KR20050003453A

KR20050003453A - 세포 에너지 직접 전달 시스템

Info

Publication number: KR20050003453A
Application number: KR10-2004-7018321A
Authority: KR
Inventors: 윌리암 디. 에링거; 수판 치엔
Original assignee: 유니버시티 오브 루이빌 리서치 파운데이션, 인코포레이티드
Priority date: 2002-05-14
Filing date: 2003-05-09
Publication date: 2005-01-10
Also published as: US20040137051A1; AU2003229028A1; WO2003096973A2; EP1503735A2; CN1665488A; AU2003229028B2; US20030235611A1; CN1665488B; EP1503735A4; US7056529B2; NZ537163A; US7041312B2; WO2003096973A3; CA2485463A1; JP2005525424A

Abstract

소포는 ATP, 및 안정 소포 형성제인 인지질을 포함한다. 상기 소포는 20 소포 융합/초 이상의 융합 속도를 갖는다.

Description

세포 에너지 직접 전달 시스템 {A Direct Cellular Energy Delivery System}

ATP는 모든 세포-동물, 식물, 박테리아, 균류 등에 힘을 주는 연료이다. 연료 없는 자동차와 같이, ATP "탱크"가 바닥난 인간 및 다른 생물체는 살아갈 수 없다. 실제로 죽고 만다. 영양소의 분해로 발생되는 에너지는 궁극적으로 고에너지의 ATP 인산 결합으로 보존된다. 이들 결합이 깨지면, 이들은 세포, 조직, 기관 및 기관계에 활용가능한 에너지를 제공한다. 세포들은 계속 ATP 합성 및 대사한다. ATP는 산소를 최종 전자 수용체로서 이산화탄소 및 물을 부산물로 제공하는 산화적 인산화(oxidative phosphorylation)를 통하여 호기적으로 생성되거나 또는 해당과정(glycolysis) 동안에 공기없이 공급될 수 있다. 해당과정은 에너지를 세포에 공급할 수 있지만, 세포 환경이 산성이 되고 세포를 손상시키고 ATP 생성을 저해하기 때문에 공급이 제한된다.

맥관 순환계가 산소 및 영양소로부터 얻어지는 에너지의 연속 공급을 전달한다. 맥관 구조에서, 내피세포 장벽이 혈관강으로부터 공급되는 세포를 분리한다. 개별 세포에 다다르기 위해서 산소 및 영양소는 내피 라이닝을 통과해서 세포간 공간으로 들어가서 산소와 영양소를 전달해야 한다. 이 산소 공급은 병이나 상처의 결과로 차단 또는 감소될 수 있다. 예를 들어, 심근 경색(심장 발작), 졸중, 고혈압 및 심한 외상, 예컨대 자동차 사고에서 경동맥 절단으로 산소의 손실을 일으켜, 항상성의 손실을 초래하고 사망까지 가능하다.

혈액 공급이 조직에 산소 및 영양소의 손실을 초래하는 사건인 허혈 후 복구되는 경우, 허혈-재관류 손상도 일어날 수 있다. 재산소화 후에 세포가 ATP를 합성할려고 시도하기 때문에, 독성 대사물, 예컨대 세포가 ATP를 재합성할려고 시도할 때 자유 라디칼이 생성된다. 허혈은 손상과 관련된 또는 질병과 관련된 현상일 뿐 아니라 대동맥 우회 수술, 심장 개방 외과 수술, 주요 조직 재건 수술, 종양 제거, 내장 절제교합 및 기관 이식과 같은 수술의 부작용으로서 유발될 수 있다.

허혈은 성공적인 조직 및 기관 이식에 아주 큰 해결과제를 안겨준다. 약 14,000개 신장 및 2500개의 심장이 매년 미국에서 이식된다. 제거 후, 기관은 영양소와 산소가 없이는 연장 수명은 제한된다. 신장은 72 시간 이내에 이식되어야 하는 반면, 심장은 채취 후 4 내지 6시간 이내에 이식되어야 한다. 종종 수혜자가 기증자의 거리가 매우 멀 수 있기 때문에, 이런 짧은 실현가능 시간이 이식을 방해한다. 피는 4℃에서 약 45일간 보관될 수 있고 그 후에 폐기된다. 수술에 앞서 자기이식 피를 획득하는 것은 더 복잡한 문제이다. 많은 외과적 과정에서 3, 4 또는 그 이상의 혈액 유닛양을 사용하기 때문에 이 양은 충분하지 않다.

저 산소 공급의 부작용을 극복 또는 방지하기 위하여 많은 시도가 이루어졌다. 이러한 접근으로 (1) 유산소 ATP 생성을 증대하기 위하여 당분해 중간체를 제공하는 것, (2) 4℃에서 세포 저장, 조직 저장, 기관 저장과 같은 대사 요구량을 감소시키는 것, 및 (3) ATP를 세포, 조직 또는 기관에 직접 첨가시키는 것을 들 수 있다. 에너지를 세포에 공급하는 것은 바람직하게는 ATP의 직접 투여를 함으로써 성취될 수 있을 것이다. 그러나 세포는 ATP 수용체나 채널이 결핍되어, 세포는 외부에서 들어오는 ATP를 잘 받아들이지 못한다. 더구나, 세포 원형질 세포막이 소수성인 반면, ATP는 친수성이어서 ATP가 통과하는 것을 막는다. ATP를 혈관으로 도입하는 것은, ATP가 내피 장벽을 통과하지 못하고 ATP가 가수분해되기 쉽기 때문에 비효율적이다. 리포좀을 사용하여 ATP를 전달하려는 시도도 대체로 성공적이지 못하고 비효율적이다 (Arakawa et al. 1998, Puisieux et al. 1994). 예를 들어, 퓌시우 등(Puisieux et al.)은 ATP를 담은 포스파티딜 콜린, 콜레스테롤 및 포스파티딜 세린 지질 소포를 구축하고, 정자 세포, 간 및 뇌 세포 조직과 함께 이 소포를 배양하였다. 일부 흡수가 관찰되었으나, ATP에 대한 대사적 요구량에 상응하는 조절된 전달은 성취하지 못하였다. 혈관 내에 투여될 경우, 리포좀이 소포가 세포로 탑재된 ATP를 전달하는 데에 대개 내피 세포 장벽을 뛰어넘지 못하고, 또한 세포 세포막과 융합하는 속도가 빠르지 않다.

동물 세포 원형질 세포막은 총 지질의 반보다 더 크게 나타나는 4개의 주요한 인지질: 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린 및 스핑고미엘린을 함유한다. 포스파티딜콜린 및 스핑고미엘린은 바깥판(outer leaflet)에서 주로 발견되는 반면, 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린은 주로 속판(inner leaflet)에서 발견된다. 바깥판에서 음으로 하전된 포스파티딜세린 및 포스파티딜리노시톨이 많으면 세포 표면에서 전체 음전하가 된다. 원형질 세포막은 세포의 일체성을 유지하는 것을 돕고 선택적으로 투과성이다. 일부 분자가 세포막을 통하여 확산될 수 있지만, ATP를 비롯한 대부분은 운반 단백질 또는 채널과 같은 다른 통과 수단을 요구한다.

본 출원은 본원에서 전체가 참고문헌으로 포함된 2002년 5월 14일 출원된 윌리엄 디, 에링거(William D. Ehringer) 및 수판 치엔(Sufan Chien)의 미국 임시 출원 번호 60/380,762 "용해성 지질 소포(Fusogenic Lipid Vesicles)"의 우선권을 주장한다.

도 1은 한 시간 후 인간 제대정맥 내피 세포(HUVEC) 내에서의 ATP의 분배상수를 보여준다.

도 2는 누드 마우스의 상처 회복에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 보여준다.

도 3은 쥐의 절단된 사지의 성공적인 이식을 보여준다. 사지는 재부착 후에 완전히 기능하였다.

<발명의 상세한 설명>

본 발명은, 세포 이중지질 세포막과 융합성인 작은 지질 소포가 ATP를 담을 수 있고 ATP를 세포에 직접적으로 전달 가능하다는 발견을 이용한다. ATP 전달 속도는 지질 소포 조성물을 다르게 하여 그리고 다른 수단에 의하여, 융합 속도를 다르게 하여 쉽게 조절할 수 있다. 게다가 소포 조성물을 다른 방식의 투여를 제공하여 조절시킬 수 있다. 예를 들어, 작은 지질 소포는 순환계 내로 주입시에 소포가 내피 세포와 융합하여 틈을 열어 표적 세포와 효과적으로 융합할 수 있도록 만들어 질 수 있다. 융합을 촉진 또는 목표로 삼기 위해, 예컨대 특정 폴리펩티드와 같은 다른 성분도 소포에 첨가될 수 있다. 지질 소포로 로딩하여, ATP는 가수분해에 대하여 안정화된다.

본 발명의 조성물 및 방법으로써 세포로의 효과적인 ATP 전달이라는 요구를 충족한다. ATP를 세포로 효과적으로 전달하는 데 4개의 조건이 필요하다. 첫째로, ATP는 세포막을 통과해야 한다. 둘째로 ATP의 양이 기초 대사 요구량을 충족하는 속도로 전달되어야 한다. 세째로, ATP 함유 조성물은 투여 경로와 상용성이어야 한다. 마지막으로, 효과적이기 위해서, ATP는 가수분해 전에 세포를 통과해야 한다.

지질 소포막은 원형질 세포막과 유사하다. 또한, 이들은 만들기 쉽다. 이들은 수성 부분을 갖고 있기 때문에, 지질 소포는 ATP를 포함하는 것을 비롯하여 다양한 용액을 담을 수 있다. 지질 소포는 세포막과 융합하게 만들 수 있어 지질 소포 내 내용물의 전달을 가능하게 한다.

본 발명의 방법 및 조성물은 넓은 범위의 용도를 가지며, 출혈 쇼크, 심장 발작, 관상 동맥 질환, 졸중, 고혈압, 심각한 외상의 치료, 상처 치료, 조직 및 기관 저장, 심폐 소생, 및 이식을 포함한다. 심각한 외상의 경우, 본 발명의 조성물을 그 부위에 투여하여 의료 도움이 가능할 때가지 상처를 최소화할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 혈액 및 혈소판 저장을 연장할 수 있다.

다음은 제공하여 실시를 돕고자 한다. 그러나 다른 방법, 기술, 세포, 시약 및 접근도 가능하며, 이로 인하여 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다.

융합 지질 소포

지질 소포는 원형질 세포막과 유사하고, 이들을 사용하여 세포막과 융합할 수 있다. 이전의 리포좀 연구에서 리포솜 및 세포막 사이에 네개 유형의 주요한 결합인 세포 표면에의 흡착, 내포작용(식세포에 의한 리포솜의 활성적인 섭취), 지질 교환(리포솜과 원형질 세포막간의 개별 지질 분자의 전달을 포함함), 융합(리포좀 막이 원형질 세포막과 일체화되는 것)을 관찰하였다. 지질과 세포막 사이의 상호작용은 리포솜과 세포막 사이의 상호작용과 아마 유사할 것이다. 융합은 소포 내의 내용물을 세포내로 직접 도입하게 하기 때문에 융합은 가장 매력적인 센 메카니즘이다. 소포가 그리 융합성이 아니고 소포의 수성 내용물의 전달을 허용하지 않는 경우에 흡착 또는 지질 교환은 일어날 수 있다. 내포작용은 백혈구와 같은 특정 유형의 세포 내에서만 일어날 수 있다.

그러나, 대부분의 리포솜 및 멀티라멜라 소포는 그다지 융합성이 아닌데, 이는 주로, 소포의 곡률 반지름의 저장된 에너지가 적기 때문이다. 그러나, 본 발명의 작은 단층의 소포는, 매우 딱맞는 반지름을 갖기에, 매우 융합성이다. 작은 단층 소포(SUV)의 평균 직경은 5nm 내지 500nm이고, 바람직하게는 10nm 내지 100nm, 더 바람직하게는 40nm를 포함한 20 nm 내지 60 nm이다. 이 크기는 소포가 내피 세포 사이의 틈을 통과하게 한다. 유용한 소포는 크기에서 매우 다양할 수 있고, 특이적 용도에 따라 선택된다.

본 발명의 소포가 형성되는 조성물은 안정된 소포 형성제인 인지질을, 바람직하게는 다른 극성 지질과 함께, 그리고 임의적으로 하나 또는 그 이상의 추가의 극성 지질 및(또는) 래프트 형성제(raft former)와 함께 포함한다.

극성 지질은 소수성 말단과 친수성 말단을 갖는 유기 분자이다. 그리고 6개 이상의 탄소 원자를 포함하고, 화학식 (I)의 구조를 갖는다 (여기서, Z는 헤드 기이고, L은 골격 기이고, 각 Z는 지방성 기이다). 이 두 Z 기들은 같거나 상이할 수 있다. 인지질은 화학식 (II)의 헤드 기를 갖는 극성 지질이다(여기서 A 및 B는 헤드기의 치환체임).

헤드 기 X는 극성 기일 수 있고, 바람직하게는 양이온성, 음이온성 또는 양쪽성 기 또는 H일 수 있다. 더 바람직하게는 X는 화학식 (II)의 기이다. 바람직하게는, B는 Na⁺, K⁺과 같은 양이온, 또는 테트라메틸 암모늄 이온 또는 알킬 기이다. 바람직하게 A는 H 또는 알킬기이고, 더 바람직하게는 A는 아민으로 치환된 알킬기이고, 더 바람직하게는 A는 화학식 (III), (IV), (V), (VI) 또는 (VII)의 기이다. 유의해야 할 것은 명세서 전반을 통하여, 이 화학식들은 양성자화된 형태를 보여줄 것이나, 이들 또한 비양성자화된 형태(또는 그 반대)도 포함한다는 것이고, 어떤 조성물 내에 이 형태가 존재할 것인가는 조성물의 정확한 pH와 물 및(또는) 적합한 상대 이온의 존재에 따라 좌우될 것이다.

