CN101522709B

CN101522709B - 作为pth受体调节剂的聚乙二醇化的pth及其用途

Info

Publication number: CN101522709B
Application number: CN2007800382095A
Authority: CN
Inventors: P·L·布朗-奥格斯布格尔; W·D·科恩
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2006-10-13
Filing date: 2007-10-04
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2027-10-04
Also published as: AU2007313001B2; EP2084183A1; AU2007313001A1; KR101108354B1; NO341986B1; WO2008048784A1; BRPI0719885B1; US7820179B2; JP2010506844A; KR20090067168A; EA014696B1; BRPI0719885B8; US20090253630A1; PL2084183T3; DK2084183T3; SI2084183T1; ATE469173T1; CN101522709A; CA2672907C; CA2672907A1

Abstract

本发明提供了用于在哺乳动物中治疗和预防骨损失疾病(包括骨质疏松症)的药物组合物和方法。

Description

作为PTH受体调节剂的聚乙二醇化的PTH及其用途

本专利申请要求2006年10月13日提交的美国临时专利申请No.60/829,383的优先权。

发明领域

本发明涉及甲状旁腺激素受体(PTHR)调节剂化合物以及制备和使用它们的方法。

发明背景

骨退行性疾病，例如，骨质疏松症，发生于相当部分的老年人群体中。骨质疏松症包括不同种类的病症，它们导致了骨折的巨大风险以及对保健系统的相当大的负担。每年为了治疗骨质疏松症，在医疗保健上花费数十亿美元。临床上，骨质疏松症的特征在于变少的骨物质(bone mass)、减少的骨矿物质密度(BMD)和骨矿物质含量(BMC)以及骨结构的丧失，导致骨强度减少，骨折风险增加。

虽然大量抗吸收剂(包括降钙素、二膦酸盐、雌激素和SERM)预防了进一步的骨损失，但是一旦发生骨损失，它们也无法对骨加以重建。FDA批准的第一种用于治疗骨质疏松症的合成代谢骨建造剂是人PTH(1-34)，其也被称为特立帕肽，其作为商品名FORTEO

(伊莱利利公司(Eli Lillyand Company)，Indianapolis，IN)市售。PTH或PTH(1-34)被认为是通过受体介导的、对通过(1)腺苷酸环化酶和蛋白激酶A以及(2)磷脂酶C和蛋白激酶C的两条细胞内信号传导途径的活化来施加其作用的。PTH(1-34)建造骨物质，恢复骨结构，并且降低处于骨折高风险中的骨质疏松症患者脊椎和非脊椎骨折的风险(R.Neer，NEJM，344：1434，2001)。作为肽产品，PTH(1-34)需要每天皮下注射。国际公开号WO2004/060386公开了一大类PTH/PTHrP调节剂，其中包含能导致比PTH(1-34)更强的高钙血应答的运载体(vehicle)。

人们仍有对新颖的、治疗用的PTH类似物的需要，所述类似物展示出由增加的骨矿物质含量(BMC)和/或骨强度所反映出来的骨建造效果，同时优选保持与目前的PTH(1-34)治疗剂类似或更少的高钙血作用，并且仅需要比PTH(1-34)更少频次的施用。本发明的化合物满足这些需求，并且提供了相关优点。

发明内容

本发明的聚乙二醇化(pegylated)的化合物是具有选自下述的序列的化合物或其可药用盐：

a)Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg

Asp Val His Asn Phe-NH₂(SEQ ID NO：1)，

b)Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu ArgVal Glu Trp LeuArg

Gln Glu Val-NH₂(SEQ ID NO：2)，

c)Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg

Asp Val His Asn Phe-NH₂(SEQ ID NO：3)，

d)SerVal Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg Asp Val His Asn Phe-NH₂(SEQ ID NO：4)，和

e)Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg

Glu Val His Gln Phe-NH₂(SEQ ID NO：5)；

其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

在一种优选的实施方式中，本发明提供了具有下述序列的化合物或其可药用盐：

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg

Asp Val His Asn Phe-NH₂(SEQ ID NO：1)，

在另一种优选的实施方式中，本发明提供了具有下述序列的化合物或其可药用盐：

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg

Gln Asp Val His Asn Phe-NH₂(SEQ ID NO：4)，

在一种实施方式中，本发明提供了具有下述序列的化合物或其可药用盐，

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa₈ His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Xaa₁₈ Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg

Asp Val His Asn Phe-NH₂(SEQ ID NO：6)

其中，Xaa₈和Xaa₁₈是Met，或者，Xaa₈和Xaa₁₈是Nle；并且，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

在一种实施方式中，本发明提供了具有选自下述的序列的中间物或其C-末端酰胺的中间物，所述组由构成：

a)Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe(SEQ ID NO：8)，

b)Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Glu Val(SEQ ID NO：9)，

c)Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe(SEQ ID NO：l0)，

d)Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His Asn Phe(SEQ ID NO：11)，和

e)SerVal Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala SerNle Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Glu Val His Gln Phe(SEQ ID NO：12)。

本发明提供了在哺乳动物中诱导骨形成的方法，所述方法包括向需要此类治疗的哺乳动物施用有效量的SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

本发明提供了在哺乳动物中治疗下述疾病或病况的方法，所述疾病或病况中，新的骨形成和/或骨物质和骨生物机械强度增加将是有利的，所述疾病或病况包括骨质疏松症、骨质减少、骨折、脊柱融合、骨移植、关节移植、牙移植以及牙周病，所述方法包括向需要此类治疗的哺乳动物施用有效量的SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

本发明提供了在患者中治疗骨质疏松症或骨质减少的方法，所述方法包括向需要此类治疗的患者施用有效量的SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

本发明还提供了在哺乳动物中预防骨质疏松症或骨质减少的方法，所述方法包括向需要此类预防的哺乳动物施用有效量的SEQ ID NO：1、2、 3、4、5或6的化合物或其可药用盐，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

本发明提供了在患者中治疗骨折的方法，所述方法包括向需要此类治疗的患者施用有效量的SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

在一种实施方式中，本发明提供了药物制剂，其包含组合有可药用载体、稀释剂或赋形剂的SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

在一种实施方式中，本发明提供了用于治疗的SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

在一种实施方式中，本发明提供了用于在哺乳动物(优选地，人)中诱导骨形成的SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

在一种实施方式中，本发明提供了SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿，所述化合物或其可药用盐用于在哺乳动物(优选地，人)中治疗下述疾病或病况，所述疾病或病况中，新的骨形成和/或骨物质和骨生物机械强度增加将是有利的，所述疾病或病况包括骨质疏松症、骨质减少、骨折愈合、脊柱融合(spinal fusion)、骨移植、关节移植、牙移植以及牙周病。

在一种实施方式中，本发明提供了用于在哺乳动物(优选地，人)中治疗骨质疏松症的SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

在一种实施方式中，本发明提供了用于在哺乳动物(优选地，人)中预防骨质疏松症的SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

在一种实施方式中，本发明提供了用于在哺乳动物(优选地，人)中治疗骨折的SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

本发明提供了SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐用于制备用于治疗能被骨形成的诱导改善或预防的疾病或病况的药物的用途，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

