BRPI0009643B1 - kit e processo para preparar um alimento para peixe com emamectina para eliminação, redução ou prevenção de parasitas em uma população de peixes, e tal alimento - Google Patents

Abstract

patente de invenção: "método para o uso de emamectina para o tratamento de parasitas de peixes". é proporcionado um método para a eliminação, redução ou prevenção de parasitas em uma população de peixes, pela alimentação de emamectina ou de um sal da mesma à população de peixes em uma dose diária de 25 <109>g até 400 <109>g por kg de biomassa de peixes por dia, durante um período de 3 a 14 dias. também é provido um kit para a preparação de um alimento para peixes com medicamento para a eliminação, redução ou prevenção de parasitas em uma população de peixes, o kit tendo um suprimento de emamectina ou de um sal da mesma e instruções impressas para a alimentação da emamectina ou de um sal da emamectina em um dose diária de 25 <109>g até 400 <109>g por kg de biomassa de peixes por dia, durante um período de 3 a 14 dias.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "KIT E PROCESSO PARA PREPARAR UM ALIMENTO PARA PEIXE COM EMAMEC-TINA PARA A ELIMINAÇÃO, REDUÇÃO OU PREVENÇÃO DE PARASITAS EM UMA POPULAÇÃO DE PEIXES, E TAL ALIMENTO".

Antecedentes da Invenção O controle de infestações de piolhos do mar (Lepeophtheirus salmonis e Caligus elongatus) em operações de criação comercial de salmão é ainda grandemente dependente do uso de tratamentos químicos (Ro-th M., Richards R & Sommerville C. (1993) "Current Practices In The Che-motherapeutic Control of Sea Lice Infestations: A Review" Journal of Fish Diseases (16 (1): 1 - 26 ). Os surtos desses parasitas copepodes são atualmente tratados através de banhos de imersão para tratamento, com diclor-vos de fosfatos orgânicos (Aquagard® novartis) e azamentifos (Salmosan® Novartis) ou peróxido de hidrogênio (Salartect® Brenntag, Paramove® Sol-vay-lnterox) ou os piretoides sintéticos (Excis® Vericore) e deltametrina (Ai-phamax® Alpharma). Os procedimentos de banho são de trabalho muito intenso, caros e ocasionam um estresse considerável ao peixe. Além disso, esses tratamentos podem não ser possíveis em locais expostos e durante condições atmosféricas adversas.

Com a exceção da cipermetrina (Jackobsen P. J. & Holm J. C. (1990) "Promising Test With New Compound Against Salmon Lice" Norsk Fiskeoppdrett, Janeiro, 16 a 18) os tratamentos de banho são somente eficazes contra estágios pré-adultos e adultos de piolho do mar, permitindo que os estágios de calimus sobrevivam e continuem o ciclo da infestação. Os tratamentos são portanto indicados somente quando a população alcança as fases de pré-adulto ou de adulto e, por esse motivo devem ser repetidos de forma freqüente, para um controle eficaz. A resistência aos diclorvos de fosfato orgânico tem sido identificada em algumas populações de piolhos do mar (Jones M. W., Sommerville C. S. & Wootten, R. (1992) "Reduced Sensi-tivity of the Salmon Louse, Lepeophtheirus salmonis, to the Organophospha-te Dichlorvos" Journal of Fish Diseases 15: 197 - 202). O peróxido de hidrogênio pode ocasionar danos às guelras e o seu uso é restrito no verão devido a sua toxidez em altas temperaturas de água (Thomassen, J. M. (1993) "Hydrogen peroxide as a Delousing Agent for Atlantic Salmon" em: Pathogens of Wild and Farmed Salmon: Sea Lice (ed. Por G. Boxshall & D. Defaye) Ellis Horwood Ltd. London).

Um tratamento que seja eficaz contra todos os estágios parasíti-cos do piolho do mar e de outros parasitas, que pudesse ser administrado na ração, para evitar as desvantagens associadas com as aplicações de banho, poderia ser benéfico para a indústria do salmão. O tratamento com ração permite a medicação durante as condições atmosféricas adversas e em locais expostos e permitiría a medicação simultânea de todas as gaiolas em um local e todos os locais em um sistema de lagos ou de baía única, reduzindo desse modo qualquer infestação cruzada que possa ocorrer durante os diversos dias necessários para a aplicação do tratamento de banho a todas as gaiolas em um local. Os tratamentos em alimentação correntemente disponíveis são os reguladores do crescimento de insetos, difluorbenzurona (Lepsidon® Ewos) e teflubenzurona (Calicide® Nutreco) (Erdal J. I. (1997) "New Drug Treatment Hits Sea Lice When They are Most Vulnerable". Fish Farming International, vol. 24, N° 2). O modo de ação dos mesmos é a inibição da síntese da quitina (Horst Μ. N. & Walker A. N. (1996) "Biochemical Effects of Diflubenzuron on Chitin Synthesis in the Post-molt blue crab" (Callinectes sapidus) Journal of Crustacean Biology, 15: 401 - 408) e a atividade é portanto restrita aos estágios de muda do piolho do mar.