골격 기 L은 두개의 수소 원자를 더 잃은 (총 세개의 개방 부착 지점을 제공함) 알킬이고, 바람직하게는 알콕시, 아미노 치환된 알킬이다. 더 바람직하게는 L은 화학식 (VIII), (IX), 또는 (X)의 기이다.

지방성 기 Z는 동일 또는 상이할 수 있으며, H, E 기, 또는 화학식 (XI)의 구조이다 (여기서 E는 알킬 또는 알케닐이다). 바람직하게는 E는 탄소 원자수가 6-26인 비치환된 직쇄 알킬 또는 알케닐이고, 더 바람직하게는 E는 화학식 (XII), (XIII), (XIV), (XV) 또는 (XVI)의 기이다. 지방성 기의 하나가 H라면, 다른 것은 상이해야 한다. 만일 이중 결합이 존재하면, cis 구조가 바람직하다.

<화학식 (I)>

<화학식 (II)>

<화학식 (XI)>

안정한 소포 형성제인 인지질 (또는 극성 지질)은 소포를 형성할 인지질 (또는 극성 지질)이며, 다음과 같이 제조할 때 한 시간 이상동안 50 % 이상의 소포가 생존한다: 인 지질을 클로로포름에 녹이고 글래스 시험관에 위치시킨다. 용매를 질소의 안정된 기류 하에서 증발시켜 제거하고, 시료를 12시간동안 진공 조건에 두어 공기를 제거한다. 이어서 건조된 지질 물질을 지질 상전이온도 위의 온도에서60 분동안 10 mM Na₂HPO₄에서 재수화시킨다. 원하는 최종 농도는 25 mg/mL이다. 지질 혼합물을 이어서 40 % 듀티 사이클에서 사용된 마이크로팁 450 와트 소니케이터로 초음파처리하여 교반시킨다.

바람직하게는, 안정한 소포 형성제인 인지질에 덧붙여, 하나 이상의 다른 극성 지질, 더 바람직하게는 안정한 소포 형성제가 아닌 하나 이상의 극성 지질을 포함한다.

래프트 형성제는 소포가 수용액 중에 있을 때 소포의 지질 층 안으로 위치하여, 소포 벽 (래프트로 또한 알려짐) 안으로 분리된 영역을 형성하거나 형성시킬 화합물이다. 이들 분리된 영역은 소포를 불안정하게 하여, 그 용해성을 증가시키는 경향을 가진다. 래프트 형성제의 예로는 콜레스테롤 (화학식 XXIV), 스핀고미엘린, 및 멤브래인 결합성인 것으로 알려진 단백질 및 폴리펩타이드가 있다. 용해성은 또한, 표적 세포의 구이-챕만 (Gouey-Chapman) 층의 전하 (통상적으로는 구이-챕만 층은 양하전됨)의 반대로 소포 상에 표면 전하를 발생시킬 극성 지질을 선택함으로써 향상될 수도 있다.

본 발명에서 사용되기 위한 극성 지질의 예로는, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC) (화학식 XVII; 안정한 소포 형성제), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트 (POPA) (화학식 XVIII에서 모노나트륨 염으로 나타냄), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DOPC-e) (화학식 XIX에서 클로라이드 염으로 나타냄), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)(화학식 XX), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-1-세린] (DOPS) (화학식 XXI에서 나트륨 염으로 나타냄), 1-팔미토일-2-도코사헥사엔오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (화학식 XXII; 안정한 소포 형성제), 통상적인 스핀고미엘린 (화학식 XXIII; 콜레스테롤이 스핀고미엘린 및 DOPC 혼합물로부터 형성된 소포에 첨가될 때 래프트를 형성할 것임), 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤 (화학식 XXV), 및 1-팔미토일-2-히드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린 (XXVI)이 포함된다. 본 발명의 실행에 유용한 다른 극성 지질로는, 포스파티딜 세린 (PS), 포스파티딜 글리세롤 (PG), 혼합 채인 포스파티딜 콜린(MPC), 포스파티딜 에탄올 (PE), 및 인지질-함유 데코사헥산산이 포함된다. Cit-DOPC 및 cit-DOPC-e는 특히 유용하다. sn-1 및 sn-2 위치 (DHPC)에 도코사헥사엔온산을 가지는 것을 포함하는 포스파티딜콜린도 사용될 수 있다. 다른 이불포화 지질, 예컨대 디아라치도닐포스파티딜콜린 (예컨대 20:4 DOPC:DArPC), 디리놀레노일포스파티딜콜린 (예컨대 18:3 DOPC:DLnPC)도 또한 유용하다. 예를 들어, SUV 제조하는 동안 DLnPC, DArPC 및 DHPC의 양을 증가하면서 DOPC가 혼합될 수 있다. 유용한 비율 (DOPC:DLnPC, DArPC 또는 DHPC)로는 1 내지 1000 :1, 예컨대 25 내지 500 :1이며, 1:1, 25:1, 50:1, 100:1, 500:1 및 1000:1이 포함된다. 큰 평균 분자 점유 면적을 가지는 인지질의 조합, 예컨대 DOPC:DLnPC:DHPC도 또한 사용될 수 있다. 비라멜라 상 지질인 디아실글리세롤도 또한 DOPC와 혼합될 수 있다. 추가로, 20 반복단위 내지 4000 반복단위의 중량을 가진 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용할 수 있다.

바람직하게는, 안정한 소포 형성제 인지질 대 극성 지질 (안정한 소포 형성제가 아님)의 비는 1:1 내지 500:1, 더 바람직하게는 10:1 내지 100:1 (예컨대 50:1)이다. 예로는 DOPC/DOPC-e(1:1); DOPC/POPA (50:1) 및 DOPC/POPA(1:1)이 포함된다.

지질 소포 형성

지질 소포를 형성하기 위해, 지질을 클로로포름 또는 다른 적절한 유기 용매에 녹이고 글래스 시험관과 같은 용기에 위치시킨다. 용매를 질소 또는 다른 중성 가스의 안정된 기류 하에서 증발시켜 제거하고, 시료를 0.1 내지 48 시간동안 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 24, 25, 30, 36, 40, 42 또는 48시간) 진공 조건에 두어 공기를 제거한다. 일반적으로는 12시간이면 충분하다. 이어서 건조된 지질 물질을 지질 상전이온도 위의 온도에서 30 내지 60 분동안 적절한 버퍼, 예컨대 행크의 밸런스드 솔트 용액 (Hank's Balanced Salt Solution, HBSS) 또는 10 mM Na₂HPO₄에서 재수화시킨다. 원하는 최종 농도는 일반적으로 1 내지 30 mg/mL, 통상적으로는 약 25 mg/mL이다. 지질 혼합물을 이어서 교반시킨다. 예를 들면 SUV를 만들기 위해 40 % 듀티 사이클에서 사용된 마이크로팁 450 와트 소니케이터와 같은 초음파 처리가 사용될 수 있다. 초음파 처리 시간의 길이는 지질 물질의 양에 좌우된다. 어느 경우에도 퍼센트 투과도에서 더이상의 감소가 관찰되지 않거나 입자 크기 분석기를 사용한 분석에 의해 올바른 소포 사이즈가 달성되었을 때에는 초음파 처리를 정지시킨다. 지질은 UV 분광기 및 박층 크로마토그래피 (TLC)에 의해 분석하여 필요한 경우 산화 정도를 평가할 수 있다.

건조된 지질을 재수화시킬 때 다른 용액을 사용할 수도 있다. 이들에는 N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산(BES), 비스(2-히드록시에틸) 아미노-트리스 (히드록시메틸) 메탄 (비스-트리스), N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'3-프로판술폰산 (EPPS 또는 HEPPS), 글라이클클라이신, N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES), 3-(N-모르폴리노) 프로판술폰산 (MOPS), 피페라진-N,N'-비스 (2-에탄-술폰산) (PIPES), 탄산수소나트륨, 3-(N-트리스(히드록시메틸)-메틸-아미노)-2-히드록시-프로판술폰산) (TAPSO), (N-트리스 (히드록시메틸) 메틸-2-아미노에탄술폰산 (TES), N-트리스(히드록시메틸) 메틸-글라이신(트리신), 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 (트리스)로써 버퍼된 용액이 포함된다. 다른 적당한 용액으로는 염 용액, 예컨대 알제베르의 용액, 둘베코의 포스페이트 버퍼된 염수 (DPBS), 이글의 밸런스드 염 용액, 게이의 밸런스드 염 용액 (GBSS), 푹크의 염수 A, 타이로드의 염 용액, St. 토마스 용액 및 위스콘신 대학 용액이 포함된다.

다른 성분이 SUV 안에 혼입되어 그 융합속도를 조작할 수 있다. 예컨대, 퍼르틸린, 가용성 N-에틸말레이미드-민감성 인자 부착 단백질 수용기 (SNARE), SM(secl/muncl8) 폴리펩타이드 (예컨대, Vps33p, Slylp 및 Vps45p의 포유동물적 이성체; (얀 앤 수드호프 1999)) 및 바이러스 외피 융합 단백질 (예컨대, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV; 예컨대, gp41), 세밀리키 포레스트 바이러스, 및 인플루엔자로부터의 단백질)와 같은 멤브래인 융합에 관련된 폴리펩타이드가 있다. 포유동물적 SNARE 패밀리로는 신택신 (1A, 1B, 1C ; 2 (및 스플라이싱 변형체); 3, 3A, 3B,3C, 3D; 4; 5, 5A, 5B, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13 (12와 동일할 수 있음); 16 (A, B, C); 및 17), Hsyn 16, rbet1, GS15, GOS32, GOS28, 멤브린, SNAP (25, 25a, 25b; 23, 23A, 23B; 29), vtilb, 시냅토브레빈 (1 및 스플라이싱 변형체; 2), 셀루브레빈, VAMP4, VAMP5/6,Ti-VAMP, 엔도브레빈, 토모신 및 msec22b (얀 앤 수드호프 1999)이 포함된다. 아넥신 (얀 앤 수드호프 1999)과 같이 멤브래인을 불안정화시키는 다른 친양쪽성 펩타이드도, 주기능이 멤브래인 융합을 중개하는 것이 아니라도, 융합을 촉진시키기 위해 사용될 수 있다.

특정 세포를 목표로 하기 위해, 리간드-수용기 상호작용 (적어도 SUV가 투여되는 영역에서)과 같이 표적 세포에 특유한 폴리 펩타이드와 상호작용하는 폴리펩타이드, 또는 세포-특정 항원을 인식하는 항체가 SUV안으로 혼입될 수 있다. 다른 표적 폴리펩타이드로는 세포간의 멤브래인 수송 시 사용된 것 및 랩 GTPases 단백질이 포함된다. 바이러스성 융합 단백질도 또한 표적 분자로서 이용될 수 있다. 멤브래인 결합성 물질, 예컨대 바이오틴화된 지질, 및 탄수화물도 또한 사용될 수 있다.

ATP 캡슐화

통상적으로는, ATP의 마그네슘 염이 지질 재수화시에 첨가된다. ATP 농도도 변화될 수 있고 응용처에 좌우될 것이다. 바람직하게 사용된 ATP의 농도로는 0.01 mM 내지 200 mM, 바람직하게는 0.1 mM, 1 mM, 2.5 mM, 5 mM, 7.5 mM, 10 mM, 25 mM, 및 50 mM, 그리고 더 바람직하게는, 0.1 mM,1 mM, 10 mM이 포함된다. ATP를 함유하는 버퍼는 낮은 단백질 함량을 가져서 지질 물질의 비-특정성 흡수 가능성을감소시켜야 한다. ATP를 함유하는 SUV를 편의상 ATP-SUV로 칭한다.

SUV에 의한 ATP의 캡슐화를 쉽게 평가될 수 있다. 예컨대, 방사능표지된 ATP와 같이 표지된 ATP 분자 (소포 형성에 간섭하지 않는 표지), 바람직하게는 삼중수소화 ATP를 사용한다. 방사능표지로는³²P, 및³H가 포함되고, 교반전 건조후에 지질이 재수화될 때 방사능표지가 첨가된다. 용액을 세파덱스 G-25 컬럼 (또는 다른 적당한 매트릭스)에 가하여 비캡슐화된 ATP를 제거한다. 컬럼으로부터의 유출물을 포집하고, 소포의 존재에 대해 분석한다. SUV는 보통 가장 처음의 분획에 추출된다. 소포 및 상청액 분획에서의 방사능을 정량화하고, 캡슐화된 ATP의 비율을 결정하여 100으로 곱하여, 캡슐화 퍼센트를 결정한다. 바람직한 캡슐화 퍼센트는 약 1 내지 10 %의 범위이다.

ATP와 다른 분자는 유기 및 무기 분자 (제약, 폴리펩타이드, 헥산 및 세포내 항원과 반응하는 항체가 포함됨)와 같은 SW를 사용하여 세포에 전달될 수 있다.