本发明提供了SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐用于制备下述药物的用途，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿，所述药物用于在哺乳动物(优选地，人)中治疗下述病况，所述病况中，新的骨形成和/或骨物质和骨生物机械强度增加将是有利的，所述病况包括骨质疏松症、骨质减少、骨折愈合、脊柱融合、骨移植、关节移植、牙移植以及牙周病。

本发明还提供了SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐用于制备用于在哺乳动物(优选地，人)中治疗骨质疏松症的药物的用途，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

本发明还提供了SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐用于制备用于在哺乳动物(优选地，人)中预防骨质疏松症或骨质减少的药物的用途，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

本发明还提供了SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的化合物或其可药用盐用于制备用于在哺乳动物(优选地，人)中治疗骨折的药物的用途，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为大约2000道尔顿。

发明详述

骨形成在胎儿发育和新生后成长期间发生，还在成年期间或者以低速率作为正常骨重塑(remodeling)的一部分或者以加速的速率应答于受伤或不正常的骨损失而发生。骨形成涉及多种过程，包括成骨细胞祖细胞(progenitor cells)增殖、成骨细胞从祖细胞分化以及成骨细胞产生的基质的矿化。术语“诱导骨形成”或“诱导新骨形成”被用来表示骨物质的净增加(例如，骨矿物质含量(“BMC”)的增加所展示的)和/或骨生物机械强度的净增加，如用本文实施例4B的方法测定的。

术语“有效量”在本文中使用时是实现想要的药理学作用所必需的本发明化合物的剂量。

术语“体外活性”指本发明的化合物在一种或多种合适的体外测定中的活性，包括，例如，在基于细胞的测定中活化PTH受体的能力。活性可被表示为“EC₅₀”，其表示在所选用的测定中导致最大活化的50％的化合物有效浓度。任何合适的体外测定都可用于测试PTH受体的结合和活化，包括腺苷酸环化酶的活化，导致环状AMP(cAMP)水平增加(见本文实施例3)。本发明的化合物具有可变的激动活性，导致细胞内cAMP增加。

mPEG(单甲氧基聚乙二醇)典型形式是具有末端羟基的线性聚合物，其具有式CH₃O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH，其中，n是大约8至大约4000。用于本发明的mPEG具有1500至5500道尔顿的平均分子量，更优选地，大约2000至5000道尔顿，更优选地，大约2000至2300道尔顿，进一步更优选地，大约2000道尔顿。可商业获得的mPEG试剂(例如，NOFSUNBRIGHT

ME-020AS)通常具有一定程度的多分散性(polydispersity)，这意味着“n”以差不多高斯分布的形式在某范围上变动，优选地，在窄范围上变动。末端的氢通常可被末端基团(例如烷基或芳族基)取代。虽然在mPEG分子中，末端的氢被甲氧基取代，但是末端的氢也可以被线性或带支链的长度不同的碳链，例如，多至10碳链所取代，这仍在本发明的范围内。

具有SEQ ID NO：8-12所示的序列的化合物可作为中间物用于对本发明的聚乙二醇化的化合物的合成中。优选地，具有SEQ ID NO：8-12所示的序列的化合物在化合物的羧基末端是酰胺的形式。

术语“接头”、“接头部分”或“间隔区”在本文中用来表示任选用于连接相连的部分(例如聚合物片断和肽的末端)的原子或原子集合。接头部分是整个聚合物的一部分，其含有反应性部分，以允许与肽上的相互反应性位点共价连结(attachment)。

术语“缀合的”(或可互换使用的“缀合肽”)在本文中被用来表示通过肽与PEG分子的共价连结形成的异源分子。

术语“共价连结”表示肽和聚乙二醇分子直接互相共价相连或者经由一个或多个间插部分(例如接头、接头部分或间隔区)间接互相共价相连。

本发明的聚乙二醇化的化合物可与多种无机和有机酸或碱中的任何反应，形成可药用盐。优选的可药用盐是与乙酸、柠檬酸和氢氯酸形成的那些。尤其优选的是化合物SEQ ID NO：1、2、3、4或5的乙酸盐，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇，优选为大约2000至5000道尔顿，更优选为2000道尔顿。制备本发明化合物的可药用盐的方法是本领域技术人员公知的(见：Stahl等人，“Handbook ofPharmaceutical Salts：Properties，Selection and Use，”VCHA/Wiley-VCH(2002)和Berge等人，Journal of Pharmaceutical Sciences，66：1-19，1977)。

骨退行性疾病，例如骨质疏松症，特征在于变少的骨物质、减少的BMD以及骨结构的损失，导致骨强度减少，骨折风险增加。本发明的聚乙二醇化的化合物可建造骨物质、增加骨生物机械强度、恢复骨结构以及降低处于骨折高风险的骨质疏松症患者脊椎和非脊椎骨折的风险。因此，本发明的聚乙二醇化的化合物可用作为骨建造剂，以治疗或预防骨退行性疾病，例如骨质疏松症。此外，本发明的聚乙二醇化的化合物可用作为骨建造剂，以增强骨折复原以及在骨移植、关节移植或牙移植的位置刺激骨生长，或者用于治疗牙周病。

合适的患者包括患有骨损失病况或骨创伤(例如骨折)的男性、女性和儿童，其中，新的骨形成、骨物质增加和/或骨生物机械强度的增加将是有利的。例如，本发明的化合物可作为下述手段来施用，所述手段诱导骨形成和/或增加骨物质和强度，由此降低处于此类骨折风险的患者(包括患有骨质疏松症或骨质减少的患者，例如，具有年龄相关的骨质疏松、类固醇诱导的骨质疏松、经绝后骨质疏松、特发性骨质疏松，以及原发性或继发性骨质疏松症的患者)的脊椎和非脊椎骨折的风险。非脊椎位置包括，例如，髋、前臂、肱骨、胫骨、桡骨、踝、肋骨、足、骨盆和股骨。

本发明的聚乙二醇化的化合物还可施用给患者，以增强或加速脊椎和/或非脊椎骨折复原，例如，在遭受创伤导致骨折的(例如，由于意外事故或运动受伤)患者或遭受与低骨物质相关的脆弱性骨折的患者(包括髋、前臂、肱骨、胫骨、桡骨、踝、肋骨、足、骨盆和股骨)中。

化合物合成

本发明的化合物可按照下述流程来制备，所述流程是针对合成具有SEQ ID NO：1的化合物而示例的：

H2N-Rink酰胺聚苯乙烯树脂

Fmoc-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Arg-His-Leu-Ala-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe(SEQ ID NO：7)-Rink酰胺树脂(侧链保护基：用于Lys和Trp的Boc；用于Arg的Pbf；

用于Ser、Asp和Glu的tBu；用于Gln、His和Asn的Trt)

Fmoc-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Arg-His-Leu-Ala-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-NH₂(SEQ IDNO：7)

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Arg-His-Leu-Ala-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg

-Asp-Val-His-Asn-Phe-NH₂(SEQ ID NO：1)

可使用标准的人工或自动固相合成流程来合成本发明的化合物的肽链。自动肽合成仪可从例如应用生物系统公司(Applied Biosystems)(FosterCity，CA)和蛋白质技术有限公司(Protein Technologies Inc.)(Tucson，AZ)商业获得。用于固相合成的试剂易于从商业来源获得。可按照厂商说明书使用固相合成仪，以封闭干扰基团、在反应期间保护氨基酸、偶联、脱保护以及对未反应的氨基酸加帽。