As avermectinas, produzidas através da cultura de Streptomyces avermilitis tem propriedades inseticidas e anti-helmínticas de alta potência. Um derivado quimicamente modificado ivermectina (22,23-diídro avermecti-na B) foi desenvolvido como um antiparasítico de amplo espectro, para gado, ovelha, cavalos e porcos (Sutherland I. H. (1990) "Veterinary Use of Ivermeetin" Acta Leidensia 59: 211 - 216) é desde aí tem sido comercializada em todo o mundo desde 1981. A ivermectina também tem sido usada de forma extensa no tratamento de diversas parasitoses humanas (Ottensen E. A & Campbell W. C. (1994) "Ivermeetin in Human Medicine" Journal of Anti-microbial Chemoterapy, 34 (2): 195 - 203). Em seguida ao reconhecimento da resistência aos fosfatos orgânicos nos piolhos do mar (Jones M. W., Sommerville C. S. & Wootten, R. (1992) "Reduced Sensitivity of The Salmon Louse, (Lepeophtheírus salmonis), to the Organophosphate Dichlorvos" Journal of Fish Diseases 15: 197 a 201), a ivermectina foi considerada como uma terapia alternativa. Além do seu novo método de ação, uma outra vantagem está em sua aplicação como uma medicação no alimento. Embora a ivermectina não tenha recebido uma aprovação reguladora para uso no salmão, ela pode ser prescrita no Reino Unido por veterinários sob o procedimento de cascata (Anônimo (1998) Amélia N° 8 Veterinary Medicines Direc-torate, Woodham Lane, Newhaw, Addlestone, Surrey KT 15 3NB), quando os produtos autorizados falham em proporcionar um controle eficaz de infestações por piolho do mar. O uso da ivermectina durante vários anos tem indicado que ela exerce algum controle na taxa de dosagem comumente adotada de 25 pg kg"1 de biomassa duas vezes por semana. (Rae G. H. (1996) "Guidelines for the Use of Ivermectin Pré-Mix for Pigs to Treat Farmed Salmon for Sea Lice" Scottish Salmon Growers Association pamphlet). No entanto, a ivermectina foi considerada como sendo tóxica em níveis maiores do que 25 pg kg'1 de biomassa duas vezes por semana (S. C. Johnson, et al., "Toxicity and Pathological Effects of Orally Administered Ivermectin In Atlantic, Chinook and Coho Salmon and Steelhead Trout", Diseases of Aquatic Organisms, Vol. 17: 107 - 112 (1993). A emamectina (4"- desóxi-4" epimetilamino avermectina B) tem sido recentemente usada para o tratamento de lavouras de vegetais comestíveis (Leibee G. L. Jansoson, R. K. Nuessly G. & Taylor J. L. (1995) "Effica-cy of Emamectin Benzoate and Bacillus thuringensis at Controlling Diamon-dback Moth (Lepidoptera: Plutellidae) Populations On Cabbage in Florida" Florida Entomologist, 78 (1): 89 - 96).

Sumário da Invenção Esta invenção proporciona um método para a eliminação, redução ou prevenção de parasitas em uma população de peixes, que compreende a alimentação de emamectina ou um sal da mesma à referida população de peixes em uma dose diária de 25 pg por kg de biomassa de peixe por dia durante um período de 3 - 14 dias.

Em um outro aspecto, é provido um kit para a preparação de uma alimento para peixe com medicação para a eliminação, redução, ou a prevenção de parasitas em uma população de peixes, que compreende um suprimento de emamectina ou um sál da mesma e instruções impressas para a alimentação da emamectina ou de um sal da mesma em uma dose diária 25 pg para 400 pm por kg de biomassa de peixe por dia durante um período de 3 - 14 dias.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 é um mapa que compara o calimus individual médio (estágios I, II, III e IV) por peixe para o grupo de controle versus o grupo dosado a 50 pg/kg no dia 7 para o estudo de titulação de dose (Exemplo 1). A figura 2 é um mapa que mostra a mesma comparação como a da figura 1 porém no dia 14. A figura 3 é um mapa que compara calimus individual médio (estágios I, II, III e IV) por peixe para o grupo de controle versus o grupo dosado a 50 pg/kg no dia 7 para o estudo de confirmação da dose (Exemplo 3). A figura 4 é um mapa que mostra a mesma comparação como a da figura 3, porém no dia 14.

Descrição Detalhada da Invenção A emamectina (4"- desoxi-4" epimetilamino avermectina Bi) que pode ser preparada como descrito na Patente dos Estados Unidos N° 5.288.710 ou na Patente dos Estados Unidos N° 5.399.717, é uma mistura de dois homólogos, 4"- desóxi-4" -epi-metilamino avermectina B1a e 4"-desóxi-4" -epi-metilamino avermectina B1b. De preferência é usado um sal da emamectina. Os exemplos não-limitativos de sais da emamectina que podem ser usados na presente invenção incluem os sais descritos na Patente dos Estados Unidos N° 5.288.710, como por exemplo, os sais derivados a partir do ácido benzóico, ácido benzóico substituído, ácido benzeno sulfônico, ácido cítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido maléico e os assemelhados. De mais preferência o sal da emamectina usado na presente invenção é o benzoato de emamectina.

Foi descoberto de forma surpreendente que a emamectina, quando usada nos níveis de dosagem e no plano de dosagem de acordo com esta invenção não é tóxica para a população de peixes. Isso é uma descoberta particularmente surpreendente, dado o fato de que a ivermectinã ter sido considerada como tóxica em níveis relativamente baixos. Devido a que a ivermectinã não pode ser administrada em dias consecutivos devido a preocupações com a toxidez, existe um risco substancial que nem todos os peixes em uma dada população poderão receber uma dose apropriada devido a alimentadores superagressivos. A capacidade de alimentar a emamectina durante pelo menos diversos dias consecutivos é uma vantagem significativa sobre a ivermectinã, devido a que a alimentação durante vários dias aumenta a possibilidade de que mais peixes em uma dada população irão consumir a mesma. A emamectina e os seus sais podem ser usada de acordo com a presente invenção para a eliminação ou a redução de todos os tipos de parasitas de peixe, incluindo os ectoparasitas, bem como os endoparasitas. Os exemplos de endoparasitas que podem ser eliminados ou reduzidos incluem, porém não estão limitados a: aqueles que pertencem a Phylum Platyhel-mintes (Classes Monogenea, Digenea e Cestoda); os Phylum Aschelminthes (Classe nematoda); e os protozoários (como por exemplo, infeções por mi-xozoanos (Phylum Mxiozoa), infeções microsporidianas (Phylum Microspo-ra), infeções coccidianas (Phylum Apicomplexa) e Phylum Ciliophora. Os exemplos de ectoparasitas que podem ser eliminados ou reduzidos incluem, porém não estão limitados a: monogeneanos; parasitas de Phylum Arthro-poda (Classes Crustácea, Subclasse Branchiura, e Subclasse Copepoda (por exemplo incluindo as Ordens Cyclopidea, Caligidea e Lernaepodidea)) e parasitas da Ordem dos Argulus e o Phylum Isopoda. O tratamento pela emamectina da presente invenção foi considerado como sendo especificamente eficaz como um tratamento para piolho do mar, isto é, parasitas que pertençam a subclasse de Copepoda, Ordem dos Caligidea, de modo especial aqueles que pertençam aos gêneros Lepe-ophtheirus e Caligus.

