BRPI0617417A2 - composiÇço, uso da composiÇço, composto, mÉtodo para a sÍntese do composto - Google Patents

Abstract

<B>COMPOSIÇçO, USO DA COMPOSIÇçO, COMPOSTO, MÉTODO PARA A SINTESE DO COMPOSTO<D>Esta invenção diz respeito à biologia e medicina e, em particular, pode ser usado na medicina para fabricar uma composição farmacêutica para a liberação alvejada de substâncias biologicamente ativas na mitocôndria, direcionada pelo potencial eletroquímico protônico na mitocôndria. Esta invenção também diz respeito ao método para afetar um organismo pela liberação alvejada de compostos biologicamente ativos à mitocôndria. A invenção pode ser útil no tratamento de doenças ou distúrbios associados com o funcionamento anormal da mitocôndria, em particular doenças associadas com a produção aumentada de radicais livres e espécies de oxigênio reativo.

Description

A presente invenção diz respeito à biologia e medicina e,particularmente pode ser útil na medicina para preparar uma composiçãofarmacêutica para a liberação alvejada de substância biologicamente ativa namitocôndria, tal liberação sendo conduzida pelo potencial eletroquímico depróton. A invenção também diz respeito a um método para atuar em umorganismo, que compreende a dita liberação de substâncias biologicamenteativas requeridas nas mitocôndrias.Fundamento da Invenção

As mitocôndrias desempenham um papel chave em yáriosprocessos intracelulares cruciais, tais como, metabolismo energético em umacélula (uma vez que a função primária das mitocôndrias é fornecer a célulacom energia), metabolismo de certas substâncias (por exemplo, ácidosgraxos), etc. As mitocôndrias também estão diretamente envolvidas naformação e utilização de radicais livres (FR) e espécies de oxigênio reativas(ROS) - porções extremamente reativas que podem afetar muitos processosem uma célula viva. Finalmente, as mitocôndrias recentemente provaramdesempenhar um papel chave no processo de morte celular programada.

Muitas doenças são conhecidas como estando associadas coma disfunção das mitocôndrias. A esta categoria pertencem todos os distúrbiosassociados com uma formação aumentada de FR e ROS, a morte de célulasisoladamente ou em massa dentro um tecido ou um órgão, perturbações nomecanismo de morte celular programada (apoptose), perturbações nometabolismo de ácidos graxos, etc.

É levantada a hipótese de que pela ação nas mitocôndrias épossível influenciar a maioria dos diversos aspectos da atividade vital decélulas e do organismo todo.Dentro da estrutura da presente invenção uma nova tecnologiaé proposta para a ação nas mitocôndrias em uma célula viva por intermédio deliberação alvejada e acúmulo de várias substâncias biologicamente ativasnestas organelas.

Esta abordagem oferece vantagens óbvias. A liberaçãoalvejada de uma substância torna possível aumentar a eficiência deste pedido,para reduzir a dosagem total (uma vez que uma concentração eficaz de umasubstância é atingida devido ao acúmulo repetido da substância dentro docompartimento alvo da célula), para reduzir a probabilidade e, força de efeitoscolaterais.

A organização funcional das mitocôndrias por si fornece umaoportunidade única para o alvejamento: o funcionamento mitocondrialbombeia para fora, ativamente, prótons a partir de sua matriz no citoplasma.Este processo cria um potencial eletroquímico extremamente alto de íons dehidrogênio (potencial de próton) na membrana interna da mitocôndria.

Os estudos bioenergéticos resultaram na descoberta de várioscompostos que podem penetrar a membrana mitocondrial e acumularativamente dentro de mitocôndrias de um modo dependente de potencial depróton. Estas substâncias receberam o nome "íons de Skulachev" (GreenD.E., "The electromechanochemical model for energy coupling inmitochondria", 1974, Biochem. Biophys. Acta., 346:27-780). Tais íonsusualmente não apresentam atividade biológica pronunciada. A principal idéiada presente invenção é usar íons de Skulachev para criar um novo compostoque inclui, além de um íon de Skulachev, tal como, uma outra substânciadesejável (no contexto da presente invenção designado como porção efetoraou, efetor) que deve ser liberado nas mitocôndrias.

Um número muito limitado de substâncias biologicamenteativas alvejadas mitocondrialmente são conhecidas no momento. Algumassubstâncias relacionadas são descritas em US 6.331.532 e EP 1 047 701(mitoquinol (MitoQ), Mitovitamina E (MitoVitE)) e em EP 1 534 720(superóxido dismutase e glutationa peroxidase mimético ligados a trifenilfosfônio). Alguns destes compostos e sua atividade são descritos nosdocumentos debatidos abaixo.

Os compostos que compreendem superóxido dismutase eglutationa peroxidase mimético são reivindicados na EP 1 534 720 comoantioxidantes mitocondrialmente alvejados adequados para tratar doençascausadas pela tensão oxidante e outros. Nos exemplos experimentais queilustram a invenção EPI 534 720 os dados são apresentados a cerca dacapacidade destes miméticos de penetrar nas mitocôndrias e a cerca de suaação antioxidante na solução e na interação com mitocôndrias isoladas.Nenhum dado a cerca do efeito destes compostos em células ou em umorganismo como um todo é apresentado. Mas ao mesmo tempo existem dadosa cerca de reatividade alta do mimético indicado com respeito aos grupossulfidrila de proteínas. Tal reatividade deve reduzir prontamente a eficiência elimitar seriamente a possível aplicação de antioxidantes mitocondrialmentealvejados que compreendem miméticos de superóxido dismutase ou deglutationa peroxidase (ebselen), como foi mostrado por Filipovska A., KelsoG.F., Brown S. E., Beer S.M., Smith R.A., Murphy M.P., J Biol. Chem. 2005,280(25):24113-26. Este estudo demonstrou que ebselen covalentementeligado a uma porção alvej adora de mitocôndrias (o composto todo édesignado mitoebselen) tem a mesma eficiência antioxidante como o ebselenconvencional. Em outras palavras, o alvejamento de compostos do tipomitoebselen, mesmo se intensificar sua ação antioxidante, esta vantagem édiminuída pela atividade colateral indesejada de mitoebselen.

Um outro antioxidante mitocondrialmente alvejado éMitoVitE5 um composto que compreende trifenilfosfônio como a porçãoalvej adora e vitamina E como o antioxidante. No relatório descritivo dainvenção EP 1 047 701 os dados são apresentados a cerca da atividadeantioxidante deste composto em um homogeneizado de cérebro de rato, assimcomo a capacidade de MitoVitE de penetrar nas mitocôndrias isoladas ecélulas vivas na cultura. Também é mostrado que em uma concentração de até10 μΜ de MitoVitE não afeta a viabilidade de células na cultura, enquanto umaumento adicional da MitoVitE leva a uma diminuição da sobrevivência decélulas. Entretanto, nenhuma atividade antioxidante de MitoVitE em células,tecidos, órgãos individuais ou o organismo todo foi demonstrada. O efeito deMitovitE em células na cultura é descrito na publicação Jauslin MX., MeierT., Smith R.A., Murphy M.P., FASEB J. 2003 17(13): 1972-4. A partir destedocumento segue que a capacidade de MitoVitE para prevenir a morte celularprogramada não desaparece contra os fundamentos do FCCP (3-fluorometil-carbonilcianeto fenilidrazona) não ligador, isto é, sob as condições quando oacúmulo alvejado de MitovitE nas mitocôndrias não é plausível. Estes dadosmostram que mesmo se o alvejamento mitocondrial de MitoVitE ocorrer, talalvejamento não desempenha um papel decisivo no efeito biológico destecomposto.

O MitoQ antioxidante alvejado mitocondrialmente e suasvariantes (MitoQ5, MitoQ3) compreendem ubiquinona (ubiquinol em suaforma reduzida) ligado a trifenilfosfônio por um ligador C-1O (C5, C3conseqüentemente). No relatório descritivo da invenção US 6.331.532 MitoQé reivindicado como o composto ativo em composições pretendido para otratamento ou prevenção de doenças associadas com tensão oxidante. Nosexperimentos apresentados no relatório descritivo desta invenção sãodemonstradas as propriedades antioxidantes de MitoQ na solução, acapacidade deste composto de penetrar em mitocôndrias isoladas, a influênciana eficiência da respiração de mitocôndrias isoladas. Entretanto, nenhum dadono efeito de MitoQ em células vivas, tecido, órgãos de organismo inteiro, napresença ou ausência de toxicidade é apresentado neste documento.

Os dados adicionais na atividade de MitoQ podem serencontrados no W02005/019233 do mesmo grupo de inventores, ondemostram a eficiência de MitoQ para prevenir peroxidação de lipídeo nasmitocôndrias isoladas e, também na publicação de Adiam VJ., Harrison J.C.,Porteous CM., James A.M., Smith R.A., Murphy M.P., Sammut I.A., 2005,FASEB J. 19:1088-95. Neste documento os autores apresentaram apenas oexemplo conhecido até agora da ação de MitoQ em um organismo em umexperimento de alimentação de ratos com MitoQ, seguido pelo estudo de suafunção cardíaca com o sistema Lagendorff (preparação de coração perfundidode Lagendorff). Os dados relatados indiretamente suportam a afirmação queMitoQ pode ser usado para a prevenção ou tratamento de dano isquêmicomiocárdico. Entretanto, várias inexatidões e pontos discutíveis deste estudonão permitem provar de modo convincente tal declaração. Desse modo, omodelo usado pelos autores - isquemia normotérmica de 30 minutos seguidapor reperfiisão - é um modelo freqüentemente usado para o estudo do danoisquêmico do miocárdio. Entretanto, a maior desvantagem deste método é ainstabilidade elétrica do coração isolado durante a reperfiisão. É conhecidoque um certo número de corações não pode restaurar sua atividade de modoalgum devido a fibrilação periódica ou constante e, a arritmia periódica ocorrequase em todo experimento de uma tal série. Não há a indicação nem defibrilação nem de arritmia no documento citado. Portanto, permanece pouconítido, se os valores médios obtidos pelos autores caracterizam um grupo totalde experimentos ou apenas aqueles experimentos em que a arritmia foi menospronunciada. Além disso, levando em consideração as razões acima, estáclaro que o número de animais em cada grupo experimental (seis),claramente, não é suficiente para o dado modelo.

A suposição que os dados obtidos pelos autores do documentoacima não são corretos é parcialmente suportada por uma observação umpouco estranha de um aumento significante na função contrátil tanto na sériede controle quanto na experimental sob as condições de reperfusão que devemser inevitavelmente seguidas por morte de miócitos cardíacos. Este resultadopode ser obtido se o cálculo da função contrátil foi realizado usando-se apenascorações ativos, excluindo aqueles instáveis "desligados", considerando que ataxa de perfusão foi calculada usando-se todos os corações. Tal método éobviamente incorreto. Ainda que os dados médios para qualquer período dereperfusão no grupo tratado com MitoQ sejam maiores do que nos grupostratados com preparações de controle, estes grupos foram comparados umcom o outro e, desse modo, a significância destas diferenças não é clara.

Portanto, a principal conclusão feita pelos autores que MitoQ éo composto cardioprotetor sozinho parece não ser suficientementeconvincente. Tal opinião é corroborada pela ausência de resultados deinvestigação da ultra-estrutura mitocondrial, pelo rendimento de lactatodesidrogenase, citocromo C, caspase 3, complexo Iea atividade aconitaseem mitocôndrias nos grupos tratados com substâncias de controle.

