BR112021001693A2

BR112021001693A2 - molécula de ligação ao antígeno contendo dois domínios de ligação ao antígeno q ligados entre si

Info

Publication number: BR112021001693A2
Application number: BR112021001693-7A
Authority: BR
Inventors: Hirotake Shiraiwa; Tatsuya KAWA
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2018-08-03
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2021-05-04
Also published as: JP7504027B2; AU2019315226A1; CA3106829A1; KR20210040989A; WO2020027330A1; EP3831854A4; EP3831854A1; MX2021000827A; JPWO2020027330A1; SG11202101152QA; US20220195045A1; CN113286824A

Abstract

Em uma modalidade não limitativa, a presente invenção refere-se a moléculas de ligação ao antígeno compreendendo dois ou mais domínios de ligação ao antígeno que estão ligados entre si. Em uma modalidade não limitativa, as moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção possuem atividade de manter duas ou mais moléculas de antígeno em posições espacialmente próximas, atividade de regulação da interação entre duas ou mais moléculas de antígeno, atividade de regulação da ativação de duas ou mais moléculas de antígeno que são ativadas através da associação entre si, resistência à clivagem por protease, ou semelhantes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉ-

CULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CONTENDO DOIS DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO LIGADOS ENTRE SI". Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação ao antígeno contendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um segundo domínio de ligação ao antígeno que estão ligados entre si, métodos para a produção de tal molécula de ligação ao antígeno, mé- todos para o uso de uma tal molécula de ligação ao antígeno, e com- posições farmacêuticas contendo uma tal molécula de ligação ao antí- geno. A presente invenção também se refere a métodos para aumen- tar a resistência de uma molécula de ligação ao antígeno à clivagem por protease. Técnica Antecedente

[002] Os anticorpos são proteínas que se ligam especificamente a um antígeno com alta afinidade. É conhecido que várias moléculas que variam de compostos de baixo peso molecular a proteínas podem ser antígenos. Visto que a técnica de produção de anticorpos mono- clonais foi desenvolvida, as técnicas de modificação de anticorpos avançaram, facilitando a obtenção de anticorpos que reconhecem uma determinada molécula. Agora, as técnicas de modificação de anticor- pos não são apenas para modificar as próprias proteínas, mas tam- bém se expandiram em um campo que visa no acréscimo de novas funções onde a conjugação com compostos de baixo peso molecular é contemplada. Por exemplo, os anticorpos projetados com cisteína, que contêm um aminoácido cisteína livre na cadeia pesada ou leve, são utilizados como conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) para propósitos médicos (PTL 1).

[003] Enquanto isso, as técnicas de modificação de anticorpos têm contribuído não apenas para o desenvolvimento da engenharia de anticorpos como ferramentas para detectar, analisar e purificar proteí- nas, mas também para o desenvolvimento da engenharia de proteínas em geral, tal como melhorar a função de uma proteína de não anticor- po utilizando uma própria molécula de anticorpo como proteína mode- lo.

[004] Os anticorpos estão chamando a atenção como fármacos porque são altamente estáveis no plasma sanguíneo e possuem me- nos efeitos colaterais. Não apenas os anticorpos se ligam a um antí- geno e apresentam efeitos agonísticos ou antagonísticos, mas tam- bém induzem a atividade citotóxica mediada por células efetoras (tam- bém referidas como funções efetoras), incluindo ADCC (Citotoxicidade celular dependente de anticorpo), ADCP (fagocitose celular dependen- te de anticorpo), e CDC (citotoxicidade dependente do complemento). Levando vantagem dessas funções de anticorpos, foram desenvolvi- dos produtos farmacêuticos para câncer, doenças imunológicas, doen- ças crônicas, infecções, etc. (NPL 1).

[005] Por exemplo, produtos farmacêuticos que utilizam um anti- corpo agonista contra uma molécula coestimuladora que promove a ativação de células T citotóxicas foram desenvolvidos como agentes anticâncer (NPL 2). Recentemente, descobriu-se que anticorpos inibi- dores de pontos de controle imunológicos com atividade antagonista em moléculas coinibidoras são úteis como agentes anticâncer. Essa descoberta levou ao lançamento de uma série de fármacos de anticor- pos que inibem a interação de CTLA4/CD80 ou PD-1/PD-L1: Ipilimu- mab, Nivolumab, Pembrolizumab e Atezolizumab (NPL 1).

[006] No entanto, esses anticorpos às vezes não exercem sufici- entemente os efeitos esperados em sua forma original de IgG nativa. Portanto, produtos farmacêuticos de anticorpos de segunda geração, em que as funções do anticorpo IgG nativo foram artificialmente au- mentadas ou adicionadas, ou diminuídas ou eliminadas, dependendo do propósito de uso, foram desenvolvidos. Os fármacos de anticorpos de segunda geração incluem, por exemplo, anticorpos com funções efetoras aumentadas ou eliminadas (NPL 3), anticorpos que se ligam a um antígeno de uma maneira dependente do pH (NPL 4) e anticorpos que se ligam a dois ou mais antígenos diferentes por molécula (os an- ticorpos que se ligam a dois antígenos diferentes são geralmente refe- ridos como "anticorpos biespecíficos" (NPL 5).

[007] Espera-se que os anticorpos biespecíficos sejam produtos farmacêuticos mais eficazes. Por exemplo, anticorpos com atividade antitumoral aumentada que reticulam uma célula T citotóxica com uma célula cancerosa através da ligação a uma proteína expressa na membrana celular da célula T como um antígeno e a um antígeno canceroso como o outro antígeno foram desenvolvidos (NPL 7, NPL 8 e PTL 2). Os anticorpos biespecíficos relatados anteriormente incluem moléculas com dois domínios Fab de anticorpo, cada um tendo uma sequência diferente (anticorpos biespecíficos de cadeia leve comuns e hibridomas híbridos), moléculas com um sítio de ligação ao antígeno adicional anexado ao N- ou C-terminal do anticorpo (DVD-Ig e scFv- IgG), moléculas com um domínio Fab que se liga a dois antígenos (IgG dois em um), moléculas nas quais as regiões de alça calibrada do domínio de CH3 foram projetadas para formar novos sítios de ligação ao antígeno (Fcab) (NPL 9) e moléculas com Fab-Fab em tandem (NPL 10).

[008] Enquanto isso, os anticorpos com funções efetoras facil- mente provocam efeitos colaterais, através da atuação mesmo em cé- lulas normais que expressam um antígeno alvo em níveis baixos. As- sim, esforços têm sido feitos para permitir que produtos farmacêuticos de anticorpos exerçam suas funções efetoras especificamente no teci- do alvo. Os exemplos relatados anteriormente são anticorpos cuja ati- vidade de ligação muda após a ligação a um metabólito celular (PTL

3), anticorpos que se tornam capazes de se ligar a um antígeno após a clivagem da protease (PTL 4) e uma tecnologia que regula a reticula- ção mediada por anticorpos entre as células T do receptor de antígeno quimérico e células cancerosas pela adição de um composto (ABT- 737) (NPL 11).

[009] Os anticorpos agonistas podem ser difíceis de obter depen- dendo do alvo. Em particular, para proteínas de membrana tais como receptores acoplados à proteína G, muitas técnicas diferentes foram desenvolvidas (NPL 12). Assim, há uma demanda por métodos sim- ples para aumentar o efeito agonístico de anticorpos em tais alvos. Os métodos existentes conhecidos incluem, por exemplo, um método de reticulação de um anticorpo anti-DR4 (Death Receptor 4) ou anti-DR5 (Death Receptor 5) (NPL13), um método de multimerização de nano- corpos de anticorpo anti-DR5 (Death Receptor 5) (NPL 14), um méto- do de conversão de um anticorpo antirreceptor de trombopoietina em um diacorpo covalente, sc(Fv)2 (NPL 15), um método para alterar a subclasse de IgG do anticorpo anti-CD40 (NPL 16), um método de he- xamerizar um anticorpo anti-CD20 (NPL 17) e um método de produção de uma molécula circular semelhante a um anticorpo (PTL 5). Além disso, os métodos relatados utilizando anticorpos biespecíficos inclu- em, por exemplo, um método de uso de uma combinação de dois anti- corpos antieritropoietina apropriados contra diferentes epítopos como um anticorpo biespecífico (NPL 18), um método de uso de uma combi- nação de um anticorpo para funções de guia e um anticorpo para fun- ções efetoras como um anticorpo biespecífico (NPL 19), e um método de introdução de resíduos Cys em múltiplos fragmentos de anticorpo específicos para diferentes epítopos e sua conjugação (NPL 20, NPL 21 e PTL 6). Lista de Citações Literatura de Patente

[0010] [PTL 1] WO 2016/040856

[0011] [PTL 2] WO 2008/157379

[0012] [PTL 3] WO 2013/180200

[0013] [PTL 4] WO 2009/025846

[0014] [PTL 5] WO 2017/191101

[0015] [PTL 6] WO 2018/027204 Literatura Não Patente

[0016] [NPL 1] Nature Reviews Drug Discovery (2018) 17, 197-223

[0017] [NPL 2] Clinical and Experimental Immunology (2009) 157, 9-19

[0018] [NPL 3] Current Pharmaceutical Biotechnology (2016) 17, 1298-1314

[0019] [NPL 4] Nature Biotechnology (2010) 28, 1203-1208

[0020] [NPL 5] MAbs (2012) 4, 182-197

[0021] [NPL 6] Nature Reviews Immunology (2010) 10, 301-316

[0022] [NPL 7] Sci Transl Med (2017) 9(410), eaal4291

[0023] [NPL 8] Blood (2011) 117(17): 4403-4404

[0024] [NPL 9] Protein Eng Des Sel (2010) 23(4), 289-297

[0025] [NPL 10] J Immunol (2016) 196(7): 3199-3211

[0026] [NPL 11] Nature Chemical Biology (2018) 14, 112-117

[0027] [NPL 12] Exp Mol Med (2016) 48(2): e207

[0028] [NPL 13] Nature Reviews Drug Discovery (2008) 7, 1001- 1012

[0029] [NPL 14] MAbs (2014) 6(6): 1560-1570

[0030] [NPL 15] Blood (2005) 105(2): 562-566

[0031] [NPL 16] J Biol Chem (2008) 283(23): 16206-16215

[0032] [NPL 17] PLoS Biol (2016) 14(1): e1002344

[0033] [NPL 18] Proc Natl Acad Sci U S A (2012) 109(39): 15728- 15733

[0034] [NPL 19] Scientific Reports (2018) 8, Article number: 766

[0035] [NPL 20] PLoS One (2012) 7(12): e51817

[0036] [NPL 21] Nucleic Acids Res (2010) 38(22): 8188-8195 Sumário da Invenção Problema Técnico

[0037] Os esforços acima mencionados para aumentar ou diminuir a ação agonística ou função efetora de produtos farmacêuticos de an- ticorpos ainda estão em desenvolvimento e mais esforços são espera- dos. A presente invenção foi constituída nestas circunstâncias. Um ob- jetivo da presente invenção é fornecer novas moléculas de ligação ao antígeno que possuem atividade de regulação da interação entre duas ou mais moléculas do antígeno, ou métodos para produzir ou utilizar tais moléculas de ligação ao antígeno. A presente invenção pode ser útil para o rastreio e desenvolvimento de produtos farmacêuticos de anticorpos e também pode ser aplicável a outras técnicas de engenha- ria de proteínas. Solução para o Problema

[0038] Em um aspecto não limitativo, os presentes inventores mo- dificaram as moléculas de ligação ao antígeno (por exemplo, anticor- pos) que possuem atividade agonista e contêm dois domínios de liga- ção ao antígeno (por exemplo, partes Fab) através da introdução de mutações de aminoácido nos domínios de ligação ao antígeno, e mo- léculas produzidas nas quais os domínios de ligação ao antígeno esta- vam ligados entre si. Como um resultado, os inventores descobriram que a atividade agonista das moléculas foi muito melhorada. Além dis- so, em um aspecto não limitativo, os presentes inventores encontra- ram moléculas de ligação ao antígeno que adquiriram resistência à digestão por protease através da ligação entre os domínios de ligação ao antígeno.

[0039] A presente invenção baseia-se nessas descobertas e abrange especificamente as modalidades exemplificadas abaixo.

[0040] [1] Uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um segundo domínio de ligação ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno estão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações.

[0041] [2] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [1], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é uma ligação covalente.

[0042] [3] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [2], em que a ligação covalente é formada através da reticulação direta de um resíduo de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno com um resíduo de aminoácido no segundo domínio de ligação ao an- tígeno.

[0043] [4] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [3], em que os resíduos de aminoácido reticulados são cisteína.

[0044] [5] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [4], em que a ligação covalente formada é uma ligação de dissulfeto.

[0045] [6] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [2], em que a ligação covalente é formada pela reticulação de um resíduo de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno com um resíduo de aminoácido no segundo domínio de ligação ao antígeno por meio de um agente de reticulação.

[0046] [7] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [6], em que o agente de reticulação é um agente de reticulação reativo com amina.

[0047] [8] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [7], em que os resíduos de aminoácido reticulados são lisina.

[0048] [9] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [1], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é uma ligação não covalente.

[0049] [10] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [9],

em que a ligação não covalente é uma ligação iônica, ligação de hi- drogênio ou ligação hidrofóbica.

[0050] [11] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [10], em que a ligação iônica é formada entre um aminoácido acídico e um aminoácido básico.

[0051] [12] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [11], em que o aminoácido acídico é ácido aspártico (Asp) ou ácido glutâmi- co (Glu), e o aminoácido básico é histidina (His), lisina (Lys) ou argini- na (Arg).

[0052] [13] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [12], em que pelo menos um dos resíduos de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam é um resíduo de aminoácido com mutação introduzido artificialmente.

[0053] [14] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [13], em que o resíduo de aminoácido com mutação é um resíduo de cisteí- na.

[0054] [15] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [14], em que pelo menos um dos primeiro e se- gundo domínios de ligação ao antígeno possui, isoladamente, ativida- de de ligação a um antígeno.

[0055] [16] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [15], em que o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno são ambos domínios de ligação ao antígeno do mesmo tipo.

[0056] [17] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [16], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é formada através da ligação de resíduos de aminoácido presentes na mesma posição no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de li-

gação ao antígeno entre si.

[0057] [18] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [16], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é formada através da ligação de resíduos de aminoácido presentes em diferentes posições no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno entre si.

[0058] [19] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [18], em que pelo menos um dos primeiro e se- gundo domínios de ligação ao antígeno compreende um fragmento de anticorpo que se liga a um antígeno particular.

[0059] [20] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [19], em que o fragmento de anticorpo é um Fab, Fab', scFab, Fv, scFv ou anticorpo de domínio único.

[0060] [21] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [19] ou [20], em que pelo menos um dos resíduos de aminoácido dos quais se originam as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno está presente no fragmento de anticorpo.

[0061] [22] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [21], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região constante.

[0062] [23] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [22], em que a região constante é derivada de ser humano.

[0063] [24] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [22] ou [23], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região CH1.

[0064] [25] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [24], em que a subclasse da região CH1 é γ1, γ2, γ3, γ4, α1, α2, μ, δ ou ε.

[0065] [26] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [24] ou [25], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente em qualquer uma das posições 119 a 123, 131 a 140, 148 a 150, 155 a 167, 174 a 178, 188 a 197, 201 a 214 e 218 a 219, de acordo com a numeração da EU, na região CH1.

[0066] [27] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [26], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 119, 122, 123, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 148, 150, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 167, 174, 176, 177, 178, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 201, 203, 205, 206, 207, 208, 211, 212, 213, 214, 218 e 219, de acordo com a nume- ração da EU, na região CH1.

[0067] [28] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [27], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente na posição 134, 135, 136, 137, 191, 192, 193, 194, 195 ou 196, de acordo com a numeração da EU, na região CH1.

[0068] [29] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [28], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente na posição 135, 136 ou 191, de acordo com a numeração da EU, na região CH1.

[0069] [30] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [24] a [29], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é formada pela ligação de um resíduo de aminoácido na região CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno com um resíduo de aminoácido na região CH1 do segundo domínio de ligação ao antígeno.

[0070] [31] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [30], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste nas posições 119, 120, 121, 122 e 123 de acordo com a numeração da EU.

[0071] [32] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [30], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste nas posições 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 e 140 de acordo com a numeração da EU.

[0072] [33] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [30], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste nas posições 148, 149 e 150 de acordo com a numeração da EU.

[0073] [34] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [30], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste nas posições 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 e 167 de acordo com a numeração da EU.

[0074] [35] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [30], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste nas posições 174, 175, 176, 177, e 178 de acordo com a numeração da EU.

[0075] [36] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [30], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste nas posições 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 e 197 de acordo com a numeração da EU.

[0076] [37] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [30], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste nas posições 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213 e 214 de acordo com a numeração da EU.

[0077] [38] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [30], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste nas posições 218 e 219 de acordo com a numeração da EU.

[0078] [39] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [30] a [38], em que a diferença entre as posições dos resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno é de três aminoácidos ou menos.

[0079] [40] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [39], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é formada através da ligação de um resíduo de aminoácido na posição 135 de acordo com a numeração da EU na re- gião CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno com um resíduo de aminoácido em qualquer uma das posições 132 a 138 de acordo com a numeração da EU na região CH1 do segundo domínio de liga- ção ao antígeno.

[0080] [41] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [39], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é formada pela ligação de um resíduo de aminoá- cido na posição 136 de acordo com a numeração da EU na região CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno com um resíduo de aminoácido em qualquer uma das posições 133 a 139 de acordo com a numeração da EU na região CH1 do segundo domínio de ligação ao antígeno.

[0081] [42] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [39], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é formada através da ligação de um resíduo de aminoácido na posição 191 de acordo com a numeração da EU na re- gião CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno com um resíduo de aminoácido em qualquer uma das posições 188 a 194 de acordo com a numeração da EU na região CH1 do segundo domínio de liga- ção ao antígeno.

[0082] [43] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [40], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é formada pela ligação de resíduos de aminoácido na posição 135 de acordo com a numeração da EU na região CH1 dos dois domínios de ligação ao antígeno entre si.

[0083] [44] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [41], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é formada através da ligação dos resíduos de aminoácido na posição 136 de acordo com a numeração da EU na re- gião CH1 dos dois domínios de ligação ao antígeno entre si.

[0084] [45] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [42], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é formada através da ligação dos resíduos de aminoácido na posição 191 de acordo com a numeração da EU na re- gião CH1 dos dois domínios de ligação ao antígeno entre si.

[0085] [46] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [22]

ou [23], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região CL.

[0086] [47] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [46], em que a subclasse da região CL é κ ou λ.

[0087] [48] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [46] ou [47], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente em qualquer uma das posições 108 a 112, 121 a 128, 151 a 156, 184 a 190, 195 a 196, 200 a 203 e 208 a 213, de acordo com a numeração de Kabat, na região CL.

[0088] [49] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [48], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 108, 109, 112, 121, 123, 126, 128, 151, 152, 153, 156, 184, 186, 188, 189, 190, 195, 196, 200, 201, 202, 203, 208, 210, 211, 212 e 213 de acordo com a numeração de Kabat na região CL.

[0089] [50] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [49], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente na posição 126 de acordo com a numeração de Kabat na região CL.

[0090] [51] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [46] a [50], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é formada através da ligação de um resíduo de aminoácido na região CL do primeiro domí- nio de ligação ao antígeno com um resíduo de aminoácido na região CL do segundo domínio de ligação ao antígeno.

[0091] [52] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [51], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste nas posições 108, 109, 110, 111 e 112 de acordo com a numeração de Kabat.

[0092] [53] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [51], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste nas posições 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 e 128 de acordo com a numeração de Kabat.

[0093] [54] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [51], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste nas posições 151, 152, 153, 154, 155 e 156 de acordo com a numeração de Kabat.

[0094] [55] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [51], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste nas posições 184, 185, 186, 187, 188, 189 e 190 de acordo com a nume- ração de Kabat.

[0095] [56] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [51], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste nas posições 195 e 196 de acordo com a numeração de Kabat.

[0096] [57] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [51], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um,

independentemente selecionados a partir do grupo que consiste nas posições 200, 201, 202 e 203 de acordo com a numeração de Kabat.

[0097] [58] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [51], em que os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste nas posições 208, 209, 210, 211, 212 e 213 de acordo com a numeração de Kabat.

[0098] [59] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [51] a [58], em que a diferença entre as posições dos resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno é de três aminoácidos ou menos.

[0099] [60] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [59], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é formada através da ligação dos resíduos de aminoácido na posição 126 de acordo com a numeração de Kabat na região CL dos dois domínios de ligação ao antígeno entre si.

[00100] [61] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [24] a [29] e [46] a [50], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é formada pela ligação de um resíduo de aminoácido na região CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno com um resíduo de aminoácido na re- gião CL do segundo domínio de ligação ao antígeno.

[00101] [62] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [61], em que o resíduo de aminoácido na região CH1 é selecionado a partir do grupo que consiste nas posições 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 e 197 de acordo com a numeração da EU, e o resíduo de aminoácido na região CL é selecionado a partir do grupo que consiste nas posições 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 e 128 de acordo com a numeração de Kabat.

[00102] [63] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [62], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é formada pela ligação de um resíduo de aminoá- cido na posição 191 de acordo com a numeração da EU na região CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno com um resíduo de aminoácido na posição 126 de acordo com a numeração de Kabat na região CL do segundo domínio de ligação ao antígeno.

[00103] [64] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [21], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região variável.

[00104] [65] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [64], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região VH.

[00105] [66] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [65], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 6, 8, 16, 20, 25, 26, 28, 74 e 82b de acordo com a numeração de Kabat na região VH.

[00106] [67] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [64], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região VL.

[00107] [68] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [67], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 21, 27, 58,

77, 100, 105 e 107 de acordo com a numeração de Kabat na região VL (subclasse κ).

[00108] [69] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [67], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 6, 19, 33 e 34, de acordo com a numeração de Kabat na região VL (subclasse λ).

[00109] [70] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [64], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região VHH.

[00110] [71] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [70], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 20, 24, 27, 29, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 67, 69, 71, 78, 80, 82, 82c, 85, 88, 91, 93, 94 e 107 de acordo com a numeração de Kabat na região VHH.

[00111] [72] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [18], em que pelo menos um do primeiro e do se- gundo domínios de ligação ao antígeno compreende uma proteína não anticorpo que se liga a um antígeno particular, ou um fragmento do mesmo.

[00112] [73] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [72], em que a proteína não anticorpo é um par de um ligante e um receptor que especificamente se ligam entre si.

[00113] [74] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [73], em que os domínios de ligação ao antígeno compreendem uma região de dobradiça.

[00114] [75] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [74],

em que pelo menos um dos resíduos de cisteína presentes na região de dobradiça do tipo selvagem é substituído por outro resíduo de ami- noácido.

[00115] [76] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [75], em que o resíduo de cisteína está presente nas posições 226 e/ou 229, de acordo com a numeração da EU na região de dobradiça.

[00116] [77] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [74] ou [76], em que pelo menos um dos resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente na região de dobradiça.

[00117] [78] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [77], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 216, 218 e 219 de acordo com a numeração da EU na região da dobradiça.

[00118] [79] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [78], em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno estão ligados entre si por meio de duas ou mais ligações.

[00119] [80] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [79], em que pelo menos um dos resíduos de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam é um resíduo de aminoácido presente em uma sequência do tipo selvagem.

[00120] [81] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [80], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região de dobradiça.

[00121] [82] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [81], em que o resíduo de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam é um resíduo de cisteína na região de dobradiça.

[00122] [83] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [80] a [82], em que pelo menos uma das ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é uma ligação de dis- sulfeto formada através da reticulação de resíduos de cisteína presen- tes na região de dobradiça entre si.

[00123] [84] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [83], em que os resíduos de cisteína estão presentes nas posições 226 e/ou 229, de acordo com a numeração da EU na região de dobradiça.

[00124] [85] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [79] a [84], em que pelo menos um dos resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao an- tígeno se originam está presente dentro do fragmento de anticorpo, e pelo menos um dos resíduos de aminoácido está presente na região de dobradiça.

[00125] [86] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [85], em que o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno, cada um, compreendem um Fab e uma região de dobradiça, e em que a molécula de ligação ao antígeno que compreende os dois domínios de ligação ao antígeno é F(ab')2.

[00126] [87] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [86], em que os domínios de ligação ao antígeno compreendem uma região Fc.

[00127] [88] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [87], em que uma ou mais mutações de aminoácido que promovem a mul- timerização das regiões Fc são introduzidas na região Fc.

[00128] [89] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [88], em que as mutações de aminoácido que promovem a multimerização compreendem uma mutação de aminoácido em pelo menos uma posi- ção selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 247, 248,

253, 254, 310, 311, 338, 345, 356, 359, 382, 385, 386, 430, 433, 434, 436, 437, 438, 439, 440 e 447 de acordo com a numeração da EU.

[00129] [90] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [88] ou [89], em que a multimerização é hexamerização.

[00130] [91] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [87] a [90], que é um anticorpo de comprimento total.

[00131] [92] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [91], em que o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno se ligam ao mesmo antígeno.

[00132] [93] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [92], em que o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno se ligam ao mesmo epítopo no referido antígeno.

[00133] [94] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [92], em que cada um dos primeiro e segundo domínios de ligação ao antí- geno se liga a um epítopo diferente no referido antígeno.

[00134] [95] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [91], em que cada um dos primeiro e segundo domínios de ligação ao antígeno se liga a um antígeno diferente.

[00135] [96] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com [93], em que o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno pos- suem a mesma sequência de aminoácido.

[00136] [97] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [93] a [95], em que cada um dos primeiro e segundo domínios de ligação ao antígeno possui uma sequência de aminoácido diferente.

[00137] [98] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [91], em que pelo menos um dos dois antígenos aos quais o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno se ligam é uma proteína solúvel.

[00138] [99] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [91], em que pelo menos um dos dois antígenos aos quais o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno se ligam é uma proteína de membrana.

[00139] [100] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [99], que possui atividade de regulação da intera- ção entre duas moléculas de antígeno.

[00140] [101] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[100], que é capaz de aumentar ou diminuir a interação entre duas mo- léculas de antígeno em comparação com uma molécula de ligação ao antígeno de controle, em que a molécula de ligação ao antígeno de controle difere da molécula de ligação ao antígeno de [100] apenas no sentido de que a molécula de ligação ao antígeno de controle possui uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antígeno.

[00141] [102] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[100] ou [101], em que as duas moléculas de antígeno são um ligante e um receptor do mesmo, respectivamente, e em que a molécula de ligação ao antígeno possui atividade de promoção da ativação do re- ceptor pelo ligante.

[00142] [103] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[100] ou [101], em que as duas moléculas de antígeno são uma enzi- ma e um substrato da mesma, respectivamente, e em que a molécula de ligação ao antígeno possui atividade de promoção da reação catalí- tica da enzima com o substrato.

[00143] [104] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[100] ou [101], em que ambas as duas moléculas de antígeno são pro- teínas presentes nas superfícies celulares e em que a molécula de li- gação ao antígeno possui atividade de promoção da interação entre uma célula que expressa o primeiro antígeno e uma célula que ex- pressa o segundo antígeno.

[00144] [105] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[104], em que a célula que expressa o primeiro antígeno é uma célula com atividade citotóxica e a célula que expressa o segundo antígeno é uma célula-alvo da mesma, e em que a molécula de ligação ao antí- geno promove o dano de dita célula alvo pela referida célula com ativi- dade citotóxica.

[00145] [106] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[105], em que a célula com atividade citotóxica é uma célula T, célula NK, monócito ou macrófago.

[00146] [107] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [99], que possui atividade de regulação da ativa- ção de duas moléculas de antígeno que são ativadas através da asso- ciação entre si.

[00147] [108] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[107], que aumenta ou diminui a ativação de duas moléculas de antí- geno em comparação com uma molécula de ligação ao antígeno de controle, em que a molécula de ligação ao antígeno de controle difere da molécula de ligação ao antígeno de [107] apenas na medida em que a molécula de ligação ao antígeno de controle possui uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antígeno.

[00148] [109] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[107] ou [108], em que as moléculas de antígeno são selecionadas do grupo que consiste em receptores pertencentes a superfamílias de re- ceptores de citocinas, receptores acoplados à proteína G, receptores de canais iônicos, receptores de tirosina cinase, receptores imunológi- cos do ponto de controle, receptores de antígenos, antígenos de CD, moléculas coestimuladoras e moléculas de aderência celular.

[00149] [110] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [99], que possui atividade de manter duas molé- culas de antígeno em posições espacialmente próximas.

[00150] [111] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[110], que é capaz de manter duas moléculas de antígeno em posi- ções mais próximas do que uma molécula de ligação ao antígeno de controle, em que a molécula de ligação ao antígeno de controle difere da molécula de ligação ao antígeno de [110] apenas na medida em que a molécula de ligação ao antígeno de controle possui uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antígeno.

[00151] [112] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [99], em que os dois domínios de ligação ao antí- geno estão em posições espacialmente próximas e/ou a mobilidade dos dois domínios de ligação ao antígeno é reduzida.

[00152] [113] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[112], em que os dois domínios de ligação ao antígeno estão em posi- ções mais próximas e/ou os dois domínios de ligação ao antígeno possuem menos mobilidade do que uma molécula de ligação ao antí- geno de controle, em que a molécula de ligação ao antígeno de con- trole difere da molécula de ligação ao antígeno de [112] apenas em que a molécula de ligação ao antígeno de controle possui uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antígeno.

[00153] [114] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [99], que possui resistência à clivagem por pro- tease.

[00154] [115] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[114], que possui resistência aumentada à clivagem da protease em comparação com uma molécula de ligação ao antígeno de controle, em que a molécula de ligação ao antígeno de controle difere da molé- cula de ligação ao antígeno de [114] apenas em que a molécula de ligação ao antígeno de controle possui uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antígeno.

[00155] [116] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[115], em que a proporção da molécula de comprimento total que per-

manece após o tratamento com protease é aumentada em compara- ção com a molécula de ligação ao antígeno de controle.

[00156] [117] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[115] ou [116], em que a proporção de um fragmento específico produ- zido após o tratamento com protease é reduzida em comparação com a molécula de ligação ao antígeno de controle.

[00157] [118] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [99], em que quando a molécula é tratada com uma protease, um dímero dos domínios de ligação ao antígeno ou fra- gmentos dos mesmos é removido.

[00158] [119] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[118], em que quando a molécula de ligação ao antígeno de controle é tratada com a referida protease, monômeros dos domínios de ligação ao antígeno ou fragmentos dos mesmos são removidos, e em que a molécula de ligação ao antígeno de controle difere da molécula de li- gação ao antígeno de [118] apenas em que a molécula de ligação ao antígeno de controle possui uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antígeno.

[00159] [120] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[118] ou [119], em que a protease cliva a região de dobradiça.

[00160] [121] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [101] a [106], [108] a [109], [111], [113], [115] a [117] e

[119] a [120], em que a uma ligação menor é uma ligação formada que se origina de um resíduo de aminoácido com mutação.

[00161] [122] A molécula de ligação ao antígeno de acordo com

[121], em que o resíduo de aminoácido com mutação é um resíduo de cisteína.

