BRPI0617318A2

BRPI0617318A2 - método de preparar produto alimentìcio ou formulação farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0617318A2
Application number: BRPI0617318-7A
Authority: BR
Inventors: Giovanni Mogna; Gian Paolo Strozzi
Original assignee: Anidral Srl
Priority date: 2005-10-11
Filing date: 2006-07-26
Publication date: 2011-07-19
Also published as: ES2463724T3; US10428395B2; EP1869161B1; US11130938B2; ATE454443T1; CA2624580C; JP5853000B2; EP2169050A1; RU2008110695A; EP2169050B1; DE602006011590D1; EP1869161A1; KR20130118999A; PL1869161T3; PL2169050T3; US20090087418A1; DK1869161T3; WO2007054989A1; SI1869161T1; RU2410423C2

Abstract

MéTODO DE PREPARAR PRODUTO ALIMENTìCIO OU FORMULAçãO FARMACêUTICA. A presente invenção refere-se a um método para a preparação de culturas bacterianas probiáticas analérgicas.

Description

MÉTODO DE PREPARAR PRODUTO ALIMENTÍCIO OU FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a um método para apreparação de culturas bacterianas probióticas analérgicas.

É sabido que o trato gastrointestinal (GI) humano contémuma comunidade microbial complexa denominada microbiota,consistindo principalmente em bactérias estritamenteanaeróbicas capazes de desempenhar ações diferentes comefeitos que afetam o nivel gastrointestinal local eindiretamente o nivel sistêmico geral, envolvendo quase todosos órgãos e as funções hospedeiras.

A microflora intestinal, consistindo em uma grandevariedade de espécies diferentes (400-500) capazes decolonizar tanto a mucosa intestinal como as partículas dealimento ingerido, é então capaz de condicionar fortemente asaúde do indivíduo.

A composição da microflora intestinal pode ser alteradapor vários fatores, como a idade, a condição fisiológica doindivíduo, a presença de patologias diferentes, a tensão eacima de tudo a dieta.

Como conseqüência de fatores negativos endógenos eexógenos, há uma diminuição das bactérias úteis (tipicamentebactérias que pertencem ao grupo de ácido láctico nointestino delgado e bifidobactérias no intestino grosso) e umaumento de enterobactérias patogênicas, estreptococcos eclostrídia.

A administração de probiótica específica através deespecialidades medicinais, dietética, integradores e acima detudo alimentos (denominados alimentos "funcionais" ou"nutracêüticos") permite reequilibrar a microflora dohospedeiro, por recuperar funcionalidade intestinal ótima.

O termo "probiótico" se refere comumente amicroorganismos vivos, selecionados da microflora intestinalde indivíduos saudáveis, que após administração emquantidades oportunas e por um tempo adequado, são capazes decolonizar, também se somente temporariamente, os diferentestratos do intestino e transmitir efeitos benéficos para asaúde do organismo hospedeiro.

Pertencem à probiótica principalmente algumas espéciesdos gêneros Lactobacillus, Bifidobaeterium, Streptococcus,Pedioeoecus, Lactoeoceus, Propionibaeterium, Leuconostoc e,em um grau menor, Saccharomyees, Baeillus e Enterocoeeus.

Entre os efeitos saudáveis e benéficos, mostrados portestes clínicos rigorosos realizados em todo mundo einduzidos no consumidor pela ingestão de probióticos podemser mencionados:

1. estimulação do sistema imune;

2. indução de efeitos antimutagênicos eantigenotóxicos;

3. ação antitumoral e antimetastática se referindo,por exemplo a:

- carcinoma de intestino grande

- carcinoma de mama

- câncer de bexiga

4. aperfeiçoamento na absorção de nutrientes;

5. diminuição dos sintomas de intolerância àlactose;

6. melhora da motilidade intestinal devido àredução do pH e diminuição da constipação;

7. diminuição da absorção de colesterol e gorduras;

8. atividades antidiarréica, anti-hipertensão,antidiabética inibindo infecções do sistema urogenitalfeminino;

9. atividade de prevenção de patologiasgeriátricas.

A probiótica para uso oral deve ser caracterizada pelasseguintes exigências gerais e funcionais:

i) origem intestinal humana; a partir de indivíduos emboas condições de saúde;

ii) biossegurança; não devem causar efeitos colateraisespecialmente em pessoas com depressão imune ouenfraquecidas;

iii) resistência e viabilidade: devem ter taiscaracterísticas de resistência para serem capazes desobreviver ao suco gástrico, as secreções pancreática e debile de modo a alcançar o ileo e o cólon em um modo nãodanificado e ainda perfeitamente viáveis.

A competição que se inicia entre microorganismosprobióticos e microflora patogênica pode ocorrer somente se,após ingestão, os microorganismos probióticos forem capazesde atingir o trato intestinal e portanto sobreviver a acidezgástrica e a alta concentração dos sais de bile.Genericamente, após terem atingido o trato intestinal, diz-seque iniciam através de mecanismos de aderência que envolvemproteínas e/ou carboidratos com funcionalidades específicasde adesão ao vilo intestinal.

Em nível industrial, os probióticos são produzidos emforma de cultura bacteriana liofilizada, a saber ocrescimento das células em um meio adequado é determinado(fermentação) e a seguir, após a concentração e purificaçãoda biomassa, a desidratação da mesma é executada porliofilização. Tal processo é necessário para permitir que asbactérias se reproduzam em um número adequado (etapa defermentação) e se conservem por um longo período de tempo(etapa de liofilização).