通常，在存在偶联剂(例如二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt))的情况下，于室温下在惰性溶剂(例如二甲基甲酰胺、 N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷)中，将N^α-氨甲酰基保护的氨基酸和在与树脂连结的生长肽链上的N-末端氨基酸偶联起来。使用三氟乙酸(TFA)或哌啶等试剂将N^α-氨甲酰基保护基从得到的肽树脂上除去，并且用将要加入到肽链上的下一个想要的N^α-保护的氨基酸重复偶联反应。合适的胺保护基是本领域公知的，其被描述于，例如Green和Wuts，″ProtectingGroups in Organic Synthesis″，John Wiley和Sons，1991中。最常用的例子包括tBoc和芴甲氧羰基(Fmoc)。合成完成之后，使用标准处理方法，在酸性条件下将肽从固相支持物上切割下来同时进行侧链脱保护。

本领域技术人员将知道，可以用C-末端游离酸或氨甲酰来合成本发明的化合物的肽链。用于合成的衍生化聚苯乙烯树脂的类型将决定切割之后的C-末端部分。大量接头都是本领域公知并且常规使用的。对于合成C-末端酰胺肽来说，掺入有Rink酰胺MBHA或Rink酰胺AM接头的树脂一般与Fmoc合成一起使用，而MBHA树脂通常与tBoc合成一起使用。为产生C-末端酸肽，通常用2-Chlorotrityl树脂或Wang树脂来进行Fmoc合成，而tBoc合成通常利用PAM树脂。用于将第一个氨基酸装载到树脂上的方法是本领域公知的。

通常，使用反相高效液相色谱(rp-HPLC)在C8或C18柱上纯化粗制的肽，其中使用在0.05至0.1％TFA中的水-乙腈梯度。可以通过分析性rp-HPLC来验证纯度。可以通过质谱来验证肽的身份。可以将肽溶解于宽pH范围的含水缓冲液中。

可使用公知的化学合成反应(见：Roberts等人，Adv.Drug Deliv.Rev.54：459-476(2002)和Veronese，F.M.，Biomaterials 22：405-417(2001))或者按照厂商的推荐，来进行mPEG与肽的缀合。优选地，该流程使用相对于肽来说摩尔过量的聚合物，以驱动反应完成。通过传统分离方法例如rp-HPLC将过量的mPEG试剂与缀合肽产物分开。

用于制备本发明的聚乙二醇化的化合物的缀合化学是肽上的氨基和mPEG羧化物活化的例如NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯之间酰胺键的形成。mPEG和肽之间的接头是CO-CH₂(羧甲基)。本发明的肽序列被设计为含有单Lys侧链，以允许用即将引入的mPEG-NHS酯进行的选择性反应。通常，这还涉及用保护基(例如Fmoc或三氟乙酰基)对氨基末端的衍生化，保护基随后再被除去。备选地，氨基末端可被保持为未被保护的，可在最优pH和溶剂条件下获得对Lys侧链的部分选择性酰化(见，美国专利No.5,646,242)。优选用mPEG-NHS酯衍生物和N-末端经Fmoc保护的肽(含有单个Lys(或其它含胺的氨基酸))在pH 9至10的含水混合物中于室温下进行酰胺缀合，进行20至60分钟。缀合之后，回收想要的缀合肽，通过传统分离方法例如rp-HPLC进行纯化。

组合物

本发明的聚乙二醇化的化合物可被掺入适于施用给受试者(特别是人)药物组合物中。本发明的聚乙二醇化的化合物可单独施用，或与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂组合施用。特别地，本发明的聚乙二醇化的化合物可以在0.9％NaCl、3mg/ml甘露醇、pH 5中的20mM NaH₂PO₄的运载体中施用。用于施用的组合物被设计为适于所选用的施用模式，并且根据需要使用可药用稀释剂、载体和/或赋形剂，例如分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等张剂、稳定剂等。按照例如Remington，The Scienceand Practice of Pharmacy，第19版，Gennaro，编著，Mack Publishing Co.，Easton，PA 1995(其提供了配制技术的纲要，这也是操作者通常已知的)中所述的传统技术来设计所述组合物。

可使用标准施用技术，包括静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用，来将包含本发明的聚乙二醇化的化合物的组合物施用给展示出本文所述的病理或有这种风险的受试者。

本发明聚乙二醇化化合物的施用途径可以是肠胃外、口服或通过吸入或透皮递送。优选地，本发明的聚乙二醇化的化合物可掺入到适于肠胃外施用的药物组合物中。术语肠胃外在本文中使用时包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道或腹膜内施用。通过静脉内或腹膜内或皮下注射进行的外周全身性递送是优选的。

本发明的聚乙二醇化化合物可作为气雾剂施用用于治疗目的，其将用吸入器具来施用，并且含有本发明的化合物。气雾剂和合成其的方法是本领域描述过的。

本发明的聚乙二醇化的化合物可规律施用，例如，每日一次或每周一次。备选地，本发明的聚乙二醇化的化合物可例如每周两次或每周三次施用。备选地，本发明的化合物可循环施用(例如，在数日或数周期间规律施用，接着一段时间不施用)。优选地，本发明的聚乙二醇化的化合物在3个月至3年范围内的时间段每周施用一次。

通常，组合物必须是无菌的，并且在生产条件和在提供的容器(例如，密封的小瓶或注射器)中储藏条件下是稳定的。因此，可在制备制剂之后对组合物进行灭菌过滤，或者使其在微生物方面是可接受的。对于肠胃外施用而言，本发明化合物的典型剂量范围是每周大约1μg至每周大约10mg。优选地，人类剂量在每周5μg至每周大约1000μg的范围内。更优选地，剂量范围是每周10μg至每周1000μg，包括每周一次施用10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg或100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、500μg、750μg或1000μg。虽然这些剂量范围是以每周的单位示出的，但是应当考虑到可以使用其它时间间隔。

可对建议的这些化合物的量加以大的治疗考量。选择合适剂量和日程的关键因素是获得的临床结果。本文上下文考虑的因素包括被治疗的特定病症、被治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床条件、病症的原因、递送化合物的位点、施用方法、施用的日程以及医师已知的其它因素。

本发明的治疗剂可被冷冻或冻干，以备储藏，在使用前可在合适的无菌载体中对其加以重构。冻干和重构可导致化合物活性不同程度的损失。必须对剂量加以调整以予补偿。通常，制备物的pH在4至8之间是优选的。

本发明的化合物可单独施用，或者可与其它物质组合，其它物质例如骨抗吸收剂，包括降钙素、二膦酸盐、SERMs(例如雷洛昔芬(raloxifene))，激素替代疗法(HRT)，钙，维生素D1，维生素D2，维生素D3，维生素D4和雌激素。本发明的化合物可与另一物质共同施用。备选地，本发明的化合物可与另一物质顺序施用，例如，本发明的化合物在一周至一年的时间里单独施用，接着施用另一种物质，其可与所述化合物一起施用或者在不存在所述化合物时施用。