[00162] [123] Uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer um de [1] a

[122] e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00163] [124] Método para regular a interação entre duas moléculas de antígeno, que compreende:

[00164] (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno compre- endendo dois domínios de ligação ao antígeno,

[00165] (b) adicionar à molécula de ligação ao antígeno pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno entre si, e

[00166] (c) colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno produzida em (b) com as duas moléculas de antígeno.

[00167] [125] Um método para regular a atividade de duas molécu- las de antígeno que são ativadas através da associação entre si, com- preendendo:

[00168] (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno que compreende dois domínios de ligação ao antígeno,

[00169] (b) adicionar à molécula de ligação ao antígeno pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno entre si, e

[00170] (c) colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno produzida em (b) com as duas moléculas de antígeno.

[00171] [126] Método para manter duas moléculas de antígeno em posições espacialmente próximas, que compreende:

[00172] (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno compre- endendo dois domínios de ligação ao antígeno,

[00173] (b) adicionar à molécula de ligação ao antígeno pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno entre si, e

[00174] (c) colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno produzida em (b) com as duas moléculas de antígeno.

[00175] [127] Método para colocar dois domínios de ligação ao an- tígeno em posições espacialmente próximas e/ou reduzir a mobilidade dos dois domínios de ligação ao antígeno, que compreende:

[00176] (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno compre- endendo dois domínios de ligação ao antígeno, e

[00177] (b) adicionar à molécula de ligação ao antígeno pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno entre si.

[00178] [128] Método para aumentar a resistência de uma molécula de ligação ao antígeno à clivagem por protease, que compreende:

[00179] (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno compre- endendo dois domínios de ligação ao antígeno, e

[00180] (b) adicionar à molécula de ligação ao antígeno pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno entre si.

[00181] [129] Método para a produção de uma molécula de ligação ao antígeno que possui atividade de regulação da interação entre duas moléculas de antígeno, que compreende:

[00182] (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno,

[00183] (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno, de tal modo que pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicionada,

[00184] (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira,

[00185] (d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e

[00186] (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo compreendendo o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno es- tão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações.

[00187] [130] Método para a produção de uma molécula de ligação ao antígeno que possui atividade de regulação da ativação de duas moléculas de antígeno que são ativadas através da associação entre si, que compreende:

[00188] (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno,

[00189] (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno, de tal modo que pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicionada,

[00190] (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira,

[00191] (d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e

[00192] (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo compreendendo o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno es- tão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações.

[00193] [131] Método para a produção de uma molécula de ligação ao antígeno que possui atividade de manter duas moléculas de antí- geno em posições espacialmente próximas, que compreende:

[00194] (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno,

[00195] (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno, de tal modo que pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicionada,

[00196] (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira,

[00197] (d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e

[00198] (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo compreendendo o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno es- tão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações.

[00199] [132] Um método para a produção de uma molécula de li- gação ao antígeno em que dois domínios de ligação ao antígeno estão presentes em posições espacialmente próximas e/ou a mobilidade dos dois domínios de ligação ao antígeno é reduzida, compreendendo:

[00200] (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno,

[00201] (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno, de tal modo que pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicionada,

[00202] (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira,

[00203] (d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e

[00204] (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo que compreende o primeiro e o segundo domínios de li- gação ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno estão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações.

[00205] [133] Um método para a produção de uma molécula de li-

gação ao antígeno que aumentou a resistência à clivagem por pro- tease, que compreende:

[00206] (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno,

[00207] (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno, de tal modo que pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicionada,

[00208] (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira,

[00209] (d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e

[00210] (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo que compreende o primeiro e o segundo domínios de li- gação ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno estão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações.

[00211] [134] Método para identificar um novo par de moléculas de proteína que são ativadas através da associação entre si, que com- preende:

[00212] (a) fornecer duas moléculas de proteína arbitrárias,

[00213] (b) produzir, pelo método de acordo com qualquer um de

[129] a [133], uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo dois domínios de ligação ao antígeno que se ligam respectivamente às duas moléculas de proteína,

[00214] (c) colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno produzida em (b) com as duas moléculas de proteína, e

[00215] (d) avaliar se as duas moléculas de proteína são ativadas ou não.

[00216] [135] O método de [134], em que pelo menos uma das mo- léculas de proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em receptores pertencentes a superfamílias de receptores de citocina, re- ceptores acoplados à proteína G, receptores de canais iônicos, recep- tores de tirosina cinase, receptores imunológico do ponto de controle, receptores de antígeno, antígenos CD, moléculas coestimuladoras e moléculas de aderência celular. Breve Descrição dos Desenhos

[00217] A Fig. 1 representa exemplos de anticorpos modificados nos quais os Fabs são reticulados entre si, conforme descrito no Exemplo 1. A figura mostra esquematicamente as diferenças estrutu- rais entre um anticorpo do tipo selvagem (WT) e um anticorpo modifi- cado em que as regiões CH1 da cadeia H do anticorpo são reticuladas entre si (tipo HH), um anticorpo modificado no qual as regiões CL da cadeia L do anticorpo são reticuladas entre si (tipo LL) e um anticorpo modificado no qual a região CH1 da cadeia H do anticorpo é reticulada com a região CL da cadeia L do anticorpo (tipo HL ou LH).

[00218] A Fig. 2 mostra os resultados do ensaio da atividade ago- nista mediada por CD3 de uma molécula de anticorpo anti-CD3ε do tipo selvagem (CD3-G4s) e moléculas de anticorpo modificadas pro- duzidas pela ligação do Fab-Fab da molécula do tipo selvagem por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (CD3-G4sLL, CD3- G4sHH), conforme descrito no Exemplo 4-3.

[00219] A Fig. 3 mostra os resultados do ensaio da atividade ago- nista mediada por CD3 de uma molécula de anticorpo anti-CD3ε do tipo selvagem (OKT3-G1s) e moléculas de anticorpo modificadas pro- duzidas pela ligação do Fab-Fab da molécula do tipo selvagem por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (OKT3-G1sLL, OKT3- G1sHH), conforme descrito no Exemplo 4-3.

[00220] A Fig. 4 mostra os resultados do ensaio da atividade ago-

nista mediada por CD3 e/ou CD28 de uma molécula de anticorpo anti- CD3ε do tipo selvagem (CD3-G1s), uma molécula de anticorpo anti- CD28 (CD28-G1s) e um anticorpo biespecífico anti-CD3ε x anti-CD28 (CD3//CD28-G1s) e moléculas de anticorpo modificadas produzidas através da ligação do Fab-Fab do anticorpo biespecífico por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (CD3//CD28-G1sLL, CD3//CD28- G1sHH, CD3//CD28-G1sLH, CD3//CD28-G1sHL), conforme descrito no Exemplo 4-3.

[00221] A Fig. 5 mostra os resultados do ensaio da atividade ago- nista mediada por CD3 e/ou CD28 de uma molécula de anticorpo anti- CD3ε do tipo selvagem (OKT3-G1s), uma molécula de anticorpo anti- CD28 (CD28-G1s) e um anticorpo biespecífico anti -CD3ε x anti-CD28 (OKT3//CD28-G1s) e moléculas de anticorpo modificadas produzidas pela ligação do Fab-Fab do anticorpo biespecífico por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (OKT3//CD28-G1sHH, OKT3//CD28- G1sHL), conforme descrito no Exemplo 4-3.

[00222] A Fig. 6 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH.xxx-G1T4) e anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteí- na na região constante de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH-G1T4.xxx), conforme descrito no Exemplo 5-2 (1/8). Cada an- ticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não re- dutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo cadeia anti- capa.

[00223] A Fig. 7 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH.xxx-G1T4) e anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteí- na na região constante de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH-G1T4.xxx), conforme descrito no Exemplo 5-2 (2/8). Cada an- ticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não re- dutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia an- ti-capa.

[00224] A Fig. 8 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH.xxx-G1T4), e anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteí- na na região constante de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH-G1T4.xxx), conforme descrito no Exemplo 5-2 (3/8). Cada an- ticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não re- dutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia an- ti-capa.

[00225] A Fig. 9 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH.xxx-G1T4) e anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteí- na na região constante de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH-G1T4.xxx), conforme descrito no Exemplo 5-2 (4/8). Cada an- ticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não re- dutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia an- ti-capa.

[00226] A Fig. 10 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH.xxx-G1T4), e anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteí- na na região constante de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH-G1T4.xxx), conforme descrito no Exemplo 5-2 (5/8). Cada an- ticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não re- dutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia an- ti-capa.

[00227] A Fig. 11 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH.xxx-G1T4) e anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteí- na na região constante de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH-G1T4.xxx), conforme descrito no Exemplo 5-2 (6/8). Cada an- ticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não re- dutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia an- ti-capa.

[00228] A Fig. 12 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH.xxx-G1T4) e anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteí- na na região constante de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH-G1T4.xxx), conforme descrito no Exemplo 5-2 (7/8). Cada an- ticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não re- dutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia an- ti-capa.

[00229] A Fig. 13 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH.xxx-G1T4) e anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteí- na na região constante de cadeia pesada do anticorpo anti-IL6R (MRAH-G1T4.xxx), conforme descrito no Exemplo 5-2 (8/8). Cada an- ticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não re- dutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia an- ti-capa.

[00230] A Fig. 14 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL.xxx-k0) e anticorpos modifi- cados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região constante de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL-k0.xxx), conforme descrito no Exemplo 6-2 (1/10). Cada anticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não redutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia anti-capa.

[00231] A Fig. 15 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL.xxx-k0) e anticorpos modifi- cados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região constante de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL-k0.xxx), conforme descrito no Exemplo 6-2 (2/10). Cada anticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não redutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia anti-capa.

[00232] A Fig. 16 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL.xxx-k0) e anticorpos modifi- cados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região constante de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL-k0.xxx),

conforme descrito no Exemplo 6-2 (3/10). Cada anticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não redutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia anti-capa.

[00233] A Fig. 17 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL.xxx-k0) e anticorpos modifi- cados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região constante de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL-k0.xxx), conforme descrito no Exemplo 6-2 (4/10). Cada anticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não redutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia anti-capa.

[00234] A Fig. 18 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL.xxx-k0) e anticorpos modifi- cados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região constante de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL-k0.xxx), conforme descrito no Exemplo 6-2 (5/10). Cada anticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não redutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia anti-capa.

[00235] A Fig. 19 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL.xxx-k0) e anticorpos modifi- cados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região constante de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL-k0.xxx), conforme descrito no Exemplo 6-2 (6/10). Cada anticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não redutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia anti-capa.

[00236] A Fig. 20 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL.xxx-k0) e anticorpos modifi- cados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região constante de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL-k0.xxx), conforme descrito no Exemplo 6-2 (7/10). Cada anticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não redutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia anti-capa.

[00237] A Fig. 21 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL.xxx-k0) e anticorpos modifi- cados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região constante de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL-k0.xxx), conforme descrito no Exemplo 6-2 (8/10). Cada anticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não redutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia anti-capa.

[00238] A Fig. 22 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL.xxx-k0) e anticorpos modifi- cados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região constante de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL-k0.xxx), conforme descrito no Exemplo 6-2 (9/10). Cada anticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não redutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia anti-capa.

[00239] A Fig. 23 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA), anticorpos modificados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região variável de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL.xxx-k0) e anticorpos modifi- cados produzidos pela introdução de uma substituição de cisteína na região constante de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL-k0.xxx), conforme descrito no Exemplo 6-2 (10/10). Cada anticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não redutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia anti-capa.

[00240] A Fig. 24 mostra os resultados do tratamento com protease de um anticorpo anti-IL6R (MRA) e um anticorpo modificado produzido pela introdução de uma substituição de cisteína na região constante de cadeia leve do anticorpo anti-IL6R (MRAL-k0.K126C), conforme des- crito no Exemplo 7-2. Cada anticorpo tratado com protease foi aplicado à eletroforese capilar não redutora, seguido por detecção de faixa com um anticorpo de cadeia anti-capa ou um anticorpo Fc anti-humano.

[00241] A Fig. 25 mostra a correspondência entre o peso molecular de cada faixa obtida através do tratamento com protease da amostra de anticorpo e sua estrutura putativa, como descrito no Exemplo 7-2. Também é observado abaixo da estrutura de cada molécula se a mo- lécula pode reagir com um anticorpo de cadeia anti-capa ou um anti- corpo anti-Fc (se uma faixa é detectada na eletroforese da Fig. 24).

[00242] A Fig. 26 mostra os resultados do ensaio da atividade ago- nista mediada por CD3 de uma molécula de anticorpo anti-CD3 (OKT3), moléculas de anticorpo modificadas produzidas pela ligação do Fab-Fab dessa molécula de anticorpo por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (H_T135C, H_S136C, H_S191C e L_K126C), e uma molécula de anticorpo anti-KLH (IC17) (controle negativo), con- forme descrito no Exemplo 13-4.

[00243] A Fig. 27 mostra os resultados do ensaio da atividade ago- nista mediada por CD3 de uma molécula de anticorpo anti-CD3 (OKT3), uma molécula de anticorpo modificada produzida pela intro- dução de modificações Knobs-into-Holes (KiH), que facilitam a hetero-

dimerização, na região constante de cadeia pesada de OKT3 (OKT3_KiH), moléculas de anticorpo modificadas produzidas pela liga- ção do Fab-Fab dessa molécula de anticorpo por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (H_S191C_KiH, H_S191C/V188C_KiH, H_S191C/P189C_KiH, H_S191C/S190C_KiH, H_S191C/S192C_KiH, H_S191C/L193C_KiH, H_S191C/G194C_KiH), e um anticorpo anti- KLH (IC17) (controle negativo), conforme descrito no Exemplo 14-4.

[00244] A Fig. 28 mostra os resultados do ensaio da atividade ago- nista mediada por CD3 de uma molécula de anticorpo anti-CD3 (OKT3), uma molécula de anticorpo modificada produzida pela ligação do Fab-Fab dessa molécula de anticorpo por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (H_S191C), um molécula de anticorpo modificada produzida pela introdução de modificações Knobs-into-Holes (KiH), que facilitam a heterodimerização, na região constante de cadeia pe- sada de OKT3 (OKT3_KiH), uma molécula de anticorpo modificada produzida pela ligação do Fab-Fab dessa molécula de anticorpo por meio de um ligação de dissulfeto (H_S191C_KiH), moléculas de anti- corpo modificadas produzidas pela introdução de uma substituição de aminoácido carregada positivamente em uma das regiões constantes da cadeia pesada de OKT3_KiH e introdução de uma substituição de aminoácido carregada negativamente na outra região constante de cadeia pesada (0004//0004, 0004//0006), moléculas de anticorpo mo- dificadas produzidas pela introdução de uma substituição de aminoá- cido carregada positiva ou negativamente em uma das regiões cons- tantes de cadeia pesada de OKT3_KiH (0004//OKT3, OKT3//0004, OKT3//0006) e uma molécula de anticorpo anti-KLH (IC17) (controle negativo), conforme descrito no Exemplo 15-4.

[00245] A Fig. 29 mostra os resultados do ensaio da atividade ago- nista mediada por CD3 de uma molécula de anticorpo anti-CD3 (OKT3), moléculas de anticorpo modificadas produzidas pela remoção de uma ligação de dissulfeto na região de dobradiça dessa molécula de anticorpo (dh1, dh2, dh3), moléculas de anticorpo modificadas pro- duzidas pela ligação do Fab-Fab dessas moléculas por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (H_S191C_dh1, H_S191C_dh2, H_S191C_dh3), e uma molécula de anticorpo anti-KLH (IC17) (contro- le negativo), conforme descrito no Exemplo 16-4.

[00246] A Fig. 30 mostra os resultados do ensaio da atividade ago- nista mediada por CD3 de uma molécula de anticorpo monoespecífico anti-CD3 (OKT3-G1s), uma molécula de anticorpo modificada produzi- da pela ligação do Fab-Fab dessa molécula de anticorpo por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (OKT3 -G1sHH), uma molécula de anticorpo modificada produzida pela ligação do Fab-Fab de um anti- corpo monoespecífico anti-CD3 (CD3-G1s) por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (CD3-G1sLL), uma molécula de anticorpo bipa- ratópico anti-CD3 (CD3 // OKT3 -G1s), moléculas de anticorpo modifi- cadas produzidas pela ligação do Fab-Fab dessa molécula de anticor- po por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (CD3//OKT3- G1sHH, CD3//OKT3-G1sLH) e uma combinação de CD3-G1sLL e OKT3-G1s (CD3-G1sLL + OKT3-G1s), conforme descrito no Exemplo

20.

[00247] As Figs. 31A-D mostram os resultados do ensaio da ativi- dade agonista mediada por CD3 e/ou PD1 de anticorpos biespecíficos anti-CD3 x anti-PD1 e moléculas de anticorpo modificadas produzidas pela ligação do Fab-Fab desses anticorpos por meio de uma ligação de dissulfeto adicional, como descrito no Exemplo 22-1. A Fig. 31A mostra a atividade agonista de uma molécula de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-PD1 (OKT3//117-G1silent) que é composta por um an- ticorpo anti-CD3 (OKT3) e um anticorpo anti-PD1 (117), e moléculas de anticorpo modificadas produzidas pela ligação do Fab-Fab dessa molécula de anticorpo por meio de uma ligação de dissulfeto adicional

(OKT3//117-G1silentHH, OKT3//117-G1silentHL, OKT3//117- G1silentLL).

[00248] A Fig. 31B mostra a atividade agonista de uma molécula de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-PD1 (OKT3//10-G1silent) que é composta por um anticorpo anti-CD3 (OKT3) e um anticorpo anti-PD1 (10), e moléculas de anticorpo modificadas produzidas pela ligação do Fab-Fab dessa molécula de anticorpo por meio de uma ligação de dis- sulfeto adicional (OKT3//10-G1silentHH, OKT3//10-G1silentHL).

[00249] A Fig. 31C mostra a atividade agonista de uma molécula de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-PD1 (CD3//949-G1silent) que é composta por um anticorpo anti-CD3 (CD3) e um anticorpo anti-PD1 (949), e moléculas de anticorpo modificadas produzidas pela ligação do Fab-Fab dessa molécula de anticorpo por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (CD3//949-G1silentLH, CD3//949-G1silentHH, CD3//949-G1silentLL, CD3//949-G1silentHL).

[00250] A Fig. 31D mostra a atividade agonista de uma molécula de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-PD1 (OKT3//949-G1silent) que é composta por um anticorpo anti-CD3 (OKT3) e um anticorpo anti-PD1 (949), e moléculas de anticorpo modificadas produzidas pela ligação do Fab-Fab dessa molécula de anticorpo por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (OKT3//949-G1silentHL, OKT3//949-G1silentHH, OKT3//949-G1silentLL).

[00251] A Fig. 32 mostra os resultados do ensaio da atividade ago- nista mediada por CD3 e/ou PD1 de uma molécula de anticorpo bies- pecífico anti-CD3 x anti-PD1 (OKT3//949-G1silent) que é composta por um anticorpo anti-CD3 (OKT3) e um anticorpo anti-PD1 (949), e molé- culas de anticorpo modificadas produzidas pela ligação do Fab-Fab dessa molécula de anticorpo por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (OKT3//949-G1silentHH, OKT3//949-G1silentHL, OKT3//949- G1silentLH, OKT3//949-G1silentLL), conforme descrito no Exemplo 22-

2.

[00252] As Figs. 33A e B mostram os resultados da avaliação do efeito inibidor dependente de células T no crescimento de células can- cerígenas quando se utiliza um anticorpo biespecífico de fixação de CD28/CD3 e um anticorpo biespecífico de CD3 atenuado por GPC3/ligação em combinação, conforme descrito no Exemplo 23-1. Quando o anticorpo biespecífico de fixação de CD28/CD3 acima men- cionado e o anticorpo biespecífico de CD3 atenuado por GPC3/ligação são combinados e podem atuar na presença de células alvo (células cancerosas que expressam GPC3) e células efetoras (células T), o anticorpo biespecífico de CD3 atenuado por GPC3/ligação traz a célu- la alvo e a célula efetora próximas, e o anticorpo biespecífico de fixa- ção de CD28/CD3 ativa a célula efetora. A Fig. 33A mostra o efeito inibitório sobre o crescimento de células cancerígenas quando uma molécula de anticorpo biespecífico de CD3 atenuado por GPC3/ligação (GPC3/attCE115) foi utilizada como um anticorpo para direcionar células T para células cancerosas e uma molécula de anti- corpo biespecífico de fixação de GPC3/CD3 (GPC3/CD3 fixo), uma molécula de anticorpo biespecífico de fixação KLH/CD3 (KLH/CD3 fi- xo), uma molécula de anticorpo biespecífico de fixação de CD28/CD3 (CD28/CD3 fixo) ou uma molécula de anticorpo modificada produzida pela ligação do Fab-Fab dessa molécula de anticorpo através de uma ligação de dissulfeto adicional (CD28/CD3_HH fixo) foi utilizada como um anticorpo para ativar células T.

[00253] A Fig. 33B mostra o efeito inibidor sobre o crescimento de células cancerosas quando uma molécula de anticorpo modificada produzida pela ligação do Fab-Fab do anticorpo biespecífico de CD3 atenuado por GPC3/ligação através de uma ligação de dissulfeto adi- cional (GPC3/attCE115_LL) foi utilizada como um anticorpo para dire- cionar as células T para células cancerosas e uma molécula de anti-

corpo biespecífico de fixação GPC3/CD3 (GPC3/CD3 fixo), uma molé- cula de anticorpo biespecífico de fixação KLH/CD3 (KLH/CD3 fixo), uma molécula de anticorpo biespecífico de fixação CD28/CD3 (CD28/CD3 fixo) ou uma molécula de anticorpo modificada produzida pela ligação do Fab-Fab dessa molécula de anticorpo através de uma ligação de dissulfeto adicional (CD28/CD3_HH fixo) foi utilizada como um anticorpo para ativar células T.

[00254] As Figs. 34A-C mostram os resultados da avaliação da pro- dução de citocinas a partir de células T quando um anticorpo biespecí- fico de fixação de CD28/CD3 e um anticorpo biespecífico de CD3 ate- nuado por GPC3/ligação foram utilizados em combinação como des- crito no Exemplo 23-2. Quando o anticorpo biespecífico de fixação de CD28/CD3 acima mencionado e o anticorpo biespecífico de CD3 ate- nuado de GPC3/ligação são utilizados em combinação na presença de células alvo (células cancerosas de expressão de GPC3) e células efe- toras (células T), o anticorpo biespecífico de CD3 atenuado por GPC3/ligação leva a célula alvo e a célula efetora próximas, e o anti- corpo biespecífico de fixação de CD28/CD3 ativa a célula efetora. A Fig. 34A mostra o nível de produção de IL-6 quando uma molécula de anticorpo biespecífico de CD3 atenuada por GPC3/ligação (GPC3/attCE115) e uma molécula de anticorpo modificada produzida pela ligação do Fab-Fab do anticorpo biespecífico de fixação de CD28/CD3 por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (CD28/CD3_HH fixo) foram utilizadas individualmente ou em combina- ção na presença de células alvo (células cancerosas de expressão de GPC3) e células efetoras (células T).

[00255] A Fig. 34B mostra o nível de produção de IL-6 quando uma molécula de anticorpo biespecífico de CD3 atenuada por GPC3/ligação (GPC3/attCE115) e uma molécula de anticorpo modifi- cada produzida pela ligação do Fab-Fab do anticorpo biespecífico de fixação de CD28/CD3 por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (CD28/CD3_HH fixo) foram utilizadas individualmente ou em combina- ção apenas na presença de células efetoras (células T).

[00256] A Fig. 34C mostra o efeito inibidor do crescimento de célu- las cancerosas quando uma molécula de anticorpo biespecífico de CD3 atenuada por GPC3/ligação (GPC3/attCE115) e uma molécula de anticorpo modificada produzida pela ligação do Fab-Fab do anticorpo biespecífico de fixação de CD28/CD3 por meio de um ligação de dis- sulfeto adicional (CD28/CD3_HH fixo) foram utilizadas individualmente ou em combinação na presença de células alvo (células cancerosas de expressão de GPC3) e células efetoras (células T).

[00257] As Figs. 35A e B são diagramas esquemáticos que mos- tram o mecanismo de ação da inibição do crescimento de células can- cerosas dependente de células T quando um anticorpo biespecífico de fixação de CD28/CD3 e um anticorpo biespecífico de CD3 atenuado por GPC3/ligação são utilizados em combinação, conforme descrito nos Exemplos 23-1 (“ε” nos diagramas indica CD3ε). A Fig. 35A mos- tra o mecanismo de ação da inibição do crescimento de células cance- rosas quando um anticorpo biespecífico de fixação de CD28/CD3 e um anticorpo biespecífico de CD3 atenuado por GPC3/ligação são utiliza- dos em combinação na presença de células alvo (células cancerosas que expressam GPC3) e células efetoras (células T).

[00258] A Fig. 35B mostra o mecanismo de ação da inibição do crescimento de células cancerosas quando uma molécula de anticorpo modificada que foi modificada para introduzir uma ligação de dissulfeto adicional no Fab-Fab de um anticorpo biespecífico de fixação de CD28/CD3 e um anticorpo biespecífico de CD3 atenuado por GPC3/ligação é utilizada em combinação na presença de células alvo (células cancerosas que expressam GPC3) e células efetoras (células T).

[00259] As Figs. 36A e B são diagramas esquemáticos que mos- tram o mecanismo de ação da produção de citocina a partir de células T quando um anticorpo biespecífico de fixação de CD28/CD3 e um an- ticorpo biespecífico de CD3 atenuado por GPC3/ligação são utilizados em combinação, conforme descrito nos Exemplos 23-2 ("ε” nos dia- gramas indica CD3ε). A Fig. 36A mostra o mecanismo de ação da pro- dução de citocina quando uma molécula de anticorpo modificada que foi modificada para introduzir uma ligação de dissulfeto adicional no Fab-Fab de um anticorpo biespecífico de fixação de CD28/CD3 e um anticorpo biespecífico de CD3 atenuado por GPC3/ligação, é utilizada em combinação na presença de células alvo (células cancerosas de expressão de GPC3) e células efetoras (células T).

[00260] A Fig. 36B mostra o mecanismo de ação da produção de citocinas quando uma molécula de anticorpo modificada que foi modi- ficada para introduzir uma ligação de dissulfeto adicional no Fab-Fab de um anticorpo biespecífico de fixação de CD28/CD3 e um anticorpo biespecífico de CD3 atenuado por GPC3/ligação, é utilizada em com- binação apenas na presença de células efetoras (células T).

[00261] As Figs. 37A e B mostram os resultados do ensaio da ativi- dade agonista de uma molécula de anticorpo biespecífico de CD8/CD28 (CD8/CD28-P587) e moléculas de anticorpo modificadas produzidas através da ligação do Fab-Fab desse anticorpo por meio de uma ligação de dissulfeto adicional (CD8/CD28-P587(HH), CD8/CD28-P587(LL), CD8/CD28-P587(HL), CD8/CD28-P587(LH)) como descrito no Exemplo 24. Uma molécula de anticorpo anti-KLH (KLH-P587) foi utilizada como um controle negativo. Os resultados ob- tidos utilizando células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de dois doadores diferentes são mostrados (painel superior: doador A, painel inferior: doador B). A Fig. 37A mostra a proporção de células T reguladoras divididas (Treg) nas PBMCs.

[00262] A Fig. 37B mostra a proporção de células T CD8α-positivas divididas nas PBMCs. Descrição das Modalidades I. Definições

[00263] Aqui, o termo "molécula de ligação ao antígeno" refere-se, em seu sentido mais amplo, a uma molécula que se liga especifica- mente a um determinante antigênico (epítopo). Em uma modalidade, a molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo, fragmento de anticor- po ou derivado de anticorpo. Em uma modalidade, a molécula de liga- ção ao antígeno é uma proteína de não anticorpo, ou um fragmento desta, ou um derivado da mesma.

[00264] Nessa invenção, "domínio de ligação ao antígeno" refere-se a uma região que se liga especificamente e é complementar ao todo ou a uma parte de um antígeno. Aqui, uma molécula de ligação ao an- tígeno compreende um domínio de ligação ao antígeno. Quando o pe- so molecular de um antígeno é grande, um domínio de ligação ao an- tígeno só pode se ligar a uma parte particular do antígeno. A parte par- ticular é chamada de "epítopo". Em uma modalidade, um domínio de ligação ao antígeno compreende um fragmento de anticorpo que se liga a um antígeno particular. Um domínio de ligação ao antígeno pode ser fornecido a partir de um ou mais domínios variáveis de anticorpo. Em uma modalidade não limitativa, os domínios de ligação ao antíge- no compreendem a região variável de cadeia leve do anticorpo (VL) e a região variável de cadeia pesada do anticorpo (VH). Exemplos de tais domínios de ligação ao antígeno incluem "Fv de cadeia única (scFv)", "anticorpo de cadeia única", "Fv", "Fv2 de cadeia única (scFv2)", "Fab" e "Fab’". Em outras modalidades, um domínio de liga- ção ao antígeno compreende uma proteína de não anticorpo que se liga a um antígeno particular, ou um fragmento do mesmo. Em uma modalidade específica, um domínio de ligação ao antígeno compreen-

de uma região de dobradiça.

[00265] Na presente invenção, "especificamente se liga" significa ligação em um estado em que uma das moléculas envolvidas na liga- ção específica não mostra qualquer ligação significativa com as molé- culas diferentes de uma única ou de várias moléculas parceiras de li- gação. Além disso, também é utilizado quando um domínio de ligação ao antígeno é específico para um epítopo particular entre múltiplos epítopos contidos em um antígeno. Quando um epítopo ligado por um domínio de ligação ao antígeno está contido em vários antígenos dife- rentes, as moléculas de ligação ao antígeno compreendendo o domí- nio de ligação ao antígeno podem se ligar a vários antígenos que pos- suem o epítopo.

[00266] Na presente invenção, a recitação "se liga ao mesmo epíto- po" significa que os epítopos aos quais dois domínios de ligação ao antígeno se ligam, pelo menos parcialmente, se sobrepõem entre si. O grau de sobreposição é, mas não está limitado a pelo menos 10% ou mais, de preferência 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais e 80% ou mais, particularmente preferível 90% ou mais, e o mais preferível 100%.

[00267] O termo "anticorpo" nessa invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpos, incluindo, mas não limitado estes, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, an- ticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fra- gmentos de anticorpos, contanto que apresentem a atividade de liga- ção ao antígeno desejada.

[00268] O termo "anticorpo monoclonal", tal como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticor- pos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compõem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epí- topo, exceto para possíveis anticorpos variantes, por exemplo, conten-

do mutações de ocorrência natural ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, que normalmente incluem dife- rentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epíto- pos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo mo- noclonal é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Assim, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de an- ticorpos e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser preparados por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não limitado ao método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fago e métodos que utilizam animais transgê- nicos contendo todas ou parte das posições de imunoglobulina huma- na, tais métodos e outros métodos exemplares para a produção de anticorpos monoclonais sendo aqui descritos.