Especialmente, uma análise detalhada da publicação acimarevela pontos muito vulneráveis em estágios de seleção e análise dosresultados obtidos. E provável que os autores do dito documento não sejammuito experientes no procedimento com o modelo usado. Portanto, pode serafirmado que a ação cardioprotetora de MitoQ permanece não provada.

Também deve ser observado que apesar de resultados muitoencorajadores concernentes à ação de MitoQ em culturas celulares, existemvárias observações e cálculos que lançam dúvida na possibilidade deaplicação prática deste composto. Por exemplo, foi mostrado nosexperimentos com culturas celulares que produz MitoQ seu efeitoantioxidante e anti-apoptótico em uma concentração de cerca de 1 μΜ nomeio. No momento é considerado que foi provado que sob estas condições aconcentração de MitoQ em mitocôndrias pode atingir 1 mM. Por outro lado,foi mostrado por Smith R. A., Porteous C.M., Gane A.M., Murphy M.P., ProcNatl Acad Sci USA, 2003, 100(9):5407-12, que quando MitoQ é alimentado aanimais de laboratório, o acúmulo de MitoQ na maioria dos tecidos sensíveisà tensão oxidante (o cérebro e músculo cardíaco) eqüivale à concentraçãomáxima de 100 pmoles por grama de peso vivo. Os cálculos mostram quecom tal concentração de MitoQ em um tecido mesmo saturado ao máximocom mitocôndrias (o músculo cardíaco) a concentração de MitoQ dentro demitocôndrias não excede 100 nmoles. Isto é mais do que 1000 vezes menor doque a concentração demonstrada ser eficiente nos experimentos de cultura decélula. O aumento da dosagem administrada aos animais de laboratório empelo menos 10 vezes não pode ser atingido devido à toxicidade da preparação.

Desse modo, o estado de existência da técnica divulga apenasum tipo de compostos mitocondrialmente alvejados: as substânciasreivindicadas como antioxidantes mitocondrialmente alvejados. Nenhumoutro composto biologicamente ativo, mitocondrialmente alvejado éconhecido até agora. Deve ser observado que as substâncias já divulgadasreivindicadas como antioxidantes mitocondrialmente alvejados não resolvemo problema apresentado, porque sua atividade biológica foi descrita de modoextremamente insuficiente e os prospectos de sua aplicação prática para ospropósitos reivindicados são indefinidos. Além disso, para a maioria doscompostos divulgados sua ineficácia já foi provada.

Sumário da Invenção

A presente invenção é fundamentada no princípio daconcentração de substâncias biologicamente ativas nas mitocôndrias decélulas vivas através do uso da energia do potencial eletroquímico de íons dehidrogênio e de íons de Skulachev. Uma tal abordagem permitiuinesperadamente alcançar uma diminuição múltipla da dosagem dassubstâncias biologicamente ativas utilizadas, uma ação eficaz alvejada nasmitocôndrias, que são o elemento chave nos processos intracelulares maisimportantes. Desse modo, fornece uma oportunidade para uma diminuiçãomúltipla da probabilidade e força de efeitos colaterais desfavoráveis.Desse modo, um dos aspectos da presente invenção é fornecerum método para atuar em um organismo por intermédio de liberação alvejadade substâncias biologicamente ativas para mitocôndrias no gasto da energiado potencial eletroquímico de íons de hidrogênio.

Um outro aspecto da invenção é fornecer uma composiçãopara a liberação alvejada de substância biologicamente ativa às mitocôndriasde células, dita composição que compreende um composto que consiste deuma porção alvej adora que fornece a liberação do composto todo nasmitocôndrias, um grupo ligador, e um efetor - uma substância com a atividadebiológica requerida. No total, um tal composto pode ser representado pelafórmula geral::

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em que A é o grupo efetor, que compreende:

a) um antioxidante (II)

<formula>formula see original document page 9</formula>

e/ou uma forma reduzida deste, em que m é um número inteirode 1 a 3; cada Y representa os mesmos substituintes ou diferentes queconsistem de: um alquila inferior, alcóxi inferior; ou dois Ys vicinais sãoe/ou uma forma reduzida desteem que Rl e R2 são os mesmos substituintes ou diferentes esão cada um, independentemente, um alquila inferior ou alcóxi inferior;

b) um pró-oxidante;

c) um indutor de apoptose

d) um inibidor de proteínas anti-apoptose de localizaçãomitocondrial;

e) um fotossensibilizador.

Neste aspecto da presente invenção:

O antioxidante é um composto que pode reagir com FR eROS, neutralizando suas propriedades perigosas. É preferível que o ditoantioxidante na sua forma radical pode reagir com, a cadeia respiratória demitocôndrias e, desse modo, restaurar suas propriedades antioxidantes parasubseqüente reação com FR ou ROS. O antioxidante preferido correspondenteà estrutura (II) é 2,3-dimetil-l,4-benzoquinol (um resíduo de plastoquinol - damaior parte de antioxidante eficiente de tilacóides de protoplastos, isto é, deum da maior parte dos sítios saturados de FR e ROS na natureza animada);

O pró-oxidante é um composto que pode formar e/ou estimulara formação de radicais livres e/ou espécies de oxigênio reativas na entrada emuma célula: paraquat, menadiona, hidroperóxidos orgânicos;

O indutor de apoptose é um composto que, foi liberado namitocôndrias, ativa de algum modo ou outra morte celular programada(apoptose). O indutor de apoptose preferível na constituição de composto (I) éóxido de fenil arsênico, considerado no momento como a maior parte doindutor eficaz de formação de poro mitocondrial;

O inibidor de proteínas anti-apoptose de localizaçãomitocondrial é um composto que é capaz de interagir com uma ou maisproteínas anti-apoptose localizadas nas mitocôndrias (incluindo proteínasanti-apoptose de membrana) e eliminam sua atividade. O inibidor preferívelde proteínas anti-apoptose de localização mitocondrial é ABT737. Acredita-seque estes compostos sejam especialmente úteis quando combinados com umagente quimioterapêutico para facilitar a indução de apoptose;

O fotossensibilizador é um composto que é capaz de produziroxigênio singleto ou outras espécies de oxigênio reativo ou radicais livres sobiluminação. Os fotossensibilizadores preferidos são: ftalocianinaopcionalmente contendo um metal substituinte e complexos destes: porfirina eseus derivados, particularmente BDP-Mac ou BDP-Ma0; ou foscan(mTHPC).

L é um grupo ligador, que compreende:

a) uma cadeia hidrocarbônica reta ou ramificadaopcionalmente substituída por um ou mais substituintes e, que contém,opcionalmente, uma ou mais ligações duplas ou triplas;

b) uma cadeia de isopreno que ocorre naturalmente;

η é um número inteiro de 1 a 20;

B é um grupo alvejador, que compreende:

a) um íon de Skulachev Sk:

Sk+Z"

onde Sk é um cátion lipofílico, Z é um ânionfarmacologicamente aceitável; b) um peptídeo hidrofóbico carregadocontendo de 1 a 20 aminoácidos;

com a condição de que no composto de estrutura (I) A não énem ubiquinona (por exemplo, 2-metil-4,5-dimetóxi-3,6-dioxo-l,4-cicloexa-dienil) nem tocoferol ou mimético de superóxido dismutase ou ebselen\ emque L é um radical decila divalente ou pentila divalente ou propila divalente;e B é trifenilfosfônio; assim como, solvatos, isômeros, pró medicamentos eum carregador deste farmaceuticamente aceitável.

Um aspecto adicional da invenção é a provisão de um agenteterapêutico ou profilático (preventivo) - um composto correspondente àestrutura (!) - útil no tratamento de doenças que podem ser curadas,prevenidas ou aliviadas pela diminuição da quantidade de radicais livres ouespécies de oxigênio reativo em células, tecidos, sítios, órgãos separados ouem um organismo todo com a ajuda de antioxidantes mitocondrialmentealvejados. Em conexão com este aspeto da invenção, é proposto:

- uso de antioxidantes mitocondrialmente alvejadoscorrespondente à estrutura (I) para prolongar o tempo de vida de sereshumanos ou animais; o uso de um agente terapêutico ou profilático eficazquando uma doença é causada pela ação de um organismo e pelo aumento detensão oxidante; em particular, o uso de antioxidantes mitocondrialmentealvejados para tratar doenças oftalmológicas causadas pela tensão oxidantee/ou morte maciça de células retinais, envolvidas nos processos que produzema visão; para combater catarata; para tratar degeneração macular de retina;

- uso de antioxidantes mitocondrialmente alvejadoscorrespondente à estrutura (I) para o tratamento ou prevenção de doençascausadas pela morte celular programada em massa em tecidos e órgãos e/ouassociados com a propagação de sinais que iniciam a morte celularprogramada em tecido danificado;

- uso de antioxidantes mitocondrialmente alvejados quecorrespondem à estrutura (I) para o tratamento e/ou prevenção de doençascardiovasculares, quando a morte celular programada, apoptose ou necrosedesempenham um papel chave; para o tratamento e/ou prevenção de ataquecardíaco, acidente vascular cerebral; para prevenir efeitos nocivos dereoxigenação;

uso de antioxidantes mitocondrialmente alvejadoscorrespondente à estrutura (I) durante operações cirúrgicas para protegertecidos saudáveis do dano;

uso de antioxidantes mitocondrialmente alvejadoscorrespondente à estrutura (I) durante a transplantação para prevenir arejeição de material transplantado, assim como para preservar material detransplantação; uso de antioxidantes mitocondrialmente alvejadoscorrespondentes à estrutura (I) em cosmetologia, para superar asconseqüências de queimaduras, para estimular cura de ferimentos, incluindoas suturas cirúrgicas;

- uso de antioxidantes mitocondrialmente alvejadoscorrespondentes à estrutura (I) como um medicamento antiinflamatório.

Ainda, um aspecto adicional da invenção é a provisão de umagente terapêutico ou profilático (preventivo) correspondente à estrutura (I)para o tratamento ou profilaxia de doenças oncológicas. Em conexão com esteaspeto da invenção, é proposto:

- uso de agentes anticancerígenos mitocondrialmente alvejadospara combater a formação de metástase, angiogênese, assim como, para ainiciação alvejada de morte celular programada em células cancerígenas;

- uso de pró-oxidantes mitocondrialmente alvejadoscorrespondentes à estrutura (I) como as preparações anticancerígenasmitocondrialmente alvejadas, preferivelmente, paraquat mitocondrialmentealvejado, menadione mitocondrialmente alvejado ou antioxidantesmitocondrialmente alvejados incapazes de serem restaurados (reduzidos) pelacadeia respiratória mitocondrial e, desse modo, manifestar propriedades pró-oxidantes (por exemplo, composto DMMQ);

- uso de indutores mitocondrialmente alvejado de apoptosecorrespondente à estrutura (I) como as preparações anticancerígenasmitocondrialmente alvejadas. Uma tal abordagem é preferível sobre o uso deindutores convencionais de apoptose, uma vez que as mitocôndrias fornecemum grande número de possibilidades de ativar a morte celular programada.Um dos caminhos preferidos de uma tal iniciação é ligação química dosgrupos sulfidrilas de proteínas de membrana mitocondrial por intermédio dogrupo efetor do indutor mitocondrialmente alvejado de apoptose. O grupoefetor preferível de um tal composto é óxido de fenil arsênico;- uso de inibidores mitocondrialmente alvejados de proteínasanti-apoptóticas de localização mitocondrial como as preparaçõesanticancerígenas mitocondrialmente alvejadas correspondentes à estrutura (I).As proteínas preferíveis, a atividade da qual deve ser inibida por taispreparações, são bcl-2 e proteínas aliadas. Um da maior parte preferível deinibidores é ABT737.