SUV 용해성을 측정하기 위한 분석법

융합 속도는 웰/초 (약 10⁶세포)로 HUVEC 세포와 융합하는 지질 소포의 수의 척도이며, 분석법은 다음 단계를 가진다:

(1) HUVEC 세포 (아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (ATCC); Manassus, VA 또는 BioWhittaker; MD)를 배양한다.;

(2) SUV를 제조하고 카르복시플루오레샤인과 같은 형광 탐지제를 로딩한다.;

(3) SUV를 융합하기 위한 세포와 접촉시킨다.;

(4) 선택된 시기에, 잔류 SUV를 제거한다.; 및

(5) 형광도를 측정한다.

SUV를 제거한 후에 형광 신호의 존재 및 세기는 SUV가 세포 멤브래인와 융합하고 함유물을 전달하는 능력을 나타낸다.

인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC)를 예로 든다. 세포를 내피 세포 성장 매질 (EGM)에서 표준 12-웰 배양 접시 상에서 합류 (confluence)할 때 (예컨대, COSTAR로부터; 세포의 수는 약 10⁶)까지 성장시킨다. 이어서 HUVEC를 HBSS와 같은 버퍼 용액으로 3회 세척한다. 제조된 지질 소포 (예컨대, DOPC/DOPC-e (1:1); DOPC/POPA (50:1), DOPC/POPA (1:1), PS, PG, MPC, PE, cit-DOPC 및 cit-DOPCe)를 1 mM 카르복시플루오레샤인으로 로딩한다. 소포를 120 분동안 세포와 같이 항온 배양하고, 이때 37 ℃, 95 % 공기/5 % CO₂에서 각 5분마다 형광도를 분석하고, 그 후 버퍼 용액으로 세포를 세척하여 소잔류 소포를 제거한다. 음으로 하전된 지질 소포가 사용되는 경우, 칼슘 (최종 농도 0.1 내지 10 mM)가 융합 단계에서 첨가된다.

세포를 트립신으로 처리하여 접시로부터 제거한다. 형광도 (495 nm에서 여기, 520 nm에서 방출)를 형광 분광기 또는 다른 적당한 장치를 사용하여 측정한다.

ATP-SUV 조성물에 대한 융합 속도는 약 20 소포 융합/초 내지 8.0 × 10¹¹소포 융합/초이며, 이는 500 내지 1 ×10⁸소포 융합/초; 750,000 내지 50 ×10⁷소포 융합/초; 5 ×10⁶내지 1 × 10⁷소포 융합/초; 1 ×10⁶내지 8 ×10⁸소포 융합/초; 1 ×10⁷내지 5×10⁸소포융합/초 ; 및 5 ×10⁷내지 1×10⁸소포 융합/초를 포함한다. 융합속도의 예로는 적어도 100, 1000, 10⁴,10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 및 10¹¹소포융합/초가 있다. 이들 값의 몇몇은 인간 내피 세포를 사용하고, 칼슘의 존재 또는 부존재에서, DOPC 및 DOPC/DOPC-e 및 DOPC/POPA의 혼합물을 사용하여 37 ℃에서 측정하여 얻어졌다.

플라즈마 멤브래인의 지질 조성이 세포 타입에 따라 변하기 때문에, 분석법에서 사용하기 위한 세포의 선택은 신중하게 고려되고, 표적 세포 타입(들)과 가장 잘 맞아야 한다. 예컨대, 간세포 플라즈마 멤브래인은 약 7 %의 포스파티딜에탄올아민으로 이루어지지만, 적혈구 세포 플라즈마 멤브래인은 18 % (알버트 (Albert) 등, 2002)를 함유한다. 주세포 (아메리칸 타입 티슈 콜렉션 (ATCC)에서 입수가능; Manassus, VA) 뿐만 아니라 초대 배양세포도 유용하며, 여기서 초대 배양이 플라즈마 멤브래인 지질 조성이 변환된 세포에서는 변화될 수 있기 때문에 바람직하다. 세포 타입으로는 췌장, 장관, 면역계, 신경계 (두뇌, 눈, 코 및 귀의 것들을 포함), 폐, 심장, 혈액, 순환계 (림프 및 혈액), 골격, 연골, 생식기, 분비샘, 에나멜, 지방, 피부, 및 간장이 포함된다. 주세포로는 마딘-다르비 카닌 키드니 (MDCK), 차이니즈 햄스터 오바리 (CHO), HeLa 등과 같은 조직으로부터 유도된 것이 포함된다. 세포는 다른 생물, 예컨대 식물, 균류 (효모 포함), 및 박테리아로부터의 것일 수 있다. 이들 다른 세포 타입과의 융합 속도의 예로는 적어도 100, 1000, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 및 10¹¹소포 융합/초를 포함한다. 특별히 다르게 특정하지 않으면, 융합속도는 상기한 조건 하에서 HUVEC에 대한 것이다. HBSS와 같은 버퍼와 함께 다른 세포 타입에 대한 융합 속도는 약 10⁶세포이며, 소포를 37 ℃, 95 % 공기/5 % CO₂에서 120 분동안 세포와 함께 항온 배양하고, 그 후 잔류 소포를 버퍼 용액으로 세포를 세척하여 제거한다.

융합 속도를 최적화하기 위한 분석법

융합 속도에 대한 분석은, 특정 세포 타입과 특정 소포 조성의 융합속도를 최적화할 때, 더 개량될 수 있다. 예컨대, 지질 소포는 소포의 멤브래인 이중층의 일부인 형광성 또는 방사능성 트레이서를 함유할 수 있다.

다른 형광성 탐지기도 또한 사용될 수 있다. 이는 플루오레샤인 이소티오시아네이트; 플루오레샤인 디클로로트리아진 및 플루오레샤인의 불소화 유사체; 나프토플루오레샤인 카르복실산 및 그 석신이미딜 에스테르; 카르복시로다민 6G; 피리딜옥사졸 유도체; Cy2,3 및 5; 피코에리트린; 프로피온산 석신이미딜 에스테르, 및 펜탄산 석신이미딜 에스테르을 포함하는 석신이미딜 에스테르, 카르복실산, 이소티오시아네이트, 술포닐 클로라이드, 및 단실 클로라이드의 형광성 종; 카르복시테트라메틸로다민의 석신이미딜 에스테르; 로다민 레드-X 석신이미딜 에스테르; 텍사스 레드 술포닐 클로라이드; 텍사스 레드-X 석신이미딜 에스테르; 텍사스 레드-X 나트륨 테트라플루오로페놀 에스테르; 레드-X; 텍사스 레드 염료; 테트라메틸로다민;리사민 로다민 B; 테트라메틸로다민; 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트; 나프토플루오레샤인; 쿠마린 유도체; 파이렌; 피리딜옥사졸 유도체; 다목실 염료; 캐스캐이드 블루 및 엘로우 염료; 벤조푸란 이소티오시아네이트; 나트륨 테트라플루오로페놀; 및 4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센을 포함한다. 여기 파장은 이들 화합물에 대해 변할 것이다. 지질 소포는 1:800 지질/탐지기와 같은 비율의 트레이서의 존재하에서 제조된다. 다른 유용한 비율로는 1:200 내지 1:10,000 (1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900 및 1:1000을 포함함)이 포함된다.

융합 속도의 변경

임의의 지질 소포의 융합 속도가 온도, 이온, 지질 농도, 지질 소포 조성, 유속, 지질 소포 크기 등과 같은 다양한 인자를 변화시킴으로서 변경될 수 있다. SLTV의 인지질 제제 (formulation)를 변경시키는 것은 독성을 감소시킬 뿐 아니라 융합 속도를 최대화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 (예컨대, 혈액) 중 세포 또는 이식 장기를 보존하기 위하여, 보다 느리고, 지연된 융합 속도를 가지는 SUV가 바람직하다. 그러한 속도는 단지 DOPC만으로 이루어진 소포로써 얻어진다. 한편, 졸증, 심장 마비 또는 외상 환자에 관해서 세포내 ATP의 즉각적인 상승이 중요한 경우, 매우 빠른 전달 속도를 가진 SUV가 바람직하다; 예컨대 DOPC/POPA 조성물은 5 분 내에 충분한 ATP를 전달한다 (실시예 참조).

4개의 일반적인 접근법을 지질 조성물을 조작하여 융합 속도를 변경시키는데 사용할 수 있다:

(1) 정전기 상호 작용의 증가;

(2) 멤브래인 이중층의 불안정화;

(3) 비이중층 상의 증가; 및

(4) 이종 지질상의 형성

정전기 상호 작용의 증대

정전기 상호 작용을 이용하여 융합 속도를 증가시킬 수 있다. 인지질은 이들의 전하(양이온, 음이온 및 쌍성 이온)에 따라 분류된다. 다수의 양이온 인지질(예컨대, PE) 및 음이온 인지질(예컨대, 포스파티드산(POPA))은 생리적인 pH에서 폐쇄 소포를 형성하지 않는다. 그러나, 쌍성 이온 포스파티딜콜린과 혼합된 음이온 및 양이온 지질은 생리적인 pH에서 폐쇄 소포를 형성할 수 있다.

대부분의 세포의 원형질막은 순 음전하를 가진다. 이러한 음전하 때문에, 순 양전하를 나타내는 카운터밸런싱(counterbalancing) 이온, 전형적으로 칼슘, 마그네슘, 나트륨 및 칼륨의 층이 존재한다. 리포솜과 원형질막 간의 정전기 상호 작용의 이점을 취하면서, 순 음전하를 갖도록 SUV를 처리하여, 세포-지질 소포 융합을 최대화한다. 그러나, 일부 세포 원형질막은 음이온 층에 의해 카운터밸런싱되는 더 많은 양이온 지질을 함유할 수 있다. 이러한 상황에서는, 순 음전하를 갖도록 SUV를 처리하여 세포-지질 융합을 최대화한다.

이종 지질 상의 형성

원형질막은 특정 지질 종에 풍부한 지질 도메인 또는 래프트를 함유한다. 이러한 막의 경계에서는 래프트가 이종 지질 종의 영역이다. 이들 영역은 불안정한 전위를 가지며, 이는 막이 다른 막과 상호 작용하도록 한다. 일부 인지질은 지질 래프트 형성을 증가시킨다고 알려져 있으며, 이에는 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린 및 콜레스테롤의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, DOPC, 18:0 스핑고미엘린 및 콜레스테롤은 SUV 제조 과정 동안 1:1:1의 비율로 혼합된다. 콜레스테롤은 스핑고미엘린 상에 선택적으로 분배되며, DOPC가 풍부하고 콜레스테롤이 적은 영역 및 스핑고미엘린이 풍부하고 콜레스테롤이 풍부한 영역을 형성한다.

융합의 물리적인 파라미터, 즉, 온도, 농도, 이온 강도 및 융합 기간을 변화시켜 융합 속도에 영향을 끼칠 수 있다. 온도를 변화시켜 시스템의 자유 에너지(G)를 변화시키며, 이는 상이한 융합 속도에 이르게 한다. 지질 소포 농도의 증가 또한, 특히 매우 고농도에서 막 융합 속도에 영향을 끼친다. 융합 기간(융합의 길이) 및 융합 기간의 수 또한 SUV의 캡슐화 함량의 전달 속도에 영향을 끼친다.

온도

조직이 보존되는 온도(4 ℃-저체온, 22 ℃-실온, 37 ℃-정상 체온)에서 ATP-SUV를 조직과 함께 5, 10, 15, 30, 60 또는 120분 배양하였다. 소포 용액의 온도의 증가는 소포의 운동에너지의 증가 및 이로 인한 융합 능력의 증대에 이르게 한다. 온도 또한 소포의 자유 확산에 영향을 끼친다.

소포 융합시 농도

농도의 증가는 SUV 함량 전달을 증가시키는 것을 직관적으로 이해할 수 있지만, 막 융합 속도는 선형적이지 않다. 일단 SUV 지질이 가능한 모든 원형질막 표면을 차지하면, 추가의 융합은 제한된다. 원형질막과의 융합 정도는 막 부피 및물성, 예컨대 이온 투과성 및 지질 구조에 영향을 끼친다. 따라서, SUV를 투여할 때, 표적 세포가 효과적으로 처리될 수 있도록 SUV 농도를 조절하여야 한다.

융합 기간

융합이 발생할 수 있는 시간의 길이는 캡슐화된 성분이 전달되는 정도를 조절할 수 있게 한다. 바람직한 융합 기간은 1 내지 180분, 예컨대, 1, 5, 10, 30, 60, 120 및 180분이다. 융합을 중지시키기 위해서는, 소포를 제거하거나(예컨대, 완충액으로 세척하여) 또는 투여되는 소포의 농도가 바람직한 시간의 종말점에서 소포가 소진되도록 한다. 소포의 총 전달이 한번의 또는 다중의 투여를 통해 조절되도록 융합을 최적화시킬 수도 있다. 예를 들면, 표적 융합 기간이 120분인 경우, 2회의 60분 기간을 사용하거나, 4회의 30분, 12회의 10분 또는 24회의 5분 융합 기간을 사용할 수 있다. 적절한 장치가 이용가능하다면, 1분 이하의 융합 기간 또한 달성할 수 있지만, 이들 기간은 종종 불편하고 기술적으로 많은 노력을 요한다.

표적 세포 및 조직의 ATP 요건의 측정

ATP 투여의 최적 속도는 세포의 ATP에 대한 기초 대사 요구량과 유사하며, 이는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 산소 소비 속도, 피루베이트, 글루코스, 락테이트 및 양성자 누출을 계산할 수 있고, 이러한 데이타로부터 조직의 ATP 소비가 ATP 소비량/분으로서 측정된다.