Para que o processo de fermentação seja realizado comsucesso e com rendimentos adequados, é necessário dotar ascélulas de fontes de nitrogênio e carbono, oligo-elementos ebioativadores em quantidades oportunas.

Tradicionalmente, lidar com bactérias "lácticas"comumente, os substratos selecionados utilizados como fontenitrogenosa são soro, proteínas de soro de leite,hidrolisados e peptonas de caseína, caseinatos, etc.,enquanto como fonte de carbono, lactose e glicose sãonormalmente empregadas, visto que podem ser facilmentemetabolizados a partir de quase todos os organismos vivos.

Nos últimos anos, provavelmente também devido a umadieta pouco variada e demasiadamente rica em proteínas elipídeos, nos países da Europa e Ocidentais um aumentosensível do número de pessoas que sofrem de patologias dotipo alérgico foi registrado.

As reações imunes do tipo IV ou mediadas por IgE sãodenominadas "alérgicas", durante o qual, após um primeirocontato de sensibilização (que pode ocorrer a qualquermomento da vida, também na intra-uterina) IgEs específicossão produzidos com um mecanismo mediado por histamina.

Tais reações podem ser causadas também por dosesextremamente reduzidas de moléculas denominadas "alérgenos",com conseqüências clínicas, que podem mudar de reações napele leves e simples até choque anafilático e morte.

Devido ao perigo dessas substâncias para algumaspessoas, a Comunidade européia adotou uma regra de tal modoque no rótulo "o uso na produção e a presença no alimento" dealimentos que pertencem às seguintes classes (Anexo III bisda instrução acima) deve ser mostrado claramente (art. 6 sub.10, instrução 2000/13/EC desse modo modificado pela instrução2003/89/EC):

Cereais contendo glúten (isto é, trigo, cevada, centeio,aveia, espelta, kamut ou suas cepas hibridizadas) e produtosderivados; crustáceos e produtos à base de crustáceo; ovos eprodutos à base de ovos; peixe e produtos à base de peixe;amendoins e produtos à base de amendoins; soja e produtos àbase de soja; leite e produtos à base de leite (incluindolactose); frutas com casca, isto é amêndoas (Amigdaluscommunis L.), avelãs (Corylus avellana), nozes comuns(Juglans regia), nozes acagiu {Western Anacardium), nozespecan [Carya illinoiesis (Wangenh) K. Koch], nozes do Brasil(Bertholletia excelsa), pistachio nuts (Pistacia vera), nozesde Queensland (Macadami ternifolia) e produtos derivados;aipo e produtos à base de aipo; mostrada e produtos à base demostarda; sementes de gergelim e produtos à base de sementesde gergelim; dióxido de enxofre e sulfitos em concentraçõesmais elevadas do que 10 mg/kg ou 10 mg/l expresso como SO2.Como, tipicamente para a produção de probióticos,substratos baseados em leite (como uma fonte nitrogenosa) eglicose (como uma fonte de carbono), que é normalmenteoriginada a partir de amido (também amido de trigo),derivados são utilizados, os probióticos podem serconsiderados perigosos se administrados a sujeitosparticularmente sensíveis, mesmo se, no máximo, efetivamentepuderem conter somente resíduos pequenos de alérgenos(portanto derivados de leite e/ou glúten).

No caso de leite, pode haver duas causasindividualizadas de reação adversa a esse alimento; a alergiaa proteínas de leite da vaca (APLV) e a intolerância alactose.

0 leite, juntamente com o ovo, é o alimento maisalergizantes; essa característica do mesmo é determinadapelas substâncias proteínicas contidas pelo mesmo, isto éprincipalmente alfa-lactoalbumina, beta-lactoglobulina ecaseínas.

A alergia às proteínas do leite de vaca é uma patologiarelativamente freqüente no primeiro ano de vida. Asintomatologia é, em 50-70% dos casos, de um tipogastroentérico, ainda assim em 50-70% dos casos há distúrbiosde pele, nos distúrbios respiratórios de 20-30% e nosdistúrbios sistêmicos de 5-9% (anafilaxia).

0 APLV tende a desvanecer após o primeiro ano de vida edesaparecer em 10 anos e é incomum nos adultos.

Um curso oposto tem a intolerância à lactose, que émuito incomum no primeiro ano de vida e muito freqüente noadulto, em particular em algumas populações (africana,asiática, índio americano).

O leite é um alimento fundamental desde o nascimento e orecém-nascido já produz a enzima necessária para a fissão doaçúcar do leite, lactose, em seus componentes simples glicosee galactose. Após o primeiro ano de vida, o leite se torna umalimento menos importante e a lactase é espontaneamentereduzida, de tal modo que muitos adultos se tornamintolerantes (não alérgicos) ao leite.

A doença celiaca é uma doença inflamatória imunomediada,crônica, enteropática, que se origina da ingestão de glúten,uma proteína de "armazenagem" contida naturalmente em algunscereais.

Essa intolerância de alimento afeta pessoasgenericamente predispostas, tendo um sistema imune queresponde em um modo anormal à ingestão de frações proteínicastípicas do glúten de trigo, espelta (um tipo de trigo), kamute spella (um tipo de trigo), cevada, centeio, triticale (umcruzamento entre trigo e centeio) e seus derivados. Algunsindivíduos também apresentam intolerância às proteínas deaveia.

Tecnicamente, o termo "glúten" se aplica à combinação daprolamínica simples (rica em prolina), denominada"gliadinas", e glutelínica (rica em glutamina), denominada"gluteninas", proteínas dos cereais acima mencionados.

No contexto da doença celiaca, o termo "glúten" éfreqüentemente utilizado com referência a todos os tipos de proteínas contidas nos cereais, mesmo se entre as diferentesfrações proteínicas que formam o glúten, a gliadina pareceser a mais prejudicial.