Qualquer espécie de peixe, incluindo as variedades de água doce e de [água salgada, pode ser tratada com a emamectina para a eliminação ou a redução de parasitas. Os exemplos de peixes que podem ser tratados incluem, porém não estão limitados a: salmão, truta, bagre, perca, atum, linguado gigante, salmão do Ártico, esturjão, rodovalho, linguado, solha, carpa, tilápia, bagre listado, enguia, goraz do mar, olho de boi, charutei-ro-catarino, garoupa e peixe de leite. A dose de emamectina que é eficaz para a redução, eliminação ou prevenção de parasitas pode ser determinada de forma rotineira por um veterinário, embora ela possa variar dependendo da espécie do peixe tratado, o parasita específico envolvido, e o grau de infestação. De preferência a emamectina ou um sal da mesma é alimentada em uma dose de 25 pg até 400 pg por Kg de biomassa de peixe por dia, de mais preferência, 25 pg até 100 pg por Kg de biomassa de peixe por dia, de preferência, de 50 pg até 75pg por kg de biomassa de peixe por dias. O tratamento com a emamectina é administrado diariamente, durante um período de 3 a 14 dias, de preferência de 7 a 14 dias, de mais preferência durante uma semana. Foi descoberto de forma surpreendente que a emamectina exibe uma eficácia contínua em até de 8 a 10 semanas depois do tratamento. Por essa razão, a emamectina pode ser administrada como uma medida profilática para prevenir a ocorrência de parasitas. O kit de acordo com a presente invenção pode estar em qualquer forma adequada para proporcionar um suprimento de emamectina durante pelo menos 7 dias, junto com instruções por escrito para a administração da mesma de acordo com os níveis e programa de dosagem descritos acima. Os exemplos incluem, porém não estão limitados a diversos recipientes, como por exemplo, frascos, embalagens de papelão, embalagem de bolhas e ampolas) tanto acompanhadas por um inserto na embalagem que descreve as instruções cíclicas de dosagem, ou no qual as instruções de dosagem estão impressas, ou afixadas ao recipiente. A emamectina ou o sal da emamectina no kit pode estar na forma de uma pré-mistura que compreenda um ou mais diluentes e de 0,01 até 1% em peso da emamectina ou do sal da emamectina. O alimento para peixes com a medicação pode ser preparado pela incorporação de uma quantidade adequada de emamectina ou de um sal da mesma dentro de um produto para a alimentação de peixes disponível comercialmente para alcançar os níveis de dosagem desejados. A quantidade de emamectina incorporada no interior do alimento para peixes irá depender da taxa na qual os peixes são alimentados. Para os peixes alimentados na taxa de 0,2% até 4% de biomassa por dia, o alimento com a medicação contém de preferência a partir de 0,5 até 100 mg de emamectina ou de um sal da mesma por kg de alimento com a medicação, de mais preferência a partir de 1 até 50 mg por kg de alimento com a medicação e de mais preferência a partir de 5 até 15 mg por kg de alimento com a medicação.

Embora a emamectina possa ser incorporada em uma mistura de alimento antes de ser peletizada, o alimento com a medicação é formado de preferência pelo revestimento de péletes de alimento com a emamectina. Para o revestimento de péletes de ração, é de preferência a utilização de uma pré-mistura que contenha: (a) 0,01 a 1% em peso de emamectina ou de um sal da mesma; (b) 0,001 a 0,2% em peso de um conservante; (c) de 1 a 4% em peso de propileno glicol ou polietileno glicol; e (d) Q. S. de diluente. O preservativo é, de preferência hidroxianisola butilada (BHA). De preferência é usado o propileno glicol. O diluente pode ser qualquer um dos diluentes comumente usados, como por exemplo, a lactose, maltodextri-na, amido de milho, carbonato de cálcio, celulose microcristalina, cascas de arroz e espigas de milho. De preferência, o diluente é a maltodextrina, amido de milho, ou uma misturas dos mesmos. Uma pré-mistura de preferência específica contém 0,2% em peso de benzoato de emamectina,.01% em peso de hidroxianisol butilada, 2,5% em peso de propileno glicol, 49,8 % em peso de amido de milho e Q S de maltodextrina M-100. A pré-mistura é preparada, de preferência, com a utilização de um misturador/granulador de alto cisalhamento com a utilização do procedimento que se segue: Dissolver o BHA em propileno glicol sob agtação Carregar o amido em um misturador/granulados de alto cisalhamento. Carregar a solução de BHA de forma lenta ao amido que está sendo misturado. Continuar a misturação durante de 20 a 40 minutos (objetivo 30 minutos) para permitir que o amido absorva a solução. Raspe a parede interna da malga de mistura para a remoção de quaisquer materiais aderentes. Carregar a droga através de uma tela de malha 20, para a malga do misturador. Misturar e cortar (o cortador ligado) durante 10 minutos. Carregar a maltodextrina para a malga do misturador e misturar e cortar durante 10 minutos adicionais. Descarregar para ser embalado.

De modo alternativo, os processo de misturador de fita pode ser usado: Dissolver o BHA em propileno glicol sob agitação. Carregar o amido em um misturador de fita menor (de aproximadamente metade o tamanho do lote). Ligar o misturador de fita e carregar lentamente a solução de BHA para o amido. Misturar até que fique uma mistura uniforme. Parar o misturador e deixar a mistura no misturador durante cerca de 30 a 60 minutos. Tiram uma pequena quantidade de mistura (1 a 5% do volume do lote) dentro de um misturador planetário pequeno. Carregar a droga ao misturador planetário e misturar durante 5 minutos. Transferir a pré-mistura da droga de volta para o misturador de fita e misturar durante de 10 a 30 minutos. Descarregar a mistura de droga a partir do misturador de fita e passar através de um moinho de trituração (Fitzmill) para quebrar os grumos. Transferir o material moído para outro misturador de fita. Carregar a maltodextrina no misturador e misturar durante de 10 a 30 minutos. Descarregar para ser embalado.