조직 산소 소비

조직의 샘플을 -20 ℃로 미리 냉각시킨 글래스 균질화기에 위치시킨다. 얼음 냉각 분리 완충액, 예컨대 pH 7.3에서의 40 mM 트리스, 5 mM 말레에이트, 70 mM KCl 및 200 mM 수크로스를 첨가하고, 조직을 서서히 균질화시킨다. 균질물을 잠시 원심분리하여 비균질 물질을 제거한다. 이어서, 산소 측정기에 5 ㎖의 산화 완충액을 위치시키고, 37 ℃로 평형을 유지시킨다. YSI 산소 욕조 교반기(옐로우 스프링스(Yellow Springs), 미국 오하이오주)에 2 내지 3 mg/㎖의 최종 단백질 농도로 세포를 위치시킨다. 산소 프로브를 용액 내로 위치시키고, YSI 산소 측정기를 사용하여 용액 내의 산소 %를 측정한다. 이어서, ADP를 욕조에 첨가시켜 상태 2의 호흡 속도를 달성한 후, 글루타메이트를 첨가하여 상태 3의 호흡 속도를 달성한다. 일단 글루타메이트가 조직에 의해 소비되면, 호흡의 최종 상태인 상태 4가 달성된다. 상태 3의 호흡 속도 대 균질물에 첨가한 ADP 양의 플롯은 인/산소(P/O) 비의 계산을 가능하게 한다. 이 값은, 조직이 ADP/분으로부터 생산할 수 있는 ATP의 양을 결정하며, 이는 ATP의 조직 소비량/분의 지표가 된다.

막 전위 및 양성자 누출

조직 샘플을 분리하고, 막 전위 형광 프로브 MC540(시그마(Sigma); 미국 미주리주 세인트루이스)과 함께 배양하였다. 다양한 양의 칼륨의 첨가시 MC540의 형광에서의 변화가 이전에 기술된 바와 같은(브랜드(Brand), 1995) 막 전위 및 양성자 누출의 지표로서 측정된다.

글루코스, 피루베이트 및 락테이트 수준

일반적인 방법 또는 상업적으로 입수가능한 분석 키트(예컨대, 시그마로부터 입수가능한 것들)를 사용하여 이들 대사 중간체들을 측정하였다. 이들 중간체들의수준을 단백질 수준으로 조절하고, 120분 시간 주기에 걸쳐 측정하였다.

ATP 소비의 측정

락테이트, 피루베이트 및 글루코스 축적 속도, 산소 소비 속도 및 양성자 누출 속도로부터, 에인스코우(Ainscow)와 브랜드(1999)에 의해 기술된 바와 같은 반응 화학량론을 사용하여 시스템을 통한 모든 유동을 계산할 수 있다.

투여

제약 조성물

많은 경우에, ATP-SUV 및 완충액을 포함하는 간단한 조성물로서 ATP-SUV를 전달할 수 있다. 그러나, 바람직하다면, 다른 생성물, 예컨대 통상적으로 제약 조성물에서 담체로서 사용되는 것들을 첨가할 수 있다.

"제약적으로 허용가능한 담체"로는, 제약 투여에 적합성이 있는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다(레밍톤(Remington) 2000). 이러한 담체 또는 희석액의 바람직한 예로는, 물, 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 보충 활성 화합물이 조성물에 혼입될 수도 있다.

일반적인 고려할 사항

본 발명의 제약 조성물을, 정맥 내, 피내, 피하, 경구, 흡입, 경피, 경점막 및 직장 투여를 포함하는 그것의 의도된 투여 경로에 적합성이 있도록 제제화한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 및 현탁액으로는, 무균성 희석액, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는기타 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 완충액, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 독성 조절을 위한 약제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함할 수 있다. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조절될 수 있다. 앰플, 일회용 주사기, 또는 글래스 또는 플라스틱으로 제조된 다용량 바이알에 비경구용 제제를 넣을 수 있다.

음성으로 하전된 지질 소포를 ATP-SUV 조성물에 사용하는 경우, 융합 부위에서 최종 농도가 바람직하게는 0.1 mM 내지 10 mM(0.1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mM을 포함함)이 되도록 칼슘을 포함시킨다.

ATP-SUV 중의 ATP는 대개 ATP-SUV 주위의 임의의 용액 중의 ATP와 평형이며, 전형적으로는 총 ATP의 단지 1 내지 10 %가 ATP-SUV 내에 존재한다. 잔류 ATP는 수용체, 예컨대 퓨린 수용체 P2y에 결합하여 이온을 세포 밖으로 유출시키고 이온 평형 및 항상성에 간섭할 수 있다. 세포는 대개 이온 평형 및 항상성을 복구시킬 수 있지만, 이는 추가의 ATP를 소비한다. 따라서, 특히 기능의 즉각적인 복구가 바람직한 조직에서는 (예를 들어, 조직 이식 또는 사지 재부착 동안) 조성물에 하나 이상의 퓨린 수용체 P2y 길항제를 포함시키는 것이 유익하다. 길항제는 SUV 내에 있을 필요가 없기 때문에, 바람직하게는 소포를 형성한 후에 또는 투여 직전에 퓨린 수용체 P2y 길항제를 조성물에 첨가한다. 퓨린 수용체 P2y 길항제의 예로는, 피리독살 5-포스페이트, 비타민 B6(피리독살-5-인산) 및 리액티브 블루 2(Reactive Blue 2; 1-아미노-4-[[4-[[4-클로로-6-[[3(또는 4)-술포페닐]아미노]-1,3,5-트리아진-2-일]아미노]-3-술포페닐]아미노-9,10-디히드로-9,10-디옥소-2-안트라센술폰산), 및 이들의 조합을 포함한다. 퓨린 수용체 P2y 길항제는 바람직하게는 0.1 내지 250 μ몰/ℓ, 더욱 바람직하게는 1 내지 100 μ몰/ℓ의 농도로 사용될 수 있다.

주사용 제제

주사용으로 적절한 제약 조성물로는, 무균성 주사용 용액 또는 분산액의 임기 제제용 무균성 수용액 또는 분산액을 포함한다. 정맥 내 투여에서, 적절한 담체로는, 생리 염수, 정균수, 크레모포어(CREMOPHOR) EL^TM(바스프(BASF), 미국 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에서, 조성물은 무균성이어야 하고, 주사기를 사용하여 투여될 수 있도록 유체이어야 한다. 이러한 조성물은 제조 및 저장 동안 안정하여야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균으로부터의 오염에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 기타 적합성이 있는 적절한 혼합물을 함유하는 분산 매질일 수 있다. 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살은 미생물 오염물을 함유할 수 있다. 등장제, 예컨대 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨이 조성물에 포함될 수 있다. 흡수를 지연시킬 수 있는 조성물은 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 약제를 포함한다.

필요한 양의 ATP-SUV를 필요한 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매에 혼입시킨 후 멸균하여, 무균성 주사용 용액을 제조할 수 있다. 무균성 주사용 용액의 제조를 위한 무균성 고형의 제조 방법은 ATP-SUV 지질 및 임의의 필요한 성분(예컨대, ATP)을 함유하는 고형을 수득하기 위한 무균성 용액의 진공 건조 및 냉동 건조를 포함한다.

경구용 조성물

경구용 조성물은 일반적으로 불활성 희석액 또는 식용성 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 넣어지거나 또는 정제로 압축될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 활성 화합물을 부형제와 함께 혼입시키고, 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용할 수 있다. 또한, 구세액으로 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 경구용 조성물을 제조할 수 있으며, 이 때 유체 담체 내의 화합물은 경구로 가해진다. 제약적으로 적합성이 있는 결합제 및/또는 보조 물질을 포함할 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키 등은 임의의 아래의 성분들, 또는 유사한 성질의 화합물을 포함할 수 있다: 결합제, 예컨대 미정질 셀룰로스, 트라가칸드 고무 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔(PRIMOGEL), 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로츠(STEROTES); 유동화제(glidant), 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지향.

흡입용 조성물

흡입에 의한 투여를 위해, 적절한 분사제(예를 들어, 이산화탄소와 같은 가스)를 함유하는 분무기 또는 압축 용기로부터의 에어로졸 분무로 화합물을 전달한다.

경점막용 또는 경피용

투여는 경점막 또는 경피일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 표적 배리어(들)를 투과할 수 있는 침투제가 선택된다. 경점막 침투제로는, 세정제, 담즙염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여에 경비 분무 또는 좌약을 사용할 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물을 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제제화한다. 직장 전달을 위한 좌약(예를 들어, 염기, 예컨대 코코아 버터 및 기타 글리세리드와 함께) 또는 정체관장 또한 제제화할 수 있다.

담체

한 실시태양에서는, 활성 화합물은 신체로부터의 급속한 배출에 대해 화합물을 보호하는 담체와 함께 제제화된다(이식 및 미세캡슐 전달 시스템을 포함하는, 예컨대 조절 방출형 제제). 생분해성 또는 생적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 물질은 알자 코포레이션(ALZA Corporation; 미국 캘리포니아주 마운틴뷰) 및 노바 파마슈티칼스 인크(NOVA Pharmaceuticals, Inc.; 미국 캘리포니아주 레이크 엘시노어)로부터 상업적으로 얻을 수 있거나 또는 당업자에 의해 제조될 수 있다.

용량

용량은, 상이한 SUV 지질 조성물에 따라 변하는 ATP-SUV의 고유 특성, 특정한 필요한 치료 효과 및 투여 경로에 의해 정해지고, 이에 직접적으로 의존한다. 임의의 특정 환자 또는 적용에 대한 특이 용량 수준 및 빈도는 변할 수 있다. 고려되어야 할 요소로는, (1) 투여되고 융합이 일어나는 온도; (2) 투여 부위의 이온 환경 및 ATP-SUV 조성물의 이온 강도; 및 (3) 융합이 일어나는 시간의 길이를 포함한다. 이들 요소들을 조절하는 것은 ATP를 포함하는 캡슐화된 성분들이 전달되는 정도를 조절할 수 있게 한다.

SUV를 투여할 때, SUV 농도를 조절하여 표적 세포를 효과적으로 치료하면서, 동시에 SUV 지질로 원형질막을 포화시켜 이들의 기능을 억제하지 않을 수 있다. 지질 조성물, 표적 세포 분산액 및 투여되는 부피에 의존하는 바람직한 SUV의 농도는 0.5 mg/㎖ 내지 100 mg/㎖, 예컨대 0.5 mg/㎖, 1 mg/㎖, 5 mg/㎖, 10 mg/㎖, 20 mg/㎖, 30 mg/㎖, 40 mg/㎖, 50 mg/㎖, 60 mg/㎖, 70 mg/㎖, 80 mg/㎖, 90 mg/㎖ 및 100 mg/㎖일 수 있다.

정전기 상호 작용을 통해 발생하는 소포 융합은 칼슘 및/또는 마그네슘 농도의 변화에 현저하게 영향을 받고, 나트륨 및/또는 칼륨 농도의 변화에는 더 적은 정도의 영향을 받는다. ATP-SUV를 투여하는데 사용되는 조성물에서의 또는 ATP-SUV 투여 전 또는 후에 표적 부위에 투여되는 조성물에서의 상기 이온 농도의 조정은 용량 결정에 영향을 끼친다. 바람직하게는, 0.01 nM 내지 1 mM(0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM, 10 μ몰/ℓ 및 100 μ몰/ℓ를 포함함)의 이온 농도를 사용한다. 이들 및 다른 이온의 조합 또한 사용할 수 있다.

지속적 투여 또는 단독 투약의 요법이 이용될 수 있고 치료의 유형, 투여 경로, 소포 그 자체에 따라 선택된다. 바람직하게는 융합 기간은 1-180 분, 예컨대, 1, 5, 10, 30, 60, 120 및 180 분을 포함한다. 융합을 정지시키기 위해, ATP-SUV를 제거하거나 (가령 완충액으로 세척하여), 또는 소포의 농도가 소포가 바람직한 시간의 종료점에서 고갈되도록 한다. 융합은 소포의 총 전달이 1회 또는 다수의 투여를 통해 조절되도록 최적화될 수도 있다. 예를 들어, 융합 기간이 120 분인 경우, 2 회의 60 분 기간이 이용될 수 있거나, 4 회의 30 분 기간, 12 회의 10 분 기간, 또는 24 회의 5 분 융합 기간이 이용될 수 있다.

ATP-SUV의 용도

ATP가 보편적으로 세포에 필요하기 때문에, ATP-SUV 및 기타 SUV/ATP 조성물이 생물학 영역에 걸쳐 폭 넓게 적용된다.

혈액

적혈구가 제 기능을 할 수 없게 되기 전 까지, 혈액은 냉장고에서 약 45 일 동안 보관될 수 있다. 적혈구는 일반적으로 순환계 내에서 약 120 일 동안 생존하고, 그 후 지라 및 간에서 제거 및 파괴된다. 따라서, 기능을 할 수 없는 세포가 수혈되면, 이것은 마찬가지로 순환계에서 즉시 제거된다.

수집된 혈액에 ATP-SUV 또는 기타 SUV-캡슐화 ATP 조성물을 첨가하는 것은 적혈구를 더 오래 생존시키고, 활동 가능한 보관 시간 및 세포가 순환계에 잔류하여 파괴되지 않을 가능성을 증가시킨다.

