CN101356262B - 用于制备非变应性益生菌培养物的方法和相关的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明的目标是用于制备非变应性益生菌培养物的方法。
Description
本发明的目标是用于制备非变应性益生菌培养物的方法。
众所周知，人胃肠(GI)道含有复杂的微生物菌群，称为小生物群(microbiota)，其主要由能起不同作用的严格厌氧细菌组成，这些作用具有影响局部胃肠道水平和间接影响涉及几乎所有器官和宿主功能的总体系统水平的效果。
由能定植于肠粘膜和摄入的食物颗粒的各种各样的菌种(400-500种)组成的肠道微生物系统因而能够很强地调节个体健康。
肠道微生物系统的组成可以因几种因素而改变，例如个体的年龄、生理状况、不同病原体的存在、胁迫以及最重要的是饮食。
由于内源性和外源性负面因素，有用的细菌(通常为属于小肠内的乳酸菌类型和大肠内的双歧杆菌的细菌)减少而肠道致病菌(链球菌(streptococci)和梭状芽孢杆菌(clostridia))增加。
通过医学技术、营养学、integrator并且尤其是食物(所谓的“功能性”或“营养性”食物)来施用特定的益生菌使得能通过恢复最佳的肠功能来再平衡宿主的策生物系统。
术语“益生菌”通常涉及选自健康个体的肠道微生物系统的活的微生物，其一旦以适宜的量施用并施用足够长的时间，就能定植(也包括仅暂时性定植)于不同的肠道上并且能对宿主生物体的健康产生有益的影响。
属于益生菌的主要是乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、明串珠菌属(Leuconostoc)的一些种，并且在更低的范围内，是酵母(Saccharomyces)、芽孢杆菌(Bacillus)和肠球菌(Enterococcus)。
在通过全世界进行的严格临床试验显示的以及通过摄入益生菌而在消费者体内引起的有益健康的和有利的效果中，可以提及：
1.刺激免疫系统；
2.诱导抗诱变和抗基因毒性的效应；
3.抗肿瘤和抗肿瘤转移作用，涉及例如：
-大肠癌
-乳腺癌
-膀胱癌
4.改善营养吸收；
5.减轻乳糖不耐受症状；
6.由于降低了pH和减少了便秘而改善肠能动性；
7.减少胆固醇和脂肪的吸收；
8.止泻、抗-高血压、抑制女性泌尿生殖系统感染的抗-糖尿病作用；
9.预防老年人病理学的活性。
用于经口施用的益生菌的特征在于其必须具有下列一般性条件和功能性条件：
i)人肠道来源；来自良好健康状态的个体；
ii)生物安全性；它们必须不会引起副作用，特别是在虚弱的或免疫力降低的人中；
iii)抵抗力和生存力；它们必须具有这样的抵抗力特性以能够在胃液、胰腺分泌物和胆汁分泌物下存活而使得其以不受损害的方式到达回肠和结肠并仍然具有极佳的存活力。
益生性微生物和病原性微生物系统之间的竞争只有在摄入后，益生性微生物能够到达肠道并因而能在胃酸度和高浓度的胆汁盐下存活时才可以发生。通常，一旦它们已经到达肠道，它们据说开始经历粘附机制，该机制涉及对肠绒毛具有特异性粘附功能的蛋白质和/或糖类。
在工业水平上，益生菌以冻干的细菌培养物的形式产生，即测定细胞在适当的培养基中的生长(发酵)并接着，浓缩和纯化生物菌体，随后通过冷冻干燥对其进行脱水。需要让细菌自我繁殖足够的数量(发酵步骤)并自己能长时间保存(冷冻干燥步骤)的这样一个过程。
为了发酵步骤能成功地进行并具有足够的产量，必须给细胞提供合适量的碳源和氮源、微量元素以及生物活性剂。
传统上，处理通常所说的“乳酸”菌时选择用作氮源的基质是血清、乳清-蛋白质、水解产物和酪蛋白胨、酪蛋白酸盐等，而作为碳源，通常采用乳糖和葡萄糖，因为它们可以容易地由几乎所有活的生物体代谢。
在最近几年里，也可能是由于饮食缺少变化和太富含蛋白质和脂质，在欧洲和西方国家记录在案的患有变应性类型的病理的人数明显增加。
IV型或IgE型-介导的免疫反应称为“变应性”反应，在该反应过程中，在第一次致敏性接触(其可以在生命的任何时期发生，也可以在胚胎时期发生)后，特异性IgE通过组胺-介导的机制产生。
这种反应也可以由称作“变应原”分子剂量的急剧减少引起，临床结果可以从单纯的轻度皮肤反应变为过敏性休克和死亡。
由于这些物质对一些人来说危险，欧洲共同体已经批准了一项法规，即在标签中必须明确标示属于下列类型(上述指令的附录III bis)的食物“在生产中的使用和在食品中的存在”(第6(10)条，因而指令2003/89/EC对指令2000/13/EC)：