Também é um aspecto da presente invenção usar, como apreparação anticancerígena mitocondrialmente alvejada, uma composição quecompreende inibidores mitocondrialmente alvejados de proteínas anti-apoptóticas de localização mitocondrial e preparações convencionais queinduzem morte programada de células cancerígenas.

Ainda, um outro aspecto da presente invenção é o uso como apreparação anticancerígena mitocondrialmente alvejada de uma composiçãoque compreende antioxidantes mitocondrialmente alvejados correspondente àestrutura (I) e preparações convencionais que induzem a morte programada decélulas cancerígenas. Neste aspecto da invenção, a aplicação de antioxidantesligada a cátions lipofílicos é preferível, uma vez que em células cancerígenasa atividade de enzimas capaz de bombear cátions lipofílicos (enzimasresponsáveis por resistência à medicamento múltipla) é observado serfortemente aumentado. Desse modo, o antioxidante mitocondrialmentealvejado será predominantemente acumulado em células saudáveis e queresultarão em sua sobrevivência predominante durante terapiaanticancerígena, que, por sua vez, diminuirá a força de efeitos colateraisindesejáveis da dita terapia; uso de antioxidantes mitocondrialmente alvejadospara intensificar a eficiência de quimioterapia ou radioterapia de câncer;

- uso de um fotossensibilizador mitocondrialmente alvejadocomo a preparação anticancerígena mitocondrialmente alvejada;

- uso de um fotossensibilizador mitocondrialmente alvejado naterapia fotodinâmica de câncer que permite indução mitocondrial de apoptose.Esta abordagem oferece várias vantagens essenciais sobre métodosconvencionais de terapia fotodinâmica, uma vez que (a) permite a eliminaçãode células cancerígenas com a ajuda de morte celular programada em vez denecrose (associada com várias conseqüências indesejadas), (b) permitediminuir essencialmente a quantidade do fotossensibilizador utilizado, pormeio do qual a probabilidade da origem e a força de efeitos colateraisindesejados são diminuídas;

- uso de antioxidante SkQl mitocondrialmente alvejado comoo agente anticancerígeno preferível.

Ainda, um aspecto adicional da invenção é o uso de umantioxidante mitocondrialmente alvejado que compreende como o grupoalvejador o resíduo de estrutura (III) para tratar doenças associadas commetabolismo; diabetes.

Também é um aspecto da invenção fornecer um método dedesinfecção de tecidos, sangue ou outras substâncias contendo células eelementos celulares, com a ajuda de radicais livres.

Dentro da estrutura deste método as células e os elementoscelulares desejados são protegidos da tensão oxidante por um antioxidantemitocondrialmente alvejado, enquanto todos os patógenos são destruídos porradicais livres.

Ainda, um outro aspecto da invenção é o uso deantioxidantes mitocondrialmente alvejados em biotecnologia paraintensificar a viabilidade de células humanas ou animais na cultura celularpara pesquisa ou propostas tecnológicas. Este aspeto da invenção éfundamentado no fato que em um grande número de casos a concentraçãode oxigênio em um meio de cultura celular essencialmente excede aconcentração de oxigênio em um tecido, por meio do qual a probabilidadede tensão oxidante nas células é agudamente aumentada, isto, por sua vez,leva a uma probabilidade superior de apoptose ou necrose, diminui aviabilidade de tais células. O tratamento de células com um antioxidantemitocondrialmente alvejado reduz agudamente a intensidade de tensãooxidante. O tratamento de células com antioxidantes mitocondrialmentealvejados também aumenta signifícantemente a biomassa das células e,desse modo, eleva sua produtividade. Em conexão com este aspeto dainvenção é proposto:

- o uso de antioxidantes mitocondrialmente alvejados paraaumentar a produtividade de células humanas, animais, de planta ou fungicasna cultura para a produção de produtos farmacêuticos; proteínas, anticorpos;

- o uso de antioxidantes mitocondrialmente alvejados paraaumentar a produtividade de plantas integrais quando usados para a produçãode produtos farmacêuticos: proteínas, anticorpos;

- o uso de antioxidantes mitocondrialmente alvejados paraaumentar a produtividade de células de leveduras ou outros fungos dosgêneros Saccharomyces, Piehia, Hansenula, Endomyees, Yarrowia na culturacelular, quando usados para a produção de produtos farmacêuticos: proteínas,anticorpos;

- o uso de antioxidantes mitocondrialmente alvejados paraaumentar a viabilidade de protoplastos de planta na cultura celular, quandousado para a produção de produtos farmacêuticos: proteínas, anticorpos,assim como para a produção de plantas geneticamente modificadas;

- o uso de antioxidantes mitocondrialmente alvejados para aprodução de plantas transgênicas para aumentar a viabilidade de regeneraçãode plantas, células de calo;

- o uso de pró-oxidantes mitocondrialmente alvejados para

combater microorganismos patogênicos: protozoários, fungos, bactérias.

Um próximo aspecto da invenção é fornecer um método para asíntese de antioxidantes mitocondrialmente alvejados usando-se um cátionlipofílico como a porção alvej adora.Breve Descrição dos Desenhos

A Fig. 1 mostra a penetração de SkQl através de umamembrana artificial;

A Fig. 2 demonstra oxidação espontânea de derivados dequinol MitoQe SkQl;

A Fig. 3 mostra o aumento da taxa de oxidação de "MitoQ" e"SkQ 1" derivados de quinol na introdução de um radical de superóxido nosistema. A é a taxa de oxidação das formas reduzidas tanto pelo ar oxigênioquanto pelo radical de superóxido; B é a taxa de oxidação das formasreduzidas pelo radical de superóxido apenas;

A Fig. 4 mostra redução de "MitoQ" e "SkQ 1" pela cadeiarespiratória de mitocôndrias de fígado de rato (0,2 mg/ml de proteína)energizada por succinato (5 mM) na presença de 2 μΜ de rotenona;

A Fig. 5 descreve a oxidação de quinóis "MitoQ" e "SkQ 1"pela cadeia respiratória de mitocôndrias de fígado de rato energizada porsuccinato (5 mM) na presença de 2 μΜ de rotenona. Depois da reduçãocompleta de derivados de quinol, a cadeia respiratória foi bloqueada por 25mM de malonato e, a taxa de reoxidação de "MitoQ" e "SkQ 1" foi medida;

A Fig. 6 mostra o efeito citotóxico de "MitoQ" e "SkQ 1" emcélulas Hela. A porcentagem de células vivas é proporcional a O.D. (a 492nm) de MTT-formazan;

A Fig. 7 mostra a influência de SkQ e algumas outraspreparações no desenvolvimento da degeneração de retina em ratos OXYS. Aporcentagem dos olhos que têm alterações degenerativas na região macular daretina é plotado junto ao eixo Y;

A Fig. 8 mostra a porcentagem dos olhos com alterações demácula do 2o estágio. A administração de SkQl não diminuiu apenas amorbidez de maculodistrofia, mas também reduziu substancialmente o graude alterações de mácula. A porcentagem dos olhos com maculodistrofia do 2oestágio é plotada junto ao eixo Y;

A Fig. 9 mostra alterações degenerativas na região macular daretina em ratos OXYS antes da administração e depois de um curso de 45 diasde KBr5 SkQl ou vitamina E;

A Fig. 10 descreve a influência de SkQl e algumas outras

preparações na morbidez de catarata em ratos OXYS. A porcentagem dosolhos que têm alterações do cristalino é plotada junto ao eixo Y;

A Fig. 11 mostra a porcentagem dos olhos com alterações docristalino do 2° estágio. A administração de SkQl não diminuiu apenas amorbidez, mas também reduziu substancialmente o grau de catarata. Aporcentagem dos olhos com alterações correspondentes ao 2o estágio dedoença é plotada junto ao eixo Y;

A Fig. 12 mostra a condição do cristalino em ratos OXYSantes da administração e depois de um curso de 45 dias de KBr, SkQl evitamina E;

A Fig. 13 mostra a influência das três concentrações diferentesde SkQl na taxa de sobrevivência de camundongo com carcinoma ascítico deEhrlich implantado;

A Fig. 14 mostra o efeito de proteína, inibidor de síntese,cicloeximida D (ChD) e antioxidantes em células de Yarrowia lipolyticatratadas com 5 mM de peróxido de hidrogênio. A taxa de sobrevivência foiestimada usando-se o número de colônias desenvolvidas em meio sólido. Ascélulas foram transferidas ao meio sólido depois de 3 horas de incubação.

Melhor Modo de Realizar a Invenção

Os seguintes Exemplos Experimentais são dados para ilustrar apossibilidade de realizar a invenção, em particular, a ação dos compostosinventivos correspondentes à estrutura (I). Estes exemplos são pretendidosapenas para suportar a validade das reivindicações, mas não devem serentendidos como limitante do escopo do pedido ou uso da invenção.Exemplo Experimental I: Síntese de compostos de estrutura (I)- rodamina G do éster 2,3-dimetil-l,4-benzoquinona-5-decílico

O composto SkQRl foi sintetizado, o qual corresponde àestrutura (I) e compreende um resíduo de rodamina G como o grupo alvejadore um resíduo de plastoquinona como o grupo efetor de antioxidante, uma vezque a plastoquinona é um antioxidante que ocorre naturalmente presente emtilacóides de protoplastos, isto é, de um da maior parte dos sítios saturados FRe ROS na natureza animada.

<formula>formula see original document page 19</formula>

Os seguintes reagentes e solventes foram usados no trabalho:2,3-Dimetil hidroquinona, ácido 11-bromoundecanóico, rodamina G, N5N'-dicicloexil carbodiimida, bromato de potássio, nitrato de prata, perssulfato deamônio, carbonato de césio adquirido pela Fluka, Aldrich, Sigma ou Merck; acromatografia de coluna foi realizada em gel de sílica "Silicagel 60" (0,063 -0,2 MM), Merck; dimetil formamida, diclorometano, benzeno, acetonitrila eoutros solventes foram domesticamente produzidos;

A TLC foi realizada em placas de "Kieselgel 60 F254"(Merck). Os compostos contendo os grupos absorventes na região UV foramdetectados com a ajuda de quimioscópio de Brumberg. Os compostoscontendo um anel de quinona foram detectados em vapores de amônia. Oscompostos contendo rodamina foram visualmente detectados.

Os espectros de absorção UV foram registrados em umespectrômetro «Cary 50 Bio» (Varian).

A análise de HPLC e a purificação foram realizadas em ummecanismo Adjilent 1100 em gradiente de acetonitrila em 10 mM de H3PO4.

Prosseguiu-se com os espectros de massa MALDI-TOF e ESIem um espectrômetro de massa Ultraflex ou Autoflex (Bruker Daltonics,Alemanha), equipado com um laser de 337 nm.

Os espectros infra-vermelhos foram registrados em películaem um Specord 40.

Os espectros H e C-RMN foram registrados a 303 Kusando-se um espectrômetro de Bruker Avance-400.

A síntese de SkQRl é ilustrada no Esquema 1.

