ID NO: 9),
c) Pro Va Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu Arg Val Glu TrpLu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe SEC ID NO: 10),
d) Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe (SEC ID NO: 11), y
e) Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Glu Val His Gln Phe (SEC ID NO: 12); o la amida C-terminal de la misma.
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En una realización, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; en combinación con un vehículo, diluyente o excipiente aceptable farmacéuticamente.
En una realización, esta invención proporciona un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para uso en terapia.
En una realización, esta invención proporciona un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para uso en la inducción de la formación ósea en un mamífero, preferiblemente un ser humano.
En una realización, esta invención proporciona un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para uso en el tratamiento de una enfermedad o estado en el cual una nueva formación ósea y/o un incremento en la masa ósea y la resistencia biomecánica ósea sería beneficiosa en un mamífero, preferiblemente un humano, incluyendo la osteoporosis, osteopenia, curación de fracturas óseas, fusión espinal, implantes óseos, implantes de articulaciones, implantes dentales, y enfermedad periodontal.
\newpage
En una realización, esta invención proporciona un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para uso en el tratamiento de la osteoporosis en un mamífero, preferiblemente un ser humano.
En una realización, esta invención proporciona un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para uso en el tratamiento de la osteoporosis o la osteopenia en un mamífero, preferiblemente un ser humano.
En una realización, esta invención proporciona un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para uso en el tratamiento de una fractura ósea en un mamífero, preferiblemente un ser humano.
La invención proporciona el uso de un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o estado capaz de ser mejorado o prevenido mediante la inducción de formación ósea.
La invención proporciona el uso de un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de estados en los cuales una nueva formación ósea y/o un incremento en la masa ósea y la resistencia biomecánica ósea sería beneficiosa en un mamífero, preferiblemente un humano, incluyendo la osteoporosis, osteopenia, curación de fracturas óseas, fusión espinal, implantes óseos, implantes de articulaciones, implantes dentales, y enfermedad periodontal.
La invención proporciona igualmente el uso de un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la osteoporosis en un mamífero, preferiblemente un ser humano.
La invención proporciona igualmente el uso de un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para la fabricación de un medicamento para la prevención de la osteoporosis o la osteopenia en un mamífero, preferiblemente un ser humano.
La invención proporciona igualmente el uso de un compuesto de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de una fractura ósea en un mamífero, preferiblemente un ser humano.
Descripción detallada de la invención
La formación ósea se produce durante el desarrollo fetal y el crecimiento post-natal y también durante la vida del adulto o bien a un ritmo bajo como parte del remodelado óseo normal o bien a un ritmo acelerado en respuesta a una lesión o pérdida ósea anormal. La formación ósea implica un cierto número de procesos, incluyendo la proliferación de células progenitoras del osteoblasto, la diferenciación del osteoblasto a partir de las células progenitoras y la mineralización de la matriz producida por los osteoblastos. El término "inducción de formación ósea" o "inducción de nueva formación ósea" se adopta para indicar un incremento neto en la masa ósea (por ejemplo, tal como se demuestra mediante un incremento en el contenido mineral óseo ("BMC") y/o resistencia biomecánica ósea tal como se determina usando el procedimiento del Ejemplo 4B de la presente memoria.
El término "cantidad eficaz" tal como se usa en la presente memoria, es una dosis de un compuesto de la invención necesaria para lograr el efecto farmacológico deseado.
El término "actividad in vitro" se refiere a la actividad de un compuesto de la invención en uno o más ensayos in vitro adecuados incluyendo, por ejemplo, la capacidad para activar un receptor de PTH en un ensayo a base de células. La actividad puede expresarse como "EC_{50}" que identifica una concentración eficaz de un compuesto que da como resultado un 50% de actividad máxima en el ensayo elegido. Cualquier ensayo in vitro adecuado puede usarse para ensayar la unión y la activación del receptor de la PTH, incluyendo la activación de adenilato ciclasa que da como resultado unos niveles de AMP cíclica (cAMP) incrementados (véase Ejemplo 3 de la presente memoria). Los compuestos de la invención tienen actividad agonística variable que conduce a un incremento en la cAMP intracelular.
En su forma típica, el mPEG (monometoxi polietileno glicol) es un polímero lineal con grupos hidroxilo terminales que tiene la fórmula CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-OH en la que n es desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 4000. El mPEG usado en la presente invención tiene un peso molecular promedio de desde 1.500 hasta 5.500 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2.000 hasta 5.000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2.000 hasta 2.300, incluso más preferiblemente aproximadamente 2.000 Daltons. Los reactivos mPEG disponibles comercialmente (por ejemplo, NOF SUNBRIGTH® ME-020AS) tienen, generalmente, algún grado de polidispersión, lo que significa que "n" varía dentro de un intervalo en una distribución groseramente Gaussiana, preferiblemente dentro de un intervalo estrecho. Generalmente, el hidrógeno terminal puede sustituirse con un grupo de terminación tal como un grupo alquilo o aromático. Aunque en la molécula mPEG el hidrógeno terminal esté substituido con un grupo metoxi, se contempla que el hidrógeno terminal pueda ser substituido con una cadena de carbono de longitud variable, por ejemplo una cadena de hasta 10 carbonos, lineal o ramificada, y se incluye igualmente dentro de la invención.
Un compuesto con una secuencia tal como se muestra en las SEC ID NOs: 8-12 puede usarse como un producto intermedio en la síntesis de un compuesto pegilado de la invención. Preferiblemente un compuesto tal como se muestra en las SEC ID Nos: 8-12 está en la forma amida en la terminación carboxi del compuesto.
Los términos "ligador", "resto ligador", y "espaciador" se adoptan en la presente memoria para referirse a un átomo o una colección de átomos opcionalmente usados para ligar restos de interconexión tales como una terminación de un segmento de polímero y un péptido. El resto ligador es la porción del polímero total que contiene un resto reactivo para permitir la unión covalente a un sitio mutuamente reactivo sobre un péptido.
El término "conjugado" (o alternativamente "péptido conjugado") se adopta en la presente memoria para indicar una molécula heterogénea formada por la unión covalente de un péptido a una molécula PEG.
El término "unión covalente" significa que un péptido y una molécula de polietileno glicol están o bien directamente unidos covalentemente entre sí, o en su lugar están indirectamente unidos covalentemente a otro a través de un resto o restos intervinientes, tal como un ligador, resto ligador, o espaciador.