[00269] "Anticorpos nativos" referem-se a moléculas de imunoglo- bulina de ocorrência natural com estruturas variáveis. Por exemplo, os anticorpos de IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por dissulfeto. Do N- a C-terminal, cada cadeia pesada possui uma região variável (VH), também chamada de domínio pesado variável ou domínio variável de cadeia pesada, seguida por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). Da mesma forma, do N- a C-terminal, cada cadeia leve possui uma região variável (VL), também chamada de domínio leve variável ou domínio variável de cadeia leve, seguida por um domínio leve cons- tante (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a um de dois tipos, chamados capa (κ) e lambda (λ), com base na sequência de aminoácido de seu domínio constante.

[00270] O termo anticorpo "quimérico" refere-se a um anticorpo em que uma parte da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie particular, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.

[00271] A "classe" de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Exis- tem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e vários delas podem ser divididas em subclasses (isótipos), por exem- plo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglo- bulinas são chamados alfa, delta, épsilon, gama e mi, respectivamen- te.

[00272] Em uma modalidade da presente invenção, as regiões constantes são de preferência regiões constantes de anticorpos, mais preferivelmente regiões constantes de anticorpos do tipo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e ainda mais preferencialmente regiões constantes de anticorpos do tipo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. Além disso, em outra modalidade da presente invenção, as regiões constantes são de preferência regiões constantes de cadeia pesada, mais preferivelmen- te IgG1, IgG2, IgG3 e regiões constantes de cadeia pesada do tipo IgG4 e ainda mais preferivelmente regiões constantes de cadeia pesa- da do tipo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. As sequências de ami- noácido da região constante de IgG1 humana, a região constante de IgG2 humana, a região constante de IgG3 humana e a região constan- te de IgG4 humana são conhecidas. Para as regiões constantes de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana e IgG4 humana, uma plu- ralidade de sequências de alótipos com polimorfismo genético é des- crita em Sequências de proteínas de interesse imunológico, Publica-

ção NIH No. 91-3242, e qualquer uma delas podem ser utilizadas na presente invenção. As regiões constantes modificadas com aminoáci- dos da presente invenção podem conter outras mutações ou modifica- ções de aminoácido, contanto que incluam uma mutação de aminoáci- do da presente invenção.

[00273] O termo "região de dobradiça" significa uma parte de poli- peptídeo de cadeia pesada de anticorpo em uma cadeia pesada de anticorpo do tipo selvagem que se junta ao domínio CH1 e ao domínio CH2, por exemplo, de cerca da posição 216 a cerca da posição 230 de acordo com o sistema de numeração da EU, ou de cerca da posição 226 a cerca da posição 243 de acordo com o sistema de numeração de Kabat. É conhecido que em um anticorpo IgG nativo, o resíduo de cisteína na posição 220 de acordo com a numeração da EU na região de dobradiça forma uma ligação de dissulfeto com o resíduo de cisteí- na na posição 214 na cadeia leve do anticorpo. Também é conhecido que entre as duas cadeias pesadas de anticorpo, ligações de dissulfe- to são formadas entre resíduos de cisteína na posição 226 e entre re- síduos de cisteína na posição 229 de acordo com a numeração da EU na região de dobradiça. Uma região de dobradiça aqui inclui regiões de dobradiça do tipo selvagem, assim como variantes nas quais resí- duos de aminoácido em uma região de dobradiça do tipo selvagem são alteradas através da substituição, adição ou supressão.

[00274] O termo "região Fc" nessa invenção é utilizado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma parte da região constante. O termo inclui re- giões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma modali- dade, uma região Fc de cadeia pesada de IgG humana se estende de Cys226, ou de Pro230, até o terminal carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) ou glicina-lisina (resíduos 446- 447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especifi-

cado de outra forma nessa invenção, a numeração de resíduos de aminoácido na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração da EU, também chamado de índice EU, con- forme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologi- cal Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

[00275] "Funções efetoras" referem-se às atividades biológicas atri- buíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isótipo do anti- corpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação de C1q e citotoxicidade dependente do complemento (CDC); ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de an- ticorpos (ADCC); fagocitose; infrarregulação de receptores da superfí- cie celular (por exemplo, receptor de células B); e ativação de células B.

[00276] O termo "receptor Fc" ou "FcR" refere-se a um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Em algumas modalidades, um FcR é um FcR humano nativo. Em algumas modalidades, um FcR é aquele que se liga a um anticorpo de IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses Fc gama RI, Fc gama RII e Fc gama RIII, incluindo variantes alélicas e formas alternativamente unidas desses receptores. Os receptores Fc gama RII incluem Fc gama RIIA (um "re- ceptor de ativação") e Fc gama RIIB (um "receptor de inibição"), que possuem sequências de aminoácido semelhantes que diferem princi- palmente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação Fc gama RIIA contém um motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM) em seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição Fc gama RIIB contém um motivo de inibição baseado em tiro- sina imunorreceptora (ITIM) em seu domínio citoplasmático (ver, por exemplo, Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Os FcRs são revisados, por exemplo, em Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immu-

nol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs, in- cluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo "FcR" nesta invenção.

[00277] O termo "receptor Fc" ou "FcR" também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs mater- nas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) e regulação da homeostase de imunoglo- bulinas. Métodos de medição da ligação ao FcRn são conhecidos (ver, por exemplo, Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hin- ton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.).

[00278] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvi- da na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da ca- deia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anti- corpo nativo geralmente possuem estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estruturais conservadas (FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Ver, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)), Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especifi- cidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um determinado antígeno podem ser isolados utilizando um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Ver, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

[00279] O termo "região hipervariável" ou "HVR" como aqui utiliza- do, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anti-

corpo que são hipervariáveis na sequência ("regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs") e/ou formam alças calibradas estrutu- ralmente definidas ("alças calibradas hipervariáveis") e/ou contêm os resíduos de contato com o antígeno ("contatos com o antígeno"). Ge- ralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs: três no VH (H1, H2, H3) e três no VL (L1, L2, L3). HVRs exemplares aqui incluem:

[00280] (a) alças calibradas hipervariáveis que ocorrem nos resí- duos de aminoácido 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53- 55 (H2) e 96-101 ( H3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));

[00281] (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácido 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3 ) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

[00282] (c) contatos de antígeno que ocorrem nos resíduos de ami- noácido 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) e 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); e

[00283] (d) combinações de (a), (b) e/ou (c), incluindo os resíduos de aminoácido de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 ( L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) e 94-102 (H3).

[00284] Salvo indicação em contrário, os resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são numera- dos aqui de acordo com Kabat et al., supra.

[00285] "Estrutura" ou "FR" refere-se aos resíduos do domínio vari- ável diferentes dos resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências de HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1- H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

[00286] Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo in- tacto" e "anticorpo inteiro" são utilizados nessa invenção de modo tro- cável para se referir a um anticorpo tendo uma estrutura substancial- mente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativo ou tendo ca- deias pesadas que contêm uma região Fc conforme definido nesta in- venção.

[00287] Os termos "célula hospedeira", "linhagem celular hospedei- ra" e "cultura de células hospedeiras" são utilizados de modo trocável e referem-se a células nas quais o ácido nucleico exógeno foi introdu- zido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras in- cluem "transformantes" e "células transformadas", que incluem a célula transformada primária e a progênie dela derivada independentemente do número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica no teor de ácido nucleico a uma célula-mãe, mas pode conter mutações. A progênie mutante que possui a mesma função ou ativida- de biológica como rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada está aqui incluída.

[00288] O termo "vetor", tal como aqui utilizado, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual está ligada. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, assim como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais es- tão ligados de maneira operável. Esses vetores são aqui referidos co- mo "vetores de expressão".

[00289] Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma sequên- cia de aminoácido que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um ser humano ou célula humana ou derivada de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras se- quências de codificação de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humano.

[00290] Um anticorpo "humanizado" refere-se a um anticorpo qui- mérico compreendendo resíduos de aminoácido de HVRs não huma- nos e resíduos de aminoácido de FRs humanas. Em certas modalida- des, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que to- dos ou substancialmente todos os HVRs (por exemplo, CDRs) corres- pondem aos de um anticorpo não humano, e todos ou substancialmen- te todas as FRs correspondem às de um anticorpo humano. Um anti- corpo humanizado opcionalmente pode compreender pelo menos uma parte de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma "forma humanizada" de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido à humanização.

[00291] Um "fragmento de anticorpo" refere-se a uma molécula dife- rente de um anticorpo intacto que compreende uma parte de um anti- corpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limi- tados a estes, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples (por exemplo, scFv); Fabs de cadeia simples (scFabs); anticorpos de domínio único; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anti- corpos. Fragmento variável (Fv)

[00292] Aqui, o termo "fragmento variável (Fv)" refere-se à unidade mínima de um domínio de ligação ao antígeno derivado de anticorpo que é composto por um par da região variável de cadeia leve do anti- corpo (VL) e região variável de cadeia pesada do anticorpo (VH). Em 1988, Skerra e Pluckthun descobriram que anticorpos homogêneos e ativos podem ser preparados a partir da fração de periplasma de E. coli através da inserção de um gene de anticorpo a jusante de uma sequência de sinal bacteriana e indução da expressão do gene em E. coli (Science (1988) 240 ( 4855), 1038-1041). No Fv preparado a partir da fração de periplasma, VH associa-se a VL de maneira a se ligar a um antígeno. scFv, anticorpo de cadeia única, e sc(Fv)2

[00293] Aqui, os termos "scFv", "anticorpo de cadeia única" e "sc(Fv)2" referem-se todos a um fragmento de anticorpo de uma única cadeia de polipeptídeo que contém regiões variáveis derivadas das cadeias pesada e leve, mas não a região constante. Em geral, um an- ticorpo de cadeia única também contém um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL, que permite a formação de uma estrutura dese- jada que acredita-se permitir a ligação ao antígeno. O anticorpo de ca- deia única é examinado com detalhes por Pluckthun em “The Pharma- cology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)”. Ver também a Pu- blicação de Patente Internacional WO 1988/001649; Patentes US Nos.

4.946.778 e 5.260.203. Em uma modalidade particular, o anticorpo de cadeia única pode ser biespecífico e/ou humanizado.

[00294] scFv é um domínio de ligação ao antígeno no qual VH e VL formando Fv estão ligados entre si por um ligante peptídico (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85(16), 5879-5883). VH e VL podem ser reti- dos em estreita proximidade pelo ligante peptídico.

[00295] sc(Fv)2 é um anticorpo de cadeia única em que quatro re- giões variáveis de dois VL e dois VH estão ligadas por ligantes, tais como ligantes de peptídeo para formar uma única cadeia (J Immunol. Methods (1999) 231(1-2), 177-189). Os dois VH e dois VL podem ser derivados de diferentes anticorpos monoclonais. Tal sc(Fv)2 inclui pre- ferivelmente, por exemplo, um sc(Fv)2 biespecífico que reconhece dois epítopos presentes em um único antígeno, conforme divulgado no Journal of Immunology (1994) 152(11), 5368-5374. sc(Fv)2 pode ser produzido por métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, sc(Fv)2 pode ser produzido através da ligação de scFv por um ligante, tal como um ligante peptídico.

[00296] Aqui, a forma de um domínio de ligação ao antígeno que forma um sc(Fv)2 inclui um anticorpo no qual as duas unidades de VH e duas unidades de VL estão dispostas na ordem de VH, VL, VH e VL ([VH]-ligante-[VL]-ligante-[VH]-ligante-[VL]) começando a partir do N- terminal de um polipeptídeo de cadeia simples. A ordem das duas uni- dades de VH e duas unidades de VL não está limitada à forma acima e elas podem ser organizadas em qualquer ordem. A ordem de exemplo do formulário está listada abaixo.

[00297] [VL]-ligante-[VH]-ligante-[VH]-ligante-[VL]

[00298] [VH]-ligante-[VL]-ligante-[VL]-ligante-[VH]

[00299] [VH]-ligante-[VH]-ligante-[VL]-ligante-[VL]

[00300] [VL]-ligante-[VL]-ligante-[VH]-ligante-[VH]

[00301] [VL]-ligante-[VH]-ligante-[VL]-ligante-[VH] Fab, F(ab')2 e Fab'

[00302] "Fab" consiste em uma única cadeia leve e uma região CH1 e uma região variável de uma única cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab do tipo selvagem não pode formar ligações de dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada. Aqui, além das molé- culas Fab do tipo selvagem, também estão incluídas as variantes de Fab nas quais os resíduos de aminoácido em uma molécula de Fab do tipo selvagem são alterados por substituição, adição ou supressão. Em uma modalidade específica, resíduos de aminoácido com mutação compreendidos em variantes de Fab (por exemplo, resíduos de cisteí- na ou resíduos de lisina após substituição, adição ou inserção) podem formar ligações de dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada ou uma parte da mesma (por exemplo, molécula Fab).

[00303] scFab é um domínio de ligação ao antígeno no qual uma única cadeia leve e uma região CH1 e uma região variável de uma única cadeia pesada que forma Fab estão ligadas entre si por um li- gante de peptídeo. A cadeia leve e a região CH1 e a região variável de cadeia pesada podem ser retidas em estreita proximidade pelo ligante peptídico.

[00304] "F(ab')2" ou "Fab" é produzido através do tratamento de uma imunoglobulina (anticorpo monoclonal) com uma protease, tal como pepsina e papaína, e refere-se a um fragmento de anticorpo ge- rado pela digestão de uma imunoglobulina (anticorpo monoclonal) pró- ximo das ligações de dissulfeto presentes entre as regiões de dobradi- ça em cada uma das duas cadeias H. Por exemplo, a papaína cliva IgG a montante das ligações de dissulfeto presentes entre as regiões de dobradiça em cada uma das duas cadeias H para gerar dois frag- mentos de anticorpos homólogos, em que uma cadeia L compreen- dendo VL (região variável de cadeia L) e CL (região constante de ca- deia L) está ligada a um fragmento de cadeia H compreendendo VH (região variável de cadeia H) e CHγ1 (região γ1 em uma região cons- tante de cadeia H) por meio de uma ligação de dissulfeto em suas re- giões C-terminais. Cada um desses dois fragmentos de anticorpo ho- mólogo é chamado de Fab'.

[00305] "F(ab')2" consiste em duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que compreendem a região constante de um domínio CH1 e uma parte dos domínios CH2, de tal modo que as ligações de dissulfe- to são formadas entre as duas cadeias pesadas. O F(ab')2 divulgado nesta invenção pode ser preferivelmente produzido como se segue. Um anticorpo monoclonal completo ou tal compreendendo um domínio de ligação ao antígeno desejado é parcialmente digerido com uma pro- tease, tal como pepsina; e os fragmentos Fc são removidos por adsor-

ção em uma coluna de Proteína A. A protease não é particularmente limitada, contanto que possa clivar todo o anticorpo de maneira seleti- va para produzir F(ab')2 sob uma condição de reação enzimática de configuração apropriada tal como pH. Essas proteases incluem, por exemplo, pepsina e ficina. Anticorpos de domínio único

[00306] Nessa invenção, aqueles referidos pelo termo "anticorpos de domínio único" não são particularmente limitados em sua estrutura, contanto que o domínio possa exercer atividade de ligação ao antíge- no por si mesmo. Anticorpos comuns exemplificados por anticorpos de IgG exercem atividade de ligação ao antígeno em um estado em que uma região variável é formada pelo pareamento de VH e VL. Em con- traste, um anticorpo de domínio único é conhecido por ser capaz de exercer atividade de ligação ao antígeno por sua própria estrutura de domínio sem parear com outro domínio. Os anticorpos de domínio úni- co geralmente possuem um peso molecular relativamente baixo e exis- tem na forma de um monômero.

[00307] Exemplos de um anticorpo de domínio único incluem, mas não são limitados a estes, moléculas de ligação ao antígeno que natu- ralmente carecem de cadeias leves, tais como VHH de animais Came- lidae e VNAR de tubarões, e fragmentos de anticorpo compreendendo a totalidade ou uma parte de um domínio VH de anticorpo ou o todo ou uma parte de um domínio VL de anticorpo. Exemplos de um anticorpo de domínio único que é um fragmento de anticorpo compreendendo a totalidade ou uma parte de um domínio VH/VL de anticorpo incluem, mas não são limitados a estes, anticorpos de domínio único artificial- mente preparados originários de um anticorpo humano VH ou um anti- corpo humano VL como descrito, por exemplo, na Patente US No.

6.248.516 B1. Em algumas modalidades da presente invenção, um anticorpo de domínio único possui três CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3).

[00308] Os anticorpos de domínio único podem ser obtidos de ani- mais capazes de produzir anticorpos de domínio único ou por imuniza- ção de animais capazes de produzir anticorpos de domínio único. Exemplos de animais capazes de produzir anticorpos de domínio único incluem, mas não são limitados a estes, camelídeos e animais trans- gênicos nos quais os genes para a capacidade de produzir um anti- corpo de domínio único foram introduzidos. Os camelídeos incluem camelo, lhama, alpaca, dromedário, guanaco e semelhantes. Exem- plos de um animal transgênico em que os genes para a capacidade de produzir um anticorpo de domínio único foram introduzidos incluem, mas não são limitados a estes, animais transgênicos descritos na Pu- blicação Internacional No. WO2015/143414 ou Publicação de Patente US No. US2011/0123527 A1. Os anticorpos de cadeia simples huma- nizados também podem ser obtidos, substituindo as sequências estru- turais de um anticorpo de domínio único obtido de um animal por se- quências da linha germinativa humana ou sequências semelhantes às mesmas. Um anticorpo de domínio único humanizado (por exemplo, VHH humanizado) é uma modalidade do anticorpo de domínio único da presente invenção.

[00309] Alternativamente, os anticorpos de domínio único podem ser obtidos a partir de bibliotecas de polipeptídeo contendo anticorpos de domínio único por ELISA, extração e semelhantes. Exemplos de bibliotecas de polipeptídeo contendo anticorpos de domínio único in- cluem, mas não são limitados a estes, bibliotecas de anticorpos passí- veis obtidas de vários animais ou seres humanos (por exemplo, Me- thods in Molecular Biology 2012 911 (65-78) e Biochimica et Biophysi- ca Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764:8 (1307-1319)), e biblio- tecas de anticorpo obtidas através da imunização de vários animais (por exemplo, Journal of Applied Microbiology 2014 117:2 (528-536)) e bibliotecas de anticorpo sintéticas preparadas a partir dos genes de anticorpo de vários animais e seres humanos (por exemplo, Journal of Biomolecular Screening 2016 21:1 (35-43), Journal of Biological Che- mistry 2016 291:24 (12641-12657), e AIDS 2016 30:11 (1691-1701)).

[00310] "Atividade de ligação" refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um ou mais sítios de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Aqui, a atividade de ligação não é estritamente limitada a uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). Por exemplo, quando os membros de um par de ligação refletem uma interação monovalente 1:1, a atividade de ligação se refere à afinidade de ligação intrínseca (afinidade). Quando um membro de um par de ligação é capaz de ligação monova- lente e ligação multivalente, a atividade de ligação é a soma de cada força de ligação. A atividade de ligação de uma molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de disso- ciação (KD) ou "quantidade de analito ligado por quantidade unitária de ligante". A atividade de ligação pode ser medida por métodos co- muns conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos.

[00311] Uma molécula de ligação ao antígeno "agonista" ou anti- corpo "agonista", como aqui utilizado, é uma molécula ou anticorpo de ligação ao antígeno que potencializa significativamente uma atividade biológica do antígeno ao qual se liga.

[00312] Uma molécula de ligação ao antígeno de "bloqueio" ou an- ticorpo de "bloqueio" ou uma molécula de ligação ao antígeno "anta- gonista" ou anticorpo "antagonista", como aqui utilizado, é uma molé- cula ou anticorpo de ligação ao antígeno que inibe significativamente (parcial ou completamente) uma atividade biológica do antígeno ao qual se liga.

[00313] A frase "substancialmente reduzido" ou "substancialmente diferente", como aqui utilizada, refere-se a um grau suficientemente elevado de diferença entre dois valores numéricos (geralmente um as- sociado a uma molécula e o outro associado a uma molécula de refe- rência/comparadora), tal que uma pessoa de habilidade na técnica consideraria a diferença entre os dois valores como sendo de signifi- cância estatística dentro do contexto da característica biológica medi- da pelos referidos valores (por exemplo, valores de KD).

[00314] O termo "substancialmente semelhante" ou "substancial- mente o mesmo", tal como aqui utilizado, refere-se a um grau suficien- temente elevado de semelhança entre dois valores numéricos (por exemplo, um associado a um anticorpo da invenção e o outro associa- do a um anticorpo de referência/comparador), de tal modo que uma pessoa de habilidade na técnica consideraria a diferença entre os dois valores como sendo de pouca ou nenhuma significância biológica e/ou estatística dentro do contexto da característica biológica medida pelos referidos valores (por exemplo, valores de KD).

[00315] Os termos "formulação farmacêutica" e "composição farma- cêutica" referem-se a uma preparação que está em uma forma que permite que a atividade biológica de um ingrediente ativo nela contido seja eficaz e que não contém componentes adicionais que são inacei- tavelmente tóxicos para um indivíduo a qual a formulação seria admi- nistrada.

[00316] Um "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, diferente de um ingredi- ente ativo, que não é tóxico a um indivíduo. Um veículo farmaceutica- mente aceitável inclui, mas não está limitado a um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.

[00317] Uma "pessoa" ou "indivíduo" é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não são limitados a estes, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exem- plo, seres humanos e primatas não humanos tais como macacos),

coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas modalidades, a pessoa ou indivíduo é um ser humano. II. Molécula de ligação ao antígeno

[00318] Em um aspecto, a presente invenção é parcialmente base- ada na descoberta de que várias atividades de uma molécula de liga- ção ao antígeno que contém um primeiro domínio de ligação ao antí- geno e um segundo domínio de ligação ao antígeno no qual os domí- nios de ligação ao antígeno estão ligados entre si através de uma ou mais ligações são aumentadas ou diminuídas em comparação com uma molécula de ligação ao antígeno de controle contendo domínios de ligação ao antígeno sem a ligação ou ligados por meio de menos ligações. Em certas modalidades, uma molécula de ligação ao antíge- no que possui atividade de reter duas ou mais moléculas de antígeno em posições espacialmente próximas é fornecida. A molécula de liga- ção ao antígeno da presente invenção é útil, por exemplo, na medida em que pode regular a ativação de duas moléculas de antígeno que são ativadas através da associação entre si. Em certas outras modali- dades, uma molécula de ligação ao antígeno que adquiriu resistência à digestão da protease pela ligação entre os domínios de ligação ao an- tígeno é fornecida. A. Moléculas de ligação ao antígeno exemplares Estruturas de moléculas de ligação ao antígeno

[00319] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo um primeiro domínio de liga- ção ao antígeno e um segundo domínio de ligação ao antígeno, e os domínios de ligação ao antígeno estão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações.

[00320] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos uma das uma ou mais ligações que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é uma ligação covalente. Em certas modalidades, a ligação covalente é formada por reticulação direta de um resíduo de aminoáci- do no primeiro domínio de ligação ao antígeno e um resíduo de ami- noácido no segundo domínio de ligação ao antígeno. Os resíduos de aminoácido reticulados são, por exemplo, cisteína, e a ligação cova- lente formada é, por exemplo, uma ligação de dissulfeto.

[00321] Em certas outras modalidades, a ligação covalente é for- mada através da reticulação de um resíduo de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e um resíduo de aminoácido no se- gundo domínio de ligação ao antígeno por meio de um agente de reti- culação. O agente de reticulação é, por exemplo, um agente de reticu- lação reativo com amina, e os resíduos de aminoácido reticulados são, por exemplo, lisina.

[00322] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos uma das uma ou mais ligações que ligam os domínios de ligação ao antí- geno é uma ligação não covalente. Em certas modalidades, a ligação não covalente é uma ligação iônica, ligação de hidrogênio ou ligação hidrofóbica. A ligação iônica é formada, por exemplo, entre um amino- ácido acídico e um aminoácido básico. O aminoácido acídico é, por exemplo, ácido aspártico (Asp) ou ácido glutâmico (Glu). O aminoácido básico é, por exemplo, histidina (His), lisina (Lys) ou arginina (Arg).

[00323] Os resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno (as ligações que ligam dois domínios de ligação ao antígeno) se originam estão respectivamente presentes no primeiro e no segundo domínios de ligação ao antígeno, e as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno são formadas através da ligação desses resíduos de aminoácido. Em uma modali- dade dos aspectos acima, pelo menos um dos resíduos de aminoácido a partir do qual a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno se origina é um resíduo de aminoácido com mutação introduzido artifici- almente e, por exemplo, é um resíduo de cisteína introduzido artifici-

almente. Esse resíduo de aminoácido com mutação pode ser introdu- zido em um domínio de ligação ao antígeno do tipo selvagem, por exemplo, através de um método de substituição de aminoácido. O pre- sente relatório descritivo divulga os sítios de resíduos de aminoácido a partir dos quais a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno pode se originar para cada uma das regiões CH1, CL e dobradiça co- mo regiões constantes e as regiões VH, VL e VHH como regiões vari- áveis quando os domínios de ligação ao antígeno compreendem, por exemplo, um fragmento de anticorpo e, por exemplo, resíduos de cis- teína podem ser introduzidos em tais sítios.

[00324] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos um dos primeiro e segundo domínios de ligação ao antígeno possui, isola- damente, atividade de ligação a um antígeno (isto é, um único domínio de ligação ao antígeno independentemente possui atividade de ligação ao antígeno). Em certas modalidades, cada um dos primeiro e segun- do domínios de ligação ao antígeno possui, isoladamente, atividade de ligação a um antígeno.

[00325] Em uma modalidade dos aspectos acima, o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno são ambos domínios de li- gação ao antígeno do mesmo tipo. Conforme mencionado abaixo, exemplos de proteínas que constituem os domínios de ligação ao antí- geno incluem polipeptídeos derivados de um anticorpo ou uma proteí- na de não anticorpo e seus fragmentos (por exemplo, um Fab, Fab', scFab, Fv, scFv e anticorpo de domínio único). Do ponto de vista de tais formas moleculares, quando as estruturas das proteínas que cons- tituem o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno são idênticas, os domínios de ligação ao antígeno são determinados como sendo do mesmo tipo.

[00326] Em uma modalidade dos aspectos acima, a pelo menos uma ligação que liga o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno pode ser formada através da ligação de resíduos de aminoácido presentes na mesma posição no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de li- gação ao antígeno entre si, ou pode ser formada através da ligação de resíduos de aminoácido presentes em uma posição respectivamente diferente entre si.

[00327] As posições dos resíduos de aminoácido no domínio de li- gação ao antígeno podem ser mostradas de acordo com a numeração de Kabat ou sistema de numeração da EU (também chamado de índi- ce EU) descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologi- cal Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Por exemplo, se os resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno se originam estão presentes em uma posição idêntica correspondente nos domínios de ligação ao antígeno, a posi- ção destes resíduos de aminoácido pode ser indicada como o mesmo número de acordo com a numeração de Kabat ou sistema de numera- ção da EU. Alternativamente, se os resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno se originam estiverem presentes em diferentes posi- ções que não são correspondentes nos domínios de ligação ao antí- geno, as posições desses resíduos de aminoácido podem ser indica- das como números diferentes de acordo com a numeração de Kabat ou sistema de numeração da EU.

[00328] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos um dos primeiro e segundo domínios de ligação ao antígeno compreende um fragmento de anticorpo que se liga a um antígeno específico. Em certas modalidades, o fragmento de anticorpo é um Fab, Fab', scFab, Fv, scFv ou anticorpo de domínio único. Em certas modalidades, pelo menos um dos resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente em um fra- gmento de anticorpo.

[00329] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos um dos resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região constante. Em certas modalidades, o resíduo de aminoáci- do está presente em uma região CH1 e, por exemplo, está presente em qualquer uma das posições 119 a 123, 131 a 140, 148 a 150, 155 a 167, 174 a 178, 188 a 197, 201 a 214 e 218 a 219 de acordo com a numeração da EU na região CH1. Em certas modalidades, o resíduo de aminoácido está presente em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 119, 122, 123, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 148, 150, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 167, 174, 176, 177, 178, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 201, 203, 205, 206, 207, 208, 211, 212, 213, 214, 218 e 219 de acordo com a numeração da EU na região CH1. Em cer- tas modalidades, o resíduo de aminoácido está presente na posição 134, 135, 136, 137, 191, 192, 193, 194, 195 ou 196 de acordo com a numeração da EU na região CH1. Em certas modalidades, o resíduo de aminoácido está presente na posição 135, 136 ou 191 de acordo com a numeração da EU na região CH1.

[00330] Em uma modalidade dos aspectos acima, a região constan- te é derivada de ser humano. Em certas modalidades, a subclasse da região constante de cadeia pesada é qualquer uma de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD e IgE. Em certas modalidades, a sub- classe da região CH1 é qualquer um de γ1, γ2, γ3, γ4, α1, α2, μ, δ e ε.

[00331] Em uma modalidade dos aspectos acima, a pelo menos uma ligação que liga o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno é formada através da ligação de um resíduo de aminoácido na região CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno e um resíduo de aminoácido na região CH1 do segundo domínio de ligação ao antígeno.

Em certas modalidades, os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, indepen- dentemente selecionados do grupo que consiste nas posições 119, 120, 121, 122 e 123 de acordo com a numeração da EU.

Em certas modalidades, os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de liga- ção ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste nas posições 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 e 140 de acordo com a numeração da EU.

Em certas modalidades, os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente se- lecionados do grupo que consiste nas posições 148, 149 e 150 de acordo com a numeração da EU.

Em certas modalidades, os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no se- gundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independente- mente selecionados do grupo que consiste nas posições 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 e 167 de acordo com a numeração da EU.

Em certas modalidades, os resíduos de aminoá- cido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente seleciona- dos do grupo que consiste nas posições 174, 175, 176, 177 e 178 de acordo com a numeração da EU.

Em certas modalidades, os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no se- gundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independente- mente selecionados do grupo que consiste nas posições 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 e 197 de acordo com a numeração da EU.

Em certas modalidades, os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste nas posições 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213 e 214 de acordo com a numeração da EU. Em certas modalidades, os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consis- te nas posições 218 e 219 de acordo com a numeração da EU.

[00332] Em uma modalidade dos aspectos acima, a diferença nas posições dos resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações se originam em cada um do primeiro domínio de ligação ao antígeno e do segundo domínio de ligação ao antígeno é de três aminoácidos ou menos. Isso significa que quando a posição do resíduo de aminoácido a partir do qual uma ligação se origina na região CH1 do primeiro do- mínio de ligação ao antígeno e a posição do resíduo de aminoácido a partir do qual a ligação se origina na região CH1 da segunda ligação ao antígeno domínio são comparadas respectivamente de acordo com a numeração da EU, a diferença é de três aminoácidos ou menos. Em certas modalidades, a pelo menos uma ligação que liga o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno é formada através da ligação do resíduo de aminoácido na posição 135 de acordo com a numeração da EU na região CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno e um resíduo de aminoácido em qualquer uma das posições 132 a 138 de acordo com a numera- ção da EU na região CH1 do segundo domínio de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, a pelo menos uma ligação que liga o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno é formada através da ligação do resíduo de aminoácido na posição 136 de acordo com a numeração da EU na região CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno e um resíduo de aminoácido em qualquer uma das posições 133 a 139 de acordo com a numera-

ção da EU na região CH1 do segundo domínio de ligação ao antígeno.