지질 조성은 ATP 전달을 최적화하기 위해 변경될 수 있다. 예를 들어, 혈액은 4 ℃에서 저장되기 때문에, ATP에 대한 대사적 요구가 낮다. 이 온도에서는 SUV의 융합속도 또한 느려지긴 하지만, 이 속도는 활동 가능한 저장에는 너무 높을 수 있고 SUV 지질 조성물이 혈구의 대사적 요구에 더 잘 부합되도록 유도된다.

수집된 전체 혈액이 본 발명의 조성물과 접촉하여 저장되는 경우, 백혈구 및 혈소판에도 효과가 있을 것이고 더 오래 활동 가능하게 유지될 것이다.

재접합을 위한 절단된 신체 부위의 유지

(대개는 우발적인) 신체 일부의 절단 후에, 재접합의 성공 여부는 부속물이 그것의 본체와 떨어져 생존하는 능력에 주로 의존한다. 허혈 시간이 길수록 재접합에 의해 기능 가능한 부속물 또는 어떤 종류의 성과가 나타날 가능성이 적어진다.

일례로, 회수한 절단 사지의 주 공급 동맥을 관류를 위해 삽관한다. 사지가 ATP-SUV로 매 4 시간 마다 관류되거나, 또는 조직 ATP 수준의 변화 때문에 필요하다고 결정되는 대로 관류된다. 사지의 동맥압은 혈류 유도 손상의 가능성을 감소시키고 절단 사지의 전반적인 보존을 관찰하기 위해 관류하는 동안 모니터할 수 있다 (높은 관류 압력은 사지 이환을 표시하는 것일 수 있다). 보존 기간 후에, 사지를 링거액 또는 기타 적당한 용액으로 씻어내어 ATP-SUV의 잔류물을 제거한다. 그 후 사지를 공지의 방법을 이용해 외과적으로 재부착한다. 문합 후의 사지 기능의 외부 지표를 성과를 모니터하기 위해 평가한다 (색상, 미소혈전의 징후, 온도, 맥박, 산소 포화, 도플러 혈류 측정). 재접합 이전 및 이후에, 헤파린을 적용하고 감염의 가능성을 줄이기 위해 항균 요법을 취한다.

심장 정지

저산소 발작 (hypoxic episode) 후 즉시 또는 가능한 빨리 ATP-SUV를 정맥내 또는 심장내 주입에 의해 심장에 주입한다. SUV 지질 조성물은 ATP 전달이 조심스럽게 심장 조직의 대사적 요구에 부합하도록, 즉 심장 기능을 극대화하도록 조작된다. ATP-SUV는 허혈 위험이 지나갈 때까지 생리적 조건에서 지속적으로 심장 내로 관류될 수 있다.

기관 보존을 위한 ATP의 전달

기관 (예컨대, 심장, 간, 폐, 신장 또는 이자)은 기증자로부터 제거되고, 기관 내로의 주 공급 동맥이 삽관된다. 기관 내의 혈액을 식염수, 링거액 또는 기타 적절한 용액을 이용해 기관으로부터 씻어낸다. ATP-SUV를 통상적인 보존 용액 또는 완충액에 첨가하고 기관 내로 부드럽게 관류 (≥80 mm Hg)하는데, 이것의 빈도는 기관에 따라 다르다.

동일한 ATP-SUV를 동물을 이용한 실험실 세팅에 이용할 수 있다. 예를 들어, 라겐도르프 (Lagendorff) 심장 (또는 다른 기관) 관류 장치가 사용된다. 대동맥을 삽관하고 심장을 관류 챔버에 둔다. 심장을 ATP-SUV를 첨가한 산소화된 관류액으로 관류한다. 고농도의 칼슘 용액을 심장 정지를 일으키기 위해 주입할 수 있다. ATP-SUV에 의한 심장마비가 보존 기간 동안 이용될 수 있다. 심장은 기능 연구를 위해 재관류되거나 허혈 보존 후에 이식될 수 있다.

전신적인 ATP의 전달

ATP-SUV는 다양한 이유로 인해 생체에 투여될 수 있다. 예를 들어, ATP-SUV는 체내에서 에너지를 보충하기 위해 이용될 수 있고 (바람직한 투여 경로는 경구, 국소 및 흡입이다), 또는 전신에 대한 산소 의존성을 감소시키기 위해 이용될 수 있다 (이 경우 바람직한 투여 경로는 정맥내 투여이다). ATP-SUV가 목동맥을 통한 지속적인 주입에 의해 동물에 투여되는 경우, 심장 속도 및 혈압은 감소하고 호흡이 정지한다. 동물은 저산소증 9 분 후에도 소생할 수 있다 (실시예 참조).

상처에 대한 ATP-SUV

상처로의 혈류는 줄어들기 때문에, 상처 내 및 주변의 세포에서는 더 적은 산소가 이용가능하다. 산소 전달의 감소는 ATP 생산의 감소를 초래하는데, 이는 상처 치유에 필요한 많은 세포 사건, 예컨대 단백질 및 핵산 합성, 이온 채널 기능, 신호 전달 및 이동을 지연시킨다.

ATP-SUV는 상처의 치유 또는 ATP 소모 정도에 의해 필요로되는 대로 상처에 적용된다. 예를 들어, 상처 폐쇄를 촉진하기 위해 충분한 ATP를 상처의 경계세포에 공급하기 위해, ATP-SUV를 바람직하게는 하루에 1-12 회 (예컨대 일일 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 회) 적용할 수 있다. 바람직하게는 ATP-SUV는 수(水)계 ATP-SUV가 상처 경계세포와 직접 접촉되게 하는 특별히 고안된 어플리케이터로 상처 상에 직접 적용된다. 별법으로, ATP-SUV는 크림 또는 기타 국소용 제약 조성물로 국소적으로 적용될 수 있다.

ATP-SUV는 치유를 더욱 증진시키기 위해 이미 사용가능한 치유 조성물과 혼합될 수도 있다. 예를 들어, ATP-SUV는 레그라넥스 (Regranex) (등록상표)에서 발견되는 베카플러민과 혼합될 수 있다. 베카플러민 이외의 기타 상처 치료 성분은 방부제, 항균제 및 마취제를 포함한다. "상처 치료 성분"이라는 용어는 SUV를 포함하지 않는다.

출혈 쇼크에 대한 ATP-SUV

출혈 쇼크는 내부 또는 외부 손상에 의한 다량의 혈액 손실에 의해 초래된다. 혈액 공급이 불충분하므로, 피험 대상은 종종 저혈압이 되고, 기관의 부전 및 즉각적인 사망을 가져온다.

출혈 쇼크의 효과를 막기 위해, ATP-SUV를 혈액 수혈의 보충물로서 정맥내 주입한다. 그리고 전신 산소화가 향상됨에 따라 ATP-SUV를 감소시킬 수 있다.

혈소판 저장을 위한 ATP-SUV

혈소판은 약 5일의 저장 수명을 갖고, 이후에는 폐기되어야 한다. 혈소판 기능의 상실은 부분적으로는 ATP의 손실 때문이다.

분리된 혈소판에 세포내 ATP 수준 유지에 필요한 대로 ATP-SUV를 공급한다. 그러면 혈소판의 저장 수명은 연장된다. ATP-SUV는 식염수와 같은 적절한 혈소판 저장용 용액에 현탁된다. SUV 지질 조성은 ATP 투여를 최적화하기 위해 변경될 수 있다. 예를 들어, 혈소판은 실온 (22-24 ℃)에서 보관하므로 생리적 온도 (37 ℃)에서 보다 ATP에 대한 대사적 요구가 낮을 것이다. 이 온도에서는 SUV의 융합 속도 역시 느려지지만, 이 속도는 활동가능한 보관에는 너무 높을 수 있고 SUV 지질 조성물은 혈소판의 대사적 요구에 더 잘 부합하도록 유도된다.

기관 및 조직 공학을 위한 ATP-SUV

지금은 조직을 시험관 내에서 매우 효율적으로 생장시킬 수 있다. 그러나 그러한 조직은 혈액 공급에 연결하는 맥관구조가 없다. ATP-SUV는 이러한 결점 극복에 도움이 된다.

ATP-SUV는 골격근과 같은 독립 조직으로부터 유도된 혈관 네트워크를 선택적으로 보존하는데 이용될 수 있다. ATP-SUV의 지질 조성물은 ATP-SUV가 혈관에서 쉽게 빠져나가지 않도록 제조된다.

ATP-SUV의 투여는 맥관구조를 유지시키지만 실질 (parenchyma)은 유지되지 않고 죽는다. 그 후 손상되지 않은 맥관구조를 특정 조직으로 분화하는 능력이 있는 줄기 세포를 갖는 적합한 조건하에서 시딩하고 배양한다. 이러한 방법으로 맥관구조화 될 수 있는, 시험관 내 생산 조직은 간, 이자, 심장, 폐 및 지라를 포함한다.

별법으로, 이미 시험관 내에서 구성된 기관은 맥관구조가 기관 세포가 생장하기 시작한 이후에 얻어지고 처리되는 것을 제외하고는, 이와 동일한 접근법을 이용해 부분적으로 맥관구조화될 수 있다.

수술 동안의 ATP-SUV

주요 외과 수술 동안 혈액 및 산소의 감소가 일어날 수 있다. 허혈 또는 저산소증으로부터의 임의의 타격을 최소화하기 위해 ATP-SUV가 외과 수술에 관련된 부위 또는 전신에 투여될 수 있다. ATP-SUV가 유용한 수술의 예는 관상동맥 바이패스, 심장 개방 수술, 유리 피판 이식술 및 일부 성형 외과 수술을 포함한다.

일부 수술에서는, 수술 동안 척수가 충분한 산소를 공급받지 못하므로 가끔 마비가 일어난다. 이는 주로 흉외 대동맥류 절제술에서 발생한다. 처치 부위에 ATP-SUV를 적용하거나 정맥내로 투여하면 의사는 작업을 위한 더 많은 시간을 가질 수 있고, 산소 손실로 유발되는 손상의 가능성이 감소되며, 이환이 줄어들게 된다.

뇌졸중에 대한 ATP-SUV

현재, 뇌졸중 후의 즉각적인 고 글루코스 용액의 투여가 뇌로의 혈류 감소 영향을 줄이기 위해 사용된다. 글루코스는 신경 세포 ATP 수준을 증가시키고 신경 세포 사멸을 감소시키는 것으로 보인다. 그러나, 이런 목적은 산소 공급이 제한되는 경우 달성하기 어렵다. ATP-SUV는 신경 조직에 ATP를 더 효과적으로 공급할 것이다.

호흡기 문제에 대한 ATP-SUV

많은 호흡기 질환이 삶의 질을 떨어뜨리고 종종 사망에 이르게 한다. 이런 경우에 있어, 사망의 주요 원인은 조직 및 기관을 사멸케 하는 혈중 산소의 결핍이다. 피험 대상은 혈액 산소 수준의 감소 효과를 줄이기 위해 ATP-SUV를 주입받는다.

종양 환자에 대한 ATP-SUV

말기 종양 환자는 합병증의 발생으로 사망한다. 종양 또는 치료가 환자를 쇠약하게 하기 때문에, 종양 환자는 종종 폐렴으로 사망한다. 중요한 대사원을 침범하여 건강한 세포를 약화시키는 종양 세포나 또는 치료 동안 파괴되는 건강한 비종양 세포에 의해, 또는 양자 모두에 의해 쇠약해지게 된다. 종양 환자는 전신 ATP 수준을 보충하기 위해 매일 ATP-SUV를 투여받고, 따라서 대사원을 전유하는 종양 세포의 효과가 감소한다. ATP-SUV를 투여함으로써 종양으로 인한 후유증이 감소하고 기대 수명이 연장된다.

화학 독소에 대한 ATP-SUV

미토콘드리아의 ATP 생산을 억제하거나 아니면 세포의 ATP 생산을 감소시키는 시아나이드 및 기타 화합물을 ATP-SUV를 이용하여 저지할 수 있다. ATP-SUV는 시아나이드에 담구어졌을 때 세포 및 조직의 생존률 및 기능을 유지시킨다. ATP-SUV는 미토콘드리아 ATP 생산이 없을 때 세포질 ATP를 증가시킨다. ATP-SUV는 시아나이드 및 시아나이드와 유사한 방식으로 작용하는 기타 독소에 대한 해독제로 사용될 수 있다. ATP-SUV는 또한 일산화탄소 독성 효과를 감소시키는데 이용될 수 있다.

단백질, 탄수화물, 올리고뉴클레오티드 및 기타 약물의 전달을 위한 ATP-SUV

ATP-SUV를 포함한 용해성이 높은 지질 소포를 수용성 및 막 결합 단백질, 탄수화물, 올리고뉴클레오티드 및 기타 약물의 존재하에서 제조하여, 앞서 언급한 임의의 물질이 세포질 또는 세포막에 효과적으로 전달되게 할 수 있다. 이 약물 전달 방법은 많은 전통적인 문제점들을 회피하고, (1) 막 불투과성인 약제의 도입을 가능하게 하여 이용할 수 있는 약제의 범위를 크게 확장시킬 뿐만 아니라 막 침투 속도가 낮은 약제의 효능을 증가시키며, (2) 폴리펩티드 및 탄수화물이 직접 세포막에 편입될 수 있게 한다. 이 마지막 장점은 예를 들어, 불확실한 유전자 치료 접근법을 회피할 수 있는 대체 치료법이 가능하게 한다. 예컨대, 피험 대상이 세포 상에 수용체가 결핍된 경우, 그 수용체는 ATP-SUV 내에 혼입되어 적절하게 투여될 수 있다.