Os péletes de ração podem ser revestidas com a pré-mistura tanto por um método de revestimento a seco como por um método de revestimento com óleo. No método de revestimento a seco, a pré-mistura é misturada com os péletes de tal forma que ela é distribuída de modo uniforme sobre os péletes, e óleo de peixe ou de vegetais aquecido é adicionado à mistura para revestir completamente os péletes. No método de revestimento por óleo, a pré-mistura é primeiro misturada com um volume pequeno de óleo de peixe ou vegetal aquecido, que em seguida é misturado com os péletes para ser dispersa de modo uniforme sobre as mesmas, e oleo de peixe ou vegetal aquecido é adicionado às péletes revestidos e misturado até que os péletes sejam completamente revestidos.

Os exemplos que se seguem ilustram a invenção preòedente, embota esses exemplos não devam ser considerados como limitativos do âmbito da invenção.

Exemplos Foram realizados três estudos no Institute in Aquaculture Marine Environmental Research Laboratory em Machrihanish, Escócia. Foram obtidos pós salmão do Atlântico, Salmo salar L, depois de sua primeira descida para o mar a partir de um estoque livre de doença e aclimatado nas instalações para o teste.

Os peixes foram mantidos em grupos dobrados em tanques de fibra plástica, cada um com um volume de 0,54 m3. Cada tanque foi suprido com água do mar natural em temperatura ambiente (7 - 14°C) e salinidade (30 - 35 ppt), em taxas de fluxo de aproximadamente 18,1 min.'1. Os tanques foram equipados com tela de malha sobre a saída da água para reter os péletes de peixe não comidas. Os peixes foram observados diariamente com relação ao comportamento e reações adversas da droga. A mortalidade dos peixes e a ocorrência de grandes danos por piolhos do mar também foram registradas.

Infestações de Piolhos do Mar Piolhos do mar foram recolhidos durante a colheita em fazendas comerciais de salmão na costa oeste da Escócia. Cordões de ovos originários de fêmeas grávidas de piolhos do mar foram incubados em água do mar em temperatura ambiente e dentro de uma faixa de salinidade de 32 - 35 ppt. Tão logo as larvas incubadas atingiram o estágio de copepódito, foram introduzidos de 38 - 170 copepóditos por peixe dentro de cada um dos quatro tanques de peixes em duplicata e o suprimento de água de cada tanque foi desligado durante aproximadamente três horas para permitir a fixação dos copepóditos ao peixe. Isso foi repetido de 4 - 5 vezes em intervalos de 3 - 5 dias até que estivessem presentes os estágios de calimus I, II, III e IV. Os números de calimus foram avaliados no dia 1- ou no dia 2. do pré-tratamento, em subamostras de peixes (N = 6 - 9 peixes por tanque). Nesse ponto, os peixes estavam infestados com piolhos pré-adultos e adultos, pela adição de 5 a 10 piolhos por peixe em cada tanque. Os suprimentos de água de cada tanque ficam desligados durante uma hora até que os piolhos tivessem se fixado aos peixes. Os números de piolhos no pré-tratamento foram baseados em sub-amostras da população total e apresentados como o número médio de calimus por peixe. Os peixes foram em seguida redistribuídos de forma aleatória a partir dos quatro tanques originais para cada um dos tanques de controle e de tratamento, como descrito no projeto experimental para cada um dos estudos, e não foram feitas outras infestações durante o tratamento.

Aiimento com Medicação A ração básica foram péletes de alimentação de salmão Fulmar ™ (BOCM Pauis Ltd.)de 3,5 ou 5 mm. O benzoato de emamectina foi dissolvido em propileno glicol e misturado com óleo de peixe antes do revestimento final dos péletes de ração. Os alimentos de controle foram preparados da mesma maneira com propileno glicol e óleo de peixe. O tratamento foi administrado em taxas de doses nominais de 0, 25, 50 e 100 pg kg'1 de bio-massa de peixes por dia, em uma taxa de alimentação de 0,5% de biomas-sa, durante um período de sete dias consecutivos (dias de 0 - 6). O consumo real de alimentação diária foi medido em cada um dos tanques através do recolhimento de péletes de alimento não comidas aproximadamente trinta minutos depois da administração e subtraindo o número de péletes da ração diária de alimento. A dose média consumida foi calculada para cada um dos grupos da maneira que se segue: Soma do % diário de alimento consumido = Consumo médio de alimento (%); 7 dias.

Consumo médio de alimento (%) X taxa nominal de dose (pg kg'1) = Dose média consumida (pg kg'1) Avaliação dos Piolhos do Mar A avaliação dos números de piolhos do mar foi realizada nos dias 7, 14 e 21 a partir do início do tratamento. Ao peixes foram anestesiados com 40 mg Γ1 de benzoato de etil-P-amino (benzocaína) e cada peixe foi examinado sob um microscópio de baixa força. Os piolhos foram identificados como estágios de calimus de I a V, pré-adultos I ou II e adulto. Os piolhos pré-adultos e adultos foram além disso identificados como machos ou fêmeas. Os números de cada estágio de desenvolvimento foram registrados. Quaisquer piolhos que se destacaram na solução anestésica foram incluídos na contagem e de novo fixados ao peixe depois da transferência dos mesmos para água do mar fresca. Os peixes foram devolvidos aos tanques onde eram mantidos depois da amostragem e os mesmos peixes foram avaliados nos dias 7, 14 e 21.

