BRPI0518104B1 - artigo industrializado e uso de anticorpo her2 - Google Patents

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E Allison David
Lu Jian-Feng
Bruno Rene
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Abstract

métodos de tratamento de câncer, artigo industrializado e uso de um anticorpo her. a presente invenção refere-se á dosagem fixa de anticorpos her, tais como pertuzumab, artigo industrializado contendo essas doses fixas e uso de anticorpo her.

Description

“ARTIGO INDUSTRIALIZADO E USO DE ANTICORPO HER2” Pedidos Relacionados [001] Este é um pedido não provisório depositado com base em 37 CFR 1.53 (b), que reivindica o benefício com base em 35 USC §119 (e) do pedido provisório n° 60/645.697, depositado em 21 de janeiro de 2005, cujo teor é incorporado à presente invenção como referência.
Campo da Invenção [002] A presente invenção refere-se à dosagem fixa de anticorpos HER, tais como pertuzumab.
Antecedentes da Invenção Receptores HER e Anticorpos Contra Eles [003] A família HER de receptores tirosina quinases são mediadores importantes do crescimento, diferenciação e sobrevivência celular. A família de receptores inclui quatro membros distintos, que incluem receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR, ErbB1 ou HER1), HER2 (ErbB2 ou p185neu), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4 ou tyro 2).
[004] EGFR, codificado pelo gene erbB1, foi implicado nas causas de malignidade humana. Particularmente, observou-se aumento da expressão de EGFR em câncer de mama, bexiga, pulmão, cabeça, pescoço e estômago, bem como glioblastomas. O aumento da expressão de receptor EGFR é freqüentemente associado à maior produção do ligante de EGFR, fator de crescimento transformante alfa (TGF-α), pelas mesmas células tumorosas, o que resulta na ativação de receptores por meio de processo estimulante autócrino. Baselga e Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64: 127-154 (1994). Os anticorpos monoclonais dirigidos contra o EGFR ou seus ligantes, TGF-α e EGF, foram avaliados como agentes terapêuticos no tratamento dessas malignidades. Vide, por exemplo, Baselga e Mendelsohn, acima; Masui et al,
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Cancer Research 44: 1002-1007 (1984); e Wu et al, J. Clin. Invest. 95: 18971905 (1995).
[005] O segundo membro da família de HER, p185neu, foi identificado originalmente como o produto do gene de transformação de neuroblastomas de ratos tratados quimicamente. A forma ativada do proto-oncogene neu resulta de mutação pontual (valina em ácido glutâmico) na região de transmembrana da proteína codificada. A amplificação do homólogo humano de neu é observada em cânceres de mama e ovário e correlaciona-se com mau prognóstico (Slamon et al, Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et al, Science, 244: 707-712 (1989); e Patente US 4.968.603). Até o momento nenhuma mutação pontual análoga à do proto-oncogene neu foi relatada para tumores humanos. A superexpressão de HER2 (freqüente, mas não uniformemente devido à amplificação genética) também foi observada em outros carcinomas, que incluem carcinomas do estômago, endométrio, glândulas salivares, pulmão, rim, cólon, tireóide, pâncreas e bexiga. Vide, entre outros, King et al, Science, 229: 974 (1985); Yokota et al, Lancet. 1: 765767 (1986); Fukushige et al, Mol. Cell Biol., 6: 955-958 (1986); Guerin et al, Oncogene Res., 3: 21-31 (1988); Cohen et al, Oncogene, 4: 81-88 (1989); Yonemura etal, CancerRes., 51: 1034 (1991); Borst et al, Gynecol. Oncol., 38: 364 (1990); Weiner et al, Cancer Res., 50: 421-425 (1990); Kern et al, Cancer Res., 50: 5184 (1990); Park et al, CancerRes., 49: 6605 (1989); Zhau et al, Mol. Carcinog., 3: 254-257 (1990); Aasland et al, Br. J. Cancer 57: 358-363 (1988); Williams et al, Pathobiology 59: 46-52 (1991); e McCann et al, Cancer, 65: 88-92 (1990). HER2 pode ser superexpresso em câncer de próstata (Gu et al, Cancer Lett. 99: 185-9 (1996); Ross et al, Hum. Pathol. 28: 827-33 (1997); Ross et al, Cancer 79: 2162-70 (1997); e Sadasivan et al, J. Urol. 150: 126-31 (1993)).
[006] Foram descritos anticorpos dirigidos contra os produtos de proteína p185neu de rato e HER2 humana.
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3/138 [007] Drebin e colegas levantaram anticorpos contra o produto genético neu de rato, p185neu. Vide, por exemplo, Drebin et al, Cell 41: 695-706 (1985); Myers et al, Meth. Enzym. 198: 277-290 (1991); e WO 94/22478. Drebin et al, Oncogene 2: 273-277 (1988) relatam que misturas de anticorpos reativos com duas regiões distintas de p185neu resultam em efeitos antitumorosos sinérgicos sobre células NIH-3T3 neu-transformadas implantadas em camundongos tipo nude. Vide também a Patente US 5.824.311 emitida em vinte de outubro de 1998.
[008] Hudziak et al, Mol. Cell. Biol. 9 (3): 1165-1172 (1989) descrevem a geração de painel de anticorpos HER2 que foram caracterizados utilizando a linhagem de células de tumor de mama humano SK-BR-3. A proliferação celular relativa das células SK-BR-3 após a exposição aos anticorpos foi determinada por meio de manchas de violeta de cristal das monocamadas após 72 horas. Utilizando este teste, obteve-se inibição máxima com o anticorpo denominado 4D5, que inibiu a proliferação celular em 56%. Outros anticorpos no quadro reduziram a proliferação celular em menor ponto neste teste. O anticorpo 4D5 foi adicionalmente considerado sensibilizando linhagens de células de tumor de mama que superexpressam HER2 aos efeitos citotóxicos de TNF-α. Vide também a Patente US 5.677.171, emitida em 14 de outubro de 1997. Os anticorpos HER2 discutidos em Hudziak et al são adicionalmente caracterizados em Fendly et al, Cancer Research 50: 15501558 (1990); Kotts et al, In Vitro 26 (3):59A (1990); Sarup et al, Growth Regulation 1: 72-82 (1991); Shepard et al, J. Clin. Immunol. 11 (3): 117-127 (1991); Kumar et al, Mol. Cell. Biol. 11 (2): 979-986 (1991); Lewis et al, Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263 (1993); Pietras et al, Oncogene 9: 18291838 (1994); Vitetta et al, Cancer Research 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski et al, J. Biol. Chem. 269 (20): 14661-14665 (1994); Scott et al, J. Biol. Chem. 266: 14300-5 (1991); D'souza et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7202-7206
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4/138 (1994); Lewis et al, Cancer Research 56: 1457-1465 (1996); e Schaefer et al, Oncogene 15: 1385-1394 (1997).
[009] Versão humanizada recombinante do anticorpo HER2 murino 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, trastuzumab ou HERCEPTIN®, Patente US 5.821.337) é clinicamente ativa em pacientes com cânceres de mama metastáticos que superexpressam HER2 que receberam extensa terapia anticâncer anterior (Baselga et al, J. Clin. Oncol. 14: 737-744 (1996)). Trastuzumab recebeu aprovação para comercialização da Food and Drug Administration (FDA) em 25 de setembro de 1998 para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático cujos tumores superexpressam a proteína HER2.
[010] Outros anticorpos HER2 com diversas propriedades foram descritos em Tagliabue et al, Int. J. Cancer 47: 933-937 (1991); McKenzie et al, Oncogene 4: 543-548 (1989); Maier et al, Cancer Res. 51: 5361-5369 (1991); Bacus et al, Molecular Carcinogenesis 3: 350-362 (1990); Stancovski et al, PNAS (U. S. A.) 88: 8691-8695 (1991); Bacus et al, Cancer Research 52: 25802589 (1992); Xu et al, Int. J. Cancer 53: 401-408 (1993); WO 94/00136; Kasprzyk et al, Cancer Research 52: 2771-2776 (1992); Hancock et al, Cancer Res. 51: 4575-4580 (1991); Shawver et al, Cancer Res. 54: 1367-1373 (1994); Arteaga et al, Cancer Res. 54: 3758-3765 (1994); Harwerth et al, J. Biol. Chem. 267: 15160-15167 (1992); Patente US 5,783,186; e Klapper et al, Oncogene 14: 2099-2109 (1997).
[011] Seleção de homologia resultou na identificação de dois outros membros da família de receptores de HER; HER3 (Patentes US 5.183.884 e US 5.480.968, bem como Kraus et al, PNAS (U. S. A.) 86: 91939197 (1989)) e HER4 (Pedido de Patente EP 599.274; Plowman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 1746-1750 (1993); e Plowman et al, Nature 366: 473-475 (1993)). Estes dois receptores exibem expressão maior sobre pelo menos algumas linhagens de células de câncer de mama.
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5/138 [012] Os receptores de HER geralmente são encontrados em diversas combinações em células e acredita-se que a heterodimerização aumente a diversidade de reações celulares a uma série de ligantes de HER (Earp et al, Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). EGFR é ligado por seis ligantes diferentes; fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento transformante alfa (TGF-α), anfirregulina, fator de crescimento epidérmico de ligação da heparina (HB-EGF), betacelulina e epirregulina (Groenen et al, Growth Factors 11: 235-257 (1994)). Família de proteínas de herregulina resultantes da divisão alternativa de um único gene é ligante para HER3 e HER4. A família de herregulina inclui alfa, beta e gama herregulinas (Holmes et al, Science, 256: 1205-1210 (1992); Patente US 5,641,869; e Schaefer et al, Oncogene 15: 1385-1394 (1997); fatores de diferenciação neu (NDFs), fatores de crescimento glial (GGFs); receptor de acetilcolina indutor de atividade (ARIA); e fator derivado de neurônios motores e sensoriais (SMDF). Para análise, vide Groenen et al, Growth Factors 11: 235257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7: 247-262 (1996) e Lee et al, Pharm. Rev. 47: 51-85 (1995). Recentemente, foram identificados três ligantes de HER adicionais; neurregulina-2 (NRG-2), que se relata ligar HER3 ou HER4 (Chang et al, Nature 387: 509-512 (1997); e Carraway et al, Nature 387: 512516 (1997)); neurregulina-3 que liga HER4 (Zhang et al, PNAS (U. S. A.) 94 (18): 9562-7 (1997)); e neurregulina-4 que liga HER4 (Harari et al, Oncogene 18: 2681-89 (1999)) HB-EGF, betacelulina e epirregulina também se ligam a HER4.
[013] Embora EGF e TGFa não liguem HER2, EGF estimula EGFR e HER2 para formar heterodímero, que ativa EGFR e resulta em transfosforilação de HER2 no heterodímero. Dimerização e/ou transfosforilação aparentemente ativam a tirosina quinase de HER2. Vide Earp et al, acima. De forma similar, quando HER3 é coexpresso com HER2, complexo de sinalização
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6/138 ativo é formado e anticorpos dirigidos contra HER2 são capazes de romper esse complexo (Sliwkowski et al, J. Biol. Chem., 269 (20): 14661-14665 (1994)). Além disso, a afinidade de HER3 para herregulina (HRG) é aumentada para estado de afinidade superior quando coexpresso com HER2. Vide também Levi et al, Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92: 1431-1435 (1995); e Lewis et al, Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996) com relação ao complexo de proteína HER2HER3. HER4, como HER3, forma complexo de sinalização ativo com HER2 (Carraway e Cantley, Cell 78: 5-8 (1994)).
[014] As patentes publicadas relativas a anticorpos HER incluem: US 5.677.171, US 5.720.937, US 5.720.954, US 5.725.856, US 5.770.195, US 5.772.997, US 6.165.464, US 6.387.371, US 6.399.063, US 2002/0192211 A1, US 6.015.567, US 6.333.169, US 4.968.603, US 5.821.337, US 6.054.297, US 6.407.213, US 6.719.971, US 6.800.738, US 2004/0236078 A1, US 5.648.237, US 6.267.958, US 6.685.940, US 6.821.515, WO 98/17797, US 6.127.526, US 6.333.398, US 6.797.814, US 6.339.142, US 6.417.335, US 6.489.447, WO 99/31140, US 2003/0147884A1, US 2003/0170234A1, US 2005/0002928A1, US 6.573.043, US 2003/0152987A1, WO 99/48527, US 2002/0141993A1, WO 01/00245, US 2003/0086924, US 2004/0013667A1, WO 00/69460, WO 01/00238, WO 01/15730, US 6.627.196 B1, US6.632.979 B1, WO 01/00244, US 2002/0090662 A1, WO 01/89566, US 2002/0064785, US 2003/0134344, WO 04/24866, US 2004/0082047, US 2003/0175845 A1, WO 03/087131, US 2003/0228663, WO 2004/008099 A2, US 2004/0106161, WO 2004/048525, US 2004/0258685 A1, US 5.985.553, US 5.747.261, US 4.935.341, US 5.401.638, US 5.604.107, WO 87/07646, WO 89/10412, WO 91/05264, EP 412.116 B1, EP 494.135 B1, US 5.824.311, EP 444.181 B1, EP 1.006.194 A2, US 2002/0155527 A1, WO 91/02062, US 5.571.894, US 5.939.531, EP 502.812 B1, WO 93/03741, EP 554.441 B1, EP 656.367 A1, US 5.288.477, US
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5.514.554, US 5.587.458, WO 93/12220, WO 93/16185, US 5.877.305, WO
93/21319, WO 93/21232, US 5.856.089, WO 94/22478, US 5.910.486,US
6.028.059, WO 96/07321, US 5.804.396, US 5.846.749, EP 711.565, WO 96/16673, US 5.783.404, US 5.977.322, US 6.512.097, WO 97/00271,US
6.270.765, US 6.395.272, US 5.837.243, WO 96/40789, US 5.783.186,US
6.458.356, WO 97/20858, WO 97/38731, US 6.214.388, US 5.925.519, WO 98/02463, US 5.922.845, WO 98/18489, WO 98/33914, US 5.994.071, WO 98/45479, US 6.358.682 B1, US 2003/0059790, WO 99/55367, WO 01/20033, US 2002/0076695 A1, WO 00/78347, WO 01/09187, WO 01/21192, WO 01/32155, WO 01/53354, WO 01/56604, WO 01/76630, WO 02/05791, WO 02/11677, US 6.582.919, US 2002/0192652 A1, US 2003/0211530 A1, WO 02/44413, US 2002/0142328, US 6.602.670 B2, WO 02/45653, WO 02/055106, US 2003/0152572, US 2003/0165840, WO 02/087619, WO 03/006509, WO 03/012072, WO 03/028638, US 2003/0068318, WO 03/041736, EP 1.357.132, US 2003/0202973, US 2004/0138160, US 5.705.157, US 6.123.939, EP 616.812 B1, US 2003/0103973, US 2003/0108545, US 6.403.630 B1, WO 00/61145, WO 00/61185, US 6.333.348 B1, WO 01/05425, WO 01/64246, US 2003/0022918, US 2002/0051785 A1, US 6.767.541, WO 01/76586, US 2003/0144252, WO 01/87336, US 2002/0031515 A1, WO 01/87334, WO 02/05791, WO 02/09754, US 2003/0157097, US 2002/0076408, WO 02/055106, WO 02/070008, WO 02/089842 e WO 03/86467.
Diagnóstico [015] Pacientes tratados com o anticorpo de HER2 trastuzumab são selecionados para terapia com base na superexpressão/amplificação de HER2. Vide, por exemplo, WO 99/31140 (Paton et al), US 2003/0170234 A1 (Hellmann, S.) e US 2003/0147884 (Paton et al); bem como WO 01/89566, US 2002/0064785 e US 2003/0134344 (Mass et al). Vide também US 2003/0152987, Cohen et al, referente à imunohistoquímica (IHC) e hibridização
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8/138 in situ por fluorescência (FISH) para a detecção da superexpressão e amplificação de HER2.
[016] WO 2004/053497 (Bacus et al) refere-se à determinação ou previsão da reação à terapia com HERCEPTIN®. US 2004/013297 A1 (Bacus et al) refere-se à determinação ou previsão da reação à terapia com anticorpo EGFR ABX0303. WO 2004/000094 (Bacus et al) refere-se à determinação da reação a GW572016, inibidor de tirosina quinase EGFRHER2 de moléculas pequenas. WO 2004/063709, Amler et al, refere-se à biomarcadores e métodos de determinação da sensibilidade a inibidor de EGFR, erlotinib HCl. US 2004/0209290, Cobleigh et al, refere-se a marcadores da expressão genética para prognóstico de câncer de mama.
[017] Pacientes tratados com pertuzumab podem ser selecionados para determinar terapia com base na ativação ou dimerização de HER. As patentes publicadas referentes à pertuzumab e à seleção de pacientes para terapia com ele incluem: WO 01/00245 (Adams et al); US 2003/0086924 (Sliwkowski, M.); US 2004/0013667A1 (Sliwkowski, M.); bem como WO 2004/008099 A2 e US 2004/0106161 (Bossenmaier et al).
[018] Cross et al, Am. J. Path. 164 (1): 35-42 (2004), descrevem a medição da expressão genética em tecidos embutidos em parafina arquivados. Ma et al, Cancer Cell 5: 607-616 (2004), descrevem a formação de perfis genéticos por microarray de oligonucleotídeos genéticos utilizando RNA isolado de seções de tecidos de tumores tomadas de biópsias primárias arquivadas.
Dosagem de Drogas Anticancerígenas e Anticorpos HER [019] Os documentos que discutem a dosagem de drogas anticancerígenas incluem: Egorin, M., J. Clin. Oncol. 2003; 21: 182-3 (2003); Baker et al, J. Natl. Cancer Inst. 94: 1883-8 (2002); Felici et al, Eur. J. Cancer 38: 1677-84 (2002); Loos et al, Clin. Cancer Res. 6: 2685-9 (2000); de Jongh et
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9/138 al, J. Clin. Oncol. 19: 3733-9 (2001); Mathijssen et al, J. Clin. Oncol. 20: 81-7 (2002); e de Jong et al, Clin. Cancer Res. 10: 4068-71 (2004).
[020] Tipicamente, anticorpos monoclonais IgG humanizados disponíveis comercialmente (ou seja, trastuzumab e bevacizumab, Genentech Inc., South San Francisco, e gemtuzumab ozogomicin, Wyeth Pharmaceuticals, Filadélfia) e drogas de moléculas pequenas citotóxicas em oncologia foram administradas em método de dosagem com base em peso (mg/kg) ou com base à área de superfície do corpo (BSA).
[021] Cetuximab (ERBITUX®) é anticorpo que se liga ao receptor EGF e é aprovado para terapia de câncer colorretal. Em câncer colorretal, 400 mg/m2 de Cetuximab são fornecidos como dose de carregamento por meio de infusão intravenosa por duas horas. Esta é seguida por doses de manutenção semanais de 250 mg/m2 administradas por uma hora. Vide informações de receituário de Cetuximab.
[022] Trastuzumab (HERCEPTIN®) é administrado à pacientes com câncer de mama metastático na forma de dose de carregamento de 4 mg/kg, seguida por doses semanais de 2 mg/kg. Vide informações de receituário de trastuzumab.
[023] Vide também WO 99/31140; US 2003/0147884 A1; US 2003/0170234 A1; US 2005/0002928 A1; WO 00/69460; WO 01/15730 e US 6.627.196 B1 com referência à dosagem de trastuzumab.
[024] Pertuzumab (também conhecido como anticorpo monoclonal humano recombinante 2C4; OMNITARG®, Genentech, Inc., South San Francisco) representa o primeiro de uma nova classe de agentes conhecidos como inibidores da dimerização de HER (HDI) e funciona para inibir a capacidade de HER2 de formar heterodímeros ativos com outros receptores de HER (tais como EGFR/HER1, HER3 e HER4) e é ativo independentemente dos níveis de expressão de HER2. Vide, por exemplo, Harari e Yarden,
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Oncogene 19: 6102-14 (2000); Yarden e Sliwkowski, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 127-37 (2001); Sliwkowski, Nat. Struct. Biol. 10: 158-9 (2003); Cho et al, Nature 421: 756-60 (2003); e Malik et al, Pro. Am. Soc. Cancer Res. 44: 176-7 (2003).
[025] Demonstrou-se que o bloqueio por pertuzumab da formação de heterodímeros HER2-HER3 em células tumorosas inibe a sinalização de células críticas, o que resulta na redução da proliferação e sobrevivência do tumor (Agus et al, Cancer Cell 2:127-37 (2002)).
[026] Pertuzumab passou por testes como agente isolado na clínica com teste de fase Ia em pacientes com câncer avançado e testes de fase II em pacientes com câncer do ovário e câncer de mama, bem como câncer do pulmão e de próstata. Em estudo de Fase I, pacientes com tumores sólidos incuráveis, localmente avançados, recorrentes ou metastáticos que haviam progredido durante ou após a terapia padrão foram tratados com pertuzumab administrado por via intravenosa a cada três semanas. Pertuzumab foi geralmente bem tolerado. A regressão do tumor foi atingida em três dentre vinte pacientes avaliáveis para reação. Dois pacientes haviam confirmado reações parciais. Doença estável duradoura por mais de 2,5 meses foi observada em seis dentre 21 pacientes (Agus et al, Pro. Am. Soc. Clin. Oncol. 22: 192 (2003)). Em doses de 2,0 a 15 mg/kg, a farmacocinética de pertuzumab era linear, liberação média variou de 2,69 a 3,74 ml/dia/kg e a meia-vida de eliminação terminal média variou de 15,3 a 27,6 dias. Não foram detectados anticorpos para pertuzumab (Allison et al, Pro. Am. Soc. Clin. Oncol. 22: 197 (2003)). Pertuzumab foi dosado com base em peso (mg/kg) no teste de Fase I. Os testes de Fase II foram iniciados utilizando dose fixa.
Descrição Resumida da Invenção [027] A presente invenção fornece a primeira determinação crítica do impacto e utilidade de dosagem fixa de anticorpo monoclonal IgG1 humanizado sobre farmacocinética e concentrações de droga alvo. Os
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11/138 principais objetivos desta análise do anticorpo HER pertuzumab foram: 1) avaliar a farmacocinética da população e covariados de previsão para pertuzumab em pacientes com câncer; e 2) examinar a variabilidade de concentrações de vale em estado estável e exposições após dosagem com base na área da superfície do corpo (BSA), peso do corpo ou fixa.
[028] Conseqüentemente, em primeiro aspecto, a presente invenção fornece método de tratamento de câncer que compreende a administração de uma ou mais doses fixas de um anticorpo HER a um paciente humano em uma quantidade eficaz para tratamento do câncer.
[029] Em outro aspecto, a presente invenção fornece método de tratamento de câncer em um paciente humano, que compreende a administração de pelo menos uma dose fixa de pertuzumab ao paciente, em que a dose fixa é selecionada a partir do grupo que consiste de cerca de 420 mg, cerca de 525 mg, cerca de 840 mg e cerca de 1050 mg de pertuzumab.
[030] A presente invenção também se refere a artigo industrializado que compreende uma ampola que contém uma dose fixa de um anticorpo HER, em que a dose fixa é selecionada a partir do grupo que consiste de cerca de 420 mg, cerca de 525 mg, cerca de 840 mg e cerca de 1050 mg do anticorpo HER.
Breve Descrição das Figuras [031] A Figura 1 fornece esquema da estrutura da proteína HER2 e seqüências de aminoácidos para os Domínios I a IV (SEQ ID NO: 19 a 22, respectivamente) do seu domínio extracelular.
[032] As Figuras 2A e 2B ilustram alinhamentos das seqüências de aminoácidos dos domínios leve variável (VL) (Fig. 2A) e pesado variável (VH) (Fig. 2B) de anticorpo monoclonal murino 2C4 (SEQ ID NO: 1 e 2, respectivamente); domínios Vl e Vh de 2C4 humanizado versão 574 (SEQ ID NO: 3 e 4, respectivamente) e estruturas consenso de VL e VH humana (hum
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12/138 κ1, subgrupo kappa leve I; humlII, subgrupo pesado III) (SEQ ID NO: 5 e 6, respectivamente). Os asteriscos identificam diferenças entre 2C4 humanizado versão 574 e anticorpo monoclonal murino 2C4 ou entre 2C4 humanizado versão 574 e a estrutura humana. As Regiões de Determinação de Complementaridade (CDRs) encontram-se entre parênteses.
[033] As Figuras 3A e 3B exibem as seqüências de aminoácidos da cadeia leve e cadeia pesada de pertuzumab (SEQ ID NO: 13 e 14, respectivamente). As CDRs são exibidas em negrito. A massa molecular calculada da cadeia leve e cadeia pesada são de 23.526,22 Da e 49.216,56 Da (cisteínas em forma reduzida). A porção carboidrato é ligada a Asn 299 da cadeia pesada.
[034] A Figura 4 ilustra esquematicamente a ligação de 2C4 no sítio de ligação heterodimérico de HER2, de forma a evitar a heterodimerização com EGFR ou HER3 ativado.
[035] A Figura 5 ilustra o acoplamento de HER2/HER3 aos processos de MAPK e Akt.
[036] A Figura 6 compara várias atividades de trastuzumab e pertuzumab.
[037] As Figuras 7A e 7B exibem as seqüências de aminoácidos da cadeia leve (Fig. 7A; SEQ ID N° 15) e cadeia pesada (Fig. 7B; SEQ ID N° 16) de trastuzumab, respectivamente.
[038] As Figuras 8A e 8B ilustram seqüência de cadeia leve variável do pertuzumab (Fig. 8A; SEQ ID N° 17) e seqüência de cadeia pesada variável do pertuzumab (Fig. 8B; SEQ ID N° 18), respectivamente.
[039] As Figuras 9A e 9B são perfis representativos de dados PK de um único paciente encaixados em modelo de um (Fig. 9A) ou dois (Fig. 9B) compartimentos. Os círculos abertos indicam a concentração observada. Linhas sólidas e pontilhadas indicam a população prevista e a concentração prevista individual, respectivamente.
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13/138 [040] As Figuras 10A e 10B representam modelos de plotagens de diagnóstico. A Fig. 10A ilustra concentrações de pertuzumab observadas vs. previstas. A linha sólida é a linha de unidade. A Fig. 10B ilustra residuais pesados vs. concentrações de pertuzumab previstas. A linha tracejada é suavização de dados LOESS.
[041] As Figuras 11A e 11B ilustram o efeito aleatório (η) para liberação (CL) em peso (WT) e volume no compartimento central (Vc) por área da superfície do corpo (BSA) para o modelo base (Fig. 11A e o modelo final (Fig. 11B).
[042] As Figuras 12A a F exibem modelo de avaliação de modelo farmacocinético da população final de pertuzumab utilizando modelo de verificação posterior. Distribuição prevista posterior e valores observados para as estatísticas de teste: Fig. 12A - 2,5°; Fig. 12B - 5°; Fig. 12C - 50°; Fig. 12D - 90°; Fig. 12E - 95°; Fig. 12F - 97,5°. A linha vertical sobre cada histograma representa o valor observado da estatística de teste.
[043] A Figura 13 ilustra a concentração de vale em estado estável de pertuzumab prevista (Dia 84) após dosagem com base em BSA, peso (WT) ou fixa para mil pacientes simulados retirados do conjunto de dados farmacocinéticos (PK) original de acordo com o modelo final.
[044] As Figuras 14A e 14B exibem a concentração de vale em estado estável de pertuzumab prevista (Dia 84) após dose com base em BSA, peso (WT) ou fixa para populações de pacientes com valores WT < 10° (50,4 kg) (Fig. 14A) ou > 90° (88,5 kg) (Fig. 14B).
Descrição Detalhada da Invenção
I. Definições [045] Dose “fixa” ou “plana” de agente terapêutico na presente invenção indica a dose que é administrada a pacientes humanos sem considerar o peso (WT) ou a área de superfície do corpo (BSA) do paciente. A
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14/138 dose fixa ou plana, portanto, não é fornecida na forma de dose em mg/kg ou dose em mg/m2, mas sim como quantidade absoluta do agente terapêutico.
[046] Dose de “carregamento” na presente invenção compreende, de forma geral, dose inicial de agente terapêutico administrada à paciente e é seguida por uma ou mais de suas doses de manutenção. Geralmente, é administrada uma única dose de carregamento, mas diversas doses de carregamento são contempladas na presente invenção. Normalmente, a quantidade de dose(s) de carregamento administrada(s) excede a quantidade da(s) dose(s) de manutenção administrada(s) e/ou a(s) dose(s) de carregamento é(são) administrada(s) mais freqüentemente que a(s) dose(s) de manutenção, de forma a atingir a concentração em estado estável desejada do agente terapêutico mais cedo que pode ser atingida com a(s) dose(s) de manutenção.