Los compuestos pegilados de la presente invención pueden reaccionar con cualquiera de entre un cierto número de ácidos o bases inorgánicas u orgánicas para formar sales aceptables farmacéuticamente. Las sales aceptables farmacéuticamente preferidas son las formadas con ácido acetato, ácido citrato y ácido clorhídrico. Son especialmente preferidas las sales acetato de los compuestos de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, ó 5, en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons, preferiblemente aproximadamente 2000 a 5000 Daltons, más preferiblemente aproximadamente 2000 Daltons. Los procedimientos para la preparación de sales aceptables farmacéuticamente de compuestos de la presente invención son bien conocidos para el técnico experto (Sec: Stahl y otros, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, VCHA-Wiley-VCH (202); y Berge y otros, Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 66, págs. 1-19, (1977)).
Las enfermedades degenerativas óseas, tal como osteoporosis, se caracterizan por una masa ósea disminuida, BMD disminuida, y pérdida de estructura ósea resultante de una resistencia ósea disminuida, y riesgo incrementado de fractura ósea. Los compuestos pegilados de la invención pueden formar masa ósea, incrementar la resistencia biomecánica ósea, restaurar la estructura ósea, y reducir el riesgo de fracturas vertebrales y no vertebrales en pacientes osteoporóticos que está en alto riesgo de fractura. Por ello, los compuestos pegilados de la invención son útiles como agentes de formación ósea para tratar o prevenir enfermedades degenerativas óseas, tal como osteoporosis. Más aún, los compuestos pegilados de la invención son útiles como agentes de formación ósea para potenciar la curación de fracturas y estimular el desarrollo óseo en el lugar de implantes óseos, implantes de articulaciones o implantes dentales, o para el tratamiento de enfermedad periodontal.
Los pacientes adecuados incluyen hombres, mujeres, y niños que sufren de estados de pérdida ósea o traumas óseos, por ejemplo, fractura ósea, en los cuales sería beneficiosa una nueva formación ósea, un incremento en la masa ósea, y/o un incremento en la resistencia biomecánica ósea. Por ejemplo, los compuestos de la invención pueden administrarse como un medio para inducir la formación ósea y/o incremento de la masa y resistencia ósea, reduciendo, de esta forma, el riesgo de fractura ósea vertebral y no vertebral en un paciente en riesgo de dichas fracturas, incluyendo pacientes que sufren de osteoporosis u osteopenia, por ejemplo pacientes que tienen osteoporosis relacionada con la edad, osteoporosis inducida por esteroides, osteoporosis post-menopáusica, osteoporosis idiopática, y osteoporosis primaria o secundaria. Los sitios no vertebrales incluyen, por ejemplo, cadera, antebrazo, húmero, tibia, radio, tobillo, costilla, pié, pelvis, y fémur.
Los compuestos pegilados de la invención pueden suministrase también a un paciente para potenciar o acelerar la curación de fractura vertebral o no vertebral, por ejemplo, en un paciente que ha sufrido un trauma como resultado de una fractura ósea, por ejemplo debido a un accidente o lesión deportiva, o que ha sufrido una fractura por fragilidad asociada con una baja masa ósea, incluyendo cadera, antebrazo, húmero, tibia, radio, tobillo, costilla, pié, pelvis, y fémur.
Síntesis de compuestos
Los compuestos de la invención pueden prepararse tal como se describe en el esquema siguiente ejemplificado por la síntesis de un compuesto con la SEC ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
100
9
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La cadena péptida de los compuestos de la presente invención puede sintetizarse usando procedimientos de síntesis en fase sólida manuales o automatizados convencionales. Los sintetizadores de péptidos automatizados se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo, de Applied Biosystems (Forster City, CA) y de Protein Technologies Inc. (Tucson, AZ). Los reactivos para la síntesis en fase sólida se encuentran fácilmente disponibles a partir de fuentes comerciales. Los sintetizadores en fase sólida pueden usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el bloqueo de grupos interferentes, protección de aminoácidos durante la reacción, acoplamiento, desprotección y terminación de aminoácidos sin reaccionar.
Típicamente, un aminoácido N^{\alpha}-carbamoil protegido y el aminoácido N-terminal sobre a cadena péptida en desarrollo unido a una resina se acoplan a temperatura ambiente en un disolvente inerte tal como dimetilformamida, N-metilpirrolidona o cloruro de metileno en la presencia de agentes de acoplamiento tal como diisopropil-carbodiimida (DIC) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt). El grupo de protección N^{\alpha}-carbamoilo se separa de la resina péptida resultante usando un reactivo tal como ácido trifluoroacético (TFA) o piperidina, y la reacción de acoplamiento se repite con el siguiente aminoácido N^{\alpha}-protegido deseado a agregar a la cadena péptida. Los grupos de protección amina adecuados son bien conocidos en la técnica y se encuentran descritos, por ejemplo, en Green y Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, (1991). Los ejemplos los más comúnmente usados incluyen tBOC y fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Después de completarse la síntesis, los péptidos se escinden del soporte de fase sólida con desprotección simultánea de la cadena lateral usando procedimientos de tratamiento convencionales bajo condiciones ácidas.
El técnico experto valorará el que la cadena péptida de los compuestos de la invención pueda sintetizarse o bien con un ácido libre C-terminal o bien carboxamida. El tipo de resina de poliestireno modificada usada para la síntesis determinará el resto C-terminal después de la escisión. En la técnica se conocen y usan de manera rutinaria un cierto número de ligadores. Para la síntesis de péptidos de amida C-terminal, se usan típicamente resinas que incorporan ligadores amida de Rink-MBHA o amida de Rink-AM con síntesis Fmoc, en tanto que la resina MBHA se usa generalmente con síntesis tBOC. Para a generación de péptidos de ácido C-terminal, se usa típicamente 2-clorotritilo o resina de Wang para la síntesis Fmoc, en tanto que la síntesis tBOC generalmente usa resina PAM. Los procedimientos para la carga del primer aminoácido a la resina son bien conocidos en la técnica.
Típicamente los péptidos brutos se purifican usando Cromatografía Líquida de Alta Eficacia de Fase Inversa (rp-HPLC) sobre columnas C8 ó C18 usando gradientes de agua-acetonitrilo en TFA del 0,05 al 0,1%. La pureza puede verificarse mediante rp-HPLC analítica. La identidad de los péptidos puede verificarse mediante espectrometría de masa. Los péptidos pueden solubilizarse en tampones acuosos dentro de un amplio intervalo de pH.
La conjugación de mPEG a un péptido puede realizarse usando reacciones de síntesis químicas bien caracterizadas (Véanse: Roberts y otros, Adv. Drug Deliv. Rev., vol. 54, págs. 459-476, (2002) y Veronese, F.M., Biomaterials, vol. 22, págs. 405-417, (2001)) o de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Es preferible que el procedimiento use un exceso molar de un polímero con respecto al péptido para conducir la reacción hacia su terminación. El exceso de reactivo mPEG se separa de los productos péptidos conjugados mediante procedimientos de separación convencionales tal como rp-HPLC.