含谷蛋白的谷物(即小麦、黑麦、大麦、燕麦、斯佩尔特小麦、卡姆(kamut)或它们的杂交株)及衍生品、甲壳动物(Crustacea)和基于甲壳动物的制品、蛋和基于蛋的制品、鱼和基于鱼的制品、花生和基于花生的制品、大豆和基于大豆的制品、奶和基于奶的制品(包括乳糖)、有壳的果实，即巴旦杏(Amigdalus communis L.)、榛子(Corylus avellana)、胡桃(Juglans regia)、acagi ùwalnut(Western Anacardium)、美国山核桃[Carya illinoiesis(Wangenh)K.Koch]、巴西坚果(Bertholletia excelsa)、阿月浑子(Pistaciavera)、澳洲坚果(Macadamia ternifolia)及衍生的产品、芹菜和基于芹菜的制品、芥菜和基于芥菜的制品、芝麻种子和基于芝麻种子的制品、浓度高于10mg/kg或10mg/l的二氧化硫(以SO2表示)和亚硫酸盐。
因为，通常为了产生益生菌，使用了基于牛奶(作为氮源)和通常源自淀粉(也包括小麦淀粉)的葡萄糖(作为碳源)、衍生物的基质，如果该益生菌施用给特别敏感的受试者，即使它们实际上至多只能含有痕量的变应原(因而来自奶和/或谷蛋白)，也可以认为该益生菌是危险的。
在奶的情形中，可以具体考虑对该食品的有害反应的两个原因：牛乳蛋白过敏(APLV)和乳糖不耐受。
奶与蛋是更致敏的食品；这种特性由其含有的蛋白质物质决定，即主要是α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和酪蛋白。
对牛奶蛋白过敏是一种在生命的第一年内相对常见的病理。在50-70％的情形中，症状是胃肠型的，然而在50-70％的情形中存在皮肤障碍，在20-30％的情形中存在呼吸障碍并且在5-9％的情形中存在系统性障碍(过敏性反应)。
APLV在生命的第一年后有自身趋于减弱并在将近10年后会消失，而且在成人中是不常见的。
乳糖不耐受具有相反的过程，其在生命的第一种非常罕见而在成人中是极为常见的，尤其是在某些人群(非洲人、亚洲人、美国印第安人)中。
自出生以来，奶就是一种基本的食物而且新生儿已经产生了将乳糖分解成其简单成分葡萄糖和半乳糖所需要的酶。在生命的第一年后后，奶变成了一种不很重要的食物而乳糖酶自然减少，这样许多成人变得对奶不耐受(非变应性的)。乳糜泻病是一种肠接触性(enterophatic)、慢性的、免疫-介导的炎性疾病，其由摄入谷蛋白所致，所述谷蛋白是一些谷物中天然含有的“储藏”蛋白。
这种食物耐受不良影响遗传上易感的人，这些人具有以不正常的方式响应蛋白质成分的摄入的免疫系统，所述的蛋白质成分通常为小麦谷蛋白、斯佩尔特小麦(一种小麦)、卡姆和spella(一种小麦)、大麦、黑麦、黑小麦(小麦和黑麦的杂交麦)和它们的衍生物的蛋白质成分。一些个体还表现出对燕麦蛋白质的不耐受。
技术上，术语“谷蛋白”用于上面提及的谷物的简单的醇溶蛋白(富含脯氨酸，称为“麦醇溶蛋白”)和谷蛋白(富含谷氨酰胺，称为“麦谷蛋白”)的组合。
在有关乳糜泻病的内容中，术语“谷蛋白”通常用于指谷物中含有的所有类型的蛋白质，即使形成谷蛋白的不同蛋白质成分中，麦醇溶蛋白看上去是最有害的。
在受乳糜泻病影响的人中，谷蛋白的消费(也包括少量的消费)能够引起免疫系统的异常应答：转谷氨酰胺酶(一种存在于肠粘膜组织中的酶)与麦醇溶蛋白结合并通过脱酰胺作用使其转化成能够激活T细胞(能够介导所有对蛋白质抗原的免疫应答的免疫系统细胞)的分子，并随后产生抗转谷氨酰胺酶的IgG和IgA以及抗-endomise的IgA免疫球蛋白。
在开始的阶段，肠上皮内的激活的T细胞增加，而随着疾病的发展，该增加与淋巴细胞和浸润的自身薄层的浆细胞都相关，并产生了负责缩短绒毛并因而引起了对肠粘膜的损害的金属蛋白酶。
迄今为止，不存在防止乳糜泻发展或治疗乳糜泻病的可能性，因此一生中严格实行无谷蛋白饮食是能够确保受乳糜泻疾病影响的人非常健康的唯一疗法。
乳糜泻患者也必须排除痕量的危险谷物的面粉，因为谷蛋白的摄入(也包括极小量谷蛋白的摄入)可促使自身免疫应答。
由于摄入的谷蛋白的量与在肠道水平上引起的毒性作用的比率仍未确定，术语“痕量”在治疗乳糜泻疾病和在食品立法规划方面具有重要的实践意义，因为它涉及在适合乳糜泻患者的饮食的产品中“可接受的”谷蛋白的最大限度(阀值)。所有技术人员都了解每天100mg剂量的麦醇溶蛋白(等于200mg谷蛋白，即约3g面包)足以在大多数乳糜泻患者中引起肠上皮内淋巴细胞的增加，这是持续性肠道炎症的早期症状。
关于最小阀值，迄今为止进行的少数科学研究似乎显示，摄入高达每天10毫克麦醇溶蛋白(等于百万分之20的谷蛋白)不能够敏感地损害肠粘膜，但是在少数情形中可以决定胃肠症状的发生。
在国际立法水平上，仍然有效的旧标准“Codex Standard forGluten-Free Foods”显示，饮食治疗性产品中的最大谷蛋白量是每100g干产品(参照小麦淀粉)0.05g氮，其相当于约500ppm的谷蛋白成分。
然而，现在对上述准则做出了正确和恰当的评估，包括从天然的无谷蛋白成分得到的无谷蛋白食物不能含有多于20ppm的谷蛋白，而源自含谷蛋白的谷物的无谷蛋白食物可含有最大限度为200ppm的谷蛋白。