[047] Dose de “manutenção” na presente invenção indica uma ou mais doses de agente terapêutico administradas ao paciente ao longo de período de tratamento. Normalmente, as doses de manutenção são administradas em intervalos de tratamento espaçados, tais como aproximadamente a cada semana, a cada cerca de duas semanas, a cada cerca de três semanas ou a cada cerca de quatro semanas.
[048] “Receptor de HER” é proteína receptora tirosina quinase que pertence à família de receptores de HER e inclui receptores de EGFR, HER2, HER3 e HER4. O receptor de HER geralmente compreenderá domínio extracelular, que pode ligar ligante de HER e/ou dimerizar-se com outra molécula receptora de HER; domínio de transmembrana lipofílica; domínio de tirosina quinase intracelular conservado; e domínio de sinalização carboxilterminal que abriga vários resíduos de tirosina que podem ser fosforilados. O receptor de HER pode ser receptor de HER de “seqüência nativa” ou sua
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15/138 “variante de seqüência de aminoácidos”. Preferencialmente, o receptor de HER é receptor de HER humano de seqüência nativa.
[049] As expressões “ErbBI”, “HER1”, “receptor de fator de crescimento epidérmico” e “EGFR” são utilizadas de forma intercambiável na presente invenção e designam EGFR conforme descrito, por exemplo, em Carpenter et al, Ann. Rev. Biochem. 56: 881-914 (1987), incluindo suas formas mutantes de ocorrência natural (tais como EGFR mutante de exclusão como em Humphrey et al, PNAS (U. S. A.) 87: 4207-4211 (1990)). erbB1 designa o gene que codifica o produto de proteína EGFR.
[050] As expressões “ErbB2” e “HER2” são utilizadas de forma intercambiável na presente invenção e designam a proteína HER2 humana descrita, por exemplo, em Semba et al, PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) e Yamamoto et al, Nature 319: 230-234 (1986) (acesso Genebank n° X03363). O termo “erbB2” designa o gene que codifica ErbB2 humano e “neu” designa o gene que codifica p185neu de rato. HER2 preferido é HER2 humano de seqüência nativa.
[051] O domínio extracelular de HER2 compreende quatro domínios: Domínio I (resíduos de aminoácidos de cerca de 1 a 195; SEQ ID NO: 19), Domínio II (resíduos de aminoácidos de cerca de 196 a 319; SEQ ID NO: 20), Domínio III (resíduos de aminoácidos de cerca de 320 a 488; SEQ ID NO: 21) e Domínio IV (resíduos de aminoácidos de cerca de 489 a 630; SEQ ID NO: 22) (numeração de resíduos sem peptídeo de sinal). Vide Garrett et al, Mol. Cell. 11: 495-505 (2003), Cho et al, Nature 421: 756-760 (2003), Franklin et al, Cancer Cell 5: 317-328 (2004) e Plowman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1746-1750 (1993), bem como a Fig. 1 da presente invenção.
[052] “ErbB3” e “HER3” designam o polipeptídeo receptor conforme descrito, por exemplo, nas Patentes US 5.183.884 e US 5.480.968, bem como Kraus et al, PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989).
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16/138 [053] As expressões “ErbB4” e “HER4” designam na presente invenção o polipeptídeo receptor conforme descrito, por exemplo, no Pedido de Patente EP 599.274; Plowman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 17461750 (1993); e Plowman et al, Nature, 366: 473-475 (1993), incluindo suas isoformas, por exemplo, conforme descrito em WO 99/19488, publicada em 22 de abril de 1999.
[054] “Ligante de HER” indica polipeptídeo que se liga ao receptor de HER e/ou o ativa. O ligante de HER de interesse específico na presente invenção é ligante HER humano de seqüência nativa, tal como fator de crescimento epidérmico (EGF) (Savage et al, J. Biol. Chem. 247: 7612-7621 (1972)); fator de crescimento transformante alfa (TGF-a) (Marquardt et al, Science 223: 1079-1082 (1984)); anfirregulina, também conhecida como schwanoma ou fator de crescimento autócrinos de queratinócitos (Shoyab et al, Science 243: 1074-1076 (1989); Kimura et al, Nature 348: 257-260 (1990); e Cook et al, Mol. Cell. Biol. 11: 2547-2557 (1991)); betacelulin (Shing et al, Science 259: 1604-1607 (1993); e Sasada et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 190: 1173 (1993)); fator de crescimento epidérmico de ligação da heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al, Science 251: 936-939 (1991)); epirregulina (Toyoda et al, J. Biol. Chem. 270: 7495-7500 (1995); e Komurasaki et al, Oncogene 15: 2841-2848 (1997)); herregulina (vide abaixo); neurregulina2 (NRG-2) (Carraway et al, Nature 387: 512-516 (1997)); neurregulina-3 (NRG3) (Zhang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9562-9567 (1997)); neurregulina-4 (NRG-4) (Harari et al, Oncogene 18: 2681-89 (1999)) e cripto (CR-1) (Kannan et al, J. Biol. Chem. 272 (6): 3330-3335 (1997)). Ligantes de HER que ligam EGFR incluem EGF, TGF -a, anfirregulina, betacelulina, HB-EGF e epirregulina. Ligantes de HER que ligam HER3 incluem herregulinas. Ligantes de HER capazes de ligar HER4 incluem betacelulina, epirregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 e herregulinas.
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17/138 [055] “Herregulina” (HRG), quando utilizada na presente invenção, designa polipeptídeo codificado pelo produto genético de herregulina conforme descrito na Patente US 5.641.869 ou Marchionni et al, Nature, 362: 312-318 (1993). Exemplos de herregulinas incluem herregulina-α, herregulinaβ1, herregulina-32 e herregulina-33 (Holmes et al, Science, 256: 1205-1210 (1992); e Patente US 5.641.869); fator de diferenciação neu (NDF) (Peles et al, Cell 69: 205-216 (1992)); atividade indutora de receptor de acetilcolina (ARIA) (Falls et al, Cell 72: 801-815 (1993)); fatores de crescimento glial (GGFs) (Marchionni et al, Nature, 362: 312-318 (1993)); fator derivado de neurônios motores e sensoriais (SMDF) (Ho et al, J. Biol. Chem. 270: 14523-14532 (1995)); γ-herregulina (Schaefer et al, Oncogene 15: 1385-1394 (1997).
[056] “Dímero de HER” na presente invenção é dímero associado de forma não covalente que compreende pelo menos dois receptores de HER. Estes complexos podem formar-se quando uma célula que expressa dois ou mais receptores de HER é exposta a ligante de HER e pode ser isolada por imunoprecipitação e analisada por meio de SDS-PAGE conforme descrito, por exemplo, em Sliwkowski et al, J. Biol. Chem., 269 (20): 14661-14665 (1994). Exemplos desses dímeros de HER incluem heterodímeros EGFR-HER2, HER2-HER3 e HER3-HER4. Além disso, o dímero HER pode compreender dois ou mais receptores de HER2 combinados com receptor de HER diferente, tal como HER3, HER4 ou EGFR. Outras proteínas, tais como subunidade receptora de citocinas (como gp130) pode ser associada ao dímero.
[057] “Inibidor de HER” é agente que interfere com a ativação ou função de HER. Exemplos de inibidores de HER incluem anticorpos de HER (tais como anticorpos EGFR, HER2, HER3 ou HER4); drogas dirigidas a EGFR; antagonistas de HER de moléculas pequenas; inibidores da tirosina quinase de HER; inibidores da tirosina quinase dupla de HER2 e EGFR, tais
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18/138 como lapatinib/GW572016; moléculas antisenso (vide, por exemplo, WO 2004/87207); e/ou agentes que se ligam a moléculas de sinalização abaixo no fluxo ou interferem com a sua função, tais como MAPK ou Akt (vide Fig. 5). Preferencialmente, o inibidor de HER é anticorpo ou molécula pequena que se liga ao receptor HER.
[058] “Anticorpo HER” é anticorpo que se liga ao receptor de HER. O anticorpo HER opcionalmente interfere ainda com a ativação ou função de HER. Preferencialmente, o anticorpo HER liga-se ao receptor de HER2. Anticorpo HER2 de interesse específico na presente invenção é pertuzumab. Outro exemplo de anticorpo HER2 é trastuzumab. Exemplos de anticorpos EGFR incluem Cetuximab e ABX0303.
[059] “Ativação de HER” designa a ativação, ou fosforilação, de qualquer um ou mais receptores de HER. Geralmente, a ativação de HER resulta em transdução de sinais (tal como a causada por domínio de quinase intracelular de resíduos de tirosina fosforilantes receptores de HER no receptor de HER ou substrato de polipeptídeo). A ativação de HER pode ser mediada pela ligação de ligantes HER a um dímero de HER que compreende o receptor de HER de interesse. A ligação de ligante HER a dímero de HER pode ativar domínio de quinase de um ou mais dos receptores de HER no dímero e, desta forma, resulta em fosforilação de resíduos de tirosina em um ou mais dos receptores de HER e/ou fosforilação de resíduos de tirosina em polipeptídeo(s) substrato(s) adicional(is), tal(is) como quinases intracelulares de Akt ou MAPK. Vide a Fig. 5, por exemplo.
[060] “Fosforilação” designa a adição de um ou mais grupos fosfato a proteína, tal como receptor de HER, ou seu substrato.
[061] Anticorpo que “inibe a dimerização de HER” é anticorpo que inibe a formação de dímero de HER ou com ela interfere. Preferencialmente, esse anticorpo liga-se a HER2 no seu sítio de ligação heterodimérico. O anticorpo de dimerização de maior preferência na presente
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19/138 invenção é pertuzumab ou MAb 2C4. A ligação de 2C4 ao sítio de ligação heterodimérico de HER2 é ilustrada na Fig. 4. Outros exemplos de anticorpos que inibem a dimerização de HER incluem anticorpos que se ligam a EGFR e inibem a sua dimerização com um ou mais receptores de HER diferentes (tais como anticorpo monoclonal EGFR 806, MAb 806, que se liga ao EGFR ativado ou “não amarrado”; vide Johns et al, J. Biol. Chem. 279 (29): 30375-30384 (2004)); anticorpos que se ligam a HER3 e inibem a sua dimerização com um ou mais receptores de HER diferentes; e anticorpos que se ligam a HER4 e inibem a sua dimerização com um ou mais receptores de HER diferentes.
[062] Anticorpo que “inibe a dimerização de HER mais eficientemente que trastuzumab” é aquele que reduz ou elimina dímeros de HER mais eficientemente (tal como pelo menos cerca de duas vezes mais eficientemente) que trastuzumab. Preferencialmente, esse anticorpo inibe a dimerização de HER2 de forma pelo menos aproximadamente tão eficiente quanto anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste de anticorpo monoclonal murino 2C4, fragmento Fab de anticorpo monoclonal murino 2C4, pertuzumab, e fragmento Fab de pertuzumab. Pode-se avaliar a inibição da dimerização de HER estudando dímeros de HER diretamente, ou avaliando a ativação de HER, ou sinalização abaixo no fluxo, que resulta da dimerização de HER e/ou por meio de avaliação do sítio de ligação de HER2-anticorpo etc. Testes de seleção de anticorpos com a capacidade de inibir a dimerização de HER mais eficientemente que trastuzumab são descritos em Agus et al, Cancer Cell 2: 127-137 (2002) e WO 01/00245 (Adams et al). Unicamente como forma de exemplo, pode-se testar a inibição da dimerização de HER determinandose, por exemplo, a inibição da formação de dímeros de HER (vide, por exemplo, a Fig. 1A-B de Agus et al, Cancer Cell 2: 127-137 (2002); e WO 01/00245); redução da ativação por ligante HER de células que expressam dímeros de HER (WO 01/00245 e Fig. 2A-B de Agus et al, Cancer Cell 2: 127
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137 (2002), por exemplo); bloqueio da ligação de ligante HER a células que expressam dímeros de HER (WO 01/00245 e Fig. 2E de Agus et al, Cancer Cell 2: 127-137 (2002), por exemplo); inibição do crescimento celular de células cancerosas (tais como células MCF7, MDA-MD-134, ZR-75-1, MD-MB-175, T47D) que expressam dímeros de HER na presença (ou ausência) de ligante de HER (WO 01/00245 e Figs. 3A-D de Agus et al, Cancer Cell 2: 127-37 (2002), por exemplo); inibição da sinalização abaixo no fluxo (tal como inibição da fosforilação de AKT dependente de HRG ou inibição da fosforilação de MAPK dependente de HRG ou TGFa) (vide WO 01/00245 e Fig. 2C-D de Agus et al, Cancer Cell 2: 127-137 (2002), por exemplo). Pode-se também determinar se o anticorpo inibe a dimerização de HER por meio de estudo do sítio de ligação de anticorpo e HER2, tal como por meio de avaliação de estrutura ou modelo, como estrutura de cristal, do anticorpo ligado a HER2 (vide, por exemplo, Franklin et al, Cancer Cell 5: 317-328 (2004)).
[063] “Sítio de ligação heterodimérica” sobre HER2 designa região no domínio extracelular de HER2 que entra em contato ou forma interface com região no domínio extracelular de EGFR, HER3 ou HER4 mediante a formação de dímero com ele. A região é encontrada no Domínio II de HER2. Franklin et al, Cancer Cell 5: 317-328 (2004).
[064] O anticorpo HER2 pode “inibir a fosforilação de AKT dependente de HRG” e/ou inibir “fosforilação de MARK dependente de HRG ou TGFa” mais eficientemente (tal como pelo menos duas vezes mais eficientemente) que trastuzumab (vide Agus et al, Cancer Cell 2: 127-137 (2002) e WO 01/00245, por exemplo).
[065] O anticorpo HER2 pode ser aquele que “não inibe a divisão de ectodomínio de HER2” (Molina et al, Cancer Res. 61: 47444749(2001)).
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21/138 [066] Anticorpo HER2 que “se liga ao sítio de ligação heterodimérico” de HER2 liga-se a resíduos no domínio II (e, opcionalmente, também se liga a resíduos em outro dos domínios do domínio extracelular de HER2, tais como domínios I e III) e pode obstruir estericamente, pelo menos até certo ponto, a formação de heterodímero HER2-EGFR, HER2-HER3 ou HER2-HER4. Franklin et al, Cancer Cell 5: 317-328 (2004), caracterizam a estrutura de cristal de HER2-pertuzumab, depositada no Banco de Dados de Proteínas RCSB (Código ID IS78), que ilustra exemplo de anticorpo que se liga ao sítio de ligação heterodimérico de HER2.
[067] Anticorpo que “se liga ao domínio II” de HER2 liga-se a resíduos no domínio II e, opcionalmente, resíduos em outro(s) domínio(s) de HER2, tal(is) como domínios I e III. Preferencialmente, o anticorpo que se liga ao domínio II liga-se à junção entre os domínios I, II e III de HER2.
[068] Polipeptídeo de “seqüência nativa” é aquele que contém a mesma seqüência de aminoácidos de polipeptídeo (tal como receptor de HER ou ligante de HER) derivado da natureza. Esses polipeptídeos de seqüência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios sintéticos ou recombinantes. Desta forma, um polipeptídeo de seqüência nativa pode conter a seqüência de aminoácidos de polipeptídeo humano de ocorrência natural, polipeptídeo murino ou polipeptídeo de qualquer outra espécie de mamífero.
[069] O termo “anticorpo” é utilizado na presente invenção no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (tais como anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada.
[070] A expressão “anticorpo monoclonal”, da forma utilizada na presente invenção, designa anticorpo obtido a partir de população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais
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22/138 que compreendem a população são idênticos e/ou ligam o(s) mesmo(s) epítopo(s), exceto por possíveis variantes que podem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal, em que essas variantes estão geralmente presentes em quantidades menores. Esse anticorpo monoclonal inclui tipicamente anticorpo que compreende seqüência de polipeptídeos que se liga ao alvo, em que a seqüência de polipeptídeos de ligação de alvos foi obtida por meio de processo que inclui a seleção de uma única seqüência de polipeptídeos de ligação alvo a partir de uma série de seqüências de polipeptídeos. O processo de seleção pode ser, por exemplo, a seleção de um único clone a partir de uma série de clones, tal como conjunto de clones de hibridoma, clones de fagos ou clones de DNA recombinante. Dever-se-á compreender que a seqüência de ligação alvo selecionada pode ser adicionalmente alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade para o alvo, para humanizar a seqüência de ligação alvo, para aumentar a sua produção em cultura celular, para reduzir a sua imunogenicidade in vivo, para criar anticorpo multiespecífico etc., e que anticorpo que compreende a seqüência de ligação alvo alterada também é anticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção. Ao contrário das preparações de anticorpos policlonais que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos a diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de preparação de anticorpos monoclonais é dirigido a um único determinante sobre antígeno. Além da sua especificidade, as preparações de anticorpos monoclonais são vantajosas por tipicamente não serem descontaminadas por outras imunoglobulinas. O adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser considerado como exigindo a produção do anticorpo por meio de qualquer método específico. Os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser preparados, por exemplo, por meio de
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23/138 uma série de métodos, que incluem, por exemplo, o método de hibridoma (tal como em Kohler et al, Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, segunda edição, 1988); Hammerling et al, em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, NY, 1981)), métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, a Patente US 4.816.567), tecnologias de exibição de fagos (vide, por exemplo, Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991); Sidhu et al, J. Mol. Biol. 338 (2): 299-310 (2004); Lee et al, J. Mol. Biol. 340 (5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 101 (34): 12467-12472 (2004); e Lee et al, J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004), e tecnologias de produção de anticorpos humanos ou similares a humanos em animais que possuem todos ou parte dos sítios de imunoglobulina humana ou genes que codificam seqüências de imunoglobulina humana (vide, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al, Year in Immuno., 7: 33 (1993); Patentes US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.591.669 (todas da GenPharm); Patente US 5.545.807, WO 1997/17852; Patentes US 5.545.807, US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.661.016, e em Marks et al, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al, Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812813 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).
[071] Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluem especificamente anticorpos “quiméricos”, nos quais uma parte da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe
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24/138 ou subclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências correspondentes de anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente US 4.816.567; e Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81: 6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse na presente invenção incluem anticorpos “primatizados”, que compreendem seqüências de ligação de antígenos de domínio variável derivadas de primatas não humanos (por exemplo, Macaco do Velho Mundo, Chimpanzé, etc.) e seqüências de regiões constantes humanas.
[072] “Fragmentos de anticorpos” compreendem uma parte de anticorpo intacto, que compreende preferencialmente a sua região de ligação de antígenos. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de fita simples e anticorpos multiespecíficos formados com fragmento(s) de anticorpo(s).
[073] “Anticorpo intacto” na presente invenção é aquele que compreende duas regiões de ligação de antígenos e região Fc. Preferencialmente, o anticorpo intacto possui uma ou mais funções efetoras.
[074] Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, anticorpos intactos podem ser atribuídos a “classes” diferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser adicionalmente divididas em “subclasses” (isotipos), tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de anticorpos são denominados α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
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25/138 [075] “Funções efetoras” de anticorpos designam as atividades biológicas que podem ser atribuídas à região Fc (região Fc de seqüência nativa ou região Fc com variação de seqüência de aminoácidos) de anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem ligação de C1q, citotoxicidade dependente de complemento, ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulagem para baixo de receptores da superfície celular (tais como receptor de células B; BCR) etc.
[076] “Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos” e “ADCC” designam reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores de Fc (FcRs) (tais como células Matadoras Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado sobre célula alvo e causam em seguida a lise da célula alvo. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FcyRIII, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3, pág. 464, de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para determinar a atividade de ADCC de molécula de interesse, pode-se realizar teste de ADCC in vitro, tal como descrito na Patente US 5.500.362 ou US 5.821.337. Células efetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em modelo animal como o descrito em Clynes et al, PNAS (U. S. A.) 95: 652-656 (1998).
[077] “Células efetoras humanas” são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e realizam função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células
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26/138 mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC), células matadoras naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; em que PBMCs e células NK são preferidas. As células efetoras podem ser isoladas a partir de fonte nativa, tal como sangue ou PMBCs, conforme descrito na presente invenção.
[078] As expressões “receptor de Fc” ou “FcR” são utilizadas para descrever receptor que se liga à região Fc de anticorpo. O FcR preferido é FcR humano de seqüência nativa. Além disso, FcR preferido é aquele que se liga ao anticorpo de IgG (receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (“receptor de ativação”) e FcyRIIB (“receptor de inibição”), que possuem seqüências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcyRIIA contém motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM) no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém motivo de inibição com base em tirosina imunorreceptora (ITIM) no seu domínio citoplasmático (vide análise M. em Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcRs são analisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126: 33041 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo “FcR” na presente invenção. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al, J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al, J. Immunol. 24: 249 (1994)) e regula a homeostase de imunoglobulinas.
[079] “Citotoxicidade dependente de complemento” ou “CDC” designa a capacidade de uma molécula de lisar alvo na presença de complemento. O processo de ativação de complementos é iniciado pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a uma molécula (tal
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27/138 como anticorpo) em complexo com antígeno cognato. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado teste de CDC, conforme descrito, por exemplo, em Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
[080] “Anticorpos nativos” são normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por ligação de dissulfeto covalente, enquanto a quantidade de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia leve e pesada também contém pontes de dissulfeto intracadeias em espaços regulares. Cada cadeia pesada contém, em uma extremidade, domínio variável (VH) seguido por uma série de domínios constantes. Cada cadeia leve contém um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade. O domínio constante da cadeia leve é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve é alinhado ao domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formem superfície intermediária entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada.
[081] O termo “variável” indica o fato de que certas partes dos domínios variáveis diferem extensamente de seqüência entre os anticorpos e são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para o seu antígeno específico. A capacidade de variação não é, entretanto, distribuída regularmente ao longo de todos os domínios variáveis de anticorpos. Ela é concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis de cadeia leve quanto de cadeia pesada. As partes mais altamente conservadas de domínios variáveis são denominadas regiões de estrutura (FRs). Os domínios variáveis de cadeias leve e pesada nativas compreendem quatro FRs cada um, que adotam em
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28/138 grande parte configuração de folha β, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam laços que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha β. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígenos de anticorpos (vide Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de anticorpo a antígeno, mas exibem diversas funções efetoras, tais como a participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
[082] A expressão “região hipervariável”, da forma utilizada na presente invenção, designa os resíduos de aminoácidos de anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígenos. A região hipervariável compreende geralmente resíduos de aminoácidos de “região de determinação de complementaridade” ou “CDR” (por exemplo, resíduos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)) e/ou os resíduos de “circuito hipervariável” (tais como os resíduos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Resíduos de “região de estrutura” ou “FR” são os resíduos de domínios variáveis diferentes dos resíduos de região hipervariável conforme definido na presente invenção.
[083] A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos de ligação de antígenos idênticos, denominados fragmentos “Fab”,
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29/138 cada qual com um único sítio de ligação de antígenos, e um fragmento “Fc” residual, cujo nome reflete a sua capacidade de rápida cristalização. O tratamento com pepsina gera fragmento F(ab')2 que contém dois sítios de ligação de antígenos e ainda é capaz de reticular antígeno.
[084] “Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de reconhecimento e de ligação de antígenos completo. Esta região consiste de dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em associação firme e não covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígenos sobre a superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antígenos ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável isolado (ou a metade de um Fv que compreende apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno) possui a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora em afinidade mais baixa que o sítio de ligação completo.
[085] O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carbóxi do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a denominação da presente invenção para Fab', em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contém(êm) pelo menos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpos F(ab')2 foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos Fab' que contêm cisteínas de articulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.
[086] As “cadeias leves” de anticorpos de qualquer espécie vertebrada podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramente distintos,
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30/138 denominados kappa (κ) e lambda (λ), com base nas seqüências de aminoácidos dos seus domínios constantes.
[087] Fragmentos de anticorpos “Fv de fita simples” ou “scFv” compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferencialmente, o polipeptídeo Fv compreende adicionalmente um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação de antígenos. Para análise de scFv, vide Plückthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994). Fragmentos scFv de anticorpo HER2 são descritos em WO 93/16185; Patente US 5.571.894; e Patente US 5.587.458.
[088] O termo “diacorpos” designa pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação de antígenos, que compreendem um domínio pesado variável (VH) conectado a um domínio leve variável (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH - VL). Utilizando um ligante que é curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a se parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígenos. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404.097, WO 93/11161 e Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 6444-6448 (1993).
[089] As formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de região hipervariável do paciente são substituídos por resíduos de região hipervariável de espécie não humana
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31/138 (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem aos de imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
[090] Os anticorpos HER2 humanizados incluem huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 ou trastuzumab (HERCEPTIN®), conforme descrito na Tabela 3 da Patente US 5.821.337, expressamente incorporada a presente invenção como referência; anticorpos 520C9 humanizados (WO 93/21319) e 2C4 humanizados, conforme descrito na presente invenção.
[091] Para os propósitos da presente invenção, “trastuzumab”, “HERCEPTIN®’ e “huMAb4D5-8” designam anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidos de cadeia leve e pesada de SEQ ID N° 15 e 16, respectivamente.
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32/138 [092] Na presente invenção, “pertuzumab” e “OMNITARG®” designam anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidos de cadeia leve e pesada de SEQ ID N° 13 e 14, respectivamente.
[093] As diferenças entre as funções de trastuzumab e pertuzumab são ilustradas na Fig. 6.
[094] “Anticorpo nu” é anticorpo que não é conjugado a molécula heteróloga, tal como porção citotóxica ou radiomarcadores.
[095] Anticorpo “isolado” é aquele que tenha sido identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações em diagnóstico ou terapêuticas para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo, conforme determinado por meio do método de Lowry, e, de maior preferência, mais de 99% em peso; (2) até grau suficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos de seqüência de aminoácidos interna ou N-terminal, utilizando seqüenciador de xícara de centrifugação; ou (3) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, manchas de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado por meio de pelo menos uma etapa de purificação.
[096] Anticorpo “amadurecido por afinidade” é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais de suas regiões hipervariáveis, o que resulta em aumento da afinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com anticorpo parental que não possui essa(s) alteração(ões). Os anticorpos amadurecidos por afinidade preferidos possuirão afinidades nanomolares ou até
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33/138 picomolares para o antígeno alvo. Os anticorpos amadurecidos por afinidade são produzidos por meio de procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992) descrevem amadurecimento por afinidade por meio de troca de domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de cadeia principal e/ou CDR é descrita por: Barbas et al, Proc. Natl. Acad. Sci, U.
S. A. 91: 3809-3813 (1994); Schier et al, Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al, J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al, J. Immunol. 154 (7): 3310-9 (1995); e Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992).
[097] A expressão “anticorpo de espécie principal” na presente invenção indica a estrutura de anticorpos em composição que é a molécula de anticorpo quantitativamente predominante na composição. Em uma realização, a espécie de anticorpo principal é anticorpo HER2, tal como anticorpo que se liga ao Domínio II de HER2, anticorpo que inibe a dimerização de HER mais eficientemente que trastuzumab, e/ou anticorpo que se liga ao sítio de ligação heterodimérica de HER2. A realização preferida na presente invenção da espécie de anticorpo principal é aquela que compreende as seqüências de aminoácidos leve variável e pesada variável de SEQ ID NO: 3 e 4 e, de preferência superior, que compreende a seqüência de aminoácidos de cadeia leve e de cadeia pesada de SEQ ID N° 13 e 14 (pertuzumab).
[098] Anticorpo “variante de seqüência de aminoácidos” na presente invenção é anticorpo com seqüência de aminoácidos que difere de anticorpo de espécie principal. Normalmente, variantes de seqüências de aminoácidos possuirão pelo menos cerca de 70% de homologia com o anticorpo de espécie principal; preferencialmente, eles serão pelo menos cerca de 80% e, de maior preferência, pelo menos cerca de 90% homólogos ao anticorpo de espécie principal. As variantes de seqüências de aminoácidos possuem substituições, exclusões e/ou adições em certas posições na seqüência de aminoácidos da espécie de anticorpo principal ou adjacentes a
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34/138 ela. Exemplos de variantes de seqüências de aminoácidos na presente invenção incluem variante ácida (tal como variante de anticorpo desamidado), variante básica, anticorpo com extensão líder amino-terminal (tal como VHS-) sobre uma ou duas de suas cadeias leves, anticorpo com resíduo de lisina Cterminal sobre uma ou duas de suas cadeias pesadas etc. e inclui combinações de variações para as seqüências de aminoácidos de cadeias leve e/ou pesada. A variante de anticorpo de interesse específico na presente invenção é o anticorpo que compreende extensão líder amino-terminal sobre uma ou duas de suas cadeias leves, que opcionalmente também compreende outras diferenças de glicosilação e/ou seqüência de aminoácidos relativas ao anticorpo da espécie principal.