Exemplo 1 Estudo de Titulação de Dose A temperatura da água foi de 7 a 10°C e a salinidade foi de 33 a 34 ppt. Os pesos médios dos peixes no pré-tratamento era de 192 g (+ 30 g S. D.). O benzoato de emamectina foi administrados em taxas doses diárias nominais de 0, 25, 50 e 100 pg kg'1 de biomassa de peixes. Haviam dois tanques em duplicata por tratamento com um tamanho de amostra de 19 ou 20 peixes por tanque. Os resultados deste estudo são relatados na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1: Estudo de titulação de dose: Eficácia do benzoato de emamectina contra infestações induzidas de piolhos do mar, Lepeophtheirus salmonis, em salmão do Atlântico, Salmo salar. Os peixes receberam o alimento com a medicação na taxa de 0,5% de biomassa por dia, durante 7 dias consecutivos (Dia 0 - Dia 6). O número médio de piolhos do mar foi determinado nos dias 7, 14 e 21. Os desvios médio e padrão são derivados a partir dos dados juntados de dois tanques dobrados (tamanho da amostra N = 19 ou 20 peixes por tanque). * A dose média consumida é a dose real recebida calculada a partir da porcentagem de consumo de ração durante o período de medicação.

Exemplo 2 Estudo de confirmação de dose I A temperatura da água foi de 12 - 14°C e a salinidade foi de 33 -35 ppt. Os pesos médios dos peixes no pré-tratamento era de 224 g (± 43 g S. D.). O benzoato de emamectina foi administrados em taxas de doses diárias nominais de 0, 25,e 50 pg kg'1 de biomassa de peixes. Haviam dois tanques duplos por tratamento com 15 peixes por tanque. No entanto, neste estudo, a mortalidade dos peixes reduziu o número de peixes disponíveis para a avaliação de parasitas no final do estudo, para 9, 10 e 14 nos grupos de 25 pg kg'1, para 10, 12 e 13 nos grupos de 50 pg kg'1 e para somente 2, 5 e 5 nos grupos de controle. Por essa razão foi realizado um segundo, con- firmação de dose II (Exemplo 3 abaixo). Os resultados desse estudo estão relatados na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Estudo de confirmação de dose I : Eficácia do benzo-ato de emaméctina contra a infestação induzida de piolhos do mar Lepeo-phtheirus salmonis, em salmão do Atlântico, Salmo salar. Os peixes receberam o alimento com a medicação na taxa de 0,5% de biomassa por dia, durante 7 dias consecutivos (Dia 0 - Dia 6). O número médio de piolhos do mar foi determinado nos dias 7, 14 e 21. Os desvios médio e padrão são derivados a partir dos dados juntados de três tanques em dobra (tamanho da amostra N = 2 a 15 peixes por tanque). * A dose média consumida é a dose real recebida calculada a partir da porcentagem de consumo de ração durante o período de medicação.

Exemplo 3 Estudo de Confirmação de Dose II A temperatura da água foi de 9 - 12°C e a salinidade foi de 30 -33 ppt. Os pesos médios dos peixes no pré-tratamento era de 418.2 g (+ 43 g S. D.). O benzoato de emamectina foi administrados em taxas de doses diárias nominais de 0 e 50 μς kg'1 de biomassa de peixes. Haviam três tanques duplos por tratamento com 15-16 peixes por tanque. Os resultados desse estudo foram relatados na tabela 3, abaixo.

Tabela 3: Estudo de confirmação de dose II: Eficácia do benzoato de emamectina contra a infestação induzida de piolhos do mar Lepeo-phtheirus salmonis, em salmão do Atlântico, Salmo salar. Os peixes receberam o alimento com a medicação na taxa de 0,5% de biomassa por dia, durante 7 dias consecutivos (Dia 0 - Dia 6). O número médio de piolhos do mar foi determinado nos dias 7, 14 e 21. Os desvios médio e padrão são derivados a partir dos dados juntados de três tanques duplos (tamanho da amostra N = 15 - 16 peixes por tanque). * A dose média consumida é a dose real recebida calculada a partir da porcentagem de consumo de ração durante o período de medicação. Manipulação de Dados Os resultados foram resumidos como calimus (estágios de cali-mus de I - IV), piolhos que se moviam ( estágios de pré-adultos e de adultos) e total de piolhos (calimus e que se moviam combinados). Os dados sobre o número de piolhos por peixe foram submetidos a testes F para homogenei- dade e a um teste de correlação para o exame da normalidade da distribuição. Os pesos dos peixes e as contagens de piolhos pré-tratamento foram testados por ANOVA de direção única. A medida em que as variações não eram homogêneas ou distribuídas de modo normal, os números de piolhos pós-tratamento foram analisados com a utilização de testes de Dunn não paramétricos (Zar 1984).

Em todos os três estudos não houveram diferenças significativas (P > 0,05) nos números de calimus e de piolhos em movimento entre qualquer um dos tanques em duplicata em cada um dos grupos de controle de 25, 50 ou 100 kg"1 em qualquer ponto de tempo. Isso permitiu que os dados médios para cada um dos conjuntos de tanques em duplicata fossem juntados nas Tabelas 1, 2 e 3. No entanto, os dados também foram analisados de forma separada, para cada um dos tanques em duplicata. A redução em percentagem em média de piolhos do mar, com relação aos grupos de controle, foi calculada para cada uma das doses da maneira que se segue: % de redução = 100 - ( Média de duplicados tratados ) Média de controle de duplicados Um sumário dos resultados para cada um dos três estudos está mostrado na Tabela 4, abaixo.

Tabela 4: Sumário de dados para o estudo de titulação de dose, estudo para a confirmação de dose I e estudo para a confirmação de dose II no dia 21: Eficácia do benzoato de emamectina contra a infestação induzida de piolhos do mar Lepeophtheirus salmonis, em salmão do Atlântico, Salmo salar. Os peixes receberam o alimento com a medicação na taxa de 0,5% de biomassa por dia, durante 7 dias consecutivos (Dia-0 - Dia-6). O percentual de redução é a redução no grande número de piolhos do mar com relação ao grupo de controle, calculada a partir das médias reunidas em duplicata para cada um dos grupos de tratamento. * Representa a mortalidade atribuída aos danos nos piolhos do mar, exceto no estudo de confirmação da dose II no qual 2% da mortalidade nos peixes de controle não foram atribuídas aos piolhos do mar. Os números da mortalidade incluem os peixes postos de lado.