Nas pessoas afetadas pela doença celiaca, a assunção deglúten, também em pequenas quantidades, é capaz de causar aresposta anormal do sistema imune: a transglutaminase, umaenzima que existe no tecido de mucosa intestinal, se liga àgliadina e através de desamidação transforma a mesma em umamolécula capaz de ativar as células T (células do sistemaimune capaz de mediar todas as respostas imunes em direçãoaos antígenos proteínicos), com uma produção conseqüente deantitransglutaminase IgG e IgA e imunoglobulinas IgAantiendomise.

Em um primeiro estágio, um aumento das células Tativadas intestinais intra-epiteliais ocorre, enquanto com oavanço da doença o aumento se refere tanto aos linfócitoscomo as células de plasma infiltradas da própria lâmina, comuma produção de metaloproteinases responsáveis peloencurtamento do vilo e, portanto o dano à mucosa intestinal.

A possibilidade de evitar o desenvolvimento outratamento da doença celiaca não existe até o presente,portanto uma dieta isenta de glúten, estritamente realizadapor toda vida é a única terapia capaz de assegurar às pessoasafetadas pela doença celiaca uma saúde perfeita.

As pessoas celiacas devem eliminar também os menoresresíduos de farinha dos cereais perigosos, porque a ingestãode glúten, também em quantidades mínimas, pode descontrolar aresposta auto-imune.

Como a razão da quantidade de glúten ingerido para oefeito tóxico induzido no nível intestinal não foi aindadefinido, o termo "resíduos" tem uma importância práticafundamental no tratamento da doença celiaca e implicações noplano de legislação sobre alimentos, porque é relacionado nolimite máximo de glúten "aceitável" (limite) nos produtosapropriados para a dieta da pessoa celiaca. Todas as pessoasversadas acordam que uma dose de 100 mg por dia de gliadina,igual a 200 mg de glúten, isto é aproximadamente 3 g de pão,é suficiente para causar, na maioria das pessoas celiacas, oaumento dos linfócitos intra-epiteliais intestinais, um sinalprematuro de inflamação intestinal persistente.

Com referência ao limite mínimo, alguns trabalhoscientíficos realizados até o presente pareceriam mostrar quea ingestão até 10 miligramas por dia de gliadina (igual a 20partes por milhão de glúten) não é capaz de danificar deforma sensível à mucosa intestinal, porém pode determinar, emuma minoria dos casos, a ocorrência de sintomas gastroentéricos.

No nível legislativo internacional, o antigo padrão"Codex Standard for gluten-free foods", ainda em vigor,mostra, como o teor máximo de glúten nos produtosterapêuticos de dieta, 0,05 de nitrogênio por 100 g deproduto seco (com referência a amido de trigo) , quecorresponde a uma fração de glúten igual a aproximadamente500 ppm.

Entretanto, uma revisão correta e adequada da diretrizacima mencionada está ocorrendo, que parece prever que osalimentos isentos de glúten resultando de ingredientesnaturalmente isentos de glúten não contêm mais de 20 ppm deglúten, enquanto os alimentos isentos de glúten, que derivamde cereais com glúten, podem ter um limite máximo de 200 ppmde glúten.

Na França, Grã-Bretanha e Holanda, esperando pelarevisão da diretriz acima mencionada, eles considerem, como olimite máximo para os produtos isentos de glúten, 200 ppm.

No âmbito nacional, a regra atual parece ser maisprecaução do que a da comunidade e a internacional, narealidade um limite de "partes por milhão", tanto para osalimentos fabricados com matérias-primas naturalmente isentasde glúten como alimentos purificados a partir dessasubstância, é estabelecido.

A regra prevê que "se, na composição do produtoalimentício ou naquela de um ou mais ingredientes(aromatizantes, aditivos ou coadjuvantes) que formam o mesmo,estiverem presentes cereais contendo glúten ou substânciasque derivam a partir daí e/ou se a partir do processoprodutivo uma quantidade de glúten pode derivar no produtofinal, analiticamente determinado como mais elevado do que 20partes por milhão, tal produto terá de mostrar no rótulo, aopé da lista de ingredientes e em um modo bem visível, aspalavras "produto contendo glúten".

A exclusão completa de glúten a partir da dieta não é,entretanto, fácil de realizar, considerando que fenômenos decontaminação cruzada de cereais e derivados (amidos,farinhas, farinha de amido, etc.) naturalmente isentos deglúten, já no nível de indústria de moagem, podem ocorrer.

Tais produtos são então utilizados pela indústriaalimentícia na preparação de alimentos complexos com base em múltiplos ingredientes tecnológicos, aditivos e coadjuvantesde diferente origem e natureza.Uma pesquisa recente mostrou que até 6% dos produtos"teoricamente" isentos de glúten, com base nos ingredientesreportados, na realidade contêm mais de 30 mg de gliadina por100 g de produto final, igual a 600 ppm de glúten.

Para fins de excluir uma possível contaminação deglúten, é portanto necessário considerar, para cada produtoalimentício comercializado, não somente todos os ingredientesutilizados e o processamento, porém também toda a cadeiaprodutiva de cada ingrediente único.

Portanto, permanece a necessidade de ser capaz deproduzir culturas bacterianas probióticas isentas desubstâncias alergizantes devido ao uso de substratos defermentação com base em leite ou cereais ou,alternativamente, devido a contaminações cruzadas ou nãointencionais. Na realidade, não obstante é possível que,devido a contaminações cruzadas, não intencionais eacidentais, alguns componentes utilizados no processoprodutivo contenham resíduos alérgenos.