[099] Anticorpo “variante de glicosilação” na presente invenção é anticorpo com uma ou mais porções carboidrato a ele ligadas que diferem de uma ou mais porções carboidrato ligadas a anticorpo de espécie principal. Exemplos de variantes de glicosilação na presente invenção incluem anticorpo com estrutura de oligossacarídeo G1 ou G2, em vez de estrutura de oligossacarídeo G0, ligado a sua região Fc, anticorpo com uma ou duas porções carboidrato ligadas a uma ou duas de suas cadeias leves, anticorpo sem carboidrato ligado a uma ou duas cadeias pesadas do anticorpo etc., bem como combinações dessas alterações de glicosilação.
[0100] Quando o anticorpo possuir região Fc, estrutura de oligossacarídeo tal como a exibida na Fig. 9 da presente invenção pode ser ligada a uma ou duas cadeias pesadas do anticorpo, tal como no resíduo 299 (298, numeração Eu de resíduos). Para pertuzumab, G0 foi a estrutura de oligossacarídeo predominante, com outras estruturas de oligossacarídeos tais como G0-F, G-1, Man5, Man6, G1-1, G1 (1-6), G1 (1-3) e G2 sendo encontradas em quantidades menores na composição de pertuzumab.
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35/138 [0101] A menos que indicado em contrário, “estrutura de oligossacarídeo G1” na presente invenção inclui estruturas G-1, G1-1, G1 (1-6) e G1 (1-3).
[0102] “Extensão líder amino-terminal” na presente invenção indica um ou mais resíduos de aminoácidos da seqüência líder amino-terminal que estão presentes no terminal amino de qualquer uma ou mais cadeias pesada ou leve de anticorpo. Exemplo de extensão líder amino-terminal compreende ou consiste de três resíduos de aminoácidos, VHS, presentes sobre uma ou as duas cadeias leves de variante de anticorpo.
[0103] Anticorpo “desamidado” é aquele em que um ou mais de seus resíduos de asparagina foi derivado, por exemplo, em ácido aspártico, succinimida ou ácido iso-aspártico.
[0104] Os termos “câncer” e “canceroso” designam ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas sem limitar-se a carcinoma, linfoma, blastoma (incluindo meduloblastoma e retinoblastoma), sarcoma (incluindo lipossarcoma e sarcoma de células sinoviais), tumores neuroendócrinos (incluindo tumores carcinóides, gastrinoma e câncer de células ilha), mesotelioma, schwannoma (incluindo neuroma acústico), meningioma, adenocarcinoma, melanoma e leucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epiteliais), câncer do pulmão, incluindo câncer do pulmão de células pequenas (SCLC), câncer de pulmão de células não-pequenas (NSCLC), adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou estomacal, incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer da cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama (incluindo câncer de mama metastático), câncer do cólon, câncer retal, câncer colorretal,
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36/138 carcinoma uterino ou endométrico, carcinoma das glândulas salivares, câncer renal ou dos rins, câncer de próstata, câncer da vulva, câncer da tireóide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, câncer testicular, câncer do esôfago, tumores do trato biliar e câncer da cabeça e pescoço.
[0105] “Paciente” na presente invenção é paciente humano. O paciente pode ser “paciente com câncer”, ou seja, que está sofrendo ou apresenta risco de sofrer de um ou mais sintomas de câncer, ou outro paciente que poderá beneficiar-se de terapia com anticorpo HER.
[0106] “Amostra biológica” designa amostra, geralmente células ou tecido derivado de fonte biológica.
[0107] “Amostra de paciente” designa amostra obtida de paciente, tal como paciente com câncer.
[0108] “Amostra de tumor” da presente invenção é amostra derivada de células tumorosas de tumor de paciente ou que as compreende. Exemplos de amostras de tumores da presente invenção incluem, mas sem limitar-se a biópsias de tumores, células tumorosas em circulação, proteínas de plasma em circulação, fluido ascítico, cultura de células primárias ou linhagens celulares derivadas de tumores ou que exibem propriedades similares a tumores, bem como amostras de tumores preservadas, tais como amostras de tumores embutidas em parafina fixas por formalina ou amostras de tumores congeladas.
[0109] Amostra de tumor “fixa” é aquela que tenha sido preservada histologicamente utilizando fixador.
[0110] Amostra de tumor “fixa em formalina” é aquela que tenha sido preservada utilizando formaldeído como fixador.
[0111] Amostra de tumor “embutida” é aquela rodeada por meio firme e geralmente duro, tal como parafina, cera, celoidina ou resina. O
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37/138 embutimento possibilita o corte de seções finas para exame microscópico ou para a geração de microarray de tecido (TMAs).
[0112] Amostra de tumor “embutida em parafina” é aquela rodeada por mistura purificada de hidrocarbonetos sólidos derivados de petróleo.
[0113] Amostra de tumor “congelada” na presente invenção designa amostra de tumor que é ou foi congelada.
[0114] Amostra biológica ou de câncer que “exibe a expressão, amplificação ou ativação de HER” é aquela que, em teste de diagnóstico, expressa (incluindo superexpressão) receptor de HER, possui gene HER amplificado e/ou demonstra de outra forma a ativação ou fosforilação de receptor de HER. Esta ativação pode ser determinada diretamente (tal como se medindo a fosforilação de HER) ou indiretamente (tal como por meio de formação de perfis de expressão genética ou de detecção de heterodímeros de HER, conforme descrito na presente invenção).
[0115] Câncer com “amplificação ou superexpressão de receptor de HER” é aquele que contém níveis significativamente mais altos de proteína ou gene receptor de HER em comparação com célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Essa superexpressão pode ser causada por amplificação genética ou por maior transcrição ou tradução. A amplificação ou superexpressão do receptor de HER pode ser determinada em teste de diagnóstico ou prognóstico, por meio da avaliação de níveis mais altos da proteína HER presentes sobre a superfície de uma célula (por exemplo, por meio de teste de imunohistoquímica; IHC). Alternativa, ou adicionalmente, pode-se medir os níveis de ácido nucléico codificador de HER na célula, por exemplo, por meio de hibridização in situ fluorescente (FISH; vide WO 98/45479 publicada em outubro de 1998), Southern Blot ou técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR), tais como PCR quantitativo em tempo real
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38/138 (qRT-PCR). Pode-se também estudar a amplificação ou superexpressão do receptor de HER por meio da medição de antígeno dividido (tal como domínio extracelular de HER) em fluido biológico tal como soro (vide, por exemplo, a Patente US 4.933.294 emitida em doze de junho de 1990; WO 91/05264 publicada em 18 de abril de 1991; Patente US 5.401.638 emitida em 28 de março de 1995; e Sias et al, J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). Além dos testes acima, diversos testes in vivo são disponíveis para os técnicos no assunto. Pode-se, por exemplo, expor as células no corpo do paciente a anticorpo que seja opcionalmente marcado com marcador detectável, tal como isótopo radioativo, e pode-se avaliar a ligação do anticorpo a células do paciente, por exemplo, por meio de varredura externa para avaliação da radioatividade ou de análise de biópsia retirada de paciente exposto anteriormente ao anticorpo.
[0116] Por outro lado, câncer que “não superexpressa nem amplifica receptor de HER” é aquele que não possui níveis acima do normal de proteína ou gene receptor de HER em comparação com célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Os anticorpos que inibem a dimerização de HER, tais como pertuzumab, podem ser utilizados no tratamento de câncer que não superexpressa nem amplifica receptor de HER2.
[0117] “Agente inibidor de crescimento”, da forma utilizada na presente invenção, designa composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente célula cancerosa, que expressa HER, seja in vitro ou in vivo. Desta forma, o agente inibidor do crescimento é aquele que reduz significativamente o percentual de células que expressam HER em fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam o progresso do ciclo celular (em sítio diferente da fase S), tais como agentes que induzem a suspensão de G1 e a suspensão da fase M. Os bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina),
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39/138 taxanos e inibidores topo II, tais como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposida e bleomicina. Os agentes que prendem G1 também invadem a prisão da fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA, tais como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5fluorouracil e ara-C. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado Cell Cycle Regulation, Oncogenes and Antineoplastic Drugs de Murakami et al (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente pág. 13.
[0118] Exemplos de anticorpos “inibidores do crescimento” são aqueles que se ligam a HER2 e inibem o crescimento de células cancerosas que superexpressam HER2. Os anticorpos HER2 inibidores do crescimento preferidos inibem o crescimento de células de tumor de mama SK-BR-3 em cultura celular em mais de 20%, preferencialmente mais de 50% (tal como cerca de 50% a cerca de 100%) em concentração de anticorpos de cerca de 0,5 a 30 pg/ml, em que a inibição do crescimento é determinada seis dias após a exposição das células SKBR-3 ao anticorpo (vide a Patente US 5.677.171 emitida em 14 de outubro de 1997). O teste de inibição do crescimento de células SK-BR-3 é descrito em mais detalhes naquela patente e abaixo na presente invenção. O anticorpo inibidor do crescimento preferido é variante humanizada de anticorpo monoclonal murino 4D5, tal como trastuzumab.
[0119] Anticorpo que “induz a apoptose” é aquele que induz a morte celular programada, conforme determinado por meio da ligação de anexina V, fragmentação de DNA, contração celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de bolhas de membrana (denominadas corpos apoptóticos). A célula é normalmente aquela que superexpressa o receptor de HER2. Preferencialmente, a célula é célula tumorosa, tal como célula da mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tireóide, pancreática ou da bexiga. In vitro, a célula
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40/138 pode ser célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SKOV3. Diversos métodos são disponíveis para avaliação dos eventos celulares associados a apoptose. A translocação de fosfatidil serina (PS), por exemplo, pode ser medida pela ligação de anexina; a fragmentação de DNA pode ser avaliada por meio de escalas de DNA; e condensação nuclear/de cromatina juntamente com fragmentação de DNA pode ser avaliada por meio de qualquer aumento das células hipodiplóides. Preferencialmente, o anticorpo que induz a apoptose é aquele que resulta em cerca de duas a cinqüenta vezes, preferencialmente cerca de cinco a cinqüenta vezes e, de preferência superior, cerca de dez a cinqüenta vezes, a indução da ligação de anexina com relação a células não tratadas em teste de ligação de anexina utilizando células BT474 (vide abaixo). Exemplos de anticorpos HER2 que induzem a apoptose são 7C2 e 7F3.
[0120] O “epítopo 2C4” é a região no domínio extracelular de HER2 à qual se liga o anticorpo 2C4. Para selecionar anticorpos que se liguem ao epítopo 2C4, pode-se realizar teste bloqueador cruzado de rotina, tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988). Preferencialmente, o anticorpo bloqueia a ligação de 2C4 a HER2 em cerca de 50% ou mais. Alternativamente, pode-se realizar mapeamento de epítopos para determinar se o anticorpo se liga ao epítopo 2C4 de HER2. O epítopo 2C4 compreende resíduos do Domínio II no domínio extracelular de HER2. 2C4 e pertuzumab ligam-se ao domínio extracelular de HER2 na junção dos domínios I, II e III. Franklin et al, Cancer Cell5: 317-328 (2004).
[0121] O “epítopo 4D5” é a região no domínio extracelular de HER2 à qual se ligam o anticorpo 4D5 (ATCC CRL 10463) e trastuzumab. O epítopo está próximo do domínio transmembrana de HER2 e dentro do Domínio IV de HER2. Para selecionar anticorpos que se liguem ao epítopo HER2, pode-se realizar teste bloqueador cruzado de rotina, tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory
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Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988). Alternativamente, pode-se realizar mapeamento de epítopos para determinar se o anticorpo se liga ao epítopo 4D5 de HER2 (tal como qualquer um ou mais resíduos na região de perto do resíduo 529 a perto do resíduo 625, inclusive, da ECD de HER2, em que a numeração dos resíduos inclui peptídeo de sinal).
[0122] O “epítopo 7C2/7F3” é a região no terminal N, dentro do Domínio I, do domínio extracelular de HER2 à qual se ligam os anticorpos 7C2 e/ou 7F3 (cada qual depositado com a ATCC, vide abaixo). Para selecionar anticorpos que se liguem ao epítopo 7C2/7F3, pode-se realizar teste bloqueador cruzado de rotina, tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988). Alternativamente, pode-se realizar mapeamento de epítopos para determinar se o anticorpo se liga ao epítopo 7C2/7F3 de HER2 (tal como qualquer um ou mais resíduos na região de perto do resíduo 22 a perto do resíduo 53, inclusive, da ECD de HER2, em que a numeração dos resíduos inclui peptídeo de sinal).
[0123] “Tratamento” designa tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas. Os necessitados de tratamento incluem os que já detêm a doença, bem como aqueles em que a doença deve ser evitada. Desta forma, o paciente a ser tratado na presente invenção pode haver sido diagnosticado como portador da doença ou pode ser pré-disposto ou suscetível à doença.
[0124] A expressão “quantidade eficaz” designa quantidade de droga eficaz para o tratamento de câncer no paciente. A quantidade eficaz da droga pode reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (ou seja, reduzir a velocidade até certo ponto e, preferencialmente, suspender) a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir (ou seja, reduzir até certo ponto e, preferencialmente, suspender) a metástase
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42/138 tumorosa; inibir, até certo ponto, o crescimento de tumores; e/ou melhorar, até certo ponto, um ou mais dos sintomas associados ao câncer. Desde que possa evitar o crescimento de células cancerosas existentes e/ou matá-las, a droga pode ser citostática e/ou citotóxica. A quantidade eficaz pode estender a sobrevivência livre de progresso (conforme medido, por exemplo, por meio de Critérios de Avaliação de Reação para Tumores Sólidos, RECIST, ou alterações CA-125), resulta em reação objetiva (que inclui reação parcial, PR, ou reação completa, CR), aumenta o tempo de sobrevivência geral e/ou melhora um ou mais sintomas de câncer (conforme determinado, por exemplo, por meio de FOSI).
[0125] “Sobrevivência geral” designa o paciente permanecer vivo por período de tempo definido, tal como um ano, cinco anos etc., a partir do momento de diagnóstico ou tratamento.
[0126] “Sobrevivência livre de progresso” indica o paciente permanecer vivo, sem que o câncer piore.
[0127] “Reação objetiva” designa reação mensurável, que inclui reação completa (CR) ou reação parcial (PR).
[0128] “Reação completa” ou “remissão completa” designa o desaparecimento de todos os sinais de câncer em resposta ao tratamento. Isso nem sempre significa a cura do câncer.
[0129] “Reação parcial” designa redução do tamanho de um ou mais tumores ou lesões, ou da extensão do câncer no corpo, em resposta ao tratamento.
[0130] A expressão “agente citotóxico”, da forma utilizada na presente invenção, indica substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/ou causa destruição das células. A expressão destina-se a incluir isótopos radioativos (tais como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos e toxinas tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem
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43/138 bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo seus fragmentos e/ou variantes.
[0131] “Agente quimioterápico” é composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquila, tais como busulfano, improsulfano e piposulfano; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; TLK 286 (TELCYTA®), acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiina; espongistatina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucil, clornazafina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosuréias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; bifosfonatos, tais como clodronato; antibióticos tais como os antibióticos de enediina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 1I e caliqueamicina ômega I1 (vide, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994)) e antraciclinas tais como anamicina, AD 32, alcarubicina, daunorubicina, dexrazoxano, DX-52-1, epirubicina, GPX
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100, idarubicina, KRN 5500, menogaril, dinemicina, incluindo dinemicina A; esperamicina, neocarzinostatina cromoforo e cromoforos antibióticos de enediina cromoproteína relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolinodoxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, doxorubicina lipossômica e desoxidoxorubicina), esorubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina e zorubicina; análogos de ácido fólico, tais como denopterina, pteropterina e trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina e tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina e floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano e testolactona; anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano e trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico (leucovorin); aceglatona; agentes antineoplásicos antifolato tais como ALIMTA®, LY231514 pemetrexed, inibidores da di-hidrofolato redutase tais como metotrexato, antimetabólitos tais como 5-fluorouracil (5-FU) e suas pró-drogas tais como UFT, S-1 e capecitabina e inibidores da timidilato sintase e inibidores da glicinamida ribonucleotídeo formiltransferase, tais como ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; epotilona; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidainina; maitansinóides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitaerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeos PSK®
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45/138 (JHS Natural Products, Eugene OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2”-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridin A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides e taxanos, tais como paclitaxel TAXOL® (BristolMyers Squibb Oncology, Princeton NJ), ABRAXANE® livre de Cremophor, formulação de nanopartículas de paclitaxel elaborada com albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) e docetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil; gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; platina; análogos de platina ou análogos com base em platina, tais como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN®); etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); vinca alcalóide; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides, tais como ácido retinóico; sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos acima tais como CHOP, abreviação de terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, abreviação de regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN®) combinado com 5-FU e leucovorina.
[0132] Também são incluídos nesta definição agentes antihormonais que agem para regular ou inibir a ação hormonal sobre tumores tais como antiestrógenos e moduladores receptores de estrógenos seletivos (SERMs), que incluem, por exemplo, tamoxifen (incluindo tamoxifen NOVALDEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno FARESTON®; inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógenos nas glândulas adrenais,
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46/138 tais como 4 (5)-imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® e anastrozol ARIMIDEX®; e anti-andrógenos, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; bem como troxacitabina (análogo de citosina nucleosídeo de 1,3-dioxolano); oligonucleotídeos antisenso, particularmente os que inibem a expressão de genes em processos de sinalização relacionados à proliferação celular aberrante, tais como PKC-alfa, Raf, H-Ras e receptor de fator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas, tais como vacinas de terapia genética, por exemplo vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; rIL-2 PROLEUKIN®; inibidor da topoisomerase 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; e os sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.
[0133] “Agente quimioterápico antimetabólito” é agente que é estruturalmente similar a metabólito, mas não pode ser utilizado pelo corpo de maneira produtiva. Muitos agentes quimioterápicos antimetabólitos interferem com a produção dos ácidos nucléicos, RNA e DNA. Exemplos de agentes quimioterápicos antimetabólitos incluem gemcitabina (GEMZAR®), 5-fluorouracil (5-FU), capecitabina (XELODA®), 6-mercaptopurino, metotrexato, 6-tioguanina, pemetrexed, raltitrexed, arabinosilcitosina ARAC citarabina (CYTOSAR-U®), dacarbazina (DTIC-DOME®), azocitosina, desoxicitosina, piridimideno, fludarabina (FLUDARA®), cladrabina, 2desóxi-D-glicose etc. O agente quimioterápico antimetabólito preferido é gemcitabina.
[0134] “Gemcitabina” ou “monocloridrato de 2’-desóxi-2’,2’difluorocitidina (isômero b)” é análogo de nucleosídeo que exibe atividade antitumorais. A fórmula empírica para gemcitabina HCl é C9H11F2N3O4 A HCl. Gemcitabina HCl é vendida pela Eli Lilly com a marca comercial GEMZAR®.
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47/138 [0135] “Agente quimioterápico com base em platina” compreende composto orgânico que contém platina como parte integral da molécula. Exemplos de agentes quimioterápicos com base em platina incluem carboplatina, cisplatina e oxaliplatina.
[0136] Por “quimioterapia com base em platina”, compreende-se terapia com um ou mais agentes quimioterápicos com base em platina, opcionalmente em combinação com um ou mais agentes quimioterápicos diferentes.
[0137] Câncer “resistente a platina” indica que o paciente com câncer progrediu enquanto recebia quimioterapia com base em platina (ou seja, o paciente é “refratário a platina”), ou o paciente progrediu em até doze meses (tal como em seis meses) após completar regime de quimioterapia com base em platina.
[0138] “Agente antiangiogênico” designa um composto que bloqueia ou interfere, até certo grau, no desenvolvimento de vasos sangüíneos. O fator antiangiogênico pode ser, por exemplo, molécula pequena ou anticorpo que se liga ao fator de crescimento ou receptor de fator de crescimento envolvido na promoção da angiogênese. O fator antiangiogênico preferido da presente invenção é anticorpo que se liga ao Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF), tal como Bevacizumabe (AVASTIN®).
[0139] O termo “citocina” é termo genérico para proteínas liberadas por população celular que agem sobre outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos dessas citocinas são linfoquinas, monoquinas e hormônios de polipeptídeos tradicionais. Encontram-se incluídos entre as citocinas hormônios do crescimento, tais como hormônio do crescimento humano, hormônio do crescimento humano N-metionila e hormônio do crescimento bovino; hormônio paratireóide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; pró-relaxina; hormônios de glicoproteínas tais como hormônio folículo
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48/138 estimulante (FSH), hormônio estimulante da tireóide (TSH) e hormônio luteinizante (LH); fator do crescimento hepático; fator de crescimento dos fibroblastos; prolactina; lactogênio da placenta; fator de necrose tumorosa α e β; substância inibidora mulleriana; peptídeo associado à gonadotropina de camundongos; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento dos nervos tais como NGF-β; fator de crescimento das plaquetas, fatores de crescimento transformantes (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fator de crescimento similar à insulina I e II; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferons, tais como interferon-α, β e γ; fatores estimulantes de colônias (CSFs) tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; fator de necrose tumoral tal como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores de polipeptídeos que incluem LIF e ligante de kits (KL). Da forma utilizada na presente invenção, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura celular recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de seqüência nativa.
[0140] Da forma utilizada na presente invenção, a expressão “droga dirigida a EGFR” indica agente terapêutico que se liga ao EGFR e, opcionalmente, inibe a ativação de EGFR. Exemplos desses agentes incluem anticorpos e moléculas pequenas que se ligam a EGFR. Exemplos de anticorpos que se ligam a EGFR incluem MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (vide Patente US 4.943.533, Mendelsohn et al) e suas variantes, tais como 225 quimerizado (C225 ou Cetuximab; ERBUTIX®) e 225 humano remoldado (H225) (vide WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticorpos que ligam EGFR mutante do tipo II (Patente US 5.212.290); anticorpos quiméricos e humanizados que ligam EGFR conforme descrito na Patente US 5.891.996; e
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49/138 anticorpos humanos que ligam EGFR, tais como ABX-EGF (vide WO 98/50433, Abgenix); EMD 55900 (Stragliotto et al, Eur. J. Cancer 32A: 636-640 (1996)); e mAb 806 ou mAb 806 humanizado (Johns et al, J. Biol. Chem. 279 (29): 3037530384 (2004)). O anticorpo anti-EGFR pode ser conjugado com agente citotóxico, de forma a gerar um imunoconjugado (vide, por exemplo, EP 659.439 A2, Merck Patent GmbH). Exemplos de moléculas pequenas que se ligam a EGFR incluem ZD1839 ou Gefitinibe (IRESSA®; Astra Zeneca), CP358774 ou Erlotinib HCL (TARCEVA®; Genentech/OSI) e AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen).
[0141] “Inibidor da tirosina quinase” é molécula que inibe a atividade de tirosina quinase de tirosina quinase tal como receptor de HER. Exemplos desses inibidores incluem as drogas dirigidas a EGFR observadas no parágrafo anterior; inibidor de tirosina quinase de HER2 de moléculas pequenas, tal como TAK165 disponível por meio da Takeda, inibidores de HER duplo tais como EKB-569 (disponível por meio da Wyeth) que se liga preferencialmente ao EGFR mas inibe células que superexpressam HER2 e EGFR, GW572016 (disponível por meio da Glaxo), inibidor de tirosina quinase de HER2 e EGFR oral, PKI-166 (disponível por meio da Novartis); inibidores pan-HER tais como canertinibe (CI-1033; Pharmacia); inibidores de Raf-1 tais como agente antisenso ISIS-5132 disponível por meio da ISIS Pharmaceuticals, que inibe a sinalização de Raf-1; inibidores de TK não dirigidos por HER tais como mesilato de Imatinibe (Gleevac®) disponível por meio da Glaxo; inibidor de quinase I regulado extracelular MAPK CI-1040 (disponível por meio da Pharmacia); quinazolinas, tais como PD 153035,4-(3cloroanilino) quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, tais como CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidinas; curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis (4-fluoroanilino)ftalimida); tirfostinas que contêm
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50/138 porções nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lamber); moléculas antisenso /tais como as que se ligam a ácido nucléico codificador de HER); quinoxalinas (Patente US 5.804.396); trifostinas (Patente US 5.804.396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inibidores pan-HER, tais como CI1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de Imatinibe (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxinibe (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); ou conforme descrito em qualquer das publicações de patentes a seguir: Patente US 5.804.396; WO 99/09016 (American Cyanamid); WO 98/43960 (American Cyanamid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, Inc); WO 96/33978 (Zeneca); WO 96/3397 (Zeneca); e WO 96/33980 (Zeneca).