이들 방법은 SUV가 소포내 물질 및/또는 막 결합된 분자로 채워지는 것을 제외하고는 ATP를 세포 내에 도입하는 방법을 모방한다.

기타 저산소 환경을 위한 ATP-SUV

잠수, 우주 여행, 고지 및 기타 산소가 희박한 환경은 신체로의 산소 전달을 감소시킬 수 있다. 산소 부족을 보충하기 위해, ATP-SUV를 정맥내, 경구 또는 흡입으로 투여한다.

고기 보존을 위한 ATP-SUV

조직 및 기관 보존, 동물 및 환자에 있어서의 용도 뿐 아니라, ATP-SUV는 고기 내의 세포를 산소가 없이도 살아있게 유지할 수 있다. 도살 후, 동물은 출혈하고 잔여 혈액을 사체로부터 씻어낸다. ATP-SUV를 목동맥 또는 기타 거대 동맥을 통해 관류하고 맥관구조를 ATP-SUV로 채운다. 그리고 동물을 ATP-SUV가 그대로 있는 채 운반하고, 동물 세포를 살아있게 유지하여 ATP-SUV가 혈액의 저장 수명을 연장시키는 만큼 고기의 저장 수명을 연장시킨다. ATP-SUV가 내인성 성분을 이용하므로 고기의 맛 및 육질에는 영향이 없다.

식물에 대한 ATP-SUV

식물은 생명 및 생장을 유지하기 위해 광합성을 이용한다. 광합성은 두가지 반응으로 나뉘는데, 햇빛으로부터 에너지를 수집하여 화학 에너지, ATP 및 니코타인아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트의 환원 형태 (NADPH)로 전환하하는 광반응과 ATP 및 NADPH를 이용하여 CO₂를 고정시키는 암반응이 그것이다.

식물은 뿌리 시스템, 또는 잎, 줄기, 꽃, 분열조직 또는 다른 식물 부분에의 직접 적용을 통해 ATP-SUV를 제공받는다. ATP-SUV는 식물 세포에 암반응에 필수적인 ATP를 전달한다. ATP-SUV를 이용한 ATP의 전달은 햇빛에 대한 필요성을 줄이거나 대체시키고, 식물이 어둠 또는 밝지 않은 조건 하에서 생장할 수 있게 한다. 또한, ATP-SUV는 식물 생장을 증진하고 식물 생명을 유지시키는데, 시판되는 신선한 야채, 절화 (cut-flower) 산업 및 수경 원예에 중요한 측면이다.

생체반응기를 위한 ATP-SUV

생체반응기 생산성에 대한 주요 제한 요소는 이러한 물질의 일차 생산자인 박테리아 및 효모가 ATP를 만들 충분한 기질을 가져야 하는 것이다. 그러므로, 임의의 한 배양에서 박테리아 또는 효모의 수는 제한된다. ATP-SUV는 생체반응기로 주입되어 미생물의 수를 증가시키고, 생체반응기의 산출을 증가시킨다. 배양된 곤충, 동물, 식물 및 기타 진핵 세포가 동일한 ATP 생산 요건을 가지므로, 본 출원은 박테리아 및 진균에만 한정되지 않는다.

<요약>

제 1 측면으로, 본 발명은 ATP, 및 안정한 소포 형성제인 인지질을 포함하는 소포이다. 소포의 융합 속도가 20 소포 융합/초 이상이다.

제 2 측면으로, 본 발명은 안정한 소포 형성제인 안지질 및 다른 극성 지질 및(또는) PEG를 포함하는 소포이다. 이 소포의 융합 속도가 20 소포 융합/초 이상이다.

제 3 측면으로, 본 발명은 ATP 및 안정한 소포 형성제인 인지질을 포함하는 소포이다. 인지질은 하기 화학식 (I')의 구조를 갖는다

여기서, X'는 화학식 (II')의 구조를 가지며, L'는 두개의 수소 원자를 추가 이탈시킨 알킬이고, Z'의 하나는 E"이거나 화학식 (XI")의 구조를 갖고, 다른 Z는 E'이거나, 화학식 (XI')의 구조이다

(여기서, B'는 양이온 또는 알킬기이고, A' 는 일킬기임)

(여기서, E"은 알킬 또는 알케닐임)

(여기서, E'은 알케닐임)

제 4 측면으로, 본 발명은 안정한 소포 형성제인 인지질 및 안정한 소포 형성제가 아닌 극성 지질 및(또는) PEG를 포함하는 소포이다. 안정한 소포 형성제인 인지질은 화학식 (I)의 구조를 갖는다.

여기서, X는 H 또는 화학식 (II)의 구조를 갖고, L은 두개의 수소 원자를 더 이탈시킨 알킬이고, 각 Z는 독립적으로 H, E 또는 화학식 (XI)의 구조이다.

(여기서, B는 양이온 또는 알킬기이고, A는 H 또는 알킬기임)

(여기서, E는 알킬 또는 알케닐이고, Z 중의 하나가 H인 경우, 다른 Z는 H가 아님).

제 5 측면으로, 본 발명은 세포를 소포에 접촉시키는 것을 포함하는 ATP를 세포로 전달하는 방법이다. 소포는 안정한 소포 형성제인 인지질 및 ATP를 포함한다. 세포에 전달되는 ATP의 양은 세포의 대사 요구량을 만족시키기에 충분하다.

제 6 측면으로, 본 발명은 상처에 소포를 포함하는 조성물을 접촉시키는 것을 포함하는 상처를 치료하는 방법이다. 이 소포는 안정한 소포 형성제인 인지질 및 ATP를 포함한다.

제 7 측면으로, 본 발명은 소포 및 베카플러민을 포함하는 조성물이다. 소포는 안정한 소포 형성제인 인지질 및 ATP를 포함한다.

제 8 측면으로, 본 발명은 세포를 소포에 접촉하는 것을 포함하는 하나 이상의 세포를 갖는 생체 반응기의 생산성을 개선하는 방법이다. 소포는 안정한 소포 형성제인 인지질 및 ATP를 포함한다.

정의

"알킬" (또는 알킬- 또는 알크-)는 치환 또는 비치환, 직쇄, 분지 또는 시클릭 탄화수소 사슬, 바람직하게는 탄소 원자수 1 내지 20를 포함하는 탄화 수소 사슬을 지칭한다. 이러한 비치환 알킬기의 예로 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 시클로프로필, 부틸, 이소-부틸, tert-부틸, sec-부틸, 시클로부틸, 펜틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 헥실 등을 포함한다. "알킬아릴" 및 "알킬헤테로시클릭" 기는 각각 아릴 또는 헤테로시클릭 기에 공유결합된 알킬 기이다.

"알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 포함하는, 그리고 바람직하게는 탄소 원자수가 2 내지 20인 치환 또는 비치환된, 직쇄, 분지 또는 시클릭, 불포화 탄화수소 사슬이다. 예시적인 비치환된 알케닐기는 에테닐(또는 비닐), 1-프로페닐, 2-프로페닐 (또는 알릴), 1,3-부타디에닐, 헥세닐, 펜테닐, 1,3,5-헥사트리에닐 등을 포함한다. 바람직한 시클로알케닐 기는 5 내지 8 탄소 원자 및 하나 이상의 이중 결합을 포함한다. 시클로알케닐 기의 예로 시클로헥사디에닐, 시클로헥세닐, 시클로펜테닐, 시클로헵테닐, 시클로옥테닐, 시클로헥사디에닐, 시클로헵타디에닐, 시클로옥타트리에닐 등을 포함한다.

"알콕시"는 치환 또는 비치환 -O-알킬기이다. 알콕시기의 예시적인 예로 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, t-부톡시 등을 포함한다.

"아릴"은 임의의 일가 방향족 카르보시클릭 또는 헤테로방향족 기, 바람직하게 탄소원자수가 3 내지 10인 기이다. 아릴기는 모노시클릭(예를 들어 페닐(또는 Ph)) 또는 폴리시클릭(예를 들어 나프틸)일 수 있고, 치환 또는 비치환일 수 있다.바람직한 아릴기는 페닐, 나프틸, 푸릴, 티에닐, 피리딜, 인돌릴, 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐을 포함한다.

"아미노"는 치환 또는 비치환 -NRR'기이다. 아민은 치환기(R 또는 R')의 갯수에 따라 일차(-NH₂), 이차(-NHR), 또는 삼차(-NRR')일 수 있다. 치환된 아미노기의 예로 메틸아미노, 디메틸아미노, 에틸아미노, 디에틸아미노, 2-프로필아미노, 1-프로필아미노, 디(n-프로필) 아미노, 디(이소-프로필)아미노, 메틸-n-프로필아미노, t-부틸아미노, 아닐리노 등을 포함한다.

"헤테로시클릭 라디칼"은 안정한 포화, 부분적으로 포화 또는 방향족 고리, 바람직하게 원자 수 5 내지 10, 더 바람직하게는 5 또는 6의 고리를 지칭한다. 고리는 치환체로 한번 또는 여러번 (바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5번) 치환될 수 있다. 고리는 모노-, 바이- 또는 폴리시클릭일 수 있다. 헤테로시클릭기는 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로 원자로 이루어졌다. 헤테로원자는 보호 또는 비보호될 수 있다. 유용한 헤테로시클릭 기의 예로서 치환 또는 비치환, 보호 또는 비보호 아크리딘, 벤자티아졸린, 벤즈이미다졸, 벤조푸란, 벤조티오펜, 벤조티아졸, 벤조티오페닐, 카바졸, 시놀린, 푸란, 이미다졸, 1H-인다졸, 인돌, 이소인돌, 이소퀴놀린, 이소티아졸, 모르폴린, 옥사졸 (즉 1,2,3-옥사디아졸), 펜아진, 페노티아진, 페녹사진, 프탈아진, 피페라진, 프테리딘, 푸린, 피라진, 피라졸, 피리다진, 피리딘, 피리미딘,피롤, 퀴나졸린, 퀴놀린,퀴녹살린, 티아졸, 1,3,4-티아디아졸, 티오펜, 1,3,5-트리아진, 트리아졸(즉 1,2,3-트리아졸) 등을 포함한다.

"치환(된)"이라는 의미는 하나 이상, 바람직하게는 1-3 치환체를 함유하는 잔기(moiety)를 의미한다. 적합한 치환체로 수소(H) 및 히드록시(-OH), 아미노(-NH₂), 옥시(-O-), 카르보닐(-CO-), 티올, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 할로, 니트릴, 니트로, 아릴 및 헤테로시클릭 기를 포함한다. 이들 치환체는 1-3 치환기로 임의로 더 치환될 수 있다. 치환된 치환체의 예로 카르복스아미드, 알킬메캅토, 알킬술포닐, 알킬아미노, 디알킬아미노, 카르복실레이트, 알콕시카르보닐, 알킬아릴, 아르알킬, 알킬헤테로시클릭 등을 포함한다.

이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 제공된다. 당업자는 본 발명의 조성 및 방법의 중요하지 않은 변이를 쉽게 만들 수 있다. 본 실시예는 결코 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다.

실시예 1 지질 소포의 구성

소포를 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DOPC-e) 및 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트 (POPA) 지질로부터 구성하였다 (모두 아반티 폴라 리피드 (Avanti Polar Lipids); 알라바마주 알바스터로부터 구함). 지질을 추가의 정제 없이 사용하였다. 지질을 클로로포름 중에 용해시킨 후, 유리 시험 튜브에 놓고, 클로로포름을 질소 기체의 일정한 흐름 하에서 증발에 의하여 제거하고, 밤새 진공 펌프하였다. 건조된 지질 물질을 그것의 상 전이 온도 (25 ℃)보다 높은 온도에서 30 분동안 HBSS 실험 완충액 (시그마 (Sigma); 미조리주 세인트 루이스) 중에서 재수화하였다. 2 개의 유리 비드를 완충액/지질 혼합물에 첨가하고, 현탁액을 5 분 동안 볼텍스하여 멀티라멜라 소포를 만들었다. 그후 시험 튜브에 마이크로팁을 놓고, 유백색 용액을 마이크로팁 브랜손 소니파이어 450 (microtip Branson Sonifier 450)를 사용하여 초음파처리하였다. 그후 소포를 40 % 듀티 사이클 (duty cycle)에서 레벨 5로 5 분 동안 초음파처리하여 작은 유니라멜라 소포 (SUVs)를 만들었다.

실시예 2 ATP의 캡슐화

실시예 1의 소포로의 ATP의 혼입을 표시하기 위하여, 30 μCi의³H-ATP (아머샴 (Amersham); 일리노이주 아링톤 하이츠)를 멀티라멜라 소포를 만들기에 앞서 실험 완충액에 첨가하였다. 현탁액을 세파덱스 G-25 (Sephadex G-25) (시그마) 컬럼 (1 cm x 40 cm)에 통과시켜 비-캡슐화된 ATP를 제거하였다. 소포를 50 ml의 첫 방출물 중에 수집하였다. 캡슐화의 퍼센트는 액체 섬광 계수로 소포 내 및 상등액에 함유된 방사능을 측정하여 결정하였다. DOPC, DOPC:DOPC-e (1:1), DOPC:POPA (50:1) 및 DOPC:POPA (1:1)를 포함하는 소포 모두는 대략 동일한 ATP 캡슐화 퍼센트를 얻고, 용액 중의 원래의 ATP 양의 1 내지 2.5 % 사이로 변했다.