产品

在本发明的另一实施方式中，提供了含有可用于治疗或预防上文所述的疾病或病况的材料的产品。产品包含容器和标签。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器、笔(pen)、吸入器、贴膏和试管。容器可用多种材料(例如玻璃、金属或塑料)制成。容器装纳可有效预防或治疗疾病或病况的本发明化合物，并且可具有无菌的进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子)。容器中的活性物质是本发明的组合物。容器上或与之相关的标签指示组合物用于治疗所选择的病况。产品还可包含第二容器，其包含可药用缓冲液，例如磷酸缓冲的盐溶液、Ringer’s溶液和葡萄糖(dextrose)溶液。其还可包括从商业和使用者角度来看所想要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和指导使用的包装说明书。

下述实施例仅为阐述目的提供，其并非意欲以任何方式限制本发明的范围。

具体实施方式：

实施例1：肽合成

在Rapp AM RAM Fmoc-酰胺聚苯乙烯树脂(Rapp PolymereTubingen，德国)(取代0.6至0.7mmol/g)上进行肽合成。使用Fmoc主链保护基策略来进行合成。此外，是芳香性、酸性、碱性或高度极性的任何氨基酸侧链都可能是反应性的。它们也必需被保护起来以阻止不想要的支链的形成。这种方式有四种主要的基团使用：tBoc(叔丁氧羰基)，用于Lys和Trp；Pbf(2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)，用于 Arg；tBu(叔丁基)，用于Ser、Asp和Glu；Trt(三苯基甲基)，用于Gln、His和Asn。使用的氨基酸侧链衍生物是：Arg(Pbf)、Asn(Trt)、Asp(OtBu)、Cys(Trt)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、His(Trt)、Lys(Boc)、Ser(OtBu)、Trp(Boc)。用大约10个当量的、经二甲基甲酰胺(DMF)中的二异丙基碳二亚胺(DIC)和羟基苯并三唑(HOBt)(1∶1∶1的摩尔比)活化的氨基酸在二甲基甲酰胺(DMF)中来进行偶联。氨基酸1位上的Fmoc保护基适当留下，以允许对赖氨酸侧链进行选择性缀合(见下文的实施例2)。

在含有三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶甲醇∶茴香醚(90∶5∶2.5∶2.5)的溶液中，从树脂上进行伴随切割以及除去侧链保护基，这在室温下进行1.5至2小时。从Rink酰胺树脂上切下肽，产生肽的C-末端氨甲酰形式。用二乙醚来沉淀肽，将其重新溶解于30-40mL 10％的乙腈中，在C₁₈反相HPLC柱上纯化，其中使用线性AB梯度(A＝0.05％TFA/水，B＝0.05％TFA/乙腈)，流速为12-15mL/分钟。所使用的柱是Waters SymmetryPrep 7um，19×300mm或Kromasil 10um，22×250mm。在具有单个四极MS检测器的Agilent 1100Series LC-MS系统上验证肽纯度和分子量。在ZorbaxEclipse XDB-C8，5微米，4.6mm i.d.×15cm柱上进行分析性HPLC分离，其使用线性AB梯度：10至100％的B，进行15分钟，其中A＝0.05％TFA/H₂O，B＝0.05％TFA(在60∶40CH₃CN∶H₂O中)，流速为1ml/分钟。所有的肽都被纯化至＞95％的纯度，并且经验证具有对应于其计算值的分子量(在1amu以内)。

实施例2：肽缀合

将在适当的位置具有N-末端Fmoc基团的未缀合的肽溶解于1mL水/乙腈50/50(36.8mg，4272.9g/mol，0.0086mmol)中。称出1.5至2倍摩尔过量的mPEG-2kDa NHS酯(NOF Sunbright ME-020AS)(39.7mg，2280平均MW，0.017mmol)。用2mL 40mM的溴酸钠(pH 9.8)缓冲液和2mL乙腈来稀释肽溶液，然后加入进mPEG溶液。对得到的混合物加以涡旋，然后在室温下搅拌。通过分析性反相HPLC来监测反应混合物(方法如实施例1所述)，通常，20至30分钟反应时间后，显示出肽峰的完全消失(大约14.5分钟时)以及肽-PEG缀合物的峰出现(大约15.7分钟时)。在干冰上冷却混合物，加入2mL哌啶，以除去N-末端Fmoc基团。在室温下对混合物搅拌30分钟，然后在干冰上冷却，用2mL冰醋酸中和(终pH＝大约6-7)。现在应当有一个峰出现于在大约13.2分钟出现于分析性HPLC，这是由于哌啶-芴加合物导致的，以及有一个峰在大约14.25分钟，这是由于脱保护的肽-mPEG缀合物导致的。用水将混合物稀释至大约40mL，在Waters SymmetryPrep 7μm，19×300mm或Kromasil 10μm，22×250mm上以12mL/分钟纯化，采用2阶段线性AB梯度：0至30％的B 20分钟，接着是30至80％的B 100分钟，其中A＝0.05％TFA/水，B＝0.05％TFA/乙腈。

将含有产物的合并级分冻干，以获得肽的三氟乙酸盐形式。随后通过本领域已知的流程将产物转化为另一种想要的盐形式。使用基于肽序列的计算得到的摩尔消光系数，通过280nm处的UV吸光度来对经纯化的肽加以定量。缀合物的平均MW是(平均PEG-NHS MW+Fmoc-肽MW-Fmoc MW-NHS MW)＝2280+4273-115-222＝6216。对于使用了36.8mg未经缀合的肽的实施例而言，可以获得34.8mg的聚乙二醇化的肽。基本按照上文所述，来进行其中使用了mPEG-NHS酯的本发明所述的其它肽的缀合。

下面实施例中的所有数据都使用了这样的本发明化合物，其是C-末端酰胺肽(在本发明的肽主链的第26位Lys残基上经mPEG缀合)以及是三氟乙酸盐(见例如，SEQ ID NO：1-5)。

实施例3：对cAMP诱导的体外测定

将SaOS-2骨肉瘤细胞以5×10⁵个细胞/mL重新悬浮于刺激缓冲液[1M HEPES/10％BSA/250μM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，MPBiomedicals)/HBSS]中。在96孔黑半区域(black half-area)测定板(Costar公司)中每孔加入20μL/孔的细胞悬浮液，产生1×10⁴个细胞/孔。然后立即向细胞中加入20μL经稀释的测试化合物(例如，本发明的PTH类似物，n＝2)。测试化合物按照1/2对数稀释被制备，在覆盖3μM至0.1nM的滴定范围对其加以测定。在室温下对板进行1小时的孵育。再制备一块单独的96孔测定板，其含有cAMP作为标准曲线。cAMP标准是在刺激缓冲液中按照1/2对数稀释来制备的，其覆盖了400至0.0012p摩尔/孔(40μL/孔)(n＝6)的滴定范围。1小时孵育步骤后，按照厂商的指导，使用HTRF (均相时间分辨荧光)cAMP动力学2试剂盒(Cisbio公司)来测定cAMP。

当基本按照上文所述对下述化合物进行测试之后，发现它们能诱导cAMP产生，如下表所示。这些数据表明，这些化合物具有以并非不同于PTH的方式活化PTH受体(PTHR1)的有效能力。

表1

化合物	平均EC50(nM) (n＝2)
		SEQ ID NO：1，具有2kD mPEG	7.7
SEQ ID NO：2，具有2kD mPEG	2.1
		SEQ ID NO：4，具有2kD mPEG	6.9
SEQ ID NO：5，具有2kD mPEG	2.6