La química de conjugación usada en la reparación de compuestos pegilados de la invención es la formación de enlace amida entre un mPG-carboxilato activado tal como, por ejemplo, éster NHS (N-hidroxisuccinimida) y un grupo amido sobre el péptido. El ligador entre mPEG y el péptido es CO-CH2 (carboxi metilo). La secuencia péptida de la invención está diseñada para contener una cadena lateral Lys única con el fin de permitir la reacción selectiva con el mPEG-éster NHS entrante. Generalmente, esto implica igualmente la substitución del amino-terminal con un grupo de protección tal como Fmoc o trifluoroacetilo, el cual se separa posteriormente. Como alternativa, el amino-terminal puede dejarse sin proteger y la acilación parcialmente selectiva de la cadena lateral Lys puede obtenerse bajo condiciones de disolvente y pH óptimas (Véase, Patente de EE.UU. No. 5.646.242). La conjugación amida se lleva a cabo, preferiblemente, con un mPEG-derivado de éster NHS y un péptido Fmoc-protegido N-terminal que contiene un Lys única (u otro aminoácido que contenga amina) en una mezcla acuosa a pH de 9 a 10 y a temperatura ambiente durante 20 a 60 minutos. Después de la conjugación, el péptido conjugado deseado se recupera y purifica mediante procedimientos de separación convencionales tal como rp-HPLC.
Composición
Un compuesto pegilado de la invención puede incorporarse dentro de composiciones farmacéuticas adecuadas para administración a un sujeto, particularmente a un humano. Un compuesto pegilado de la invención puede administrarse solo o en combinación con un vehículo, diluyente y/o excipientes aceptables farmacéuticamente. Específicamente, un compuesto pegilado de a invención puede administrarse en un vehículo de NaH_{2}PO_{4} 20 mM en NaCl al 0,9%, 3 mg/ml de manitol, pH 5. Las composiciones para administración se diseñan para ser apropiada para el modo seleccionado de administración, y se usan diluyentes, vehículo, y/o excipientes aceptables farmacéuticamente, tales como agentes de dispersión, tampones, tensioactivos, conservantes_{,} agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes estabilizantes y similares, según sea apropiado. Dichas composiciones se diseñan de acuerdo con técnicas convencionales tales como, por ejemplo, en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 9th Edition, Gennaro, Ed. Mack Publishing Co., Easton, PA, (1995), el cual proporciona un compendio de técnica de formulación tal como son generalmente conocidas por los que las llevan a cabo.
Una composición que comprende un compuesto pegilado de la invención puede administrarse a un sujeto en riesgo, o que muestre patologías tal como se han descrito en la presente memoria, usando técnicas de administración convencionales que incluyen la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual, o mediante supositorios.
La vía de administración de un compuesto pegilado de la invención puede ser parenteral, oral, o mediante inhalación o suministro transdérmico. Preferiblemente, los compuestos pegilados de la invención pueden incorporarse dentro de una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. El término parenteral tal como se usa en la presente memoria incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal, o intraperitoneal. Se prefiere el suministro sistémico periférico mediante inyección intravenosa o intraperitoneal o subcutánea.
Un compuesto pegilado de la invención puede administrarse en forma de un aerosol para fines terapéuticos, los cuales han de administrarse con aplicadores de inhalación y que contengan un compuesto de la presente invención. Los aerosoles y los procedimientos para la síntesis de los mismos se encentran descritos en la técnica.
Un compuesto pegilado de la invención puede administrarse regularmente, por ejemplo, una vez al día o una vez a la semana. Como alternativa, un compuesto pegilado de la invención puede administrarse, por ejemplo, dos veces a la semana, o 3 veces a la semana. Como alternativa, los compuestos de la invención pueden administrarse cíclicamente (por ejemplo, regularmente durante un período de días o de semanas seguido de un período sin administración). Preferiblemente, un compuesto pegilado de la invención se administra una vez a la semana durante un período que varía desde 3 meses hasta 3 años.
La composición típicamente debe ser estéril y estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento en el envase suministrado, incluyendo por ejemplo, un vial sellado o una jeringuilla. De acuerdo con ello, las composiciones deben filtrarse de forma estéril después de la fabricación de la formulación, o bien hacerse microbiológicamente aceptable. Para administración parenteral, un intervalo de dosis típico para un compuesto de la invención es aproximadamente 1 \mug por semana hasta aproximadamente 10 mg por semana. Preferiblemente, la dosis humana está en el intervalo de 5 \mug por semana hasta aproximadamente 1000 \mug por semana. Más preferiblemente, la dosis está en el intervalo de 10 \mug por semana hasta 1000 \mug por semana, incluyendo la administración de 10 \mug, 15 \mug, 20 \mug, 25 \mug, 30 \mug, 35 \mug, 40 \mug, 45 \mug, 50 \mug, 55 \mug, 60 \mug, 65 \mug, 70 \mug, 75 \mug, 80 \mug, 85 \mug, 90 \mug, 95 \mug, ó 100 \mug, 150 \mug, 200 \mug, 250 \mug, 300 \mug, 500 \mug, 750 \mug, ó 1000 \mug una vez por semana. Aunque estos intervalos de dosis se establecen en unidades por semana, se contempla que puedan usarse otros intervalos de tiempo.
Estas cantidades sugeridas de un compuesto están sujetas en gran parte a la discreción terapéutica. El factor clave en la selección de una dosis y programación apropiadas es el resultado clínico obtenido. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular a tratar, el mamífero en particular a tratar, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del compuesto, el procedimiento de administración, la programación de administración, y otros factores conocidos para los médicos.
Los agentes terapéuticos de la invención pueden congelarse o liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un vehículo estéril adecuado antes de su uso. La liofilización y reconstitución puede conducir a grados variables de pérdida de actividad del compuesto. Las dosificaciones pueden tener que ajustarse para compensarla. Generalmente, se prefiere el pH de la preparación entre 4 y 8.
Un compuesto de la invención puede administrarse solo o en combinación con otros agentes, por ejemplo, agentes antiresortivos óseos, incluyendo la calcitonina, bisfosfonatos, SERMs (por ejemplo, raloxifeno), terapia de substitución de hormonas (HRT), calcio, Vitamina D1, Vitamina D2, Vitamina D3, Vitamina D4 y estrógeno. Un compuesto de la invención puede co-administrarse con otro agente. Como alternativa, un compuesto de la invención puede administrarse secuencialmente con otro agente; por ejemplo, un compuesto de la invención se administra solo durante un período de una semana a un año seguido de la administración de otro agente, bien conjuntamente con dicho compuesto o bien en la ausencia de dicho compuesto.
