KR101324212B1 - 쌀 단백질을 포함하는 세피아프테린 생산용 배지 및 이를 이용한 세피아프테린의 생산방법 - Google Patents

쌀 단백질을 포함하는 세피아프테린 생산용 배지 및 이를 이용한 세피아프테린의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 쌀 단백질 또는 쌀 단백질의 가수분해물을 포함하는 세피아프테린 생산용 배지 및 이를 이용한 세피아프테린의 생산방법에 관한 것으로, 본 발명의 쌀 단백질 가수분해물을 미생물 배지에 질소원으로 첨가할 경우, 기존의 다른 질소원에 비해 세피아프테린(sepiapterin)을 고 수율 및 고 생산성으로 생산할 수 있다.

Description

쌀 단백질을 포함하는 세피아프테린 생산용 배지 및 이를 이용한 세피아프테린의 생산방법{Medium for production of sepiapterin with rice protein and method for production of sepiapterin therefrom}
본 발명은 세프아프테린 생산용 배지 및 이를 이용한 세피아프테린의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 쌀 단백질 또는 쌀 단백질의 가수분해물을 포함하는 세피아프테린 생산용 배지 및 이를 이용한 세피아프테린의 생산방법에 관한 것이다.
테트라하이드로바이오프테린(Tetrahydrobiopterin, BH4)은 고등생물의 페닐알라닌 하이드록시라제(phenylalanine hydroxylase), 티로신 하이드록시라제(tyrosine hydroxylase) 및 트립토판 하이드록시라제(tryptophan hydroxylase)와 같은 방향족 아미노산의 수산화효소와 니트로 옥사이드 신타제(nitro oxide synthase)의 활성에 필수적인 조효소이다 (정재훈, "Sepiapterin Reductase(SR) 유전자 적중을 통한 BH4의 생체 기능 분석", 대한민국 특허, 10-2006-0108601).
티로신 하이드록시라제(Tyrosine hydroxylase)와 트립토판 하이드록시라제(tryptophan hydroxylase)는 뇌 신경전달물질인 세라토닌, 도파민의 생합성에 관여하며, BH4의 결핍은 도파 반응성 근육긴장 이상증과 파킨슨병을 포함한 여러 가지의 신경질환을 유발할 수 있다 (오세정, 홍용희, 이용화, 이승태, 기창석, 이동환, Dihydropteridine Reductase 결핍증 1례, Journal of Genetic Medicine, 6:170-174 [2009]).
한편, 세피아프테린(Sepiapterin)은 BH4의 전구체로서 BH4보다 안정성이 탁월하여 생산비용이 저렴해진다면 현재 동물세포주를 이용하여 생산하고 있는 BH4 보다 경제적으로 생산할 수 있는 장점이 있다.
세피아프테린은 재조합 대장균을 이용하여 생산할 수 있는데, 대장균은 통상적으로 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone) 및 카세인 가수분해물(casein hydrolysate) 등이 질소원으로 첨가된 배지에서 배양한다.
하지만, 국내에서 유통되는 카세인 가수분해물의 경우, 대부분 해외에서 수입하여 사용하고 있으며, 고가에 판매되고 있는 실정이기 때문에 새로운 대체제의 개발이 요구된다 할 것이다.
본 발명에서는 미생물을 이용한 세피아프테린의 생산에 사용되는 배지에 질소원으로 첨가될 수 있는 새로운 소재를 국내에서 생산되는 곡물로부터 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 쌀 단백질 또는 쌀 단백질의 가수분해물을 포함하는 것을 특징으로 하는 세피아프테린 생산용 배지를 제공한다. 이때, 본 발명의 쌀 단백질 또는 쌀 단백질의 가수분해물은 배지 중 질소원으로서 첨가될 수 있다.
한편, 바람직하게 본 발명의 쌀 단백질은, 쌀을 분쇄하는 단계; 분쇄한 쌀에 지용성 물질 추출 용매를 첨가하여 현탁시킨 후, 지질을 추출하여 제거하는 단계; 지질을 제거한 쌀에 알칼리성 용액을 첨가하여 pH가 9.0~9.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 불용성 물질을 제거함으로써, 1차 상등액을 회수하는 단계; 회수한 1차 상등액에 산성 용액을 첨가하여 pH가 4.0~4.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 상등액을 제거함으로써, 1차 침전물을 수득하는 단계; 수득한 1차 침전물에 증류수를 첨가하여 용해시키고, 1차 동결건조하는 단계;를 수행하여 수득되는 것을 사용하는 것이 좋다. 이와 같은 단계를 거침으로써 쌀 단백질로부터 지질을 제거하고, 쌀 단백질의 수득 수율을 높일 수 있기 때문이다.