Análise e Discussão dos Resultados O consumo de alimento nos grupos tratados variaram a partir de 81 a 92% As doses médias reais consumidas foram calculadas para cada um dos grupos e estão apresentadas nas Tabelas 1, 2 e 3, em conjunto com as taxas de doses nominais. O consumo de alimento nos grupos de controle variou de 77 a 90%. O comportamento e a atividade de alimentação foram observados como em declínio em alguns dos grupos de controle durante o período de estudo. Isso estava associado com níveis mais elevados de piolho nos peixes de controle e foi mais notado quando a atividade dos piolhos do mar aumentou na medida em que os calimus amadureceram para os estágios móveis mais destrutivos. Não houveram diferenças significativas (P > 0,05) nos pesos médios dos peixes entre nenhum dos grupos de tratamento e d controle no final do estudo.

Nenhum efeito adverso ou a mortalidade de peixes foram atribuídos ao tratamento com o benzoato de emamectina em nenhuma das doses testadas. Houve mortalidade de peixes no estudo de titulação de dose ou estudo de confirmação de dose II, porém devido ao elevado número de piolhos, uma quantidade de modalidades ou de peixes postos de lado ocorreu no estudo de confirmação de dose I (Tabela 4).

No início do estudo, o número total médio de calimus por peixe em pré-tratamento, com base em uma subamostra de 10 peixes por tanque foi de 58,1 (± 21,9). Não houveram diferenças significativas (F3j36 = 1m70, P > 0,05) nos níveis de infestação entre os tanques antes da redistribuição e do tratamento, O número médio de piolhos no pré-tratamento, incluindo os que se moviam, foi de 63 a 68 por peixe.

Os resultados do estudo de titulação de dose estão mostrados na Tabela 1. Tão cedo como no dia 7- os números totais de piolhos por peixe foram reduzidos por 35,4 a 37,5% em todos os grupos em tratamento, comparados com os grupos de controle. Pelo dia 21, o número médio de piolhos por peixe foi reduzido por 89,8 e 95,2 e 95,8%, respectivamente nos grupos 25,50 e 100 pg Kg-1. Os grupos de controle tinham uma média de 34,5 piolhos de peixe, enquanto em uma dose de 50 pg kg'1. A média foi tão baixa quanto 1,7. Números de piolhos relativos aos grupos de controle foram significantemente reduzidos em ambas taxas de dose 50 e 100 pg kg'1 nos 7, 14 (P < 0,05) e 21 (P < 0,001) dias a partir do inicio do tratamento. No entanto, não houveram diferenças significativas entre as taxas de dose de 50 e 100 pg kg'1.

Os dados também foram analisados separadamente com relação aos estágios de calimus e de piolhos em movimento e mostraram que a partir do dia 7 até o dia 21 o numero médio de piolhos que se moviam aumentou nos grupos de controle a partir de uma média de 26,7 até 34,5 por peixe, na medida em que os calimus de tornaram adultos Em contraste o número médio de piolhos que se moviam nos grupos tratados caíram para tão baixo quanto 0,1 a 1 por peixe no dia 21.

Os números médios de calimus também declinaram nos grupos de controle na medida em que eles se tornaram adultos, resultando em um aumento no número de estágios em movimento (Tabela 1). No entanto,em todos os três grupos tratados, o número médio de calimus declinou de forma mais lenta e não houve um aumento correspondente no número dos estágios em movimento. Nos dias 14 e 21, os números de calimus estavam mais elevados em todos os grupos tratados do que nos grupos de controle. No entanto muitos dos calimus presentes nos peixes tratados estavam anormais na aparência e foram considerados como mortos ou não-viáveis. No dia 7, haviam mais caiimus dos estágios I e II nos peixes tratados do que no peixe de controle, que tinha uma proporção mais alta de calimus dos estágios III e IV como mostrado na Figura 1. No dia 14 (Figura 2), ainda não haviam calimus dos estágios I e II presentes nos peixes não tratados, enquanto que os peixes de controle não tinham nenhum calimus I e II e somente restaram uns poucos calimus dos estágios III e IV.

No dia 21 muitos dos peixes tratados não tinham piolhos que se moviam presentes, enquanto que alguns peixes estavam completamente livres tanto dos piolhos no estágio de calimus como em movimento. Em contraste, nenhum dos peixes de controle estava completamente livre dos piolhos que se moviam (tabela 4).

Estudo de Confirmação de Dose I

No início do estudo, o número total médio de calimus por peixe em pré-tratamento, com base em uma sub-amostra de 9 peixes por tanque foi de 82,3 (+ 36,6). Não houveram diferenças significativas (F3,36 = 0,55, P > 0,05) nos níveis de infestação entre os tanques antes da redistribuição e do tratamento. O número médio de piolhos no pré-tratamento, incluindo os que se moviam, foi de 87 a 92 por peixe.

Neste estudo uma quantidade de peixes morreram ou foram postos à parte como um resultado dos altos níveis de infestação alcançados.

Nos grupos de controle, nos quais os números de piolhos se mantiveram elevados, 75% dos peixes morreram ou foram postos à parte, enquanto que somente 27% dos peixes tratados a 50 pg kg'1 morreram ou foram descartados. (Tabela 4). O exame dos peixes mortos nos grupos de controle revelaram números muito elevados de piolhos que se moviam, e é possível que os peixes de controle que sobreviveram até o dia 21 foram aqueles que tinham menos piolhos presentes. Desse modo, o número médio de piolhos por peixe no dia 21 pode ter sido muito mais elevado se todos os peixes de controle tivessem sobrevivido. Toda a mortalidade e peixes postos à parte foram atribuídas aos danos infligidos pela atividade dos piolhos do mar. Os danos por piolhos do mar tanto nos peixes de controle como nos peixes tratados apareceram como áreas de erosão da epiderme nas regiões craniana e dorsal e foram acompanhadas por atividade reduzida de alimentação nesses indivíduos. Pelo dia 21, a aparência geral e o comportamento de alimentação dos peixes nos grupos tratados foi melhorada de forma marcante. Em contraste, os poucos peixes que sobreviveram nos grupos de controle tinham danos por piolhos e continuaram a mostrar uma resposta alimentar reduzida.