[0142] “Doença autoimune” na presente invenção é doença ou disfunção que surge dos próprios tecidos do indivíduo e é dirigida contra eles, sua manifestação, co-segregado ou condição resultante. Exemplos de doenças ou disfunções autoimunes incluem, mas sem limitar-se a artrite (artrite reumatóide, tal como atrite aguda, artrite reumatóide crônica, artrite da gota, artrite da gota aguda, artrite inflamatória crônica, artrite degenerativa, artrite infecciosa, artrite de Lyme, artrite proliferativa, artrite psoriática, artrite vertebral e artrite reumatóide de início juvenil, osteoartrite, artrite crônica progressiva, artrite deformans, poliartrite crônica primária, artrite reativa e espondilite anquilosante), doenças da pele hiperproliferativas inflamatórias, psoríase tal como psoríase de placas, psoríase gutatte, psoríase pustular e psoríase das unhas, atopia incluindo doenças atópicas tais como febre do feno e síndrome de Jó, dermatite incluindo dermatite de contato, dermatite de contato crônica, dermatite alérgica, dermatite de contato alérgica, dermatite herpetiforme e dermatite atópica, síndrome de hiper IgM ligada por x, urticária tal como
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51/138 urticária alérgica crônica e urticária idiopática crônica, incluindo urticária autoimune crônica, polimiosite/dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, necrólise epidérmica tóxica, esclerodermia (incluindo esclerodermia sistêmica), esclerose tal como esclerose sistêmica, esclerose múltipla (MS) tal como MS espinhoótica, MS progressiva primária (PPMS) e MS reincidente (RRMS), esclerose sistêmica progressiva, aterosclerose, arteriosclerose, esclerose disseminada e esclerose atáxica, doença intestinal inflamatória (IBD) (por exemplo, mal de Crohn, doenças gastrointestinais mediadas por imunicidade, colite tal como colite ulcerativa, colite ulcerosa, colite microscópica, colite colagenosa, colite poliposa, enterocolite necrotizante e colite transmural, bem como doença intestinal inflamatória autoimune), pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangite esclerosante primária, episclerite, síndrome de mal-estar respiratório, incluindo síndrome de mal-estar respiratório em adultos ou aguda (ARDS), meningite, inflamações totais ou parciais da úvea, irite, coroidite, disfunção hematológica autoimune, espondilite reumatóide, perda súbita da audição, doenças mediadas por IgE tais como anafilaxia e rinite alérgica e atópica, encefalite tal como encefalite de Rasmussen e encefalite dos membros e/ou do tronco cerebral, uveíte tal como uveíte anterior, uveíte anterior aguda, uveíte granulomatosa, uveíte não granulomatosa, uveíte facoantigênica, uveíte posterior ou uveíte autoimune, glomerulonefrite (GN) com e sem síndrome nefrótica tal como glomerulonefrite aguda ou crônica como GN primária, GN mediada imune, GN membranosa (nefropatia membranosa), GN membranosa idiopática ou nefropatia membranosa idiopática, GN membranoproliferativa ou proliferativa membranosa (MPGN), incluindo Tipo I e Tipo II, bem como GN de rápida progressão, condições e reações alérgicas, reações alérgicas, eczema incluindo eczema alérgica ou atópica, asma tal como asma dos brônquios, asma brônquica e asma autoimune, condições que envolvem a infiltração de células T e reações inflamatórias crônicas, reações imunológicas contra
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52/138 antígenos exógenos tais como grupos sanguíneos A-B-O fetais durante a gravidez, doença inflamatória pulmonar crônica, miocardite autoimune, deficiência da adesão de leucócitos, eritematose do lúpus sistêmico (SLE) ou eritematodes do lúpus sistêmicos tais como SLE cutânea, eritematose do lúpus cutânea sistêmica, síndrome do lúpus neonatal (NLE), eritematose do lúpus disseminada, lúpus (incluindo nefrite, cerebrite, pediátrico, não renal, extrarenal, discóide, alopecia) diabetes mellitus de início juvenil (Tipo I), incluindo diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM) pediátrica, diabetes mellitus de início em adultos (diabetes Tipo II), diabetes autoimune, diabetes insipidus idiopática, reações imunológicas associadas à hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose linfomatóide, granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculitide incluindo vasculite (incluindo vasculite de vasos grandes (incluindo polimialgia reumática e artrite de células gigantes (de Takayasu)), vasculite de vasos médios (incluindo mal de Kawasaki e poliartrite nodosa/periartrite nodosa), poliartrite microscópica, vasculite do SNC, vasculite necrotizante, cutânea ou por hipersensibilidade, vasculite necrotizante sistêmica e vasculite associada a ANCA, tal como síndrome ou vasculite de Churg-Strauss (CSS), artrite temporal, anemia aplástica, anemia aplástica autoimune, anemia positiva de Coombs, anemia Diamond Blackfan, anemia hemolítica ou anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), anemia perniciosa, mal de Addison, aplasia ou anemia de glóbulos vermelhos pura (PRCA), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças que envolvam a diapedese de leucócitos, disfunções inflamatórias do SNC, síndrome de lesões a múltiplos órgãos tais como as que se seguem a septicemia, trauma ou hemorragia, doenças mediadas por complexo de antígeno e anticorpo, doença da membrana base anti-glomerular, síndrome de anticorpos anti-fosfolipídios,
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53/138 neurite alérgica, mal de Bechet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigóide tal como penfigóide bolhosa e penfigóide da pele, pênfigo (incluindo pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo, penfigóide do mucomembrana do pênfigo e pênfigo eritematoso), poliendocrinopatias autoimunes, síndrome ou mal de Reiter, nefrite do complexo imunológico, nefrite mediada por anticorpos, neuromielite ótica, polineuropatias, neuropatia crônica tal como polineuropatias IgM ou neuropatia mediada por IgM, trombocitopenia (conforme desenvolvido por pacientes com enfarte do miocárdio, por exemplo), incluindo púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), púrpura pós-transfusão (PTP), trombocitopenia induzida por heparina e trombocitopenia autoimune ou mediada por imunicidade tal como púrpura trombocitopênica idiopática (ITP) incluindo ITP crônica ou aguda, doença autoimune dos testículos e ovário incluindo orquite autoimune e ooforite, hipotireoidismo primário, hipoparatireoidismo, doenças endócrinas autoimunes incluindo tireoidite tal como tireoidite autoimune, mal de Hashimoto, tireoidite crônica (tireoidite de Hashimoto) ou tireoidite subaguda, mal da tireóide autoimune, hipotireoidismo idiopático, mal de Grave, síndromes poliglandulares tais como síndromes poliglandulares autoimunes (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular), síndromes paraneoplásicas, incluindo síndromes paraneoplásicas neurológicas tais como síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou síndrome de EatonLambert, síndrome de rigidez humana ou de rigidez pessoal, encefalomielite tal como encefalomielite alérgica ou alergia de encefalomielite e encefalomielite alérgica experimental (EAE), miastenia grave tal como miastenia grave associada à timoma, degeneração do cerebelo, neuromiotonia, opsoclonus ou síndrome de opsoclonus mioclonus (OMS) e neuropatia sensorial, neuropatia motor multifocal, síndrome de Sheehan, hepatite autoimune, hepatite crônica, hepatite lupóide, hepatite de células gigantes, hepatite ativa crônica ou hepatite
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54/138 ativa crônica autoimune, pneumotite intersticial linfóide (LIP), bronquiolite obliterans (não de transplante) contra NSIP, síndrome de Guillain-Barré, mal de Berger (nefropatia de IgA), nefropatia de IgA idiopática, dermatose de IgA linear, cirrose biliar primária, pneumonocirrose, síndrome de enteropatia autoimune, doença celíaca, psilose celíaca (enteropatia do glúten), psilose refratária, psilose idiopática, crioglobulinemia, esclerose lateral amilotrófica (ALS; mal de Lou Gehrig), doença das artérias coronarianas, doença autoimune do ouvido tal como doença do ouvido interno autoimune (AIED), perda de audição autoimune, policondrite tal como policondrite refratária ou retardada, proteinose alveolar pulmonar, amiloidose, esclerite, linfocitose não cancerosa, linfocitose primária, que inclui linfocitose de células B monoclonais (tal como gamopatia monoclonal benigna e gamopatia monoclonal de significado indeterminado, MGUS), neuropatia periférica, síndrome paraneoplásica, canalopatias tais como epilepsia, enxaqueca, arritmia, disfunções musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica e canalopatias do SNC, autismo, miopatia inflamatória, glomeruloesclerose segmental focal (FSGS), oftalmopatia endócrina, uveorretinite, coriorretinite, disfunção hepatológica autoimune, fibromialgia, falha endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, adrenalite, atrofia gástrica, demência pré-senil, doenças demielinantes tais como doenças demielinantes autoimunes e polineuropatia demielinante inflamatória crônica, nefropatia diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome de CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud, dismobilidade do esôfago, esclerodactilia e telangiectasia), infertilidade autoimune masculina e feminina, doença de tecidos conjuntivos misturados, doença de Chagas, febre reumática, aborto recorrente, pulmão de fazendeiro, eritema multiforme, síndrome pós-cardiotomia, síndrome de Cushing, pulmão de criador de pássaros, angite granulomatosa alérgica, angite linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolite tal como alveolite alérgica e alveolite
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55/138 fibrosante, doença pulmonar intersticial, reação de transfusão, hanseníase, malária, leishmaníase, cipanossomíase, esquistossomíase, ascaríase, aspergilose, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocardite, fibrose do endomiocárdio, fibrose pulmonar intersticial difusa, fibrose pulmonar intersticial, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose cística, endoftalmite, eritema elevatum et diutinum, eritroblastose fetal, facite eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flaríase, ciclite tal como ciclite crônica, ciclite heterocrônica, iridociclite (aguda ou crônica) ou ciclite de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infecção por vírus da imunodeficiência humana (HIV), infecção por ecovírus, cardiomiopatia, mal de Alzheimer, infecção por parvovírus, infecção por vírus da rubéola, síndromes pósvacinação, infecção por rubéola congênita, infecção por vírus Epstein-Barr, caxumba, síndrome de Evan, falha gonadal autoimune, coréia de Sydenham, nefrite pós-estreptococo, tramboangite ubiterans, tirotoxicose, tabes dorsalis, corioidite, polimialgia de células gigantes, oftalmopatia endócrina, pneumonite por hipersensibilidade crônica, ceratoconjuntivite seca, ceratoconjuntivite epidêmica, síndrome nefrítica idiopática, nefropatia por mudanças mínimas, lesões por reperfusão de isquemia e familiar benigna, autoimunidade da retina, inflamação das juntas, bronquite, doença das vias aéreas obstruídas crônica, silicose, aftas, estomatite aftosa, disfunções arterioscleróticas, aspermiogênese, hemólise autoimune, mal de Boeck, crioglobulinemia, contratura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilática, enterite alérgica, eritema nodosum leprosum, paralisia facial idiopática, síndrome de fadiga crônica, febre reumática, mal de Hamman-Rich, perda de audição sensoneural, hemoglubinúria paroxismática, hipogonadismo, ileíte regional, leucopenia, mononucleose infecciosa, mielite transversal, mixedema idiopático primário, nefrose, oftalmia simpática, orquite granulomatose, pancreatite, polirradiculite aguda, pioderma gangrenoso, tireoidite de Quervain, atrofia esplênica
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56/138 adquirida, infertilidade devido a anticorpos antiespermatozóides, timoma não maligno, vitiligo, SCID e doenças associadas ao vírus Epstein-Barr, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), doenças parasíticas tais como leishmaniose, síndrome de choque tóxico, envenenamento com alimentos, condições que envolvem a infiltração de células T, deficiência na adesão de leucócitos, reações imunológicas associadas à hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, doenças que envolvem diapedese de leucócitos, síndrome por lesões de múltiplos órgãos, doenças mediadas por complexo antígeno-anticorpo, doença da membrana base antiglomerular, neurite alérgica, poliendocrinopatias autoimunes, ooforite, mixedema primário, gastrite atrófica autoimune, oftalmia simpática, doenças reumáticas, doença do tecido conjuntivo misto, síndrome nefrótica, insulite, falhas poliendócrinas, neuropatia periférica, síndrome poliglandular autoimune tipo I, hipoparatireoidismo idiopático em adultos (AOIH), alopecia total, cardiomiopatia dilatada, epidermiólise bolhosa adquirida (EBA), homocromatose, miocardite, síndrome nefrótica, colangite esclerosante primária, sinusite purulenta ou não purulenta, sinusite aguda ou crônica, sinusite etmóide, frontal, maxilar ou esfenóide, disfunção relativa a eosinófilos tal como eosinofilia, eosinofilia por infiltração pulmonar, síndrome de eosinofiliamialgia, síndrome de Loffler, pneumonia eosinofílica crônica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilose broncopneumônica, aspergiloma ou granulomas que contêm eosinófilos, anafilaxia, espondiloartritides soronegativas, doença autoimune poliendócrina, colangite esclerosante, esclerose, episclerose, candidíase mucocutânea crônica, síndrome de Bruton, hipogamaglobulinemia infantil transitória, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de ataxia telangiectasia, disfunções autoimunes associadas a doença de colágeno, reumatismo, doença neurológica, linfadenite, disfunção de reperfusão isquêmica, redução da reação da pressão sangüínea, disfunção vascular,
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57/138 angiectasia, lesões dos tecidos, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral e doença que acompanha a vascularização, disfunções por hipersensibilidade alérgica, glomerulonefritides, lesões por reperfusão, lesões por reperfusão de tecidos do miocárdio e outros, dermatoses inflamatórias, dermatoses com componentes inflamatórios agudos, meningite purulenta aguda ou outras disfunções inflamatórias do sistema nervoso central, disfunções inflamatórias oculares e orbitais, síndromes associadas à transfusão de granulócitos, toxicidade induzida por citocinas, narcolepsia, inflamação séria aguda, inflamação intratável crônica, pielite, pneumonocirrose, retinopatia diabética, disfunção de artérias grandes diabética, hiperplasia endoarterial, úlcera péptica, vasculite e endometriose.
[0143] “Disfunção proliferativa benigna” indica estado em paciente que se refere à proliferação celular e que é reconhecido como anormal por membros da comunidade médica. Estado anormal é caracterizado por nível de propriedade que é estatisticamente diferente do nível observado em organismos que não sofrem da disfunção. A proliferação celular designa crescimento ou extensão por meio de multiplicação de células e inclui a divisão celular. A velocidade da proliferação celular pode ser medida por meio de contagem da quantidade de células produzidas em uma dada unidade de tempo. Exemplos de disfunções hiperproliferativas benignas incluem psoríase e pólipos.
[0144] “Doença respiratória” envolve o sistema respiratório e inclui bronquite crônica, asma que inclui asma aguda e asma alérgica, fibrose cística, bronquioectase, sinusite ou rinite alérgica ou outra, deficiência de a1antitripsina, tosse, enfisema pulmonar, fibrose pulmonar ou hiper-reação das vias aéreas, doença pulmonar obstrutiva crônica e disfunção pulmonar obstrutiva crônica.
[0145] “Psoríase” é condição caracterizada pe la erupção de macropápulas com escamas prateadas avermelhadas discretas,
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58/138 confluentes e circunscritas. Lesões psoriáticas geralmente ocorrem predominantemente sobre os cotovelos, joelhos, couro cabeludo e tronco e exibem microscopicamente paracerotose característica e alongamento de espinhas retas. A expressão inclui as várias formas de psoríase, incluindo formas eritrodérmicas, pustulares, moderadas a severas e recalcitrantes da doença.
[0146] “Endometriose” designa a ocorrência ectópica de tecido endometrial, que freqüentemente forma cistos que contêm sangue alterado.
[0147] A expressão “doença ou disfunção vascular” na presente invenção designa as várias doenças ou disfunções que apresentam impacto sobre o sistema vascular, incluindo o sistema cardiovascular. Exemplos destas doenças incluem arteriosclerose, reobstrução vascular, aterosclerose, estenose vascular pós-cirúrgica, restenose, oclusão vascular ou doença obstrutiva da carótide, doença das artérias coronarianas, angina, doença dos vasos pequenos, hipercolesterolemia, hipertensão e condições que envolvem a proliferação anormal ou função das células epiteliais vasculares.
[0148] O termo “estenose” designa o estreitamento ou estrutura de passagem oca (tal como duto ou canal) no corpo.
[0149] A expressão “estenose vascular” designa obstrução ou estreitamento de vasos sangüíneos. Estenose vascular freqüentemente resulta de depósito graxo (como no caso de arteriosclerose) ou migração excessiva e proliferação de células dos músculos moles vasculares e células endoteliais. As artérias são particularmente suscetíveis a estenose. O termo “estenose”, da forma utilizada na presente invenção, inclui especificamente estenose inicial e restenose.
[0150] O termo “restenose” indica recorrência de estenose após o tratamento de estenose inicial com sucesso aparente. “Restenose”, por exemplo, no contexto de estenose vascular, designa a nova ocorrência de
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59/138 estenose vascular após o seu tratamento com sucesso aparente, tal como por meio da remoção de depósito graxo por meio de angioplastia (tal como angioplastia coronariana transluminal percutânea), aterectomia coronariana de direção ou ponte de safena etc. Um dos fatores que contribuem em restenose é hiperplasia íntima. A expressão “hiperplasia íntima”, utilizada de forma intercambiável com “hiperplasia neoíntima” e “formação neoíntima”, designa espessamento da camada mais interna de vasos sangüíneos, íntima, em conseqüência da proliferação excessiva e migração de células endoteliais e células dos músculos moles vasculares. As diversas mudanças que têm lugar durante a restenose freqüentemente são denominadas coletivamente “remodelagem das paredes vasculares”.
[0151] As expressões “angioplastia de balão” e “angioplastia coronariana transluminal percutânea” (PTCA) são freqüentemente utilizadas de forma intercambiável e designam tratamento com base em cateteres não cirúrgico para remoção de placa da artéria coronariana. Estenose ou restenose freqüentemente geram hipertensão como resultado do aumento da resistência a fluxo sangüíneo.
[0152] O termo “hipertensão” designa pressão sangüínea anormalmente alta, ou seja, além do valor superior da faixa normal.
[0153] “Pólipos” designa massa de tecido que se protubera ou projeta-se para fora ou para cima a partir do nível normal da superfície, de forma a ser macroscopicamente visível na forma de estrutura similar a monte irregular, esferoidal ou semiesferoidal que cresce a partir de base relativamente ampla ou bastão delgado. Exemplos incluem pólipos do cólon, retais e nasais.
[0154] “Fibroadenoma” refere-se à neoplasma benigno derivado do epitélio glandular, no qual existe estroma conspícuo de fibroblastos em proliferação e elementos de tecido conjuntivo. Isso comumente ocorre em tecido de mama.
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60/138 [0155] “Asma” é condição que resulta em dificuldade para respirar. Asma brônquica designa condição dos pulmões nos quais existe estreitamento disseminado das vias aéreas, que pode dever-se à contração (espasmo) de músculos moles, edema da mucosa ou muco no lúmen dos brônquios e bronquíolos.
[0156] “Bronquite” designa inflamação da membrana mucosa dos tubos brônquicos.
[0157] Para os propósitos da presente invenção, “ampola” designa recipiente que retém agente terapêutico. A ampola pode ser vedada por tampa perfurável por seringa. Geralmente, a ampola é formada com material de vidro. O agente terapêutico na ampola pode encontrar-se em vários estados, que incluem líquido, liofilizado, congelado etc.
[0158] “Bula” indica instruções costumeiramente incluídas em embalagens comerciais de agentes terapêuticos que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contra-indicações e/ou avisos referentes à utilização desses produtos terapêuticos.
II. Produção de Anticorpos [0159] Segue-se descrição de exemplos de técnicas de produção de anticorpos HER utilizados de acordo com a presente invenção. O antígeno HER a ser utilizado para a produção de anticorpos pode ser, por exemplo, forma solúvel do domínio extracelular de HER ou uma de suas partes que contém o epítopo desejado. Alternativamente, células que expressam HER na sua superfície celular (por exemplo, células NIH-3T3 transformadas para superexpressar HER2; ou linhagem de células de carcinoma tais como células SK-BR-3, vide Stancovski et al, PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991)), podem ser utilizadas para gerar anticorpos. Outras formas de receptor HER úteis para a geração de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto.
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61/138 (i) Anticorpos policlonais [0160] Os anticorpos policlonais são preferencialmente elevados em animais por meio de diversas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante a uma proteína que seja imunogênica na espécie a ser imunizada tal como hemocianina de conchas, albumina de soro, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja, utilizando agente bifuncional ou derivatizante, tal como éster maleimidobenzoil sufossuccinimida (conjugação por meio de resíduos de cisteína), Nhidroxissuccinimida (por meio de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCl2 ou R1N=C=NR, em que R e R1 são grupos alquila diferentes.
[0161] Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivados por meio de combinação, por exemplo, de 100 pg ou 5 pg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com três volumes de adjuvante completo de Freund e injeção da solução por via intradérmica em diversos sítios. Um mês mais tarde, os animais são incentivados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugado em adjuvante completo de Freund, por meio de injeção subcutânea em diversos sítios. Sete a quatorze dias mais tarde, os animais são sangrados e o soro é testado para determinar a titulagem de anticorpos. Os animais são incentivados até a estabilização do título. Preferencialmente, o animal é incentivado com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado a proteína diferente e/ou por meio de reagente reticulante diferente. Os conjugados podem também ser elaborados em cultura celular recombinante, na forma de fusões de proteínas. Além disso, agentes agregantes tais como alúmen são adequadamente utilizados para aumentar a reação imunológica.
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62/138 (ii) Anticorpos Monoclonais [0162] Diversos métodos de elaboração de anticorpos monoclonais da presente invenção são disponíveis na técnica. Os anticorpos monoclonais podem ser fabricados, por exemplo, utilizando o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al, Nature 256: 495 (1975), por meio de métodos de DNA recombinante (Patente US 4.816.567).
[0163] No método de hibridoma, camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como hamster, é imunizado na forma descrita acima para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são fundidos em seguida a células de mieloma, utilizando agente de fusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)).
[0164] As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas e cultivadas em meio de cultura apropriado que contém preferencialmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Caso as células de mieloma parentais não contenham a enzima hipoxantino guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), por exemplo, o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência de HGPRT.
[0165] Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, apóiam a produção estável em alto nível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a meio tal como meio HAT. Dentre estas, as linhagens celulares de mieloma preferidas são linhagens de mieloma murino, tais como as derivadas de tumores de
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63/138 camundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis por meio do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis por meio da Coleção Norte-Americana de Tipos de Cultura, Rockville, Maryland, Estados Unidos. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano de camundongos também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); e Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)).
[0166] O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão crescendo é testado para determinar a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por meio de imunoprecipitação ou de teste de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA).
[0167] A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, por meio da análise Scatchard de Munson et al, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
[0168] Após a identificação de células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, os clones podem ser subclonados por meio da limitação de procedimentos de diluição e cultivados por meio de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios de cultura apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na forma de tumores de ascite em animal.
[0169] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro por meio de procedimentos convencionais de purificação de anticorpos, tais como
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64/138 proteína A Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese de gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
[0170] DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e seqüenciado utilizando procedimentos convencionais (empregando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes que codificam as cadeias leve e pesada de anticorpos murinos). As células de hibridoma servem de fonte preferida desse DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida em células hospedeiras tais como células de E. coli, células de COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de análise sobre a expressão recombinante em bactérias de DNA que codificam o anticorpo incluem Skerra et al, Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) e Plückthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992).
[0171] Em realização adicional, anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al, Nature, 348: 552-554 (1990), Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos humanos e murinos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicações subseqüentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa de nM) por meio de mistura de cadeias (Marks et al, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), bem como infecções combinatórias e recombinação in vivo, como estratégia de construção de bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al, Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Desta forma, essas técnicas são alternativas viáveis para técnicas de hibridoma
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65/138 de anticorpos monoclonais tradicionais para o isolamento de anticorpos monoclonais.
[0172] O DNA pode também ser modificado, por exemplo, por meio de substituição da seqüência de codificação por domínios constantes de cadeia leve e cadeia pesada humana no lugar das seqüências murinas homólogas (Patente US 4.816.567; e Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81: 6851 (1984)), ou por meio de ligação covalente da seqüência de codificação de imunoglobulina com a seqüência de codificação para um polipeptídeo não de imunoglobulina, no todo ou em parte.
[0173] Tipicamente, esses polipeptídeos não de imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de anticorpo ou são substituídos pelos domínios variáveis de sítio de combinação de antígenos de anticorpo para criar anticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio de combinação de antígenos que possui especificidade para um antígeno e outro sítio de combinação de antígenos que possui especificidade para antígeno diferente.
(iii) Anticorpos humanizados [0174] Métodos de humanização de anticorpos não humanos foram descritos na técnica. Preferencialmente, anticorpo humanizado contém um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentemente denominados resíduos “importados”, que são tomados tipicamente de domínio variável “importado”. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et al, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332: 323327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988)), por meio de substituição de seqüências de regiões hipervariáveis pelas seqüências correspondentes de anticorpo humano. Conseqüentemente, esses anticorpos
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66/138 “humanizados” são anticorpos quiméricos (Patente US 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de regiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
[0175] A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método de “melhor adequação”, a seqüência do domínio variável de anticorpo de roedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca de seqüências de domínio variável humanas conhecidas. A seqüência humana que é a mais próxima da do roedor é então aceita como a região de estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al, J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al, J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Outro método utiliza região de estrutura específica derivada da seqüência consenso de todos os anticorpos humanos de subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89: 4285 (1992); Presta et al, J. Immunol., 151: 2623 (1993)).
[0176] É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com método preferido, anticorpos humanizados são preparados por meio de processo de análise das seqüências parentais e diversos produtos humanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das seqüências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. São
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67/138 disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de possíveis seqüências de imunoglobulina selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da possível seqüência de imunoglobulina, ou seja, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da possível imunoglobulina de ligar o seu antígeno. Desta forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüências receptora e importada para atingir a característica de anticorpo desejada, tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s) alvo. Geralmente, os resíduos da região hipervariável são direta e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação de antígenos.
[0177] WO 01/00245 descreve a produção de exemplos de anticorpos HER2 humanizados que ligam HER2 e bloqueiam a ativação de ligantes de receptor de HER. O anticorpo humanizado de interesse específico da presente invenção bloqueia a ativação mediada por EGF, TGF-α e/ou HRG de MAPK de forma essencialmente tão eficiente quanto anticorpo monoclonal murino 2C4 (ou seu fragmento Fab) e/ou se liga ao HER2 de forma essencialmente tão eficiente quanto anticorpo monoclonal murino 2C4 (ou seu fragmento Fab). O anticorpo humanizado da presente invenção pode compreender, por exemplo, resíduos de regiões hipervariáveis não humanas incorporados a um domínio pesado variável humano e pode compreender adicionalmente substituição de região de estrutura (FR) em posição selecionada a partir do grupo que consiste de 69H, 71H e 73H, utilizando o sistema de numeração de domínios variáveis estabelecido em Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991). Em uma realização, o anticorpo humanizado compreende substituições FR em duas ou todas as posições 69H, 71H e 73H.
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68/138 [0178] Exemplo de anticorpo humanizado de interesse na presente invenção compreende os resíduos de determinação de complementaridade de domínios pesados variáveis GFTFTDYTMX, em que X é preferencialmente D ou S (SEQ ID NO: 7), DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO: 8) e/ou NLGPSFYFDY (SEQ ID NO: 9), que compreendem opcionalmente modificações de aminoácidos desses resíduos de CDR, por exemplo, em que as modificações essencialmente mantêm ou aumentam a afinidade do anticorpo. A variante de anticorpo de interesse, por exemplo, pode conter cerca de um a cerca de sete ou cerca de cinco substituições de aminoácidos nas seqüências de CDR pesadas variáveis acima. Essas variantes de anticorpos podem ser preparadas por meio de amadurecimento por afinidade, por exemplo, conforme descrito abaixo. O anticorpo humanizado de maior preferência compreende a seqüência de aminoácidos de domínio pesado variável em SEQ ID NO: 4.
[0179] O anticorpo humanizado pode compreender resíduos de determinação de complementaridade de domínio leve variável KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: 10); SASYX1X2X3, em que X1 é preferencialmente R ou L, X2 é preferencialmente Y ou E e X3 é preferencialmente T ou S (SEQ ID NO: 11); e/ou QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12), por exemplo, além dos resíduos de CDR de domínio pesado variável no parágrafo anterior. Esses anticorpos humanizados compreendem opcionalmente modificações de aminoácidos dos resíduos de CDR acima, por exemplo, em que as modificações essencialmente mantêm ou aumentam a afinidade do anticorpo. A variante de anticorpo de interesse, por exemplo, pode conter cerca de um a cerca de sete ou cerca de cinco substituições de aminoácidos nas seqüências de CDR leve variável acima. Essas variantes de anticorpos podem ser preparadas por meio de amadurecimento por afinidade, por exemplo, conforme descrito
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69/138 abaixo. O anticorpo humanizado de maior preferência compreende a seqüência de aminoácidos de domínio leve variável em SEQ ID NO: 3.
[0180] O presente pedido também contempla anticorpos amadurecidos por afinidade que ligam HER2 e bloqueiam a ativação de ligantes de receptor de HER. O anticorpo parental pode ser anticorpo humano ou anticorpo humanizado, tal como um que compreenda as seqüências leve e/ou pesada variáveis de SEQ ID NO: 3 e 4, respectivamente (ou seja, variante 574). O anticorpo amadurecido por afinidade preferencialmente liga-se ao receptor de HER2 com afinidade superior à de 2C4 murino ou variante 574 (tal como afinidade cerca de duas ou cerca de quatro vezes a cerca de cem vezes ou cerca de mil vezes maior, tal como conforme determinado utilizando ELISA de domínio extracelular-HER2 (ECD)). Exemplos de resíduos de CDR pesada variáveis para substituição incluem H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99 ou combinações de dois ou mais (tais como dois, três, quatro, cinco, seis ou sete desses resíduos). Exemplos de resíduos de CDR leve variáveis para alteração incluem L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 ou combinações de dois ou mais (tais como dois a três, quatro, cinco ou até cerca de dez desses resíduos).
[0181] São contempladas várias formas do anticorpo humanizado ou anticorpo amadurecido por afinidade. O anticorpo humanizado ou anticorpo amadurecido por afinidade, por exemplo, pode ser fragmento de anticorpo, tal como Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agentes citotóxicos, a fim de gerar imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado ou anticorpo amadurecido por afinidade pode ser anticorpo intacto, tal como anticorpo IgG1 intacto. O anticorpo IgG1 intacto preferido compreende a seqüência de cadeia leve em SEQ ID NO: 13 e a seqüência de cadeia pesada em SEQ ID NO: 14.
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70/138 (iv) Anticorpos humanos [0182] Como alternativa para a humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. É agora possível produzir, por exemplo, animais transgênicos (tais como camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. Descreveu-se, por exemplo, que a exclusão homozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (JH) em camundongos quiméricos e mutantes de linhagem germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do conjunto de genes de imunoglobulina da linhagem de gérmen humano nesses camundongos com mutação da linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante desafio com antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al, Year in Immuno., 7: 33 (1993); e Patentes US 5.591.669, US 5.589.369 e US 5.545.807.
[0183] Alternativamente, pode-se utilizar tecnologia de exibição de fagos (McCafferty et al, Nature 348: 552-553 (1990)) para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro a partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes de domínio V de anticorpos são clonados em quadro em um gene de proteína de revestimento maior ou menor de bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos na forma de fragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita simples do genoma de fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene codificador do anticorpo que exibe essas propriedades. Assim, o fago imita
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71/138 algumas das propriedades da célula B. A exibição de fagos pode ser realizada em uma série de formatos; para sua análise, vide, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Diversas fontes de segmentos de gene V podem ser utilizadas para exibição de fago. Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) isolaram conjunto diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de camundongos imunizados. Repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para conjunto diverso de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados seguindo-se essencialmente as técnicas descritas por Marks et al, J. Mol. Biol. 222: 581597 (1991), ou Griffith et al, EMBO J. 12: 725-734 (1993). Vide também as Patentes US 5.565.332 e US 5.573.905.
[0184] Conforme discutido acima, anticorpos humanos podem também ser gerados por células B ativadas in vitro (vide as Patentes US 5.567.610 e US 5.229.275).
[0185] Os anticorpos HER2 humanos são descritos na Patente US 5.772.997 emitida em trinta de junho de 1998 e WO 97/00271 publicada em três de janeiro de 1997.