[00333] Em certas modalidades, a pelo menos uma ligação que liga o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de li- gação ao antígeno é formada através da ligação do resíduo de amino- ácido na posição 191 de acordo com a numeração da EU na região CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno e um resíduo de ami- noácido em qualquer uma das posições 188 a 194 de acordo com a numeração da EU na região CH1 do segundo domínio de ligação ao antígeno. Em uma modalidade exemplar, a pelo menos uma ligação que liga o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domí- nio de ligação ao antígeno é formada através da ligação dos resíduos de aminoácido na posição 135 de acordo com a numeração da EU nas regiões CH1 dos dois domínios de ligação ao antígeno entre si. Em uma modalidade exemplar, a pelo menos uma ligação que liga o pri- meiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno é formada através da ligação dos resíduos de aminoácido na posição 136 de acordo com a numeração da EU nas regiões CH1 dos dois domínios de ligação ao antígeno entre si. Em uma modalida- de exemplar, a pelo menos uma ligação que liga o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno é formada através da ligação dos resíduos de aminoácido na posição 191 de acordo com a numeração da EU nas regiões CH1 dos dois domínios entre si.

[00334] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos um dos resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região CL e, por exemplo, está presente em qualquer uma das posições 108 a 112, 121 a 128, 151 a 156, 184 a 190, 195 a 196, 200 a 203 e 208 a 213 de acordo com a numeração de Kabat na região CL. Em certas modalidades, o resíduo de aminoácido está presente em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posi- ções 108, 109, 112, 121, 123, 126, 128, 151, 152, 153, 156, 184, 186, 188, 189, 190, 195, 196, 200, 201, 202, 203, 208, 210, 211, 212 e 213 de acordo com a numeração de Kabat na região CL. Em certas moda- lidades, o resíduo de aminoácido está presente na posição 126 de acordo com a numeração de Kabat na região CL.

[00335] Em uma modalidade dos aspectos acima, a região constan- te é derivada de ser humano. Em certas modalidades, a subclasse da região CL é κ ou λ.

[00336] Em uma modalidade dos aspectos acima, a pelo menos uma ligação que liga o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno é formada através da ligação de um resíduo de aminoácido na região CL do primeiro domínio de li- gação ao antígeno e um resíduo de aminoácido na região CL do se- gundo domínio de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, os re- síduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independen- temente selecionados do grupo que consiste nas posições 108, 109, 110, 111 e 112 de acordo com a numeração de Kabat. Em certas mo- dalidades, os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste nas posi- ções 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 e 128 de acordo com numera- ção de Kabat. Em certas modalidades, os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de li- gação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste nas posições 151, 152, 153, 154, 155 e 156 de acordo com a numeração de Kabat. Em certas modalidades, os resí- duos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independen-

temente selecionados do grupo que consiste nas posições 184, 185, 186, 187, 188, 189 e 190 de acordo com a numeração de Kabat. Em certas modalidades, os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consis- te nas posições 195 e 196 de acordo com a numeração de Kabat. Em certas modalidades, os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consis- te nas posições 200, 201, 202 e 203 de acordo com a numeração de Kabat. Em certas modalidades, os resíduos de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste nas posições 208, 209, 210, 211, 212 e 213 de acordo com a numeração de Kabat.

[00337] Em uma modalidade dos aspectos acima, a diferença nas posições dos resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações se originam em cada um do primeiro domínio de ligação ao antígeno e do segundo domínio de ligação ao antígeno é de três aminoácidos ou menos. Isso significa que quando a posição do resíduo de aminoácido a partir do qual uma ligação se origina na região CL do primeiro domí- nio de ligação ao antígeno e a posição do resíduo de aminoácido a partir do qual a ligação se origina na região CL do segundo domínio de ligação ao antígeno são comparadas respectivamente de acordo com a numeração da EU, a diferença é de três aminoácidos ou menos. Em uma modalidade exemplar, a pelo menos uma ligação que liga o pri- meiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno é formada através da ligação dos resíduos de aminoácido na posição 126 de acordo com a numeração de Kabat nas regiões CL dos dois domínios de ligação ao antígeno entre si.

[00338] Em uma modalidade dos aspectos acima, a pelo menos uma ligação que liga o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno é formada através da ligação de um resíduo de aminoácido na região CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno e um resíduo de aminoácido na região CL do se- gundo domínio de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, os re- síduos de aminoácido na região CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno são selecionados a partir do grupo que consiste nas posi- ções 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 e 197 de acordo com a numeração da EU e os resíduos de aminoácido na região CL do se- gundo domínio de ligação ao antígeno são selecionados a partir do grupo que consiste nas posições 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 e 128 de acordo com a numeração de Kabat. Em uma modalidade exemplar, a pelo menos uma ligação que liga o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno é formada através da ligação do resíduo de aminoácido na posição 191 de acordo com a numeração da EU na região CH1 da primeira ligação ao antígeno e do resíduo de aminoácido na posição 126 de acordo com a numeração de Kabat na região CL do segundo domínio de liga- ção ao antígeno.

[00339] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos um dos resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região variável. Em certas modalidades, o resíduo de aminoácido está presente em uma região VH e, por exemplo, está presente em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 6, 8, 16, 20, 25, 26, 28, 74 e 82b de acordo com a numeração de Kabat na re- gião VH. Em certas modalidades, o resíduo de aminoácido está pre- sente em uma região VL e, por exemplo, está presente em uma posi- ção selecionada do grupo que consiste nas posições 21, 27, 58, 77,

100, 105 e 107 de acordo com a numeração de Kabat na região VL (subclasse κ) e posições 6, 19, 33 e 34 de acordo com a numeração de Kabat na região VL (subclasse λ). Em certas modalidades, o resí- duo de aminoácido está presente em uma região VHH e, por exemplo, está presente em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 20, 24, 27, 29, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 67, 69, 71, 78, 80, 82, 82c, 85, 88, 91, 93, 94 e 107 de acordo com a numeração de Kabat na região VHH.

[00340] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos um do primeiro e do segundo domínios de ligação ao antígeno compreen- de uma ligação de proteína de não anticorpo a um antígeno particular, ou um fragmento do mesmo. Em certas modalidades, a proteína de não anticorpo é de um par de um ligante e um receptor que se ligam especificamente entre si. Tais receptores incluem, por exemplo, recep- tores pertencentes a superfamílias de receptores de citocina, recepto- res acoplados à proteína G, receptores de canais iônicos, receptores de tirosina cinase, receptores do ponto de controle imunológico, recep- tores de antígeno, antígenos CD, moléculas coestimuladoras e molé- culas de aderência celular.

[00341] Em uma modalidade dos aspectos acima, o primeiro e/ou o segundo domínios de ligação ao antígeno compreendem uma região de dobradiça. Em certas modalidades, pelo menos um dos resíduos de cisteína presentes em uma região de dobradiça do tipo selvagem é substituído por outro resíduo de aminoácido. Esses resíduos de cisteí- na estão presentes, por exemplo, nas posições 226 e/ou 229 de acor- do com a numeração da EU na região de dobradiça do tipo selvagem. Em certas modalidades, pelo menos um dos resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se ori- ginam está presente dentro de uma região de dobradiça e, por exem- plo, está presente em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 216, 218, e 219 de acordo com a numeração da EU na região de dobradiça.

[00342] Em uma modalidade dos aspectos acima, o primeiro domí- nio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antíge- no estão ligados entre si por meio de duas ou mais ligações.

[00343] Em certas modalidades, pelo menos um dos resíduos de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam é um resíduo de aminoácido presente em uma sequência do tipo selvagem e, por exemplo, é um resíduo de cis- teína em uma região de dobradiça do tipo selvagem. Em certas moda- lidades, a pelo menos uma ligação que liga o primeiro domínio de liga- ção ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno é uma ligação de dissulfeto formada através da reticulação de resíduos de cisteína presentes nas regiões de dobradiça do tipo selvagem entre si. Tais resíduos de cisteína estão presentes, por exemplo, nas posições 226 e/ou 229 de acordo com a numeração da EU de uma região de dobradiça do tipo selvagem.

[00344] Em certas modalidades, pelo menos um dos resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao an- tígeno se originam está presente dentro de um fragmento de anticorpo, e pelo menos um está presente dentro de uma região de dobradiça. Em uma modalidade exemplar, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é F(ab')2, em que tanto o primeiro quanto o segun- do domínios de ligação ao antígeno compreendem um Fab e uma re- gião de dobradiça.

[00345] Em uma modalidade dos aspectos acima, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção ainda compreende uma re- gião Fc e, por exemplo, é um anticorpo de comprimento total. Em cer- tas modalidades, uma ou mais mutações de aminoácido que promo- vem a multimerização de regiões Fc são introduzidas na região Fc da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção. Tais mutações de aminoácido incluem, por exemplo, as mutações de aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste nas posi- ções 247, 248, 253, 254, 310, 311, 338, 345, 356, 359, 382, 385, 386, 430, 433, 434, 436, 437, 438, 439, 440 e 447 de acordo com a nume- ração da EU (ver, por exemplo, WO 2016/164480). Em certas modali- dades, a multimerização é hexamerização. Antígenos ligados por moléculas de ligação ao antígeno

[00346] Em uma modalidade dos aspectos acima, tanto o primeiro quanto o segundo domínios de ligação ao antígeno se ligam ao mes- mo antígeno. Em certas modalidades, tanto primeiro quanto o segundo domínios de ligação ao antígeno se ligam ao mesmo epítopo no mes- mo antígeno. Em certas outras modalidades, cada um dos primeiro e segundo domínios de ligação ao antígeno se liga a um epítopo diferen- te no mesmo antígeno. Em certas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é uma molécula de ligação ao antí- geno biparatópica (por exemplo, um anticorpo biparatópico) que dire- ciona um antígeno específico.

[00347] Em outra modalidade dos aspectos acima, cada um dos primeiro e segundo domínios de ligação ao antígeno se liga a um antí- geno diferente.

[00348] Em outra modalidade dos aspectos acima, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é uma molécula de ligação ao antígeno de fixação (por exemplo, um anticorpo de fixação). Uma molécula de ligação ao antígeno de fixação no presente relatório des- critivo significa uma molécula de ligação ao antígeno que se liga espe- cificamente a um complexo antígeno/molécula de ligação ao antígeno formado entre um determinado antígeno A e uma molécula de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno A, e que assim aumenta a ativida- de de ligação para o antígeno A da molécula de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno A (ou alternativamente, estabiliza o complexo de antígeno/molécula de ligação ao antígeno formado pelo antígeno A e a molécula de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno A). Por exemplo, um anticorpo de fixação de CD3 se liga especificamente ao complexo antígeno-anticorpo formado entre CD3 e um anticorpo com capacidade de ligação reduzida para CD3 (anticorpo CD3 atenuado por ligação) e pode, assim, aumentar a atividade de ligação do anti- corpo CD3 atenuado por ligação para CD3 (ou alternativamente, esta- bilize o complexo antígeno-anticorpo formado por CD3 e o anticorpo CD3 atenuado por ligação). Em certas modalidades, o primeiro e/ou segundo domínios de ligação ao antígeno na molécula de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser domínios de ligação ao an- tígeno (domínios de ligação ao antígeno de fixação) a partir de molé- culas de ligação ao antígeno de fixação.

[00349] Em uma modalidade dos aspectos acima, tanto o primeiro quanto o segundo domínios de ligação ao antígeno possuem a mesma sequência de aminoácido. Em outra modalidade, cada um dos primeiro e segundo domínios de ligação ao antígeno possui uma sequência de aminoácido diferente.

[00350] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos um dos dois antígenos aos quais o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno se ligam é uma proteína solúvel ou uma proteína de membrana. Funções das moléculas de ligação ao antígeno

[00351] Em uma modalidade dos aspectos acima, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção possui atividade de reter duas moléculas de antígeno em posições espacialmente próximas. Em certas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é capaz de manter duas moléculas de antígeno em posições mais próximas do que uma molécula de ligação ao antígeno de contro-

le, e a molécula de ligação ao antígeno de controle difere da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção apenas em que a molé- cula de ligação ao antígeno de controle possui uma ligação menor en- tre os dois domínios de ligação ao antígeno. Em uma outra modalida- de, uma ligação menor pode ser selecionada de ligações em que os resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domí- nios de ligação ao antígeno se originam são derivados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de ciste- ína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem).

[00352] Em outra modalidade dos aspectos acima, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção possui atividade de regula- ção da interação entre duas moléculas de antígeno. Sem estar limitado por uma teoria particular, a atividade de regulação da interação é con- siderada de ser o resultado da retenção de duas moléculas de antíge- no em posições espacialmente mais próximas pela molécula de liga- ção ao antígeno da presente invenção. Em certas modalidades, a mo- lécula de ligação ao antígeno da presente invenção é capaz de au- mentar ou diminuir a interação entre duas moléculas de antígeno em comparação com uma molécula de ligação ao antígeno de controle, e a molécula de ligação ao antígeno de controle difere da molécula de ligação ao antígeno do presente invenção apenas em que a molécula de ligação ao antígeno de controle possui uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antígeno. Em uma outra modalidade, uma ligação menor pode ser selecionada a partir de ligações em que os resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domí- nios de ligação ao antígeno se originam são derivados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de ciste-

ína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem).

[00353] Em certas modalidades, as duas moléculas de antígeno ligadas pela molécula de ligação ao antígeno da presente invenção são um ligante e um receptor do mesmo, respectivamente, e a molécu- la de ligação ao antígeno da presente invenção possui atividade de promoção da ativação do receptor pelo ligante. Em certa outra modali- dade, as duas moléculas de antígeno ligadas pela molécula de ligação ao antígeno da presente invenção são uma enzima e um substrato da mesma, respectivamente, e a molécula de ligação ao antígeno da pre- sente invenção possui atividade de promoção da reação catalítica da enzima com o substrato.

[00354] Além disso, em certas outras modalidades, ambas as duas moléculas de antígeno ligadas pela molécula de ligação ao antígeno da presente invenção são antígenos (por exemplo, proteínas) presen- tes nas superfícies celulares e a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção possui atividade de promoção da interação entre uma célula que expressa o primeiro antígeno e uma célula que ex- pressa o segundo antígeno. Por exemplo, a célula que expressa o primeiro antígeno e a célula que expressa o segundo antígeno são, respectivamente, uma célula com atividade citotóxica e uma célula al- vo da mesma, e a molécula de ligação ao antígeno da presente inven- ção promove dano da célula alvo pela célula com atividade citotóxica. A célula com atividade citotóxica é, por exemplo, uma célula T, célula NK, monócito ou macrófago.

[00355] Em uma modalidade dos aspectos acima, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção possui atividade de regula- ção da ativação de duas moléculas de antígeno que são ativadas por associação entre si. Sem estar limitado por uma teoria particular, acre- dita-se que a atividade de regulação da ativação resulta da retenção de duas moléculas de antígeno em posições espacialmente mais pró- ximas pela molécula de ligação ao antígeno da presente invenção. Em certas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção pode aumentar ou diminuir a ativação de duas moléculas de antígeno em comparação com uma molécula de ligação ao antígeno de controle, e a molécula de ligação ao antígeno de controle difere da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção apenas na me- dida em que a molécula de ligação ao antígeno de controle possui uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antígeno. Em uma outra modalidade, uma ligação menor pode ser selecionada a partir de ligações em que os resíduos de aminoácido dos quais as li- gações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam são de- rivados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão pre- sentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem). Por exemplo, tais moléculas de antígeno são selecionadas a partir do grupo que consiste em recepto- res pertencentes a superfamílias de receptores de citocina, receptores acoplados à proteína G, receptores de canais iônicos, receptores de tirosina cinase, receptores do ponto de controle imunológico, recepto- res de antígenos, antígenos CD, moléculas coestimuladoras e molécu- las de aderência celular.

[00356] Em uma modalidade dos aspectos acima, na molécula de ligação ao antígeno da presente invenção, dois domínios de ligação ao antígeno estão presentes em posições espacialmente próximas e/ou a mobilidade dos dois domínios de ligação ao antígeno é reduzida. Em certas modalidades, em comparação com uma molécula de ligação ao antígeno de controle, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção possui dois domínios de ligação ao antígeno que estão pre- sentes em posições mais próximas e/ou a mobilidade dos dois domí-

nios de ligação ao antígeno é mais reduzida, e a molécula de ligação ao antígeno de controle difere da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção apenas por ter uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antígeno. Em uma outra modalidade, uma liga- ção menor pode ser selecionada a partir de ligações em que os resí- duos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de liga- ção ao antígeno se originam são derivados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de do- bradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem).

[00357] Em uma modalidade dos aspectos acima, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção possui resistência à cliva- gem por protease. Em certas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção aumentou a resistência à clivagem por protease em comparação com uma molécula de ligação ao antígeno de controle, e a molécula de ligação ao antígeno de controle difere da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção apenas pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno de controle possui uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antígeno. Em uma outra modalidade, a uma ligação menor pode ser selecionada a partir de ligações em que os resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam são derivados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resí- duos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobra- diça do tipo selvagem). Em certas modalidades, na molécula de liga- ção ao antígeno da presente invenção, a proporção da molécula de comprimento total (por exemplo, molécula de IgG de comprimento to- tal) remanescente após o tratamento com protease é aumentada em comparação com a molécula de ligação ao antígeno de controle. Em certas modalidades, na molécula de ligação ao antígeno da presente invenção, a proporção de um fragmento particular (por exemplo, mo- nômero Fab) produzido após o tratamento com protease é reduzida em comparação com a molécula de ligação ao antígeno de controle.

[00358] Em uma modalidade dos aspectos acima, quando a molé- cula de ligação ao antígeno da presente invenção é tratada com uma protease, um dímero dos domínios de ligação ao antígeno ou fragmen- tos dos mesmos (por exemplo, dímero Fab reticulado) é removido. Em certas modalidades, quando a molécula de ligação ao antígeno de controle, que difere da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção apenas pelo fato de que possui uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antígeno, é tratada com a protease, mo- nômeros dos domínios de ligação ao antígeno ou seus fragmentos são removidos. Em uma outra modalidade, uma ligação menor pode ser selecionada a partir de ligações em que os resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se ori- ginam são derivados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo sel- vagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem). Nessas modalidades, a protease pode clivar a região de dobradiça da molécula de ligação ao antígeno.

[00359] Em uma outra modalidade, a molécula de ligação ao antí- geno de controle difere da molécula de ligação ao antígeno da presen- te invenção apenas pelo fato de que possui uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antígeno, e a uma ligação menor é uma ligação que é formada originando de resíduos de aminoácido com mutação. Os resíduos de aminoácido com mutação são, por exemplo, resíduos de cisteína artificialmente introduzidos. Composições farmacêuticas

[00360] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma compo- sição farmacêutica que compreende a molécula de ligação ao antíge- no da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Uso de moléculas de ligação ao antígeno

[00361] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para manter duas moléculas de antígeno em posições espacialmente próximas, compreendendo: (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno compre- endendo dois domínios de ligação ao antígeno, (b) adicionar à molécula de ligação ao antígeno pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno entre si, e (c) colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno produzida em (b) com as duas moléculas de antígeno. Em certas mo- dalidades, os dois domínios de ligação ao antígeno na molécula de ligação ao antígeno citada em (a) acima podem ser ligados entre si por meio de uma ou mais ligações e, neste caso, algumas ou todas as uma ou mais ligações são ligações em que os resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se ori- ginam são derivados de resíduos de aminoácido que estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína na região de dobradiça). Em uma outra modalida- de, a referida pelo menos uma ligação citada em (b) acima é uma liga- ção em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são derivados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de ciste- ína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem). A presente invenção também fornece um método para manter duas moléculas de antígeno em posições espacialmente pró-

ximas que compreende o contato de duas moléculas de antígeno com a molécula de ligação ao antígeno ou composição farmacêutica da presente invenção. A presente invenção fornece ainda uma molécula de ligação ao antígeno ou composição farmacêutica da presente in- venção para uso na retenção de duas moléculas de antígeno em posi- ções espacialmente próximas.

[00362] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para regular a interação entre duas moléculas de antígeno, que com- preende: (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno compre- endendo dois domínios de ligação ao antígeno, (b) adicionar à molécula de ligação ao antígeno pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno entre si, e (c) colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno produzida em (b) com as duas moléculas de antígeno. Em certas mo- dalidades, os dois domínios de ligação ao antígeno na molécula de ligação ao antígeno citada em (a) acima podem ser ligados entre si por meio de uma ou mais ligações e, neste caso, algumas ou todas as uma ou mais ligações são ligações em que os resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se ori- ginam são derivados de resíduos de aminoácido que estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína na região de dobradiça). Em uma outra modalida- de, a referida pelo menos uma ligação citada em (b) acima é uma liga- ção em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são derivados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de ciste- ína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem). A presente invenção também fornece um método para re- gular a interação entre duas moléculas de antígeno que compreende o contato de duas moléculas de antígeno com a molécula de ligação ao antígeno ou composição farmacêutica da presente invenção. A pre- sente invenção fornece ainda uma molécula de ligação ao antígeno ou composição farmacêutica da presente invenção para uso na regulação da interação entre duas moléculas de antígeno.

[00363] Além disso, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para regular a atividade de duas moléculas de antígeno que são ativadas através da associação entre si, que compreende: (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno compre- endendo dois domínios de ligação ao antígeno, (b) adicionar à molécula de ligação ao antígeno pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno entre si, e (c) colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno produzida em (b) com as duas moléculas de antígeno. Em certas mo- dalidades, os dois domínios de ligação ao antígeno na molécula de ligação ao antígeno citada em (a) acima podem ser ligados entre si por meio de uma ou mais ligações e, neste caso, algumas ou todas as uma ou mais ligações são ligações em que os resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se ori- ginam são derivados de resíduos de aminoácido que estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína na região de dobradiça). Em uma outra modalida- de, dita pelo menos uma ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são derivados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de ciste-

ína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem). A presente invenção também fornece um método para re- gular a atividade de duas moléculas de antígeno que são ativadas através da associação entre si, que compreende o contato de duas moléculas de antígeno com a molécula de ligação ao antígeno ou composição farmacêutica da presente invenção. A presente invenção fornece ainda uma molécula de ligação ao antígeno ou composição farmacêutica da presente invenção para uso na regulação da atividade de duas moléculas de antígeno que são ativadas através da associa- ção entre si.

[00364] Além disso, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para colocar dois domínios de ligação ao antígeno em po- sições espacialmente próximas e/ou reduzir a mobilidade de dois do- mínios de ligação ao antígeno, que compreende: (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno compre- endendo dois domínios de ligação ao antígeno, e (b) adicionar à molécula de ligação ao antígeno pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno entre si. Em certas modalidades, os dois domínios de ligação ao antígeno na molécula de ligação ao antígeno citada em (a) acima podem ser liga- dos entre si por meio de uma ou mais ligações e, neste caso, algumas ou todas as uma ou mais ligações são ligações em que os resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao an- tígeno se originam são derivados de resíduos de aminoácido que es- tão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína na região de dobradiça). Em uma outra modalidade, dita pelo menos uma ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são derivados de re- síduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem).

[00365] Além disso, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para aumentar a resistência de uma molécula de ligação ao antígeno à clivagem por protease, que compreende: (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno compre- endendo dois domínios de ligação ao antígeno, e (b) adicionar à molécula de ligação ao antígeno pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno entre si. Em certas modalidades, os dois domínios de ligação ao antígeno na molécula de ligação ao antígeno citada em (a) acima podem ser liga- dos entre si por meio de uma ou mais ligações e, neste caso, algumas ou todas as uma ou mais ligações são ligações em que os resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao an- tígeno se originam são derivados de resíduos de aminoácido que es- tão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína na região de dobradiça). Em uma outra modalidade, a referida pelo menos uma ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são deriva- dos de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de do- bradiça do tipo selvagem).

[00366] A molécula de ligação ao antígeno utilizada nestes vários métodos pode ter as características das moléculas de ligação ao antí- geno aqui descritas. Métodos para produzir moléculas de ligação ao antígeno

[00367] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para a produção de uma molécula de ligação ao antígeno que possui atividade de reter duas moléculas de antígeno em posições espacial- mente próximas, que compreende: (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno, (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno de tal modo que pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicionada, (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira, (d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo compreendendo o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno es- tão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações.

Em certas mo- dalidades, cada um dos dois domínios de ligação ao antígeno citados em (a) acima pode compreender um ou mais resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações para ligar os dois domínios de ligação ao antígeno se originam e, neste caso, alguns ou todos os um ou mais resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domí- nios de ligação ao antígeno são resíduos de aminoácido que estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína na região de dobradiça). Em uma outra modalidade, dita pelo menos uma ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a liga- ção entre os domínios de ligação ao antígeno são derivados de resí-

duos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem).

[00368] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a produção de uma molécula de ligação ao antígeno que possui atividade de regulação da interação entre duas moléculas de antígeno, que compreende: (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno, (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno, de tal modo que pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicionada, (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira, (d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo compreendendo o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno es- tão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações. Em certas mo- dalidades, cada um dos dois domínios de ligação ao antígeno citados em (a) acima pode compreender um ou mais resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações para ligar os dois domínios de ligação ao antígeno se originam e, neste caso, alguns ou todos os um ou mais resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domí- nios de ligação ao antígeno são resíduos de aminoácido que estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína na região de dobradiça). Em uma outra modalidade, dita pelo menos uma ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a liga- ção entre os domínios de ligação ao antígeno são derivados de resí- duos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem).

[00369] Além disso, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir uma molécula de ligação ao antígeno que possui atividade de regulação da ativação de duas moléculas de antí- geno que são ativadas através da associação entre si, que compreen- de: (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno, (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno, de tal modo que pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicionada, (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira, (d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo compreendendo o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno es- tão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações. Em certas mo-

dalidades, cada um dos dois domínios de ligação ao antígeno citados em (a) acima pode compreender um ou mais resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações para ligar os dois domínios de ligação ao antígeno se originam e, neste caso, alguns ou todos os um ou mais resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domí- nios de ligação ao antígeno são resíduos de aminoácido que estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína na região de dobradiça). Em uma outra modalidade, a referida pelo menos uma ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são derivados de re- síduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem).

[00370] Além disso, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a produção de uma molécula de ligação ao antígeno em que dois domínios de ligação ao antígeno estão presentes em po- sições espacialmente próximas e/ou a mobilidade de dois domínios de ligação ao antígeno é reduzida, que compreende: (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno, (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno, de tal modo que pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicionada, (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira,

(d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo compreendendo o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno es- tão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações. Em certas mo- dalidades, cada um dos dois domínios de ligação ao antígeno citados em (a) acima pode compreender um ou mais resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações para ligar os dois domínios de ligação ao antígeno se originam e, neste caso, alguns ou todos os um ou mais resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domí- nios de ligação ao antígeno são resíduos de aminoácido que estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína na região de dobradiça). Em uma outra modalidade, a referida pelo menos uma ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são derivados de re- síduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem).

[00371] Além disso, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a produção de uma molécula de ligação ao antígeno que aumentou a resistência à clivagem por protease, que compreende: (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno, (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno, de tal modo que pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicionada, (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira, (d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo compreendendo o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno es- tão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações. Em certas mo- dalidades, cada um dos dois domínios de ligação ao antígeno citados em (a) acima pode compreender um ou mais resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações para ligar os dois domínios de ligação ao antígeno se originam e, neste caso, alguns ou todos os um ou mais resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domí- nios de ligação ao antígeno são resíduos de aminoácido que estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína na região de dobradiça). Em uma outra modalidade, dita pelo menos uma ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a liga- ção entre os domínios de ligação ao antígeno são derivados de resí- duos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem).

[00372] A molécula de ligação ao antígeno produzida nestes vários aspectos pode ter as características das moléculas de ligação ao antí- geno aqui descritas. Métodos de rastreamento de moléculas de ligação ao antígeno

[00373] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para identificar um novo par de moléculas de proteína que são ativa- das através da associação entre si, que compreende: (a) fornecer duas moléculas de proteína arbitrárias, (b) produzir, pelo método de produção da presente inven- ção, uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo dois domí- nios de ligação ao antígeno que se ligam respectivamente às duas mo- léculas de proteína, (c) colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno produzida em (b) com as duas moléculas de proteína, e (d) avaliar se as duas moléculas de proteína são ativadas ou não.

[00374] Em certas modalidades, pelo menos uma das duas molécu- las de proteína é selecionada do grupo que consiste em receptores pertencentes a superfamílias de receptores de citocina, receptores acoplados à proteína G, receptores de canais iônicos, receptores de tirosina cinase, receptores do ponto de controle imunológico, recepto- res de antígenos, antígenos CD, moléculas coestimuladoras e molécu- las de aderência celular. A. Moléculas de ligação ao antígeno exemplares Estruturas de moléculas de ligação ao antígeno

[00375] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo um primeiro domínio de liga- ção ao antígeno e um segundo domínio de ligação ao antígeno, e os domínios de ligação ao antígeno estão ligados entre si por meio de duas ou mais ligações. Em uma modalidade, pelo menos um dos pri- meiro e segundo domínios de ligação ao antígeno possui, isoladamen- te, atividade de ligação a um antígeno (isto é, um único domínio de ligação ao antígeno independentemente possui atividade de ligação ao antígeno). Em certas modalidades, cada um dos primeiro e segundo domínios de ligação ao antígeno possui, isoladamente, atividade de ligação a um antígeno.

[00376] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos um dos primeiro e segundo domínios de ligação ao antígeno compreende um fragmento de anticorpo que se liga a um antígeno particular. Em certas modalidades, o primeiro e/ou segundo domínios de ligação ao antígeno compreendem uma região de dobradiça. Os resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam estão respectivamente presentes no primeiro e no segundo domínios de ligação ao antígeno, e as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno são formadas pela ligação desses resíduos de aminoácido. Em certas modalidades, pelo menos um dos resíduos de aminoácido dos quais se originam as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno está presente no fragmento de anti- corpo. Em certas modalidades, pelo menos um dos resíduos de ami- noácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antíge- no se originam está presente dentro de uma região de dobradiça. Em certas modalidades, pelo menos um dos resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se origi- nam está presente dentro do fragmento de anticorpo, e pelo menos um dos resíduos de aminoácido está presente dentro de uma região de dobradiça.

[00377] Em uma modalidade dos aspectos acima, em pelo menos um dos primeiro e segundo domínios de ligação ao antígeno, múltiplos resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domí- nios de ligação ao antígeno se originam estão presentes em posições a uma distância de sete aminoácidos ou mais um do outro na estrutura primária. Isto significa que, entre quaisquer dois resíduos de aminoáci- do dos múltiplos resíduos de aminoácido acima, estão presentes seis ou mais resíduos de aminoácido que não são os referidos resíduos de aminoácido. Em certas modalidades, as combinações de múltiplos re-

síduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam incluem um par de resíduos de aminoácido que estão presentes em posições a uma distância de me- nos de sete aminoácidos na estrutura primária. Em certas modalida- des, se o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno esti- verem ligados entre si por meio de três ou mais ligações, as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno podem se originar de três ou mais resíduos de aminoácido, incluindo um par de resíduos de amino- ácido que estão presentes em posições a uma distância de sete ami- noácidos ou mais na estrutura primária.