在法国、英国和荷兰，还在等待对上述准则的评估，它们认为无谷蛋白产品的最大限度为200ppm。
在国家范围内，当前的法规似乎比共和体和国际的法规更谨慎，实际上为用天然不含谷蛋白的原料加工的食物和从这种物质中纯化的食物两者都确定了“百万分之20”的限度。
该法规包括，如果食品的组分中或形成食品的一种或多种成分(调味剂、添加剂或辅佐剂)的组分中存在含谷蛋白或源自谷蛋白的物质的谷物和/或如果终产物中的一定量的谷蛋白可源自生产步骤，谷蛋白经分析测定为高于百万分之20，则这种产品将必须在标签中在成分列表下面并且以非常明显的方式标示“含谷蛋白产品”的文字。
然而，考虑到在加工工业水平上可以发生天然不含谷蛋白的谷物和衍生物(淀粉、面粉、淀粉面粉等)的交叉污染现象，将谷蛋白从食物中全部除去是不容易实现的。
这些产品随后可通过食品工业用于制备基于多种不同来源和性质的工艺成分(technological inqredionts)、添加剂和辅佐剂的复杂食品。
最近的研究已经显示，高达6％的“理论上”无谷蛋白的产品(基于报告的成分)实际上每100g最终产品含有超过30mg的麦醇溶蛋白(等于600ppm的谷蛋白)。
为了排除可能的谷蛋白污染，因此对于每种商品化的食品，不仅需要考虑使用的所有成分和加工，而且还需要考虑每种单一成分的全部生产链。
因此，由于使用基于牛奶或谷物的发酵基质或者另外由于无意识的污染或交叉污染，仍然存在对能够产生无致敏性物质的益生菌培养物的需要。事实上，由于交叉污染、无意识污染和意外污染，生产过程中使用的一些成分带来痕量变应原仍然是可能的。
因此，仍然存在对能够提供用于制备益生菌培养物的方法的需要，所述方法包括在生产过程的每一步骤中(包括发酵)非变应性物质的使用。特别是，期望确定和选择不同于代表良好氮源和碳源的牛奶及其衍生物和含谷蛋白谷物的发酵基质。
因而，所有的部门操作者都认为，迄今为止，仍然存在对提供用于制备益生菌培养物的方法的非常强烈的需要，所述方法够使用替换至今还使用的那些基质的基质，并且同时能够减少可能会发生的交叉污染、无意识污染和意外污染
特别是，仍然存在对提供用于制备益生菌培养物的方法的需要，所述方法提供了涉及不含致敏物质的双重水平安全性。
本发明的一个目标是提供用于制备能够克服已知技术的局限的培养基的方法。
本发明的另一个目标是提供用于产生可安全施用给所有人(包括受变态反应影响的人)的益生菌培养物的方法。
这些目标和其他的目标(根据下面的详细述将变得显而易见)已经通过本申请人实现，本申请人已经改进了方法，该方法具有在益生菌培养物的生产过程中的涉及不含变应原的双重安全水平。
特别是，本申请已经建立了一种生产方法，在该方法中使用选择的非变应性发酵基质(非变应性原料)，该基质能够确保用于益生菌培养物的合适的氮源和碳源。
用于制备非变应性益生菌培养物的方法、含有所述培养物的组合物以及所述培养物用于制备所谓的“功能性”或“营养性”食品的用途形成了本发明主题，该主题具有如在附带的权利要求书中定义的特征。
在本发明的一个实施方案中，所述的细菌培养物菌株属于下列属：乳酸杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、片球菌属、乳球菌属、丙酸杆菌属、芽胞杆菌属、酵母菌属、肠球菌属、明串珠菌属。
优选地，乳酸杆菌属中已经发现可使用下列种：戊糖乳杆菌(L.pentosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、干酪乳杆菌(L.casei)、干酪乳杆菌副干酪亚种(L.casei ssp.paracasei)、干酪乳杆菌鼠李糖亚种(L.casei ssp.rhamnosus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii ssp.bulgaricus)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、格氏乳杆菌(L.gasseri)。
使用的上述种的菌株的实例在附表1中描述。优选地，双歧杆菌属中已经发现可使用下列种：长双歧杆菌(B.longum)、短双歧杆菌(B.breve)、乳双歧杆菌(B.lactis)、青春双岐杆菌(B.adolescentis)和假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)。
使用的上述种的菌株的实例在附表1中描述。优选地，乳球菌属中已经发现可使用下列种：乳酸乳球菌(L.lactis)和乳酸乳球菌乳酸亚种(L.lactis ssp.Lactis)。
使用的上述种的菌株的实例在附表1中描述。优选地，链球菌属中已经发现可使用下列种：嗜热链球菌(S.thermophilus)。
使用的上述种的菌株的实例在附表1中述及。
表1：