实施例4：对缀合化合物的体外评估

A.骨质减少的、切除卵巢的、年轻成年大鼠

雌性Sprague-Dawley大鼠(大约3月龄)被除去卵巢(除了sham对照之外)，并在22℃保持于12小时的光照/黑暗循环下，并且无限获取食物(TD 89222，含有0.5％Ca和0.4％P，泰克来公司(Teklad)，Madison，WI)和水。令切除卵巢的(Ovx)大鼠经历25天的骨损失，然后称重，并随机分进处理组。通过以不同剂量(如下表2所示)皮下注射本发明的化合物1个月来进行处理，所述化合物处于20mM NaH₂PO₄(在0.9％NaCl，3mg/ml甘露醇，pH 5)的运载体中。每三或四天用化合物对大鼠进行一次注射，至大约每周向人施用一次。仅用运载体处理Sham和Ovx对照(“sham运载体对照”和“ovx运载体对照”)。最后一次注射后大约24小时，在异氟醚(isoflurane)麻醉下，尸检时(最后一次注射后大约24小时)通过心脏穿刺收集血清，使用临床化学分析仪(Hitachi 917，东京，日本)对其加以分析。

在尸检时，取出左股骨，清除软组织，4℃储藏于50％乙醇/盐水中。在室温下，将50％EtOH/盐水中的股骨封进石蜡膜中，放到用于定量计算X射线断层术(QCT)(M研究公司(Research M)，Stratec)的工作台中央。在3D分析之前，先以2D产生股骨远端干骺端的冠状搜索扫描。测量QCT参数，包括骨矿物质密度(BMD，羟磷灰石的mg/ml)、骨矿物质含量(BMC，mg羟磷灰石)和横截面积(mm²)，细节之前描述过(Sato，等人，JPET，272：1252-1259，1995)。

高钙血在本文中被定义为：针对所用的动物类型而言正常的切除卵巢的运载体对照血清钙值的97.5个百分位数以上，这是使用临床化学数据和从心脏穿刺收集的血清(International Federation of Clinical Chemistry，HE Solberg in Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry，第5版，BurtisCA和Ashwood ER，编辑，2001，第251-261页)来进行的。反映97.5个百分位数的值是每dL来自ovx运载体对照的血清有11.2mg的钙。“高钙血剂量”，即，使用从心脏穿刺收集来的血清和临床化学数据，测试化合物注射后24小时观察到高钙血的剂量，这是通过插值，使用回归分析，以拟合在向切除卵巢的大鼠施用化合物后24小时观察到的钙血剂量应答来测定的。

在7.5周期间(3.5周的预处理期加上4周处理期)，相对于sham运载体对照而言，卵巢切除术显著降低了大鼠的BMD(Sato等人J.Med.Chem.42：1-24，1999)。本发明的聚乙二醇化的化合物能在4周处理期结束时将BMD恢复至sham运载体对照水平。对于本发明的优选的聚乙二醇化的化合物而言，在本测定的参数内测试时，将BMD恢复至Sham运载体对照水平所需的剂量(“BMD剂量”)并不比高钙血剂量高。当基本按照上文所述进行测试时，下表2中列出的化合物能在用一定剂量处理四周之后将Ovx大鼠的BMD恢复至sham运载体对照水平；但是，需要类似或更高剂量的化合物来诱导高钙血剂量。影响高钙血剂量/BMD剂量之比的因素包括但可不限于：肽主链的氨基酸序列以及PEG所连结的氨基酸位置。在本测定的参数内测试的本发明优选的化合物具有等于或高于大约1.0的高钙血剂量/BMD剂量比，如下表2所示。

表2

化合物	BMD剂量^＊ (nmole/kg)(μg/kg)	高钙血剂量⁺ (nmole/kg)(μg/kg)	高钙血剂量 /BMD剂量
				SEQ ID NO：1，具有 5kD mPEG	3.7 34.3	＞32.5^＊＊＞300	＞8.8
SEQ ID NO：2，具有 5kD mPEG	6.7 59.8	＞34 ＞300	＞5.1
				SEQ ID NO：4，具有 5kD mPEG	31.8 297.9	＞32 ＞300	＞1.00
SEQ ID NO：5，具有 5kD mPEG	4.4 41.0	＞32.2 ＞300	＞7.3

^＊在测定参数内，将BMD恢复至Sham对照水平的剂量(拟合为回归线并用插值测定的)

+在测定参数内，施用测试化合物后24小时观察到高钙血的剂量(拟合为回归线并用插值测定的)

^＊＊“＞”表示所示剂量是测试的最高剂量，而在该剂量没有达到本文定义的高钙血。

B.骨质缺乏的、切除卵巢的、衰老大鼠

在本实施例中，测定了本发明的聚乙二醇化的化合物将Ovx大鼠的生物机械骨强度、BMD和BMC增加至sham运载体对照水平的能力。化合物对骨生物机械强度的作用预计是比BMD更好的临床疗效预测指标。脊椎BMD有限地预测骨质疏松症疗法降低脊椎骨折发病的临床效果 (Cummings，等人Am.Journal of Medicine，112：281-289，2002；Sarkar等人J.Bone & Mineral Research 17：1-20，2002)。因为PTH(1-34)能降低脊椎和非脊椎骨折的风险(Neer等人NEJM，344：1434-1441，2001)，对本发明的化合物的效果加以分析，以证实它们能否在腰椎和两处非脊椎位点(即，股骨中段和股骨颈)增加骨生物机械强度。

雌性Sprague-Dawley大鼠(大约6月龄)被除去卵巢(除了Sham对照之外)，并在22℃保持于12小时的光照/黑暗循环下，并且无限获取食物(TD 89222，含有0.5％Ca和0.4％P，泰克来公司(Teklad)，Madison，WI)和水。令切除卵巢的(Ovx)大鼠经历1个月的骨损失，然后用本发明的化合物再进行2个月的处理。以不同剂量(如下表3所示)皮下注射待测试的化合物，所述化合物处于20mM NaH₂PO₄(0.9％NaCl，3mg/ml甘露醇，pH 5)的运载体中，每6或7天进行一次注射，持续2个月。仅用运载体处理Sham和Ovx对照(“sham运载体对照”和“ovx运载体对照”)。然后在异氟醚麻醉下，尸检时通过心脏穿刺收集血清，使用临床化学分析仪对其加以分析。取出腰椎L4-6和左股骨，清除软组织，4℃储藏于50％乙醇/盐水中。在室温下，将50％EtOH/盐水中的L-5封进石蜡膜中，放到QCT(M研究公司(Research M)，Stratec)的工作台中央。在3D分析之前，先用2D产生L-5脊椎的冠状搜索扫描。测量QCT参数，包括BMD(mg/cc)、BMC(mg)和横截面积(mm²)。然后制备腰椎L-5、股骨中段和近股骨部分，用于生物机械测试。通过将样品负载至被破坏(failure)来评估强度(N)，详细过程之前有过描述(Sato，等人，Endocrinology，10：4330-4337，1997)。