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Artículos de fabricación
En otra realización de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento o prevención de las enfermedades o estados descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas, plumillas, inhaladores, parches y tubos de ensayo. Los envases pueden estar formados a partir de una diversidad de materiales tales como vidrio, metal o plástico. El envase contiene una composición de la invención que es eficaz para la prevención o tratamiento de las enfermedades o condiciones y puede tener una entrada de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en el envase es una composición de la invención. La etiqueta sobre, o asociada con, el envase indica que la composición se use para tratar el estado elegido. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo envase comprendiendo un tampón aceptable farmacéuticamente, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además, puede comprender otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas, e insertos de envasado con instrucciones para su uso.
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Ejemplo 1 Síntesis de péptido
La síntesis de péptidos se llevó a cabo sobre Fmoc-amida-resina de poliestireno Rapp AM RAM (Rapp Polymere Tubingen, Alemania) (substitución: 0,6 a 0,7 mmol/g). La síntesis se llevó a cabo usando la estrategia del grupo de protección de la cadena principal Fmoc. Además, cualquier cadena lateral de aminoácido que sea aromática, ácida, básica o altamente polar tiene probabilidad de ser reactiva. Estas deben igualmente ser protegidas para prevenir la formación de cadenas laterales no deseadas. Existen cuatro grupos principales usados en esta vía: tBoc (un grupo butiloxicarbonilo terciario) para Lys y Trp; Pbf (un grupo 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo) para Arg; tBu (un grupo butilo terciario) para Ser, Asp, y Glu; Trt (un grupo trifenilmetilo) para Gln, His, y Asn. Los derivados de cadena lateral de aminoácido usados son: Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OtBu), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Ser(OtBu), Trp(Boc). El acoplamiento se llevó a cabo con aproximadamente 10 equivalentes de aminoácido activado con diisopropilcarbodiimida (DIC) e hidroxibenzotriazol (HOBt) (relación molar 1:1:1) en dimetilformamida (DMF). El grupo de protección Fmoc del aminoácido en la posición 1 se dejó en su lugar para permitir la conjugación selectiva de una cadena lateral de Lisina (véase Ejemplo 2, más adelante).
La escisión simultánea de la resina y la separación del grupo de protección de la cadena lateral se llevó a cabo en un solución conteniendo ácido tifluoroacético:triisopropilsilano:metanol:anisol, 90:5:2,5:2,5 durante 1,5 a 2 horas a temperatura ambiente. La escisión del péptido de la resina de amida de Rink genera la forma carboxamida C-terminal del péptido Los péptidos se precipitaron con éter dietílico, se redisolvieron en 30-40 ml de acetonitrilo al 10% y s purificaron sobre una columna de HPLC de fase inversa de C_{18} a una velocidad de flujo 12-15 ml/min con un gradiente lineal AB en el que A = TFA al 0,05%/agua y B = TFA al 0,05%/acetonitrilo. La columna usada es o bien una Waters SymmtryPrep de 7 um, de 19x300 mm, o bien una Kromasil de 10 um, de 22x250 mm. La pureza del péptido y el peso molecular se confirmó sobre un sistema Agilent 1100 Series LC-MS con un detector MS cuatripolar único. La separación mediante HPLC analítica se realizó sobre una columna Zorbax Eclipse XDB-C8, de 5 micrómetros, 4,6 mm de diámetro interno x 15 cm, con un gradiente lineal AB de 10 al 100% de B durante 15 minutos, en el cual A = TFA al 0,05%/H_{2}O y B = TFA al 0,05% en CH_{3}CN:H_{2}O al 60:40 y una velocidad de flujo de 1 ml/min. Todos los péptidos se purificaron a >95% de pureza y se confirmó que tenían un peso molecular correspondiente al valor calculado dentro de 1 unidad de masa atómica.
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Ejemplo 2 Conjugación de péptido
Se disolvió péptido no conjugado con un grupo Fmoc N-terminal in situ en 1 ml de agua/acetonitrilo 50/50 (36,8 mg, 4272,9 g/mol, 0,0086 mmol). Se pesó un exceso 1,5 a 2 veces molar de éster NHS-mPEG de 2kDa (NOF Sunbright ME-020AS) (39,7 mg, 2280 de p.mol. promedio, 0,017 mmol). La solución péptida se diluyó con 2 ml de tampón de borato sódico 40 mM, pH 9,8 y 2 ml de acetonitrilo y, a continuación, se agregó a la solución de mPEG. La mezcla resultante se batió y, a continuación, se agitó a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se controló mediante HPLC de fase inversa analítica (procedimiento tal como se describe en el Ejemplo 1), y típicamente después de 20 a 30 minutos de tiempo de reacción, mostró completa desaparición del pico péptido (a aproximadamente 14,5 minutos) y emergió un pico debido al conjugado de péptido-PEG (a aproximadamente 15,7 minutos) La mezcla se enfrió sobre hielo seco, y se agregaron 2 ml de piperidina para separar el grupo Fmoc N-terminal. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y, a continuación, se enfrió sobre hielo seco y se neutralizó con 2 ml de ácido acético glacial (pH final = aproximadamente 6-7). A partir de la HPLC analítica debería aparecer un pico a aproximadamente 13,2 minutos debido al aducto piperidina-fluoreno y un pico a aproximadamente 14,25 minutos debido al conjugado péptido-mPEG desprotegido. La mezcla se diluyó a aproximadamente 40 ml con agua y se purificó sobre o bien una columna Waters SymmetryPrep de 7 \mum, y 19x300 mm o bien una Kromasil de 10 \mum, y 22x250 mm a 12 ml/min con un gradiente AB lineal de dos fases de 0 a 30% de B durante 20 minutos, seguido de 30 a 80% de B durante 100 minutos, en donde A = TFA al 0,05%/agua y B = TFA al 0,05%/acetonitrilo.
Las fracciones combinadas conteniendo el producto se liofilizaron para obtener la forma de sal de trifluoroacetato del péptido. El producto puede posteriormente convertirse en otra forma de sal deseada mediante procedimientos conocidos en la técnica. El péptido purificado se cuantificó mediante absorbancia UV a 280 nm usando un coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia péptida. El p.mol. promedio del conjugado es (promedio de p.mol. de PEG-NHS + p.mol. de Fmoc-péptido - p.mol. de Fmoc - p.mol. de NHS) = 2280 + 4273 - 115 - 222 = 6216. Para el ejemplo en el cual se usaron 36,8 mg de un péptido no conjugado, pueden obtenerse 34,8 mg del péptido pegilado. La conjugación de otros péptidos descritos en esta invención, en los cuales se usa mPEG-éster NHS, se llevó cabo esencialmente tal como se ha descrito anteriormente.