(v) Fragmentos de anticorpos [0186] Foram desenvolvidas diversas técnicas de produção de fragmentos de anticorpos que compreendem uma ou mais regiões de ligação de antígenos. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, por exemplo, Morimoto et al, , Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); e Brennan et al, Science 229: 81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agora produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados, por exemplo, a partir das
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72/138 bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Outros métodos de produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo selecionado é fragmento Fv de fita simples (scFv). Vide WO 93/16185; Patente US 5.571.894; e Patente US 5.587.458. O fragmento de anticorpo pode também ser “anticorpo linear”, conforme descrito, por exemplo, na Patente US 5.641.870. Esses fragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
(vi) Anticorpos biespecíficos [0187] Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Exemplos de anticorpos biespecíficos podem ligar-se a dois epítopos diferentes da proteína HER2. Outros desses anticorpos podem combinar sítio de ligação de HER2 com sítio(is) de ligação para EGFR, HER3 e/ou HER4. Alternativamente, um braço HER2 pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula acionadora sobre leucócito, tal como molécula receptora de células T (por exemplo, CD2 ou CD3), ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de forma a dirigir mecanismos de defesa celular para a célula que expressa HER2. Anticorpos biespecíficos podem também ser utilizados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam HER2. Esses anticorpos possuem um braço de ligação de CD20 e um braço que liga o agente citotóxico (tal como saporina, antiinterferon-α, vinca alcalóide, cadeia A rícina, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados na forma
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73/138 de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (tais como anticorpos biespecíficos F(ab')2).
[0188] WO 96/16673 descreve anticorpo HER2/FcyRIII biespecífico e a Patente US 5.837.234 descreve um anticorpo IDM1 HER2/FcyRI biespecífico (Osidem). Anticorpo HER2/Fca biespecífico é exibido em WO 98/02463. A Patente US 5.821.337 ensina anticorpo HER2/CD3 biespecífico. MDX-210 é HER2-FcyRIII Ab biespecífico.
[0189] Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na coexpressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuem especificidades diferentes (Millstein et al, Nature, 305: 537-539 (1983)). Devido à seleção aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem mistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que normalmente é realizada por meio de etapas de cromatografia de afinidade, é um tanto problemática e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos em WO 93/08829 e em Traunecker et al, EMBO J. 10: 3655-3659 (1991).
[0190] De acordo com abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de anticorpos e antígenos) são fundidos a seqüências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão ocorre preferencialmente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões de articulação, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) que contém o sítio necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em
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74/138 vetores de expressão separados e são cotransfectados em organismo hospedeiro apropriado. Isso proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeos em realizações quando razões desiguais das três cadeias de polipeptídeos utilizadas na construção fornecerem os rendimentos ideais. É possível, entretanto, inserir as seqüências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos em razões iguais resultar em altos rendimentos ou quando as razões não forem de significação específica.
[0191] Em realização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina híbrida (que fornece segunda especificidade de ligação) no outro braço. Concluiu-se que esta estrutura assimétrica possibilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, pois a presença de cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica proporciona forma fácil de separação. Esta abordagem é descrita em WO 94/04690. Para detalhes adicionais de geração de anticorpos biespecíficos, consulte, por exemplo, Suresh et al, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
[0192] De acordo com outra abordagem descrita na Patente US 5.731.168, a superfície intermediária entre um par de moléculas de anticorpos pode ser construída de forma a maximizar o percentual de heterodímeros que é recuperado da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (tais como tirosina ou triptofano). “Cavidades” compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre a interface da segunda
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75/138 molécula de anticorpo, por meio da substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos com cadeias menores (tais como alanina ou treonina). Isso proporciona mecanismo de aumento do rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.
[0193] Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou “heteroconjugados”. Um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado, por exemplo, a avidina e o outro a biotina. Esses anticorpos foram propostos, por exemplo, para dirigir células do sistema imunológico alvo a células indesejadas (Patente US 4.676.980) e para o tratamento de infecções por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser fabricados utilizando qualquer método reticulante conveniente. Os agentes reticulantes apropriados são bem conhecidos na técnica e descritos na Patente US 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas reticulantes.
[0194] As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados, por exemplo, utilizando ligações químicas. Brennan et al, Science, 229: 81 (1985) descrevem procedimento em que anticorpos intactos são divididos proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente formador de complexo de ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditióis vizinhos e evitar a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são convertidos em seguida em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é então novamente convertido no Fab'-tiol por meio de redução com mercaptoetilamina e é misturado com quantidade eqüimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.
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76/138 [0195] Progressos recentes possibilitaram a recuperação direta de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi secretado separadamente de E. coli e submetido a acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de ligar-se a células que superexpressam o receptor de HER2 e células T humanas normais, bem como acionar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humanos.
[0196] Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente a partir de cultura celular recombinante também foram descritas. Anticorpos biespecíficos foram produzidos, por exemplo, utilizando fechos de leucina. Kostelny et al, J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às partes Fab' de dois anticorpos diferentes por meio de fusão genética. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de articulação para formar monômeros e, em seguida, novamente oxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de “diacorpos” descrita por Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 6444-6448 (1993) forneceu mecanismo alternativo de fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia. Conseqüentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a se parear com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, de maneira a formar dois sítios de
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77/138 ligação de antígenos. Outra estratégia de fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos utilizando dímeros Fv de fita simples (sFv) também foi relatada. Vide Gruber et al, J. Immunol., 152: 5368 (1994).
[0197] São contemplados anticorpos com mais de duas valências. Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et al, J. Immunol. 147: 60 (1991).
(vii) Outras modificações de seqüências de aminoácidos [0198] É (são) contemplada(s) modificação(ões) dos anticorpos descritos na presente invenção. Pode ser desejável, por exemplo, aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de seqüências de aminoácidos do anticorpo são preparadas por meio da introdução de mudanças de nucleotídeos apropriadas no ácido nucléico do anticorpo, ou por meio da síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, exclusões e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas seqüências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de exclusão, inserção e substituição é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As mudanças de aminoácidos podem também alterar processos pós-tradução do anticorpo, tais como a mudança do número ou posição de sítios de glicosilação.
[0199] Método útil de identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são sítios preferidos para mutagênese é denominado “mutagênese de varredura de alanina”, conforme descrito por Cunningham e Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvo é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituído por aminoácido neutro ou negativamente carregado (de maior preferência alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno. Esses sítios de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são refinados em seguida por meio da
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78/138 introdução de outras variantes ou adicionais nos sítios de substituição ou para estes. Desta forma, embora o sítio para introdução de variação de seqüência de aminoácidos seja previamente determinado, a natureza intrínseca da mutação não necessita ser previamente determinada. Para analisar o desempenho de mutação em um dado sítio, por exemplo, varredura de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região desejada e as variantes de anticorpos expressas são selecionadas para a atividade desejada.
[0200] As inserções de seqüências de aminoácidos incluem fusões de terminais carboxila e/ou amino que variam de comprimento de um resíduo até polipeptídeos que contenham cem ou mais resíduos, bem como inserções intraseqüenciais de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem anticorpo com resíduo de metionila N-terminal ou o anticorpo fundido a polipeptídeo citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou polipeptídeo que aumente a meia vida do anticorpo em soro.
[0201] Outro tipo de variante é variante de substituição de aminoácidos. Estas variantes contêm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo substituída por resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagênese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas também são contempladas alterações de FR. Substituições conservadoras são exibidas na Tabela 1 sob o título “substituições preferidas”. Caso essas substituições resultem em mudança da atividade biológica, mudanças mais substanciais, denominadas “exemplos de substituições” na Tabela 1 ou conforme descrito adicionalmente abaixo com referência a classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos são selecionados.
Tabela 1
Resíduo original Exemplos de substituições Substituições preferidas
Ala (A) val; leu; ilê Val
Arg (R) lys; gln; asn lys
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Resíduo original Exemplos de substituições Substituições preferidas
Asn (N) gln; his; asp, lys; arg Gln
Asp (D) glu; asn Glu
Cys (C) ser; ala Ser
Gln (Q) asn; glu Asn
Glu (E) asp; gln Asp
Gly (G) Ala Ala (A)
His (H) asn; gln; lys; arg Arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucina Leu
Leu (L) norleucina; ile; val; met; ala; phe Ile
Lys (K) arg; gln; asn Arg
Met (M) leu; phe; ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina Leu
[0202] Modificações substanciais das propriedades biológicas do anticorpo são atingidas por meio da seleção de substituições que difiram significativamente de efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, tal como na forma de folha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as similaridades das propriedades das suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, Biochemistry, segunda edição, págs. 73-75, Worth Publishers, Nova Iorque (1975)):
(1) não polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) polares não carregados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His(H)
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80/138 [0203] Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral:
(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) resíduos que influenciam a orientação de cadeias: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.
[0204] Substituições não conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[0205] Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo pode também ser substituído, geralmente com serina, para aprimorar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar retícula aberrante. Por outro lado, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para aumentar a sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo for fragmento de anticorpo, tal como fragmento Fv).
[0206] Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de anticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimento adicional terá(ão) propriedades biológicas aprimoradas com relação ao anticorpo parental do qual é (são) gerado(s). Uma forma conveniente de geração dessas variantes de substituição envolve a maturação por afinidade utilizando exibição de fagos. Resumidamente, diversos sítios de regiões hipervariáveis (por exemplo, seis a sete sítios) sofrem mutações para gerar todas as substituições amino possíveis em cada sítio. As variantes de
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81/138 anticorpos geradas desta forma são exibidas de maneira monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos na forma de fusões para o produto de gene III de M13 embalado em cada partícula. As variantes exibidas por fago são selecionadas em seguida de acordo com a sua atividade biológica (tal como afinidade de ligação), da forma descrita na presente invenção. A fim de identificar possíveis sítios de regiões hipervariáveis para modificação, mutagênese de varredura de alanina pode ser realizada para identificar resíduos de regiões hipervariáveis que contribuem significativamente para a ligação de antígenos. Alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar estrutura de cristal do complexo de antígeno e anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e HER2 humano. Esses resíduos de contatos e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas na presente invenção. Após a geração dessas variantes, o quadro de variantes é submetido à seleção conforme descrito na presente invenção e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais testes relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.
[0207] Outro tipo de variante de aminoácidos do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Por alteração, designa-se a exclusão de uma ou mais porções carboidrato encontradas no anticorpo e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estejam presentes no anticorpo.
[0208] A glicosilação de anticorpos é tipicamente N-ligada ou Oligada. N-ligado designa a ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral de resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeos asparagino-X-serina e asparagino-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido, com exceção de prolina, são as seqüências de reconhecimento para a ligação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Desta forma, a presença de qualquer dessas seqüências de tripeptídeos em polipeptídeo cria potencial sítio de glicosilação. Glicosilação O-ligada designa a ligação de um dos açúcares N
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82/138 acetilgalactosamina, galactose ou xilose a ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora também possam ser utilizadas 5-hidroxiprolina ou 5hidroxilisina.
[0209] A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente conseguida por meio de alteração da seqüência de aminoácidos, de forma que contenha uma ou mais das seqüências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode também ser feita por meio da adição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original, ou substituição por ele (para sítios de glicosilação O-ligados).
[0210] Quando o anticorpo compreender região Fc, o carboidrato a ele ligado pode ser alterado. Anticorpos com estrutura de carboidrato madura que não contém fucose ligada à região Fc do anticorpo, por exemplo, são descritos no Pedido de Patente US 2003/0157108 A1, Presta, L. Vide também US 2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). Anticorpos com Nacetilglucosamina (GlcNAc) bisseccionada no carboidrato ligado a região Fc do anticorpo são indicados em WO 03/011878, Jean-Mairet et al, e na Patente US 6.602.684, Umana et al. Anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado a região Fc do anticorpo são relatados em WO 97/30087, Patel et al. Vide também WO 98/58964 (Raju, S.) e WO 99/22764 (Raju, S.) referentes a anticorpos com carboidrato alterado ligado à sua região Fc.
[0211] Pode ser desejável modificar o anticorpo de acordo com a presente invenção com relação à função efetora, por exemplo, de forma a aumentar a citotoxicidade mediada por células dependente de antígenos (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isso pode ser atingido por meio da introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos em região Fc do anticorpo. Alternativa ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína
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83/138 pode(m) ser introduzido(s) na região Fc, de forma a permitir a formação de uniões de dissulfeto intercadeias nessa região. O anticorpo homodimérico gerado desta forma pode possuir capacidade de internalização aprimorada e/ou morte celular mediada por complemento aprimorada e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Vide Caron et al, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, B., J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade antitumorosa aumentada podem também ser preparados utilizando reticulantes heterobifuncionais, conforme descrito em Wolff et al, Cancer Research 53: 25602565 (1993). Alternativamente, pode ser construído anticorpo que possui regiões Fc duplas e pode, portanto, apresentar capacidades de ADCC e lise de complemento aprimoradas. Vide Stevenson et al, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).
[0212] WO 00/42072 (Presta, L.) descreve anticorpos com função ADCC aprimorada na presença de células efetoras humanas, em que os anticorpos compreendem substituições de aminoácidos na sua região Fc. Preferencialmente, o anticorpo com ADCC aprimorado compreende substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc. Preferencialmente, a região Fc alterada é região Fc de IgG1 humano que compreende ou consiste de substituições em uma, duas ou três destas posições.
[0213] Anticorpos com ligação de C1q alterada e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) são descritos em WO 99/51642, Patente US 6.194.551 B1, Patente US 6.242.195 B1, Patente US 6.528.624 B1 e Patente US 6.538.124 (Idusogie et al). Os anticorpos compreendem substituição de aminoácidos em uma ou mais das posições de aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 e/ou 334 da sua região Fc.
[0214] Para aumentar a meia vida do anticorpo em soro, pode-se incorporar epítopo de ligação de receptor de salvados ao anticorpo (especialmente fragmento de anticorpo), conforme descrito, por exemplo, na Patente US 5.739.277. Da forma utilizada na presente invenção, a expressão “epítopo de ligação de
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84/138 receptor de salvados” designa epítopo da região Fc de molécula de IgG (tal como IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia vida em soro in vivo da molécula de IgG.
[0215] Anticorpos com ligação aprimorada ao receptor Fc neonatal (FcRn) e meias-vidas maiores são descritos em WO 00/42072 (Presta, L.). Estes anticorpos compreendem região Fc com uma ou mais substituições que aumentam a ligação da região Fc a FcRn. A região Fc pode possuir ainda substituições em uma ou mais dentre as posições 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434. A variante de anticorpo que compreende região Fc preferida com maior ligação de FcRn compreende substituições de aminoácidos em uma, duas ou três das posições 307, 380 e 434 da sua região Fc.
[0216] Anticorpos elaborados com três ou mais (preferencialmente quatro) sítios de ligação de antígenos funcionais também são contemplados (Pedido de Patente US 2002/0004587 A1, Miller et al).
[0217] Moléculas de ácidos nucléicos que codificam variantes da seqüência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por meio de uma série de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas sem limitar-se ao isolamento a partir de fonte natural (no caso de variantes de seqüências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por meio de mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou dirigida para sítio), mutagênese de PCR e mutagênese de conjunto de variante preparada anteriormente ou versão não variante do anticorpo.
(viii) Seleção de anticorpos com as propriedades desejadas [0218] Foram descritas acima as técnicas de geração de anticorpos. Pode-se selecionar adicionalmente anticorpos com certas características biológicas, conforme o desejado.
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85/138 [0219] Para identificar anticorpo que bloqueia a ativação de ligantes de receptor de HER, a capacidade do anticorpo de bloquear a ligação de ligantes HER a células que expressam o receptor de HER (tal como em conjugação com outro receptor de HER com o qual o receptor de HER de interesse forma heterooligômero de HER) pode ser determinada. Células que expressam naturalmente, ou transfectadas para expressar receptores de HER do heterooligômero de HER, por exemplo, podem ser incubadas com o anticorpo e expostas em seguida a ligante de HER marcado. A capacidade do anticorpo de bloquear a ligação de ligantes para o receptor de HER no heterooligômero de HER pode ser avaliada em seguida.
[0220] A inibição de ligação de HRG a linhagens de células de tumores de mama MCF7 por anticorpos HER2, por exemplo, pode ser realizada utilizando culturas de MCF7 monocamadas sobre gelo em formato de placas com 24 cavidades essencialmente conforme descrito em WO 01/00245. Anticorpos monoclonais HER2 podem ser adicionados a cada cavidade e incubados por trinta minutos. rHRGp1177-224 marcado com 125I (25 pm) pode ser adicionado em seguida e a incubação pode prosseguir por quatro a dezesseis horas. Curvas de reação à dosagem podem ser preparadas e valor IC50 pode ser calculado para o anticorpo de interesse. Em uma realização, o anticorpo que bloqueia a ativação de ligantes de receptor de HER terá IC50 para inibir a ligação de HRG a células MCF7 neste teste de cerca de 50 nM ou menos, de maior preferência 10 nM ou menos. Quando o anticorpo for fragmento de anticorpo tal como fragmento Fab, o IC50 para inibir a ligação de HRG a células MCF7 neste teste pode ser, por exemplo, de cerca de 100 nM ou menos, de maior preferência 50 nM ou menos.
[0221] Alternativa ou adicionalmente, pode-se determinar a capacidade de anticorpo de bloquear a fosforilação de tirosina estimulada por ligante HER de receptor HER presente em heterooligômero de HER. Células
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86/138 que expressam de forma endógena os receptores de HER ou transfectadas para expressá-las podem ser incubadas, por exemplo, com o anticorpo e testadas em seguida para determinar a atividade de fosforilação de tirosina dependente de ligante de HER utilizando monoclonal anti-fosfotirosina (que é opcionalmente conjugado com marcador detectável). O teste de ativação de receptor de quinase descrito na Patente US 5.766.863 também é disponível para determinar a ativação de receptor de HER e o bloqueio daquela atividade por anticorpo.
[0222] Em uma realização, pode-se selecionar anticorpo que iniba o estímulo por HRG de fosforilação de p180 tirosina em células MCF7, essencialmente conforme descrito em WO 01/00245. As células MCF7, por exemplo, podem ser colocadas em placas com 24 cavidades e anticorpos monoclonais para HER2 podem ser adicionados a cada cavidade e incubados por trinta minutos à temperatura ambiente; em seguida, pode-se adicionar rHRGp1 177-244 a cada cavidade até concentração final de 0,2 nM e a incubação pode prosseguir por oito minutos. Meios podem ser aspirados de cada cavidade e as reações podem ser suspensas por meio da adição de 100 pl de tampão de amostra SDS (5% SDS, 25 mM de DTT e 25 mM de Tris-HCl, pH 6,8). Cada amostra (25 pl) pode sofrer eletroforese sobre gel de gradiente 4 a 12% (Novex) e, em seguida, transferida eletroforeticamente para membrana de difluoreto de polivinilideno. Antifosfotirosina (a 1 pg/ml) podem ser desenvolvidas e a intensidade da faixa reativa predominante a Mr -180.000 pode ser quantificada por meio de densitometria de reflexão. O anticorpo selecionado preferencialmente inibirá significativamente o estímulo de HRG de fosforilação de p180 tirosina até cerca de 0 a 35% do controle neste teste. Curva de reação à dosagem para inibir o estímulo por HRG de fosforilação de p180 tirosina conforme determinado por meio de densitometria de reflexão pode ser preparada e pode-se calcular IC50 para o
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87/138 anticorpo de interesse. Em uma realização, o anticorpo que bloqueia a ativação de ligantes de receptor de HER terá IC50 para inibir o estímulo de HRG de fosforilação de p180 tirosina neste teste de cerca de 50 nM ou menos, de maior preferência 10 nM ou menos. Quando o anticorpo for fragmento de anticorpo tal como fragmento Fab, o IC50 para inibir o estímulo de HRG de fosforilação de p180 tirosina neste teste pode ser, por exemplo, de cerca de 100 nM ou menos, de maior preferência 50 nM ou menos.
[0223] Pode-se também determinar os efeitos inibidores do crescimento do anticorpo sobre células MDA-MB-175, tal como essencialmente conforme descrito em Schaefer et al, Oncogene 15: 1385-1394 (1997). Segundo este teste, células MDA-MB-175 podem ser tratadas com anticorpo monoclonal HER2 (10 pg/ml) por quatro dias e manchadas com violeta de cristal. A incubação com anticorpo de HER2 pode exibir efeito inibidor do crescimento sobre esta linhagem celular similar ao exibido pelo anticorpo monoclonal 2C4. Em realização adicional, HRG exógeno não reverterá significativamente esta inibição. Preferencialmente, o anticorpo será capaz de inibir a proliferação celular de células MDA-MB-1 75 até ponto maior que o anticorpo monoclonal 4D5 (e, opcionalmente, até ponto maior que o anticorpo monoclonal 7F3), tanto na presença quanto na ausência de HRG exógeno.
[0224] Em uma realização, o anticorpo HER2 de interesse pode bloquear a associação dependente de herregulina de HER2 com HER3 em células MCF7 e SK-BR-3 conforme determinado em experimento de coimunoprecipitação tal como descrito em WO 01/00245 de forma substancialmente mais eficaz que o anticorpo monoclonal 4D5, preferencialmente de forma substancialmente mais eficaz que o anticorpo monoclonal 7F3.
[0225] Para identificar anticorpos HER2 inibidores do crescimento, pode-se selecionar anticorpos que inibam o crescimento de células cancerosas
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88/138 que superexpressam HER2. Em uma realização, o anticorpo inibidor do crescimento selecionado é capaz de inibir o crescimento de células SK-BR-3 em cultura celular em cerca de 20 a 100% e, preferencialmente, em cerca de 50 a 100% em concentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 pg/ml. Para identificar esses anticorpos, pode ser realizado o teste SK-BR-3 descrito na Patente US 5.677.171. Segundo este teste, células SK-BR-3 são cultivadas em mistura 1:1 de F12 e meio DMEM suplementada com 10% soro de feto bovino, glutamina e penicilino estreptomicina. As células SK-BR-3 são colocadas em placas a 20.000 células em placa de cultura celular de 35 mm (2 ml/placa de 35 mm). 0,5 a 30 pg/ml do anticorpo HER2 são adicionados por placa. Após seis dias, a quantidade de células, em comparação com células não tratadas, é contada utilizando contador celular eletrônico COULTER®. Os anticorpos que inibem o crescimento das células SK-BR-3 em cerca de 20 a 100% ou cerca de 50 a 100% podem ser selecionados como anticorpos inibidores do crescimento. Vide a Patente US 5.677.171 para testes de seleção de anticorpos inibidores de crescimento, tais como 4D5 e 3E8.
[0226] A fim de selecionar anticorpos que induzem apoptose, é disponível teste de ligação de anexina utilizando células BT474. As células BT474 são cultivadas e semeadas em placas conforme discutido no parágrafo anterior. O meio é removido em seguida e substituído com meio novo isolado ou meio que contém 10 pg/ml do anticorpo monoclonal. Após período de incubação de três dias, monocamadas são lavadas com PBS e destacadas por meio de tripsinização. As células são centrifugadas em seguida, novamente suspensas em tampão de ligação de Ca2+ e parceladas em tubos conforme discutido acima para o teste de morte celular. Os tubos recebem então anexina marcada (tal como anexina V-FTIC) (1 pg/ml). As amostras podem ser analisadas utilizando um citômetro de fluxo FACSCAN® e “software” FACSCONVERT® CellQuest (Becton Dickinson). Os anticorpos que induzem
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89/138 níveis estatisticamente significativos de ligação de anexina com relação ao controle são selecionados como anticorpos indutores da apoptose. Além do teste de ligação de anexina, é disponível teste de manchas de DNA utilizando células BT474. A fim de realizar este teste, células BT474 que foram tratadas com o anticorpo de interesse descrito nos dois parágrafos anteriores são incubadas com 9 pg/ml de HOECHST 33342® por duas horas a 37 °C, analisadas em seguida em citômetro de fluxo EPICS ELITE® (Coulter Corporation) utilizando software MODFIT LT® (Verity Software House). Anticorpos que induzem alteração do percentual de células apoptóticas que é de duas vezes ou mais (preferencialmente três vezes ou mais) que as células não tratadas (até 100% de células apoptóticas) podem ser selecionados como anticorpos pró-apoptóticos utilizando este teste. Vide WO 98/17797 para testes de seleção de anticorpos que induzem a apoptose, tais como 7C2 e 7F3.
[0227] Para selecionar anticorpos que se liguem a um epítopo sobre HER2 ligado por anticorpo de interesse, pode-se realizar teste bloqueador cruzado de rotina, tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), para determinar se o anticorpo provoca bloqueio cruzado da ligação de anticorpo, tal como 2C4 ou pertuzumab, a HER2. Alternativa ou adicionalmente, o mapeamento de epítopos pode ser realizado por meio de métodos conhecidos na técnica e/ou pode-se estudar a estrutura de anticorpo e HER2 (Franklin et al, Cancer Cell 5: 317-328 (2004)) para observar qual(is) domínio(s) de HER2 é(são) ligado(s) pelo anticorpo.
(ix) Composições de pertuzumab [0228] Em uma realização de composição de anticorpo HER2, a composição compreende mistura de anticorpo pertuzumab de espécie principal e uma ou mais de suas variantes. A realização preferida na presente invenção da espécie de anticorpo principal de pertuzumab é a que compreende as
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90/138 seqüências de aminoácidos leve variável e pesada variável em SEQ ID NO: 3 e 4 e, de preferência superior, que compreende seqüência de aminoácidos de cadeia leve de SEQ ID N° 13 e 17 e seqüência de aminoácidos de cadeia pesada de SEQ ID N° 14 e 18 (incluindo variantes desamidadas e/ou oxidadas destas seqüências). Em uma realização, a composição compreende mistura do anticorpo pertuzumab de espécie principal e sua variante de seqüência de aminoácidos que compreende extensão líder amino-terminal. Preferencialmente, a extensão líder amino-terminal encontra-se sobre cadeia leve da variante de anticorpo (tal como sobre uma ou duas cadeias leves da variante de anticorpo). O anticorpo HER2 de espécie principal ou a variante de anticorpo pode ser anticorpo de comprimento total ou fragmento de anticorpo (tal como Fab de fragmentos F(ab')2), mas preferencialmente ambos são anticorpos de comprimento total. A variante de anticorpo na presente invenção pode compreender extensão líder amino-terminal sobre qualquer uma ou mais das suas cadeias leve ou pesada. Preferencialmente, a extensão líder aminoterminal encontra-se sobre uma ou duas cadeias leves do anticorpo. A extensão líder amino-terminal preferencialmente compreende ou consiste de VHS-. A presença da extensão líder amino-terminal na composição pode ser detectada por meio de vários métodos analíticos que incluem, mas sem limitarse a análise de seqüências N-terminais, teste de heterogeneidade de carga (tal como cromatografia de intercâmbio de cátions ou eletroforese da zona capilar), espectrometria de massa etc. A quantidade da variante de anticorpo na composição geralmente varia de quantidade que constitui o limite de detecção de qualquer teste (preferencialmente análise de seqüência N-terminal) utilizado para detectar a variante em quantidade menor que a quantidade do anticorpo de espécie principal. Geralmente, cerca de 20% ou menos (tal como cerca de 1% a cerca de 15%, por exemplo 5% a cerca de 15%) das moléculas de anticorpos na composição compreendem extensão líder amino-terminal. Estes
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91/138 números percentuais são preferencialmente determinados utilizando análise de seqüências N-terminais quantitativas ou análise de intercâmbio de cátions (utilizando preferencialmente coluna de intercâmbio de cátions fracos de alta resolução, tal como coluna de intercâmbio de cátions PROPAC WCX-10®). Além da variante de extensão líder amino-terminal, alterações de seqüências de aminoácidos adicionais da espécie de anticorpo principal e/ou variante são contempladas, incluindo mas sem limitar-se a anticorpo que compreende resíduo de lisina C-terminal sobre uma ou as suas duas cadeias pesadas, variante de anticorpo desamidada etc.
[0229] Além disso, a espécie de anticorpo principal ou variante pode compreender ainda variações de glicosilação, cujos exemplos não limitadores incluem anticorpo que compreende estrutura de oligossacarídeo G1 ou G2 ligada à sua região Fc, anticorpo que compreende porção carboidrato ligada a uma de suas cadeias leves (tal como uma ou duas porções carboidrato, como glicose ou galactose, ligadas a uma ou duas cadeias leves do anticorpo, tais como ligadas a um ou mais resíduos de lisina), anticorpo que compreende uma ou duas cadeias pesadas não glicosiladas ou anticorpo que compreende oligossacarídeo sialidado ligado a uma ou duas de suas cadeias pesadas etc.