이때, 상기의 수득된 1차 침전물은, 바람직하게, 상기의 1차 동결건조 단계중 증류수 첨가 전에, pH 4.0~4.5로 조정된 증류수를 수득된 1차 침전물에 첨가하여 현탁하고 원심분리하여 상등액을 한 번 더 제거하는 단계를 추가로 거치는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 쌀 단백질 가수분해물은, 쌀을 분쇄하는 단계; 분쇄한 쌀에 지용성 물질 추출 용매를 첨가하여 현탁시킨 후, 지질을 추출하여 제거하는 단계; 지질을 제거한 쌀에 알칼리성 용액을 첨가하여 pH가 9.0~9.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 불용성 물질을 제거함으로써, 1차 상등액을 회수하는 단계; 회수한 1차 상등액에 산성 용액을 첨가하여 pH가 4.0~4.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 상등액을 제거함으로써, 1차 침전물을 수득하는 단계; 수득한 1차 침전물에 증류수를 첨가하여 용해시키고, 1차 동결건조하는 단계; 상기 1차 동결건조 후 수득된 동걸건조물과 단백질가수분해효소를 효소반응용액에 첨가한 후, 반응시키는 단계; 반응 후, 단백질가수분해효소를 불활성화시키고, 원심분리하여 2차 상등액을 수득하는 단계; 수득한 2차 상등액을 여과하여 분자량 10 kDa 이상의 단백질을 분리하는 단계; 분리된 분자량 10kDa 이상의 단백질을 2차 동결건조하는 단계;를 수행함으로써 수득되는 것이 좋다. 단백질 가수분해 과정을 추가적으로 거침으로써, 쌀 단백질을 저분자화시켜 미생물이 질소원으로서 보다 용이하게 사용할 수 있기 때문이다.
한편, 본 발명은 세피아프테린을 생산할 수 있도록 형질전환된 미생물을 배양하여 세피아프테린을 생산함에 있어서, 미생물 배양용 배지로, 본 발명의 쌀 단백질 또는 쌀 단백질의 가수분해물을 포함하는 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 세피아프테린의 생산방법을 제공한다
이때, 세피아프테린 생산용 미생물은 일 예로 대장균일 수 있다. 세피아프테린을 생산할 수 있도록 형질전환된 형질전환된 대장균은 GTP 사이클로하이드로라제 1 (GTP cyclohydrolase 1, CGH1)와 프로테인 티로신 포스파타제 (protein tyrosine phosphatase, PTPS)를 발현할 수 있도록 형질전환되어야 하는데, 세피아프테린의 생산을 위해서는 상기의 두 가지 효소가 필요하기 때문이다.
GTP 사이클로하이드로라제 1은 일 예로 시네코싸이스티스 속(Synechocystis sp.)에서 유래한 것을 사용할 수 있고, 프로테인 티로신 포스파타제는 사람의 섬유아세포 cDNA 유래의 것을 사용할 수 있다.
형질전환은 상기의 두 효소를 암호화하는 유전자를 대장균 형질전환용 벡터에 삽입한 후, 대장균 내부에 도입시킴으로써 수행될 수 있다.
기타의 형질전환 과정은 공지의 기술을 사용할 수 있으며, 배양도 대장균 배양에 관한 공지의 기술을 사용할 수 있으므로, 이에 관한 구체적 기술은 생략하기로 한다.
본 발명에서 개발한 쌀 단백질 또는 쌀 단백질 가수분해물은 국내에서 대량 생산되는 작물인 쌀로부터 수득하기 때문에 원료 수급성 면에서 경제성이 높다.
또한, 본 발명에서 개발한 쌀 단백질 가수분해물을 미생물 배지에 질소원으로 첨가할 경우, 기존의 다른 질소원에 비해 세피아프테린(sepiapterin)을 고 수율 및 고 생산성으로 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 쌀 단백질 추출 과정을 보여주는 흐름도이다.
도 2는 세피아프테린 생산용 배지에서의 재조합 대장균의 비성장속도(specific growth rate)를 보여준다.
도 3은 재조합 대장균의 세피아프테린 생성 농도(sepiapterin concentration)를 보여준다.
도 4는 재조합 대장균의 세피아프테린 생산성(sepiapterin productivity)을 보여준다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: 쌀 단백질의 제조]
시중에서 구매한 쌀을 120 mesh(TOP30P, 한국기계엔지니어링, 군포, 대한민국) 입자 크기로 분쇄한 후 n-헥산을 이용하여 지질을 추출하였다.
지질을 제거한 쌀을 상온에서 12시간 건조시킨 후, 불용성 물질의 제거를 위해 2M NaOH를 첨가하여 pH 9.0~9.5로 조정한 후, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리(SUPRA21K, 한일과학, 강릉, 대한민국)하여 상등액을 회수하였다.
회수한 상등액은 2N HCl을 이용하여 pH 4.0~4.5로 조정하고, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하였다.