Os resultados do estudo de confirmação de dose I estão mostrados na tabela 2. Nos grupos tratados, os números médios totais de piolhos já haviam sido reduzidos por 44 a 54 % no dia 7, quando comparados com os grupos de controle e no final do teste no dia 21, os números médios de piolhos estavam reduzidos por 82% nos grupos de 25 pg kg'1· E nos grupos de 50 pg kg'1. Na taxa de dosagem mais elevada de 50 pg kg"1 os números de piolhos do mar foram reduzidos de forma significativa quando comparados com dois dos três grupos de controle nos dias 14 e 21 (P < 0,05). A terceira dupla de controle teve um tamanho de amostra de somente dois peixes no final do estudo e portanto não foi incluído na analise. Embora não existissem diferenças significativas entre as duplicatas individuais nos grupos de controle e de 25 pg kg"1, quando os dados foram reunidos para dar um tamanho de amostragem maior, houve uma diferença significativa (P < 0,001) entre esses dois tratamentos. Também não existiram diferenças significativas entre as dobras de 25pg kg'1 e duas das dobras de 50 pg kg'1, porém de novo quando os dados desses grupos foram agrupados as duas taxas de doses foram significativamente diferentes (P < 0,001). No dia 21, os números médios de piolhos reunidos foram de 27,3 por peixe nos grupos de controle, 4,9 no grupo de 25 pg kg'1, e de 1,6 no grupo de pg kg'1, respectivamente.

Embora houvessem relativamente poucos estágios de pré-adultos e de adultos em movimento presentes no início do estudo, os números aumentaram em todos os grupos até o dia 7, na medida em que os estágios de calimus amadureceram (Tabela 2). O aumento nos números de piolhos que se moviam nos peixes dos sois grupos tratados foram de menos do que aqueles observados nos grupos de controle. Entre os dias 7 e 21, os números médios caíram nos grupos de controle através da mortalidade natural em neste estudo, devido à morte ou ao descarte dos peixes mais pesa-damente infestados. Nos grupos tratados, a redução nos números médios de piolhos foi ainda maior durante todo o tempo e no dia 21, os números totais de piolhos foram 82 a 94% mais baixos do que nos grupos de controle. A Tabela 2 mostra que os números médios de calimus caíram nos grupos de controle de 25 pg kg'1, a partir o início do estudo até o dia 14. Nos dias 7 e 14, os números de calimus estavam ligeiramente mais elevados no grupo de 50 pg kg"1, porém de novo os calimus presentes nos peixes tratados foram considerados como não viáveis de tal forma que no dia 21, não haviam calimus remanescentes em nenhum dos peixes examinados.

No dia 21, 28,6% dos peixes no grupo de 50 pg kg'1, estavam completamente livres tanto de calimus como de piolhos que se moviam (Tabela 4). Em contraste, somente 3% dos peixes no grupo de 25pg kg'1, e no grupo de peixes de controle estava completamente livre dos piolhos.

Estudo de Confirmação de Dose II Não houveram diferenças significativas (F3,2o = 0,428, P < 0,05) nos níveis de infestação de calimus entre os tanques antes da redistribuição e do tratamento. O Número de piolhos no pré-tratamento incluindo os que se movimentavam era de 79 a 84 por peixe.

Os resultados sumarizados apresentados na Tabela 3 mostram que tão cedo como no dia 7, o total médio do número de piolhos nos grupos de 50 μ9 kg'1,estava reduzido por 46% com relação ao dos grupos de controle e no dia 21 por 95%. No dia 21 os grupos de controle tinham uma media total de 38,1 piolhos por peixe, enquanto que os grupos de 50 μ9 kg'1, tinham uma média de somente 2,1 piolhos por peixe. Os números de piolhos foram mais baixos de modo significativo (P < 0,001) em todos os três grupos tratados a 50pg kg'1, quando comparados com os três grupos de controle, nos dias 7, 14 e 21. O número médio de piolhos que se movimentavam nos três grupos de controle mostraram um declínio a partir de 52,2 por peixe no dia 7 para 38,1 por peixe no dia 21 (Tabela 3). Durante o mesmo período o número médio de piolhos que se moviam nos grupos de 50 pg kg'1, caiu de forma muito mais rápida e, no dia 21 havia uma média de somente 0,6 piolho por peixe. Os números médios de calimus se reduziram nos grupos de controle com a maturação, de forma que, virtualmente não haviam calimus presentes pelo dia 14 (Tabela 3). Em cada amostragem, mais calimus permaneciam sobre os peixes tratados do que nos grupos de controle e no dia 14, esta diferença era estatisticamente significativa (P < 0,001). No dia 21, muitos de tais calimus que persistiam nos peixes tratados foram observados como sendo formas degeneradas e foram considerados como estando como seu desenvolvimento prejudicado e não viáveis. As Figuras 3 e 4 mostram a proporção de cada um estágio de calimus nos grupos de controle e nos grupos tratados nos dias 7 e 14. No dia 7, havia uma proporção mais elevada de calimus I e II nos peixes tratados enquanto que os peixes de controle tinham mais calimus III e IV (Figura 3). No dia 14 os peixes tratados ainda tinham, em sua maioria, calimus dos estágios III e IV, e alguns nos estágios I e II, enquanto que os peixes do controle tinham uma média de somente 0,4 calimus IV por peixe (Figura 4).