[0230] A composição pode ser recuperada a partir de linhagem celular elaborada geneticamente, tal como linhagem de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) que expressam o anticorpo HER2, ou pode ser preparada por meio de síntese de peptídeos.
(X) IMUNOCONJUGADOS [0231] A presente invenção também se refere à imunoconjugados que compreendem anticorpo conjugado a agente citotóxico tal como agente quimioterápico, toxina (como toxina de moléculas pequenas ou toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal,
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92/138 incluindo seus fragmentos e/ou variantes) ou isótopo radioativo (ou seja, radioconjugado).
[0232] Os agentes quimioterápicos úteis na geração desses imunoconjugados foram descritos acima. Conjugados de anticorpo e uma ou mais toxinas de moléculas pequenas, tais como caliqueamicina, maitansina (Patente US 5.208.020), tricoteno e CC1065, também são contemplados na presente invenção.
[0233] Em realização preferida da presente invenção, o anticorpo é conjugado a uma ou mais moléculas de maitansina (tal como cerca de uma a cerca de dez moléculas de maitansina por molécula de anticorpo). Maitansina pode ser convertida, por exemplo, em May-SS-Me, que pode ser reduzido em May-SH3 e reagido com anticorpo modificado (Chari et al, Cancer Research 52: 127-131 (1992)) para gerar imunoconjugado de anticorpo e maitansinóide.
[0234] Outro imunoconjugado de interesse compreende anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir rupturas de DNA de fita dupla em concentrações subpicomolares. Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas sem limitar-se a γ^, a2I, a3I, N-acetil-y1I, PSAG e 0I1 (Hinman et al, Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) e Lode et al, Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)). Vide também as Patentes US 5.714.586, US 5.712.374, US 5.264.586 e US 5.773.001, expressamente incorporadas a presente invenção como referência.
[0235] Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não de ligação da toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia rícina A, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfasarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia,
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93/138 curcina, crotina, inibidor Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Vide, por exemplo, WO 93/21232, publicada em 28 de outubro de 1993.
[0236] A presente invenção contempla adicionalmente imunoconjugado formado entre anticorpo e composto com atividade nucleolítica (por exemplo, ribonuclease ou endonuclease de DNA, tal como desoxirribonuclease; DNase).
[0237] Uma série de isótopos radioativos é disponível para a produção de anticorpos HER2 rádio-conjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu.
[0238] Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser fabricados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Podese preparar, por exemplo, imunotoxina rícina, conforme descrito em Vitetta et al, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é exemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide WO 94/11026. A ligação pode ser “ligação divisível” que possibilita a liberação da droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, ligante instável ácido, ligante sensível a peptidase, ligante de dimetila ou ligante que contém dissulfeto (Chari et al, Cancer Research 52: 127-131 (1992)).
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94/138 [0239] Alternativamente, pode ser fabricada proteína de fusão que compreende o anticorpo e agente citotóxico, por exemplo, por meio de técnicas recombinantes ou síntese de peptídeos.
[0240] Outros imunoconjugados são contemplados na presente invenção. O anticorpo pode ser ligado, por exemplo, a um dentre uma série de polímeros não proteináceos, tais como polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. O anticorpo pode também ser capturado em microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de acumulação ou polimerização interfacial (por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente) em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Estas técnicas são descritas em RemingtonS Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A., Ed. (1980).
[0241] Os anticorpos descritos na presente invenção podem também ser formulados como imunolipossomos. Os lipossomos que contêm o anticorpo são preparados por meio de métodos conhecidos na técnica, conforme descrito em Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 82: 3688 (1985); Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 77: 4030 (1980); Patentes US 4.485.045 e US 4.544.545; e WO 97/38731 publicada em 23 de outubro de 1997. Lipossomos com maior tempo de circulação são descritos na Patente US 5.013.556.
[0242] Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados por meio do método de evaporação de fase reversa com composição de lipídios que compreende fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Os lipossomos são extrudados por meio de filtros com tamanho de poro definido para gerar lipossomos com o diâmetro desejado. Os
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95/138 fragmentos Fab' do anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser conjugados aos lipossomos descritos em Martin et al, J. Biol. Chem. 257: 286288 (1982) por meio de reação de troca de dissulfetos. Agente quimioterápico é opcionalmente contido no interior do lipossomo. Vide Gabizon et al, J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).
III. Seleção de Pacientes para Terapia [0243] O paciente na presente invenção é opcionalmente submetido a teste de diagnóstico antes da terapia. O teste de diagnóstico pode, por exemplo, avaliar a expressão (incluindo superexpressão), amplificação e/ou ativação de HER (tal como HER2 ou EGFR), incluindo fosforilação ou dimerização.
[0244] Geralmente, caso seja realizado teste de diagnóstico, pode-se obter amostra de paciente necessitado de terapia. Quando o paciente for portador de câncer, a amostra geralmente é amostra de tumor. Na realização preferida, a amostra de tumor é amostra de tumor de câncer do ovário, câncer peritoneal, câncer de trompa de falópio, câncer de mama metastático (MBC), câncer de pulmão de células não-pequenas (NSCLC), câncer de próstata ou câncer colorretal.
[0245] Observou-se, entretanto, que várias outras indicações terapêuticas não malignas para anticorpos HER são descritas na presente invenção. Quando o paciente necessitar ser tratado para estas indicações não malignas, amostra apropriada pode ser obtida do paciente e submetida a teste de diagnóstico conforme descrito na presente invenção.
[0246] A amostra biológica da presente invenção pode ser amostra fixa, tal como amostra embutida em parafina e fixa com formalina (FFPE) ou amostra congelada.
[0247] Segundo realização preferida da presente invenção, o paciente selecionado para terapia possui tumor que exibe ativação de HER (e,
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96/138 preferencialmente, HER2). Em uma realização, a extensão da ativação de HER (ou HER2) em células cancerosas excede significativamente o nível de ativação daquele receptor em células não cancerosas do mesmo tipo de tecido. Essa ativação excessiva pode resultar da superexpressão do receptor de HER e/ou níveis maiores que os normais de ligante de HER disponível para ativar o receptor de HER nas células cancerosas. Essa ativação excessiva pode causar e/ou ser causada pelo estado maligno de células cancerosas. Em algumas realizações, o câncer será submetido a teste de diagnóstico ou prognóstico para determinar se está ocorrendo amplificação e/ou superexpressão de receptor de HER que resulte nessa ativação excessiva do receptor de HER. Alternativa ou adicionalmente, o câncer pode ser submetido a teste de diagnóstico ou prognóstico para determinar se está ocorrendo amplificação e/ou superexpressão de ligante de HER no câncer que seja atribuída à ativação excessiva do receptor. Em subconjunto desses cânceres, ativação excessiva do receptor pode resultar de processo estimulador autócrino. Vários testes para determinar a ativação de HER serão descritos em mais detalhes abaixo.
(I) Dímeros de HER [0248] Amostras de tumores podem ser testadas para determinar a presença de dímeros de HER, como indicando ativação de HER2 ou HER. Qualquer método conhecido na técnica pode ser utilizado para detectar dímeros de HER2, tais como EGFR-HER2, HER2-HER3, em tumores. Vários métodos preferidos são descritos abaixo. Estes métodos detectam interações entre proteínas não covalentes ou indicam de outra forma a proximidade entre proteínas de interesse.
[0249] Métodos com base em imunoafinidade, tais como imunoprecipitação ou ELISA, podem ser utilizados para detectar dímeros de HER. Em uma realização, anticorpos de HER2 são utilizados para imunoprecipitar complexos que compreendem HER2 de células tumorosas e o
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97/138 imunoprecipitante resultante é sondado em seguida para determinar a presença de EGFR ou HER3 por meio de imunomanchas. Em outra realização, anticorpos EGFR ou HER3 podem ser utilizados para a etapa de imunoprecipitação e o imunoprecipitante é sondado em seguida com anticorpos HER2. Em realização adicional, ligantes de HER específicos para EGFR, HER3, complexos de EGFR e HER2 ou complexos de HER e HER3 podem ser utilizados para precipitar complexos, que são sondados em seguida para determinar a presença de HER2. Ligantes podem ser conjugados, por exemplo, a avidina e os complexos purificados sobre coluna de biotina.
[0250] Em outras realizações, tais como ELISA ou testes do tipo “sanduíche” de anticorpos, os anticorpos para HER2 são imobilizados sobre suporte sólido, colocados em contato com células tumorosas ou lisato de células tumorosas, lavados e expostos em seguida a anticorpo contra EGFR ou HER3. A ligação do último anticorpo, que pode ser detectada diretamente ou por anticorpo secundário conjugado a um marcador detectável, indica a presença de heterodímeros. Em certas realizações, anticorpo HER3 ou EGFR é imobilizado e anticorpo HER2 é utilizado para a etapa de detecção. Em outras realizações, ligantes de HER podem ser utilizados no lugar de anticorpos de HER ou em combinação com estes.
[0251] Retícula UV ou química pode também ser utilizada para ligar covalentemente dímeros sobre a superfície de células vivas. Hunter et al, Biochem. J., 320: 847-53. Exemplos de reticulantes químicos incluem ditiobis(succinimidil) propionato (DSP) e 3,3’-ditiobis(sulfossuccinimidil) propionato (DTSSP). Em uma realização, extratos celulares de células de tumores reticuladas quimicamente são analisados por meio de SDS-PAGE e imunomanchados com anticorpos para EGFR e/ou HER3. Faixa superalterada com peso molecular apropriado muito provavelmente representa dímeros de EGFR-HER2 ou HER2-HER3, pois HER2 é o parceiro de dimerização preferido
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98/138 para EGFR e HER3. Este resultado pode ser confirmado por meio de imunomanchas subseqüentes com anticorpos HER2.
[0252] Transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) pode também ser utilizada para detectar dímeros de EGFR-HER2 ou HER2-HER3. FRET detecta alterações conformacionais de proteínas e interações entre proteínas in vivo e in vitro com base na transferência de energia de fluoroforo doador para fluoroforo receptor. Selvin, Nat. Struct. Biol. 7: 730-34 (2000). A transferência de energia tem lugar somente se o fluoroforo doador encontrar-se em proximidade suficiente do fluoroforo receptor. Em experimento FRET típico, duas proteínas ou dois sítios sobre uma única proteína são marcados com sondas fluorescentes diferentes. Uma das sondas, a sonda doadora, é excitada até estado de energia superior por luz incidente com comprimento de onda específica. A sonda doadora transmite em seguida a sua energia para a segunda sonda, a sonda receptora, o que resulta em redução da intensidade de fluorescência do doador e aumento da emissão de fluorescência do receptor. Para medir a extensão da transferência de energia, a intensidade do doador em amostra marcada com sondas doadoras e receptoras é comparada com a sua intensidade em amostra marcada somente com sonda doadora. Opcionalmente, a intensidade do receptor é comparada em amostras de doador e receptor e somente de receptor. Sondas apropriadas são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, tinturas que penetram nas membranas, tais como fluoresceína e rodamina, tinturas orgânicas, tais como tinturas de cianina e átomos de lantanídeos. Selvin, acima. Métodos e instrumentação para detectar e medir transferência de energia também são conhecidos na técnica. Selvin, acima.
[0253] Métodos com base em FRET apropriados para detectar e medir interações entre proteínas em células individuais também são conhecidos na técnica. Microscopia de transferência de energia por ressonância de fluorescência fotomanchadora (pbFRET) de doador e
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99/138 microscopia de formação de imagens em tempo real por fluorescência (FLIM), por exemplo, podem ser utilizadas para detectar a dimerização de receptores da superfície celular. Selvin, acima; Gadella & Jovin, J. Cell Biol., 129: 1543-58 (1995). Em uma realização, pbFRET é utilizada sobre células “em suspensão” ou in situ para detectar e medir a formação de dímeros de EGFR e HER2 ou HER2 e HER3, conforme descrito em Nagy et al, Cytometry, 32: 120-131 (1998). Estes métodos medem a redução do tempo de vida de fluorescência do doador devido à transferência de energia. Em realização específica, pode-se utilizar método de FRET do tipo Foerster citométrico de fluxo (FCET) para investigar a dimerização de EGFR-HER2 e HER2-HER3, conforme descrito em Nagy et al, acima, e Brockhoff et al, Cytometry, 44: 338-48 (2001).
[0254] FRET é utilizado preferencialmente em conjunto com métodos de marcação imunohistoquímica padrão. Kenworthy, Methods, 24: 289-96 (2001). Anticorpos conjugados a tinturas fluorescentes apropriadas, por exemplo, podem ser utilizados como sondas para marcação de duas proteínas diferentes. Caso as proteínas se encontrem próximas entre si, as tinturas fluorescentes agem como doadores e receptores para FRET. A transferência de energia é detectada por meios padrão. A transferência de energia pode ser detectada por meios citométricos de fluxo ou por sistemas de microscopia digital, tais como microscopia confocal ou microscopia de fluorescência de campo amplo acoplada à câmera de dispositivo acoplado a carga (CCD).
[0255] Em realização da presente invenção, anticorpos HER2 e anticorpos EGFR ou HER3 são marcados diretamente com dois fluoroforos diferentes, tal como conforme descrito em Nagy et al, acima. Células de tumores ou lisatos de células de tumores são colocados em contato com anticorpos marcados de forma diferencial, que agem como doadores e receptores para FRET na presença de dímeros de EGFR e HER2 ou HER2 e HER3. Alternativamente, anticorpos não marcados contra HER2 e EGFR ou
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HER3 são utilizados junto com anticorpos secundários marcados de forma diferencial que servem de doadores e receptores. Vide, por exemplo, Brockhoff et al, acima. A transferência de energia é detectada e a presença de dímeros é determinada caso os marcadores sejam encontrados em boa proximidade.
[0256] Em outras realizações, ligantes de receptores de HER que são específicos para HER2 e HER1 ou HER3 são marcados de forma fluorescente e utilizados para estudos FRET.
[0257] Em ainda outras realizações da presente invenção, a presença de dímeros sobre a superfície de células de tumores é demonstrada por meio de colocalização de HER2 com EGFR ou HER3 utilizando métodos de imunofluorescência direta ou indireta padrão e microscopia de varredura a laser confocal. Alternativamente, formação de imagens por varredura a laser (LSI) é utilizada para detectar a ligação de anticorpos e colocalização de HER2 com EGFR ou HER3 em formato de alto rendimento, tal como placa de microcavidades, conforme descrito em Zuck et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 96: 11122-27 (1999).
[0258] Em realizações adicionais, a presença de dímeros de EGFR e HER2 e/ou HER2 e HER3 é determinada identificando-se atividade enzimática que é dependente da proximidade dos componentes dos dímeros. Anticorpo HER2 é conjugado com uma enzima e anticorpo EGFR ou HER3 é conjugado com segunda enzima. Primeiro substrato para a primeira enzima é adicionado e a reação produz segundo substrato para a segunda enzima. Isso gera reação com outra molécula para produzir composto detectável, tal como tintura. A presença de outra substância decompõe o segundo substrato, de forma que a reação com a segunda enzima seja evitada, a menos que as primeira e segunda enzimas, e desta forma os dois anticorpos, encontrem-se em boa proximidade. Em realização específica, células de tumores ou lisatos celulares são colocados em contato com anticorpo HER2 que é conjugado com
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101/138 glicose oxidase e anticorpo HER3 ou HER1 que é conjugado com peroxidase de rabanete silvestre. Adiciona-se glicose à reação, junto com precursor de tintura, tal como DAB, e catalase. A presença de dímeros é determinada pelo desenvolvimento de coloração mediante manchas para DAB.
[0259] Os dímeros podem também ser detectados utilizando métodos com base no sistema de teste eTag® (Aclara Bio Sciences, Mountain View CA), conforme descrito, por exemplo, no Pedido de Patente US 2001/0049105, publicado em seis de dezembro de 2001, ambos os quais são expressamente incorporados integralmente como referência. eTag®, ou “marcador eletroforético”, compreende porção receptora detectável, tal como grupo fluorescente. Ela pode também compreender “modificador da mobilidade”, que consiste essencialmente de porção que possui mobilidade eletroforética exclusiva. Estas porções permitem a separação e detecção da eTag® a partir de mistura complexa sob condições eletroforéticas definidas, tais como eletroforese capilar (CE). A porção da eTag® que contém a porção relatora e, opcionalmente, o modificador da mobilidade, é ligada a primeira porção de ligação alvo por grupo ligante divisível para produzir primeiro composto de ligação. A primeira porção de ligação alvo reconhece especificamente primeiro alvo específico, tal como ácido nucléico ou proteína. A primeira porção de ligação alvo não é limitada de nenhuma forma e pode ser, por exemplo, polinucleotídeo ou polipeptídeo. Preferencialmente, a primeira porção de ligação alvo é anticorpo ou fragmento de anticorpo. Alternativamente, a primeira porção de ligação alvo pode ser ligante receptor de HER ou seu fragmento competente de ligação.
[0260] O grupo ligante compreende preferencialmente porção divisível, tal como substrato de enzima, ou qualquer ligação química que possa ser dividida sob condições definidas. Quando a primeira porção de ligação alvo liga-se ao seu alvo, o agente divisor é introduzido e/ou ativado e o grupo ligante
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102/138 é dividido, de forma a liberar a porção de eTag® que contém a porção relatora e modificador da mobilidade. Desta forma, a presença de eTag® “livre” indica a ligação da porção de ligação alvo ao seu alvo.
[0261] Preferencialmente, segundo composto de ligação compreende o agente divisor e segunda porção de ligação alvo que reconhece especificamente segundo alvo. A segunda porção de ligação alvo também não é limitada, de nenhuma forma, e pode ser, por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo ou ligante receptor de HER ou fragmento ligante competente de ligação. O agente divisor é tal que dividirá apenas o grupo ligante no primeiro composto de ligação caso o primeiro composto de ligação e o segundo composto de ligação estejam em boa proximidade.
[0262] Em realização da presente invenção, primeiro composto de ligação compreende eTag® na qual anticorpo para HER2 serve de primeira porção de ligação alvo. Segundo composto de ligação compreende anticorpo para EGFR ou HER3 ligado a agente de divisão capaz de dividir o grupo ligante da eTag®. Preferencialmente, o agente de divisão deve ser ativado, a fim de poder dividir o grupo de ligação. Células de tumores ou lisatos de células de tumores são colocados em contato com a eTag®, que se liga ao HER2 e com o anticorpo EGFR ou HER3 modificado, que se liga ao EGFR ou HER3 sobre a superfície celular. Composto de ligação não ligado é preferencialmente removido e o agente de divisão é ativado, se necessário. Caso estejam presentes dímeros de EGFR e HER2 ou HER2 e HER3, o agente de divisão dividirá o grupo de ligação e liberará a eTag® devido à proximidade entre o agente de divisão e o grupo de ligação. eTag® livre pode ser detectada em seguida por meio de qualquer método conhecido na técnica, tal como eletroforese capilar.
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103/138 [0263] Em uma realização, o agente de divisão é substância química ativável que age sobre o grupo de ligação. O agente de divisão pode ser ativado, por exemplo, expondo-se a amostra à luz.
[0264] Em outra realização, a eTag® é construída utilizando anticorpo para EGFR ou HER3 como a primeira porção de ligação alvo e o segundo composto de ligação é construído a partir de anticorpo para HER2.
[0265] Em ainda outra realização, o dímero de HER é detectado utilizando anticorpo ou outro reagente que se liga específica ou preferencialmente ao dímero em comparação com a sua ligação a qualquer receptor de HER no dímero.
(ii) Fosforilação de HER2 [0266] Imunoprecipitação com anticorpo EGFR, HER2 ou HER3 conforme discutido no capítulo anterior pode ser opcionalmente seguida por teste funcional para dímeros, como alternativa ou suplemento para imunomanchas. Em uma realização, imunoprecipitação com anticorpo HER3 é seguida por teste para determinar a atividade de tirosina quinase receptora no imunoprecipitante. Como HER3 não possui atividade de tirosina quinase intrínseca, a presença de atividade de tirosina quinase no imunoprecipitante indica que HER3 é mais provavelmente associado a HER2. Graus-Porta et al, EMBO J., 16: 1647-55 (1997); Klapper et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 96: 4995-5000 (1999). Este resultado pode ser confirmado por meio de imunomanchas com anticorpos HER2. Em outra realização, imunoprecipitação com anticorpo HER2 é seguida por teste para determinar a atividade de tirosina quinase receptora de EGFR. Neste teste, o imunoprecipitante é colocado em contato com ATP radioativo e substrato de peptídeo que imita o sítio in vivo de transfosforilação de HER2 por EGFR. A fosforilação do peptídeo indica coimunoprecipitação e, desta forma, a dimerização de EGFR com HER2. Testes de atividade de tirosina quinase receptora são bem conhecidos na técnica e incluem testes que detectam a fosforilação de substratos alvo, tais como por anticorpo de
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104/138 fosfotirosina, e a ativação de processos de transdução de sinal cognatos, tais como o processo de MAPK.
[0267] A fosforilação de receptor de HER pode ser determinada por meio de imunoprecipitação de um ou mais receptores de HER, tais como receptor de HER2, e análise Western Blot. A positividade é determinada, por exemplo, por meio da presença de faixa fosfo-HER2 sobre o gel, utilizando anticorpo antifosfotirosina para detectar resíduo(s) de tirosina fosforilado(s) no(s) receptor(es) de HER imunoprecipitado(s). Anticorpos anti-fosfotirosina são disponíveis comercialmente por meio da PanVera (Madison WI), subsidiária da Invitrogen, Chemicon International Inc. (Temecula CA) ou Upstate Biotechnology (Lake Placid NY). A negatividade é determinada pela ausência da faixa.
[0268] Em outra realização, a fosforilação de receptor de HER2 (HER2) é determinada por meio de imunohistoquímica utilizando anticorpo HER2 fosfoespecífico (clone PN2A; Thor et al, J. Clin. Oncol., 18 (18): 3230-3239 (2000)).
[0269] Outros métodos de detecção da fosforilação de receptor(es) de HER incluem, mas sem limitar-se a KIRA ELISA (Patentes US 5.766.863, US 5.891.650, US 5.914.237, US 6.025.145 e US 6.287.784), espectrometria de massa (comparando o tamanho de HER2 fosforilado e não fosforilado) e teste de proximidade de e-tag com anticorpo HER (tal como HER2) e anticorpo fosfoespecífico ou específico de fosfotirosina (utilizando, por exemplo, o kit de teste eTag® disponível por meio da Aclara BioSciences (Mountain View CA). Detalhes do teste eTag são descritos acima.
[0270] Pode-se também utilizar anticorpos fosfoespecíficos em conjunto celular para detectar a situação de fosforilação em amostra celular de proteína de transdução de sinal (US 2003/0190689).
(iii) Perfil de expressão genética [0271] Em uma realização, análises de expressão genética podem servir de subordinado para medir a ativação ou fosforilação de HER
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105/138 diretamente. Isso é particularmente útil quando a amostra for amostra fixa (tal como amostra de tumor fixada com formalina embutida com parafina) em que a fosforilação de HER pode ser de difícil quantificação de forma confiável. Segundo este método, a expressão de dois ou mais receptores de HER e um ou mais ligantes HER em amostra é(são) avaliada(s), em que a expressão dos dois ou mais receptores de HER e um ou mais ligantes de HER indica ativação ou fosforilação de HER positiva na amostra. Em uma realização deste método, a expressão de betacelulina e/ou anfirregulina na amostra pode ser medida, em que a expressão de betacelulina e/ou anfirregulina indica ativação ou fosforilação de HER positiva na amostra.
[0272] Segundo este método, amostra do paciente é testada para determinar a expressão de dois ou mais receptores de HER (preferencialmente selecionados a partir de EGFR, HER2 e HER3) e um ou mais ligantes de HER (preferencialmente selecionados a partir de betacelulina, anfirregulina, epirregulina e TGF-α, de maior preferência betacelulina ou anfirregulina). Os dois ou mais receptores de HER, por exemplo, podem ser EGFR e HER2, ou HER2 e HER3. Preferencialmente, é determinada a expressão de HER2 e EGFR ou HER3, bem como betacelulina ou anfirregulina. A amostra pode ser testada para determinar a expressão de betacelulina ou anfirregulina isoladamente, ou em combinação com testes de expressão de dois ou mais receptores de HER. A expressão positiva do(s) gene(s) identificado(s) indica que o paciente é candidato a terapia com anticorpo HER, tal como pertuzumab. Além disso, a expressão positiva do(s) gene(s) indica que o paciente é mais propenso a reagir favoravelmente à terapia com o anticorpo HER que paciente que não apresenta essa expressão positiva.
[0273] Vários métodos de determinação da expressão de mRNA ou proteína incluem, mas sem limitar-se a formação de perfis de expressão
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106/138 genética, reação em cadeia de polimerase (PCR) incluindo PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR), análise por microarray, análise em série da expressão genética (SAGE), MassARRAY, Análise de Expressão Genética por meio de Seqüenciamento de Assinaturas Massivamente Paralelas (MPSS), proteômicos, imunohistoquímica (IHC) etc. Preferencialmente, é quantificado mRNA. Essa análise de mRNA é preferencialmente realizada utilizando o método de reação em cadeia da polimerase (PCR) ou por meio de análise por microarray. Ao empregar-se PCR, forma preferida de PCR é PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR). Em uma realização, a expressão de um ou mais dos genes indicados acima é considerada expressão positiva caso esteja no meio ou acima, por exemplo, em comparação com outras amostras do mesmo tipo de tumor. O nível médio de expressão pode ser determinado de forma essencialmente simultânea com a medição da expressão genética, ou pode haver sido determinado anteriormente.
[0274] Vários exemplos de métodos de determinação da expressão genética. As etapas de protocolo representativo para a formação de perfis de expressão genética utilizando tecidos fixos embutidos em parafina como a fonte de RNA, incluindo isolamento de RNA, purificação, extensão de primers e amplificação são fornecidas em vários artigos publicados (por exemplo: Godfrey et al, J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Specht et al, Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). Resumidamente, processo representativo iniciase com o corte de seções com cerca de dez microgramas de espessura de amostras de tecido tumoroso embutido em parafina. O RNA é extraído em seguida e proteína e DNA são removidos. Após a análise da concentração de RNA, podem ser incluídas etapas de amplificação e/ou reparo de RNA, se necessário, e RNA é transcrito reverso utilizando promotores específicos de genes seguidos por PCR. Por fim, os dados são analisados para identificar a(s) melhor(es) opção(ões) de tratamento disponível(is) para o paciente com base
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107/138 no padrão de expressão genética característico identificado na amostra de tumor examinada.
(iv) Expressão e amplificação de HER [0275] Para determinar a expressão ou amplificação de HER no câncer, são disponíveis diversos testes de diagnóstico/prognóstico. Em uma realização, a superexpressão de HER pode ser analisada por meio de IHC, utilizando, por exemplo, o HERCEPTEST® (Dako). Seções de tecidos embutidas em parafina da biópsia de tumor podem ser submetidas ao teste IHC de acordo com os critérios de intensidade de manchas de proteína HER2 a seguir:
[0276] Nota 0: não se observa nenhuma mancha ou a mancha de membranas é observada em menos de 10% de células tumorosas.
[0277] Nota 1+: é detectada mancha de membrana fraca/pouco perceptível em mais de 10% das células tumorosas. As células somente são manchadas em parte da sua membrana.
[0278] Nota 2+: é detectada mancha completa de membrana fraca a moderada em mais de 10% das células tumorosas.
[0279] Nota 3+: é detectada mancha completa de membrana moderada a forte em mais de 10% das células tumorosas.
[0280] Os tumores com notas 0 ou 1+ para determinação da superexpressão de HER2 podem ser caracterizados como não superexpressando HER2, enquanto os tumores com notas 2+ ou 3+ podem ser caracterizados como superexpressando HER2.
[0281] Os tumores que superexpressam HER2 são avaliados por meio de avaliações imunohistoquímicas correspondentes à quantidade de cópias de moléculas HER2 expressas por célula e podem ser determinados bioquimicamente:
= 0-10.000 cópias/célula;
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1+ = pelo menos cerca de 200.000 cópias/célula;
2+ = pelo menos cerca de 500.000 cópias/célula;
3+ = pelo menos cerca de 2.000.000 cópias/célula;
[0282] A superexpressão de HER2 no nível 3+, que gera ativação independente de ligantes da tirosina quinase (Hudziak et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 84: 7159-7163 (1987)), ocorre em cerca de 30% de cânceres de mama e, nestes pacientes, a sobrevivência livre de reincidência e a sobrevivência geral são reduzidas (Slamon et al, Science, 244: 707-712 (1989); Slamon et al, Science, 235: 177-182 (1987)).