Esquema 1

<formula>formula see original document page 20</formula>Síntese de 2)3-dimetil-l,4-benzoquinona (2)

0,83 g (6 mmoles) de 2,3-dimetil hidroquinona foi adicionadoà solução de 0,34 g (2 mmoles) de bromato de potássio em H2O (6 ml) e 5Nde ácido sulfurico (0,3 ml). A mistura foi aquecida a 60°C e agitada. Atemperatura de reação foi então elevada para 80C. Na conclusão da reação amistura foi esfriada até a temperatura ambiente e extraída com éter. Ascamadas orgânicas combinadas foram retro-lavada com H2O, secadas comCaCl2 anidro, filtradas e o filtrado foi evaporado a vácuo para obter, 0,74 g(90%) de produto bruto. O composto do título foi dissolvido em éter (20 ml) epassado através de uma camada de gel de sílica (30 χ 30 mm).

O gel de sílica foi lavado com éter várias vezes, o éter foiremovido a vácuo para obter 0,67 g de 2,3-dimetil-l,4-benzoquinona (purezade HPLC de 99,37%).

TLC: Rf 0,46 (clorofórmio); HPLC: τ - 17,6 min (0 - 90% deB por 26,4 min; A: 10 mM de H3PO4; B: acetonitrila); P. f. 60° C; UV(metanol): Amax 209 nm, 256 nm, 344 nm.

Síntese de 2,3-dimetil-5-(10'-bromodecil)-l,4-benzoquinona (3)

136 mg (1 mmol) de 2,3-dimetil-l,4-benzoquinona (2) foramdissolvidos em uma mistura de acetonitrila e H2O (10 ml, (1:1)). A soluçãoresultante, 292 mg (1,1 mmol) de ácido 11-bromoundecanóico e nitrato deprata (170 mg, 1 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi aquecidade 60 a 70° C e uma solução de perssulfato de amônio (228 mg, 1 mmol) emH2O (10 ml) foi adicionada às gotas. O aquecimento continuou por mais 1hora, depois a mistura de reação foi esfriada e extraída com éter. As camadasetéreas combinadas foram retro-lavadas com uma solução de bicarbonato desódio a 5%, secadas com MgSO4, filtradas e, o solvente foi removido a vácuo.

O resíduo foi purificado por cromatografla cintilante em gel de sílica. Ocomposto do título (3) foi obtido como óleo vermelho escuro (70% derendimento).

TLC: Rf 0,62 (clorofórmio); HPLC: τ = 23 min (79 - 90% deB por 26,4 min; A: 10 mM H3P04; B: acetonitrila); UV (metanol): Xmax 207nm, 258 nm, 344 nm; MALDI-TOF MS: calc. para C18H27O2Br: 355,3;encontrado m/z 356,1 (MH+; 100%); IR: 2928, 2336, 1600, 1496, 1304 cm-1.

Síntese de sal de césio de rodamina G (4)

1 ml de solução aquosa 2M de carbonato de césio foiadicionado a uma solução de rodamina G (200 mg, 0,48 mmol) em metanol (6ml). O produto foi filtrado, lavado com éter e secado a vácuo a 60° C. 210 mg(80%) de composto do título (4) foram obtidos como sólido cristalino violetaescuro.

P. f. > 250° C (decomp.)

Síntese de 10-(2',3'-dimetil-l',4'-benzoquinona-5'-decanoil)rodamina G

O composto (4) (190 mg) foi colocado em suspensão emDMFA (5 ml) e o composto (3) (200 mg, 0,56 mmol) foi adicionado a este. Amistura de reação aquecida a 50° C e agitada por 48 horas, depois concentradaa vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em gel de sílicaem um sistema de clorofórmio-metanol (4:1). A fração que contém ocomposto do título foi evaporada até a secura. Ao resíduo seco, HCl 5N emdioxano (150 μl) foi adicionado, depois evaporado novamente e cristalizadosob benzeno para produzir 160 mg (65%) do composto do título.

TLC: Rf 0,68 (clorofórmio - metanol, 4:1); Rf 0,80(clorofórmio-metanol-água, 65:25:4);

HPLC: τ = 23,9 min (0 - 90% de B por 26,4 min; A: 10 mM deH3PO4; B: acetonitrila);

P. f. de 178 a 180° C (decomp.);

UV (metanol): Xmax 250, 350, 535 mm, ε535 = 80000;

Análise elementar: calc. para C44HCIN2O5: C, 72,86; H, 7,36;Cl, 4,89; Ν, 3,86; encontrado: C, 72,53; Η, 7,21; Cl, 4,22; Ν, 3,61;

ES MS: calc. para C44HsiN2O5 688,89; encontrado m/z 689,4(MH+; 100%);

IR (película): 3200, 2928, 2336, 1700, 1685, 1600, 1496, 1304cm-1;

<formula>formula see original document page 23</formula>

Seguindo-se um procedimento similar, um outro compostoestrutura como indicada acima): 0,95 - 1,25 ppm (br, m, 14H, 2", 3", 4", 5",6", 7", 8" - (CH2)7); 1,24 ppm (t, 6H, J= 6,8 Hz, 2"", 2""' -(CH3)2); 1,41ppm (q, 2H, J = 7,5 Hz); 1,92 e 1,94 (cada - s, 3H, 4"', 5"' - (CH3)2); 2,09ppm (s, 6H, 2,7 -(CH3)2); 3,48 ppm (q, 4H, - 1"", 1"" -(CH2)2); 3,85 ppm (t,2H, J = 6,3 Hz, 1" -CH2); 6,57 ppm (s, 1H, H3-); 6,80 e 6,91 (cada - s, 3H, H1,H5 e H4, H8); 7,44 ppm (dd, 1H; J1 = 7,8, J2 = 1 Hz; H6-); 7,74 ppm (t, 2H, J= 5,8 Hz; 3,6 -NH); 8,60 - 8,70 ppm (m, 2H, H4- e H5-); 8,22 (dd, 1H, J1 =8,2; J2 =1,1 Hz, H3-).

13C-RMN (400 MHz; DMSO-d6): 11,59 e 11,98 ppm (4"',5"' -(CH3)2); 13,45 ppm (2"" e 2'"" -(CH3)2); 17,29 ppm (2,7 -(CH3)2);25,07, 27,29, 27,57, 28,25, 28,39, 28,51, 28,55, 28,56 e 28,65 (2", 3", 4", 5",6", 7", 8", 9", 10" -(CH2)9); 37,86 (l"", 1"'" -(N-CH2)2); 64,96 (l" -CH2);93,45 (C4 e C5); 112,78 (C1 e C8); 125,32 (C4); 128,38 (C5=); 129,78 e 130,752(Cr e C2-); 130,20 e 130,22 (C5-, C8a e C9a); 131,77 (C2); 132,85 (C9-); 132,88(C3O; 139,79 e 140,36 (C4- e C5-); 148,40 (C1-); 155,71 e 156,6 (C4a-C10ae C3- - C6-); 164,98 (COOR); 186,91 e 187,00 (C3- e C6-).correspondente à estrutura (I) - brometo de 2,3-dimetil-,4-benzoquinona-5-decil-trifenilfosfônio foi preparado. Este composto difere do SkQRl descritoacima em que o grupo alvejador utilizado neste é trifenilfosfônio. Os gruposefetor e ligador são os mesmos como no composto descrito anteriormente. Asíntese de SkQl antioxidante mitocondrialmente alvejado é apresentado noEsquema 2:

Esquema 2

A síntese compreende as seguintes etapas:

1. Oxidação de 2,3-dimetilidroquinona (1) por bromato depotássio à 2,3-dimetil-l,4-benzoquinona (2) correspondente.

2. Adição de ácido 11-bromoundecanóico (3) à 2,3-dimetil-1,4-benzoquinona (2) obtida na presença de nitrato de prata e perssulfato desódio.

3. Formação de composto alvo (5) no curso da reação comtrifenilfosfina na atmosfera de oxigênio.

O composto obtido é um sólido altamente higroscópicomarrom amarelado.

A partir dos resultados de investigação, a estrutura docomposto alvo pelas técnicas de RMN, HPLC e MS, a estrutura do compostoobtido foi estabelecida para ser idêntica à fórmula prescrita. A pureza daamostra não foi menos do que 98,5%.

O controle de pureza do produto foi realizado por doismétodos: HPLC de alta pressão e PMR de alta resolução (500 MHz). Doismétodos de registro de pureza do produto SkQl foram requeridos em conexãocom propriedades de tensoativo pronunciadas deste composto, que tornam oprocesso cromatográfico difícil.

A concentração de SkQl na preparação obtida, comodeterminado pela HPLC, é de 98,55%. Os dados de RMN são apresentadosabaixo:

1H-RMN (CDCl3; δ, ppm; numeração atômica na estruturacomo indicado acima): 7,82 - 7,58 (m, 15H, aromáticos); 6,38 (s, 1H, H5); 3,6(m, 2H, CH2P(Ph)3); 2,25 (m, 2H,

CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2P(Ph)3); 1,90 (br s,6H, CH3); 1,55, 1,32, 1,15 (3m, 6H, 3CH2).

HQSC (DMSO; δ, ppm): 8,15 (br s, 1H, OH tautomérico),7,88 - 7,20 (m, 15H, aromáticos); 7,08 (br s, 1H, OH tautomérico), 6,38 (s,1H, H-5); 3,55 (m, 2H, CH2P(Ph)3); 2,4 (m, 2H,

CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2P(Ph)3); 2,05, 1,90(2s, cada um de 3H, CH3); 1,5 (m, 6H3 3CH2).

13C-RMN (DMSO; δ, ppm): 147,83, 144,65 (C-l, C-4); 134,75- 129,97 (Ph); 113,01 CH2P(Ph)3; 12,72, 11,89 (CH3).

ESI-MS (m/z): [M]+ calc. 537,7, encontrado 537,4

Também, seguindo-se um procedimento similar, um compostocorrespondente à estrutura (I) foi sintetizado: brometo de 10-(2-metil-5-metóxi-3,6-dioxo-1,4-cicloexadienil)-decil-trifenilfosfônio (DMMQ). Nestecomposto desmetoxiubiquinona é usada como o grupo efetor. Este compostopode interagir com radicais livres, espécies de oxigênio reativo e oxigênio,mas julgando, a partir de sua estrutura e do procedimento a partir doconhecimento atual do funcionamento de mitocôndrias, pode ser inferido queo dito composto não será reduzido pela cadeia respiratória mitocondrial, e,conseqüentemente, apresentará propriedades pró-oxidantes, citotóxicas.

Exemplo Experimental 2: "Transferência dos compostoscorrespondentes à estrutura (I) através da membrana de lipídeo planar

Foi mostrado que o composto de teste correspondente àestrutura (I) (composto SkQl foi usado) penetra através da membrana defosfolipídio de camada dupla planar, movendo-se ao longo do gradiente deconcentração e se distribui através da membrana de acordo com a equação deNernst. Portanto, SkQl é um cátion penetrante.

O procedimento experimental foi usado várias vezes antes nosexperimentos apontados na exploração da capacidade de íons diferentes parapenetrar através da membrana de lipídeo de camada dupla planar e é descritoem detalhes por Starkov A.A., Bloch D.A., Chemyak B.V., Dedukhova V.I.,Mansurova S. A. Symonyan R.A., Vygodina Τ. V., Skulachev V.P.,1997,

<table>table see original document page 26</column></row><table>Biochem. Biophys. Acta, 1318, 159-172. Este método compreende o uso deduas câmaras preenchidas com uma solução com base em água e separadaspor uma membrana de camada dupla e pelo registro eletrométrico datransferência de compostos carregados capaz de penetrar através de talmembrana de uma câmara em uma outra.

Em nosso experimento a membrana foi fabricada de umamistura de fosfatidilcolina e difitonail dissolvido em decano; ambas ascâmaras foram preenchidas com 50 mM de TrisHCl, pH 7,4, contendo 10" Mde SkQl.