No final do estudo, 27% dos peixes tratados não tinham calimus ou piolhos em movimento presentes e 66% dos peixes não tinham piolhos que se movimentavam presentes. Em contraste, nenhum dos peixes de controle estavam completamente livres de calimus ou de piolhos em moví- mento em qualquer estágio (Tabela 4). Pelo dia 21, 21% dos peixes de controle tinham lesões no crânio resultando da atividade de piolhos do mar. Não foram registradas lesões cranianas nos peixes nos grupos de 50 pg kg'1, e não houve mortalidade de peixes em nenhum dos grupos tratados, enquanto que 4% dos peixes de controle foram deixados de lado neste estudo devido aos danos por piolhos do mar. O tratamento oral do salmão do Atlântico com o benzoato de emamectina mostrou uma eficiência muito boa contra os estágios em movimento e de calimus do L salmonis em todos os três estudos. A redução no número de parasitas aumentou durante o período de 21 dias do estudo. Uma taxa de dose de 50 pg kg"1, de benzoato de emamectina foi considerada como sendo tão eficaz como a de 100pg kg'1, na redução do número de piolhos do mar. A despeito do fato de que a taxa de dose de 25pg kg'1, provou ser eficaz na maioria dos casos, reduções mais elevadas, de 94 a 95% foram alcançadas de forma consistente em uma taxa de dose de 50pg kg'1. No estudo de confirmação de dose I, o número médio total de piolhos nos peixes tratados com 25pg kg'1, não foi diferente de forma significativa daquele dos grupos de controle, enquanto que os peixes tratados com 50 pg kg" Vinham significativamente menos piolhos do que os peixes tratados com 25pg kg'1,. Naquele estudo, os grupos tratados com 25 pg kg"1, receberam uma taxa de dose real de somente 18,7 a 22,0 pg kg'1, com base nas taxas de consumo de alimento. Indivíduos com uma infestação pesada no início do estudo foram prováveis como tendo uma ingestão de alimento mais baixo e desse modo o consumo da droga e não foram capazes de se beneficiar totalmente com a medicação. Isso resultou em uma taxa de mortalidade e de descarte relativamente alta esse grupo e, em todos os casos, essas foram atribuídas aos danos pelos piolhos. Embora os números de calimus continuassem mais altos nos peixes tratados do que nos peixes de controle, a ausência de qualquer aumento correspondente nos números de piolhos em movimento e o desenvolvimento retardado dos diferentes estágios do calimus, indicam com clareza que o tratamento com o benzoato de emamectina é altamente eficaz contra os estágios imaturos dos calimus.

Em seguida ao tratamento com uma taxa de dose de 50 pg kg"1 de benzoato de emamectina, a percentagem de peixes sem a presença de piolhos em movimento foi tão alta como 87%. Embora a percentagem de peixes sem piolhos de qualquer etapa presentes, fosse somente de 20 a 30%, a maioria dos peixes com piolhos tinham somente o estágio de cali-mus. Embora muitos estágios dos calimus nos peixes tratados fossem anormais na aparência e considerados como estando mortos ou não viáveis, eles persistiram nos peixes na medida em que toma algum tempo para a estrutura de fixação, o filamento frontal, se romper e para ocorrer a separação. Embora a eficácia contra os estágios de calimus seja benéfica na prevenção do seu desenvolvimento para os estágios móveis mais destrutivos, uma redução rápida nos números de piolhos móveis também é importante na medida em que eles são muito mais agudamente danosos aos peixes hospedeiros. Tão cedo como no dia 7, a partir do início da medicação, os números de piolhos quem se movimentavam foram reduzidos nos peixes tratados com 50 pg kg"1, portanto quanto de 58 a 89%. A remoção dos piolhos que se segue ao tratamento com o benzoato de emamectina, foi observada como resultando em uma reaução nas lesões epidérmicas infligidas pelo parasita. No estudo de confirmação de dose I, os danos por piolhos resultaram em um número de mortalidades e de peixes postos de lado os quais reduziram a validade do estudo. Por essa razão, o estudo foi repetido, porém os resultados demonstraram os benefícios de proteção do tratamento com a emamectina. A maioria dos tratamentos licenciados disponíveis para o controle de infestações por piolhos do mar não são eficazes contra tanto os estágios imaturos dos calimus como dos estágios adultos que se movimentam (Roth, Richards & Sommerville 1993) e os tratamentos devem ser tempori-zados com cuidado para assegurar que a maioria dos piolhos sejam tratados em uma etapa suscetível no ciclo de vida. As larvas de piolho podem em seguida chegar o estágios reprodutivos adultos de tal forma que as populações são constantemente regeneradas. A vantagem de um tratamento que se já eficaz contra todas as etapas parasíticas é que os piolhos podem ser controlados em qualquer ponto no ciclo de vida, impedindo dessa forma a reprodução. Os tratamentos com alimentação permite o controle simultâneo em todas as gaiolas de tal forma que os tratamentos de locais e áreas inteiras são possíveis, reduzindo dessa forma a freqüência dos tratamentos.

Embora a presente invenção tenha sido descrita em conjunto com as modalidades específicas apresentadas acima, muitas alternativas, modificações e variações das mesmas se tornarão aparentes àqueles versados na técnica. Todas essas alternativas, modificações e variações estão destinadas a ficar dentro do espírito e do âmbito da presente invenção.

Claims (7)

1. Kit para a preparação de um alimento para peixe com um medicamento para a eliminação, redução ou prevenção de parasitas em uma população de peixes, caracterizado pelo fato de que compreende uma pré-mistura que compreende de 0,01 até 1% em peso do benzoato de emamec-tina e instruções impressas para a alimentação do benzoato de emamectina em uma dose diária de 25 até 400 pg por kg de biomassa de peixes por dia, durante um período de 3 a 14 dias.

2. Kit de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pré-mistura compreende: (a) 0,01 a 1% em peso de benzoato de emamectina; (b) 0,001 a 0,2% em peso de um conservante; (c) 1 a 4% em peso de propileno glicol ou polietileno glicol; e (d) Q. S. de diluente.

3. Kit de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pré-mistura compreende: (a) 0,2% em peso de benzoato de emamectina; (b) 0,01 % em peso de hidroxianisol butilado; (c) 2,5% em peso de propileno glicol; (d) 49,8 % em peso de amido de milho; e (e) Q. S. de maltodextrina M-100.

4. Alimento para peixe com um medicamento preparado pelo kit como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente uma quantidade adequada de emamectina ou de um sal da mesma.

5. Alimento para peixe com um medicamento de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de conter de 0,5 a 100 mg de emamectina ou de um sal da mesma por kg de alimento para peixe com um medicamento.

6. Processo para preparar um alimento para peixe com um medicamento como definido na reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de se incorporar, ao alimento para peixe, uma quantidade adequada de ema- mectina ou de um sal da mesma.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de se revestirem péletes de alimento para peixe com emamectina ou com um sal da mesma.