Portanto, permanece a necessidade de ser capaz defornecer um método para a preparação de culturas bacterianasprobióticas que prevê, em cada etapa do processo produtivo,incluindo a fermentação, o uso de substâncias analérgicas. Emparticular, é desejável localizar e selecionar substratos defermentação, diferentes de leite e seus derivados e oscereais contendo glúten, que representam uma boa fonte decarbono e nitrogênio.

Portanto, todos os operadores de setor concordam que,até o presente, permanece uma necessidade muito forte defornecer um método para a preparação de culturas bacterianasprobióticas capazes de utilizar substratos alternativosàqueles utilizados até hoje e, simultaneamente, capazes dereduzir as contaminações cruzadas, não intencionais eacidentais, caso ocorram.

Em particular, permanece a necessidade de fornecer ummétodo para a preparação de culturas bacterianas probióticasque prevê um nível duplo de segurança em relação à ausênciade substâncias alergizantes.

Um objetivo da presente invenção é fornecer um métodopara a preparação de meios de cultura capazes de superar oslimites da técnica conhecida.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer umametodologia para a produção de culturas bacterianasprobióticas seguras para administrar a toda a população,também às pessoas afetadas por alergias.

Esses e outros objetivos, que se tornarão evidentes apartir da seguinte descrição detalhada, foram obtidos pelorequerente, que aperfeiçoou uma metodologia que inclui umnivel de segurança duplo referente à ausência de alérgenosnos processos de produção de culturas bacterianasprobióticas.

Em particular, o requerente estabeleceu uma metodologiade produção na qual substratos de fermentação analérgicosselecionados (matérias-primas analérgicas) são utilizados,capazes de assegurar uma fonte adequada de nitrogênio ecarbono às culturas probióticas.

Um método para a preparação de culturas bacterianasprobióticas analérgicas, uma composição incluindo a cultura eo uso da cultura para a preparação dos alimentos denominados"funcionais" ou "nutracêuticos" formam o tema da presenteinvenção, tendo as características como definido nasreivindicações apensas.

Em uma modalidade da invenção, as cepas da culturabacteriana pertencem aos gêneros: Lactobacillus,Bifidobacterium, Streptococcus, Pediococcus, Laetococeus,Propionibaeterium, Bacillus, Saccharomyees, Eriterococcus,Leueonostoe.

Preferivelmente, do gênero Lactobacillus, as seguintesespécies foram utilizadas: L. pentosus, L. plantarum, L.casei, L. casei ssp. Paracasei, L. casei ssp. Rhamnosus, L.acidophilus, L. Delbrueckii ssp. Bulgaricus, L. Fermentu, L.Gasseri.

Os exemplos de cepas utilizadas das espécies sãoreportados a seguir. Preferivelmente, do gêneroBifidobacterium, as seguintes espécies foram utilizadas: B.longum. B. breve, B. lactis, B. Aadolescentis e B.Pseudocatenulatum.

Os exemplos de cepas utilizadas das espécies sãoreportados a seguir. Preferivelmente, do gênero Lactococcusas seguintes espécies foram utilizadas: L. lactis e L. lactisssp. Lactis.

Os exemplos de cepas utilizadas das espécies sãoreportados a seguir. Preferivelmente, do gênero Streptococcusas seguintes espécies foram utilizadas: S. thermophilus.

Os exemplos de cepas utilizadas das espécies sãoreportados a seguir.

Em uma modalidade particularmente preferida da invenção,as bactérias da cultura bacteriana são selecionadas do grupoque inclui as cepas bacterianas probióticas reportadas aseguir.

o Requerente considerou útil selecionar e empregarmatérias-primas analérgicas específicas. Em particular, oRequerente encontrou, como uma fonte de nitrogênio, peptonase/ou hidrolisados proteínicos de origem vegetal e/ou animal,naturalmente isentos de glúten e alérgenos de origem de leitee, como uma fonte de carbono, glicose e/ou outros mono- oudissacarídeos derivados da hidrólise de polissacarídeos maiscomplexos típicos de espécie vegetal naturalmente isento deglúten e alérgenos de origem de leite.

As peptonas de origem vegetal são selecionadas a partirdos grupos incluindo: arroz, batata, milho, castanhas,tapioca, mandioca, ervilha, feijão fava e suas misturas nãoimporta como capazes de promover o crescimento bacteriano defermentação, porém sem produzir alérgenos, dos tipos de leiteou glúten.

Em uma primeira modalidade preferida, o método dapresente invenção prevê o uso, como fonte de nitrogênio, de uma ou mais peptonas e/ou hidrolisados proteínicosanalérgicos e, como fonte de carbono, glicose e/ou outrosmono- ou dissacarideos derivados de hidrólise depolissacarideo complexo (matérias-primas analérgicas).

Em uma segunda modalidade preferida, o método dapresente invenção prevê um pré-tratamento das matérias-primas com enzimas apropriadas para a retirada de resíduos, casohaja, de alérgenos que se derivam de contaminação cruzadaocorrida ao longo da cadeia de produção e/ou distribuição.

No contexto da presente invenção, o substrato de culturaé um substrato de cultura analérgico de origem vegetal e/ou animal, naturalmente isento de glúten, alérgenos ou de origemde leite e todas as substâncias que pertencem à lista doanexo III bis das instruções (matérias-primas analérgicas)acima mencionadas. O uso de matérias-primas analérgicas acimamencionadas permite a obtenção de probióticos certificáveispara o uso em pessoas alérgicas, como o não uso desubstâncias que pertencem à lista do anexo III bis dasinstruções de comunidade acima mencionada e o uso deingredientes certificados a partir do fornecedor como isentode tais substâncias pode ser assegurado.