在本测定中，相对于3-5μg/kg/d PTH(1-38)的阳性对照来评估本发明的聚乙二醇化的化合物。在骨质减少的、切除卵巢的大鼠中，PTH(1-34)和PTH(1-38)被发现在骨骼作用或钙血作用方面没有区别。以前已有显示，施用了5μg/kg/d(1nmol/kg/d)PTH(1-34)的大鼠的全身性暴露大约是人中PTH(1-34)(即FORTEO^TM)的3倍(Tashjian和Chabner，J.Bone Miner Res，17：1151-1161，2002；Tashjian和Gagel，J.Bone Miner Res，21：354-365， 2006)。以前还有显示，PTH(1-34)5μg/kg/d能将在衰老的骨质减少的切除卵巢的大鼠模型中将脊椎BMD从Ovx恢复至sham运载体对照水平(Kishi等人Bone 22：515-522，1998；Kimmel等人Endocrinologv132：1577-1584，1993)。在该模型中，采用3-5μg/kg/d的剂量，就PTH(1-38)验证了这点。

在衰老的大鼠中，在三个月期间，相对于sham运载体对照而言，卵巢切除术显著降低了BMD、BMC和骨强度。当基本按照上文所述进行测试时，用表3列出的剂量处理8周时，下表3的化合物将Ovx大鼠的BMC恢复至sham运载体对照水平。此外，当基本按照上文所述进行测试时，在测试的脊椎、中段和股骨颈位点中的一处、两处或三处，表3列出的化合物将Ovx大鼠的骨生物机械强度恢复至了sham运载体对照的水平。

对于本发明的某些优选的化合物而言，在本测定的参数内进行测试时，直到测试的最大剂量(大约110nmol/kg)也没有观察到高钙血。在本测定的参数内测试时，本发明的优选化合物能将BMD和BMC恢复至sham运载体对照水平，同时也具有等于或高于大约1.0、2.0、3.0或4.0的高钙血剂量/BMD剂量之比，或者甚至更优选地，所述比高于大约5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或更高。在本测定的参数内进行测试时，本发明的优选的化合物能将BMD和BMC恢复至sham运载体对照的水平，同时还在脊椎、中段和股骨颈位置中的一处、两处或三处将骨生物机械强度恢复至sham运载体对照的水平。甚至更优选地，在本测定的参数内测试时，本发明的化合物能在脊椎、中段和股骨颈位置中的一处或多处将BMC和骨生物机械强度恢复至sham运载体对照水平，同时还具有等于或高于大约1.0、2.0、3.0或4.0的高钙血剂量/BMD剂量之比，或者甚至更优选地，所述比等于或高于大约5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或更高。

对于脊椎、中段和股骨颈位点而言，具有2kD mPEG(平均mw)的SEQ ID NO：4的化合物在11nmol/kg的剂量时达到sham运载体对照水平，在测试的最高剂量下也不存在高钙血。因此，该化合物对于所有三个位点都具有＞10的高钙血剂量/生物机械强度剂量之比。类似地，具有2kD mPEG的SEQ ID NO：1在11nmol/kg的剂量时将脊椎和股骨颈强度恢复到sham运载体对照水平，在测试的最高剂量下也不存在高钙血，因此对于这两个位点而言也具有＞10的高钙血剂量/生物机械强度剂量之比。这些数据表明，本发明的化合物的肽主链的序列以及与化合物肽主链缀合的mPEG的大小贡献了化合物的骨骼效果(BMD、BMC和强度量度所反映出来的)。

表3

化合物	高钙血剂量⁺ (nmol/k g)	脊椎 BMD剂量⁺⁺ (nmol/kg)	脊椎 BMC剂量^＊ (nmol/kg)	脊椎强度剂量^＊＊ (nmol/kg)	中段强度剂量 ^(nmol/k g)	股骨颈强度剂量 ^^(nmol/kg)
							SEQ ID NO：1，具有 5kD mPEG	＞107	＞108	32	108	108	11
SEQ ID NO：2，具有 5kD mPEG	＞112	112	34	32	108	32
							SEQ ID NO：4，具有 5kD mPEG	＞110	＞107	32	107	32	32
SEQ ID NO：5，具有 5kD mPEG	＞110	11	11	107	32	107
							SEQ ID NO：1，具有 2kD mPEG	＞110	110	32	11	32	11
SEQ ID NO：2，具有 2kD mPEG	＞117	34	34	＞117	117	34
							SEQ ID NO：4，具有 2kD mPEG	＞110	11	11	11	11	11
SEQ ID NO：3，具有 2kD mPEG	97	＞110	11	＞110	11	11

+在测定参数内，施用测试化合物后24小时在血清中观察到高钙血的剂量(拟合为回归线并用插值测定的)。“＞”表示所示剂量是测试的最高剂量，而在该剂量没有达到本文定义的高钙血。

++在测定参数内实现了脊椎骨矿物质密度(BMD)的Sham水平的剂量

^＊在测定参数内实现了脊椎骨矿物质含量(BMC)的Sham水平的剂量

^＊＊实现了可与sham和阳性对照(3-5μg/kg/d PTH(1-38))相当的脊椎强度的剂量(在测定对照内)

^实现了可与sham运载体对照和阳性对照(3-5μg/kg/d PTH(1-38))相当的中段强度的剂量

^^实现了可与sham运载体对照和阳性对照(3-5μg/kg/d PTH(1-34))相当的股骨颈强度的剂量

下表4示出了源于表3的值的感兴趣的比例。本发明的一些优选化合物具有大约1.0或更高，更优选等于或高于3、5、6、7、8、9或10的高钙血剂量/脊椎BMD剂量之比，这是在测定的参数内达到的。在测定的参数内达到地，本发明的优选的化合物具有大约3.0或更高，更优选高于5、6、7、8、9或10的高钙血剂量/脊椎BMC剂量之比。在测定的参数内达到地，本发明的优选的化合物具有大约1.0或更高，更优选3、5、6、7、8、9或10或更高的高钙血剂量/脊椎强度剂量之比。在测定的参数内达到地，本发明的优选的化合物具有大约1.0或更高，更优选高于3、5、6、7、8、9或10的高钙血剂量/中段强度剂量之比。在测定的参数内达到地，本发明的优选的化合物具有大约3.0或更高，更优选大约5、6、7、8、9或10或更高的高钙血剂量/股骨颈强度剂量之比。

表4

化合物	高钙血剂量 /脊椎BMD 剂量	高钙血剂量 /脊椎BMC 剂量	高钙血剂量/脊椎强度剂量	高钙血剂量/中段强度剂量	高钙血剂量 /股骨颈强度剂量
						SEQ ID NO： 1，具有5kD mPEG	＞1.0	＞3.34	＞1.0	＞1.0	＞9.7
SEQ ID NO： 2，具有5kD mPEG	＞1.0	＞3.14	＞3.34	＞1.0	＞3.34

[0129]

化合物	高钙血剂量 /脊椎BMD 剂量	高钙血剂量 /脊椎BMC 剂量	高钙血剂量/脊椎强度剂量	高钙血剂量/中段强度剂量	高钙血剂量 /股骨颈强度剂量
						SEQ ID NO： 4，具有5kD mPEG	＞1.02	＞3.43	＞1.02	＞3.43	＞3.43
SEQ ID NO： 5，具有5kD mPEG	＞10.0	＞10.0	＞1.02	＞3.43	＞10.0
						SEQ ID NO： 1，具有2kD mPEG	＞1.0	＞3.43	＞10.0	＞3.43	＞10.0
SEQ ID NO： 2，具有2kD mPEG	＞3.4	＞3.4	1	＞1	＞3.4
						SEQ ID NO： 4，具有2kD mPEG	＞10.0	＞10.0	＞10.0	＞10.0	＞10.0
SEQ ID NO： 3，具有2kD mPEG	＜0.9	8.8	＜0.9	8.8	8.8