| 1 | 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) | LMG P-18383 |
| 2 | 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) | LMG P-18384 |
| 3 | 戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus) | LMG P-21019 |
| 4 | 植物乳杆菌(Lactobacillus planterum) | LMG P-21020 |
| 5 | 植物乳杆菌(Lactobacillus planterum) | LMG P-21021 |
| 6 | 植物乳杆菌(Lactobacillus planterum) | LMG P-21022 |
| 7 | 植物乳杆菌(Lactobacillus planterum) | LMG P-21023 |
| 8 | 干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus casei ssp，piracasei) | LMG P-21380 |
| 9 | 嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) | LMG P-21381 |
| 10 | 长双歧杆菌(Bifidobacterium longum) | LMG P-21382 |
| 11 | 短双歧杆菌(Bifidobacterium breve) | LMG P-21383 |
| 12 | 乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis) | LMG P-21384 |
| 13 | 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) | LMG P-21385 |
| 14 | 乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis ssp，lactis) | LMG P-21387 |
| 15 | 乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis ssp.lactis) | LMG P-21388 |
| 16 | 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) | LMG P-21389 |
| 17 | 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) | DSM 16506 |
| 18 | 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) | DSM 16507 |
| 19 | 长双歧杆菌(Bifidobacterium longum) | DSM 16603 |
| 20 | 短双歧杆菌(Bifidobacterium breve) | DSM 16604 |
| 21 | 千酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei ssp.rhamnosus) | DSM 16605 |
| 22 | 德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus) | DSM 16606 |
| 23 | 德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus) | DSM 16607 |
| 24 | 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) | DSM 16590 |
| 25 | 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) | DSM 16591 |
| 26 | 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) | DSM 16592 |
| 27 | 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) | DSM 16593 |
| 28 | 青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis) | DSM 16594 |
| 29 | 青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis) | DSM 16595 |