A seguir, em virtude do fato de que a ausência dequaisquer substâncias químicas em uma dada amostra não écientificamente demonstrável, porém se pode simplesmentedeterminar que a quantidade que existe possivelmente é maisbaixa do que o limite de detecção do método analíticoutilizado (mesmo se o método mais sensível e refinadoconhecido na técnica foi utilizado) , também o uso de um pré-tratamento enzimático resulta como sendo uma fonte de umagarantia adicional.

Simplesmente como exemplo, algumas formulaçõesanalérgicas de meio para o crescimento de culturasbacterianas probióticas são reportadas abaixo.

Os componentes de um meio de cultura devem trazer fontesde nitrogênio (nesse caso, as peptonas e/ou hidrolisadosproteínicos), fontes de carbono (nesse caso, glicose e/ououtros mono- ou dissacarideos derivados de hidrólise depolissacarídeos complexos), bioativadores de crescimento evitaminas (nesse caso, a partir de extrato de levedo) e saisminerais.

Por exemplo, um meio de cultura pode conter:

glicose preferivelmente selecionada de: amido demilho, batata, sacarose de beterraba ou sacarose de cana;

- peptona preferivelmente selecionada de: arroz, batata,milho, castanha, tapioca, mandioca, ervilha, feijão fava,feijão ou genericamente legumes e suas misturas;

- peptona preferivelmente selecionada de: carne;

- extrato de levedo; sais minerais (como exemplo:acetatos, carbonatos, fosfatos, fosfatos de hidrogênio,cloretos, citratos, sulfatos e outros);

builder (se necessário, como: Tween, lecitinas eoutros) e água potável.

Uma das formulações apropriadas para o crescimento decepas dos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium poderiaincluir, preferivelmente, os seguintes ingredientes:

Glicose (a partir das fontes listadas acima) 10 - 100 g/l

Peptona de arroz 10—50 g/lPeptona de carne 10 - 50 g/lExtrato de levedo 2 -20 g/lSais minerais 1-10 g/lBuilders 0-5 ml/lÁgua potável q.s. até o volume desejado

Um exemplo preferido de um meio para culturasbacterianas probióticas analérgicas poderia ser o seguinte:

Glicose (de amido de milho) 20 g/lPeptona de arroz 10 g/lPeptona de carne 10 g/lExtrato de levedo 5 g/lAcetato de sódio 5 g/lAmônio de citrato 2 g/lFosfato de potássio dibásico 2 g/lSulfato de magnésio 0,1 g/lSulfato de manganês 0,05 g/lTween 80 1 ml/l

Água potável q.s. até o volume desejado

A fermentação é realizada de acordo com os ensinamentosconhecidos para as pessoas versadas na técnica e sob ascondições experimentais de uso comum.

O Requerente verificou a presença, ou não, de resíduosalérgenos em uma cultura probiótica cultivada em matérias-primas tema da presente invenção.

Por exemplo, no caso de alérgenos derivados de leite, apesquisa por modo analítico de β-lactoglobulina e lactose nosprodutos finais, com metodologias sensíveis e específicasconfirmadas (análise com kit ELISA específica para a β-lactoglobulina do tipo "Bovine β-lactoglubilins ELISAquantitation kit - Bethyl Laboratories", com um limite de0,05 ppm e análise com kit quimienzimático e detecção UV-vispara a lactose do tipo "Lactose/D-glucose - BoehringerMannheim, cod. 10986119", com um limite de 7 ppm) fornece umresultado negativo e, portanto, essas substâncias, caso haja,devem certamente estar abaixo do limite de detecção.

Ao mesmo tempo, a pesquisa com glúten realizada com ametodologia mais refinada e até o presente mais sensívelconfirmada (ELISA RIDASCREEN® Gliadin kit-R-Biopharm A,Darmstadt, Alemanha, com uma sensibilidade igual a 3 ppm)permite a confirmação da ausência de glúten. Conclui-se que,mesmo se glúten estivesse presente, sua concentração seria emqualquer caso abaixo do limite de detecção, a saber inferiora 3 ppm.

0 pré-tratamento enzimático nas matérias-primas, a serrealizado ou não como uma função das exigências, é capaz dehidrolisar leite e resíduos de derivados de glúten ederivados acidentalmente existentes no meio de cultura.

Tal tratamento transmite o padrão de segurança maiselevado para um uso também apropriado para pessoas alérgicase particularmente sensíveis.

Essa estratégia de fabricação é apropriada para aprodução de probiótica com um grau de segurança analérgicodenominado DSS - Sistema de segurança dupla.

O pré-tratamento enzimático prevê o uso de pelo menosuma enzima proteolitica e/ou o uso de pelo menos uma enzimade glicosidase.

No contexto da presente invenção, a enzima proteoliticaé capaz de executar uma proteólise. A enzima proteolitica éselecionada do grupo que inclui as proteases e/ou peptidases.As proteases e peptidases são selecionadas do grupo queinclui: tripsina, quimiotripsina, pancreatina, pepsina,papaina e bromelaina. Preferivelmente, as proteases e aspeptidases são selecionadas entre pepsina e/ou bromelaina.

No contexto da presente invenção, a enzima glicosidase écapaz de executar uma clivagem hidrolitica de um glicosideo.A enzima glicosidase é selecionada do grupo que inclui: alfa-glucosidase e beta-glucosidase, alfa-galactosidase e beta-galactosidase.