[00378] Em certas modalidades, os resíduos de aminoácido presen- tes na mesma posição no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno estão ligados entre si para formar uma ligação. Em certas modalidades, os resíduos de aminoáci- do presentes em uma posição diferente no primeiro domínio de ligação ao antígeno e no segundo domínio de ligação ao antígeno estão liga- dos entre si para formar uma ligação.

[00379] As posições dos resíduos de aminoácido no domínio de li- gação ao antígeno podem ser mostradas de acordo com a numeração de Kabat ou sistema de numeração da EU (também chamado de índi- ce EU) descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologi- cal Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Por exemplo, se os resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno se originam estão presentes em uma posição idêntica correspondente nos domínios de ligação ao antígeno, a posi- ção destes resíduos de aminoácido pode ser indicada como o mesmo número de acordo com a numeração de Kabat ou sistema de numera- ção da EU. Alternativamente, se os resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre o primeiro e o segundo domínios de liga-

ção ao antígeno se originam estiverem presentes em diferentes posi- ções que não são correspondentes nos domínios de ligação ao antí- geno, as posições desses resíduos de aminoácido podem ser indica- das como números diferentes de acordo com a numeração de Kabat ou sistema de numeração da EU.

[00380] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos uma das duas ou mais ligações que ligam os domínios de ligação ao antí- geno é uma ligação covalente. Em certas modalidades, a ligação cova- lente é formada através da reticulação direta de um resíduo de amino- ácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e um resíduo de aminoácido no segundo domínio de ligação ao antígeno. Os resíduos de aminoácido reticulados são, por exemplo, cisteína, e a ligação co- valente formada é, por exemplo, uma ligação de dissulfeto. Pelo me- nos um dos resíduos de cisteína reticulada pode estar presente dentro de uma região de dobradiça.

[00381] Em certas outras modalidades, a ligação covalente é for- mada através da reticulação de um resíduo de aminoácido no primeiro domínio de ligação ao antígeno e um resíduo de aminoácido no se- gundo domínio de ligação ao antígeno por meio de um agente de reti- culação. O agente de reticulação é, por exemplo, um agente de reticu- lação reativo com amina, e os resíduos de aminoácido reticulados são, por exemplo, lisina.

[00382] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos uma das duas ou mais ligações que ligam os domínios de ligação ao antí- geno é uma ligação não covalente. Em certas modalidades, a ligação não covalente é uma ligação iônica, ligação de hidrogênio ou ligação hidrofóbica.

[00383] Em uma modalidade dos aspectos acima, o fragmento de anticorpo é um Fab, Fab', scFab, Fv, scFv ou anticorpo de domínio único.

[00384] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos um dos resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região constante. Em certas modalidades, o resíduo de aminoáci- do está presente em uma região CH1 e, por exemplo, está presente em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 119, 122, 123, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 148, 150, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 165, 167, 174, 176, 177, 178, 190, 191, 192, 194, 195, 197, 213 e 214 de acordo com a numeração da EU na região CH1. Em uma modalidade exemplar, o resíduo de ami- noácido está presente na posição 191 de acordo com a numeração da EU na região CH1, e os resíduos de aminoácido na posição 191 de acordo com a numeração da EU na região CH1 dos dois domínios de ligação ao antígeno estão ligados entre si para formar uma ligação.

[00385] Em certas modalidades, pelo menos um dos resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região de do- bradiça e, por exemplo, está presente em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 216, 218 e 219 de acordo com a nu- meração da EU na região de dobradiça.

[00386] Em certas modalidades, pelo menos um dos resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao an- tígeno se originam está presente dentro de uma região CL e, por exemplo, está presente em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 109, 112, 121, 126, 128, 151, 152, 153, 156, 184, 186, 188, 190, 200, 201, 202, 203, 208, 210, 211, 212 e 213 de acordo com a numeração da EU na região CL. Em uma modalidade exemplar, o resíduo de aminoácido está presente na posição 126 de acordo com a numeração da EU na região CL, e os resíduos de ami- noácido na posição 126 de acordo com a numeração da EU na região

CL dos dois domínios de ligação ao antígeno estão ligados entre si para formar uma ligação.

[00387] Em certas modalidades, um resíduo de aminoácido na regi- ão CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno e um resíduo de aminoácido na região CL do segundo domínio de ligação ao antígeno estão ligados para formar uma ligação. Em uma modalidade exemplar, um resíduo de aminoácido na posição 191 de acordo com a numera- ção da EU na região CH1 do primeiro domínio de ligação ao antígeno e um resíduo de aminoácido na posição 126 de acordo com a numera- ção da EU na região CL do segundo domínio de ligação ao antígeno estão ligados para formar um vínculo.

[00388] Em uma modalidade dos aspectos acima, a região constan- te é derivada de ser humano. Em certas modalidades, a subclasse da região constante de cadeia pesada é qualquer uma de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD e IgE. Em certas modalidades, a sub- classe da região CH1 é qualquer um de γ1, γ2, γ3, γ4, α1, α2, μ, δ e ε. Em certas modalidades, a subclasse da região CL é κ ou λ.

[00389] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos um dos resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região variável. Em certas modalidades, o resíduo de aminoácido está presente em uma região VH e, por exemplo, está presente em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 8, 16, 28, 74 e 82b de acordo com a numeração de Kabat na região VH. Em certas modalidades, o resíduo de aminoácido está presente em uma região VL e, por exemplo, está presente em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 100, 105 e 107 de acordo com a numeração de Kabat na região VL.

[00390] Em uma modalidade dos aspectos acima, o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno compreendem um Fab e uma região de dobradiça.

[00391] Em certas modalidades, pelo menos um dos resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam é um resíduo de aminoácido presente em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem e, por exemplo, é um resíduo de cisteína na dobradiça região. Exemplos de tais resíduos de cisteína incluem os resíduos de cisteína nas posições 226 e 229 de acordo com a numeração da EU.

[00392] Em certas outras modalidades, pelo menos um dos resí- duos de aminoácido a partir do qual as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam é um resíduo de aminoácido com mu- tação que não está presente em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem e, por exemplo, é um resíduo de cisteína que não está presente em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem. Tal resíduo de aminoácido com mutação pode ser introduzido em uma re- gião Fab ou de dobradiça do tipo selvagem, por exemplo, através de um método de substituição de aminoácido. O presente relatório descri- tivo divulga os sítios de resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno podem se originar para cada uma das regiões CH1, dobradiça, CL, VH e VL e, por exem- plo, resíduos de cisteína podem ser introduzidos em tais sítios.

[00393] Alternativamente, em outra modalidade, um resíduo de aminoácido que está presente em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem e que está envolvido em uma ligação entre os domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, um resíduo de cisteína) pode ser substituído por outro aminoácido ou excluído. Exemplos de tais resí- duos de cisteína incluem os resíduos de cisteína nas posições 220, 226 e 229 de acordo com a numeração da EU na região de dobradiça e o resíduo de cisteína na posição 214 na região CL.

[00394] Em certas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é F(ab')2, em que tanto o primeiro quanto o se- gundo domínios de ligação ao antígeno compreendem um Fab e uma região de dobradiça.

[00395] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos um dentre o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno com- preende uma ligação de proteína de não anticorpo a um antígeno par- ticular, ou um fragmento do mesmo. Em certas modalidades, a proteí- na de não anticorpo é um par de um ligante e um receptor que se li- gam especificamente entre si. Tais receptores incluem, por exemplo, receptores pertencentes a superfamílias de receptores de citocinas, receptores acoplados à proteína G, receptores de canais iônicos, re- ceptores de tirosina cinase, receptores do ponto de controle imunoló- gico, receptores de antígenos, antígenos CD, moléculas coestimulado- ras e moléculas de aderência celular.

[00396] Em uma modalidade dos aspectos acima, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção compreende ainda uma re- gião Fc e, por exemplo, é um anticorpo de comprimento total. Em cer- tas modalidades, uma ou mais mutações de aminoácido que promo- vem a multimerização de regiões Fc são introduzidas na região Fc da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção. Tais mutações de aminoácido incluem, por exemplo, as mutações de aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste nas posi- ções 247, 248, 253, 254, 310, 311, 338, 345, 356, 359, 382, 385, 386, 430, 433, 434, 436, 437, 438, 439, 440 e 447 de acordo com a nume- ração da EU (ver, por exemplo, a WO 2016/164480). Em certas moda- lidades, a multimerização é hexamerização. Antígenos ligados por moléculas de ligação ao antígeno

[00397] Em uma modalidade dos aspectos acima, tanto o primeiro quanto o segundo domínios de ligação ao antígeno se ligam ao mes- mo antígeno. Em certas modalidades, o primeiro e o segundo domí-

nios de ligação ao antígeno se ligam ao mesmo epítopo no mesmo antígeno. Em certas outras modalidades, cada um dos primeiro e se- gundo domínios de ligação ao antígeno se liga a um epítopo diferente no mesmo antígeno. Em certas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é uma molécula de ligação ao antígeno biparatópica (por exemplo, anticorpo biparatópico) que direciona um antígeno específico.

[00398] Em uma modalidade dos aspectos acima, cada um dos primeiro e segundo domínios de ligação ao antígeno se liga a um antí- geno diferente.

[00399] Em outra modalidade dos aspectos acima, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é uma molécula de ligação ao antígeno de fixação (por exemplo, anticorpo de fixação). Aqui, uma molécula de ligação ao antígeno de fixação se refere a uma molécula de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um complexo de antígeno/molécula de ligação ao antígeno formado por um determina- do antígeno A e uma molécula de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno A e, assim, aumenta a atividade da molécula de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno A para ligar o antígeno A (ou estabili- zar o complexo de antígeno/molécula de ligação ao antígeno formado pelo antígeno A e a molécula de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno A). Por exemplo, um anticorpo de fixação de CD3 é capaz de se ligar a um complexo antígeno-anticorpo formado por CD3 e um an- ticorpo com capacidade de ligação atenuada a CD3 (anticorpo CD3 atenuado por ligação) e, assim, aumentar a atividade de ligação a CD3 do anticorpo CD3 atenuado por ligação (ou estabilizar o complexo an- tígeno-anticorpo formado por CD3 e o anticorpo CD3 atenuado por li- gação). Em certas modalidades, o primeiro e/ou segundo domínios de ligação ao antígeno na molécula de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser domínios de ligação ao antígeno derivados de moléculas de ligação ao antígeno de fixação (domínios de ligação ao antígeno de fixação).

[00400] Em uma modalidade dos aspectos acima, tanto o primeiro quanto o segundo domínios de ligação ao antígeno possuem a mesma sequência de aminoácido. Em outra modalidade, cada um dos primeiro e segundo domínios de ligação ao antígeno possui uma sequência de aminoácido diferente.

[00401] Em uma modalidade dos aspectos acima, pelo menos um dos dois antígenos aos quais o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno se ligam é uma proteína solúvel ou uma proteína de membrana. Funções das moléculas de ligação ao antígeno

[00402] Em uma modalidade dos aspectos acima, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção possui atividade de reter duas moléculas de antígeno em posições espacialmente próximas. Em certas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é capaz de manter duas moléculas de antígeno em posições mais próximas do que uma molécula de ligação ao antígeno de contro- le, e a molécula de ligação ao antígeno de controle difere da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção apenas em que a molé- cula de ligação ao antígeno de controle possui uma ligação menor en- tre os dois domínios de ligação ao antígeno. Em uma outra modalida- de, uma ligação menor pode ser selecionada a partir de ligações em que os resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam são derivados de resí- duos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem).

[00403] Em uma modalidade dos aspectos acima, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção possui atividade de regula- ção da interação entre duas moléculas de antígeno. Sem estar limitado por uma teoria particular, a atividade de regulação da interação é con- siderada de ser resultado da retenção de duas moléculas de antígeno em posições espacialmente mais próximas pela molécula de ligação ao antígeno da presente invenção. Em certas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é capaz de aumentar ou diminuir a interação entre duas moléculas de antígeno em comparação com uma molécula de ligação ao antígeno de controle, e a molécula de ligação ao antígeno de controle difere da molécula de ligação ao antígeno do presente invenção apenas em que a molécula de ligação ao antígeno de controle possui uma ligação menor entre os dois domí- nios de ligação ao antígeno. Em uma outra modalidade, uma ligação menor pode ser selecionada a partir de ligações em que os resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam são derivados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem).

[00404] Em certas modalidades, as duas moléculas de antígeno ligadas pela molécula de ligação ao antígeno da presente invenção são um ligante e um receptor do mesmo, respectivamente, e a molécu- la de ligação ao antígeno da presente invenção possui atividade de promoção da ativação do receptor pelo ligante. Em certa outra modali- dade, as duas moléculas de antígeno ligadas pela molécula de ligação ao antígeno da presente invenção são uma enzima e um substrato da mesma, respectivamente, e a molécula de ligação ao antígeno da pre- sente invenção possui atividade de promoção da reação catalítica da enzima com o substrato.

[00405] Além disso, em certas outras modalidades, ambas as duas moléculas de antígeno ligadas pela molécula de ligação ao antígeno da presente invenção são antígenos (por exemplo, proteínas) presen- tes nas superfícies celulares e a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção possui atividade de promoção da interação entre uma célula que expressa o primeiro antígeno e uma célula que ex- pressa o segundo antígeno. Por exemplo, a célula que expressa o primeiro antígeno e a célula que expressa o segundo antígeno são, respectivamente, uma célula com atividade citotóxica e uma célula al- vo da mesma, e a molécula de ligação ao antígeno da presente inven- ção promove dano da célula alvo pela célula com atividade citotóxica. A célula com atividade citotóxica é, por exemplo, uma célula T, célula NK, monócito ou macrófago.

[00406] Em uma modalidade dos aspectos acima, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção possui atividade de regula- ção da ativação de duas moléculas de antígeno que são ativadas atra- vés da associação entre si. Sem estar limitado por uma teoria particu- lar, acredita-se que a atividade de regulação da ativação resulta da retenção de duas moléculas de antígeno em posições espacialmente mais próximas pela molécula de ligação ao antígeno da presente in- venção. Em certas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção pode aumentar ou diminuir a ativação de duas mo- léculas de antígeno em comparação com uma molécula de ligação ao antígeno de controle, e a molécula de ligação ao antígeno de controle difere da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção ape- nas na medida em que a molécula de ligação ao antígeno de controle possui uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antí- geno. Em uma outra modalidade, uma ligação menor pode ser seleci- onada de ligações em que os resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam são de- rivados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão pre-

sentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem). Por exemplo, tais moléculas de antígeno são selecionadas do grupo que consiste em receptores per- tencentes a superfamílias de receptores de citocina, receptores aco- plados à proteína G, receptores de canais iônicos, receptores de tiro- sina cinase, receptores do ponto de controle imunológico, receptores de antígenos, antígenos CD, moléculas coestimuladoras e moléculas de aderência celular.

[00407] Em uma modalidade dos aspectos acima, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção possui resistência à cliva- gem por protease. Em certas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção aumentou a resistência à clivagem da protease em comparação com uma molécula de ligação ao antígeno de controle, e a molécula de ligação ao antígeno de controle difere da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção apenas pelo fato de que a molécula de ligação ao antígeno de controle possui uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antígeno. Em uma outra modalidade, uma ligação menor pode ser selecionada a partir de ligações em que os resíduos de aminoácido dos quais as ligações en- tre os domínios de ligação ao antígeno se originam são derivados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resí- duos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobra- diça do tipo selvagem). Em certas modalidades, na molécula de liga- ção ao antígeno da presente invenção, a proporção da molécula de comprimento total (por exemplo, molécula de IgG de comprimento to- tal) remanescente após o tratamento com protease é aumentada em comparação com a molécula de ligação ao antígeno de controle. Em certas modalidades, na molécula de ligação ao antígeno da presente invenção, a proporção de um fragmento particular (por exemplo, mo- nômero Fab) produzido após o tratamento com protease é reduzida em comparação com a molécula de ligação ao antígeno de controle.

[00408] Em uma modalidade dos aspectos acima, quando a molé- cula de ligação ao antígeno da presente invenção é tratada com uma protease, um dímero dos domínios de ligação ao antígeno ou fragmen- tos dos mesmos (por exemplo, dímero Fab reticulado) é removido. Em certas modalidades, quando a molécula de ligação ao antígeno de controle, que difere da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção apenas por ter uma ligação menor entre os dois domínios de ligação ao antígeno, é tratada com a protease, monômeros dos domí- nios de ligação ao antígeno ou seus fragmentos são removidos. Em uma outra modalidade, uma ligação menor pode ser selecionada a partir de ligações em que os resíduos de aminoácido dos quais as li- gações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam são de- rivados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão pre- sentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem). Nessas modalidades, a protease pode clivar a região de dobradiça da molécula de ligação ao antígeno. Composições farmacêuticas

[00409] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma compo- sição farmacêutica que compreende a molécula de ligação ao antíge- no da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Uso de moléculas de ligação ao antígeno

[00410] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para manter duas moléculas de antígeno em posições espacialmente próximas, que compreende: (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno compre- endendo dois domínios de ligação ao antígeno, em que os dois domí-

nios de ligação ao antígeno estão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações, (b) adicionar à molécula de ligação ao antígeno outra liga- ção que liga os dois domínios de ligação ao antígeno entre si, e (c) colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno produzida em (b) com as duas moléculas de ligação ao antígeno.

[00411] Em certas modalidades, algumas ou todas as uma ou mais ligações citadas em (a) acima são ligações nas quais os resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao an- tígeno se originam são derivados de resíduos de aminoácido que es- tão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína na região de dobradiça). Em uma outra modalidade, dita outra ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são derivados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de ciste- ína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem). A presente invenção também fornece um método para manter duas moléculas de antígeno em posições espacialmente pró- ximas que compreende o contato de duas moléculas de antígeno com a molécula de ligação ao antígeno ou composição farmacêutica da presente invenção. A presente invenção fornece ainda uma molécula de ligação ao antígeno ou composição farmacêutica da presente in- venção para uso na retenção de duas moléculas de antígeno em posi- ções espacialmente próximas.

[00412] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para regular a interação entre duas moléculas de antígeno, que com- preende: (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno compre-

endendo dois domínios de ligação ao antígeno, em que os dois domí- nios de ligação ao antígeno estão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações, (b) adicionar à molécula de ligação ao antígeno outra liga- ção que liga os dois domínios de ligação ao antígeno entre si, e (c) colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno produzida em (b) com as duas moléculas de ligação ao antígeno.

[00413] Em certas modalidades, algumas ou todas as uma ou mais ligações citadas em (a) acima são ligações nas quais os resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao an- tígeno se originam são derivados de resíduos de aminoácido que es- tão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína na região de dobradiça). Em uma outra modalidade, a referida outra ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a liga- ção entre os domínios de ligação ao antígeno são derivados de resí- duos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem). A presente invenção também fornece um método para regular a interação entre duas moléculas de antígeno que compreende o contato de duas moléculas de antígeno com a molécula de ligação ao antígeno ou composição farmacêutica da presente invenção. A pre- sente invenção fornece ainda uma molécula de ligação ao antígeno ou composição farmacêutica da presente invenção para uso na regulação da interação entre duas moléculas de antígeno.

[00414] Além disso, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para regular a atividade de duas moléculas de antígeno que são ativadas através da associação entre si, que compreende: (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno compre-

[00415] Em certas modalidades, algumas ou todas as uma ou mais ligações citadas em (a) acima são ligações nas quais os resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao an- tígeno se originam são derivados de resíduos de aminoácido que es- tão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína na região de dobradiça). Em uma outra modalidade, a referida outra ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a liga- ção entre os domínios de ligação ao antígeno são derivados de resí- duos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem). A presente invenção também fornece um método para regular a atividade de duas moléculas de antígeno que são ativadas através da associação entre si, que compreende o contato de duas moléculas de antígeno com a molécula de ligação ao antígeno ou composição farmacêutica da presente invenção. A presente invenção fornece ainda uma molécula de ligação ao antígeno ou composição farmacêutica da presente invenção para uso na regulação da atividade de duas moléculas de antígeno que são ativadas através da associa- ção entre si.

[00416] Além disso, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para aumentar a resistência de uma molécula de ligação ao antígeno à clivagem por protease, que compreende: (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno compre- endendo dois domínios de ligação ao antígeno, em que os dois domí- nios de ligação ao antígeno estão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações, e (b) adicionar à molécula de ligação ao antígeno outra liga- ção que liga os dois domínios de ligação ao antígeno entre si.

[00417] Em certas modalidades, algumas ou todas as uma ou mais ligações citadas em (a) acima são ligações nas quais os resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao an- tígeno se originam são derivados de resíduos de aminoácido que es- tão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína na região de dobradiça). Em uma outra modalidade, a referida outra ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a liga- ção entre os domínios de ligação ao antígeno são derivados de resí- duos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem).

[00418] A molécula de ligação ao antígeno utilizada nestes vários métodos pode ter as características das moléculas de ligação ao antí- geno aqui descritas. Métodos para a produção de moléculas de ligação ao antígeno

[00419] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para a produção de uma molécula de ligação ao antígeno que possui atividade de reter duas moléculas de antígeno em posições espacial- mente próximas, que compreende: (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno, em que cada um dos dois do- mínios de ligação ao antígeno compreende um ou mais resíduos de aminoácido a partir dos quais uma ligação para ligar os dois domínios de ligação ao antígeno se origina, (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno, de tal modo que outra ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicio- nada, (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira, (d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo compreendendo o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno es- tão ligados entre si por meio de duas ou mais ligações.

[00420] Em certas modalidades, alguns ou todos os um ou mais resíduos de aminoácido citados em (a) acima dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são resíduos de aminoácido que estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (para exemplo, resíduos de cisteína na região de do- bradiça). Em uma outra modalidade, dita outra ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são deriva- dos de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de do- bradiça do tipo selvagem).

[00421] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a produção de uma molécula de ligação ao antígeno que possui atividade de regulação da interação entre duas moléculas de antígeno, que compreende: (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno, em que cada um dos dois do- mínios de ligação ao antígeno compreende um ou mais resíduos de aminoácido a partir dos quais uma ligação para ligar os dois domínios de ligação ao antígeno se origina, (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno, de tal modo que outra ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicio- nada, (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira, (d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo compreendendo o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno es- tão ligados entre si por meio de duas ou mais ligações.

[00422] Em certas modalidades, alguns ou todos os um ou mais resíduos de aminoácido citados em (a) acima dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são resíduos de aminoácido que estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (para exemplo, resíduos de cisteína na região de do- bradiça). Em uma outra modalidade, a referida outra ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são deri-

vados de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presen- tes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exem- plo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem).

[00423] Além disso, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir uma molécula de ligação ao antígeno que possui atividade de regulação da ativação de duas moléculas de antí- geno que são ativadas através da associação entre si, que compreen- de: (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno, em que cada um dos dois do- mínios de ligação ao antígeno compreende um ou mais resíduos de aminoácido a partir dos quais uma ligação para ligar os dois domínios de ligação ao antígeno se origina, (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno, de tal modo que outra ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicio- nada, (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira, (d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo compreendendo o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno es- tão ligados entre si por meio de duas ou mais ligações.

[00424] Em certas modalidades, alguns ou todos os um ou mais resíduos de aminoácido citados em (a) acima dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são resíduos de aminoácido que estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (para exemplo, resíduos de cisteína na região de do- bradiça). Em uma outra modalidade, dita outra ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são deriva- dos de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de do- bradiça do tipo selvagem).

[00425] Além disso, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a produção de uma molécula de ligação ao antígeno que aumentou a resistência à clivagem por protease, que compreende: (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno, em que cada um dos dois do- mínios de ligação ao antígeno compreende um ou mais resíduos de aminoácido a partir dos quais uma ligação para ligar os dois domínios de ligação ao antígeno se origina, (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno, de tal modo que outra ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicio- nada, (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira, (d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo compreendendo o primeiro e o segundo domínios de liga-

ção ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno es- tão ligados entre si por meio de duas ou mais ligações.

[00426] Em certas modalidades, alguns ou todos os um ou mais resíduos de aminoácido citados em (a) acima dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são resíduos de aminoácido que estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (para exemplo, resíduos de cisteína na região de do- bradiça). Em uma outra modalidade, dita outra ligação citada em (b) acima é uma ligação em que os resíduos de aminoácido dos quais se origina a ligação entre os domínios de ligação ao antígeno são deriva- dos de resíduos de aminoácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de do- bradiça do tipo selvagem).

[00427] A molécula de ligação ao antígeno produzida nestes vários aspectos pode ter as características das moléculas de ligação ao antí- geno aqui descritas. Métodos de rastreamento de moléculas de ligação ao antígeno

[00428] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para identificar um novo par de moléculas de proteína que são ativa- das através da associação entre si, que compreende: (a) fornecer duas moléculas de proteína arbitrárias, (b) produzir, pelo método de produção da presente inven- ção, uma molécula de ligação ao antígeno compreendendo dois domí- nios de ligação ao antígeno que se ligam respectivamente às duas mo- léculas de proteína, em que a molécula de ligação ao antígeno possui atividade de manter as duas moléculas de proteína em posições pró- ximas, (c) colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno produzida em (b) com as duas moléculas de proteína, e

(d) avaliar se as duas moléculas de proteína são ativadas ou não.

[00429] Em certas modalidades, pelo menos uma das moléculas de proteína é selecionada do grupo que consiste em receptores perten- centes a superfamílias de receptores de citocina, receptores acoplados à proteína G, receptores de canais iônicos, receptores de tirosina ci- nase, receptores do ponto de controle imunológico, receptores de an- tígenos, antígenos CD, moléculas coestimuladoras e moléculas de aderência celular. Ligação de domínios de ligação ao antígeno

[00430] Em uma modalidade não limitativa, dois ou mais domínios de ligação ao antígeno contidos em uma molécula de ligação ao antí- geno da presente invenção estão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações. Em uma modalidade preferida, um domínio de ligação ao antígeno contido em uma molécula de ligação ao antígeno da pre- sente invenção possui, isoladamente, atividade para se ligar a um an- tígeno. Em uma tal modalidade, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção contendo dois domínios de ligação ao antígeno po- de se ligar a duas ou mais moléculas de antígeno; a molécula de liga- ção ao antígeno da presente invenção contendo três domínios de liga- ção ao antígeno pode se ligar a três ou mais moléculas de antígeno; a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção contendo qua- tro domínios de ligação ao antígeno pode se ligar a quatro ou mais moléculas de antígeno; e a molécula de ligação ao antígeno da pre- sente invenção contendo N domínios de ligação ao antígeno pode se ligar a N ou mais moléculas de antígeno.

[00431] Em certas modalidades, pelo menos uma das ligações en- tre os domínios de ligação ao antígeno contidos em uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é diferente de uma ligação encontrada em um anticorpo de ocorrência natural (por exemplo, em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem). Exemplos das li- gações encontradas entre os domínios de ligação ao antígeno de um anticorpo de ocorrência natural (por exemplo, anticorpo de IgG de ocorrência natural) incluem ligações de dissulfeto na região de dobra- diça. As ligações entre os resíduos de aminoácido posicionados em uma região diferente da região de dobradiça podem ser ligações entre os resíduos de aminoácido dentro de um fragmento de anticorpo (por exemplo, Fab) e incluem ligações entre as cadeias pesadas (HH), liga- ções entre as cadeias leves (LL), e ligações entre as cadeias pesadas e leves (HL ou LH) (ver a Figura 1). Exemplos de resíduos de aminoá- cido na cadeia pesada ou leve a partir dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam incluem resíduos de ami- noácido nas posições acima mencionadas dentro da região variável (região VH ou região VL) ou dentro da região constante (região CH1, região de dobradiça ou região CL).

[00432] Em uma modalidade não limitativa, as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno podem se originar de vários resíduos de aminoácido presentes em posições separadas umas das outras na estrutura primária em pelo menos um de dois ou mais domínios de li- gação ao antígeno contidos em uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção. A distância entre os múltiplos resíduos de ami- noácido é uma distância que permite a obtenção das estruturas de dois ou mais domínios de ligação ao antígeno suficientemente próxi- mos como um resultado da ligação entre os domínios de ligação ao antígeno pelas ligações que se originam dos resíduos de aminoácido. A distância entre os múltiplos resíduos de aminoácido pode ser, por exemplo, 4 aminoácidos ou mais, 5 aminoácidos ou mais, 6 aminoáci- dos ou mais, 7 aminoácidos ou mais, 8 aminoácidos ou mais, 9 ami- noácidos ou mais, 10 aminoácidos ou mais, 11 aminoácidos ou mais, 12 aminoácidos ou mais, 13 aminoácidos ou mais, 14 aminoácidos ou mais, 15 aminoácidos ou mais, 20 aminoácidos ou mais, 25 aminoáci- dos ou mais, 30 aminoácidos ácidos ou mais, 35 aminoácidos ou mais, 40 aminoácidos ou mais, 45 aminoácidos ou mais, 50 aminoácidos ou mais, 60 aminoácidos ou mais, 70 aminoácidos ou mais, 80 aminoáci- dos ou mais, 90 aminoácidos ou mais, 100 aminoácidos ou mais, 110 aminoácidos ou mais, 120 aminoácidos ou mais, 130 aminoácidos ou mais, 140 aminoácidos ou mais, 150 aminoácidos ou mais, 160 ami- noácidos ou mais, 170 aminoácidos ou mais, 180 aminoácidos ou mais, 190 aminoácidos ou mais, 200 aminoácidos ou mais, 210 ami- noácidos ou mais ou 220 aminoácidos ou mais.

[00433] Além disso, o número de ligações entre os domínios de li- gação ao antígeno e o número dos resíduos de aminoácido dos quais as ligações se originam são um número que permite a obtenção das estruturas de dois ou mais domínios de ligação ao antígeno suficien- temente próximos como um resultado da ligação entre os domínios de ligação ao antígeno pelas ligações. O número pode ser, por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais ou dez ou mais.

[00434] Em certas modalidades, contanto que as estruturas de dois ou mais domínios de ligação ao antígeno suficientemente próximos sejam alcançadas como um resultado da ligação entre os domínios de ligação ao antígeno por três ou mais ligações que, respectivamente, se originam de três ou mais resíduos de aminoácido no domínios de liga- ção ao antígeno, a distância na estrutura primária entre quaisquer dois resíduos de aminoácido selecionados a partir dos três resíduos de aminoácido pode ser de sete aminoácidos ou mais em pelo menos um par de resíduos de aminoácido e pode ser menor do que sete aminoá- cidos no restante dos pares de resíduos de aminoácido.