实施例5

将本发明的具有SEQ ID NO：1的、其中其缀合的mPEG是2kD的mPEG的化合物与本发明的具有SEQ ID NO：1的、其中其缀合的mPEG是5kD的mPEG的化合物直接相比。令衰老的骨质减少的切除卵巢的大鼠骨质损失1个月，然后施用(表5和6中，nmol/kg)仅运载体或2kD聚乙二醇化的SEQ ID NO：1化合物或5kD聚乙二醇化的SEQ ID NO：1化合物，每6天1次，持续8周。表5显示了给药后24小时的平均血清钙(mg/dL)值。表6显示了平均BMD(mg/cc)。

给药后24小时，用各化合物给药的动物具有正常的血清钙水平。但是，具有2kD mPEG的化合物对血清钙具有较少影响，同时其在低、中和高剂量时都显示出比具有5kD mPEG的化合物更好的BMD骨骼效果。这些数据表明，2kD聚乙二醇化的化合物在骨骼效果方面与5kD聚乙二醇化的化合物类似，但具有更低的血清钙影响。

表5血清钙(mg/dL)

剂量(nmol/kg)	Sham	Ovx	PEG 2kD	PEG 5kD
					0	10.69	10.68
11			10.45	10.86
					32			10.38	10.79
108				11.03
					110			10.25

表6脊椎BMD(mg/cc)

剂量(nmol/kg)	Sham	Ovx	PEG 2kD	PEG 5kD
					10.3	625	544
11			590	567
					32			603	589
108				612
					110			623

实施例6在衰老的、骨质减少的、切除卵巢的大鼠中的PTH(1-34)

6月龄的被切除卵巢的Sprague-Dawley大鼠在22℃保持于12小时的光照/黑暗循环下，并且无限获取食物(TD 89222，含有0.5％Ca和0.4％P，泰克来公司(Teklad)，Madison，WI)和水。令切除卵巢的大鼠经历1个月的骨损失，然后用rhPTH(1-34)进行接下来3个月的处理。每周用0、10或30μg/kg人PTH(1-34)对衰老的、骨质减少的、切除卵巢的大鼠进行皮下注射，持续12周。Sham和ovx对照仅用运载体注射。在尸检时切下腰椎，通过显微-CT(Stratec)进行分析，然后加以制备，用于生物机械测试。通过对脊椎标本加以负载至被破坏，来评估强度(以牛顿(N)计)。在下表7中，通过^＊来表明相对于ovx运载体对照的显著性(Fishers PLSD，P＜0.05)。下表7提供了模型数据。

相对于Ovx运载体对照而言，处理12周后，在骨质减少的切除卵巢的大鼠中，多至30ug/kg(7nmol/kg)的PTH(1-34)对脊椎BMD或脊椎生物机械强度没有显著作用。当在最后一次给药后大约24小时时测量时，血清钙是正常的。较之本文上文中显示的数据，本发明的化合物相对于每周给予PTH(1-34)来说具有出众的脊椎BMD和生物机械脊椎强度。

表7：PTH(1-34)每周给药的骨骼效果

脊椎BMD：
			组	剂量(μg/kg)	平均BMD mg/mL
Sham	0	605^＊
			Ovx	0	512
PTH(1-34)	10	534
			PTH(1-34)	30	529

			脊椎强度：
组	剂量(ug/kg)	平均负载至被破坏(N)
			Sham	0	277^＊
Ovx	0	210
			PTH(1-34)	10	222
PTH(1-34)	30	243

实施例7PTH受体的内在化

在配体与膜受体结合之后，针对本发明的化合物测定PTHR1(PTH受体1)内在化的动力学。用PTHR-emGFP质粒(英杰生命科学公司(Invitrogen))来转染HEK 293细胞。

将细胞以7000个细胞/孔，100μL/孔接种进涂布有多聚-D赖氨酸的干净有底黑色96孔板。接种进96孔板后24小时，在0分钟至3小时中间隔的时间点，用10μL待测试化合物对细胞给药，终浓度为100nM。在给药的终点吸出培养基。用100μL Prefer(阿娜技术公司(Anatech)，BattleCreek，MI)固定细胞30分钟。从细胞吸出Prefer，用100μL 1×PBS洗细胞三次。用100μL稀释的Hoechst核染料(在1×PBS中稀释的)来对细胞进行30分钟的染色。吸走Hoechst染料，用1X PBS代替。在4℃将平板储藏于黑暗中，直到进行扫描。使用Cellomics

ArrayScan在48小时内对细胞加以扫描。表8给出了来自多个时间点的代表数据，其被示作为仅运载体对照的百分比(基线＝100％)。

表8

化合物^＊	20分钟	40分钟	60分钟	180分钟
					PTH(1-38)	166	177	224	175

					SEQ ID NO：4，但是没有聚乙二醇化，并且第26位氨基酸是赖氨酸	136	132	136	151
SEQ ID NO：4，具有2kD mPEG	154	167	186	163
					SEQ ID NO：4，具有5kD mPEG	106	96	98	107

					SEQ ID NO：2，但是没有聚乙二醇化，并且第26位氨基酸是赖氨酸	126	114	139	139
SEQ ID NO：2，具有2kD mPEG	148	102	107	96
					SEQ ID NO：2，具有5kD mPEG	128	95	108	102

					SEQ ID NO：1，但是没有聚乙二醇化，并且第26位氨基酸是赖氨酸	106	126	113	142
SEQ ID NO：1，具有2kD mPEG	160	120	104	102
					SEQ ID NO：1，具有5kD mPEG	127	93	91	92

这些数据表明，本发明的化合物具有与PTH(1-38)显著不同的内在化动力学，这取决于肽主链的序列、其是否聚乙二醇化和PEG的大小。注意，没有聚乙二醇化的分子具有被命名的序列的主链，但是有一处例外，即，在第26位是赖氨酸残基。较慢的内在化动力学表明：当使用本发明的化合物时形成配体-PTHR1受体复合物时，PTHR1受体内在化的速度降低，这导致配体结合后细胞中信号传导的量更大。这可能是对下述现象的解释中的部分，所述现象是：本发明的具有2kD PEG的化合物的形式每周给药观察到的改善的骨骼效果优于每周PTH给药所观察到的骨骼效果。

序列表

<110>伊莱利利公司(Eli Lilly and Company)

<120>作为PTH受体调节剂的聚乙二醇化的PTH及其用途

<130>X17107

<160>12

<170>PatentIn版本3.4

<210>1

<211>34

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(26)..(26)

<223>在第26位的Xaa是经修饰的赖氨酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(34)..(34)

<223>酰胺化

<400>1

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Xaa Leu Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210>2

<211>31

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>在第8位的Xaa是正亮氨酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>在第18位的Xaa是正亮氨酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(26)..(26)