Vantajosamente, o tratamento enzimático das matérias-primas formando o caldo de crescimento para a probiótica érealizado com proteases (alcalases e bromelaina) e comglicosidases.

As glicosidases são selecionadas do grupo que inclui:lactase (ou β-galactosidase). Em uma modalidade preferida, opré-tratamento das matérias-primas prevê o uso em umaseqüência incluindo três enzimas: alcalase, lactase ebromelaina.

Em uma modalidade preferida, a seleção das enzimas e suaseqüência são as seguintes:

alcalase, que hidrolisa praticamente todas asproteínas e particularmente aquelas do leite;

- lactase, que hidrolisa a lactose;

- bromelaina, que hidrolisa o glúten.

A seqüência mostrada é uma função do pH ótimo dehidrólise em um gradiente a partir de básico até ácido; dessemodo, o meio conserva as propriedades nutricionais.

A alcalase, ativa em direção a β-lactoglobulina, a a-lactaalbumina e as caseinas, permite eliminar resíduosalergênicos, caso haja, derivando de contaminações cruzadasfortuitas e não intencionais com derivados de leite.

Tal tratamento prevê a adição às matérias-primasdissolvidas em água de uma quantidade de enzima variando de0,0025 a 0,0500 g/l, correspondendo a 0,001 - 0,020 AU/1(Unidades Anson por litro).

A solução é então levada a uma temperatura entre 45 e55°C por 15 - 60 minutos, com um pH entre 7 e 8;preferivelmente, um pH controlado de 7,50 + 0,20.

A lactase, também conhecida como β-galactosidase, écarregada na hidrólise da ligação de glicosideo entre glicosee galactose no dissacarideo de lactose.

O tratamento com lactase é realizado após a hidrólisecom proteínas alcalase após ter sido levado o pH do caldo decultura a um valor entre 6 e 7; preferivelmente, um valor de6,50 ± 0,20 com ácidos orgânicos (preferivelmente, ácidoláctico) pela adição de 250 - 2.000 NLU/1 (Unidades delactase neutro por litro), correspondendo a 0,05 - 0,40 ml deuma solução de enzima titulada a 5.000 NLU/g.

A solução é mantida a 37 ± 50C por um período variávelde 2 - 6 horas. Finalmente, a bromelaína é uma enzimaproteolítica contida naturalmente no abacaxi, capaz dehidrolisar efetivamente a gliadina em fragmentos nãoreconhecidos pelo sistema imune e, portanto não alergênicos.

o tratamento é realizado pela adição do meio defermentação com a enzima à quantidade de 0, 005 - 0, 010 g/l(igual a 110 - 220 GDU/1, Unidades de digestão de gelatinapor litro), após correção do pH a valores de 5,0 - 6,0 comácidos orgânicos (preferivelmente ácido láctico). Atemperatura de trabalho deve ser mantida a 37 ± 50C por umtempo entre 1 e 6 horas.

Após os três tratamentos enzimáticos, é necessáriorecuperar o pH no valor ótimo para a fermentação das cepasúnicas (preferivelmente com 5 N NaOH para basificar, ou comácido láctico para acidificar).

A seguir, um tratamento a calor para a purificação domeio é realizado (executado em temperaturas entre 90 e 145°Cpor tempos que variam de alguns segundos a 4 5 minutos) , que,entretanto, desnaturará e inativará as enzimas adicionadas,sem riscos adicionais para o produto final e as pessoasdestinadas que derivam de resíduos da enzima utilizada.

Um desenho típico de produção industrial prevê,portanto, as seguintes etapas:

a. seleção das matérias-primas analérgicas

b. dissolução das matérias-primas em água

c. correção do pH e temperatura para valoresadequados para o uso da enzima proteolítica, preferivelmentealcalase

d. adição da enzima e sua ação pelo temponecessário

e. correção do pH e temperatura para valoresadequados para o uso da enzima glicolítica, preferivelmentelactase

f. adição da enzima e sua ação pelo temponecessário

g. correção do pH e temperatura para valoresadequados para o uso da enzima proteolítica, preferivelmentebromelaína

h. adição da enzima e sua ação pelo temponecessário

i. correção do pH até valores apropriados para afermentação

j· purificação através de pasteurização e/ouesterilização do meio de cultura

k. resfriamento na temperatura de inóculo típicada cepa probiótica em produção (37 ± 20C) .

1. inóculo da cepa

m. fermentação

n. separação da biomassa e crioproteção

o. Iiofilização.

A presente invenção permite então a produção de cepasprobiótica analérgicas e em particular com ausência absolutade alérgenos, mais preferivelmente de leite e derivados deglúten, com uma ampla segurança de uso para todas as classesde populações.

Vantajosamente, as culturas bacterianas probióticasanalérgicas preparadas de acordo com os ensinamentos dapresente invenção, podem ser utilizadas de forma eficaz paraa preparação de formulações farmacêuticas.

Em vista do número elevado de pessoas alérgicas a leite(3-5% da população com idade abaixo de 2 anos) e pessoasceliacas (1% da população total) é útil tentar desenvolverbactérias probióticas que possam ser administradas também aessas classes de população.

A presente invenção então é útil:

. para os consumidores, para os quais a transparência narotulação é fundamental;

. para os produtores, que desse modo pode se basear emum produto com garantia total de suas propriedadesanalérgicas, portanto proposto para compra por todapopulação.