[00435] Em conexão com os domínios de ligação ao antígeno con- tidos nas moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção, "su-

ficientemente próximo" significa que dois ou mais domínios de ligação ao antígeno estão próximos na medida em que isso é suficiente para alcançar as funções (atividades) desejadas da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção. Exemplos das funções (atividades) desejadas incluem a atividade de manter duas moléculas de antígeno em posições espacialmente próximas; atividade de regulação da inte- ração entre duas moléculas de antígeno; atividade de promoção da ativação de um receptor por um ligante; atividade de promoção da re- ação catalítica de uma enzima com um substrato; atividade de promo- ção de interação entre uma célula que expressa um primeiro antígeno e uma célula que expressa um segundo antígeno; atividade de promo- ção de dano de uma célula alvo por uma célula com atividade citotóxi- ca (tal como uma célula T, célula NK, monócito, macrófago); atividade de regulação da ativação de duas moléculas de antígeno que são ati- vadas através da por associação entre si; e resistência à clivagem por protease das moléculas de ligação ao antígeno.

[00436] Em uma modalidade não limitativa, a ligação entre os do- mínios de ligação ao antígeno contidos em uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser uma ligação covalente ou uma ligação não covalente. A ligação covalente pode ser uma ligação covalente formada através da reticulação direta de um resíduo de ami- noácido em um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um resíduo de aminoácido de um segundo domínio de ligação ao antígeno, por exemplo, uma ligação de dissulfeto entre resíduos de cisteína. O resí- duo de aminoácido diretamente reticulado pode estar presente em um fragmento de anticorpo tal como Fab, ou dentro de uma região de do- bradiça.

[00437] Em outra modalidade, uma ligação covalente é formada através da reticulação de um resíduo de aminoácido em um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um resíduo de aminoácido de um segundo domínio de ligação ao antígeno por meio de um agente de reticulação. Por exemplo, quando um agente de reticulação reativo com amina é utilizado para reticulação, a reticulação pode ser feita através de um grupo amino livre do aminoácido N-terminal do domínio de ligação ao antígeno, ou uma amina primária da cadeia lateral de uma lisina resíduo no domínio de ligação ao antígeno. Os agentes de reticulação reativos com amina incluem um grupo funcional que forma uma ligação química com uma amina primária, tal como isotiocianato, isocianato, acil azida, éster NHS, cloreto de sulfonils, aldeído, glioxal, epóxido, oxirano, carbonato, haleto de arila, éster de imida, carbodii- mida, anidrido e fluoroéster. Exemplos representativos incluem DSG (glutarato de dissuccinimidila), DSS (suberato de dissuccinimidila), BS3 (suberato de bis (sulfossuccinimidila)), DSP (ditiobis(propionato de succinimidila)), DTSSP (3,3'-ditiobis(propionato de sulfossuccinimi- dila)), DST (tartarato de dissuccinimidila), BSOCOES (bis(2- (succinimidooxicarbonilóxi)etil)sulfona), EGS (etileno glicol bis(succinato de succinimidila)), Sulfo-EGS (etileno glicol bis(succinato de sulfossuccinimidila)), DMA (dimetil adipimidato), DMP (dimetil pi- melimidato), DMS (dimetil suberimidato) e DFDNB (1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Exemplos de outros agentes de reticulação incluem agentes de reticulação reativos a carboxila/amina, reativos a sulfidrila, reativos a aldeído e reativos à luz.

[00438] A ligação não covalente para ligar os domínios de ligação ao antígeno pode ser uma ligação iônica, ligação de hidrogênio ou li- gação hidrofóbica.

[00439] Se o número de ligações entre os domínios de ligação ao antígeno é maior do que o de uma molécula de ligação ao antígeno de controle (por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno tendo uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anti- corpo de ocorrência natural), pode ser avaliado, por exemplo, pelo se-

guinte método. Em primeiro lugar, uma molécula de ligação ao antíge- no de interesse e uma molécula de ligação ao antígeno de controle são tratadas com uma protease que corta o domínio de ligação ao an- tígeno (por exemplo, uma protease que cliva o lado N-terminal do sítio de reticulação das regiões de dobradiça tal como papaína e Lys-C) e depois submetidas à eletroforese não redutora. Em seguida, um anti- corpo que reconhece uma parte do domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo marcado com HRP de cadeia anti-capa) é uti- lizado para detectar fragmentos que estão presentes após o tratamen- to com protease. Quando apenas um monômero do domínio de liga- ção ao antígeno (por exemplo, monômero Fab) é detectado para a mo- lécula de ligação ao antígeno de controle e um multímero do domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, dímero Fab) é detectado para a ligação ao antígeno molécula de interesse, então pode ser avaliado que o número das ligações entre os domínios de ligação ao antígeno da molécula de ligação ao antígeno de interesse é maior do que aque- le da molécula de ligação ao antígeno de controle.

[00440] A formação de uma ligação de dissulfeto entre cisteínas em uma molécula de ligação ao antígeno modificada produzida pela intro- dução de cisteínas em uma molécula de ligação ao antígeno de con- trole pode ser avaliada, por exemplo, pelo seguinte método. Em pri- meiro lugar, uma molécula de ligação ao antígeno de interesse é incu- bada com quimiotripsina em tampão de fosfato 20 mM (pH 7,0) e, em seguida, a massa de peptídeos que se espera que sejam gerados a partir da sequência de aminoácido de cada anticorpo é detectada por LC/MS. Se um componente que corresponde à massa teórica de um peptídeo que deve ser gerado quando as cisteínas introduzidas recen- temente formam uma ligação de dissulfeto for detectado, as cisteínas introduzidas podem ser avaliadas como tendo formado uma ligação de dissulfeto. Além do mais, se este componente se tornar indetectável quando a amostra contendo a molécula de ligação ao antígeno menci- onada acima for analisada após a adição de um agente para reduzir as ligações dissulfeto (por exemplo, tris(2-carboxietil)fosfina) na amostra, a exatidão da avaliação acima será ainda fortemente verificada. Resistência à clivagem por protease

[00441] Em uma modalidade não limitativa, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção possui resistência à clivagem por protease. Em certas modalidades, a resistência à clivagem por pro- tease da molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é au- mentada em comparação com uma molécula de ligação ao antígeno de controle (por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno tendo uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anti- corpo de ocorrência natural) onde o número de ligações entre os do- mínios de ligação ao antígeno é menor em um ou mais em compara- ção com a molécula de ligação ao antígeno. Em uma outra modalida- de, uma ligação menor pode ser selecionada de ligações em que os resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam são derivados de resíduos de amino- ácido com mutação que não estão presentes em uma região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem (por exemplo, resíduos de cisteína que não estão presentes na região Fab ou de dobradiça do tipo selvagem). Se a proporção da molécula de comprimento total (por exemplo, molé- cula de IgG de comprimento total) remanescente após o tratamento com protease for aumentada, ou a proporção de um fragmento particu- lar (por exemplo, monômero Fab) produzido após o tratamento com protease for reduzida para um antígeno molécula de ligação em com- paração com uma molécula de ligação ao antígeno de controle, então pode ser avaliado que a resistência à clivagem por protease é aumen- tada (a resistência à protease é melhorada).

[00442] Em certas modalidades, a proporção da molécula de com-

primento total remanescente após o tratamento com protease pode ser, em relação a todas as moléculas de ligação ao antígeno, por exemplo, 0,5% ou mais, 1% ou mais, 1,5% ou mais, 2% ou mais, 2,5% ou mais, 3% ou mais, 3,5% ou mais, 4% ou mais, 4,5% ou mais, 5% ou mais, 7,5% ou mais, 10% ou mais, 12,5% ou mais, 15% ou mais, 20% ou mais, 25% ou mais, 30% ou mais, 35% ou mais, 40% ou mais, 45% ou mais ou 50% ou mais. Em certas outras modalidades, a pro- porção de um monômero de um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, Fab) produzido após o tratamento com protease pode ser, em relação a todas as moléculas de ligação ao antígeno, por exemplo, 99% ou menos, 98% ou menos, 97% ou menos, 96% ou menos, 95% ou menos, 94% ou menos, 93% ou menos, 92% ou menos, 91% ou menos, 90% ou menos, 85% ou menos, 80% ou menos, 75% ou me- nos, 70% ou menos, 60% ou menos, 50% ou menos, 40% ou menos, 30% ou menos, 20% ou menos ou 10% ou menos. Em certas outras modalidades, a proporção de um dímero de um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, Fab) produzido após o tratamento com pro- tease pode ser, em relação a todas as moléculas de ligação ao antí- geno, por exemplo, 0,5% ou mais, 1% ou mais, 1,5% ou mais, 2% ou mais, 2,5% ou mais, 3% ou mais, 3,5% ou mais, 4% ou mais, 4,5% ou mais, 5% ou mais, 7,5% ou mais, 10% ou mais, 12,5% ou mais, 15% ou mais, 20% ou mais, 25% ou mais, 30% ou mais, 35% ou mais, 40% ou mais, 45% ou mais ou 50% ou mais.

[00443] Exemplos de proteases incluem, mas não são limitados a estes, Lys-C, plasmina, elastase de neutrófilos humanos (HNE) e pa- paína.

[00444] Em um outro aspecto, uma molécula de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades acima pode incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, conforme descrito nas Seções 1 a 7 abaixo:

1. Afinidade da Molécula de Ligação ao Antígeno

[00445] Em certas modalidades, uma molécula de ligação ao antí- geno aqui fornecida possui uma constante de dissociação (KD) de 1 micro M ou menos, 100 nM ou menos, 10 nM ou menos, 1 nM ou me- nos, 0,1 nM ou menos, 0,01 nM ou menos ou 0,001 nM ou menos (por exemplo, 10 a 8 M ou menos, por exemplo, de 10 a 8 M a 10 a 13 M, por exemplo, de 10 a 9 M a 10 a 13 M).

2. Fragmentos de Anticorpo

[00446] Em certas modalidades, uma molécula de ligação ao antí- geno aqui fornecida é um fragmento de anticorpo. Os fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados a estes, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv e fragmentos scFv e outros fragmentos aqui descritos. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, ver Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Pra uma revisão de fragmentos scFv, vêr, por exemplo, Pluckthün, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodi- es, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); ver também WO 93/16185; e Patente U.S. Nos.

5.571.894 e 5.587.458. Para a argumentação dos fragmentos Fab e F(ab')2 compreendendo resíduos de epítopo de ligação ao receptor de recuperação e tendo meia-vida in vivo aumentada, ver a Patente U.S. No. 5.869.046.

[00447] Diacorpos são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Ver, por exemplo, EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Triabodies e tetrabodies também são descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

3. Anticorpos Quiméricos e Humanizados

[00448] Em certas modalidades, uma molécula de ligação ao antí- geno aqui fornecida é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos qui-

méricos são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um ca- mundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em outro exemplo, um anti- corpo quimérico é um anticorpo de "classe comutada" em que a classe ou subclasse foi alterada daquela do anticorpo precursor. Os anticor- pos quiméricos incluem seus fragmentos de ligação ao antígeno.

[00449] Em certas modalidades, um anticorpo quimérico é um anti- corpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humani- zado para reduzir a imunogenicidade para os seres humanos, enquan- to retém a especificidade e afinidade do anticorpo não humano precur- sor. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis em que HVRs, por exemplo, CDRs, (ou partes das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano, e FRs (ou par- tes das mesmas) são derivadas de sequências de anticorpos huma- nos. Um anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma parte de uma região constante humana. Em algumas modalidades, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especifici- dade ou afinidade do anticorpo.

4. Anticorpos Humanos

[00450] Em certas modalidades, uma molécula de ligação ao antí- geno aqui fornecida é um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na técni- ca. Os anticorpos humanos são descritos de uma forma geral em van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) e

Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

5. Moléculas de Ligação ao Antígeno Derivadas de Biblioteca

[00451] As moléculas de ligação ao antígeno da invenção podem ser isoladas por rastreamento de bibliotecas combinatórias para molé- culas de ligação ao antígeno com a atividade ou atividades desejadas. Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida na técnica para gerar bibliotecas de exibição de fago e rastreamento de tais bibliotecas para moléculas de ligação ao antígeno que possuem as características de ligação desejadas. Tais métodos são revisados, por exemplo, em Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) e ainda descritos, por exemplo, em McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161- 175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

6. Moléculas de Ligação ao Antígeno Multiespecíficas

[00452] Em certas modalidades, uma molécula de ligação ao antí- geno aqui fornecida é uma molécula de ligação ao antígeno multiespe- cífica, por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica. As moléculas de ligação ao antígeno multiespecíficas são moléculas monoclonais de ligação ao antígeno que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois locais diferentes. Em certas modalida- des, uma das especificidades de ligação é para um antígeno particular (por exemplo, CD3) e a outra é para qualquer outro antígeno (por exemplo, CD28 ou antígeno de câncer). Em certas modalidades, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas podem se ligar a dois epítopos diferentes em um único antígeno. As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas podem ser preparadas como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos.

[00453] Técnicas para a constituição de moléculas de ligação ao antígeno multiespecíficas incluem, mas não são limitadas a estas, co- expressão recombinante de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina com especificidades diferentes (ver Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, e Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), e engenharia "knob-in-hole" (ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.731.168). As moléculas de ligação ao antígeno multiespecíficas também podem ser constituídas por enge- nharia de efeitos de direção eletrostática para a produção de molécu- las heterodiméricas Fc de anticorpo (WO 2009/089004A1); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (ver, por exemplo, Patente US No. 4.676.980, e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); utilizan- do zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (ver, por exemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); utili- zando tecnologia "diacorpo" para produzir fragmentos de anticorpo bi- específico (ver, por exemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); e utilizando dímeros Fv de cadeia simples (scFv) (ver, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)); e a preparação de anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

[00454] Anticorpos projetados com três ou mais sítios de ligação de antígeno funcional, incluindo "anticorpos de Octopus", também são incluídos nessa invenção (ver, por exemplo, a US 2006/0025576A1).

7. Variantes de Moléculas de Ligação ao Antígeno

[00455] Em certas modalidades, as variantes da sequência de ami- noácido das moléculas de ligação ao antígeno fornecidas nesta inven- ção são contempladas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas da molécula de ligação ao antígeno. As variantes da sequência de aminoácido de uma molécula de ligação ao antígeno podem ser preparadas através da introdução de modificações apropriadas na sequência de nucleotí- deo que codifica a molécula de ligação ao antígeno ou através da sín- tese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, supres- sões e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das se- quências de aminoácido da molécula de ligação ao antígeno. Qualquer combinação de supressão, inserção e substituição pode ser feita para chegar ao construto final, contanto que o construto final possua as ca- racterísticas desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno. a) Variantes de Substituição, Inserção e Supressão

[00456] Em certas modalidades, são fornecidas variantes da molé- cula de ligação ao antígeno tendo uma ou mais substituições de ami- noácido. Os sítios de interesse para mutagênese substitucional inclu- em os HVRs e os FRs. As substituições conservativas são mostradas na tabela abaixo sob o título de "substituições preferidas". Mudanças mais substanciais são fornecidas na tabela sob o título de "substitui- ções exemplares", e como ainda descrito abaixo, com referência às classes de cadeia lateral de aminoácidos. As substituições de aminoá- cidos podem ser introduzidas em uma molécula de ligação ao antígeno de interesse e os produtos rastreados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação ao antígeno retida/melhorada, imunogenicidade diminuída ou ADCC ou CDC melhorado. Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn

Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine Leu Leu (L) Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

[00457] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com pro- priedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídico: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

[00458] As substituições não conservativas implicarão na troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[00459] Um tipo de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de uma molécula de ligação ao antígeno precursora (por exemplo, um anticorpo humaniza- do ou humano). Geralmente, as variantes resultantes selecionadas para estudo posterior terão modificações (por exemplo, melhorias) em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) em relação à molécula de ligação ao antí- geno precursora e/ou terão certas propriedades biológicas substanci- almente retidas da molécula de ligação ao antígeno precursora. Uma variante de substituição exemplar é um anticorpo maturado por afini- dade, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, utilizando técnicas de maturação por afinidade baseadas na exibição de fago, tais como aquelas aqui descritas. Resumidamente, um ou mais resí- duos de HVR são modificados e os anticorpos variantes exibidos no fago e rastreados com relação a uma atividade biológica particular (por exemplo, afinidade de ligação).

[00460] Alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para melhorar a afinidade da molécula de li- gação ao antígeno. Tais alterações podem ser feitas em "pontos de acesso" de HVR, isto é, resíduos codificados por códons que sofrem mutação em alta frequência durante o processo de maturação somáti- ca (ver, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), e/ou resíduos que colocam em contato o antígeno com a vari- ante resultante VH ou VL sendo testada quanto à afinidade de ligação. A maturação de afinidade por construção e resseleção de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al. in Me- thods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). Em algumas modalidades de maturação por afi- nidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis selecionados para maturação através de qualquer um de uma variedade de métodos (por exemplo, PCR sujeito a erros, rearranjo de cadeia ou mutagênese direcionada por oligonucleotídeo). Uma biblioteca secundária é então criada. A biblioteca é então rastreada para identificar quaisquer varian- tes de molécula de ligação ao antígeno com a afinidade desejada. Ou- tro método para introduzir diversidade envolve abordagens direciona-

das a HVR, nas quais vários resíduos de HVR (por exemplo, 4 a 6 re- síduos de cada vez) são randomizados. Os resíduos de HVR envolvi- dos na ligação ao antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, utilizando mutagênese ou modelagem de varredura de alanina. CDR-H3 e CDR-L3 em particular são frequentemente direcio- nados.

[00461] Em certas modalidades, substituições, inserções ou su- pressões podem ocorrer dentro de um ou mais HVRs, contanto que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade da molé- cula de ligação ao antígeno para se ligar ao antígeno. Por exemplo, alterações conservativas (por exemplo, substituições conservativas como aqui fornecidas) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Tais alterações podem, por exemplo, estar fora dos resíduos de contato com o antígeno nas HVRs. Em certas modalidades das sequências variantes de VH e VL fornecidas acima, cada HVR está inalterado ou contém não mais do que uma, duas ou três substituições de aminoácido.

[00462] Um método útil para a identificação de resíduos ou regiões de uma molécula de ligação ao antígeno que pode ser direcionada pa- ra mutagênese é denominado "mutagênese de varredura de alanina", conforme descrito por Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys e glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou carrega- do negativamente (por exemplo, alanina ou polialanina) para determi- nar se a interação da molécula de ligação ao antígeno com o antígeno é afetada. Substituições adicionais podem ser introduzidas nos locais de aminoácido demonstrando sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativamente, ou adicionalmente, uma estrutura de cristal de um complexo de antígenos e uma molécula de ligação ao antígeno pode ser analisada para identificar pontos de contato entre a molécula de ligação ao antígeno e o antígeno. Esses resíduos de contato e re- síduos adjacentes podem ser direcionados ou eliminados como candi- datos para substituição. As variantes podem ser rastreadas para de- terminar se contêm as propriedades desejadas.

[00463] As inserções de sequência de aminoácido incluem fusões de amino- e/ou carboxil-terminal que variam no comprimento de um resíduo com os polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, assim como inserções intrassequências de resíduos de aminoácido únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem uma molécula de ligação ao antígeno com um resíduo metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de ligação ao antígeno incluem a fusão de uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida plasmática da molécula de ligação ao antí- geno para o N- ou C-terminal da molécula de ligação ao antígeno. b) Variantes de glicosilação

[00464] Em certas modalidades, uma molécula de ligação ao antí- geno fornecida nesta invenção é alterada para aumentar ou diminuir a extensão em que a molécula de ligação ao antígeno é glicosilada. A adição ou supressão de sítios de glicosilação a uma molécula de liga- ção ao antígeno pode ser convenientemente executada através da al- teração da sequência de aminoácido de tal modo que um ou mais lo- cais de glicosilação sejam criados ou removidos.

[00465] Quando a molécula de ligação ao antígeno compreende uma região Fc, o carboidrato a ela ligado pode ser alterado. Anticorpos nativos produzidos por células de mamífero tipicamente compreendem um oligossacarídeo biantenário ramificado que é geralmente ligado por uma ligação N a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Ver, por exemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil gluco-

samina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, assim como uma fucose ligada a um GlcNAc na "haste" da estrutura do oligossacarídeo biante- nário. Em algumas modalidades, as modificações do oligossacarídeo em uma molécula de ligação ao antígeno da invenção podem ser fei- tas a fim de criar variantes da molécula de ligação ao antígeno com certas propriedades melhoradas.

[00466] Em uma modalidade, as variantes da molécula de ligação ao antígeno são fornecidas tendo uma estrutura de carboidrato que carece de fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Por exemplo, a quantidade de fucose em tal molécula de ligação ao antí- geno pode ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada através do cálculo da quantidade média de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas anexadas a Asn297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e de alta manose) con- forme medido pela espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito na WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 refere-se ao resí- duo de asparagina localizado próximo da posição 297 na região Fc (numeração da EU dos resíduos da região Fc); no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de +/- 3 aminoácidos a montan- te ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a pequenas variações de sequência nas moléculas de ligação ao antígeno. Essas variantes de fucosilação podem ter função de ADCC melhorada. Ver, por exemplo, Publicações de Patente US Nos. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Exemplos de publicações relacionadas com variantes de moléculas de ligação ao antígeno "desfucosiladas" ou "deficientes em fucose" incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US

2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir moléculas de ligação ao antígeno desfucosiladas incluem células de CHO Lec13 deficientes em fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; e WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares neutraliza- das, tais como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células de CHO neutralizadas (ver, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bio- eng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680- 688 (2006); e WO2003/085107).

[00467] Variantes da molécula de ligação ao antígeno são ainda fornecidas com oligossacarídeos divididos em duas partes, por exem- plo, em que um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc da mo- lécula de ligação ao antígeno é dividido em duas parte por GlcNAc. Tais variantes da molécula de ligação ao antígeno podem ter fucosila- ção reduzida e/ou função de ADCC melhorada. Exemplos de tais vari- antes de anticorpos são descritos, por exemplo, na WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente US No. 6.602.684 (Umana et al.); e US 2005/0123546 (Umana et al.). Variantes da molécula de ligação ao an- tígeno com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc também são fornecidas. Tais variantes da molécula de ligação ao antígeno podem ter função de CDC melhorada. Tais va- riantes da molécula de ligação ao antígeno são descritas, por exemplo, nas WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); e WO 1999/22764 (Raju, S.). c) Variantes da região Fc

[00468] Em certas modalidades, uma ou mais modificações de ami-

noácido podem ser introduzidas na região Fc de uma molécula de li- gação ao antígeno fornecida nesta invenção, gerando assim uma vari- ante da região Fc. A variante da região Fc pode compreender uma se- quência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácido.

[00469] Em certas modalidades, a invenção contempla uma varian- te da molécula de ligação ao antígeno que possui algumas, mas não todas as funções efetoras, o que a torna um candidato desejável para aplicações em que a meia-vida da molécula de ligação ao antígeno in vivo é importante, embora certas funções efetoras (tais como comple- mento e ADCC) sejam desnecessárias ou deletérias. Os ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confir- mar a redução/depleção das atividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, os ensaios de ligação ao receptor Fc (FcR) podem ser con- duzidos para garantir que a molécula de ligação ao antígeno careça de ligação Fc gama R (portanto, provavelmente sem atividade ADCC), mas retém a capacidade de ligação a FcRn. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas Fc gama RIII, enquanto os monócitos expressam Fc gama RI, Fc gama RII e Fc gama RIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabe- la 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457- 492 (1991). Exemplos não limitativos de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Paten- te U.S. No. 5.500.362 (ver, por exemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) e Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5.821.337 (ver Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (ver, por exemplo,

ensaio de citotoxicidade não radioativa ACT1TM para citometria de flu- xo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; e CytoTox 96 (marca re- gistrada) ensaio de citotoxicidade não radioativa (Promega, Madison, WI). Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononu- cleares do sangue periférico (PBMC) e células exterminadoras natu- rais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o divulgado em Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Os ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que a molécula de ligação ao an- tígeno é incapaz de se ligar a C1q e, portanto, não possui atividade de CDC. Ver, por exemplo, ELISA de ligação C1q e C3c nas WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do comple- mento, um ensaio de CDC pode ser executado (ver, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); e Cragg, M.S. and M.J. Glen- nie, Blood 103:2738-2743 (2004)). A ligação de FcRn e as determina- ções de depuração/meia-vida in vivo também podem ser executadas utilizando métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).

[00470] As moléculas de ligação ao antígeno com função efetora reduzida incluem aquelas com substituição de um ou mais dos resí- duos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente U.S. No. 6.737.056). Tais mutantes Fc incluem mutantes Fc com substitui- ções em duas ou mais posições de aminoácido 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o assim chamado mutante Fc "DANA" com substituição dos resíduos 265 e 297 em alanina (Patente US No. 7.332.581).

[00471] Certas variantes da molécula de ligação ao antígeno com ligação aumentada ou diminuída a FcRs são descritas. (Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 6.737.056; WO 2004/056312 e Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001)).

[00472] Em certas modalidades, uma variante da molécula de liga- ção ao antígeno compreende uma região Fc com uma ou mais substi- tuições de aminoácido que melhoram a ADCC, por exemplo, substitui- ções nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração da EU de resíduos).

[00473] Em algumas modalidades, são feitas alterações na região Fc que resultam em ligação de C1q alterada (isto é, aumentada ou di- minuída) e/ou Citotoxicidade Dependente do Complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na Patente US No. 6.194.551, WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

[00474] Anticorpos com meia-vida aumentada e ligação aumentada ao receptor Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), são descritos na US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições que aumentam a liga- ção da região Fc ao FcRn. Tais variantes Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais dos resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição do re- síduo da região Fc 434 (Patente US No. 7.371.826).

[00475] Ver também Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente U.S. No. 5.648.260; Patente U.S. No. 5.624.821; e WO 94/29351 em relação a outros exemplos de variantes da região Fc. d) Variantes da molécula de ligação ao antígeno projetadas com ciste- ína

[00476] Em certas modalidades, pode ser desejável criar moléculas de ligação ao antígeno projetadas com cisteína, por exemplo, "thi- oMAbs", em que um ou mais resíduos de uma molécula de ligação ao antígeno são substituídos por resíduos de cisteína. Nas modalidades particulares, os resíduos substituídos ocorrem em locais acessíveis da molécula de ligação ao antígeno. Ao substituir esses resíduos por cis- teína, os grupos tiol reativos são posicionados em locais acessíveis da molécula de ligação ao antígeno e podem ser utilizados para conjugar a molécula de ligação ao antígeno com outros componentes, tais como componentes de fármaco ou componentes de ligante-fármaco, para criar um imunoconjugado, conforme descrito mais adiante. Em certas modalidades, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração da EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração da EU) da região Fc de cadeia pesada. As moléculas de ligação ao antí- geno projetadas com cisteína podem ser geradas conforme descrito, por exemplo, na Patente U.S. Nº 7.521.541. e) Derivados de Moléculas de Ligação ao Antígeno

[00477] Em certas modalidades, uma molécula de ligação ao antí- geno fornecida nesta invenção pode ser ainda modificada para conter componentes não protéicos adicionais que são conhecidos na técnica e facilmente disponíveis. Os componentes adequados para derivação da molécula de ligação ao antígeno incluem, mas não são limitados a estes, polímeros solúveis em água. Exemplos não limitativos de polí- meros solúveis em água incluem, mas não são limitados a estes, polie- tileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, car- boximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli- 1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido ma- leico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de polipropileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de eti- leno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e suas misturas. O propionaldeído de polietileno glicol pode apresentar vantagens na fabricação devido à sua estabilidade em água. O políme- ro pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ra- mificado. O número de polímeros ligados à molécula de ligação ao an- tígeno pode variar e, se mais do que um polímero estiver ligado, eles podem ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não limitando às proprie- dades ou funções particulares da molécula de ligação ao antígeno a serem melhoradas, se o derivado da molécula de ligação ao antígeno irá ser utilizado em uma terapia sob condições definidas, etc.

[00478] Em conexão com uma molécula de ligação ao antígeno na presente invenção, exemplos da propriedade desejada (atividade) po- dem incluir, mas não são particularmente limitados a estes, atividade de ligação, atividade neutralizante, atividade citotóxica, atividade ago- nista, atividade antagonista e atividade enzimática. A atividade agonis- ta é uma atividade de transdução intracelular de sinais, por exemplo, através da ligação de um anticorpo a um antígeno tal como um recep- tor, para induzir mudança em alguma atividade fisiológica. Exemplos da atividade fisiológica podem incluir, mas não são limitados a estes, atividade proliferativa, atividade de sobrevivência, atividade de diferen- ciação, atividade de transcrição, atividade de transporte de membrana, atividade de ligação, atividade proteolítica, atividade de fosforila- ção/desfosforilação, atividade oxirredução, atividade de transferência, atividade nucleolítica, atividade de desidratação, atividade de indução de morte celular e atividade de indução de apoptose.

[00479] Em outra modalidade, conjugados de uma molécula de li- gação ao antígeno e um componente não protéico que pode ser seleti- vamente aquecido através da exposição à radiação são fornecidos. Em uma modalidade, o componente não protéico é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605

(2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda e in- clui, mas não está limitada aos comprimentos de onda que não preju- dicam as células comuns, mas que aquecem o componente não pro- téico em uma temperatura na qual as células proximais à molécula de ligação ao antígeno-componente não protéico são neutralizadas. B. Métodos e Composições Recombinantes

[00480] As moléculas de ligação ao antígeno podem ser produzidas utilizando métodos e composições recombinantes, por exemplo, con- forme descrito na Patente U.S. No. 4.816.567. Em uma modalidade, o ácido nucleico isolado que codifica uma molécula de ligação ao antí- geno na presente invenção (um polipeptídeo compreendendo um do- mínio de ligação ao antígeno aqui descrito) é fornecido. Tal ácido nu- cleico pode codificar uma sequência de aminoácido compreendendo o VL e/ou uma sequência de aminoácido compreendendo o VH da mo- lécula de ligação ao antígeno (por exemplo, as cadeias leves e/ou pe- sadas da molécula de ligação ao antígeno). Em uma outra modalida- de, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) compre- endendo esse ácido nucleico são fornecidos. Em uma outra modalida- de, uma célula hospedeira compreendendo esse ácido nucleico é for- necida. Em uma tal modalidade, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido que com- preende o VL da molécula de ligação ao antígeno e uma sequência de aminoácido compreendendo o VH da molécula de ligação ao antígeno, ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifi- ca uma sequência de aminoácido compreendendo o VL da molécula de ligação ao antígeno e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido compreendendo o VH da molécula de ligação ao antígeno. Em uma modalidade, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula de ovário de hams-

ter chinês (CHO) ou célula linfóide (por exemplo, célula Y0, NS0, Sp2/0). Em uma modalidade, é fornecido um método de produção de uma molécula de ligação ao antígeno na presente invenção, em que o método compreende o cultivo de uma célula hospedeira compreen- dendo um ácido nucleico que codifica a molécula de ligação ao antí- geno, conforme fornecido acima, sob condições adequadas para a ex- pressão da molécula de ligação ao antígeno e, opcionalmente, recupe- ração da molécula de ligação ao antígeno da célula hospedeira (ou meio de cultura da célula hospedeira).

[00481] Para a produção recombinante de uma molécula de ligação ao antígeno na presente invenção, o ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação ao antígeno, por exemplo, como descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ou expressão em uma célula hospedeira. Tal ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencio- nais (por exemplo, através do uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as ca- deias pesadas e leves da molécula de ligação ao antígeno).