| 30 | 短双歧杆菌(Bifidobacterium breve) | DSM 16596 |
| 31 | 假链状双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum) | DSM 16597 |
| 32 | 假链状双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum) | DSM 16598 |
| 33 | 木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus) | DSM 17102 |
| 34 | 青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis) | DSM 17103 |
| 35 | 植物乳杆菌(Lactobacilus plantarum) | DSM 17104 |
| 36 | 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) | DSM 17843 |
| 37 | 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) | DSM 17844 |
| 38 | 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) | DSM 17845 |
| 39 | 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum) | DSM 18295 |
| 40 | 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum) | DSM 18296 |
| 41 | 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum) | DSM 18297 |
| 42 | 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum) | DSM 18298 |
| 43 | 格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri) | DSM 18299 |
| 44 | 格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri) | DSM 18300 |
| 45 | 格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri) | DSM 18301 |
| 46 | 格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri) | DSM 18302 |
| 47 | 青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis) | DSM 18350 |
| 48 | 青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis) | DSM 18351 |
| 49 | 青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis) | DSM 18352 |
| 50 | 链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum) | DSM 18353 |
在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述细菌培养物的细菌选自在附表1中描述的益生菌菌株。
本申请的申请已经发现可用于选择和利用的具体的非变应性原料。特别是，本申请人已经发现，天然不含谷蛋白和牛奶来源的变应原的、植物和/或动物来源的蛋白胨和/或蛋白水解产物可作为氮源，而不含谷蛋白和奶来源变应原的植物物种典型的较复杂的多糖水解产生的葡萄糖和/或其他单糖或二糖可作为碳源。
植物源的蛋白胨选自：稻米、马铃薯、玉米、栗子、木薯淀粉、木薯粉(manioca)、豌豆、蚕豆以及它们的混合物，它们能够促进发酵细菌的生长但不会产生奶或谷蛋白类型的变应原。
在第一个优选的实施方案中，本发明的方法主题包括一种或多种蛋白胨和/或非变应性蛋白水解产物作为氮源的用途，以及源自复杂多糖(非变应性原料)的水解产物的葡萄糖和/或其他单糖或二糖用作碳源的用途。
在第二个优选的实施方案中，本发明的方法主题包括用适合除去痕量的源自生产和/或分配链发生的交叉污染的变应原(如果有的话)的酶预处理原料。