Claims

1. Método de preparar produto alimentício ou formulaçãofarmacêutica, destinado a pessoas afetadas pela doençacelíaca, e sendo particularmente sensíveis a substânciasalergizantes do tipo glúten e/ou leite, caracterizado pelofato de por intermédio de pelo menos uma cultura bacterianaprobiótica analérgica obtida por um método que inclui pelomenos uma etapa na qual as bactérias são produzidas atravésdo desenvolvimento em um substrato de cultura analérgico.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que as bactérias são selecionadasdo grupo que inclui as seguintes cepas bacterianasprobióticas:Streptococcus thermophilus LMG P-18383, Streptococcusthermophilus LMG P-18384, Lactobacillus pentosus LMG P--21019, Lactobacillus plantarum LMG P-21020, Laetobaeillusplantarum LMG P-21021, Laetobaeillus plantarum LMG P--21022, Laetobaeillus plantarum LMG P-21023, Laetobaeilluscasei ssp. Paraeasei LMG P-21380, Laetobaeillus aeidophilus-LMG P-21381, Bifidobaeterium longum LMG P-21382,Bifidobaeterium breve LMG P-21383, Bifidobaeterium laetis LMGP-21384, Laetobaeillus plantarum LMG P-21385, Laetococeuslaetis ssp. laetis LMG P-21387, Laetococeus laetis ssp.laetis LMG P-21388, Laetobaeillus plantarum LMG P-21389,Streptococcus thermophilus DSM 16506, Streptococcusthermophilus DSM 16507, Bifidobacterium longum DSM 16603,Bifidobacterium breve DSM 16604, Laetobaeillus casei ssp.rhamnosus DSM 16605, Laetobaeillus delbrueckii ssp.bulgaricus DSM 16606, Laetobaeillus delbrueckii ssp.bulgaricus DSM 16601, Streptococcus thermophilus DSM 16590,Streptococcus thermophilus DSM 16591, Streptococcusthermophilus DSM 16592, Streptococcus thermophilus DSM-16593, Bifidobacterium adolescentis DSM 16594,Bifidobacterium adolescentis DSM 16595, Bifidobacterium breveDSM 16596, Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 16597,Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 16598, Staphylococcusxylosus DSM 2 7102, Bifidobacterium adolescentis DSM 17103,Lactobacillus plantarum DSM 17104, Streptococcus thermophilusDSM 17843, Streptoeoceus thermophilus DSM 17844,Streptoeoceus thermophilus DSM 17845, Laetobaeillusfermentum DSM 18295, Laetobaeillus fermentum DSM 18296,Laetobaeillus fermentum DSM 18297, Laetobaeillus fermentumDSM 18298, Laetobaeillus gasseri DSM 18299, Laetobaeillusgasseri DSM 18300, Laetobaeillus gasseri DSM 18301,Laetobaeillus gasseri DSM 18302, Bifidobaeteriumadolescentis DSM 18350, Bifidobacterium adolescentis DSM- 18351, Bifidobacterium adolescentis DSM 18352,Bifidobacterium catenulatum DSM 18353.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o substrato de culturaanalérgica inclui pelo menos uma peptona e/ou hidrolisadoproteinico, a peptona e/ou hidrolisado proteinico sendoselecionado do grupo que inclui peptona e/ou hidrolisadoproteinico de origem vegetal e/ou animal.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a peptona de origem vegetal éselecionada do grupo que inclui: arroz, batata, milho,castanhas, tapioca, mandioca, ervilha, feijão fava, legumese/ou suas misturas e a peptona de origem animal é selecionadadas peptonas de carne.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o substrato de culturaanalérgico inclui pelo menos uma substância selecionada de:glicose e/ou mono- ou dissacarideo derivado de hidrólises depolissacarideo complexos, glicose sendo derivada de amido demilho, amido de batata ou de sacarose de beterraba ou cana.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o substrato de culturaanalérgico inclui: glicose derivado de amido de milho, amidode batata ou de sacarose de cana ou beterraba; pelo menos umapeptona de carne e pelo menos uma peptona de origem vegetalselecionada do grupo que inclui: arroz, batata, milho,castanhas, tapioca, mandioca, ervilha, feijão fava, legumese/ou suas misturas.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que as bactérias em contato com osubstrato de cultura analérgica são submetidas a uma etapa defermentação e subseqüente liofilização.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que as culturas bacterianasprobióticas obtidas são culturas bacterianas probióticasanalérgicas contendo uma quantidade de alérgenos abaixo dolimite de detecção: 3 ppm para glúten, 7 ppm para lactose e-0,05 ppm para lactoglobulinas.