[0283] Alternativa ou adicionalmente, testes FISH tais como INFORM® (vendido pela Ventana, Arizona) ou PATHVISION® (Vysis, Illinois) podem ser conduzidos sobre tecido tumoroso embutido em parafina e fixo por formalina, para determinar a extensão (se houver) da superexpressão de HER2 no tumor.
[0284] Em uma realização, o câncer será aquele que expressa (e pode superexpressar) EGFR, em que essa expressão pode ser avaliada quanto aos métodos de avaliação da expressão de HER2 conforme indicado acima.
[0285] A amplificação ou superexpressão de ligantes de HER ou receptor de HER pode também ser avaliada utilizando teste de ensaio diagnóstico in vivo, por exemplo, por meio da administração de molécula (tal como anticorpo) que una a molécula a ser detectada e seja marcada com marcador detectável (por exemplo, isótopo radioativo) e varredura externa do paciente para localização do marcador.
IV. Formulações Farmacêuticas [0286] Formulações terapêuticas dos anticorpos utilizados de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenagem por meio da mistura de anticorpo que apresente o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou
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109/138 estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos para pacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes que incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (tais como complexos de Zn e proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG). Formulações de anticorpos liofilizadas preferidas são descritas em WO 97/04801, expressamente incorporada a presente invenção como referência.
[0287] A formulação de pertuzumab preferida para uso terapêutico compreende 30 mg/ml de pertuzumab em 20 mM de acetato de histidina, 120 mM de sacarose, 0,02% polissorbato 20, a pH 6,0. Formulação alternativa de pertuzumab compreende 25 mg/ml de pertuzumab, 10 mM de tampão histidina-HCl, 240 mM de sacarose, 0,02% polissorbato 20, pH 6,0.
[0288] A formulação da presente invenção pode também conter mais de um composto ativo conforme o necessário para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não se prejudiquem entre si. Várias drogas que podem ser combinadas com o anticorpo
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HER são descritas no capítulo método de tratamento abaixo. Essas moléculas encontram-se adequadamente presentes em combinação, em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
[0289] Os ingredientes ativos podem também ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por métodos de aglutinação ou por polimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (tais como lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas são descritas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
[0290] Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes com liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou álcool (poli)vinílico, polilactidas (Patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de γ etila, etileno vinil acetato não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico e ácido glicólico, tais como LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3hidroxibutírico.
[0291] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente obtido por meio de filtragem através de membranas de filtragem estéreis.
V. Tratamento e Dosagem de Anticorpos HER [0292] Exemplos de vários cânceres que podem ser tratados com dose fixa de anticorpo HER encontram-se relacionados no capítulo de
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111/138 definições acima. Indicações de câncer preferidas incluem câncer do ovário, câncer peritoneal, câncer de trompa de falópio, câncer de mama, incluindo câncer de mama metastático (MBC), câncer do pulmão, incluindo câncer de pulmão de células não-pequenas (NSCLC), câncer de próstata, câncer colorretal e/ou câncer que exiba expressão, amplificação e/ou ativação de HER. Em uma realização, o câncer que é tratado é câncer resistente a quimioterapia ou câncer resistente a platina. A administração de dose(s) fixa(s) do anticorpo resultará em melhoria dos sinais ou sintomas de câncer.
[0293] Além do câncer, dose(s) fixa(s) dos anticorpos HER conforme descrito na presente invenção pode(m) ser utilizada(s) para o tratamento de várias doenças ou disfunções não malignas. Essas doenças ou disfunções não malignas incluem doença autoimune (por exemplo, psoríase; vide definição acima); endometriose; escleroderma; restenose; pólipos, tais como pólipos do cólon, pólipos nasais ou pólipos gastrointestinais; fibroadenoma; doença respiratória (vide definição acima); colecistite; neurofibromatose; doença renal policística; doenças inflamatórias; disfunções da pele, incluindo psoríase e dermatite; doença vascular (vide definição acima); condições que envolvam a proliferação anormal de células epiteliais vasculares; úlceras gastrointestinais; mal de Menetrier; adrenomas de secreção ou síndrome de perda de proteínas; disfunções renais; disfunções angiogênicas; doenças oculares tais como degeneração macular relativa à idade, síndrome de histoplasmose ocular presumida, neovascularização da retina causada por retinopatia diabética proliferativa, vascularização da retina, retinopatia diabética ou degeneração macular relacionada com a idade; patologias associadas a ossos, tais como osteoartrite, raquitismo e osteoporose; lesões após evento isquêmico cerebral, doenças de edemia ou fibróticas tais como cirrose hepática, fibrose pulmonar, carcoidose, tireoidite, síndrome de hiperviscosidade sistêmica, mal de Osler Weber-Rendu, doença pulmonar oclusiva crônica ou edema após queimaduras,
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112/138 trauma, radiação, apoplexia, hipoxia ou isquemia; reação de hipersensibilidade da pele; retinopatia diabética e nefropatia diabética; síndrome de Guillain-Barre; doença de enxerto contra hospedeiro ou rejeição de transplante; mal de Paget; inflamação dos ossos ou das juntas; fotoenvelhecimento (tal como causado por radiação UV da pele humana); hipertrofia prostática benigna; certas infecções microbianas que incluem patógenos microbianos selecionados a partir de adenovírus, hantavírus, Borrelia burgdorferi, Yersinia spp e Bordetella pertussis; trombo causado pela agregação de plaquetas; condições reprodutivas tais como endometriose, síndrome de hiperestimulação do ovário, preeclampsia, sangramento uterino por disfunção ou menometrorragia; sinovite; ateroma; nefropatias aguda e crônica (incluindo glomerulonefrite proliferativa e doença renal induzida por diabetes); eczema; formação de cicatrizes hipertróficas; choque endotóxico e infecções fúngicas; polipose adenomatose familiar; doenças neurodegenerativas (tais como mal de Alzheimer, demência relativa à AIDS, mal de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, retinite pigmentosa, atrofia muscular espinhal e degeneração cerebelar); síndromes mielodisplásticas; anemia aplástica; lesões isquêmicas; fibrose do pulmão, rim ou fígado; doença de hipersensibilidade mediada por células T; estenose pilórica hipertrófica infantil; síndrome obstrutiva urinária; artrite psoriática; e tireoidite de Hashimoto. Indicações não malignas preferidas para terapia na presente invenção incluem psoríase, endometriose, escleroderma, doença vascular (tal como restenose, arteriosclerose, doença das artérias coronarianas ou hipertensão), pólipos do cólon, fibroadenoma ou doenças respiratórias (tais como asma, bronquite crônica, bronquioectase ou fibrose cística).
[0294] O anticorpo HER é administrado à pacientes humanos de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo, na forma de mistura ou de infusão contínua ao longo de período de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinhal, subcutânea,
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113/138 intraarticular, intrassinovial, intratecal, oral, tópica ou inalatória. Prefere-se administração intravenosa do anticorpo.
[0295] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem fixa de anticorpo HER dependerá do tipo de doença a ser tratado, conforme definido acima, da severidade e do curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e reação ao anticorpo e do critério do médico atendente. A dose fixa é administrada adequadamente ao paciente uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Preferencialmente, a dose fixa encontrase na faixa de cerca de 20 mg a cerca de 2000 mg do anticorpo HER. A dose fixa pode ser, por exemplo, de cerca de 420 mg, cerca de 525 mg, cerca de 840 mg ou cerca de 1050 mg do anticorpo HER.
[0296] Ao administrar-se uma série de doses fixas, estas podem ser administradas, por exemplo, aproximadamente a cada semana, a cada cerca de duas semanas, a cada cerca de três semanas ou a cada cerca de quatro semanas, mas preferencialmente a cada cerca de três semanas. As doses fixas podem, por exemplo, continuar a ser administradas até o progresso da doença, evento adverso ou outro momento, conforme determinado pelo médico. Pode-se administrar, por exemplo, cerca de duas, três ou quatro, até cerca de 17 ou mais doses fixas.
[0297] Em uma realização, uma ou mais doses de carregamento do anticorpo são administradas, seguida(s) por uma ou mais doses de manutenção do anticorpo. Em outra realização, uma série da mesma dose fixa é administrada ao paciente.
[0298] Segundo realização preferida da presente invenção, é administrada dose fixa de anticorpo HER (tal como pertuzumab) de cerca de 840 mg (dose de carregamento), seguida por uma ou mais doses de cerca de 420 mg (dose(s) de manutenção) do anticorpo. As doses de manutenção são
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114/138 preferencialmente administradas aproximadamente a cada três semanas, pelo total de pelo menos duas doses, até dezessete ou mais doses.
[0299] Segundo outra realização preferida da presente invenção, uma ou mais doses fixas de cerca de 1050 mg do anticorpo HER (tal como pertuzumab) são administradas, por exemplo, a cada três semanas. Segundo esta realização, uma, duas ou mais das doses fixas são administradas, tal como por até um ano (17 ciclos) e por mais tempo, conforme o desejado.
[0300] Em outra realização, dose fixa de cerca de 1050 mg de anticorpo HER2 (tal como pertuzumab) é administrada como dose de carregamento, seguida por uma ou mais doses de manutenção de cerca de 525 mg do anticorpo. Cerca de uma, duas ou mais doses de manutenção podem ser administradas ao paciente a cada três semanas, de acordo com a presente realização.
[0301] Desta forma, a presente invenção fornece método de tratamento de câncer em pacientes humanos, que compreende a administração de pelo menos uma dose fixa de pertuzumab ao paciente, em que a dose fixa é de cerca de 420 mg, cerca de 525 mg, cerca de 840 mg ou cerca de 1050 mg de pertuzumab.
[0302] Quando a doença for câncer, o paciente é preferencialmente tratado com combinação do anticorpo HER e um ou mais agentes quimioterápicos. Preferencialmente, pelo menos um dos agentes quimioterápicos é agente quimioterápico antimetabólitos, tal como gemcitabina. A administração combinada inclui coadministração ou administração simultânea, utilizando formulações separadas ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutiva em qualquer ordem, em que há preferencialmente período de tempo em que ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente as suas atividades biológicas. Desta forma, o agente quimioterápico antimetabólitos pode ser administrado antes ou depois
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115/138 da administração do anticorpo HER. Nesta realização, o tempo entre pelo menos uma administração do agente quimioterápico antimetabólitos e pelo menos uma administração do anticorpo HER é preferencialmente de cerca de um mês ou menos e, de preferência superior, cerca de duas semanas ou menos. Alternativamente, o agente quimioterápico antimetabólitos e o anticorpo HER são administrados simultaneamente ao paciente, em uma única formulação ou formulações separadas. Tratamento com a combinação do agente quimioterápico (tal como agente quimioterápico antimetabólitos como gemcitabina) e o anticorpo HER (tal como pertuzumab) pode resultar em benefício terapêutico sinérgico, ou maior que o aditivo, para o paciente.
[0303] Caso seja administrado agente quimioterápico antimetabólitos, ele normalmente é administrado em dosagens conhecidas para tanto ou opcionalmente reduzidas devido à ação combinada das drogas ou efeitos colaterais negativos que podem ser atribuídos à administração do agente quimioterápico antimetabólitos. Cronogramas de preparação e dosagem para esses agentes quimioterápicos podem ser utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes ou conforme determinado empiricamente pelos técnicos no assunto. Quando o agente quimioterápico antimetabólitos for gemcitabina, ele é preferencialmente administrado em dose de cerca de 600 mg/m2 a 1250 mg/m2 (tal como cerca de 1000 mg/m2), por exemplo, nos dias 1 e 8 de ciclo de três semanas.
[0304] Além do anticorpo HER e do agente quimioterápico antimetabólitos, outros regimes terapêuticos podem ser combinados. Segundo (terceiro, quarto etc.) agente(s) quimioterápico(s), por exemplo, pode(m) ser administrado(s), em que o segundo agente quimioterápico é outro agente quimioterápico antimetabólitos diferente ou agente quimioterápico que não é antimetabólitos. O segundo agente quimioterápico pode ser, por exemplo, taxano (tal como paclitaxel ou docetaxel), capecitabina ou agente quimioterápico com base em platina (tal como carboplatina, cisplatina ou
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116/138 oxaliplatina), antraciclina (tal como doxorubicina, incluindo doxorubicina lipossômica), topotecan, pemetrexed, vinca alcalóide (tal como vinorelbina) e TLK 286. Podem ser administrados “coquetéis” de diferentes agentes quimioterápicos.
[0305] Outros agentes terapêuticos que podem ser combinados com o anticorpo HER incluem qualquer um ou mais dentre: segundo anticorpo HER diferente (tal como anticorpo HER2 inibidor do crescimento como Trastuzumab, ou anticorpo HER2 que induz a apoptose de célula que superexpressa HER2, tal como 7C2, 7F3 ou suas variantes humanizadas); anticorpo dirigido contra outro antígeno associado a tumor, tal como EGFR, HER3, HER4; composto anti-hormonal, tal como composto anti-estrógenos como tamoxifeno, ou inibidor da aromatase; cardioprotetor (para evitar ou reduzir qualquer disfunção do miocárdio associada à terapia); citocina; droga dirigida a EGFR (tal como TARCEVA®, IRESSA® ou Cetuximab); agente antiangiogênico (especialmente Bevacizumab vendido pela Genentech com a marca comercial AVASTIN®); inibidor da tirosina quinase; inibidor de COX (tal como inibidor de COX-1 ou COX-2); droga antiinflamatória não esteroidal, Celecoxibe (CELEBREX®); inibidor de farnesil transferase (tal como Tipifarnibe/ZARNESTRA® R115777 disponível por meio da Johnson & Johnson ou Lonafarnibe SCH66336 disponível por meio da Schering-Plough); anticorpo que se liga à proteína CA 125 oncofetal, tal como Oregovomabe (MoAb B43.13); vacina HER2 (tal como vacina HER2 AutoVac da Pharmexia, ou vacina de proteína APC8024 da Dendreon, ou vacina de peptídeo HER2 da GSK/Corixa); outra terapia direcionadora de HER (tal como trastuzumab, Cetuximab, gelfitinib, erlotinib, CI1033, GW2016 etc.); Raf e/ou inibidor de ras (vide, por exemplo, WO 2003/86467); injeção de lipossomo doxorubicina HCl (DOXIL®); inibidor da topoisomerase I, tal como topotecan; taxano; inibidor da tirosina quinase duplo HER2 e EGFR, tal como lapatinib/GW572016; TLK286
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117/138 (TELCYTA®); EMD-7200; medicamento que trata de náusea, tal como antagonista de serotonina, esteróide ou benzodiazepina; medicamento que evita ou trata de erupções da pele ou terapias contra a acne padrão, que incluem antibiótico oral ou sítio; medicamento redutor da temperatura do corpo, tal como acetaminofeno, difenidramina ou meperidina; fator de crescimento hematopoiético etc.
[0306] Dosagens apropriadas para qualquer dos agentes coadministrados acima são as utilizadas atualmente e podem ser reduzidas devido à ação combinada (sinergia) do agente e anticorpo HER.
[0307] Além dos regimes terapêuticos acima, o paciente pode ser submetido à remoção cirúrgica de células cancerosas e/ou terapia de radiação.
[0308] Preferencialmente, o anticorpo administrado é anticorpo nu. Entretanto, o anticorpo administrado pode ser conjugado com agente citotóxico. Preferencialmente, o imunoconjugado e/ou antígeno ao qual é ligado é(são) internalizado(s) pela célula, resultando em maior eficácia terapêutica do imunoconjugado para matar a célula alvo à qual se liga. Em realização preferida, o agente citotóxico dirige-se ou interfere com o ácido nucléico na célula cancerosa. Exemplos desses agentes citotóxicos incluem maitansinóides, caliqueamicinas, ribonucleases e endonucleases de DNA.
[0309] Além da administração da proteína de anticorpo ao paciente, o presente pedido contempla a administração de anticorpo ou inibidor de proteínas por meio de terapia genética. Vide, por exemplo, WO 96/07321 publicada em 14 de março de 1996, referente à utilização de terapia genética para gerar anticorpos intracelulares.
[0310] Existem duas abordagens principais para a colocação do ácido nucléico (opcionalmente contido em vetor) nas células do paciente: in vivo e ex vivo. Para fornecimento in vivo, o ácido nucléico é injetado
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118/138 diretamente no paciente, normalmente no sítio em que é necessário o anticorpo. Para tratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucléico é introduzido nessas células isoladas e as células modificadas são administradas ao paciente diretamente ou, por exemplo, encapsuladas em membranas porosas que são implantadas no paciente (vide, por exemplo, Patentes US 4.892.538 e US 5.238.187). Existe uma série de técnicas disponíveis para a introdução de ácidos nucléicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo da transferência ou não do ácido nucléico para células cultivadas in vitro ou in vivo nas células do hospedeiro desejado. Técnicas apropriadas de transferência de ácido nucléico para células de mamíferos in vitro incluem o uso de lipossomos, eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrana, método de precipitação de fosfato de cálcio etc. Vetor comumente utilizado para fornecimento ex vivo do gene é retrovírus.
[0311] As técnicas de transferência de ácido nucléico in vivo atualmente preferidas incluem transfecção com vetores virais (tais como adenovírus, vírus I simplex da Herpes ou vírus adenoassociado) e sistemas com base em lipídios (lipídios úteis para transferência mediada por lipídios do gene são, por exemplo, DOTMA, DOPE e DC-Chol). Em algumas situações, é desejável fornecer à fonte de ácido nucléico um agente que se dirija às células alvo, tal como anticorpo específico para proteína de membrana da superfície celular ou a célula alvo, ligante para receptor sobre a célula alvo etc. Ao empregar-se lipossomos, proteínas que se ligam a proteína de membrana da superfície celular associada à endocitose podem ser utilizadas para dirigir e/ou facilitar a absorção, por exemplo, de proteínas de capsídeo ou seus fragmentos trópicos para um tipo de célula específico, anticorpos para proteínas que sofrem internalização na ciclização e proteínas que dirigem localização intracelular e aumentam a meia vida intracelular. O método de endocitose mediada por receptor é descrito, por exemplo, por Wu et al, J. Biol. Chem. 262:
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4429-4432 (1987); e Wagner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 34103414 (1990). Para análise dos protocolos de terapia genética e marcação genética atualmente conhecidos, vide Anderson et al, Science 256: 808-813 (1992). Vide também WO 93/25673 e as referências ali mencionadas.
VI. Artigos Industrializados [0312] Em outra realização da presente invenção, é fornecido artigo industrializado que contém materiais úteis para o tratamento de câncer ou das outras disfunções descritas acima. O artigo industrializado compreende ampola com dose fixa do anticorpo HER nela contido e, opcionalmente, bula. A ampola pode ser formada a partir de uma série de materiais, tais como vidro ou plástico, e pode ser vedada por tampa perfurável por seringa. A ampola pode ser, por exemplo, ampola de vidro tipo I vitrum formal (por exemplo, ampola de 20 cc para dose fixa de 420 mg ou ampola de 50 cc para dose fixa de 1050 mg), com tampa laminada de fluoro-resina DAIKYO GREY® e tampa de alumínio flip top de 20 mm. O artigo industrializado pode incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas etc.
[0313] Na presente realização, o artigo industrializado compreende ampola que contém dose fixa de anticorpo HER (tal como pertuzumab), em que a dose fixa é de cerca de 420 mg, cerca de 525 mg, cerca de 840 mg e cerca de 1050 mg do anticorpo HER.
[0314] O artigo industrializado preferencialmente compreende ainda bula. A bula pode fornecer instruções de administração da dose fixa ao paciente com câncer, incluindo mas sem limitar-se a paciente com câncer do ovário, câncer peritoneal, câncer de trompa de falópio, câncer de mama metastático (MBC), câncer de pulmão de células não-pequenas (NSCLC), câncer de próstata ou câncer colorretal e/ou para administrar a dose fixa ao
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120/138 paciente com câncer cujo câncer exibe expressão, amplificação e/ou fosforilação de HER.
[0315] Em uma realização, o artigo industrializado compreende duas ampolas, em que primeira ampola contém dose fixa de cerca de 840 mg de pertuzumab e segunda ampola contém dose fixa de cerca de 420 mg de pertuzumab.
[0316] Em outra realização, o artigo industrializado compreende duas ampolas, em que primeira ampola contém dose fixa de cerca de 1050 mg de pertuzumab e segunda ampola contém dose fixa de cerca de 525 mg de pertuzumab.
VII. Depósito de Materiais [0317] As linhagens de células de hibridoma a seguir foram depositadas na Coleção Norte-Americana de Tipos de Culturas, 10801 University Blvd., Manassas VA 20110-2209, Estados Unidos (ATCC):
Designação de Anticorpo TCC n° Data de Depósito
7C2 ATCC HB-12215 17 de outubro de 1996
7F3 ATCC HB-12216 17 de outubro de 1996
4D5 ATCC CRL 10463 24 de maio de 1990
2C4 ATCC HB-12697 08 de abril de 1999
[0318] Detalhes adicionais da presente invenção são ilustrados pelos exemplos não limitadores que se seguem. As descrições de todas as citações no relatório descritivo são expressamente incorporadas a presente invenção como referência.
Exemplo 1 [0319] O presente exemplo avalia a farmacocinética (PK) da população e covariados de previsão para anticorpo HER pertuzumab e examinou a variabilidade de concentrações de vale em soro em estado estável após métodos de dosagem com base em BSA, com base no peso do corpo ou fixa. Pertuzumab
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121/138 foi administrado por meio de infusão IV (três semanas) como dose com base em peso (0,5 a 15 mg/kg) ou dose fixa (420 mg ou 1050 mg). Os dados de concentração em soro de pertuzumab de um teste da fase Ia e dois da fase II (ovário e mama), que compreende 153 pacientes e 1458 momentos de concentração, foram reunidos para esta análise utilizando NONMEM® com a estimativa condicional de primeira ordem com método Interaction (interação FOCE). Modelo de dois compartimentos linear melhor descreveu os dados. Peso do corpo, albumina do soro e fosfatase alcalina do soro foram covariados significativos que afetam a liberação (CL) e a área da superfície do corpo (BSA) foi variável significativa que afeta o volume de distribuição no compartimento central (Vc). No modelo final, CL e Vc foram de 0,214 l/dia e 2,74 l, respectivamente. O peso explicou apenas 8,3% da variabilidade entre pacientes para CL. Avaliação do modelo PK de população final utilizando verificação de previsão posterior exibiu bom desempenho. Em comparação com a dosagem fixa, dosagem com base em BSA e peso reduziram apenas a variabilidade da população de concentrações de vale em estado estável em 6,2% e 5,8%, respectivamente, em mil pacientes simulados retirados do conjunto de dados original utilizando o modelo final. Simulações também demonstraram que os percentuais de pacientes com concentrações de vale em estado estável prevista abaixo do alvo de 20 pg/ml foram similares após dosagem com base em BSA, em peso ou fixa. Concluiu-se que, embora anticorpos humanizados sejam tipicamente dosados em peso, as análises neste exemplo demonstram a adequação da administração do anticorpo HER, pertuzumab, utilizando dose fixa para o tratamento de câncer.
Métodos
Estudos e Pacientes [0320] Todos os três estudos utilizados nesta análise foram aprovados pelos comitês de ética apropriados dos centros participantes. Consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.
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122/138 [0321] O Estudo 1, foi um estudo de Fase Ia, multicêntricos, aberto, de escalada de doses, para avaliar a segurança, tolerância e perfis farmacocinéticos de pertuzumab administrado por via intravenosa como agente único a pacientes com malignidades sólidas avançadas. Estes pacientes receberam dose de pertuzumab administrada por meio de via intravenosa a cada três semanas na forma de infusão intravenosa por noventa minutos no primeiro ciclo e, em seguida, como infusão por trinta minutos em ciclos subseqüentes. As doses foram escaladas (0,5, 2, 5, 10 e 15 mg/kg) em grupos de três ou seis pacientes até a definição da dose tolerada máxima (MTD) ou até que o nível de dosagem mais alto fosse atingido. Durante o primeiro ciclo de tratamento, amostras de soro para determinação de concentrações de pertuzumab foram recolhidas em momentos em série: antes da dosagem, ao final da infusão intravenosa, após 1,5, quatro e nove horas, e nos dias 2, 5, 8 e
15. Durante o segundo ciclo de tratamento, amostras de soro para determinação de concentrações de pertuzumab foram recolhidas antes da dose, 29 minutos após o início da infusão intravenosa, e no dia 8.
[0322] O estudo 2 foi teste multicêntrico de ramificação única (single-arm) e aberto, fase II, para avaliar a eficácia geral, segurança, tolerância e o efeito da ativação de HER2 com base em tumores sobre a eficácia de pertuzumab em pacientes com câncer do ovário avançado, em que a sua doença foi refratária ou sofreu recorrência após quimioterapia anterior. Estas mulheres receberam infusões intravenosas de pertuzumab administradas como agente isolado por período de noventa minutos durante o primeiro ciclo de tratamento em dose fixa de 840 mg, seguido por dose de manutenção de 420 mg, fornecida como infusão de trinta minutos a cada três semanas durante ciclos de tratamento subseqüentes. Durante o primeiro e o segundo ciclo de tratamento, amostras de soro para determinação das concentrações de pertuzumab foram recolhidas antes da dosagem, quinze minutos após o final
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123/138 da infusão e nos dias 8 e 15. Amostras de soro adicionais para determinação das concentrações de pertuzumab foram recolhidas antes da dose e quinze minutos após o final da infusão intravenosa durante ciclos de tratamento subseqüentes.
[0323] O Estudo 3 foi estudo aleatorizado, multicêntrico, aberto, de ramificação única de Fase II para avaliar a eficácia e a segurança de duas doses diferentes de pertuzumab administradas na forma de agente isolado em pacientes com câncer de mama metastático com baixa expressão de HER2. Em primeiro grupo de dosagem, os pacientes receberam pertuzumab na forma de infusão intravenosa administrada ao longo de período de noventa minutos na forma de dose de carregamento de 840 mg no primeiro ciclo, seguida por dose de manutenção de 420 mg administrada a cada três semanas na forma de infusão intravenosa por trinta minutos durante ciclos de tratamento subseqüentes. No segundo grupo de dosagem, os pacientes receberam infusão intravenosa de pertuzumab na forma de dose de 1050 mg ao longo de período de noventa minutos durante o primeiro ciclo e como dose de 1050 mg como infusão intravenosa de trinta minutos a cada três semanas durante ciclos de tratamento subseqüentes. No estudo 3, amostras de soro para determinação de concentrações de pertuzumab foram recolhidas antes da dosagem, quinze minutos após o final da infusão e nos dias 8 e 15 durante os dois primeiros ciclos de tratamento. Amostras de soro adicionais para determinação de concentrações de pertuzumab foram recolhidas antes da dosagem e quinze minutos após o final da infusão durante ciclos de tratamento subseqüentes.
Teste de Drogas [0324] Concentrações em soro de pertuzumab foram determinadas por meio de teste de imunoadsorção enzimática (ELISA) de ligação de receptores validado. O teste utilizou domínio extracelular de p185HER2 para capturar pertuzumab de amostras de soro. Pertuzumab ligado
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124/138 foi detectado com peroxidase de rabanete silvestre anti-Fc humano (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) e tetrametil benzidina (TMB) (KPL, Inc.) foi utilizada como substrato para desenvolvimento de coloração para quantificar pertuzumab no soro. O teste possui concentração mínima quantificável de 0,25 pg/ml para pertuzumab em soro humano.
Análise Farmacocinética da População [0325] Modelagem de efeitos mistos não linear da população foi realizada utilizando software NONMEM® (Boeckmann and Beal NONMEM® User Guide, São Francisco: Grupo de Projeto NONMEM®, Universidade da Califórnia, São Francisco (1994)) (Versão V, Nível 1.0) com NM-TRAN e PREDPP e o compilador Compaq Visual Fortran (Versão 6.5). Dois modelos estruturais básicos diferentes, modelo PK linear de um e dois compartimentos com infusão IV, foram adaptados a dados de tempo e concentração de pertuzumab em soro. O método de estimativa condicional de primeira ordem (FOCE) com interação η-ε foi utilizado ao longo de todo o procedimento de elaboração de modelos.