상등액을 제거하고 남은 침전물은 추가적으로 pH 4.5로 조정된 증류수를 이용하여 현탁하고 한 번 더 원심분리한 후, 상등액을 제거하였다.
상등액을 제거한 침전물은 증류수로 용해시키고 24시간 동결건조(RD5508, 일신랩, 양주, 대한민국)하여 분말형태의 단백질로 수득하였다(도 1).
[ 실시예 2: 가수분해된 쌀 단백질의 제조]
실시예 1에서 수득한 쌀 단백질 가수분해를 위해, 121℃에서 15분간 멸균하여 준비한 pH 7.0으로 조정된 0.05M 소디움 포스페이트(sodium phosphate) 완충액에 실시예 1에서 수득한 쌀 단백질 20 g과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 유래된 단백질가수분해효소(Maxazyme NNP DS, 비젼바이오켐, 성남, 대한민국) 180 unit을 혼합하여 45℃에서 8시간 동안 반응시킨 후, 95℃에서 20분간 처리하여 효소를 불활성화하였다.
여과지(Advantec, Tokyo, Japan)로 반응물을 여과한 후, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였고, 상등액은 여과지(Cat#7182004, Whatman, Maidstone, England)로 여과하였다.
분자량 10 kDa 크기 이상의 단백질 가수분해물을 획득하기 위하여 여과지(PLGC06210, Millipore, Billerica, USA)로 재여과하였다.
위의 방법으로 얻은 분자량 10 kDa 크기 이상의 단백질 가수분해물은 24시간 동안 동결건조하여 분말상태로 확보하였다.
[ 실시예 3: 본 발명의 가수분해된 쌀 단백질을 이용한 세피아프테린의 제조]
본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 수득한 분자량 10 kDa 크기 이상 쌀 단백질 가수분해물의 질소원 대체 효과를 확인하고자 하였다. 대조구는 질소원으로써 카세인 가수분해물을 이용하였고, 실험구는 카세인 가수분해물 대신 본 발명의 10 kDa 크기 이상의 쌀단백질 가수분해물을 이용하였다.
세피아프테린 생산을 위해 시네코싸이스티스 속(Synechocystis sp.)에서 유래한 GTP 사이클로하이드로라제 1과 사람의 섬유아세포 cDNA 유래의 프로테인 티로신 포스파타제(PTPS)를 pET-28a(Merck, Darmstadt, Germany) 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 구축한 후, 이 벡터로 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시켜 세피아프테린 생산용 호스트 균주로 사용하였다.
미생물 배양용 플라스크에 하기 표 1에 제시된 배지 100 ml를 주입하고 상기의 세피아프테린 생산용 재조합 균주를 접종하여, 진탕배양기(한백과학, 부천, 대한민국)을 이용하여 24시간 동안 37℃, 200 rpm 조건에서 배양함으로써, 세피아프테린의 생산성을 비교하였다.
생산된 세피아프테린은 HPLC(High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다. ODS-3 컬럼(5020-01732, GL Science, Tokyo, Japan)을 사용하여, UV/VIS 검출기(SPD-20A, Shimadzu, Tokyo, Japan)로 420 nm 파장에서 분석하였다. 컬럼 온도는 40℃로 유지하였으며, 이동상으로서 12%(v/v) 메탄올을 1.2 ml/min의 유속으로 설정하여 분석하였다.
실험구와 대조구의 배지 조성
성분 농도 (g/L)
대조구 실험구
글리세롤 20 20
효모 추출액(Yeast extract) 4 4
KH2PO4 4 4
K2HPO4 4 4
Na2HPO4 2.8 2.8
(NH4)2SO4 1.2 1.2
NH4Cl 0.2 0.2
카세인 가수분해물 10 -
쌀단백질 가수분해물
(분자량 10 kDa 이상)		 - 10
MgSO4·H2O 2 2
FeSO4·H2O 0.04 0.04
CaCl2·H2O 0.04 0.04
MnSO4·H2O 0.01 0.01
AlCl3·H2O 0.01 0.01
CoCl2·H2O 0.004 0.004
ZnSO4·H2O 0.002 0.002
Na2MoO4·H2O 0.002 0.002
CuCl2·H2O 0.001 0.001
H3BO3 0.0005 0.0005
배양 후, 세피아프테린 생산 재조합 대장균의 비증식속도와 세피아프테린의 생성 농도 및 생산성을 측정하였다.
비증식속도는 10 kDa 크기 이상의 쌀 단백질 가수분해물을 첨가하였을 때, 0.2±0.0 h-1로 카세인 가수분해물을 첨가하였을 때보다 약 11% 낮은 값을 나타내었다 (도 2).