Todos los datos en los Ejemplos más adelante usan compuestos de la invención que son péptidos de amida C-terminal que están mPEG-conjugados en el resto Lys de la posición 26 de la cadena principal péptida de la invención y son sales trifluoroacetato (véanse, por ejemplo, las SEC ID NOs: 1-5).
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Ejemplo 3 Ensayo in vitro de inducción de cAMP
Se resuspendieron células de osteosarcoma SaOS-2 a una concentración de 5x10^{5} células/ml en tampón de estimulación [HEPES 1 M/BSA al 10%/IBMX (3-isobutil-1-metilxantina, MB Biomedicals) 250 \muM/HBSS]. Se agregaron 20 \mul/pocillo de suspensión de células por pocillo de una placa de ensayo de semi-área negra de 96 pocillos (Costar) para proporcionar 1x10^{4} células/pocillo. A continuación, se agregaron inmediatamente a las células 20 \mul del compuesto de ensayo diluido (por ejemplo, análogo de PTH de la invención, n = 2). Los compuestos de ensayo se prepararon como diluciones ½ log y se ensayaron a lo largo de un intervalo de valoración de 3 \muM a 0,1 nM. Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Así mismo, se preparó una placa de ensayo de 96 pocillos separada conteniendo cAMP como una curva patrón. La cAMP patrón se preparó como diluciones ½ log en tampón de estimulación a lo largo de un intervalo de valoración de 400 a 0,0012 pmoles/pocillo (40 \mul/pocillo) (n = 6). Después de la etapa de incubación de una hora, la cAMP se ensayó usando el kit cAMP dynamic 2 HTRF® (fluorescencia resuelta en tiempo homogéneo) (Cisbio) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Cuando los compuestos siguientes se ensayaron esencialmente tal como se ha descrito anteriormente, se encontró que inducían la producción de cAMP tal como se ha tabulado a continuación. Estos datos demuestran que estos compuestos tienen la potente capacidad para activar el receptor de PTH (PTHR1) de una manera no diferente a PTH.
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TABLA 1
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Ejemplo 4 Evaluación in vivo de compuestos conjugados A. Ratas ovariectomizadas osteopénicas adultas jóvenes
Se ovariectomizaron ratas Sprague-Dawley hembras de aproximadamente 3 meses de edad, excepto para los controles falsos, y se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad a 22ºC con acceso ad libitum a alimento (TD 89222 con Ca al 0,5% y P al 0,4%, Teklad, Madison, WI) y agua. Las ratas ovariectomizadas (Ovx) se dejaron que perdieran masa ósea durante 25 días y, a continuación, se pesaron y separaron aleatoriamente en grupos de tratamiento. El tratamiento fue mediante inyección subcutánea de un compuesto de la invención a diversas dosis (tal como se indica en la Tabla 2 más adelante) durante 1 mes en un vehículo de NaH_{2}PO_{4} 20 mM en NaCl al 0,9%, 3 mg/ml de manitol, pH 5. Las ratas se inyectaron con los compuestos cada tercer o cuarto día para aproximarse a una administración de una vez a la semana para un humano. Los controles falsos y Ovx se trataron con el vehículo solamente ("control de vehículo falso" y "control de vehículo Ovx"). Los sueros se recogieron mediante punción cardíaca aproximadamente 24 horas después de la inyección final bajo anestesia con isofurano a la necropsia (aproximadamente 24 horas después de la inyección final), y se analizaron usando un analizador químico clínico (Hitachi 917, Tokio, Japón).
Al alcanzar la necropsia, se extrajeron el arco del fémur izquierdo, se limpiaron con un tejido suave y se almacenaron en etanol/solución salina al 50% a 4ºC. A temperatura ambiente, los fémures en EOH/solución salina al 50% se arrollaron en Parafilm y se centraron con respecto al soporte para la tomografía computerizada cuantitativa (QCT) (Research M, Stratec). Se generó un escáner de reconocimiento coronal de la metáfisis del fémur distal primeramente en 2D antes del análisis en 3D. Los parámetros QCT se midieron incluyendo la densidad mineral ósea (BMD, mg/ml de hidroxil apatito), el contenido mineral óseo (BMC, mg hidroxil apatito), y el área de sección trasversal (mm^{2}) tal como se ha detallado previamente (Sato, y otros, JPET, vol. 272, págs. 1252-1259, (1995)).
La hipercalcemia se define en la presente memoria como el valor de calcio en suero superior al percentil 97,5 de controles de vehículo oviarectomizados normales para el tipo de animal usado, usando datos químico clínicos procedentes de la punción cardíaca (International Federation of Clinical Chemistry, HE Solberg en Tietz, Fundamentals of Clinical Chemistry, 5th edition, Burtis CA y Ashwood ER. Editors, págs. 251-261, (2001)). El valor que refleja el percentil de 97,5 es 11,2 mg de calcio por dl de suero procedente de vehículo de control Ovx. La "Dosis hipercalcémica", es decir, la dosis a la cual se observó hipercalcemia 20 horas después de la inyección del compuesto de ensayo usando datos químico clínicos y sueros recogidos procedentes de la punción cardíaca, se determinó mediante interpolación, usando análisis de regresión para ajustar la respuesta de dosis calcémica observada 24 horas después de la administración del compuesto de ensayo a ratas ovariectomizadas.
La ovariectomía reduce significativamente la BMD en ratas con relación a controles de vehículo falso durante un período de 7,5 semanas (3,5 semanas de fase de pre-tratamiento más 4 semanas de fase de tratamiento) (Sato y otros, J. Med. Chem., vol. 42, págs. 1-24, (1999)). Los compuestos pegilados de la invención son capaces de volver a restaurar la BMD a los niveles de control de vehículo falso al final de las 4 semanas de la fase de tratamiento. Para los compuestos pegilados preferidos de la invención, ensayados con los parámetros de este ensayo, la dosis requerida para restaurar la BMD a los niveles de control de vehículo falso ("Dosis BMD") no es mayor que la Dosis hipercalcémica. Cuando se ensayaron esencialmente tal como se ha descrito anteriormente, los compuestos listados en la Tabla 2 más adelante, son capaces de restaurar la BMD de ratas Ovx al nivel de control de vehículo falso después de cuatro semanas de tratamiento con una cierta dosificación; pero, es necesario una dosis similar o mayor del compuesto para inducir la Dosis hipercalcémica. Los factores que afectan a la relación Dosis hipercalcémica/Dosis BMD incluyen, pero pueden no estar limitados a ellos, la secuencia de aminoácidos de la cadena principal péptida y la posición del aminoácido al cual está unido el PEG. Los compuestos preferidos de la invención ensayados dentro de los parámetros de este ensayo tienen una relación Dosis hipercalcémica/Dosis BMD igual o mayor de aproximadamente 1,0 tal como se muestra en la Tabla 2 a continuación.