在本发明内容中，培养基质是天然不含谷蛋白、奶来源变应原以及不含有上面提到的指令的附录III bis的名单中的所有物质(非变应性原料)的植物和/或动物源非变应性培养基质。上述非变应性原料的使用使得能获得可认证的益生菌用于过敏症患者，因为可以确定没有使用上述欧共体指令的附录III bis的名单中的物质和使用供应商保证不含这些物质的成分。
此外，尽管事实上是给定样品中缺少任何化学物质在科学上是不可证明，但人们可以简单地确定可能存在的量是低于使用的分析方法的检测极限(即使使用本领域已知的更灵敏和精确的方法)，而且酶预处理的使用提供额外的保证。
仅为了以实例说明，在下面报导了一些用于益生菌培养物生长的培养基的非变应性成分。
培养基的成分必须携带有氮源(在该情形中为蛋白胨和/或蛋白水解产物)、碳源(在该情形中，为源自复杂多糖的水解产物的葡萄糖和/或其他单糖或二糖)、生长生物活性剂和维生素(在该情形中来自酵母提取物)以及矿物盐。
例如，培养基可含有：
-葡萄糖，优选选自：玉米淀粉、马铃薯、甜菜蔗糖或甘蔗蔗糖；
-蛋白胨，优选选自：稻米、马铃薯、玉米、栗子、木薯淀粉、木薯粉(manioca)、豌豆、蚕豆、大豆或一般豆类以及它们的混合物；
-蛋白胨，优选选自肉类；
-酵母提取物、矿物盐(例如，仅为了举例说明：醋酸盐、碳酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、氯化物、柠檬酸盐、硫酸盐等)、中和剂(builder)(如果需要，例如吐温、卵磷脂等)和饮用水。
一种适合用于乳酸杆菌和双歧杆菌属的菌株生长的制剂包括下列成分：
葡萄糖(来自上面列出的来源) 10-100g/l
稻米蛋白胨 10-50g/l
肉类蛋白胨 10-50g/l
酵母提取物 2-20g/l
矿物盐 1-10g/l
增量组分 0-5ml/l
饮用水 补足到期望量
用于非变应性益生菌培养物的培养基的一个优选实例可以是如下：
葡萄糖(来自玉米淀粉) 20g/l
稻米蛋白胨 10g/l
肉类蛋白胨 10g/l
酵母提取物 5g/l
醋酸钠 5g/l
柠檬酸铵 2g/l
磷酸氢二钾 2g/l
硫酸镁 0.1g/l
硫酸锰 0.05g/l
吐温80 1ml/l
饮用水 补足到期望量
发酵是根据本领域技术人员已知的技术并在通常使用的实验条件下进行的。
本申请人已经检验了痕量变应原在生长于本发明原料物质上的益生菌培养物上的存在与否。
例如，在奶来源的变应原的情形中，用已验证过的特异性且灵敏的方法(用对β-乳球蛋白特异性的ELISA试剂盒(“牛β-乳球蛋白ELISA定量试剂盒-Bethyl Laboratories”型，阀限为0.05ppm)分析，并且用化学酶(chemoenzymatic)试剂盒和UV-vis检测仪(“乳糖/D-葡萄糖-Boe-hringer Mannheim，cod.10986119”型，阀限为7ppm)分析乳糖，通过分析的方式研究终产物上的β-乳球蛋白和乳糖得到阴性结果，因而，这些物质(如果有的话)应该肯定在检测阀以下。
同时，用至今为止更精确且更灵敏的已验证的方法(ELISAGliadin kit-R-Biopharm A，Darmstadt，德国，灵敏度等于3ppm)进行的谷蛋白研究使得能确认不存在谷蛋白。由此可见，即使存在谷蛋白，其浓度在任何情况下都应该在检测阀值以下，即低于3ppm。
对原料的酶预处理(根据需求实施或不实施)能够水解意外存在于培养基中的痕量的奶和衍生物以及谷蛋白和衍生物。
这种处理给予了最高的安全标准以便使用也适合于过敏症患者和特别敏感的人。
这种生产策略适用于具有称为DSS(Double Safety System)的非变应性安全水平的益生菌生产。
酶预处理包括至少一种蛋白水解酶的使用和/或至少一种糖苷酶的使用。
在本发明的内容中，蛋白水解酶能够进行蛋白水解。蛋白水解酶选自蛋白酶和/或肽酶。蛋白酶和肽酶选自胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰酶、胃蛋白酶、番木瓜酶和菠萝蛋白酶。优选地，蛋白酶和肽酶选自胃蛋白酶和/或菠萝蛋白酶。在本发明的内容中，糖苷酶能够进行糖苷的水解。糖苷酶选自α-糖苷酶和β-糖苷酶、α--半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶。
有利地是，形成用于益生菌的生长肉汤培养基的原料的酶处理用蛋白酶(碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶)和糖苷酶完成。
糖苷酶选自乳糖酶(或β-半乳糖苷酶)。在一个优选的实施方案中，原料的预处理包括三种酶按顺序使用：碱性蛋白酶、乳糖酶和菠萝蛋白酶。
在一个优选的实施方案中，酶和它们的顺序的选择如下：
-碱性蛋白酶(碱性蛋白酶)，其几乎水解所有的蛋白质并且尤其是奶类中的蛋白质；