9. Método de preparar produto alimentício ou formulaçãofarmacêutica, destinado a pessoas afetadas pela doençacelíaca e sendo particularmente sensíveis a substânciasalergizantes do tipo de glúten e/ou leite, caracterizado pelofato de por intermédio de pelo menos uma cultura bacterianaprobiótica analérgica, em que as bactérias da cultura sãoselecionadas do grupo que inclui as seguintes cepasbacterianas probióticas:Streptococcus thermophilus LMG P-18383, Streptococcusthermophilus LMG P-18384, Lactobacillus pentosus LMG P--21019, Laetobaeillus plantarum LMG P-21020, Laetobaeillusplantarum LMG P-21021, Laetobaeillus plantarum LMG P--21022, Laetobaeillus plantarum LMG P-21023, Laetobaeilluscasei ssp. Paraeasei LMG P-21380, Laetobaeillus aeidophilusLMG P-21381, Bifidobaeterium longum LMG P-21382,Bifidobaeterium breve LMG P-21383, Bifidobaeterium laetis LMGP-21384, Laetobaeillus plantarum LMG P-21385, Laetocoecuslaetis ssp. laetis LMG P-21387, Laetocoecus lactis ssp.laetis LMG P-21388, Laetobaeillus plantarum LMG P-21389,Streptococcus thermophilus DSM 16506, Streptococcusthermophilus DSM 16507, Bifidobacterium longum DSM 16603,Bifidobacterium breve DSM 16604, Laetobaeillus casei ssp.rhamnosus DSM 16605, Laetobaeillus delbrueckii ssp.bulgaricus DSM 16606, Laetobaeillus delbrueckii ssp.bulgaricus DSM 16607, Streptococcus thermophilus DSM 16590,Streptococcus thermophilus DSM 16591, Streptococcusthermophilus DSM 16592, Streptococcus thermophilus DSM-16593, Bifidobaeterium adoleseentis DSM 16594,Bifidobaeterium adoleseentis DSM 16595, Bifidobaeterium breveDSM 16596, Bifidobaeterium pseudoeatenulatum DSM' 16597,Bifidobacterium pseudoeatenulatum DSM 16598, StaphyloeoeeusKylosus DSM 17102, Bifidobaeterium adoleseentis DSM 17103,Lactobacillus plantarum DSM 17104, Streptocoeeus thermophilusDSM 17843, Streptocoeeus thermophilus DSM 17844,Streptocoeeus thermophilus DSM 17845, Lactobacillusfermentum DSM 18295, Lactobacillus fermentum DSM 18296,Lactobacillus fermentum DSM 18297, Lactobacillus fermentumDSM 18298, Lactobacillus gasseri DSM 18299, Lactobacillusgasseri DSM 18300, Lactobacillus gasseri DSM 18301,Lactobacillus gasseri DSM 18302, Bifidobacteriumadoleseentis DSM 18350, Bifidobaeterium adoleseentis DSM-18351, Bifidobaeterium adoleseentis DSM 18352,Bifidobaeterium eatenulatum DSM 18353,e em que a cultura é obtida por um método incluindo pelomenos uma etapa na qual as bactérias são produzidas atravésdo desenvolvimento em um substrato de cultura analérgicoanteriormente submetido a um pré-tratamento enzimático paraeliminar resíduos alérgenos existentes por contaminaçãocruzada ou não intencional.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o pré-tratamento enzimáticoprevê o uso de pelo menos uma enzima proteolítica e/ou pelomenos uma enzima de glicosídeo; a enzima proteolítica sendoselecionada do grupo que inclui proteases e/ou peptidasesselecionados do grupo que inclui: tripsina, quimiotripsina,pancreatina, pepsina, papaína e bromelaína; e a enzima deglicosídeo sendo selecionada do grupo que inclui alfa-glucosidase e beta-glucosidase, alfa-galactosidase e beta-galactosidase.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o pré-tratamento enzimáticoinclui o uso de pelo menos uma protease selecionada entrealcalase e bromelaina e pelo menos um glicosidase selecionadoentre lactase ou beta-galactosidase.

12. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o pré-tratamento enzimáticoinclui sucessivamente o uso de: alcalase, lactase ebromelaina.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que:- a alcalase e o substrato analérgico são tratados emuma temperatura entre 45°C e 55°C, por um tempo entre 15 e 60minutos em um pH entre 7 e 8;- a lactase e o substrato de cultura analérgico sãotratados em uma temperatura entre 30° e 40°C, por um tempoentre 2 e 6 horas em um pH entre 6 e 7;- bromelaina e o substrato de cultura analérgico sãotratados a uma temperatura entre 30°C e 40°C, por um tempoentre 1 e 6 horas em um pH entre 5 e 6.

14. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que ao término do pré-tratamentoenzimático uma etapa na qual o pH é recuperado em valoresapropriados para a fermentação das cepas únicas, uma etapa detratamento a calor em uma temperatura entre 900C e 145°C paradesnaturar e inativar as enzimas utilizadas no pré-tratamentoenzimático e uma etapa de fermentação das cepas sãoprevistas.

15. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o substrato de culturaanalérgica inclui pelo menos uma peptona e/ou hidrolisadoproteínico, a peptona e/ou hidrolisado proteinico sendoselecionado do grupo que inclui peptona e/ou hidrolisadoproteinico de origem vegetal e/ou animal.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que a peptona de origem vegetal éselecionada do grupo que inclui: arroz, batata, milho,castanhas, tapioca, mandioca, ervilha, feijão fava e suasmisturas e a peptona de origem animal é selecionada daspeptonas de carne.

17. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o substrato de culturaanalérgico inclui pelo menos uma substância selecionada de:glicose e/ou mono- ou dissacarideo derivado de hidrólises depolissacarideo complexos, glicose sendo derivada de amido demilho, amido de batata ou de sacarose de beterraba ou cana.

18. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o substrato de culturaanalérgico inclui: glicose derivada de amido de milho, amidode batata ou de sacarose de cana ou beterraba; pelo menos umapeptona de carne e pelo menos uma peptona de origem vegetalselecionada do grupo que inclui: arroz, batata, milho,castanhas, tapioca, mandioca, ervilha, feijão fava, legumese/ou suas misturas.

19. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que as bactérias em contato com osubstrato de cultura analérgica são submetidas a uma etapa defermentação e subseqüente Iiofilização.

20. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que as culturas bacterianasprobióticas obtidas são culturas bacterianas probióticasanalérgicas contendo uma quantidade de alérgenos abaixo dolimite de detecção: 3 ppm para glúten, 7 ppm para lactose e-0,05 ppm para beta-lactoglobulinas.MÉTODO DE PREPARAR PRODUTO ALIMENTÍCIO OD FORMULAÇÃOFARMACÊUTICAA presente invenção refere-se a um método para apreparação de culturas bacterianas probióticas analérgicas.