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TABLA 2
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B. Ratas ovariectomizadas osteopénicas viejas
En este ejemplo, se determinó la capacidad de los compuestos pegilados de la invención para incrementar la resistencia ósea biomecánica, la BMD y la BMC de ratas Ovx a niveles de control de vehículo falso. El efecto de los compuestos sobre la resistencia biomecánica ósea se espera que sea una predicción mejor de la eficacia clínica que la BMD. La BMD vertebral predice marginalmente la eficacia clínica de las terapias contra la osteoporosis para reducir la incidencia de fracturas vertebrales (Cummings, y otros, Am. Journal of Medicine, vol. 112, págs. 281-289, (2002); Sarkar y otros, J. Bone & Mineral Research, vol. 17, págs. 1-20, (2002)). Dado que la PTH(1-34) reduce el riesgo tanto de fracturas vertebrales cono no vertebrales (Neer y otros, NEJM, vol. 344, págs. 1434-1441, (2001)), se analizó la eficacia de los compuestos de la invención para demostrar si incrementan la resistencia biomecánica ósea en la vértebra lumbar y en dos sitios no vertebrales, es decir, el tallo medio femoral y el cuello femoral.
Se ovariectomizaron ratas Sprague-Dawley hembras de aproximadamente 6 meses de edad, excepto para los controles falsos, y se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad a 22ºC con acceso ad libitum a alimento (TD 89222 con Ca al 0,5% y P al 0,4%, Teklad, Madison, WI) y agua. Las ratas ovariectomizadas (Ovx) se dejaron que perdieran masa ósea durante un mes antes de tratamiento con compuestos de la invención durante dos meses más. El compuesto a ensayar se administró subcutáneamente a diversas dosis (tal como se indica en la Tabla 3 más adelante) en un vehículo de NaH_{2}PO_{4} 20 mM en NaCl al 0,9%, 3 mg/ml de manitol, pH 5, cada 6 ó 7 días durante dos meses. Los controles falsos y Ovx se trataron con el vehículo solamente ("control de vehículo falso" y "control de vehículo Ovx"). A continuación, se recogieron los sueros mediante punción cardíaca bajo anestesia con isofurano a la necropsia, y se analizaron usando un analizador químico clínico. Se extrajeron la vértebra lumbar L4-6 y los fémures izquierdos, se limpiaron con un tejido suave y se almacenaron en etanol/solución salina al 50% a 4ºC. A temperatura ambiente, las L-5 en EtOH/solución salina al 50% se arrollaron en Parafilm y se centraron con respecto al soporte de QCT (Research M, Stratec). Se generó un escáner de reconocimiento coronal de la vértebra L-5 primeramente en 2D antes del análisis en 3D. Los parámetros QCT se midieron incluyendo la BMD (mg/cc), la BMC (mg), y el área de sección trasversal (mm^{2}). A continuación, se prepararon la vertebra lumbar L-5, el tallo medio femoral y el femoral proximal para el ensayo biomecánico. La resistencia (N) se evaluó cargando las muestras hasta rotura, tal como se ha descrito previamente (Sato, y otros, Endocrinology, vol. 10, págs. 4330-4337, (1997)).
Los compuestos preferidos de la invención se evaluaron en este ensayo con relación a un control positivo de 3-5 \mug/k/d de PTH(1-38). Se encontró que la PTH(1-34) y PTH(1-38) eran indistinguibles en términos de eficacia esquelética o efectos calcémicos en ratas oaviectomizadas osteopénicas. Previamente se mostró que las ratas administradas con 5 \mug/kg/d (1 nmol/kg/d) de PTH(1-34) tienen una exposición sistémica que es aproximadamente 3 veces la de PTH(1-34) (es decir, FORTEO^{TM}) en humanos (Tashjian y Chabner, J. Bone Miner. Res., vol. 17, págs. 1151-1161, (2002); Tashjian y Gagel, J. Bone Miner. Res., vol. 21, págs. 354-365, (2006)). Previamente, se había mostrado también que 5 \mug/kg/d de PTH(1-34) restauran la BMD procedente de Ovx a niveles de control de vehículo falso en el modelo de rata ovariectomizada osteopénica vieja (Kishi y otros, Bone, vol. 22, págs. 515-522, (1988); Kimmel y otros, Endocrinology, vol. 132, págs. 1577-1584, (1993)). Esto se confirmó para PHT(1-38) en este modelo con una dosificación de 3-5 \mug/kg/d.
La ovariectomía reduce significativamente la BMD, la BMC y la resistencia ósea con relación a los controles de vehículo falso a lo largo de un período de tres meses en ratas viejas. Los compuestos en la Tabla 3 más delante, cuando se ensayaron esencialmente tal como se ha descrito anteriormente, restauran la BMC de ratas Ovx a los niveles de control de vehículo falso cuando se trataron durante ocho semanas con la dosis listada en la Tala 3. Además, los compuestos listados en la Tabla 3, cuando se ensayaron esencialmente tal como se ha descrito anteriormente, restauran la resistencia biomecánica de las ratas Ovx al nivel de control de vehículo falso en uno, dos o tres de los lugares vertebral, tallo medio y cuello femoral ensayados.
Para ciertos compuestos preferidos de la invención, ensayados dentro de los parámetros de este ensayo, no se observó hipercalcemia hasta la dosis máxima ensayada de aproximadamente 110 nmol/kg. Los compuestos preferidos de la invención, ensayados dentro de los parámetros de este ensayo, son capaces de restaurar la BMD y la BMC a los niveles de control de vehículo falso, al tiempo que tienen igualmente una relación de Dosis hipercalcémica/Dosis BMD igual o mayor de aproximadamente 1,0, 2,0, 3,0 ó 4,0, o incluso más preferiblemente, mayor de aproximadamente 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 o mayor. Los compuestos preferidos de la invención, ensayados dentro de los parámetros de este ensayo, son capaces de restaurar la BMD y la BMC a los niveles de control de vehículo falso, al tiempo que igualmente restauran la resistencia biomecánica en uno, dos o tres de los lugares vertebral, tallo medio y cuello femoral a los niveles de control de vehículo falso. Incluso más preferiblemente, los compuestos de la invención, ensayados dentro de los parámetros de este ensayo, son capaces de restaurar la BMD y la resistencia biomecánica en uno, dos o tres de los lugares vertebral, tallo medio y cuello femoral a los niveles de control de vehículo falso, al tiempo que tienen igualmente una relación de Dosis hipercalcémica/Dosis BMD igual o mayor de aproximadamente 1,0, 2,0, 3,0 ó 4,0, o incluso más preferiblemente, igual o mayor de aproximadamente 5,0, 6,0, 7,0, 80, 9,0, 10,0 o mayor.