그러나, 세피아프테린의 생성 농도를 비교한 결과, 카세인 가수분해물을 질소원으로 첨가하여 배양하였을 때, 세피아프테린 생성농도는 56.0±9.5 mg/L 이었으나, 분자량 10 kDa 이상의 쌀단백질 가수분해물을 이용해 질소원을 대체하여 재조합 대장균을 배양하였을 때, 세피아프테린의 생성농도는 120.8±25.8 mg/L 이었다. 이 수치는 대조구에 비하여 2배나 높은 수치이다 (도 3).
정리하자면, 10 kDa 크기 이상의 쌀단백질 가수분해물과 카세인 가수분해물을 사용한 대조구의 성장속도는 동등 수준의 결과를 나타내지만, 세피아프테린의 생산성을 볼 때, 10 kDa 크기 이상의 쌀단백질 가수분해물은 0.81±0.2 mg/L·hr의 생산성을 나타내고, 대조구의 생산성은 0.2±0.0 mg/L·hr을 나타낸 것이다 (도 4). 이와 같은 결과는 10 kDa 크기 이상의 쌀단백질 가수분해물이 대조구에 비해 4배 이상의 월등한 생산성 향상을 나타내는 것을 의미하는 것이다.

Claims (7)

  1. 쌀 단백질 또는 쌀 단백질의 가수분해물을 포함하며,
    상기 쌀 단백질은,
    쌀을 분쇄하는 단계;
    분쇄한 쌀에 지용성 물질 추출 용매를 첨가하여 현탁시킨 후, 지질을 추출하여 제거하는 단계;
    지질을 제거한 쌀에 알칼리성 용액을 첨가하여 pH가 9.0~9.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 불용성 물질을 제거함으로써, 1차 상등액을 회수하는 단계;
    회수한 1차 상등액에 산성 용액을 첨가하여 pH가 4.0~4.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 상등액을 제거함으로써, 1차 침전물을 수득하는 단계;
    수득한 1차 침전물에 증류수를 첨가하여 용해시키고, 1차 동결건조하는 단계;를 수행하여 수득되는 것을 특징으로 하는 세피아프테린 생산용 배지.
  2. 제1항에 있어서, 상기 쌀 단백질 또는 쌀 단백질의 가수분해물은,
    배지 중 질소원으로서 첨가되는 것을 특징으로 하는 세피아프테린 생산용 배지.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 1차 침전물은,
    상기의 1차 동결건조 단계 중 증류수 첨가 전에,
    pH 4.0~4.5로 조정된 증류수를 상기의 수득된 1차 침전물에 첨가하여 현탁하고 원심분리하여 상등액을 한 번 더 제거하는 단계;를 추가로 거친 것을 특징으로 하는 세피아프테린 생산용 배지.
  5. 제1항에 있어서, 상기 쌀 단백질의 가수분해물은,
    쌀을 분쇄하는 단계;
    분쇄한 쌀에 지용성 물질 추출 용매를 첨가하여 현탁시킨 후, 지질을 추출하여 제거하는 단계;
    지질을 제거한 쌀에 알칼리성 용액을 첨가하여 pH가 9.0~9.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 불용성 물질을 제거함으로써, 1차 상등액을 회수하는 단계;
    회수한 1차 상등액에 산성 용액을 첨가하여 pH가 4.0~4.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 상등액을 제거함으로써, 1차 침전물을 수득하는 단계;
    수득한 1차 침전물에 증류수를 첨가하여 용해시키고, 1차 동결건조하는 단계;
    상기 1차 동결건조 후 수득된 동걸건조물과 단백질가수분해효소를 효소반응용액에 첨가한 후, 반응시키는 단계;
    반응 후, 단백질가수분해효소를 불활성화시키고, 원심분리하여 2차 상등액을 수득하는 단계;
    수득한 2차 상등액을 여과하여 분자량 10 kDa 이상의 단백질을 분리하는 단계;
    분리된 분자량 10kDa 이상의 단백질을 2차 동결건조하는 단계;를 수행함으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 세피아프테린 생산용 배지.
  6. 세피아프테린을 생산할 수 있도록 형질전환된 미생물을 배양하여 세피아프테린을 생산함에 있어서,
    미생물 배양용 배지로,
    제1항의 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 세피아프테린의 생산방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 미생물은,
    대장균인 것을 특징으로 하는 세피아프테린의 생산방법.
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KR20020096181A (ko) * 2001-06-18 2002-12-31 박영식 재조합 대장균에 의한 테리딘 화합물의 제조방법
KR20080056303A (ko) * 2005-10-11 2008-06-20 애니드랄 에스.알.엘. 비알레르기성 프로바이오틱 박테리아 배양물의 제조 방법및 관련 용도
US20090104668A1 (en) 2005-02-09 2009-04-23 Kaneka Corporation Method for Producing Biopterins Using Tetrahydrobiopterin Biosynthesis Enzyme

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