SkQl foi titulado em concentrações de IO"7 M a IO"5 M. Foimostrado que dentro da faixa de 4'IO"6 M a 4'IO"5 M a distribuição de SkOlobedece a equação de Nernst para cátions que penetram em membrana ideais.Em concentrações menores a equação de Nernst não é satisfatória (osresultados são apresentados na Fig. 1).

Conseqüentemente, o composto SkQl (2,3-dimetil-l,4-benzoquinona-5-decil-trifenilfosfônio) é uma substância solúvel em gorduracapaz de penetrar através de membranas biológicas na forma catiônica.

Exemplo Experimental 3: "Propriedades antioxidantes decompostos correspondente à estrutura (I)".

Foi mostrado que o composto de teste correspondente àestrutura (I) - SkQl antioxidante mitocondrial - é um antioxidante mais forteque se distingue na atividade dos antioxidantes relatados anteriormente empublicações e reivindicados na US 6.331.532 como "mitocondrialmentealvejado" (composto MitoQ).

A estabilidade prorrogada das formas reduzidas (quinólicas) deSkQl e MitoQ sob condições aeróbicas foi examinada pela análise dosespectros de absorção absoluta destes compostos em uma faixa de 240 a 310nm, usando-se um espectrofotômetro Pye Unicam SP1100 de feixe duplo(Inglaterra). Os derivados de quinona foram reduzidos com tetraidroborato desódio no meio de medição contendo 20 mM de MOPS-KOH, pH = 7,6. Acubeta de controle não contém SkQl ou MitoQ5 o agente de redução foiadicionado a ambas cubetas, as medições foram realizadas exatamente depoisque o hidrogênio parou de evoluir. O grau da redução das quinonas foiestimado a partir do tamanho da área de pico pela pesagem contra o valor deabsorção absoluto a 267 nm (absorção máxima). Como pode ser visto a partirdos dados apresentados na Fig. 2, a forma reduzida (quinólica) de SkQl émais resistente à oxidação pelo ar do que MitoQ.

A fim de comparar a atividade antioxidante das formasreduzidas, medimos a taxa de oxidação de quinóis pelos radicais desuperóxido-ânion gerados em um sistema de xantina oxidase/hipoxantina. Osdados obtidos apresentados na Fig. 3a indicam que a taxa de oxidação deSkQl é aproximadamente duas vezes aquela de MitoQ. Isto sugere que SkOlé mais ativo como um antioxidante e sua forma reduzida (ativa) é maisresistente à oxidação espontânea pelo ar oxigênio do que MitoQ é e tem umaafinidade maior para o radical superóxido. A Fig. 3b ilustra a taxa deoxidação de formas quinólicas reduzidas pelo radical superóxido, menos aoxidação contribuído pelo ar oxigênio. E fácil ver que SkQl interage com oradical de superóxido melhor do que MitoQ faz.

Os experimentos acima demonstram de modo convincente queSkQl possui propriedades antioxidantes muito mais fortes do que seusanálogos. Na solução, SkQl é capaz de reagir eficazmente com ROS eneutralizá-la. Uma vantagem essencial deste antioxidante é sua baixareatividade ao oxigênio convencional e, conseqüentemente, suas propriedadespró-oxidantes inferiores.

Exemplo Experimental 4: "Investigação da interação decompostos correspondentes à estrutura (I) com mitocôndrias".

A vantagem chave dos antioxidantes mitocondrialmentealvejados proposta dentro da estrutura desta invenção é sua capacidade de serreduzidos pela cadeia respiratória de mitocôndrias. Esta propriedade é adistinção fundamental destes compostos de antioxidantes convencionais: apossibilidade de neutralização segura de formas de radical dos compostosinventivos e, por isso, a possibilidade de neutralização segura da forma de radical dos compostos inventivos e o uso repetido destes para a neutralizaçãode FR e ROS.

A fim de examinar se os compostos de teste (SkQl e seu análogoMitoQ) podem ser reduzidos pela cadeia respiratória de mitocôndrias, a taxa dealterações na razão entre as formas oxidadas e reduzidas dos compostos de teste foi medida na presença de substratos respiratórios em um meio usado para oisolamento de mitocôndrias de fígado de rato. As medições foram realizadas napresença de mitocôndrias (concentração de proteína de 0,2 mg/ml).

Os dados obtidos (Figs. 4, 5) indicam que ambos os compostosde teste são facilmente reduzidos por mitocôndrias energizadas nas mesmas taxas e subseqüentemente são oxidados em taxas que são muito mais altas doque a taxa de oxidação espontânea (por ar oxigênio).

Este Exemplo experimental sugere que SkQl não elimina arespiração mitocondrial em concentrações de até 10 μΜ, mas estimula arespiração "conjugada" de mitocôndrias, isto é, funcionamento normal destas. Também foi mostrado que SkQl é estável sob condições de incubaçãoem meios biológicos para os períodos de tempo correspondentes à duraçãodos experimentos (dezenas de minutos). Este Exemplo favorece o aspecto queSkQl nos experimentos in vitro com indução de oxidação de quinol reduzidopor mitocôndrias através da agência de ROS gerado (radical de superóxido na reação de xantano oxidase) demonstrou uma vantagem óbvia sobre MitoQquanto à afinidade de ROS e estabilidade com o tempo.

Exemplo Experimental 5: "Comparação da toxicidade deantioxidantes mitocondriais diferentes para células na cultura".

Neste Exemplo experimental o nível de toxicidade do MitoQantioxidante mitocondrial divulgado na técnica anterior é comparado comaquele do composto SkQl proposto dentro da estrutura da presente invenção.

Neste curso do experimento, SkQl e MitoQ foram adicionadosem concentrações iguais a uma cultura celular, e a porcentagem de célulasvivas foi calculada depois de 2 horas de incubação. Os resultados obtidosmostrados na Fig. 6 demonstra, não ambiguamente, que SkQl tem umatoxicidade substancialmente inferior. Desse modo, LD50 (a concentração emque 50% das células morrem) para SkQ é de 20 μΜ, enquanto para MitoQLD50 é mais do que 3 vezes menor, cerca de 7 μΜ. estes resultados tambémsão confirmados por um outro experimento onde os efeitos tóxicos de SkQ eMitoQ nas células na presença de peróxido de hidrogênio (em concentraçõesde 50, 100 e 200 μΜ) foram estudados. Como no caso anterior, MitoQ provouser um composto mais tóxico. LD50 de MitoQ contra o fundamento de 100μΜ de peróxido de hidrogênio foi de 4 μΜ, considerando que aquele de SkQfoi 20 μΜ, isto é, não diferente do LD50 da preparação pura.Conseqüentemente, contra o fundamento de tensão oxidante forte a toxicidadede SkQ é mais do que 5 vezes menor do que a toxicidade de MitoQ.

Portanto pode ser afirmado que os antioxidantes mitocondriaiscorrespondentes à estrutura (I), fornecidos pela presente invenção, têm umatoxicidade essencialmente menor do que as substâncias divulgadas no estadoda técnica e reivindicado neste como antioxidantes mitocondriais. Estadiferença pode ser facilmente explicada levando-se em consideração osresultados obtidos no Exemplo experimental 3 onde o antioxidante superior eas propriedades pró-oxidantes menos pronunciadas de SkQl quandocomparados a MitoQ foram demonstrados.

Exemplo Experimental 6: "Efeito protetor dos compostoscorrespondentes à estrutura (I) em células humanas de tipos diferentes".

Neste Exemplo estabelecemos que o composto correspondenteà estrutura (I) com a função antioxidante (antioxidante mitocondrialmentealvejado) protege células na cultura a partir de uma tensão oxidante causadapor H2O2.

Os fibroplastos diplóides normais de pele e pulmão humanos,células de carcinoma de útero humano (células HeLa) e células de linfomahumano (cepa U 937) foram usados nos experimentos. As células foramcultivadas em meio padrão (DMEM ou RPMI) na presença de um soro fetal a10% a 37° C na atmosfera de CO2 a 5%. Os experimentos foram realizadosem culturas desenvolvidas de 30 a 50% de confluência. H2O2 foi adicionadouma vez e as células foram analisadas de 18 a 24 horas depois da adição. Amorte apoptótica foi monitorada pela condensação de cromatina epela fragmentação de núcleo depois de tingir as células com Hoechst33342 (1 μg/ml, 15 minutos). 300 - 500 células foram levadas emconsideração a partir de cada preparação e foi calculada a média dos dadossobre 3-5 experimentos independentes. A morte necrótica foi determinadatingindo os núcleos com iodeto de propídio (2 μg/ml, 5 minutos).

Em experimentos preliminares as concentrações de H2O2 quecausam apoptose considerável (60 — 80%) com nenhuma necrose detectávelem tipos de célula diferentes foram determinadas como 50 - 200 μΜ. Foiconfirmado que a apoptose em todos os casos foi acompanhada por umadiminuição do potencial de membrana mitocondrial, liberação de citocromo ca partir de mitocôndrias no citoplasma e ativação de caspases.

Nos experimentos com o antioxidante SkQl foramdeterminadas as condições ótimas para efeito anti-apoptótico protetor. Foimostrado que a incubação de células com SkQl 20 nM durante 6 diasaumenta apreciavelmente a resistência de células para H2O2. Não há nenhumanecessidade para a presença de um antioxidante no meio de incubação comH2O2 e, esta presença por si só não intensifica o efeito protetor. Em particular,nos experimentos com fibroblastos de pulmão humano 100 μΜ de H202causaram 60+/-5% de apoptose da população celular, enquanto depois da pré-incubação com 20 nM de SkQl a figura respectiva foi 1+1-3%. Uma proteçãoquase completa foi também observada na concentração de H2O2 de 200 μΜ(80+/-5% de apoptose no controle e 12+/-5% de apoptose depois da pré-incubação com 20 nM de SkQl). O efeito protetor do SkQl foi retido quandoa concentração de H2O2 foi aumentada até 500 μΜ, mas, por outro lado,houve uma morte total de células por necrose sob tais condições. Osresultados similares foram obtidos com outros tipos de células.

Desse modo, os antioxidantes do tipo SkQl em concentraçõesextremamente baixas protege eficazmente células de tipos diferentes daapoptose causada pela tensão oxidante. Portanto, tais compostos ecomposições com base nisso, devem ser eficazes para a prevenção de mortecelular programada em tecidos, órgãos diferentes no organismo todo. Estapropriedade descoberta do SkQ pode ser usada para tratar e prevenir doençasem que a redução de tensão oxidante e/ou bloqueio da morte celularprogramada é um método terapêutico eficaz.

Exemplo Experimental 7: "Prevenção de propagação desinal apoptótico pelos compostos correspondentes à estrutura (I)"

A transmissão de longa distância do sinal apoptótico entre ascélulas é bloqueada por antioxidantes do tipo SkQl.