-乳糖酶，其水解乳糖；
-菠萝蛋白酶，其水解谷蛋白。
显示的顺序是按照最佳的从碱到酸梯度的水解pH；以这种方式，培养基可保持营养特性。对β-乳球蛋白、α-乳清蛋白和酪蛋白有活性的碱性蛋白酶使得能除去源自与奶衍生物发生的偶然的和无意识的交叉污染的变应原残余物(如果有的话)。
这种处理包括加入一定量的酶至溶解于水中的原料，酶的范围在0.0025和0.0500g/l之间，相当于0.001-0.020AU/l(安森单位/升)。
然后，使溶液达到45℃和55℃之间的温度并持续15-60分钟，且pH在7和8之间；优选控制pH为7.50±0.20。
乳糖酶(也称作β-半乳糖甘酶)负责水解乳糖二糖中葡萄糖和半乳糖之间的糖苷键。在用蛋白质碱性蛋白酶水解之后，用有机酸(优选乳酸)使肉汤培养基的pH达到6和7之间的值，优选值为6.50±0.20，随后通过加入250-2.000NLU/L(中性乳酸酶单位/升)，相当于0.05-0.40ml的滴定为5.000NLU/g的酶溶液，来进行乳糖酶处理。
将该溶液在37±5℃下保持2-6小时。最后，菠萝蛋白酶是一种菠萝中天然含有的蛋白水解酶，它能够将谷蛋白有效地水解成免疫系统不识别并因而不是变应原的片段。
在用有机酸(优选乳酸)调节pH值为5.0-6.0之后，通过加入0.005-0.010g/L(等于110-220GDU/L(明胶消化单位/升))量的该酶至发酵培养基来完成该处理。工作温度必须保持在37+5℃下1-6小时。
在三次酶处理后，需要将pH恢复到用于单一菌株发酵的最佳值(优选用5N NaOH碱化，或者用乳酸酸化)。
接着，进行热处理(在90和145℃之间进行数秒至45分钟不等)以纯化培养基，该处理将会使加入的酶变性和失活，对终产物和期望它们的人来说，不会有源自使用的酶的残余物的其它风险。
因此，典型的工业生产方案包括下列步骤：
a.选择非变应性原料
b.将原料溶解于水中
c.将pH和温度校正至合适的值以便使用蛋白水解酶，优选碱性蛋白酶
d.加入该酶并让其作用需要的时间
e.将pH和温度校正至合适的值用于使用糖酵解酶，优选乳糖酶
f.加入该酶并让其作用需要的时间
g.将pH和温度调节至合适的值以便使用蛋白水解酶，优选菠萝蛋白酶
h.加入该酶并让其作用需要的时间
i.校正pH达到适用于发酵的值
j.通过巴氏消毒法和/或杀菌纯化培养基
k.在生产的益生菌株的典型接种温度(37±2℃)下冷却
l.接种菌株
m.发酵
n.分离生物菌体并进行抗冻保护(cvioprotection)。
o.冷冻干燥。
本发明因而能产生非变应性的益生菌菌株并且特别是绝对不含变应原，更优选不含牛奶和谷蛋白衍生物，对所有人群具有广泛的使用安全性。
有利地是，根据本发明教导制备的非变应性益生菌培养物可有效地用于制备药物制剂。
考虑到大量对牛奶过敏的人(3-5％的年龄小于2岁的人)和乳糜泻病患者(总人口的1％)，设法研发出也可以施用给这些类型的人的益生菌是有用的。
本发明因而对下列人有用：
标签的明晰对其至关重要的消费者；
生产者，以这种方式他们可依赖于绝对保证了其非变应性特性，因而能面向整个购买人群的产品。
Claims (36)
1.用于制备非变应性益生菌培养物的方法，该方法特征在于它包括至少一个其中将益生菌与非变应性培养基质接触的步骤，以及对与所述非变应性培养基质接触的所述益生菌进行发酵和随后的冷冻干燥的步骤，其中所述非变应性培养基质是指，天然不含谷蛋白、奶来源变应原以及不合有指令2003／89／EC的附录III bis的名单中的所有物质的植物和／或动物源非变应性培养基质，并且包含至少一种蛋白水解产物，以及至少一种选自源于复杂多糖水解产物的单糖或二糖的物质；并且，所述非变应性益生菌培养物是指，含有低于检测极限的量的变应原的非变应性益生菌培养物，其中所述的检测极限对于谷蛋白为3ppm，对于乳糖为7ppm，而对于乳球蛋白为0.05ppm。
2.根据权利要求1的方法，其中所述非变应性培养基质包含至少一种蛋白胨。
3.根据权利要求1的用于制备非变应性益生菌培养物的方法，其中在所述的至少一个步骤中，所述培养物的益生菌通过在非变应性培养基质中生长而产生，所述的益生菌选自乳酸杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、片球菌属、乳球菌属、丙酸杆菌属、芽胞杆菌属、酵母属、肠球菌属、明串珠菌属。
4.根据权利要求3的方法，其中所述培养物的益生菌选自下列菌种：戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、乳双歧杆菌、青春双岐杆菌和假链状双歧杆菌、乳酸乳球菌、和嗜热链球菌。
5.根据权利要求3的方法，其中所述培养物的益生菌选自下列菌 种：干酪乳杆菌干酪亚种、干酪乳杆菌鼠李糖亚种和乳酸乳球菌乳酸亚种。
6.根据权利要求1至4任意一项的方法，其中所述的益生菌选自下列益生菌株：