<223>在第26位的Xaa是经修饰的赖氨酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(31)..(31)

<223>酰胺化

<400>2

Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala

1 5 10 15

Ser Xaa Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Xaa Leu Leu Gln Glu Val

20 25 30

<210>3

<211>34

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(26)..(26)

<223>在第26位的Xaa是经修饰的赖氨酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(34)..(34)

<223>酰胺化

<400>3

Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Xaa Leu Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210>4

<211>34

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>在第8位的Xaa是正亮氨酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>在第18位的Xaa是正亮氨酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(26)..(26)

<223>在第26位的Xaa是经修饰的赖氨酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(34)..(34)

<223>酰胺化

<400>4

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala

1 5 10 15

Ser Xaa Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Xaa Leu Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210>5

<211>34

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>在第8位的Xaa是正亮氨酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>在第18位的Xaa是正亮氨酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(26)..(26)

<223>在第26位的Xaa是经修饰的赖氨酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(34)..(34)

<223>酰胺化

<400>5

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala

1 5 10 15

Ser Xaa Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Xaa Leu Leu Gln Glu Val His

20 25 30

Gln Phe

<210>6

<211>34

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>在第8位的Xaa是Met，如果在第18位的Xaa也是Met；或者

在第8位的Xaa是正亮氨酸；如果在第18位的Xaa也是正亮氨酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>在第8位的Xaa是Met，如果在第18位的Xaa也是Met；或者

在第8位的Xaa是正亮氨酸；如果在第18位的Xaa也是正亮氨酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(26)..(26)

<223>在第26位的Xaa是经修饰的赖氨酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(34)..(34)

<223>酰胺化

<400>6

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala

1 5 10 15

Ser Xaa Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Xaa Leu Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210>7

<211>34

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>用FMOC修饰的

<400>7

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210>8

<211>34

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>MOD_RES

<222>(34)..(34)

<223>可以被或可以不被酰胺化

<400>8

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210>9

<211>31

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>在第8位的Xaa是正亮氨酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>在第18位的Xaa是正亮氨酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(31)..(31)

<223>可以被或可以不被酰胺化

<400>9

Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala

1 5 10 15

Ser Xaa Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Glu Val

20 25 30

<210>10

<211>34

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>MOD_RES

<222>(34)..(34)

<223>可以被或可以不被酰胺化

<400>10

Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210>11

<211>34

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>在第8位的Xaa是正亮氨酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>在第18位的Xaa是正亮氨酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(34)..(34)

<223>可以被或可以不被酰胺化

<400>11

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala

1 5 10 15

Ser Xaa Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210>12

<211>34

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>在第8位的Xaa是正亮氨酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>在第18位的Xaa是正亮氨酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(34)..(34)

<223>可以被或可以不被酰胺化

<400>12

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala

1 5 10 15

Ser Xaa Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Glu Val His

20 25 30

Gln Phe

Claims

1.化合物或其可药用盐，所述化合物的序列为：

Asp Val His Asn Phe-NH₂(SEQ ID NO：6)；

其中，Xaa₈和Xaa₁₈是Met，或者，Xaa₈和Xaa₁₈是Nle；并且，其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇。

2.权利要求1的化合物，其氨基酸序列为：

Asp Val His Asn Phe-NH₂(SEQ ID NO：l).

3.权利要求1的化合物，其氨基酸序列为：

Asp Val His Asn Phe-NH₂(SEQ ID NO：4).

4.选自下述的化合物或其可药用盐：

a)Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu ArgVal Glu Trp Leu ArgGln Glu Val-NH₂(SEQ ID NO：2)；

b)Pro Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Ala Ser Met Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg

Asp Val His Asn Phe-NH₂(SEQ ID NO：3)；

和

c)Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Nle His Gln Arg Gly Arg His Leu Ala Ser Nle Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg

Glu Val His Gln Phe-NH₂(SEQ ID NO：5)；

其中mPEG是平均分子量为1500至5500道尔顿的单甲氧基聚乙二醇。

5.中间物，其序列选自SEQ ID NO：8-12。

6.权利要求1至4中任意一项所述的化合物或其可药用盐，其中，mPEG具有2000至5000道尔顿的平均分子量。

7.权利要求1至4中任意一项所述的化合物或其可药用盐，其中，mPEG具有2000道尔顿的平均分子量。

8.包含权利要求1至4中任意一项所述的化合物或其可药用盐的组合物，所述化合物或其可药用盐与可药用载体、稀释剂或赋形剂组合。

9.权利要求8的组合物，其中mPEG具有2000至5000道尔顿的平均分子量。

10.权利要求8所述的组合物，其中，mPEG具有2000道尔顿的平均分子量。

11.用于治疗的、权利要求1至4中任意一项所述的化合物或其可药用盐。

12.用于在哺乳动物中诱导骨形成的、权利要求1至4中任意一项所述的化合物或其可药用盐。

13.权利要求1至4中任意一项所述的化合物或其可药用盐，其用于在哺乳动物中治疗下述疾病或病况，所述疾病或病况中，新的骨形成和/或骨物质和骨生物机械强度增加将是有利的，所述疾病或病况包括骨质疏松症、骨质减少、骨折、脊柱融合、骨移植、关节移植、牙移植以及牙周病。

14.用于在哺乳动物中治疗骨质疏松症的、权利要求1至4中任意一项所述的化合物或其可药用盐。

15.用于在哺乳动物中预防骨质疏松症或骨质减少的、权利要求1至4中任意一项所述的化合物或其可药用盐。

16.用于在哺乳动物中治疗骨折的权利要求1至4中任意一项所述的化合物或其可药用盐。

17.权利要求11至16中任意一项所述的化合物，其中，mPEG具有2000至5000道尔顿的平均分子量。

18.权利要求11至16中任意一项所述的化合物，其中，mPEG具有2000道尔顿的平均分子量。

19.权利要求12至16中任意一项所述的化合物，其中所述哺乳动物是人。

20.权利要求1至4中任意一项所述的化合物或其可药用盐用于制备下述药物的用途，所述药物用于治疗能被骨形成的诱导改善或预防的疾病或病况。

21.权利要求1至4中任意一项所述的化合物或其可药用盐用于制备下述药物的用途，所述药物用于在哺乳动物中治疗下述病况，所述病况中，新骨形成以及骨物质和骨生物机械强度的增加将是有利的，所述病况包括骨质疏松症、骨质减少、骨折、脊柱融合、骨移植、关节移植、牙移植以及牙周病。

22.权利要求1至4中任意一项所述的化合物或其可药用盐用于制备下述药物的用途，所述药物用于在哺乳动物中治疗骨质疏松症或骨质减少。

23.权利要求1至4中任意一项所述的化合物或其可药用盐用于制备下述药物的用途，所述药物用于在哺乳动物中预防骨质疏松症或骨质减少。

24.权利要求1至4中任意一项所述的化合物或其可药用盐用于制备下述药物的用途，所述药物用于在哺乳动物中治疗骨折。

25.权利要求20至24中任意一项所述的用途，其中，mPEG具有2000至5000道尔顿的平均分子量。

26.权利要求20至24中任意一项所述的用途，其中，mPEG具有2000道尔顿的平均分子量。

27.权利要求21至24中任意一项所述的用途，其中，所述哺乳动物是入。