Nestes experimentos as células da linha HeLa foram usadas.As células cultivadas em uma lâmina de vidro foram tratadas com agentesindutores de apoptose diferentes (fator de necrose tumoral (TNF),estaurosporina, H2O2) por 3 horas. Depois, a lâmina de vidro com células(indutor) foi lavada para remover estes reagentes e colocadas em uma placade Petri para entrar em contato com a lâmina de vidro (recipiente) com célulascultivadas na ausência de qualquer agente que induz apoptose. Depois de 16 -18 horas de subseqüente crescimento conjunto e tingimento das células comHoechst 33342 como descrito acima, a apoptose em ambas as lâminas devidro foi analisada.Os experimentos preliminares mostraram que quando aapoptose na lâmina indutor foi de 80 - 90%, 30 — 50% das células na lâminarecipiente também apresentaram morfologia apoptótica. Os experimentos decontrole demonstraram que neste modelo não houve nenhuma transmissão doagente que induz apoptose, inicial, às células recipientes. A transmissão dosinal apoptótico não requer contato direto das células e é enfraquecido quandoo volume do meio de incubação aumentou. A adição de catalase (2500 E/ml)no meio para a incubação conjunta preveniu a apoptose das células recipientese ao mesmo tempo não teve nenhuma influência significante na apoptose dascélulas indutoras (causada por TNF ou estaurosporina). Desse modo, omediador principal do sinal de apoptose foi H2O2.

A incubação das células indutoras com 20 nM de SkQl por 6dias não previne a apoptose causada por TNF (10-50 ng/ml, com adição de 1μΜ de emetina) ou estaurosporina (2 μΜ). Depois de colocar ambas aslâminas de vidro em contato e a subseqüente incubação conjunta, a apoptosecausada por TNF na lâmina indutor foi de 95+/-5% no controle e de 90+/-5%depois da incubação com o SkQl. A apoptose na lâmina recipiente foi de37+/-4% no controle e 17+/-3% depois da pré-incubação do indutor com oSkQl. Deve ser levado em consideração que a apoptose no experimento decontrole sem TNF foi de 12+/-3% em ambas as lâminas devido ao efeitotóxico de emetina. Portanto o efeito protetor do SkQl foi quase 100%. A pré-incubação das células recipientes com o SkQl deu resultados similares. Nessecaso a apoptose diminuiu para 16+/-4%. O efeito protetor similar também foiobservado na indução de apoptose com estaurosporina.

As medições mostraram que a incubação conjunta das célulasindutoras (pré-tratadas com TNF) e das células recipientes resultaram em umaumento significante de concentração de H2O2 no meio (quando comparadoao controle onde as células não tratadas foram incubadas) já em 2-3 horasdepois de colocar as lâminas em contato. A concentração de H2O2 medida 24horas mais tarde foi de 140+/-20 nM considerando que esta seria apenas de40+/-10 nM se as células indutoras fossem pré-incubadas com o SkQl. A pré-incubação das células recipientes com o SkQl não leva a uma diminuição daconcentração de H2O2.

Conseqüentemente, os antioxidantes do tipo SkQl emconcentrações extremamente baixas bloqueiam a geração do sinal apoptóticopelas células que foram tratadas com agentes que induzem apoptose denatureza diferente. Os mesmos antioxidantes protegem eficazmente as célulasrecipientes da apoptose causada pelo sinal transmitido através do meio dascélulas indutoras.

A transmissão do sinal apoptótico pode constituir a base dapatogênese de doenças (infarto, acidente vascular cerebral, patologias pós-traumáticas) em que partes de tecido prejudicadas são cercadas por uma zonade ampliação de células apoptóticas.

Exemplo Experimental 8: "Efeito protetor dos compostos

correspondentes à estrutura (I) contra dano fotodinâmico de células".

Os antioxidantes do tipo SkQl inibem o efeito tóxico deoxigênio singleto gerado na fotoativação de fotossensibilizadores e previnema morte celular necrótica causada pelo tratamento fotodinâmico demitocôndrias.

A proteção do efeito de dano de oxigênio singleto foi analisadaem uma membrana de lipídeo modelo contendo gramicidina e umfotossensibilizador de fltalocianina. As medições da corrente de íons atravésdo canal de gramicidina mostraram que a ativação do fotossensibilizador porum breve jato de luz resultou em uma rápida inatividade do canal. Este efeitofoi completamente bloqueado por azida de sódio, este sendo uma indicaçãoque oxigênio singleto foi o fator principal na inatividade de gramicidina.

A proteção do efeito fotodinâmico foi estudada usando-se umacultura de células HeLa. As células foram incubadas com o clorometil-X-rosamina fotossensibilizador (0,5 μΜ, 15 min) que se acumulou seletivamentenas mitocôndrias. As células foram irradiadas com luz verde (na absorçãomáxima do fotossensibilizador de 580 nM) através da objetiva de ummicroscópio Axiovert 200M (Zeiss, Alemanha) por 1-2 minutos e analisadas5 horas mais tarde. A morte necrótica foi detectada a partir do tingimento dosnúcleos com iodeto de propídio (2 μ^ιηΐ, 5 min).

Foi observado que o SkQl em uma concentração de 1 μΜprevine completamente a inatividade dependente de luz de gramicidina namembrana de lipídeo modelo contendo o fotossensibilizador de ftalocianina.

A morte celular necrótica de 100% foi observada depois dotratamento fotodinâmico das células. Por outro lado, a necrose depois dotratamento fotodinâmico foi de 25+/-5% se as células fossem pré-incubadascom 20 nM de SkQl por 6 dias. Quando 1 μΜ de SkQl foi adicionado 1 horaantes da iluminação, a morte celular necrótica foi de 15+/-5%. Um aumentoda concentração de SkQl não fornece proteção adicional, considerando queuma diminuição a 0,5 μΜ leva ao enfraquecimento perceptível do efeito.

A partir dos resultados obtidos uma conclusão pode serretirada daqueles oxidantes do tipo SkQl em concentrações extremamentebaixas, prevenir o efeito de dano de oxigênio singleto gerado na iluminaçãode fotossensibilizadores. Tais antioxidantes protegem eficazmente células danecrose causada pelo tratamento fotodinâmico, se o fotossensibilizador forlocalizado dentro das mitocôndrias.

Exemplo Experimental 9: "Efeito protetor de compostoscorrespondentes à estrutura (I) contra catarata relacionada com oenvelhecimento e distrofia macular".

Um aumento do período de vida humano médio em paísesdesenvolvidos leva ao envelhecimento progressivo da população mundial e éacompanhada por crescimento de morbidez com doenças relacionadas àidade, entre as quais, de acordo com relatórios recentes de WHO/OMS,distrofia macular e catarata manterão o terceiro lugar depois do câncer eosteoporose. A catarata e a degeneração macular sendo as causas principais decegueira em pessoas mais velhas, a determinação de fatores de risco paraestas doenças e o desenvolvimento de tratamentos profiláticos seguros são degrande importância econômica. O efeito da dieta no desenvolvimento decatarata e distrofia macular foi ativamente debatido na literatura. Os estudosepidemiológicos de doenças oculares relacionadas com a idade revelaramuma redução significante no risco relativo de degeneração macularrelacionado com a idade que se desenvolve em pacientes que recebemantioxidantes por um longo tempo. Entretanto, as tentativas de reduzir odesenvolvimento de catarata e distrofia macular com a ajuda de antioxidantesde maneira nenhuma nunca provaram ser bem sucedidas.

Entretanto o número de preparações farmacológicas enutrientes bioativos anunciados que têm propriedades antioxidantes cresce, aavaliação objetiva de sua eficiência, por via de regra, não é realizada. Enenhuma surpresa: avaliação correta dos resultados de terapia preventiva ésubstancialmente impedida pela detecção tardia e aspectos individuais dapatogênese destas doenças. Em tais situações é convencional recorrer amodelos animais e, como nossas investigações mostraram, as oportunidadesúnicas para avaliação da eficiência de preparações podem ser oferecidas pelacepa de ratos OXYS de senescência acelerada, que pode servir como ummodelo universal de envelhecimento do órgão de visão. A cepa OXYS deratos foi obtida pela seleção e procriação consangüínea de ratos da linhagemWistar suscetíveis ao efeito cataratogênico de galactose. O defeito metabólicogeneticamente condicionado expresso em uma resistência reduzida de ratosOXYS à tensão oxidante leva a tais alterações no seu organismo que pode serconsiderado como na síndrome de senescência acelerada. As alteraçõespatológicas nos cristalinos de ratos OXYS ocorrem na idade de 2 meses e, naidade de 6 meses a catarata é detectada em 100% dos ratos OXYS (assimcomo, contra 5% em ratos Wistar) e na idade de 12 meses a catarata afetaambos os olhos. De acordo com os dados ofitalmoscópicos, biomicroscópicose morfológicos, a catarata nos ratos OXYS corresponde a catarata senilhumana e desenvolve-se contra o fundamento de distrofia de mácula deprogressão. Os primeiros sinais da doença são manifestados nas 6 semanas deidade e para a idade de 4 - 6 meses a patologia alcança estágios pronunciados.Pela manifestação dos aspectos, o padrão de lesões de fundo de olho em ratosOXYS corresponde às alterações de retina observadas em pacientes humanoscom distrofia macular, tal como, degeneração corioretiniana involutivacentral.

A meta da presente parte da invenção foi investigar o efeito dapreparação de SkQ no desenvolvimento de catarata e distrofia macular emratos OXYS.

O estudo foi realizado usando-se um total de 120 machos deratos OXYS e Wistar. Os animais foram mantidos nos grupos de 5 indivíduossob condições de iluminação natural, abastecidos com um dieta granuladapadrão e água ad libitum. Na idade de 1,5 meses, depois da dilatação da pupilapreliminar com 1% da tropicamida oftálmica, os ratos foram submetidos aoexame oftalmoscópico usando-se um oftalmoscópio direto "Beta" (Alemanha).Durante um período de 1,5 a 3 meses, que é crítico para o desenvolvimento dealterações pronunciadas no órgão de visão dos ratos OXYS, aos animais foramdados SkQl (50 nmol por kg de peso corporal) ou, KBr (50 nmol por kg de pesocorporal) ou vitamina E - acetato de alfa-tocoferol ("Uralbiofarm"), 20 mg porkg). O último é tradicionalmente usado por nós como a referência padrão. Osanimais receberam os compostos em um pedaço pequeno de pão seco antes darefeição regular e, os grupos intactos receberam apenas um pedaço similar depão seco. Na conclusão do curso com os antioxidantes, os animais foram re-examinados. Para impedir a subjetividade na avaliação dos resultados derecepção das preparações, todas as inscrições de identificação forampreliminarmente removidas da gaiolas em que os animais foram mantidos.

A condição dos cristalinos foi avaliada de acordo com osistema de contagem adotado na prática clínica em pontos que variam de 0 a 3: 0 - a lente é clara; 1 - turvação fraca marcada; 2 - pontos múltiplos deturvação e, 3 - turvação intensa do córtex ou núcleo da lente. A presença e ograu de alterações marcadas na área macular foram avaliados de acordo com aclassificação geralmente adotada: 0 - nenhuma alteração; 1 - o 1° estágio depatologia, quando pequenos depósitos amarelos, conhecidos como "drusen"aparecem no pólo posterior da lente; 2 - o 2° estágio, desenvolvimento de umponto amarelo proeminente com margens de contorno nítido com o tamanhode 0,5 a 1 do diâmetro do disco (esfoliação exsudativa de epitélio retinianopigmentado); e 3 - o 3° estágio com hemorragia extensiva na área macular.

Resultados

O exame oftalmoscópico não revela qualquer alteração noscristalinos ou nos cristalinos e na área macular da retina em ratos Wistar de1,5 e 3 meses de idade. Em ratos OXYS, ao contrário, catarata precoce (1contada) foi observada em 20% dos casos e degeneração macular do 10estágio - em 10% dos casos na idade de 1,5 meses.

Na idade de 3 meses no grupo intacto de controle deratos OXYS as alterações patológicas dos cristalinos foram observadasem 90% de olhos examinados, incluindo 35% dos olhos com o 2° estágio decatarata. A distrofia macular foi observada em 85% dos olhos do grupo decontrole de animais, dos quais 16% corresponderam ao 2° estágio destapatologia (Fig. 8).