실시예 3 HUVEC으로의 소포의 융합 속도 및 캡슐화된 내용물의 세포질 내로의 방출

SUV의 용해성 속도를 결정하기 위하여, SUV에 형광 탐침을 로딩하고, 시험관내에서 세포로 표시하고, 세척하고, 그후 세포 형광을 분석하였다.

인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC)를 바이오화이테이커 (BioWhitaker) (메릴랜드주 워커스빌)에서 계대 1에서 구입하여, 계대 8까지 배양하였고, 그 이후에는 더이상 사용하지 않았다. HUVEC을 내피 세포 성장 배지 (EGM; 바이오화이테이커)에서 EGM 배지 중의 12-웰 배양 디쉬 상에서 콘플루언스까지 생장시켰다. 그후 HUVEC을 HBSS로 3 회 세척하였다. 지질 소포를 실시예 1에서와 같이 제조하였으나, 1 mM 카르복시플루오레세인을 소포 내로 로딩하였다. 그후 소포를 세포와 가습 CO₂인큐베이터에서 37 ℃에서 각 5, 10, 30, 45, 60, 90, 120 또는 240 분 동안 인큐베이션하고, 그후 소포를 세포로부터 세척하고, 세포를 트립신으로 부드럽게 처리하여 디쉬로부터 제거하였다. HUVEC 중의 카르복시플루오레세인의 형광을 495 nm의 여기 및 520 nm의 방출을 사용하여, 퍼킨-엘머 LS5OB 루미네센스 분광광도계 (Perkin-Elmer LS50B Luminescence Spectrophotometer (메사추세스주, 웰레슬리))를 사용하여 측정하였다. 일부 실험에서, 세포를 트립신 처리하지 않고, 융합 사건의 균일성을 나타내기 위하여 세포의 현미경 사진을 찍었다. 본 실험을 위한 형광 단위 (FUs)의 범위는 0 내지 450 단위였다. 융합 속도는 SUV의 지질 조성에 고도로 의존하였다. DOPC는 최초 30 분 동안 융합을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않았고, 그후 융합 속도가 로그형이 되고, 대략 350 FU에 도달하였다. 반대로, DOPC:DOPC-e (1:1)은 보다 빠른 초기 융합 속도 및 보다 느린 최종 융합 속도 (5 분에서 대략 35 FU; 120 분에서 대략 100 FU)를 얻었다. 가장 빠른 융합 속도는 DOPC:POPA (1:1)를 사용하여 발견하였고, 이는 5 분 내에 ATP의 현저한 전달을 나타내었다. 고안한 바와 같이, 3 종의 소포의 융합 속도는 빠름, 중간 및 느림으로 특징지을 수 있다.

해결된 한 문제점은 소포가 실제로 세포와 융합하였는지 또는 단순히 세포 표면에 응집하였는지 하는 것이다. 이를 조사하기 위하여, 지질 소포에 노출되고 배양 웰로부터 제거되지 않은 HUVEC을 형광 현미경 검사로 형광의 분포를 조사하였다. 모두 3 종의 조성물에 노출된 세포는 형광의 점 보다 5 분 후에 세포에 걸쳐서 분산된 형광을 나타내었고, 이는 리소좀이 소포를 격리하여, 카르복시플루오레세인으로 세포가 접근하는 것을 방지하는 것을 암시할 것이다. 다르게는, 소포가 세포 표면 상에 응집하고 있었다. 이러한 결과는 세포 표면 상에 응집되거나 리소좀에 의하여 격리되기보다 지질 소포가 세포에 융합되고 세포질 내의 캡슐화 내용물을 방출시킴을 나타낸다.

ATP가 카르복시플루오레세인과 같이 세포 내로 도입되었는지 여부를 결정하기 위하여, HUVEC으로의 소포 융합 및 ATP 방출을 실시예 2의³H-ATP-함유 소포를 사용하였다. 소포를 HUVEC과 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120 또는 240 분 동안 인큐베이션하였다. 도 1에서 나타난 결과는 1 시간 후에 세포 내부의 ATP의 분배 계수이다. DOPC/POPA가 이 기간에서 가장 큰 혼입 퍼센트를 얻었고, DOPC/DOPC-e가 뒤따르고, 그 다음은 소포가 없는³H-ATP 단독이었다. 세포를 반복하여 세척하였을 때, 세포의 방사능에 현저한 변화가 있었다. DOPC는 근소하지만 현저한 방사능 감소를 나타내었고; DOPC/DOPC-e는 반복 세척 후에 방사능에 감소를 나타내지 않았고, 자유³H-ATP는 방사능의 완전한 손실을 나타내었고, 이는 자유 ATP가 세포 막을 통과할 수 없다는 관찰을 확인시킨다. 융합 데이타와 함께, 이러한 데이타는 DOPC 소포가 내포되고, DOPC:DOPC-e 소포가 융합되고, 자유 ATP는 세포 내로 들어가지 않는다는 것을 나타낸다. DOPC:POPA 소포는 또한 세척 제거될 수 없고, 이는 그들이 세포와 융합하고 캡슐화된 내용물을 세포질로 전달하는 것을 나타낸다.

실시예 4 내피 고분자 투과성

분자를 직접 세포로 전달하는 것과 대조적으로 순환계를 통하여 생체 내에서 캡슐화된 분자를 전달하기 위한 본 발명의 소포의 임의의 사용은 소포 및(또는) 분자가 혈관 내피를 통과할 것을 요구한다. 혈관 내피는 배리어를 구성하지만, 세포-세포 배리어는 예를 들어, 백혈구가 순환계를 떠나서 간질 공간으로 들어올 때 연결될 수 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 내피 투과성에 대한 본 발명의 지질 소포의 영향을 측정하였다.

HUVEC을 EGM 중에서 미공성 필터 (0.8 ㎛) 상에 콘플루언스까지 생장시켰다. 세포를 내피 단일층을 가로지르는 단백질 유동을 측정하도록 하는 특수 챔버 내에 위치시켰다. 내피 투과성에 대한 지질 소포의 영향을 조사하는데 사용되는 추적자는 FITC-알부민 (1 mg/ml)이었다. FITC-알부민 및 지질 소포를 0 시간에서 내피 세포에 첨가하였다. 매 5 분 마다, 500 ㎕의 상등액 샘플을 수집하고, 그후 퍼킨-엘머 LS5OB 루미네센스 분광광도계를 사용하여 형광을 분석하였다. DOPC 소포는투과성에 영향이 없었고, 반면 DOPC/DOPC-e의 존재 시에 HUVEC 투과성이 증가하였고, 이는 이들 소포가 인접 내피 세포 사이에 작은 간극을 형성함을 나타낸다.

실시예 5 ATP를 위한 대사 요구

필요한 최적 속도를 측정하는 한 예로서, 래트 간 세포의 ATP의 대사 요구를 측정하였다. 전체 래트 간을 단리하고, 단리 완충액 (0.25 M 수크로스, 0.04 M 트리스, pH 7.2) 중에 놓고, 무균 가위로 잘게 자르고, 결합 조직편을 조심스럽게 다듬었다. 그후 간을 #60 스테인레스 스틸 와이어 메쉬 시브 (stainless steel wire mesh sieve)를 통과시키고, 세포 방출물을 얼음 상에서 수집하였다. 현탁액을 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛화하였다. 상등액을 폐기하고, 세포를 산소화 완충액 (200 mM 수크로스, 70 mM KCL, 5 mM 말레에이트 및 40 mM 트리스, pH 7.3)중에서 재현탁하였다. 5 ml의 산소화 완충액을 옐로우 스프링스 인스트루먼트 산소계 (Yellow Springs Instruments Oxygen Meter) (오하이오주 옐로우 스프링스)에 놓고, 37 ℃로 평형되도록 하였다. 50 ㎕의 세포 추출물을 챔버에 놓고, 2-3 mg/ml 최종 단백질 농도를 얻었다. 그후 기준 산소 소비를 1 분 동안 모니터링하였고, 그후 100 mM ADP를 세포에 첨가하고, 상태 2 호흡을 측정하였다. 다음으로, 5 mM 글루타메이트를 첨가하고, 상태 3 호흡을 측정하였다. ADP/O₂비를 소비된 산소량에 첨가된 ADP 량을 측정하여 결정하였다. 그러므로, 상태 3 호흡은 ATP가 세포/분/조직의 mg에 의하여 얼마나 소비되는지의 측정이다.

실시예 6 ATP-SUV는 상처 치유를 촉진한다

표재성 상처 (대략 80 mm²원)를 누드 마우스 상에 상부 두개 부위에 외피에 가하였다. 그후 ATP-SUV를 상처에 하루 2 회 적용하여 상처의 경계 세포에 ATP를 제공하였다. 수성 ATP-SUV가 상처와 직접 접촉 하도록 하는 특수 고안된 어플리케이터로 상처에 ATP-SUV를 직접 위치시켰다.

도 2에 나타난 바와 같이, 대조 물질로 치료된 상처와 비교하여 ATP-SUV로 치료된 상처가 보다 빠르게 치유하였다. 치유 시간에 대한 상처 면적을 플롯팅한, ATP-SUV-치료된 상처에 대한 곡선은 로그형 곡선을 나타내고, 반면 대조군은 보다 선형의 치유 속도를 나타내었다. 제4일에, ATP-SUV 치료(~30 mm²; 원래의 상처 면적의 절반 미만)과 대조군 치료 (~60 mm²) 사이에 대략 30 mm²의 차이가 관찰되었고; 제10일에, 상처 면적이 ATP-SUV로 치료된 상처에서는 사실상 사라졌으나, 대조군 치료된 상처에서는 그렇지 않았다 (~25 mm²). 정성적으로, 제4일의 바이탈솔 (VitalSol)로 치료된 상처가 대조군에서의 제10일의 상처와 유사하고, 제10일은 제17일의 대조군과 유사하였다. 상처는 ATP-SUV로 처리한 상처에서 제17일까지 치유되었고, 반면 같은 날의 대조군에서는 아직 완전히 치료되지 않았다.

실시예 7 사지 재부착

뒷다리를 래트로부터 절단하였고, 절단된 사지에 대한 주요 영양 동맥을 ATP-SUV의 주입을 위하여 삽관하고, 1 mM ATP 용액을 로딩하였다. 사지를 매 3 시간 마다 ATP-SUV 또는 대조 용액으로 (표 1 참조), 또는 조직 ATP 레벨 변화에 필요하다고 간주되는 바와 같이 관류하였다. 흐름-유도된 손상의 가능성을 감소시키기 위하여 주입 중에 사지의 동맥압을 모니터링하고, 절단된 사지의 전체적인 보존을 모니터링하였다 (보다 높은 관류압은 사지의 병적 상태를 나타낼 수 있다). 보존 기간 후에, 사지를 링거로 씻어서 미량의 ATP-SUV를 제거하였다. 그후 사지를 수술로 재부착하고, 문합술 이후의 사지 기능의 외부 지표를 평가하였다 (사지 색상, 미소혈전, 응고, 사지 온도의 증거). 이식 전 및 후에 동물은 지혈을 방지하기 위하여 헤파린을 받았다. 또한, 동물은 감염을 감소시키기 위하여 항생제 치료를 받았다. 대조군 사지는 비히클 단독으로, 비히클 및 ATP 단독, 또는 비히클 및 SUV 단독으로 관류하였다.

재접합 21 시간 후에, ATP-SUV-치료된 사지는 건강한 분홍색을 나타내었고, 생리적 온도를 회복하였다. 150 일이 지난 후에, ATP-SUV로 치료된 사지를 받은 동물은 사지가 절단된 적이 없었던 것처럼 이들 사지를 사용하였다. 유일한 정성적 부작용은 발가락의 컬링 (curling)이고, 분명 이 작은 결함을 가장 잘 교정할 물리 치료가 없었기 때문일 것이다. 그러나, 대조군에서는 사지가 검은 색이고, 촉감이 차갑고, 괴사의 징후를 나타냈다. 이들 결과의 요약을 표 1에 나타내었다. 정성적인 결과는 도 3에 나타내었다.

사지 재접합 연구로부터의 결과의 요약

그룹	사지 결과	n
비히클 단독	괴사	2
비히클 및 1 mM ATP 단독	괴사	2
비히클 및 SUV 단독	괴사	2
비히클 및 ATP-SUV	생존	5

실시예 8 ATP-SUV는 단리된 심장을 저산소증으로부터 보호한다

래트로부터 제거한 심장을 라겐도르프 (Lagendorff) 심장 관류 장치를 사용하여 모니터링하였다. 심장을 삽관하고, 심장을 관류하는 특수 고안된 챔버 내에 두고, ATP-SUV를 주사하도록 하였다. 심장을 순환하는 산소화된 관류액을 중단하고, ATP-SUV를 심장으로 주사하였다. 그후 심장을 고칼륨 용액을 주사하여 정지시켰다. ATP-SUV를 심장 중에 120 분 동안 37 ℃에서 흐르지 않는 상태에서 유지하였다. 그후 심장을 산소화된 관류액 용액으로 씻고, 심장의 성능을 모니터링하였다. ATP-SUV 치료된 심장은 대조군과 비교하여 심장 기능을 회복하였다.