7.根据权利要求1的方法，其中所述的蛋白水解产物选自：植物和／或动物来源的蛋白水解产物。
8.根据权利要求1的方法，其中所述的蛋白水解产物选自：植物和／或动物来源的蛋白胨。
9.根据权利要求8的方法，其中所述的植物来源的蛋白胨选自：稻米、马铃薯、玉米、栗子、木薯淀粉、豆类和／或它们的混合物。
10.根据权利要求8的方法，其中所述的植物来源的蛋白胨选自：稻米、马铃薯、玉米、栗子、木薯、豆类和／或它们的混合物。
11.根据权利要求9或10的方法，其中所述豆类选自豌豆和蚕豆。
12.根据权利要求8的方法，其中所述的动物来源的蛋白胨选自肉蛋白胨。
13.根据权利要求1的方法，其中所述的单糖为葡萄糖。
14.根据权利要求13的方法，其中所述的葡萄糖源自玉米淀粉、马铃薯淀粉或者源自甜菜或甘蔗蔗糖。
15.根据权利要求1的方法，其中所述的非变应性培养基质包含葡萄糖、至少一种肉蛋白胨和至少一种植物来源的蛋白胨。
16.根据权利要求15的方法，其中所述的植物来源的蛋白胨是稻米蛋白胨。
17.非变应性益生菌培养物，其中所述的益生菌培养物选自权利要求1至6任意一项所述的益生菌菌株，并通过权利要求1至16中任一项的方法获得。
18.至少一种权利要求17所述的非变应性益生菌培养物的用途，其用于制备用于对致敏物质特别敏感的人的食品，所述的物质选自谷蛋白和／或奶类物质。
19.用于制备益生菌培养物的方法，其中所述的培养物选自权利要求1至6任意一项所述的益生菌菌株，所述方法的特征在于它至少包括一个将该益生菌与非变应性培养基质接触的步骤，以及对与所述非变应性培养基质接触的所述益生菌进行发酵和随后的冷冻干燥的步骤，其中所述的非变应性培养基质预先接受酶预处理以除去通过交叉污染或 无意识污染而存在的痕量变应原，如果有的话；并且所述非变应性培养基质是指，天然不含谷蛋白、奶来源变应原以及不含有指令2003／89／EC的附录III bis的名单中的所有物质的植物和／或动物源非变应性培养基质，并且包含至少一种蛋白水解产物，以及至少一种选自源于复杂多糖水解产物的单糖或二糖的物质；并且所述的酶预处理依次包括碱性蛋白酶、乳糖酶和菠萝蛋白酶的使用，其中
将碱性蛋白酶和所述的非变应性培养基质在pH在7和8之间，温度在45℃和55℃之间时处理15至60分钟；
将乳糖酶和所述的非变应性培养基质在pH在6和7之间，温度在30℃和40℃之间时处理2至6小时；
将菠萝蛋白酶和所述的非变应性培养基质在pH在5和6之间，温度在30℃和40℃之间时处理1至6小时。
20.根据权利要求19的方法，其中所述非变应性培养基质包含至少一种蛋白胨。
21.根据权利要求19的方法，其中将碱性蛋白酶和所述的非变应性培养基质在7.5±0.20的pH下进行处理。
22.根据权利要求19的方法，其中将乳糖酶和所述的非变应性培养基质在6.5±0.20的pH下进行处理。
23.根据权利要求19至22中任一项的方法，其中在酶预处理后，包括恢复pH至适于单一菌株发酵的值的步骤、在90和145℃之间的温度下进行热处理以使在所述酶预处理中使用的酶变性和失活的步骤，以及所述的权利要求1至6任意一项所述的益生菌菌株的发酵步骤。
24.根据权利要求19至22中任一项的方法，其中所述的蛋白水解产物选自植物和／或动物来源的蛋白水解产物。
25.根据权利要求19至22中任一项的方法，其中所述的蛋白水解产物选自植物和／或动物来源的蛋白胨。
26.根据权利要求25的方法，其中所述的植物来源的蛋白胨选自稻米、马铃薯、玉米、栗子、木薯淀粉、豆类和它们的混合物。
27.根据权利要求25的方法，其中所述的植物来源的蛋白胨选自稻米、马铃薯、玉米、栗子、木薯、豆类和它们的混合物。
28.根据权利要求26或27的方法，其中所述豆类选自豌豆和蚕豆。
29.根据权利要求25的方法，其中所述的动物来源的蛋白胨选自肉蛋白胨。
30.根据权利要求19至22中任一项的方法，其中所述单糖为葡萄糖。
31.根据权利要求30的方法，其中葡萄糖源自玉米淀粉、马铃薯或者甜菜或甘蔗蔗糖。
32.根据权利要求19至22中任一项的方法，其中所述的非变应性培养基质包含葡萄糖、至少一种肉蛋白胨和至少一种植物来源的蛋白胨。
33.根据权利要求32的方法，其中所述植物来源的蛋白胨是稻米蛋白胨。
34.根据权利要求19至22中任一项的方法，其中获得的益生菌培养物是含有低于检测极限量变应原的非变应性益生菌培养物，其中的检测极限谷蛋白为3ppm，乳糖为7ppm而β-乳球蛋白为0.05ppm。
35.非变应性益生菌培养物，其中所述的益生菌培养物选自权利要求1至6任意一项所述的益生菌菌株，并通过根据权利要求19至34中任一项的方法获得。
36.至少一种权利要求35所述的非变应性益生菌培养物的用途，其用于制备用于对致敏物质特别敏感的人的食品，所述物质选自谷蛋白和／或奶类物质。
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