[00482] As células hospedeiras adequadas para clonagem ou ex- pressão de vetores que codificam moléculas de ligação ao antígeno incluem células procarióticas ou eucarióticas aqui descritas. Por exemplo, as moléculas de ligação ao antígeno podem ser produzidas em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmentos de anti- corpos e polipeptídeos em bactérias, ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.648.237, 5.789.199 e 5.840.523. (Ver também Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, descrevendo a expressão de frag- mentos de anticorpo em E. coli.). Após a expressão, a molécula de li- gação ao antígeno pode ser isolada da pasta de células bacterianas em uma fração solúvel e pode ser posteriormente purificada.

[00483] Além de procariotas, micróbios eucarióticos tais como fun- gos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou ex- pressão adequados para vetores que codificam moléculas de ligação ao antígenos, incluindo cepas de fungos e leveduras cujas vias de gli- cosilação foram "humanizadas", resultando na produção de uma molé- cula de ligação ao antígeno com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Ver Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), e Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

[00484] As células hospedeiras adequadas para a expressão da molécula de ligação ao antígeno glicosilada também são derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Nume- rosas cepas baculovirais foram identificadas, as quais podem ser utili- zadas em conjunto com células de inseto, particularmente para trans- fecção de células de Spodoptera frugiperda.

[00485] As culturas de células vegetais também podem ser utiliza- das como hospedeiros. Ver, por exemplo, as Patentes US Nos.

5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIESTM para a produção de moléculas de liga- ção ao antígeno em plantas transgênicas).

[00486] As células de vertebrados também podem ser utilizadas como hospedeiros. Por exemplo, as linhagens celulares de mamíferos que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Ou- tros exemplos de linhas de células hospedeiras de mamífero úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 como des- crito, por exemplo, em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); célu- las de rim de hamster bebê (BHK); células de Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Re-

prod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); Células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervi- cal humano (HELA); células renais caninas (MDCK); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células hepáticas humanas (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, como descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens celulares hospedeiras de mamífero úteis inclu- em células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR- CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); e linhagens celulares de mieloma tais como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens celulares hospedeiras de mamí- feros adequadas para a produção de moléculas de ligação ao antíge- no, ver, por exemplo, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). C. Ensaios

[00487] As moléculas de ligação ao antígeno fornecidas nesta in- venção podem ser identificadas, rastreadas ou caracterizadas por su- as propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica.

1. Ensaios de ligação e outros ensaios

[00488] Em um aspecto, uma molécula de ligação ao antígeno na presente invenção é testada quanto à sua atividade de ligação ao an- tígeno, por exemplo, por métodos conhecidos, tais como ELISA, Wes- tern blot, etc.

2. Ensaios de atividade

[00489] Em um aspecto, os ensaios são fornecidos para identificar moléculas de ligação ao antígeno das mesmas tendo atividade biológi- ca. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, atividade de manter duas moléculas de antígeno em posições espacialmente próximas, atividade de regulação da interação entre duas moléculas de antígeno, atividade de promoção da ativação de um receptor por um ligante, ati- vidade de promoção da reação catalítica de uma enzima com um substrato, promoção da interação entre uma célula que expressa um primeiro antígeno e uma célula que expressa um segundo antígeno, atividade de promoção de dano de uma célula alvo por uma célula com atividade citotóxica (por exemplo, uma célula T, célula NK, monó- cito ou macrófago), atividade de regulação da ativação de duas molé- culas de antígeno que são ativadas através da associação entre si e resistência à clivagem por protease. Moléculas de ligação ao antígeno tendo tal atividade biológica in vivo e/ou in vitro também são forneci- das.

[00490] Além disso, uma molécula de ligação ao antígeno na pre- sente invenção pode exercer várias atividades biológicas, dependendo do tipo de uma molécula de antígeno à qual a molécula de ligação ao antígeno se liga. Exemplos de tais moléculas de ligação ao antígeno incluem uma molécula de ligação ao antígeno que se liga a um com- plexo de receptor de células T (TCR) (por exemplo, CD3) e possui ati- vidade de indução da ativação de células T (atividade agonista); e uma molécula de ligação ao antígeno que se liga a uma molécula da super- família de receptores de TNF (por exemplo, OX40 ou 4-1BB) ou de outras moléculas coestimuladoras (por exemplo, CD28 ou ICOS) e possui atividade de promoção da ativação acima mencionada (ativida- de agonista). Em certas modalidades, essa atividade biológica exerci- da através da ligação a uma molécula de antígeno é aumentada ou diminuída pela ligação de dois ou mais domínios de ligação ao antíge- no compreendidos na molécula de ligação ao antígeno na presente invenção. Sem ser limitado pela teoria, em certas modalidades, tal aumento ou diminuição pode ser alcançado porque a interação entre duas ou mais moléculas de antígeno é regulada através da ligação à molécula de ligação ao antígeno na presente invenção (por exemplo, a associação entre duas ou mais moléculas de antígeno é promovida).

[00491] Em certas modalidades, uma molécula de ligação ao antí- geno da invenção é testada com relação a essa atividade biológica. Se duas moléculas de antígeno são mantidas espacialmente próximas, pode ser avaliada utilizando técnicas tais como análise de estrutura de cristal, microscopia eletrônica e análise estrutural baseada em tomo- grafia eletrônica de um complexo composto de antígenos e uma molé- cula de ligação ao antígeno. Se dois domínios de ligação ao antígeno estão espacialmente próximos um do outro ou se a mobilidade de dois domínios de ligação a antígeno é reduzida, também pode ser avaliada pelas técnicas acima mencionadas. Em particular, quanto a técnicas para analisar a estrutura tridimensional de moléculas de IgG utilizando tomografia eletrônica, ver, por exemplo, Zhang et al., Sci. Rep. 5:9803 (2015). Na tomografia de elétrons, a frequência de ocorrência de estru- turas que uma molécula objeto pode formar pode ser mostrada por his- togramas, permitindo a avaliação distributiva de mudanças estruturais, tais como a mobilidade reduzida de domínios. Por exemplo, quando a conexão entre valores que podem ser obtidos por parâmetros relacio- nados à estrutura, tal como distância e ângulo entre dois domínios, e sua frequência de ocorrência é mostrada por histogramas, pode-se determinar que a mobilidade dos dois domínios é diminuída se suas áreas de distribuição forem reduzidas. A atividade exercida por meio da interação de duas moléculas de antígeno pode ser avaliada através da seleção e uso de um sistema de medição de atividade apropriado a partir daqueles conhecidos de acordo com o tipo de moléculas de an- tígeno alvo. O efeito na clivagem por protease pode ser avaliado utili- zando métodos conhecidos por aqueles pelos versados na técnica ou métodos descritos nos Exemplos abaixo.

D. Formulações Farmacêuticas (Composições Farmacêuticas)

[00492] As formulações farmacêuticas de uma molécula de ligação ao antígeno, conforme descrito nesta invenção, são preparadas pela mistura dessa molécula de ligação ao antígeno tendo o grau de pureza desejado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis op- cionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações empregadas e incluem, mas não são limitados a estes: tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascór- bico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetil- benzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; ressorcinol; cicloexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelati- na ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolido- na; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidra- tos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbi- tol; contraíons formadores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iôni- cos, tais como polietileno glicol (PEG). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplares incluem ainda agentes de dispersão de fárma- cos intersticiais, tais como glicoproteínas de hialuronidase neutra-ativa solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialuronidase PH-20 solúveis humanas, tais como rHuPH20 (HYLENEX (marca re- gistrada), Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplares e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritas nas Publicações de Patente US Nos. 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.

[00493] As formulações liofilizadas exemplares de molécula de liga- ção ao antígeno são descritas na Patente US No. 6.267.958. As formu- lações aquosas de molécula de ligação ao antígeno incluem aquelas descritas na Patente US No. 6.171.586 e WO2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão de acetato de histidina.

[00494] A formulação aqui também pode conter mais de um ingre- diente ativo conforme necessário para a indicação particular a ser tra- tada, de preferência aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente entre si. Tais ingredientes ativos estão adequa- damente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

[00495] Os ingredientes ativos podem ser capturados em microcáp- sulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou atra- vés da polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, na- nopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

[00496] As preparações de liberação prolongada podem ser prepa- radas. Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo a molécula de ligação ao antígeno, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas.

[00497] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente alcan- çada, por exemplo, por meio da filtração através de membranas de filtração estéreis. Exemplos

[00498] O que se segue são exemplos de moléculas de ligação ao antígeno e métodos da presente invenção. Ficará entendido que várias outras modalidades podem ser praticadas, dada a descrição geral for- necida acima. Exemplo 1: Conceito de anticorpo reticulado por Fab

[00499] Os anticorpos agonistas são superiores em propriedades tais como estabilidade, farmacocinética e métodos de produção, em comparação com os ligantes naturais e suas proteínas de fusão, e seu desenvolvimento farmacêutico está em andamento. No entanto, em geral, os anticorpos agonistas com forte atividade são mais difíceis de obter do que os simples anticorpos de ligação ou neutralização. Uma solução para este problema está, portanto, sendo procurada.

[00500] As propriedades necessárias para um anticorpo agonista podem depender do tipo de ligante. Para anticorpos agonistas contra a superfamília de receptores de TNF, tipificados por receptor de morte (DR), OX40, 4-1BB, CD40 e semelhantes, foi relatado que a multimeri- zação do anticorpo ou ligante contribui para a ativação. Como técnicas para aumentar este efeito, o uso de ligantes naturais, reticulação por anticorpos anti-Fc, reticulação por meio de FcγRs, multimerização de domínios de ligação ao anticorpo, multimerização por meio de anticor- po Fc, e semelhantes, foram relatados de aumentar a atividade ago- nista. Também é conhecido que, para certos tipos de antígenos, o ajuste da distância dos sítios de ligação ao antígeno utilizando a estru- tura Fab do anticorpo ou scFv leva ao aumento da atividade agonista independentemente da multimerização.

[00501] Como outra técnica, um anticorpo agonista contra um re-

ceptor de citocina que é um anticorpo biespecífico capaz de se ligar a diferentes epítopos dentro do mesmo antígeno foi relatado. Além do mais, um método para melhorar a atividade agonista utilizando conju- gação química para reticular dois Fabs diferentes de uma maneira se- melhante foi relatado.

[00502] Mais métodos além dos mencionados acima para melhorar a atividade de anticorpos agonistas são desejados. No entanto, ne- nhum método simples para conseguir isso foi relatado. Assim, os in- ventores desenvolveram um método para reticular Fabs entre si atra- vés da introdução de mutações mínimas e demonstraram que isso re- almente aumentava a atividade agonista, completando assim a inven- ção. Uma modalidade exemplificativa é mostrada na Fig. 1. Exemplo 2: Produção de vetores de expressão para anticorpos modifi- cados e expressão e purificação de anticorpos modificados

[00503] Um gene de anticorpo inserido em um vetor de expressão para células animais foi submetido à substituição da sequência de re- síduos de aminoácido por um método conhecido da pessoa versada na técnica utilizando PCR, o kit de clonagem In-Fusion Advantage PCR (TAKARA), ou semelhante, para construir um vetor de expressão para um anticorpo modificado. A sequência de nucleotídeo do vetor de expressão resultante foi determinada por um método conhecido da pessoa versada na técnica. O vetor de expressão produzido foi intro- duzido transitoriamente em células FreeStyle293® ou Expi293® (Invi- trogen) e as células foram deixadas expressar o anticorpo modificado no sobrenadante de cultura. O anticorpo modificado foi purificado a partir do sobrenadante de cultura obtido por um método conhecido da pessoa versada na técnica utilizando rProtein A Sepharose® Fast Flow (GE Healthcare). A absorbância em 280 nm foi medida utilizando um espectrofotômetro. Um coeficiente de absorção foi calculado a partir do valor medido utilizando o método PACE e utilizado para calcular a concentração de anticorpo (Protein Science 1995;4:2411-2423).

[00504] A quantidade de agregados do anticorpo modificado foi analisada por um método conhecido da pessoa versada na técnica uti- lizando Agilent 1260 Infinity® (Agilent Technologies) para HPLC e G3000SWXL (TOSOH) como uma coluna de cromatografia de filtração em gel. A concentração do anticorpo purificado foi de 0,1 mg/ml, e 10 μl do anticorpo foram injetados.

[00505] Os anticorpos preparados por este método (anticorpos anti- CD3ε, anticorpos anti-CD28 e anticorpos biespecíficos anti-CD3ε x an- ti-CD28) são mostrados na Tabela 1. Tabela 1 Nomes de anticorpos, SEQ ID NOs Nome do anticorpo SEQ ID NO: Cadeia pe- Cadeia le- Cadeia pe- Cadeia le- sada 1 ve 1 sada 2 ve 2 CD3-G4s 1 10 - - CD3-G4sHH 2 10 - - CD3-G4sLL 1 11 - - CD3-G1s 4 10 - - OKT3-G1s 5 12 - - CD28-G1 6 13 - - CD3-G1sLL 4 11 - - CD3-G1sHH 7 10 - - CD3//CD28-G1s 4 10 6 13 CD3//CD28-G1sLL 4 11 6 14 CD3//CD28-G1sHH 7 10 9 13 CD3//CD28-G1sLH 4 11 9 13 CD3//CD28-G1sHL 7 10 6 14 OKT3//CD28-G1s 5 12 6 13 OKT3//CD28-G1sHH 8 12 9 13 OKT3//CD28-G1sHL 8 12 6 14 HH: a posição 191 (numeração da EU) foi alterada para Cys nas duas regiões constantes de cadeia H

LL: a posição 126 (numeração da EU) foi alterada para Cys nas duas regiões constantes de cadeia L HL, LH: a posição 191 (numeração da EU) foi alterada para Cys em uma região constante de cadeia H, e a posição 126 (numeração da EU) foi alterada para Cys em uma região constante de cadeia L Exemplo 3: Preparação de anticorpos biespecíficos

[00506] O anticorpo purificado foi dialisado em tampão TBS (WA- KO) e sua concentração foi ajustada para 1 mg/ml. Como um tampão de reação 10x, 2-MEA (SIGMA) 250 mM foi preparado. Dois anticor- pos homodiméricos diferentes preparados no Exemplo 2 foram mistu- rados em quantidades iguais. A esta mistura, um volume 1/10 do tam- pão de reação 10x foi adicionado e misturado. A mistura foi deixada repousar a 37 °C durante 90 minutos. Após a reação, a mistura foi dia- lisada em TBS para obter uma solução de um anticorpo biespecífico em que os dois anticorpos diferentes acima foram heterodimerizados. A concentração de anticorpo foi medida pelo método acima menciona- do e o anticorpo foi submetido a experiências subsequentes. Exemplo 4: Avaliação da atividade agonista Exemplo 4-1 Preparação de suspensão de células Jurkat

[00507] Células Jurkat (células efetoras TCR/CD3 (NFAT), Prome- ga) foram coletadas de frascos. As células foram lavadas com tampão de ensaio (meio RPMI 1640 (Gibco), 10% de FBS (HyClone), 1% de aminoácidos não essenciais MEM (Invitrogen) e piruvato de sódio 1 mM (Invitrogen)) e, em seguida, colocadas em suspensão em 3 x 106 células/ml em Tampão de Ensaio. Esta suspensão de células Jurkat foi submetida a experiências subsequentes. Exemplo 4-2 Preparação de solução de reagente de luminescência

[00508] 100 ml de Bio-Glo Luciferase Assay Buffer (Promega) foram adicionados ao frasco de Bio-Glo Luciferase Assay Substrate (Prome- ga) e misturados por inversão. O frasco foi protegido da luz e congela- do a -20 °C. Esta solução reagente de luminescência foi submetida a experimentos subsequentes. Exemplo 4-3 Ensaio de ativação de células T

[00509] A ativação de células T através da sinalização de agonista foi avaliada com base na alteração da dobra da luminescência da luci- ferase. As células Jurkat acima mencionadas são células transforma- das com um gene repórter de luciferase tendo uma sequência respon- siva a NFAT. Quando as células são estimuladas por um anticorpo an- ti-TCR/CD3, a via de NFAT é ativada por meio de sinalização intrace- lular, induzindo assim a expressão da luciferase. A suspensão de célu- las Jurkat preparada conforme descrito acima foi adicionada a uma placa branca de fundo plano de 384 cavidades a 10 μl por cavidade (3 x 104 células/cavidade). Em seguida, a solução de anticorpo prepara- da em cada concentração (150, 15, 1,5, 0,15, 0,015, 0,0015, 0,00015, 0,000015 nM) foi adicionada em 20 μl por cavidade. Esta placa foi dei- xada repousar em uma incubadora de CO2 a 5% em 37 °C durante 24 horas. Após a incubação, a solução do reagente de luminescência foi descongelada e 30 μl da solução foram adicionados a cada cavidade. A placa foi então deixada repousar na temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência de luciferase em cada cavidade da placa foi medida utilizando um luminômetro.

[00510] Como um resultado, as moléculas modificadas com uma ligação de dissulfeto adicional que liga o Fab-Fab do anticorpo anti- CD3ε apresentaram sinalização mediada por CD3 variada em compa- ração com a molécula do tipo selvagem (molécula não modificada) como mostrado nas Figs. 2 e 3. Além disso, como mostrado nas Figs. 4 e 5, as moléculas modificadas de um anticorpo biespecífico compos- to por um anticorpo anti-CD3ε e um anticorpo anti-CD28 com uma li- gação de dissulfeto adicional que liga o Fab-Fab também mostraram sinalização mediada por CD3 e/ou CD28 amplamente variada em comparação com a molécula do tipo selvagem.

[00511] Estes resultados sugerem que a introdução de modifica- ções da presente invenção pode aumentar ou diminuir a atividade agonista possuída por moléculas de ligação ao antígeno, tais como anticorpos. Exemplo 5: Avaliação de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições na cadeia pesada Exemplo 5-1 Avaliação de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições na cadeia pesada

[00512] A região variável e a região constante de cadeia pesada de um anticorpo de neutralização IL6R anti-humano, MRA (cadeia pesa- da: MRAH-G1T4 (SEQ ID NO: 15), cadeia leve: MRAL-k0 (SEQ ID NO: 16)) foram submetidas a um estudo em que um resíduo de ami- noácido arbitrário estruturalmente exposto à superfície foi substituído por cisteína.

[00513] Os resíduos de aminoácidos dentro da região variável de cadeia pesada de MRA (MRAH, SEQ ID NO: 17) foram substituídos por cisteína para produzir variantes da região variável de cadeia pesa- da de MRA mostradas na Tabela 2. Estas variantes da região variável de cadeia pesada de MRA foram cada um ligados à região constante de cadeia pesada de MRA (G1T4, SEQ ID NO: 18) para produzir vari- antes de cadeia pesada de MRA, e os vetores de expressão que codi- ficam os genes correspondentes foram produzidos por um método co- nhecido da pessoa versada na técnica.

[00514] Além disso, os resíduos de aminoácido dentro da região constante de cadeia pesada de MRA (G1T4, SEQ ID NO: 18) foram substituídos por cisteína para produzir variantes da região constante de cadeia pesada de MRA mostrada na Tabela 3. Estas variantes da região constante de cadeia pesada de MRA foram ligadas à região va- riável de cadeia pesada de MRA (MRAH, SEQ ID NO: 17) para produ- zir variantes de cadeia pesada de MRA, e os vetores de expressão que codificam os genes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

[00515] As variantes de cadeia pesada de MRA produzidas acima foram combinadas com a cadeia leve de MRA. As variantes de MRA resultantes mostradas na Tabela 4 foram expressas através da ex- pressão transitória utilizando células FreeStyle293 (Invitrogen) ou célu- las Expi293 (Life technologies) por um método conhecido da pessoa versada na técnica e purificadas com Proteína A por um método co- nhecido da pessoa versada na técnica. Tabela 2 Variantes da região variável de cadeia pesada de MRA e posição da substituição de cisteína Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada de MRA teína (numeração de Kabat) NO: MRAH.Q5C 5 21 MRAH.E6C 6 22 MRAH.S7C 7 23 MRAH.G8C 8 24 MRAH.P9C 9 25 MRAH.G10C 10 26 MRAH.L11C 11 27 MRAH.V12C 12 28 MRAH.R13C 13 29 MRAH.P14C 14 30 MRAH.S15C 15 31 MRAH.Q16C 16 32 MRAH.T17C 17 33 MRAH.L18C 18 34 MRAH.S19C 19 35 MRAH.L20C 20 36 MRAH.T21C 21 37 MRAH.T23C 23 38

Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada de MRA teína (numeração de Kabat) NO: MRAH.S25C 25 39 MRAH.G26C 26 40 MRAH.S28C 28 41 MRAH.T30C 30 42 MRAH.R66C 66 43 MRAH.V67C 67 44 MRAH.T68C 68 45 MRAH.L70C 70 46 MRAH.D72C 72 47 MRAH.T73C 73 48 MRAH.S74C 74 49 MRAH.K75C 75 50 MRAH.N76C 76 51 MRAH.Q77C 77 52 MRAH.S79C 79 53 MRAH.L80C 80 54 MRAH.R81C 81 55 MRAH.L82C 82 56 MRAH.S82aC 82a 57 MRAH.S82bC 82b 58 MRAH.V82cC 82c 59 MRAH.S112C 112 60 MRAH.S113C 113 61 MRAH.S31C 31 62 MRAH.W35C 35 63 MRAH.S35aC 35a 64 MRAH.Y50C 50 65 MRAH.I51C 51 66 MRAH.S52C 52 67 MRAH.S62C 62 68 MRAH.L63C 63 69

Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada de MRA teína (numeração de Kabat) NO: MRAH.K64C 64 70 MRAH.S65C 65 71 MRAH.D101C 101 72 MRAH.Y102C 102 73

Tabela 3 Variantes da região constante de cadeia pesada de MRA e posição da substituição de cisteína Variante da região constante Posição da substituição de SEQ ID de cadeia pesada de MRA cisteína (numeração da EU) NO: G1T4.A118C 118 74 G1T4.S119C 119 75 G1T4.T120C 120 76 G1T4.K121C 121 77 G1T4.G122C 122 78 G1T4.P123C 123 79 G1T4.S124C 124 80 G1T4.V125C 125 81 G1T4.F126C 126 82 G1T4.P127C 127 83 G1T4.S131C 131 84 G1T4.S132C 132 85 G1T4.K133C 133 86 G1T4.S134C 134 87 G1T4.T135C 135 88 G1T4.S136C 136 89 G1T4.G137C 137 90 G1T4.G138C 138 91 G1T4.T139C 139 92 G1T4.A140C 140 93 G1T4.A141C 141 94

Variante da região constante Posição da substituição de SEQ ID de cadeia pesada de MRA cisteína (numeração da EU) NO: G1T4.D148C 148 95 G1T4.Y149C 149 96 G1T4.F150C 150 97 G1T4.P151C 151 98 G1T4.E152C 152 99 G1T4.P153C 153 100 G1T4.V154C 154 101 G1T4.T155C 155 102 G1T4.V156C 156 103 G1T4.S157C 157 104 G1T4.W158C 158 105 G1T4.N159C 159 106 G1T4.S160C 160 107 G1T4.G161C 161 108 G1T4.A162C 162 109 G1T4.L163C 163 110 G1T4.T164C 164 111 G1T4.S165C 165 112 G1T4.G166C 166 113 G1T4.V167C 167 114 G1T4.V173C 173 115 G1T4.L174C 174 116 G1T4.Q175C 175 117 G1T4.S176C 176 118 G1T4.S177C 177 119 G1T4.G178C 178 120 G1T4.L179C 179 121 G1T4.Y180C 180 122 G1T4.V186C 186 123 G1T4.T187C 187 124 G1T4.V188C 188 125

Variante da região constante Posição da substituição de SEQ ID de cadeia pesada de MRA cisteína (numeração da EU) NO: G1T4.P189C 189 126 G1T4.S190C 190 127 G1T4.S191C 191 128 G1T4.S192C 192 129 G1T4.L193C 193 130 G1T4.G194C 194 131 G1T4.T195C 195 132 G1T4.Q196C 196 133 G1T4.T197C 197 134 G1T4.Y198C 198 135 G1T4.I199C 199 136 G1T4.N201C 201 137 G1T4.V202C 202 138 G1T4.N203C 203 139 G1T4.H204C 204 140 G1T4.K205C 205 141 G1T4.P206C 206 142 G1T4.S207C 207 143 G1T4.N208C 208 144 G1T4.T209C 209 145 G1T4.K210C 210 146 G1T4.V211C 211 147 G1T4.D212C 212 148 G1T4.K213C 213 149 G1T4.R214C 214 150 G1T4.V215C 215 151 G1T4.E216C 216 152 G1T4.P217C 217 153 G1T4.K218C 218 154 G1T4.S219C 219 155

Tabela 4 Variantes de MRA SEQ ID NO: Nome do anticorpo Região va- Região Região va- Região riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada leve MRAH.Q5C-G1T4 21 18 19 20 MRAH.E6C-G1T4 22 18 19 20 MRAH.S7C-G1T4 23 18 19 20 MRAH.G8C-G1T4 24 18 19 20 MRAH.P9C-G1T4 25 18 19 20 MRAH.G10C-G1T4 26 18 19 20 MRAH.L11C-G1T4 27 18 19 20 MRAH.V12C-G1T4 28 18 19 20 MRAH.R13C-G1T4 29 18 19 20 MRAH.P14C-G1T4 30 18 19 20 MRAH.S15C-G1T4 31 18 19 20 MRAH.Q16C-G1T4 32 18 19 20 MRAH.T17C-G1T4 33 18 19 20 MRAH.L18C-G1T4 34 18 19 20 MRAH.S19C-G1T4 35 18 19 20 MRAH.L20C-G1T4 36 18 19 20 MRAH.T21C-G1T4 37 18 19 20 MRAH.T23C-G1T4 38 18 19 20 MRAH.S25C-G1T4 39 18 19 20 MRAH.G26C-G1T4 40 18 19 20 MRAH.S28C-G1T4 41 18 19 20 MRAH.T30C-G1T4 42 18 19 20 MRAH.R66C-G1T4 43 18 19 20 MRAH.V67C-G1T4 44 18 19 20 MRAH.T68C-G1T4 45 18 19 20 MRAH.L70C-G1T4 46 18 19 20

SEQ ID NO: Nome do anticorpo Região va- Região Região va- Região riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada leve MRAH.D72C-G1T4 47 18 19 20 MRAH.T73C-G1T4 48 18 19 20 MRAH.S74C-G1T4 49 18 19 20 MRAH.K75C-G1T4 50 18 19 20 MRAH.N76C-G1T4 51 18 19 20 MRAH.Q77C-G1T4 52 18 19 20 MRAH.S79C-G1T4 53 18 19 20 MRAH.L80C-G1T4 54 18 19 20 MRAH.R81C-G1T4 55 18 19 20 MRAH.L82C-G1T4 56 18 19 20 MRAH.S82aC-G1T4 57 18 19 20 MRAH.S82bC-G1T4 58 18 19 20 MRAH.V82cC-G1T4 59 18 19 20 MRAH.S112C-G1T4 60 18 19 20 MRAH.S113C-G1T4 61 18 19 20 MRAH.S31C-G1T4 62 18 19 20 MRAH.W35C-G1T4 63 18 19 20 MRAH.S35aC-G1T4 64 18 19 20 MRAH.Y50C-G1T4 65 18 19 20 MRAH.I51C-G1T4 66 18 19 20 MRAH.S52C-G1T4 67 18 19 20 MRAH.S62C-G1T4 68 18 19 20 MRAH.L63C-G1T4 69 18 19 20 MRAH.K64C-G1T4 70 18 19 20 MRAH.S65C-G1T4 71 18 19 20 MRAH.D101C-G1T4 72 18 19 20 MRAH.Y102C-G1T4 73 18 19 20 MRAH-G1T4.A118C 17 74 19 20

SEQ ID NO: Nome do anticorpo Região va- Região Região va- Região riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada leve MRAH-G1T4.S119C 17 75 19 20 MRAH-G1T4.T120C 17 76 19 20 MRAH-G1T4.K121C 17 77 19 20 MRAH-G1T4.G122C 17 78 19 20 MRAH-G1T4.P123C 17 79 19 20 MRAH-G1T4.S124C 17 80 19 20 MRAH-G1T4.V125C 17 81 19 20 MRAH-G1T4.F126C 17 82 19 20 MRAH-G1T4.P127C 17 83 19 20 MRAH-G1T4.S131C 17 84 19 20 MRAH-G1T4.S132C 17 85 19 20 MRAH-G1T4.K133C 17 86 19 20 MRAH-G1T4.S134C 17 87 19 20 MRAH-G1T4.T135C 17 88 19 20 MRAH-G1T4.S136C 17 89 19 20 MRAH-G1T4.G137C 17 90 19 20 MRAH-G1T4.G138C 17 91 19 20 MRAH-G1T4.T139C 17 92 19 20 MRAH-G1T4.A140C 17 93 19 20 MRAH-G1T4.A141C 17 94 19 20 MRAH-G1T4.D148C 17 95 19 20 MRAH-G1T4.Y149C 17 96 19 20 MRAH-G1T4.F150C 17 97 19 20 MRAH-G1T4.P151C 17 98 19 20 MRAH-G1T4.E152C 17 99 19 20 MRAH-G1T4.P153C 17 100 19 20 MRAH-G1T4.V154C 17 101 19 20 MRAH-G1T4.T155C 17 102 19 20

SEQ ID NO: Nome do anticorpo Região va- Região Região va- Região riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada leve MRAH-G1T4.V156C 17 103 19 20 MRAH-G1T4.S157C 17 104 19 20 MRAH-G1T4.W158C 17 105 19 20 MRAH-G1T4.N159C 17 106 19 20 MRAH-G1T4.S160C 17 107 19 20 MRAH-G1T4.G161C 17 108 19 20 MRAH-G1T4.A162C 17 109 19 20 MRAH-G1T4.L163C 17 110 19 20 MRAH-G1T4.T164C 17 111 19 20 MRAH-G1T4.S165C 17 112 19 20 MRAH-G1T4.G166C 17 113 19 20 MRAH-G1T4.V167C 17 114 19 20 MRAH-G1T4.V173C 17 115 19 20 MRAH-G1T4.L174C 17 116 19 20 MRAH-G1T4.Q175C 17 117 19 20 MRAH-G1T4.S176C 17 118 19 20 MRAH-G1T4.S177C 17 119 19 20 MRAH-G1T4.G178C 17 120 19 20 MRAH-G1T4.L179C 17 121 19 20 MRAH-G1T4.Y180C 17 122 19 20 MRAH-G1T4.V186C 17 123 19 20 MRAH-G1T4.T187C 17 124 19 20 MRAH-G1T4.V188C 17 125 19 20 MRAH-G1T4.P189C 17 126 19 20 MRAH-G1T4.S190C 17 127 19 20 MRAH-G1T4.S191C 17 128 19 20 MRAH-G1T4.S192C 17 129 19 20 MRAH-G1T4.L193C 17 130 19 20

SEQ ID NO: Nome do anticorpo Região va- Região Região va- Região riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada leve MRAH-G1T4.G194C 17 131 19 20 MRAH-G1T4.T195C 17 132 19 20 MRAH-G1T4.Q196C 17 133 19 20 MRAH-G1T4.T197C 17 134 19 20 MRAH-G1T4.Y198C 17 135 19 20 MRAH-G1T4.I199C 17 136 19 20 MRAH-G1T4.N201C 17 137 19 20 MRAH-G1T4.V202C 17 138 19 20 MRAH-G1T4.N203C 17 139 19 20 MRAH-G1T4.H204C 17 140 19 20 MRAH-G1T4.K205C 17 141 19 20 MRAH-G1T4.P206C 17 142 19 20 MRAH-G1T4.S207C 17 143 19 20 MRAH-G1T4.N208C 17 144 19 20 MRAH-G1T4.T209C 17 145 19 20 MRAH-G1T4.K210C 17 146 19 20 MRAH-G1T4.V211C 17 147 19 20 MRAH-G1T4.D212C 17 148 19 20 MRAH-G1T4.K213C 17 149 19 20 MRAH-G1T4.R214C 17 150 19 20 MRAH-G1T4.V215C 17 151 19 20 MRAH-G1T4.E216C 17 152 19 20 MRAH-G1T4.P217C 17 153 19 20 MRAH-G1T4.K218C 17 154 19 20 MRAH-G1T4.S219C 17 155 19 20

Exemplo 5-2. Avaliação da fragmentação Fab mediada por protease de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições na ca-

deia pesada

[00516] Utilizando uma protease que cliva a região de dobradiça de cadeia pesada do anticorpo para provocar a fragmentação Fab, as va- riantes de MRA produzidas no Exemplo 5-1 foram examinadas para verificar se adquiriram resistência à protease de modo que sua frag- mentação fosse inibida. A protease utilizada foi Lys-C (Endoproteinase Lys-C Sequencing Grade) (SIGMA; 11047825001). A reação foi execu- tada sob as condições de 2 ng/μl de protease, 100 μg/ml de anticorpo, 80% de Tris-HCl 25 mM pH 8,0, 20% de PBS e 35 °C durante duas horas, ou sob as condições de 2 ng/μl de protease, 20 μg/ml de anti- corpo, 80% de Tris-HCl 25 mM pH 8,0, 20% de PBS e 35 °C durante uma hora. A amostra foi então submetida à eletroforese capilar não redutora. Wes (Protein Simple) foi utilizada para eletroforese capilar, e um anticorpo de cadeia anti-capa marcado com HRP (abcam; ab46527) foi utilizado para detecção. Os resultados são mostrados nas Figs. 6 a 13. O tratamento com Lys-C de MRA provocou a clivagem da região de dobradiça de cadeia pesada, resultando no desaparecimento da faixa de IgG em cerca de 150 kDa e aparecimento da faixa de Fab em cerca de 50 kDa. Para as variantes de MRA produzidas no Exem- plo 5-1, algumas mostraram a faixa de dímero Fab aparecendo em cerca de 96 kDa e algumas mostraram a faixa de IgG não digerida de- tectada em cerca de 150 kDa após o tratamento com protease. A área de cada faixa obtida após o tratamento com protease foi enviada usando software exclusivo para Wes (Compass for SW; Protein Sim- ple) para calcular a porcentagem das áreas de faixa de IgG não digeri- da, dímero Fab, etc. A porcentagem calculada de cada faixa é mostra- da na Tabela 5.