El compuesto con la SEC ID NO:4 con mPEG de 2 kD (p.mol. promedio) alcanza la resistencia del nivel de control de vehículo falso a una dosis de 11 nmol/kg para sitios vertebral, tallo medio y cuello femoral, en la ausencia de hipercalcemia a la dosis la más alta ensayada. En consecuencia, este compuesto tiene una relación de Dosis hipercalcémica/Dosis BMD de >10 para los tres sitios. De manera similar, la SEC ID NO:1 con mPEG de 2 kD restaura la resistencia vertebral y cuello femoral a los niveles de control de vehículo falso a una dosis de 11 nmol/kg, en la ausencia de hipercalcemia a la dosis la más alta ensayada y, en consecuencia, tiene una relación de Dosis hipercalcémica/Dosis de resistencia biomecánica de >10 para estos dos sitios. Estos datos indican que la secuencia de la cadena principal péptida de un compuesto de la invención, así como el sitio del mPEG conjugado con la cadena principal péptida del compuesto, contribuye a la eficacia esquelética (tal como se refleja por las mediciones d BMD, BMC y de resistencia) del compuesto.
TABLA 3
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TABLA 3 (continuación)
13
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La Tabla 4 más adelante establece las relaciones de interés obtenidas a partir de valores en la Tabla 3. Los compuestos preferidos de la invención tienen una relación Dosis hipercalcémica/Dosis DMB vertebral lograda dentro de los parámetros del ensayo de aproximadamente 1,0 o mayor, más preferiblemente igual o mayor de 3, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Los compuestos preferidos de la invención tienen una relación Dosis hipercalcémica/Dosis BMC vertebral lograda dentro de los parámetros del ensayo de aproximadamente 3,0 o mayor, más preferiblemente mayor de 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Los compuestos preferidos de la invención tienen una relación Dosis hipercalcémica/Dosis de resistencia vertebral lograda dentro de los parámetros del ensayo de aproximadamente 1,0 o mayor, más preferiblemente mayor de 3, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Los compuestos preferidos de la invención tienen una relación Dosis hipercalcémica/Dosis de resistencia de tallo medio lograda dentro de los parámetros del ensayo de aproximadamente 1,0 o mayor, más preferiblemente mayor de 3, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Los compuestos preferidos de la invención tienen una relación Dosis hipercalcémica/Dosis de resistencia de cuello femoral, lograda dentro de los parámetros del ensayo, de aproximadamente 3,0 o mayor, más preferiblemente mayor de 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o mayor.
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TABLA 4
14
TABLA 4 (continuación)
15
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Ejemplo 5
Un compuesto de la invención con la SEC ID NO:1, en el que el mPEG al cual está conjugado es un mPEG de 2 kD, se comparó directamente con un compuesto de la invención con la SEC ID NO:1, en el que el mPEG al cual está conjugado es un mPEG de 5 kD. Las ratas ovariectomizadas osteopénicas viejas se las permitió que perdieran masa ósea durante un mes antes de la dosificación (nmol/kg tal como en la Tabla 5 y 6) cada 6 días con vehículo solamente, o el compuesto de la SEC ID NO:2 pegilado con 2 kD o el compuesto de la SEC ID NO:1 pegilado con 5 kD durante 8 semanas. La Tabla 5 muestra los valores de calcio en suero promedio (mg/dl) 24 horas después de la dosificación. La Tabla 6 muestra la BMD promedio (mg/cc).
Los animales dosificados con cualquier compuesto tenían niveles de calcio en suero normales 24 horas después de la dosificación. Sin embargo, el compuesto con el mPEG de 2 kD tuvo menos efecto sobre el calcio en suero al tiempo que exhibió mejor eficacia esquelética BMD a dosis baja, media y alta de lo que mostró el compuesto con el mPEG de 5 kD. Estos datos demuestran que el compuesto pegilado con 2 kD es similar al compuesto pegilado con 5 kD en cuanto a la eficacia esquelética al tiempo que tiene menores efectos de calcio en suero.
TABLA 5 Calcio en suero (mg/dl)
16
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TABLA 6 BMD vertebral (mg/cc)
17
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Ejemplo 6 PTH(1-34) en ratas ovariectomizadas osteopénicas viejas
Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley ovariectomizadas de seis meses de edad, bajo un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad a 22ºC con acceso ad libitum a alimento (TD 89222 con Ca al 0,5% y P al 0,4%, Teklad, Madison, WI) y agua. Las ratas ovariectomizadas se dejaron que perdieran masa ósea durante 1 mes, antes de tratamiento con rhPTH(1-34) durante los siguientes 3 meses. Las ratas ovariectomizadas osteopénicas viejas se inyectaron subcutáneamente, semanalmente, con 0, 10 ó 30 \mug/kg de PTH(1-34) humano. Se inyectaron controles falsos y Ovx con el vehículo solamente. Las vértebras lumbares se extirparon a la necropsia y se analizaron mediante micro-CT (Stratec) y, a continuación, se prepararon para ensayo biomecánico. Se evaluó la resistencia en Newtons (N) cargando las muestras hasta la rotura. La importancia con respecto a los controles de vehículo Ovx se indica mediante * en la Tabla 7 más adelante (Fishers PLSD, P<0,05). Los datos del modelo se proporcionan en la Tabla 7 más adelante.
Con relación a los controles de vehículo Ovx, la PTH(1-34) no tiene efecto significativo hasta 30 ug/kg (7 nmol/kg) sobre la BMD vertebral o la resistencia biomecánica vertebral en ratas ovariectomizadas osteopénicas después de 12 semanas de tratamiento. El calcio en suero es normal cuando se midió aproximadamente 24 horas después de la última dosis. En comparación con los datos mostrados en la presente memoria más adelante, los compuestos de la presente invención tienen BMD vertebral y resistencia vertebral biomecánica superior con respecto a la PTH(1-34) semanal.