실시예 9 혈액 저장의 개선 (예언적 실시예)

ATP-함유 소포가 혈액을 보존하는지 및 해당 중간체 포스포엔올피루베이트 (PEP) 및 프룩토스-1,6-디포스페이트 (FDP)의 첨가가 생육성을 더욱 개선시키는지 확인하기 위하여, 이하의 실험을 수행하였다. 실시예 2의 방법에 따라서, DOPC 만을 사용하여 소포를 구성하였다. 혈액은 기준 덱스트로스-시트레이트-아데닌-포스페이트 혼합물 (박스터 (Baxter); 일리노이주 디어필드)을 함유하는 백 안으로 기준 과정에 따라서 수집될 것이다. 각 세트의 실험을 위하여, 한 단위의 혈액을 동일한 분취량으로 분리하고, 추가의 첨가제를 함유하지 않는 폴리에틸렌 백 (대조군)으로 무균적으로 전달하였다. 시험 물질은 이하와 같이 다른 분취량에 첨가될 것이다:

ㆍ대조군, 첨가제 없음

ㆍ대조군, PEP, FDP 및 리보스를 함유하는 비히클

ㆍATP-SUV

30, 45, 60 및 90 일에서, 분취량을 회수하고, 적혈구의 상태를 이하의 파라미터에 따라서 평가하였다: ATP 함량, 적혈구용적, 헤모글로빈, 및 트리판 블루 (Trypan blue) (시그마) 제외 또는 라이브/데드 키트 (LIVE/DEAD kit) (몰레큘라 프로덕츠 (Molecular Products); 오레곤 유겐)를 사용한 세포 생존력. 예상 결과: ATP 함유 소포의 존재 하에 저장된 세포는 대조군 보다 우수한 상태일 것이다; 즉, ATP 함량은 보다 높을 것이고, pH는 덜 감소할 것이고 (보다 적은 해당을 나타낸다), 적혈구는 양면 오목한 형태의 전형적인 기능적인 적혈구를 유지할 것이다.

< 참고 문헌 >

Claims

ATP, 및 안정 소포 형성제인 인지질을 포함하는 소포로서,

20 소포 융합/초 이상의 융합 속도를 갖는 것인 소포.
제1항에 있어서, 다른 극성 지질을 추가로 포함하는 것인 소포.
제1항에 있어서, PEG, 래프트 형성제 및 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구성원을 추가로 포함하는 것인 소포.
제2항에 있어서, 인지질 또는 다른 극성 지질이 하기 화학식(I)의 구조를 갖는 것인 소포.

<화학식 (I)>

여기서,

X는 H이거나, 화학식 (II)의 구조를 가지며,

<화학식 (II)>

B는 양이온 또는 알킬기이고,

A는 H 또는 알킬기이고,

L은 2개의 수소원자를 추가 이탈시킨 알킬이고,

각 Z는 독립적으로 H, E 또는 화학식 (XI)의 구조이고,

<화학식 (XI)>

여기서, E는 알킬 또는 알케닐이고, Z 중의 하나가 H인 경우에는, 다른 Z는 H가 아니다.
제1항에 있어서, 융합 속도가 10³소포 융합/초 이상인 것인 소포.
제4항에 있어서,

A는 H이거나, 하기 화학식 (III), (IV), (V), (VI) 및 (VII)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 가지고,

L은 하기 화학식 (VIII), (IX) 또는 (X)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 가지고,

E는 하기 화학식 (XII), (XIII), (XIV), (XV) 또는 (XVI)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 소포.

<화학식 (III)>

<화학식 (IV)>

<화학식 (V)>

<화학식 (VI)>

<화학식 (VII)>

<화학식 (VIII)>

<화학식 (IX)>

<화학식 (X)>

<화학식 (XI)>

<화학식 (XII)>

<화학식 (XIII)>

<화학식 (XIV)>

<화학식 (XV)>

<화학식 (XVI)>
제6항에 있어서, 상기 인지질이 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1-팔미토일-2-도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 또는 그의 혼합물인 것인 소포.
안정 소포 형성제인 인지질, 및

다른 극성 지질, PEG, 래프트 형성제 및 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구성원

을 포함하는 소포로서,

20 소포 융합/초 이상의 융합 속도를 갖는 것인 소포.
제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 구성원이 다른 극성 지질이고, 소포가 PEG, 래프트 형성제 및 융합 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구성원을 추가로 포함하는 것인 소포.
제8항에 있어서, 상기 인지질 또는 다른 극성 지질이 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 것인 소포.

<화학식 (I)>

여기서,

X는 H이거나, 하기 화학식 (II)의 구조를 가지고,

<화학식 (II)>

B는 양이온 또는 알킬기이고,

A는 H 또는 알킬기이고,

L은 2개의 수소 원자를 추가 이탈시킨 알킬이고,

각 Z는 독립적으로 H, E 또는 하기 화학식 (XI)의 구조이고,

<화학식 (XI)>

여기서, E는 알킬 또는 알케닐이고, Z 중의 하나가 H인 경우에는, 다른 Z는 H가 아니다.
제8항에 있어서, 융합 속도가 10³소포 융합/초 이상인 것인 소포.
제10항에 있어서,

A는 H이거나, 하기 화학식 (III), (IV), (V), (VI) 및 (VII)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 가지고,

L은 하기 화학식 (VIII), (IX) 또는 (X)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 가지고,

E는 하기 화학식 (XII), (XIII), (XIV), (XV) 또는 (XVI)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 소포.

<화학식 (III)>

<화학식 (IV)>

<화학식 (V)>

<화학식 (VI)>

<화학식 (VII)>

<화학식 (VIII)>

<화학식 (IX)>

<화학식 (X)>

<화학식 (XI)>

<화학식 (XII)>

<화학식 (XIII)>

<화학식 (XIV)>

<화학식 (XV)>

<화학식 (XVI)>
제12항에 있어서, 상기 인지질이 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1-팔미토일-2-도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 또는 그의 혼합물인 것인 소포.
ATP, 및 안정 소포 형성제인 인지질을 포함하는 소포로서,

상기 인지질이 하기 화학식 (I')의 구조를 갖는 것인 소포.

<화학식 (I')>

여기서,

X'는 하기 화학식 (II')의 구조를 가지며,

<화학식 (II')>

B'는 양이온 또는 알킬기이고,

A'는 알킬기이고,

L'은 2개의 수소원자를 추가 이탈시킨 알킬이고,

Z' 중의 하나는 E" 또는 하기 화학식 (XI")의 구조이고,

<화학식 (XI")>

여기서, E"는 알킬 또는 알케닐이고,

다른 Z는 E' 또는 하기 화학식 (XI')의 구조이고,

<화학식 (XI')>

여기서, E'는 알케닐이다.
제14항에 있어서, 다른 극성 지질을 추가로 포함하는 것인 소포.
제14항에 있어서, PEG, 래프트 형성제 및 융합 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구성원을 추가로 포함하는 것인 소포.
제15항에 있어서,

다른 극성 지질이 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 것인 소포.

<화학식 (I)>

여기서,

X는 H이거나, 하기 화학식 (II)의 구조를 가지고,

<화학식 (II)>

B는 양이온 또는 알킬기이고,

A는 H 또는 알킬기이고,

L은 2개의 수소 원자를 추가 이탈시킨 알킬이고,

각 Z는 독립적으로 H, E 또는 하기 화학식 (XI)의 구조이고,

<화학식 (XI)>

여기서, E는 알킬 또는 알케닐이고, Z 중 하나가 H인 경우에는, 다른 Z는 H가 아니다.
제17항에 있어서,

A는 H이거나, 하기 화학식 (III), (IV), (V), (VI) 및 (VII)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 가지고,

L은 하기 화학식 (VIII), (IX) 또는 (X)으로 이루어진 군으로 선택되는 구조를 가지고,

E는 하기 화학식 (XII), (XIII), (XIV), (XV) 또는 (XVI)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 소포.

<화학식 (III)>

<화학식 (IV)>

<화학식 (V)>

<화학식 (VI)>

<화학식 (VII)>

<화학식 (VIII)>

<화학식 (IX)>

<화학식 (X)>

<화학식 (XI)>

<화학식 (XII)>

<화학식 (XIII)>

<화학식 (XIV)>

<화학식 (XV)>

<화학식 (XVI)>
제18항에 있어서, 상기 인지질이 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1-팔미토일-2-도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 또는 그의 혼합물인 것인 소포.
안정 소포 형성제인 인지질 및

안정 소포 형성제가 아닌 극성 지질 및 PEG로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구성원을 포함하는 소포로서,

상기 안정 소포 형성제인 인지질이 화학식 (I)의 구조를 갖는 것인 소포.

<화학식 (I)>

여기서,

X는 H이거나, 하기 화학식 (II)의 구조를 가지고,

<화학식 (II)>

B는 양이온 또는 알킬기이고,

A는 H 또는 알킬기이고,

L은 2개의 수소 원자를 추가 이탈시킨 알킬이고,

각 Z는 독립적으로 H, E 또는 하기 화학식 (XI)의 구조이고,

<화학식 (XI)>

여기서, E는 알킬 또는 알케닐이고, Z 중 하나가 H인 경우에는, 다른 Z는 H가 아니다.
제20항에 있어서,

A는 H이거나, 하기 화학식 (III), (IV), (V), (VI) 및 (VII)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 가지고,

L은 하기 화학식 (VIII), (IX) 또는 (X)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 가지고,

E는 하기 화학식 (XII), (XIII), (XIV), (XV) 또는 (XVI)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 소포.

<화학식 (III)>

<화학식 (IV)>

<화학식 (V)>

<화학식 (VI)>

<화학식 (VII)>

<화학식 (VIII)>

<화학식 (IX)>

<화학식 (X)>

<화학식 (XI)>

<화학식 (XII)>

<화학식 (XIII)>

<화학식 (XIV)>

<화학식 (XV)>

<화학식 (XVI)>
제20항에 있어서, 상기 인지질이 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1-팔미토일-2-도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 또는 그의 혼합물인 것인 소포.
제20항에 있어서, 래프트 형성제 및 융합 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구성원을 추가로 포함하는 것인 소포.
제19항에 있어서, 소포는 안정 소포 형성제가 아닌 극성 지질을 포함하고, 안정 소포 형성제가 아닌 극성 지질은 하기 화학식 (XVII), (XVIII), (XIX), (XX), (XXI), (XXII), (XXIII), (XXV) 및 (XXVI)로 구성되는 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 소포.

<화학식 (XVII)>

<화학식 (XVIII)>

<화학식 (XIX)>

<화학식 (XX)>

<화학식 (XXI)>

<화학식 (XXII)>

<화학식 (XXIII)>

<화학식 (XXV)>

<화학식 (XXVI)>
제1항의 소포를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에 ATP를 전달하는 방법.
제8항의 소포를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에 ATP를 전달하는 방법.
제14항의 소포를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에 ATP를 전달하는 방법.
제20항의 소포를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에 ATP를 전달하는 방법.
안정 소포 형성제인 인지질, 및 ATP를 포함하는 소포와 조직(tissue)을 접촉시키는 것을 포함하는, 조직을 보존하는 방법.
제29항에 있어서, 소포가 안정 소포 형성제가 아닌 극성 지질 및 PEG로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구성원을 추가로 포함하는 것인 방법.
제29항에 있어서, 상기 인지질이 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1-팔미토일-2-도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 또는 그의 혼합물인 것인 소포.
제29항에 있어서, 래프트 형성제 및 융합 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구성원을 추가로 포함하는 것인 소포.
제30항에 있어서, 소포는 안정 소포 형성제가 아닌 극성 지질을 포함하고, 안정 소포 형성제가 아닌 극성 지질은 하기 화학식 (XVII), (XVIII), (XIX), (XX), (XXI), (XXII), (XXIII), (XXV) 및 (XXVI)로 구성되는 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 소포.

<화학식 (XVII)>

<화학식 (XVIII)>

<화학식 (XIX)>

<화학식 (XX)>

<화학식 (XXI)>

<화학식 (XXII)>

<화학식 (XXIII)>

<화학식 (XXV)>

<화학식 (XXVI)>
소포를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에 ATP를 전달하는 방법으로서,

상기 소포는 안정 소포 형성제인 인지질 및 ATP를 포함하고,

세포로 전달되는 ATP의 양은 세포의 대사 요구량을 만족시키기에 충분한 것인 방법.
제1항의 소포를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에 ATP를 전달하는 방법.
제8항의 소포를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에 ATP를 전달하는 방법.
제14항의 소포를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에 ATP를 전달하는 방법.
제20항의 소포를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에 ATP를 전달하는 방법.
소포를 포함하는 조성물과 상처를 접촉시키는 것을 포함하는 상처 치료 방법으로서,

상기 소포는 안정 소포 형성제인 인지질 및 ATP를 포함하는 것인 방법.
제1항의 소포를 포함하는 조성물과 상처를 접촉시키는 것을 포함하는, 상처 치료 방법.
제8항의 소포를 포함하는 조성물과 상처를 접촉시키는 것을 포함하는, 상처 치료 방법.
제14항의 소포를 포함하는 조성물과 상처를 접촉시키는 것을 포함하는, 상처치료 방법.
제20항의 소포를 포함하는 조성물과 상처를 접촉시키는 것을 포함하는, 상처 치료 방법.
제39항에 있어서, 조성물이 베카플러민을 추가로 포함하는 것인 방법.
소포 및 베카플러민을 포함하는 조성물로서,

상기 소포는 안정 소포 형성제인 인지질 및 ATP를 포함하는 것인 조성물.
소포와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 하나 이상의 세포를 갖는 생체 반응기의 생산성을 개선하는 방법으로서,

상기 소포가 안정 소포 형성제인 인지질 및 ATP를 포함하는 것인 방법.