[0326] Modelo de erro exponencial foi utilizado para descrever a variação entre indivíduos para os parâmetros de PK:
Λ
Pi = Pi εχρ(ηιΡ) (1) [0327] Modelo de regressão de covariados multiplicativo foi implementado conforme segue:
Pi = 0,(-½--)βχ (1 + 0dD) med(X) (2) em que ηip indica a diferença proporcional entre os parâmetros
A “verdadeiros” (Pi) de i° pacientes individuais e o valor típico (Pi) na população, ajustado para valores de covariados iguais aos deste paciente individual. ηip é o efeito aleatório com média zero e variação ω2. 0x e 0d são os coeficientes de
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125/138 regressão a serem estimados para covariados contínuos (tais como PESO) ou dicotomos (tais como SEXO e RAÇA), respectivamente. Variáveis contínuas foram centralizadas sobre os seus valores médios (med (X)), de forma a permitir que 01 representasse a liberação estimada para o paciente típico com covariados médios. Covariados dicotomos receberam codificação 0 ou 1 (por exemplo, SEXO = 0 para fêmeas, SEX = 1 para machos; RAÇA = 0 para caucasianos e RAÇA = 1 para outros). A variação residual foi transformada em modelo na forma de modelo de erros com adição proporcional:
Cpij = Cpij (1 + sij,prop) + sij,add, em que Cpij e Cpij são a ja concentração medida e prevista pelo modelo, respectivamente, para o i° indivíduo e sij,prop e sij,add indicam os erros aleatórios entre indivíduos residuais aditivos e proporcionais distribuídos com meios zero e variações cprop2 e cadd2.
[0328] As relações entre estimativas bayesianas com base em modelo estrutural dos parâmetros PK e covariados individuais foram exploradas graficamente. Com base em análises exploratórias preliminares, foi testado o efeito de cada covariado sobre os parâmetros PK. Inicialmente, foi examinada a influência de covariados sobre parâmetros PK individuais (ou seja, liberação e volume do compartimento central). Em seguida, foi construído modelo covariado pleno para os parâmetros PK individuais por meio da incorporação dos covariados significativos no modelo. Utilizou-se processo de eliminação traseira para determinar o modelo covariado final para cada parâmetro PK individual retendo-se apenas os covariados significativos no modelo. Quando covariados altamente correlacionados apresentavam significado farmacológico similar (tal como peso e BSA), somente o fator mais significativo era retido no modelo. Este modelo covariado final obtido para cada parâmetro de PK foi combinado em seguida para formar novo modelo total e o modelo PK da população final foi elaborado utilizando processo de eliminação traseira.
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126/138 [0329] A comparação de modelos estruturais alternativos e construção do modelo covariado baseou-se nas plotagens de diagnóstico de adequação de encaixe típicas e teste de razão de probabilidades. Ao comparar-se modelos hierárquicos alternativos, as diferenças no valor da função objetiva são distribuídas aproximadamente em quadrados Chi com n grau de liberdade (n é a diferença do número ou parâmetros entre o modelo total e o reduzido). Demonstrou-se que esta aproximação é confiável para o método de estimativa FOCE-INTERACTION (Wahlby et al, J. Pharmacokinet. Pharmacodyn. 28: 231-52 (2001)). Para discriminar dois modelos hierárquicos, utilizou-se diferença de função objetiva de mais de 7,9 (1 grau de liberdade), que corresponde a nível de significação de p < 0,005.
[0330] A fração de variação entre indivíduos (% de variação) explicada pelos covariados no modelo de regressão para dados parâmetros de
PK (por exemplo, CL) foi computada conforme segue:
% Variação
Z 2 2 ω CL, BASED ~~ ω CL, FINAL ®CL,BASE λ
X100 (3) em que o2cl,based e o2cl,final representaram variação de liberação entre indivíduos em modelo PK base e final, respectivamente.
Avaliação de Modelo Farmacocinético de População [0331] A avaliação de modelos neste estudo utilizou técnica de reamostragem tomada para avaliar a estabilidade do modelo final e estimar o intervalo de confiança de parâmetros. Este método de avaliação de modelos consiste da criação, em primeiro lugar, de conjuntos de dados utilizando a opção de tomada no pacote de software Wings for NONMEM® (N. Holford, Versão 404, junho de 2003, Auckland, Nova Zelândia), obtendo-se em seguida estimativas de parâmetros para cada um dos conjuntos de dados repetidos. Foram obtidos os resultados de mil
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127/138 conduções bem sucedidas e a média e 2,5° e 97,5° percentuais (indicando o intervalo de confiança de 95%) para os parâmetros da população foram determinados e comparados com as estimativas dos dados originais.
[0332] Além disso, verificações de modelos de previsão posteriores foram utilizados para avaliar a capacidade do modelo final de descrever os dados observados (Yano et al, J. Pharmacokinet. Pharmacodyn. 28: 171-92 (2001); Gelman e Meng, Model Checking and Model Improvement em Gilks, W. R., Richardson, S., Spiegelhalter, D. J., eds., Markov Chain Monte Carlo in Practice, Boca Raton: Chapman & Hall/CRC, 189-202 (1996); Gelman et al, Bayesian Data Analysis, Boca Raton: Chapman & Hall/CRC (2004). Nestas análises, os 2,5°, 5°, 10°, 25°, 50° (médio), 75°, 90° e 95° percentuais dos dados observados foram computados e selecionados como estatísticas de teste para a verificação de modelo de previsão posterior. O modelo PK de população final, que inclui parâmetros de efeito aleatório e fixo final, foi utilizado para simular mil repetições do conjunto de dados observado e estatísticas de teste foram computadas a partir de cada um dentre o conjunto de dados simulado. A distribuição de previsão posterior de estatísticas de teste a partir do conjunto de dados simulado foi comparada em seguida com as estatísticas de teste observadas e o valor p (pPPC) pode ser estimado por meio de cálculo da proporção de casos em que as estatísticas de teste do conjunto de dados simulado excede o valor realizado de estatísticas de teste observadas de acordo com a equação a seguir (Gelman e Meng (1996), acima).
i 1000 ppc = £ I(T(y , Θ) > T(y, θθ) (1)
N tí em que l(.) é a função indicadora que assume o valor 1 quando o seu argumento é verdadeiro e 0 em caso contrário. T (y, Θ) é
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128/138 “valor realizado” das estatísticas de teste observadas pois é realizado pelos dados observados y. T (yirep, Θ) é a estatística de teste de conjunto de dados simulado i (varia de 1 a 1000) (Gelman e Meng, 1996, acima). Além disso, as 2,5a, 5a, 95a e 97,5a parcelas dos dados simulados foram calculadas para cada momento para pacientes individuais. Foram determinados os números de dados observados que se encontraram dentro das fronteiras das 2,5a e 95,5a parcelas (intervalo de 95%), 5a e 95a parcelas (intervalo de 90%) dos dados simulados reunidos.
Exposições de Pertuzumab após dosagem com base em peso, BSA e fixa [0333] O modelo PK da população final foi utilizado para determinar as concentrações de vale em estado estável e exposição após dosagem com base em peso, BSA e fixa. Perfis de tempo e concentração em soro e liberação de pertuzumab para mil pacientes foram simulados para regime de dosagem com base em peso, com base em PSA e fixa utilizando o modelo final com conjunto de dados obtido por meio de retirada (com substituição) do conjunto de dados PK original. Todos os pacientes simulados receberam infusão intravenosa de 840 mg, 12,2 mg/kg ou 485 mg/m2 por noventa minutos no Dia 0, depois infusão intravenosa de 420 mg, 6,1 mg/kg ou 242,5 mg/m2 por trinta dias nos Dias 21, 42 e 63. As concentrações de vale em estado estável obtidas no Dia 84 (Cssvale) após diferentes regimes de dosagem foram determinadas em seguida. Além disso, foi calculado o percentual de pacientes com concentrações de vale em estado estável abaixo de concentração alvo (20 pg/ml) após dosagem com base em BSA, com base em peso ou fixa. Valores de liberação simulados foram utilizados para determinar a exposição média em estado estável (AUCssü-τ) de acordo com a equação a seguir:
AUCsso-r = (4)
CL
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Resultados [0334] Dados demográficos As características demográficas dos pacientes incluídos nesta análise de PK encontram-se relacionadas na Tabela 2.
TABELA 2
Características Demográficas dos Pacientes Incluídos na Análise
Média Faixa
Idade (anos) 56.0 32.0 - 78.0
BSA* (m2) 1.73 1.40 - 2.53
Peso (kg) 69.0 45.0 - 150.6
Albumina (g/l) 39.2 21.0 - 52.0
Fosfatase alcalina 107.0 39.0 - 367.0
(ALK) (UI/l)
Número de pacientes %
Sexo
Masculino 8 5.2
Feminino 145 94.8
Raça
Caucasianos 141 92.2
Afro-americanos 3 2.0
Hispânicos 4 2.6
Asiáticos 3 2.0
Índios nativos 0 0
Outros 2 1.3
* BSA, área da superfície do corpo.
[0335] Total de 1458 momentos de concentração em soro de pertuzumab foi recolhido de 153 pacientes nos três estudos. Do total, 18
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130/138 pacientes foram do teste da fase Ia, 60 do teste de câncer do ovário da fase II e 75 do teste de câncer de mama da fase II. Desta forma, a maior parte (94,8%) dos pacientes nesta análise foram mulheres e representaram 1110 (76%) dos dados de concentração de pertuzumab no soro. Todos os pacientes apresentaram tumor de baixa expressão de HER2 confirmado por meio de análise FISH (hibridização in situ por fluorescência) e possuíam boa posição funcional física conforme indicado por situação de desempenho ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) de 0 ou 1. A quantidade de pacientes com covariados faltantes era muito baixa (4,6% para altura e BSA) e os covariados faltantes receberam os valores médios. Em 384 (20,8%) amostras de concentração de pertuzumab em soro com apenas uma data de amostragem documentada, o momento de amostragem foi determinado como ocorrendo ao meio-dia. Análise de sensibilidade conduzida para determinar os efeitos destes momentos determinados sobre parâmetros estimados da população no modelo não revelou influência significativa.
[0336] Análise de população PK Modelo de dois compartimentos descreveu os dados melhor que o modelo de um compartimento com base na alteração da função objetiva (δ = -736,2) e plotagens de diagnóstico. Adequação do perfil tempo-concentração em soro de pertuzumab representativa em modelo de um e dois compartimentos é ilustrada nas Figs. 9A e B. O termo de variação entre indivíduos (η) de K12 foi removido de modelos de dois compartimentos, pois a remoção deste termo η não resultou em aumento estatisticamente significativo (δ < 7,88) na função objetiva. Portanto, somente ηου ηvc e ηk21 foram retidos no modelo base final.
[0337] O efeito da presença de termo de covariação entre ηου ηvc e ηk21 foi determinado a seguir. A incorporação de termos de
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131/138 covariação entre ηοι_, ηνο e ηκ2ΐ aumentou a adequação (δ = -23,2, df = 3). Entretanto, concluiu-se que os termos de covariação são mal estimados (%CV > 100), possuem pequena correlação estimada (rCL-Vc = 0,37, rCL-K21 = 0,27; rVc-K21 = 0,42) e possuem pouca influência sobre estimativas de parâmetros (dados não exibidos). Portanto, os termos de covariação não foram retidos para a construção de modelos de efeito covariado. Em análise exploratória utilizando o modelo base final, nenhum relacionamento aparente entre potenciais covariados e ηκ21 foi identificado. Portanto, o efeito covariado sobre ηκ21 não foi examinado durante o desenvolvimento do modelo final com covariados.
[0338] Para o modelo final com covariados, plotagens de concentrações de pertuzumab em soro previstas vs. observadas e residuais pesados vs. concentração em soro prevista são exibidas nas Figs. 10A e B. No modelo final, albumina no soro (ALB), peso do corpo (BW) e fosfatase alcalina no soro (ALKP) foram os covariados mais significativos que explicam a variação entre indivíduos para liberação (CL) de pertuzumab. BSA foi o covariado mais significativo explicando a variação entre indivíduos de volume de distribuição (Vc) em compartimento central de pertuzumab. A incorporação de termos de covariação entre η^, ηvc e ηι<21 aumentou a adequação (δ = -14,0, df = 3). Entretanto, a correlação estimada não foi grande (rCL-Vc = 0,45; rCL-K21 = 0,28; rVc-K21 = 0,39) e as estimativas de parâmetros não foram influenciadas (dados não exibidos). Desta forma, os termos de covariação não foram incluídos no modelo final. O modelo final foi ilustrado conforme segue:
Figure BRPI0518104B1_D0001
(4) (5)
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132/138 [0339] As estimativas de parâmetros do modelo final encontram-se resumidas na Tabela 3.
Tabela 3
Estimativas de Parâmetros do Modelo Farmacocinético da População Final e da Estabilidade dos Parâmetros Utilizando Procedimento de
VALIDAÇÃO DE RETIRADAS
Conjunto de dados original 1000 réplicas retiradas
Estimativa (% RSE)a Média (95% CI)
Modelo estrutural CL (l/dia) 0.214 (3.1) 0.214 (0.201,0.228)
Vc (l) 2.740 (1.9) 2.739 (2.640, 2.840)
K12 (dia-1) 0.203 (16.6) 0.220 (0.159, 0.416)
K21 (dia-1) 0.258 (15.6) 0.275 (0.203, 0.480)
Variação entre indivíduos CL %CV 31.1 (11.0) 30.6 (27.0, 34.1)
Vc %cV 16.2 (20.3) 16.0 (12.7, 19.2)
K21 %CV 25.2 (37.6) 24.1 (11.4, 33.6)
Modelo de covariados ALB sobre CL (0alb_cl) -1.010 (18.4) -1.019 (-1.420, -0.632)
WT sobre CL (0wt_cl) 0.587 (19.3) 0.589 (0.372, 0.826)
ALKP sobre CL (0alkp_vc) 0.169 (29.5) 0.170 (0.067, 0.258)
BSA sobre Vc (0bsa vc) 1.160 (12.2) 1.151 (0.890, 1.451)
Variação residual Erro proporcional a2prop 0.037 (19.4) 0.037 (0.030, 0.045)
Erro aditivo, nprop, μg/ml 2.265 (77.8) 2.24 (0.002, 4.160)
a. %RSE: desvio padrão relativo percentual do estimado =
SE/parâmetro estimado x 100 [0340] Estimou-se que CL de pertuzumab no soro na população em análise foi de 0,214 l/dia e Vc foi de 2,74 l. K12 e K21 foram de 0,203 e 0,258 dias-1, respectivamente. Variação entre indivíduos para CL e Vc no modelo final, calculada como raiz quadrada da variação entre indivíduos (ω2) e expressa como %CV, é de 31,1% e 16,2%, respectivamente, em comparação
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133/138 com 38,0% e 20,8% para o modelo base sem covariados. O efeito de covariados de ALB, WT e ALKP no modelo final explicou, portanto, cerca de 33% da variação entre indivíduos para CL. O peso isoladamente, entretanto, explicou apenas 8,3% de variação entre pacientes para CL. O efeito de covariados de BSA explicou cerca de 39% de variação entre indivíduos para Vc no modelo final. A dependência de CL sobre WT e Vc sobre BSA com o modelo base é compensada no modelo final, conforme exibido nas Figs. 11A a B. t1/2a e t1/2p estimados foram de 1,4 e 17,2 dias, respectivamente.
[0341] Avaliação de Modelos. Do conjunto de dados original, mil conduções retiradas bem sucedidas foram obtidas e comparadas com os dados observados originais. Estimativas de PK da população média obtidas a partir do procedimento de retirada foram similares às estimativas de parâmetros do conjunto de dados original (Tabela 3), o que indica que o modelo desenvolvido era estável. Os intervalos de confiança de 95% para os parâmetros de efeito fixo foram estreitos, o que indicou boa precisão.
[0342] Verificação de modelo de previsão posterior foi utilizada para avaliar a capacidade do modelo final de descrever os dados observados. O modelo farmacocinético da população final, incluindo parâmetros de efeito aleatório e fixos finais, foi utilizado para simular mil réplicas. As estatísticas de teste foram computadas em seguida para cada um desses mil conjuntos de dados simulados. As Figs. 12A a F exibem histogramas dos mil valores simulados de estatísticas de teste selecionadas, com o “valor realizado” das estatísticas de teste observadas indicado por linha vertical. As distribuições de previsão posteriores foram próximas dos valores observados com os valores p estimados de mais de 0,05 para cada estatística de teste. Além disso, os percentuais de concentrações de pertuzumab observadas em faixa de quantidade de 90% a 95% dos dados simulados reunidos foram de 89,3 e 94,7%,
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134/138 respectivamente. Estes resultados sugeriram que o modelo era capaz de descrever e prever os dados razoavelmente bem.
Exposições de Pertuzumab após dosagem com base em peso, BSA e fixa [0343] As concentrações de vale em soro em estado estável de pertuzumab previstas no dia 84 (Css.vale) foram estimadas para mil pacientes simulados retirados do conjunto de dados de PK original e do modelo final utilizando dose com base em BSA, com base em peso ou fixa de acordo com os cronogramas de dosagem descritos no capítulo de métodos. Estes dados demonstraram que, com dosagem com base em BSA e com base em peso, a variação da população de Css.vale caiu em 6,17 e 5,76%, respectivamente, em comparação com dosagem fixa (Fig. 13 e Tabela 4).
Tabela 4
Concentração de vale em Estado Estável de Pertuzumab Prevista (Dia 84) Após Dosagem com Base em BSA, Peso ou Fixa para Mil Pacientes Simulados Retirados do Conjunto de Dados PK Original de Acordo com o
Modelo Final
Vale Css (pg/ml) Dose fixa Vale Css (pg/ml) Dose com base em peso Vale Css (pg/ml) Dose com base em BSA
Mínimo 2.68 2.39 2.54
5° Percentual 16.56 16.32 16.86
Médio 51.87 51.81 52.48
Média 56.37 56.08 56.44
95° Percentual 115.38 110.46 112.14
Máximo 209.67 179.06 192.00
%CV 54.05 52.62 52.40
Variação 928.21 870.93 874.71
% Variação alterado da dose fixa a - -6.17 -5.76
Percentual de 8.3 8.7 8.3
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Vale Css (pg/ml) Dose fixa Vale Css (pg/ml) Dose com base em peso Vale Css (pg/ml) Dose com base em BSA
pacientes com Cssvaie < 20 pg/ml
a 0 percentual de variação alterado a partir da dose fixa foi calculado utilizando a equação a seguir:
VaríaçãOWT ou BSA ~ dose base ~ Variação dose fixa
Percentual de variação alterado =_________________________________________________j qq variação dose fixa [0344] O percentual de pacientes com Css.vaie abaixo de concentração em soro alvo de 20 pg/ml foi similar, com valores de 8,3%, 8,7% e 8,3% para dosagem fixa, com base em peso ou com base em BSA, respectivamente (Tabela 4). Resultados similares foram obtidos a partir da análise de AUCsso-r em estado estável em soro de pertuzumab para mil paciente simulados e a dosagem com base em peso e em BSA somente reduziu a variação da população em 2,2 e 4,2%, respectivamente, em comparação com a dosagem fixa. O mesmo conjunto de dados simulado foi utilizado para determinar Css.vaie após dose fixa, dose com base em peso e em BSA para populações com peso extremo (ou seja, WT < 10° e > 90° percentual (Figs. 14A e B). Css.vaie de pertuzumab médio para população com WT menor ou igual ao 10° percentual foi de 72,3 (faixa: 8,7 a 166,5), 52,8 (faixa: 6,8 a 125,7) e 63,2 (faixa: 7,8 a 150,1) pg/ml para dose fixa, dose com base em peso e em BSA, respectivamente. O percentual de pacientes em população com Css.vaie abaixo de concentração em soro alvo de 20 pg/ml foi de 5,4%, 12,6% e 9,0% para dosagem fixa, com base em peso e com base em BSA, respectivamente. Css.vaie de pertuzumab médio para população com WT maior ou igual ao 90° percentual foi de 42,1 (faixa: 7,0 a 119,8), 62,8 (faixa: 14,4 a 167,3) e 52,9 (faixa: 10,2 a 133,3) pg/ml para dose fixa, dose com base em
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136/138 peso e em BSA, respectivamente. O percentual de pacientes nesta população com Css.vale abaixo de concentração em soro alvo de 20 pg/ml foi similar, com valores de 7,4%, 2,8% e 5.6% para dosagem fixa, com base em peso e com base em BSA, respectivamente. Resultados similares foram obtidos para a análise de AUCss0-r em estado estável em soro de pertuzumab destes subgrupos a partir de mil pacientes simulados.
Análise [0345] Tipicamente, anticorpos monoclonais IgG humanizados e drogas de moléculas pequenas citotóxicas em oncologia vêm sendo administradas em dose com base em peso (mg/kg) ou com base em BSA. Pertuzumab passou por testes clínicos com teste de fase Ia em pacientes com câncer avançado e testes de fase II em pacientes com câncer do ovário, mama, pulmão e próstata. Pertuzumab foi dosado com base em peso (mg/kg) em teste de Fase I e iniciado em seguida utilizando dose fixa em testes de fase II. Utilizando dados de tempo e concentração de pertuzumab em soro e demográficos recolhidos nestes três testes, foi construído na presente invenção modelo PK de população com covariados previstos para PK de pertuzumab. Este modelo foi utilizado em seguida para examinar as concentrações de estado estável após métodos de dosagem fixa e dosagem com base em peso e em BSA.
[0346] PK de pertuzumab obtido a partir desta análise foi muito similar às relatadas para outras drogas IgG1 monoclonais humanizadas utilizadas em oncologia (Harris et al, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 21: 488a (2002); Leyland-Jones et al, J. Clin. Oncol. 21: 3965-71 (2003); e Lu et al, Clin. Pharmacol. Ther. 75: 91 (2004)).
[0347] Modelo PK linear de dois compartimentos lineares descreve melhor os dados e, no modelo final, CL de pertuzumab foi de 0,214 l/dia. Vc típico de pertuzumab foi de 2,74 l ou cerca de 40 ml/kg, que é igual ao
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137/138 volume de plasma humano e foi consistente com valores relatados para outras drogas IgG1 monoclonais (Harris et al (2002), acima; e Lu et al (2004), acima). CL de pertuzumab foi significativamente afetado pelo peso do corpo e concentrações em soro de albumina e fosfatase alcalina, enquanto Vc foi significativamente influenciado por BSA. O efeito do sexo sobre o PK de pertuzumab não pode ser determinado devido ao pequeno número de pacientes machos (5,2%) incluídos na análise. Os resultados de procedimento de retirada e verificação de modelo posterior sugeriram que o modelo final era estável e capaz de descrever e prever os dados razoavelmente bem.
[0348] O efeito do peso sobre CL e BSA sobre Vc sugeriu que pertuzumab poderá ser dosado com base no peso do corpo ou em BSA. Entretanto, o efeito covariado do peso isoladamente e BSA isoladamente no modelo somente explicou cerca de 8,3% e 40% do efeito entre indivíduos de CL e Vc, respectivamente. Isso sugeriu que, embora o peso preveja CL e BSA preveja Vc, o efeito de peso e BSA sobre exposições de pertuzumab após a dosagem poderá ser mensurável mas não altamente colaborador.
[0349] Portanto, a etapa seguinte determinou o impacto dos vários métodos de dosagem sobre as exposições de pertuzumab utilizando simulações. Em mil pacientes retirados do conjunto de dados original, concluiu-se que dosagem com base em peso ou com base em BSA reduz a variação da população de concentrações de vale em soro em estado estável simulado no dia 84 em apenas 6,2 e 5,8%, respectivamente, em comparação com dosagem fixa. Além disso, os percentuais de pacientes com concentrações de vale em soro em estado estável previstas abaixo de alvo selecionado de 20 pg/ml foram similares com todos os três métodos de dosagem. Resultados similares foram obtidos a partir da análise de subgrupos em população com peso do corpo extremo (ou seja, WT < 10° e > 90° percentual).
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138/138 [0350] Desta forma, conclui-se que PK de pertuzumab refere-se à WT e BSA. Entretanto, WT e BSA explicaram somente pequeno percentual da variação entre indivíduos de CL e Vc e a dosagem com base em WT e BSA aparentemente não melhora a previsibilidade de exposições em estado estável de pertuzumab. Recomenda-se aplicar regimes de dosagem fixa para pertuzumab em pacientes com câncer.
[0351] Acredita-se que a presente invenção represente a primeira revelação de determinação crítica do impacto de dosagem com base em peso ou em BSA de anticorpo monoclonal IgG1 humanizado sobre concentrações de droga em estado estável em pacientes com câncer. A implementação de dosagem fixa plana possui diversas implicações econômicas e de cuidados com os pacientes significativas: i) redução de custos devido à maior eficiência de fabricação, armazenagem e transporte de dosagem unitária única; ii) preparação eficiente de dosagem isolada em farmácias e hospitais sem a necessidade de individualização do paciente, iii) maior eficiência do médico ao prescrever dose unitária isolada e iv) menor probabilidade de que o paciente receba dose errada devido a erros de cálculo de dosagem. Embora anticorpos humanizados sejam tipicamente dosados em peso ou BSA, as análises da presente invenção demonstram a adequação da administração do anticorpo HER pertuzumab, utilizando dose fixa em pacientes com câncer.

Claims (24)

  1. Reivindicações
    1. ARTIGO INDUSTRIALIZADO, caracterizado por compreender uma ampola que contém uma dose fixa de um anticorpo HER2, que se liga ao Domínio II do domínio extracelular do HER2 e compreende as sequências de aminoácidos leve variável e pesada variável de SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente, em que a dose fixa é de 420 mg ou 840 mg do anticorpo HER2.
  2. 2. ARTIGO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo HER2 ser pertuzumab.
  3. 3. ARTIGO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por compreender adicionalmente uma bula que instrui o usuário a administrar a dose fixa a um paciente com câncer.
  4. 4. ARTIGO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo câncer ser selecionado a partir do grupo que consiste em câncer do ovário, câncer peritoneal, câncer de trompa de falópio, câncer de mama metastático (MBC), câncer de pulmão de células não-pequenas (NSCLC), câncer de próstata e câncer colorretal.
  5. 5. ARTIGO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 4, caracterizado pela bula instruir adicionalmente o usuário a administrar a dose fixa a um paciente com câncer, em que este câncer exibe expressão, amplificação ou ativação de HER.
  6. 6. ARTIGO, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 5, caracterizado por compreender duas ampolas, em que uma primeira ampola contém uma dose fixa de 840 mg de pertuzumab e uma segunda ampola contém uma dose fixa de 420 mg de pertuzumab.
  7. 7. USO DE ANTICORPO HER2, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o anticorpo se liga ao Domínio II do domínio extracelular de HER2 e compreende
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    2/3 as sequências de aminoácidos leve variável e pesada variável de SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente.
  8. 8. USO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo anticorpo HER2 ser pertuzumab.
  9. 9. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a
    8, caracterizado pelo anticorpo HER2 ser um anticorpo nu.
  10. 10. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a
    8, caracterizado pelo HER2 ser um anticorpo intacto.
  11. 11. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a
    10, caracterizado pelo anticorpo HER2 ser um fragmento de anticorpo que compreende uma região de ligação de antígenos.
  12. 12. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a
    10, caracterizado pelo anticorpo HER2 ser um anticorpo IgG1 humano ou humanizado.
  13. 13. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a
    12, caracterizado pelo câncer exibir expressão, amplificação ou ativação de HER2.
  14. 14. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a
    13, caracterizado pelo câncer ser câncer de ovário, peritoneal ou de trompa de falópio.
  15. 15. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a
    13, caracterizado pelo câncer ser câncer de mama metastático (MBC).
  16. 16. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a
    13, caracterizado pelo câncer ser câncer de pulmão de células não-pequenas (NSCLC).
  17. 17. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a
    13, caracterizado pelo câncer ser câncer de próstata.
  18. 18. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a
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    3/3
    13, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer colorretal.
  19. 19. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a
    18, caracterizado por compreender a administração de um segundo agente terapêutico ao paciente.
  20. 20. USO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo dito segundo agente terapêutico ser selecionado a partir do grupo que consiste em agente quimioterápico, anticorpo HER diferente, anticorpo dirigido contra antígeno associado a tumores diferentes, composto anti-hormonal, cardioprotetor, citocina, droga dirigida a EGFR, agente antiangiogênico, inibidor de tirosina quinase, inibidor de COX, droga antiinflamatória não esteroidal, inibidor de farnesil transferase, anticorpo que se liga à proteína oncofetal CA 125, vacina HER2, outra terapia direcionadora de HER, inibidor ras ou Raf, injeção de lipossomos HCL doxorubicina, topotecan, taxano, inibidor de tirosina quinase dupla, TLK286, EMD-7200, medicamento que trata de náuseas, medicamento que evita ou trata de erupções da pele ou terapia de acne padrão, medicamento redutor da temperatura do corpo e fator de crescimento hematopoiético.
  21. 21. USO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo segundo agente terapêutico ser um agente quimioterápico.
  22. 22. USO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo agente quimioterápico ser um agente quimioterápico antimetabólito.
  23. 23. USO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo agente quimioterápico antimetabólito ser gemcitabina.
  24. 24. USO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo segundo agente terapêutico ser trastuzumab, erlotinib HCl ou bevacizumab.
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