No grupo dos ratos OXYS que receberam KBr, as alteraçõesdo cristalino foram observadas em 93% dos olhos, com 57% do número totaldos olhos tendo o 2° estágio do desenvolvimento de catarata. As alterações naárea macular da retina foram observadas em 87%) dos olhos dos animais destegrupo e 13% destas alterações corresponderam ao 2° estágio da doença.Nos animais que receberam SkQl algumas alterações docristalino foram registradas em 46% de casos e, todos estes corresponderamao 1° estágio de catarata. As alterações na área macular da retina nos ratosOXYS deste grupo foram reveladas em 38% dos casos e tambémcorresponderam ao I0 estágio de degeneração macular.

Nos ratos que receberam vitamina E, na idade de 3 meses asalterações do cristalino foram registradas em 58% dos casos, com 12% dasalterações correspondentes ao 2o estágio de catarata. As alterações na áreamacular da retina foram reveladas em 54% dos ratos OXYS deste grupo,incluindo 8% correspondentes ao 2o estágio de degeneração macular. Osresultados destes experimentos são mostrados graficamente nas Figuras 7-12.

Desse modo, este exemplo experimental demonstra de modoconvincente a eficiência da aplicação de SkQl na prevenção de doençasoculares relacionadas com a idade, e, conseqüentemente, a eficiência deantioxidantes mitocondriais correspondentes à estrutura (I) para combaterdoenças associadas com tensão oxidante.

Exemplo Experimental 10: "Ação protetora de SkQlantioxidante mitocondrial no músculo cardíaco".

E conhecido que a espécie de oxigênio reativo (ROS) tem efeitosreguladores ou tóxicos no músculo cardíaco, dependendo da sua concentração.Durante o teste da preparação de SkQl, sua capacidade de modular a ação deROS foi encontrada. Os experimentos foram realizados nos corações isolados deratos que foram administrados a preparação de SkQl intravenosamente ou comalimento (50 μg/kg). O coração foi isolado 2 horas depois da administraçãointravenosa da preparação ou 2 semanas depois da administração com alimento.A perfusão retrógrada do coração aconteceu seguindo-se um procedimentoconvencional com solução de Krebs em uma taxa constante. A pressão deperfusão (PP) registrada caracterizou o tônus dos vasos coronários. A freqüênciacardíaca e a pressão isovolumétrico no ventrículo esquerdo também forammedidas. As alterações nestes parâmetros foram registradas em umaadministração de 40 minutos de 150 μΜ de H2O2, um gerador de ROS padrão.

Nesta série de experimentos com uma administração de SkQlintravenosa única, um aumento de duas vezes na taxa de perfusão foi seguidoem ambos os grupos por uma elevação de pressão de perfusãoaproximadamente igual (120 - 125 mm Hg). A introdução de H2O2 produziuefeito de duas fases usual: um declínio de PP inicial foi seguido por seuaumento. No grupo de controle o nível de PP mínimo foi de 95+5 mm Hg,enquanto no grupo dos animais que receberam SkQl este foi de 77+2 mm Hg(p<0,02). O declínio de PP máximo quando comparado com o nível inicialantes da introdução de H2O2 foi, em uma média, -28+3 mm Hg e -43+5 mmHg, respectivamente (p <0,05). Nesta série de experimentos com entrada deSkQl prolongada, o declínio de PP máximo no grupo de controle foi emmédia -21+5 mm Hg3 enquanto no grupo dos animais que receberam SkQleste foi de -38+5 mm Hg (p <0,03). A diferença significante entre os grupostambém permaneceu no fim da introdução de H2O2: -5+6 mm Hg e -29+6 mmHg, respectivamente (p<0,03). Desse modo, tanto a administração de SkQlsimples quanto prolongada potencializaram o efeito vasodilatador inicial deH2O2. Além disso, na administração prolongada de SkQl o efeito tóxico deH2O2 nos vasos coronários diminuiu.

Desse modo, é possível concluir que a preparação de SkQlpotencializa o efeito regulador e reduz o efeito tóxico de ROS nos vasoscoronários de coração isolado. Este efeito de SkQl pode ser usado paracombater doenças cardiovasculares.

Exemplo Experimental 11: "Efeito de compostoscorrespondentes à estrutura (I) na morfologia e mobilidade de célulasnormais e tumorais".

Os antioxidantes do tipo SkQl causam alterações morfológicasde células na cultura, que são acompanhadas por uma diminuição de suamobilidade e uma intensificação da adesão de células ao substrato.

Os fibroblastos normais da pele e pulmões humanos e célulasHeLa foram cultivados em uma densidade celular baixa (20 - 30% deconfluência). A morfometria das células foi realizada pela medição de suaárea, dispersão e alongamento. As estruturas de citoesqueleto foram estudadaspelo tingimento das preparações de célula fixa com faloidin-rodamina(filamentos de actina), anticorpos contra tubulina (microtúbulos) e vinculina(contatos com substrato). A mobilidade das células foi estudada usando-seuma micro câmara de vídeo.

Os fibroblastos pré-incubados com 20 nM de SkQl por 6 diastiveram uma morfologia agudamente alterada. Uma área média de células foi 2,9vezes maior, o índice de dispersão diminuído por um fator de 2,4, e o índice dealongamento diminuiu de 2,34 para 0,69. O teor de filamentos de actina aumentou3,7 vezes, de modo que sua densidade por área de unidade correspondeu a 136%de controle. Os filamentos de actina foram reunidos em feixes grandes - fibrilas detensão. O número de contatos com o substrato aumentou muito. A mobilidade dosfibroblastos caiu agudamente. Todas as alterações observadas não diminuem ataxa de proliferação de fibroblasto. As medições similares realizadas em célulasHeLa mostraram que sua área média aumenta 2,6 vezes (sem nenhuma alteraçãonos parâmetros de dispersão e alongamento), o teor de filamentos de actina crescede modo que a densidade média permanece inalterada.

Deste modo, as alterações morfológicas de células e adiminuição de sua mobilidade na resposta ao tratamento com antioxidantes dotipo SkQl apontaram para uma redução na capacidade das células paraproliferação e metástase.

Exemplo Experimental 12: "Efeito citotóxico doscompostos correspondentes à estrutura (I) em células tumorais".

Os compostos correspondentes à estrutura (I) e que têmfunções pró-oxidantes e que modificam a proteína, podem induzir a aberturado poro não seletivo em mitocôndrias, o inchaço de mitocôndrias, a liberaçãode citocromo c do espaço de intermembrana no citoplasma e, apoptose. Osinibidores alvejados mitocondrialmente de proteínas anti-apoptóticas podempromover a apoptose causada por estes compostos e medicamentosquimioterapêuticos conhecidos na técnica.

Foi mostrado que os pró-oxidantes e os compostos ditióisvicinais de reticulação (óxido de fenilarseno, PAO) induzem a abertura doporo não seletivo e o inchaço de mitocôndrias ambos em um sistema de livrede célula e em células. Em particular, nos experimentos com linfócitos detimo, a indução do poro mitocondrial com PAO levou à liberação de íons Ca+ das mitocôndrias no citoplasma. Usando-se microscopia de elétron, asmitocôndrias com uma matriz inchada foram observadas nestas células. PAOpossui uma toxicidade alta não específica que não permite o uso de PAO nainvestigação do mecanismo de liberação de citocromo c e na apoptoseassociada. Foi mostrado em alguns modelos de célula que os agentes queinduzem a abertura de poro também promovem a liberação de citocromo c nocitoplasma e a apoptose. Pode ser presumido que a liberação alvejada de PAOe os compostos similares nas mitocôndrias diminuirão sua toxicidade nãoespecífica e permitirão a indução de apoptose nas células alvo. Foi mostradoanteriormente que os compostos que carregam uma carga positiva (derivadosde fosfônio e rodamina) acumulam-se e são retidos nas mitocôndrias decélulas tumorais de crescimento rápido muito mais eficazmente do que nasmitocôndrias de células normais. A informação acima dá terreno para esperarque as preparações anticancerígenas eficazes e seletivas sejam produzidas nabase de compostos correspondentes à estrutura (I).

Exemplo Experimental 13: "Efeito anticancerígeno decompostos correspondentes à estrutura (I) no caso de carcinoma ascítico".

Para verificar se os compostos de estrutura (I) podem ser úteisno tratamento de doenças oncológicas, testamos o efeito de SkQl emcamundongo com carcinoma ascítico Ehrlich artificialmente induzido (ummodelo padrão de desenvolvimento de uma doença oncológica aguda).

SkQl foi dado ao camundongo de linhagem NMRI junto comágua para beber em várias concentrações: 10, 1 ou 0,1 μΜ. Os resultados(taxa de sobrevivência de camundongo com carcinoma ascítico de Ehrlichpreliminarmente induzido) são mostrados na Fig. 13. O controle negativo paraeste experimento foi a água, enquanto que o controle positivo foi a cisplatinamedicamentosa anticancerígena bem conhecida.

Os resultados obtidos demonstram o efeito antitumoral daspreparações anticancerígenas mitocondrialmente alvejadas correspondente àestrutura (I).

Exemplo Experimental 14: "Efeito fotodinâmico decompostos alvejados seletiva e mitocondrialmente".

Os compostos correspondente à estrutura (I) e que realizam asfunções fotossensibilizadoras podem induzir a liberação de citocromo c doespaço de intermembrana no citoplasma e a apoptose.

Foi mostrado que os protótipos de fotossensibilizadores quecarregam uma carga positiva (rodaminas, clorometil-X-rosamina) acumulam-se nas mitocôndrias e induzem a apoptose em células tumorais de tiposdiferentes, submetidas a iluminação moderada. As moléculas nãomitocondrialmente alvejadas similares causam principalmente morte celularnecrótica sob iluminação (que pode dar complicações inflamatórias potênciasna terapia fotodinâmica). Os fotossensibilizadores protótipos estudados atéagora não são usados na prática pela razão de que seu rendimento dequantidade baixa e absorção máxima na região verde do espectro. Osfotossensibilizadores com base nos derivados de protoporfirina e ftalocianina,usados na prática clínica, têm um rendimento de quantidade alto, absorçãomáxima na região vermelha do espectro (isto melhora a eficiência dotratamento a fundo dos tecidos), mas acumulam-se principalmente emlisossomas e induzem a necrose. O alvejamento mitocondrial de taismoléculas na formulação de compostos correspondentes à estrutura (I)permitiria a indução de apoptose de células tumorais pela iluminação de baixaintensidade e na região vermelha do espectro.

Foi mostrado que os compostos que carregam uma cargapositiva (derivados de rodamina e fosfônio) acumulam-se e são retidos nasmitocôndrias de tumores de crescimento rápido a uma extensão muito maiordo que nas células de tecidos normais. Pode ser presumido que osfotossensibilizadores com base nos compostos correspondentes à estrutura (I)irão se acumular seletivamente nos tumores e, por meio disso, sua eficiênciaquando usada em terapia fotodinâmica será aumentada.

Exemplo Experimental 15: "Efeito protetor de SkQlantioxidante mitocondrial em células fúngicas, exemplificadas nas célulasde levedura Yarrowia lipolytica."

Mostramos que o SkQl antioxidante mitocondrialcorrespondente à estrutura (I) previne parcialmente a morte de célulasYarrowia lipolytica causada por 10 mM de peróxido de hidrogênio.