TABLA 7 Eficacia esquelética de dosificación semanal de PTH(1-34)
18
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Ejemplo 7 Internalización del receptor PTH
Las cinéticas de internalización del PTHR1 (Receptor 1 de PTH) para los compuestos de la invención se determinaron después de la unión de ligandos a receptores de membrana. Las células HEK 293 se transfectaron con plásmido PTHR-emGFP (Invitrogen).
Las células sembraron a una concentración de 7.000 células/pocillo, 100 \mul/pocillo en placa de 96 pocillos, negra, de fondo claro recubierta con poli-D lisina. 24 horas después de sembrarlas en la placa de 96 pocillos, las células se dosificaron con 10 \mul de un compuesto a ensayar, a las concentraciones finales de 100 nM en puntos de tiempo distribuidos aleatoriamente desde 0 minutos hasta 3 horas. El medio se aspiró al llegar al punto final de dosificación. Las células se fijaron con 100 \mul de Prefer (Anatech, Battle Creck, ML) durante 30 minutos. El Prefer se aspiró de las células, y las células se lavaron tres veces con 100 \mul de 1X PBS. Las células se tiñeron con 100 \mul de tinte nuclear Hoechst diluido (diluido en 1X PBS) durante 30 minutos. El tinte Hoechst se aspiró y reemplazó con 1X PBS. Las placas se almacenaron en la oscuridad a 4ºC hasta su escaneado. Las células se escanearon dentro de las 48 horas usando un Cellomics® ArrayScan. Los datos representativos procedentes de diversos puntos de tiempo establecidos como por ciento de vehículo de control únicamente (línea basal = 100%), se presentan la Tabla 8.
TABLA 8
19
Estos datos muestran que los compuestos de la invención tienen cinéticas de internalización marcadamente diferentes de la PTH(1-38), dependiendo de la secuencia de la cadena principal péptida, tanto esté pegilado como no, y del tamaño del PEG. Es de señalar que las moléculas no pegiladas tienen la cadena principal de la Secuencia nombrada con la excepción de que existe un resto lisina en la posición 26. Las cinéticas de internalización más lentas indican una proporción reducida de internalización del receptor PTHR1 cuando se forman complejos ligando-receptor PTHR1 que usan compuestos de la invención, dando como resultado una magnitud superior de señalización en la célula después de la unión del ligando. Esto es probablemente parte de la explicación de la eficacia esquelética mejorada observada para las formas de compuestos de la invención con PEG de 2 kD con dosificación semanal sobre la observada con dosificación de PTH semanal.
<110> Eli Lilly and Company
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<120> MODULADORES DEL RECEPTOR PTH PEGILADO Y USOS DE LOS MISMOS
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<130> X7107
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCTUS0780367
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<141> 04-10-2007
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.4
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<210> 1
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<211> 34
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> CONSTRUCTO SINTETICO
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<220>
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<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (26)..(26)
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<223> Xaa en la posición 26 es una lisina modificada
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<220>
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<221> MOD-RES
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<222> (34)..(34)
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<223> Amidación
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<400> 1
20
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<210> 2
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<211> 31
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> CONSTRUCTO SINTETICO
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<220>
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<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (8)..(8)
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<223> Xaa en la posición 8 es norleucina
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<220>
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<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (18)..(18)
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<223> Xaa en la posición 18 es norleucina
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<220>
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<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 26 es una lisina modificada
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<220>
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<221> MOD-RES
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<222> (31)..(31)
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<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
21
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<210> 3
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<211> 34
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<212> PRT
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> CONSTRUCTO SINTETICO
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<220>
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<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (26)..(26)
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<223> Xaa en la posición 26 es una lisina modificada
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> MOD-RES
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<222> (34)..(34)
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<223> Amidación
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
22
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> CONSTRUCTO SINTETICO
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<220>
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<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (8)..(8)
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<223> Xaa en la posición 8 es norleucina
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<220>
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<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 18 es norleucina
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<220>
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<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 26 es una lisina modificada
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<220>
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<221> MOD-RES
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<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es norleucina
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<220>
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<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 18 es norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (26)..(26)
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<223> Xaa en la posición 26 es una lisina modificada
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> MOD-RES
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<222> (34)..(34)
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<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es Met si Xaa en la posición 18 es también Met; o Xaa en la posición 8 es norleucina si Xaa en la posición 18 es también norleucina
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es Met si Xaa en la posición 18 es también Met; o Xaa en la posición 8 es norleucina si Xaa en la posición 18 es también norleucina
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 26 es una lisina modificada
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> MOD-RES
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<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Amidación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Modificada con FMOC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede estar o no amidada
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 18 es norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede estar o no amidada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-REVS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede estar o no amidada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 18 es norleucina
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede estar o no amidada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CONSTRUCTO SINTETICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MSC-CARACTERISTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MSC-CARACTERISTICA
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<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 18 es norleucina
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<220>
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<221> MOD-RES
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<222> (34)..(34)
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<223> Puede estar o no amidada
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
31

Claims (15)

1. Un compuesto con la secuencia de:
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32
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en la que Xaa_{8} y Xaa_{18} son Met o Xaa_{8} y Xaa_{18} son Nle; y en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un compuesto de la reivindicación 1 que tiene la secuencia de aminoácidos:
\vskip1.000000\baselineskip
33
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un compuesto de la reivindicación 1 que tiene la secuencia de aminoácidos:
\vskip1.000000\baselineskip
34
\newpage
4. Un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por:
a)
35
\vskip1.000000\baselineskip
b)
36
\vskip1.000000\baselineskip
y
c)
37
en el que mPEG es monometoxi-polietileno glicol con un peso molecular promedio de desde 1500 hasta 5500 Daltons; o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, en el que mPEG tiene un peso molecular promedio de desde 2000 hasta 5000 Daltons.
6. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, en el que mPEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2000 Daltons.
7. Un producto intermedio con una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por la SEC ID NOs: 8-12.
8. Una composición que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; en combinación con un vehículo, diluyente o excipiente aceptable farmacéuticamente.
9. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para uso en terapia.
10. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para uso en la inducción de la formación ósea en un mamífero.
11. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para uso en el tratamiento de una enfermedad o estado en el cual una nueva formación y/o incremento en la masa ósea y resistencia biomecánica ósea sería beneficiosa en un mamífero, incluyendo la osteoporosis, osteopenia, fractura ósea, fusión espinal, implantes óseos, implantes de articulaciones, implantes dentales, y enfermedad periodontal.
12. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para uso en el tratamiento de la osteoporosis en un mamífero.
13. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para uso en la prevención de la osteoporosis o la osteopenia en un mamífero.
14. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, para uso en el tratamiento de una fractura ósea en un mamífero.
15. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 en el que el mamífero es un ser humano.
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