Como pode ser visto a partir da Fig. 14, os efeitos decicloeximida D, tocoferol e SkQl são muito similares. O efeito de cicloeximidafoi demonstrado por nós anteriormente e é explicado pela necessidade dofuncionamento normal da síntese de proteína em células para a apoptoseprosseguir. A concentração de α-tocoferol foi tomado igual a 25 μΜ pela razãodesta concentração particular fornecer o efeito protetor máximo para célulasSaccharomyces cerevisiae contra morte celular programada induzida porferomônio e amiodarona (Pozniakovsky A.I., Knorre D.A., Markova O.V.,Hyman A.A., Skulachev V.P., Severin F.F., 2005, J. Cell. Biol. 168(2):257-69).Esta concentração provou ser tão eficaz quanto a concentração 10 vezes menorde SkQl. Estes resultados indicam que os antioxidantes mitocondrialmentealvejados são úteis para células fungicas e aqueles compostos do tipo SkQlpodem ser usados para a proteção de culturas industriais que produzemleveduras, outros fungos e microorganismos.

Exemplo Experimental 16: "Efeito de SkQ1 antioxidantemitocondrial no desenvolvimento de plantas superiores".

As mudas de plantas foram cultivadas em meio MS com ágarartificial com a adição de 1 μΜ de SkQ1 (3 plantas) e sem a adição de SkQ1como controle (3 plantas). As mudas de planta foram colocadas em tubostransparentes de 50 ml e cultivadas em uma câmara climática por 3 semanas a27° C e iluminação periódica (14 horas de luz, 10 horas de escuridão). Depois,as plantas foram submetidas à tensão sob escuridão, isto é, foram cultivadasem completa escuridão por 7 dias.

Como um resultado, as plantas de controle tornaram-seincolores, enquanto as plantas cultivadas na presença de SkQ1 retiveram suacor verde. Depois, as plantas retornaram às condições de iluminação normaise foram cultivadas por outros 20 dias. Depois de tal tratamento as plantascultivadas na presença de SkQ1 tornaram-se mais do que 3 vezes maiores doque as plantas de controle.

Este exemplo experimental demonstra o efeito positivo deantioxidantes mitocondrialmente alvejados em plantas como um todo.

Conseqüentemente, tais compostos podem ser usados para o cultivo deplantas em meio artificial (o estágio necessário na produção de plantasgeneticamente modificadas), para aumentar a viabilidade de culturas celularesde planta e, para aumentar a viabilidade de lavouras na agricultura.

As pessoas habilitadas na técnica avaliarão que as adições oualterações óbvias podem ser feitas na base dos exemplos acima e do relatóriodescritivo, que permitirá a obtenção de todos os compostos reivindicados ecomposições úteis para os propósitos da presente invenção. Todas as taisadições e correções óbvias estão dentro do escopo do conjunto dereivindicações da presente invenção apresentado abaixo.

Claims (26)

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dafórmula estrutural (I) para a liberação alvejada de uma substânciabiologicamente ativa na mitocôndria celular:<formula>formula see original document page 46</formula>em que A é um grupo efetor que compreende:a) um antioxidante (II)<formula>formula see original document page 46</formula>e/ou uma forma reduzida da mesmaem que m é um número inteiro de 1 a 3; cada Y representa os mesmossubstituintes ou diferentes que compreendem um alquila inferior ou um alcóxiinferior; ou dois Y adjacentes são interconectados para formar a estrutura:<formula>formula see original document page 46</formula>e/ou uma forma reduzida da mesmaem que Rl e R2 são os mesmos ou diferentes e independentementerepresentam um alquila inferior ou um alcóxi inferior;b) um pró-oxidante;c) um indutor de apoptose ou inibidor de proteínas anti-apoptose de localização mitocondrial;d) um fotossensibilizante.L é um grupo ligador, que compreende:a) uma cadeia de hidrocarboneto reta ou ramificadaopcionalmente substituída com um ou mais substituintes e opcionalmentecontendo uma ou mais ligações duplas ou triplas;b) uma cadeia de isopreno que ocorre naturalmente;η é um número inteiro de 1 a 20;B é um grupo alvejador, que compreende:a) um íon de Skulachev Sk:Sk+Z"onde Sk é um cátion lipofílico, Z é um ânion farmacologicamente aceitável;b) um peptídeo hidrofóbico carregado contendo de 1 a 20aminoácidos;com a condição de que no composto de estrutura (I) A não énem ubiquinona (por exemplo, 2-metil-4,5-dimetóxi-3,6-dioxo-l,4-cicloexadienila) nem tocoferol ou mimético da superóxido dismutase ouebselen; em que L é um radical decila divalente ou pentila divalente oupropila divalente; e B é trifenilfosfônio;assim como solvatos, isômeros, pró-drogas e um carreadorfarmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o antioxidante é 2,3-dimetil-l,4-benzoquinol (plastoquinona)ou uma forma reduzida do mesmo (plastoquinol).

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o indutor de apoptose é óxido de fenilarseno.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o inibidor de proteínas anti-apoptose de localizaçãomitocondrial é ABT737.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o pró-oxidante é paraquat, menadiona ou hidroperóxidosorgânicos.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o fotossensibilizante é ftalocianina opcionalmente contendoum substituinte metálico e complexos dos mesmos; porfirina e seus derivados,particularmente BDP-Mac ou BDP-Mao; ou foscan (mTHPC).

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o dito Sk, um cátion lipofílico, é trifenilfosfônio,trifenilamônio, tributilamônio.

8. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o dito Sk é rodamina G.

9. Uso da composição como definida em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para reduzir aquantidade de radicais livres e espécies de oxigênio reativo em uma célula.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que quando a dita célula está em um organismo humano ou em umorganismo de outro mamífero; é uma célula de uma planta em qualquerestágio de desenvolvimento do mesmo, incluindo uma planta geneticamentemodificada; é uma célula em uma cultura ou células vegetais ou protoplastos;é uma célula fungica e/ou é uma célula em uma cultura de células fungicas;incluindo o uso para aumentar a viabilidade e/ou produtividade de células quesão produtoras de preparações, proteínas, peptídeos, anticorposfarmacologicamente aplicáveis.

11. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que quando a dita célula é uma célula normal, ou uma célulacancerosa, ou uma célula tronco de um mamífero, incluindo um ser humano,está em uma cultura de células, incluindo uma cultura de células normais,cancerosas, tronco; incluindo o uso para aumentar a viabilidade e/ouprodutividade de células que são produtoras de preparações, proteínas,peptídeos, anticorpos farmacologicamente aplicáveis.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a-11, caracterizado pelo fato de ser para tratar um paciente humano ou animalque beneficiar-se-ão de uma redução da concentração de radicais livres eespécies de oxigênio reativo no organismo.

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a-11, caracterizado pelo fato de ser para proteger células saudáveis de danodurante a quimioterapia, radioterapia ou terapia fotodinâmica de câncer;durante a desinfecção do sangue ou outra substância contendo elementoscelulares saudáveis com a ajuda de radicais livres, espécies de oxigênioreativo ou substâncias geradoras dos mesmos.

14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a-11 para procedimentos cosméticos, caracterizado pelo fato de ser paracicatrização de suturas cirúrgicas; para prevenir a lesão de tecidos saudáveisdurante operações cirúrgicas, para a cicatrização ou prevenção de lesões porqueimadura de tecidos; contra inflamações, para preservar materiais detransplante; para combater a rejeição de tecidos e órgãos transplantados.

15. Uso da composição como definida em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para combater doençasoncológicas, para suprimir e prevenir a metástase e a angiogênese, paraeliminar células cancerosas; para o uso na quimioterapia ou terapiafotodinâmica de câncer; para o uso em combinação com outras preparaçõesde terapia quimioterapêutica e fotodinâmica, em combinação comradioterapia contra o câncer.

16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelofato de ser para a indução ou estimulação da indução de apoptose,aumentando a sensibilidade aos indutores de apoptose nas células de câncerou de um câncer ou outro tumor, assim como em outras células, onderequerido.

17. Uso de qualquer uma das composições como definidas nasreivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para prolongar o tempo devida de um organismo; para prevenir o envelhecimento; incluindo o uso emcombinação com terapia hormonal, particularmente em combinação comhormônios epifiseais, hormônios da glândula tireóide, incluindo o uso emcombinação com diidroepiandrosterona, melatonina.

18. Composto, caracterizado pelo fato de que é da fórmulageral (I):<formula>formula see original document page 50</formula>em que A é um grupo efetor que compreende:a) um antioxidante<formula>formula see original document page 50</formula>e/ou uma forma reduzida da mesmaem que m é um número inteiro de 1 a 3; cada Y representa os mesmossubstituintes ou diferentes que compreendem um alquila inferior ou um alcóxiinferior; ou dois Y adjacentes são interconectados para formar a estrutura:<formula>formula see original document page 50</formula>e/ou uma forma reduzida da mesma em que Rl e R2 são os mesmos oudiferentes e independentemente representam um alquila inferior ou um alcóxiinferior;b) um pró-oxidante;c) um indutor de apoptose ou inibidor de proteínas anti-apoptose de localização mitocondrial;d) um fotossensibilizante.L é um grupo ligador, que compreende:a) uma cadeia de hidrocarboneto reta ou ramificadaopcionalmente substituída com um ou mais substituintes e opcionalmentecontendo uma ou mais ligações duplas ou triplas;b) uma cadeia de isopreno que ocorre naturalmente;η é um número inteiro de 1 a 20;Béa) um íon de Skulachev Sk:Sk+Z'onde Sk é um cátion lipofílico;Z é um ânion farmacologicamente aceitável; b) um peptídeo hidrofóbico carregado contendo de 1 a 20aminoácidos;com a exceção dos compostos em que A é ubiquinona (isto é,-2-metil-4,5-dimetóxi-3,6-dioxo-l,4-cicloexadienila) ou tocoferol ou miméticoda superóxido dismutase ou ebselen; em que L é um radical decila divalenteou pentila divalente ou propila divalente; e B é trifenilfosfônio; assim comosolvatos, isômeros, pró-drogas e um carreador farmaceuticamente aceitável domesmo.

19. Composto de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o indutor de apoptose é óxido de fenilarseno; e o inibidor deproteínas anti-apoptose de localização mitocondrial é ABT737.

20. Composto de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o fotossensibilizante é ftalocianina opcionalmente contendoum substituinte metálico e complexos dos mesmos; porfirina e seus derivados,particularmente BDP-Mac ou BDP-Mao; ou foscan (mTHPC).

21. Composto de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o dito Sk, um cátion lipofílico, é rodamina G, trifenilfosfônioou trifenilamônio.

22. Composto de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que A é um resíduo de plastoquinona da fórmula geral (II)em que Y é metila, m é 3; L, η, B são como definidos na reivindicação 1,assim como solvatos, isômeros, pró-drogas e misturas farmacêuticas domesmo.

23. Composto de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que L é radical de decila divalente.

24. Composto de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que L é radical de pentila di valente.

25. Composto de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que Sk é porção de rodamina G.

26. Método para a síntese do composto como definido nareivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintesetapas:a) oxidação de hidroquinona (1.1) com um oxidante adequadopara obter benzoquinona (1.2)<formula>formula see original document page 52</formula>b) formação de um derivado (1.3)<formula>formula see original document page 52</formula>c) ligação do resíduo B-M com o composto (1.3) para formar oproduto alvo IA<formula>formula see original document page 53</formula> em que Y, L, B, Ra1, m, η são como definidos acima; V é Br, Cl, I ou OH; Mé o grupo de saída.