Tabela 5 Nome do anticorpo IgG (%) Fab- Fab (%) Cadeia pe- Cadeia leve Fab (%) sada SEQ ID NO: SEQ ID NO: MRAH.Q5C-G1T4 0,2 1,5 97,6 21 16 MRAH.E6C-G1T4 0 0,3 80,7 22 16 MRAH.S7C-G1T4 0,4 1,9 96,9 23 16 MRAH.G8C-G1T4 16,6 1,1 76,7 24 16 MRAH.P9C-G1T4 0,2 1,5 97,2 25 16 MRAH.G10C-G1T4 0,6 1,9 96,9 26 16 MRAH.L11C-G1T4 0 1,2 98,3 27 16 MRAH.V12C-G1T4 0,2 1 97,6 28 16 MRAH.R13C-G1T4 0,6 1,9 96,6 29 16 MRAH.P14C-G1T4 0,3 1,7 97,7 30 16 MRAH.S15C-G1T4 0,9 1,3 81,4 31 16 MRAH.Q16C-G1T4 92,5 0 2 32 16 MRAH.T17C-G1T4 0,4 1,4 97,8 33 16 MRAH.L18C-G1T4 0,3 0,6 96,1 34 16 MRAH.S19C-G1T4 0,3 1,2 98,1 35 16 MRAH.L20C-G1T4 1 0,3 93,3 36 16 MRAH.T21C-G1T4 0,5 1 98,3 37 16 MRAH.T23C-G1T4 sem sem sem 38 16 dados dados dados MRAH.S25C-G1T4 0,3 2,8 87 39 16 MRAH.G26C-G1T4 0,4 1,7 85,5 40 16 MRAH.S28C-G1T4 98,6 0 0,2 41 16 MRAH.T30C-G1T4 0,5 0,7 97,8 42 16 MRAH.R66C-G1T4 0,2 1,2 97,9 43 16 MRAH.V67C-G1T4 0,3 0,4 97,8 44 16 MRAH.T68C-G1T4 0,2 1,4 97,7 45 16 MRAH.L70C-G1T4 0,2 0,9 98 46 16 MRAH.D72C-G1T4 0,3 0,8 97,6 47 16 MRAH.T73C-G1T4 0,5 0,9 97,7 48 16

Nome do anticorpo IgG (%) Fab- Fab (%) Cadeia pe- Cadeia leve Fab (%) sada SEQ ID NO: SEQ ID NO: MRAH.S74C-G1T4 97,1 0 0,3 49 16 MRAH.K75C-G1T4 0,1 1,5 97 50 16 MRAH.N76C-G1T4 0,4 0,4 93,1 51 16 MRAH.Q77C-G1T4 0,1 0,2 99,6 52 16 MRAH.S79C-G1T4 0,1 1,6 96,7 53 16 MRAH.L80C-G1T4 0,2 0 96,5 54 16 MRAH.R81C-G1T4 0 1,4 98 55 16 MRAH.L82C-G1T4 0 0 96,8 56 16 MRAH.S82aC-G1T4 0,6 1 96,7 57 16 MRAH.S82bC-G1T4 97,5 0 0,3 58 16 MRAH.V82cC-G1T4 0,1 0,3 95,6 59 16 MRAH.S112C-G1T4 0,1 1,1 97,6 60 16 MRAH.S113C-G1T4 0,1 2,8 95,9 61 16 MRAH.S31C-G1T4 0,5 2 75,7 62 16 MRAH.W35C-G1T4 0,1 0,3 91,1 63 16 MRAH.S35aC-G1T4 0 0,6 90,7 64 16 MRAH.Y50C-G1T4 0,2 1,5 95,8 65 16 MRAH.I51C-G1T4 0,2 0,8 94,4 66 16 MRAH.S52C-G1T4 0,3 1,7 96,4 67 16 MRAH.S62C-G1T4 0,2 1,1 97,6 68 16 MRAH.L63C-G1T4 0,4 1,4 94,2 69 16 MRAH.K64C-G1T4 0 1,6 91,7 70 16 MRAH.S65C-G1T4 0,3 1,7 95,6 71 16 MRAH.D101C-G1T4 0 1,2 97 72 16 MRAH.Y102C-G1T4 0,2 1,3 96,8 73 16 MRAH-G1T4.A118C 1,2 1 89 74 16 MRAH-G1T4.S119C 2,3 14 77,7 75 16 MRAH-G1T4.T120C 0 0,1 0,1 76 16 MRAH-G1T4.K121C 2,4 1,1 82,2 77 16 MRAH-G1T4.G122C 8 1,4 79,8 78 16

Nome do anticorpo IgG (%) Fab- Fab (%) Cadeia pe- Cadeia leve Fab (%) sada SEQ ID NO: SEQ ID NO: MRAH-G1T4.P123C 7,1 0 45,7 79 16 MRAH-G1T4.S124C 0,8 1,7 94,5 80 16 MRAH-G1T4.V125C 2,3 0 62 81 16 MRAH-G1T4.F126C 2,1 1 85,5 82 16 MRAH-G1T4.P127C 2,9 1,4 77,4 83 16 MRAH-G1T4.S131C 68,4 0 0 84 16 MRAH-G1T4.S132C 13,9 0,8 54,6 85 16 MRAH-G1T4.K133C 66,8 0 0 86 16 MRAH-G1T4.S134C 63,5 0 21,9 87 16 MRAH-G1T4.T135C 44,7 13,2 23,6 88 16 MRAH-G1T4.S136C 22,9 27,3 35,1 89 16 MRAH-G1T4.G137C 8,4 18,1 62,1 90 16 MRAH-G1T4.G138C sem sem sem 91 16 dados dados dados MRAH-G1T4.T139C 7,4 1,4 82,1 92 16 MRAH-G1T4.A140C 20,2 0 47,2 93 16 MRAH-G1T4.A141C 0,3 0 31,9 94 16 MRAH-G1T4.D148C 21 0 64,8 95 16 MRAH-G1T4.Y149C 0,5 0 58,1 96 16 MRAH-G1T4.F150C 79,2 0 0,4 97 16 MRAH-G1T4.P151C 2 0 56,1 98 16 MRAH-G1T4.E152C 0,9 0,3 84,8 99 16 MRAH-G1T4.P153C 4,4 0,8 86,6 100 16 MRAH-G1T4.V154C 4 0 45,7 101 16 MRAH-G1T4.T155C 20,2 1,4 67,6 102 16 MRAH-G1T4.V156C 7 0 39,2 103 16 MRAH-G1T4.S157C 13,5 3,2 75,9 104 16 MRAH-G1T4.W158C 4,2 0 66,1 105 16 MRAH-G1T4.N159C 13,9 1,9 76,1 106 16 MRAH-G1T4.S160C 7,7 20,9 66,2 107 16

Nome do anticorpo IgG (%) Fab- Fab (%) Cadeia pe- Cadeia leve Fab (%) sada SEQ ID NO: SEQ ID NO: MRAH-G1T4.G161C 14,1 12 68,6 108 16 MRAH-G1T4.A162C 9,6 17,9 65,8 109 16 MRAH-G1T4.L163C 10,2 6,1 75,9 110 16 MRAH-G1T4.T164C 3,8 3,2 88,7 111 16 MRAH-G1T4.S165C 7,8 4,1 81,5 112 16 MRAH-G1T4.G166C 4,5 2,2 89,4 113 16 MRAH-G1T4.V167C 5,5 2,5 81,2 114 16 MRAH-G1T4.V173C 2,1 1,6 92,2 115 16 MRAH-G1T4.L174C 19,8 0 67,1 116 16 MRAH-G1T4.Q175C 4,4 1,1 86,6 117 16 MRAH-G1T4.S176C 2,3 7,7 85,5 118 16 MRAH-G1T4.S177C 7,1 12,4 71,6 119 16 MRAH-G1T4.G178C 6,2 2,4 85,5 120 16 MRAH-G1T4.L179C 0,2 0 0 121 16 MRAH-G1T4.Y180C 0 0 72,7 122 16 MRAH-G1T4.V186C 0 0 73,3 123 16 MRAH-G1T4.T187C 0,8 2,5 90,3 124 16 MRAH-G1T4.V188C 0,3 4 82,7 125 16 MRAH-G1T4.P189C 0,9 4,7 89,6 126 16 MRAH-G1T4.S190C 10,9 0 74,4 127 16 MRAH-G1T4.S191C 2,3 46,4 45,1 128 16 MRAH-G1T4.S192C 1,3 11 83 129 16 MRAH-G1T4.L193C 3,6 0 70,5 130 16 MRAH-G1T4.G194C 13,8 0 0 131 16 MRAH-G1T4.T195C 29,6 0 57,3 132 16 MRAH-G1T4.Q196C 1,5 0 92,6 133 16 MRAH-G1T4.T197C 81,5 0 4,5 134 16 MRAH-G1T4.Y198C 0,1 0,3 17,1 135 16 MRAH-G1T4.I199C 1 1,7 91,6 136 16 MRAH-G1T4.N201C 0,7 4 90,3 137 16

Nome do anticorpo IgG (%) Fab- Fab (%) Cadeia pe- Cadeia leve Fab (%) sada SEQ ID NO: SEQ ID NO: MRAH-G1T4.V202C 0 0,1 6,6 138 16 MRAH-G1T4.N203C 0,6 2,4 89,8 139 16 MRAH-G1T4.H204C 0,4 2,2 77,7 140 16 MRAH-G1T4.K205C 0,2 2,3 85,5 141 16 MRAH-G1T4.P206C 0,4 2,1 86,9 142 16 MRAH-G1T4.S207C sem sem sem 143 16 dados dados dados MRAH-G1T4.N208C 0,4 0 86,2 144 16 MRAH-G1T4.T209C 0,7 0 83,1 145 16 MRAH-G1T4.K210C 0,6 0 81,7 146 16 MRAH-G1T4.V211C 0,3 1 67,6 147 16 MRAH-G1T4.D212C 1,1 1,8 80,9 148 16 MRAH-G1T4.K213C 6,5 0 41,9 149 16 MRAH-G1T4.R214C 18,6 0 42,7 150 16 MRAH-G1T4.V215C 0 0 11,8 151 16 MRAH-G1T4.E216C 7,4 0 64,8 152 16 MRAH-G1T4.P217C 4,5 0,2 43,3 153 16 MRAH-G1T4.K218C 30,8 0 29,5 154 16 MRAH-G1T4.S219C 46,9 0,1 18 155 16

[00517] A partir deste resultado, observou-se que a substituição de cisteína na região variável de cadeia pesada ou região constante de cadeia pesada melhorou a resistência à protease da região de dobra- diça de cadeia pesada nas variantes de MRA mostradas na Tabela 6. Alternativamente, o resultado sugeriu que um dímero Fab fosse for- mado por uma ligação covalente entre o Fab-Fab.

Tabela 6 Variantes de MRA SEQ ID NO: Nome do anticorpo Região Região Região Região variável de constante variável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia le- de cadeia sada pesada ve leve MRAH.G8C-G1T4 24 18 19 20 MRAH.Q16C-G1T4 32 18 19 20 MRAH.S28C-G1T4 41 18 19 20 MRAH.S74C-G1T4 49 18 19 20 MRAH.S82bC-G1T4 58 18 19 20 MRAH-G1T4.S119C 17 75 19 20 MRAH-G1T4.G122C 17 78 19 20 MRAH-G1T4.P123C 17 79 19 20 MRAH-G1T4.S131C 17 84 19 20 MRAH-G1T4.S132C 17 85 19 20 MRAH-G1T4.K133C 17 86 19 20 MRAH-G1T4.S134C 17 87 19 20 MRAH-G1T4.T135C 17 88 19 20 MRAH-G1T4.S136C 17 89 19 20 MRAH-G1T4.G137C 17 90 19 20 MRAH-G1T4.T139C 17 92 19 20 MRAH-G1T4.A140C 17 93 19 20 MRAH-G1T4.D148C 17 95 19 20 MRAH-G1T4.F150C 17 97 19 20 MRAH-G1T4.T155C 17 102 19 20 MRAH-G1T4.V156C 17 103 19 20 MRAH-G1T4.S157C 17 104 19 20 MRAH-G1T4.N159C 17 106 19 20 MRAH-G1T4.S160C 17 107 19 20 MRAH-G1T4.G161C 17 108 19 20 MRAH-G1T4.A162C 17 109 19 20

SEQ ID NO: Nome do anticorpo Região Região Região Região variável de constante variável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia le- de cadeia sada pesada ve leve MRAH-G1T4.L163C 17 110 19 20 MRAH-G1T4.S165C 17 112 19 20 MRAH-G1T4.V167C 17 114 19 20 MRAH-G1T4.L174C 17 116 19 20 MRAH-G1T4.S176C 17 118 19 20 MRAH-G1T4.S177C 17 119 19 20 MRAH-G1T4.G178C 17 120 19 20 MRAH-G1T4.S190C 17 127 19 20 MRAH-G1T4.S191C 17 128 19 20 MRAH-G1T4.S192C 17 129 19 20 MRAH-G1T4.G194C 17 131 19 20 MRAH-G1T4.T195C 17 132 19 20 MRAH-G1T4.T197C 17 134 19 20 MRAH-G1T4.K213C 17 149 19 20 MRAH-G1T4.R214C 17 150 19 20 MRAH-G1T4.E216C 17 152 19 20 MRAH-G1T4.K218C 17 154 19 20 MRAH-G1T4.S219C 17 155 19 20 Exemplo 6: Avaliação de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições na cadeia leve Exemplo 6-1. Avaliação de anticorpos com substituição de cisteína em várias posições na cadeia leve

[00518] A região variável da cadeia leve e a região constante de um anticorpo de neutralização anti-IL6R humano, MRA (cadeia pesada: MRAH-G1T4 (SEQ ID NO: 15), cadeia leve: MRAL-k0 (SEQ ID NO: 16)) foram submetidas a um estudo em que um resíduo de aminoácido arbitrário estruturalmente exposto à superfície foi substituído por ciste-

ína.

[00519] Os resíduos de aminoácido na região variável de cadeia leve de MRA (MRAL, SEQ ID NO: 19) foram substituídos por cisteína para produzir variantes da região variável da cadeia leve de MRA mos- trada na Tabela 7. Estas variantes da região variável da cadeia leve de MRA foram ligadas cada uma à região constante de cadeia leve de MRA (k0, SEQ ID NO: 20) para produzir variantes de cadeia leve de MRA, e os vetores de expressão que codificam os genes correspon- dentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

[00520] Além disso, os resíduos de aminoácido dentro da região constante de cadeia leve de MRA (k0, SEQ ID NO: 20) foram substitu- ídos por cisteína para produzir variantes da região constante de cadeia leve de MRA mostrada na Tabela 8. Estas variantes da região cons- tante de cadeia leve de MRA foram cada uma ligada à região variável de cadeia leve de MRA (MRAL, SEQ ID NO: 19) para produzir varian- tes de cadeia leve de MRA, e vetores de expressão que codificam os genes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

[00521] As variantes de cadeia leve de MRA produzidas acima fo- ram combinadas com a cadeia pesada de MRA. As variantes de MRA resultantes mostradas na Tabela 9 foram expressas através da ex- pressão transitória utilizando células FreeStyle293 (Invitrogen) ou célu- las Expi293 (Life technologies) por um método conhecido da pessoa versada na técnica, e purificadas com Proteína A por um método co- nhecido da pessoa versada na técnica.

Tabela 7 Variantes da região variável de cadeia leve de MRA e posição de substituição de cisteína Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia leve de MRA teína (numeração de Kabat) NO: MRAL.T5C 5 156 MRAL.Q6C 6 157 MRAL.S7C 7 158 MRAL.P8C 8 159 MRAL.S9C 9 160 MRAL.S10C 10 161 MRAL.L11C 11 162 MRAL.S12C 12 163 MRAL.A13C 13 164 MRAL.S14C 14 165 MRAL.V15C 15 166 MRAL.G16C 16 167 MRAL.D17C 17 168 MRAL.R18C 18 169 MRAL.V19C 19 170 MRAL.T20C 20 171 MRAL.I21C 21 172 MRAL.T22C 22 173 MRAL.G57C 57 174 MRAL.V58C 58 175 MRAL.P59C 59 176 MRAL.S60C 60 177 MRAL.R61C 61 178 MRAL.F62C 62 179 MRAL.S63C 63 180 MRAL.S65C 65 181 MRAL.S67C 67 182 MRAL.G68C 68 183 MRAL.T69C 69 184

Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia leve de MRA teína (numeração de Kabat) NO: MRAL.D70C 70 185 MRAL.T72C 72 186 MRAL.F73C 73 187 MRAL.T74C 74 188 MRAL.I75C 75 189 MRAL.S76C 76 190 MRAL.S77C 77 191 MRAL.L78C 78 192 MRAL.Q79C 79 193 MRAL.F98C 98 194 MRAL.G99C 99 195 MRAL.Q100C 100 196 MRAL.G101C 101 197 MRAL.T102C 102 198 MRAL.K103C 103 199 MRAL.V104C 104 200 MRAL.E105C 105 201 MRAL.I106C 106 202 MRAL.K107C 107 203 MRAL.A25C 25 204 MRAL.S26C 26 205 MRAL.Q27C 27 206 MRAL.Y32C 32 207 MRAL.L33C 33 208 MRAL.N34C 34 209 MRAL.Y50C 50 210 MRAL.T51C 51 211 MRAL.H55C 55 212 MRAL.S56C 56 213 MRAL.Y96C 96 214 MRAL.T97C 97 215

Tabela 8

Variantes da região constante de cadeia leve de MRA e posição de substituição de cisteína Variante da região cons- Posição da substituição de cis- SEQ ID tante de cadeia leve de teína (numeração da EU) NO:

MRA k0.R108C 108 216 k0.T109C 109 217 k0.V110C 110 218 k0.A111C 111 219 k0.A112C 112 220 k0.P113C 113 221 k0.S114C 114 222 k0.V115C 115 223 k0.F116C 116 224 k0.P120C 120 225 k0.S121C 121 226 k0.D122C 122 227 k0.E123C 123 228 k0.Q124C 124 229 k0.L125C 125 230 k0.K126C 126 231 k0.S127C 127 232 k0.G128C 128 233 k0.T129C 129 234 k0.A130C 130 235 k0.S131C 131 236 k0.L136C 136 237 k0.N137C 137 238 k0.N138C 138 239 k0.F139C 139 240 k0.Y140C 140 241 k0.P141C 141 242 k0.R142C 142 243

Variante da região cons- Posição da substituição de cis- SEQ ID tante de cadeia leve de teína (numeração da EU) NO:

MRA k0.E143C 143 244 k0.A144C 144 245 k0.K145C 145 246 k0.V146C 146 247 k0.Q147C 147 248 k0.W148C 148 249 k0.K149C 149 250 k0.V150C 150 251 k0.D151C 151 252 k0.N152C 152 253 k0.A153C 153 254 k0.L154C 154 255 k0.Q155C 155 256 k0.S156C 156 257 k0.G157C 157 258 k0.N158C 158 259 k0.S159C 159 260 k0.Q160C 160 261 k0.E161C 161 262 k0.S162C 162 263 k0.V163C 163 264 k0.T164C 164 265 k0.E165C 165 266 k0.Q166C 166 267 k0.D167C 167 268 k0.S168C 168 269 k0.K169C 169 270 k0.D170C 170 271 k0.S171C 171 272 k0.T172C 172 273

MRA k0.Y173C 173 274 k0.S174C 174 275 k0.L175C 175 276 k0.T180C 180 277 k0.L181C 181 278 k0.S182C 182 279 k0.K183C 183 280 k0.A184C 184 281 k0.D185C 185 282 k0.Y186C 186 283 k0.E187C 187 284 k0.K188C 188 285 k0.H189C 189 286 k0.K190C 190 287 k0.V191C 191 288 k0.Y192C 192 289 k0.A193C 193 290 k0.E195C 195 291 k0.V196C 196 292 k0.T197C 197 293 k0.H198C 198 294 k0.Q199C 199 295 k0.G200C 200 296 k0.L201C 201 297 k0.S202C 202 298 k0.S203C 203 299 k0.P204C 204 300 k0.V205C 205 301 k0.T206C 206 302 k0.K207C 207 303

MRA k0.S208C 208 304 k0.F209C 209 305 k0.N210C 210 306 k0.R211C 211 307 k0.G212C 212 308 k0.E213C 213 309 Tabela 9 Variantes de MRA SEQ ID NO: Nome do anticor- Região vari- Região cons- Região va- Região po ável de ca- tante de ca- riável de constante de deia pesada deia pesada cadeia leve cadeia leve MRAL.T5C-k0 17 18 156 20 MRAL.Q6C-k0 17 18 157 20 MRAL.S7C-k0 17 18 158 20 MRAL.P8C-k0 17 18 159 20 MRAL.S9C-k0 17 18 160 20 MRAL.S10C-k0 17 18 161 20 MRAL.L11C-k0 17 18 162 20 MRAL.S12C-k0 17 18 163 20 MRAL.A13C-k0 17 18 164 20 MRAL.S14C-k0 17 18 165 20 MRAL.V15C-k0 17 18 166 20 MRAL.G16C-k0 17 18 167 20 MRAL.D17C-k0 17 18 168 20 MRAL.R18C-k0 17 18 169 20 MRAL.V19C-k0 17 18 170 20 MRAL.T20C-k0 17 18 171 20 MRAL.I21C-k0 17 18 172 20

SEQ ID NO: Nome do anticor- Região vari- Região cons- Região va- Região po ável de ca- tante de ca- riável de constante de deia pesada deia pesada cadeia leve cadeia leve MRAL.T22C-k0 17 18 173 20 MRAL.G57C-k0 17 18 174 20 MRAL.V58C-k0 17 18 175 20 MRAL.P59C-k0 17 18 176 20 MRAL.S60C-k0 17 18 177 20 MRAL.R61C-k0 17 18 178 20 MRAL.F62C-k0 17 18 179 20 MRAL.S63C-k0 17 18 180 20 MRAL.S65C-k0 17 18 181 20 MRAL.S67C-k0 17 18 182 20 MRAL.G68C-k0 17 18 183 20 MRAL.T69C-k0 17 18 184 20 MRAL.D70C-k0 17 18 185 20 MRAL.T72C-k0 17 18 186 20 MRAL.F73C-k0 17 18 187 20 MRAL.T74C-k0 17 18 188 20 MRAL.I75C-k0 17 18 189 20 MRAL.S76C-k0 17 18 190 20 MRAL.S77C-k0 17 18 191 20 MRAL.L78C-k0 17 18 192 20 MRAL.Q79C-k0 17 18 193 20 MRAL.F98C-k0 17 18 194 20 MRAL.G99C-k0 17 18 195 20 MRAL.Q100C-k0 17 18 196 20 MRAL.G101C-k0 17 18 197 20 MRAL.T102C-k0 17 18 198 20 MRAL.K103C-k0 17 18 199 20 MRAL.V104C-k0 17 18 200 20 MRAL.E105C-k0 17 18 201 20

SEQ ID NO: Nome do anticor- Região vari- Região cons- Região va- Região po ável de ca- tante de ca- riável de constante de deia pesada deia pesada cadeia leve cadeia leve MRAL.I106C-k0 17 18 202 20 MRAL.K107C-k0 17 18 203 20 MRAL.A25C-k0 17 18 204 20 MRAL.S26C-k0 17 18 205 20 MRAL.Q27C-k0 17 18 206 20 MRAL.Y32C-k0 17 18 207 20 MRAL.L33C-k0 17 18 208 20 MRAL.N34C-k0 17 18 209 20 MRAL.Y50C-k0 17 18 210 20 MRAL.T51C-k0 17 18 211 20 MRAL.H55C-k0 17 18 212 20 MRAL.S56C-k0 17 18 213 20 MRAL.Y96C-k0 17 18 214 20 MRAL.T97C-k0 17 18 215 20 MRAL-k0.R108C 17 18 19 216 MRAL-k0.T109C 17 18 19 217 MRAL-k0.V110C 17 18 19 218 MRAL-k0.A111C 17 18 19 219 MRAL-k0.A112C 17 18 19 220 MRAL-k0.P113C 17 18 19 221 MRAL-k0.S114C 17 18 19 222 MRAL-k0.V115C 17 18 19 223 MRAL-k0.F116C 17 18 19 224 MRAL-k0.P120C 17 18 19 225 MRAL-k0.S121C 17 18 19 226 MRAL-k0.D122C 17 18 19 227 MRAL-k0.E123C 17 18 19 228 MRAL-k0.Q124C 17 18 19 229 MRAL-k0.L125C 17 18 19 230

SEQ ID NO: Nome do anticor- Região vari- Região cons- Região va- Região po ável de ca- tante de ca- riável de constante de deia pesada deia pesada cadeia leve cadeia leve MRAL-k0.K126C 17 18 19 231 MRAL-k0.S127C 17 18 19 232 MRAL-k0.G128C 17 18 19 233 MRAL-k0.T129C 17 18 19 234 MRAL-k0.A130C 17 18 19 235 MRAL-k0.S131C 17 18 19 236 MRAL-k0.L136C 17 18 19 237 MRAL-k0.N137C 17 18 19 238 MRAL-k0.N138C 17 18 19 239 MRAL-k0.F139C 17 18 19 240 MRAL-k0.Y140C 17 18 19 241 MRAL-k0.P141C 17 18 19 242 MRAL-k0.R142C 17 18 19 243 MRAL-k0.E143C 17 18 19 244 MRAL-k0.A144C 17 18 19 245 MRAL-k0.K145C 17 18 19 246 MRAL-k0.V146C 17 18 19 247 MRAL-k0.Q147C 17 18 19 248 MRAL-k0.W148C 17 18 19 249 MRAL-k0.K149C 17 18 19 250 MRAL-k0.V150C 17 18 19 251 MRAL-k0.D151C 17 18 19 252 MRAL-k0.N152C 17 18 19 253 MRAL-k0.A153C 17 18 19 254 MRAL-k0.L154C 17 18 19 255 MRAL-k0.Q155C 17 18 19 256 MRAL-k0.S156C 17 18 19 257 MRAL-k0.G157C 17 18 19 258 MRAL-k0.N158C 17 18 19 259

SEQ ID NO: Nome do anticor- Região vari- Região cons- Região va- Região po ável de ca- tante de ca- riável de constante de deia pesada deia pesada cadeia leve cadeia leve MRAL-k0.S159C 17 18 19 260 MRAL-k0.Q160C 17 18 19 261 MRAL-k0.E161C 17 18 19 262 MRAL-k0.S162C 17 18 19 263 MRAL-k0.V163C 17 18 19 264 MRAL-k0.T164C 17 18 19 265 MRAL-k0.E165C 17 18 19 266 MRAL-k0.Q166C 17 18 19 267 MRAL-k0.D167C 17 18 19 268 MRAL-k0.S168C 17 18 19 269 MRAL-k0.K169C 17 18 19 270 MRAL-k0.D170C 17 18 19 271 MRAL-k0.S171C 17 18 19 272 MRAL-k0.T172C 17 18 19 273 MRAL-k0.Y173C 17 18 19 274 MRAL-k0.S174C 17 18 19 275 MRAL-k0.L175C 17 18 19 276 MRAL-k0.T180C 17 18 19 277 MRAL-k0.L181C 17 18 19 278 MRAL-k0.S182C 17 18 19 279 MRAL-k0.K183C 17 18 19 280 MRAL-k0.A184C 17 18 19 281 MRAL-k0.D185C 17 18 19 282 MRAL-k0.Y186C 17 18 19 283 MRAL-k0.E187C 17 18 19 284 MRAL-k0.K188C 17 18 19 285 MRAL-k0.H189C 17 18 19 286 MRAL-k0.K190C 17 18 19 287 MRAL-k0.V191C 17 18 19 288

SEQ ID NO: Nome do anticor- Região vari- Região cons- Região va- Região po ável de ca- tante de ca- riável de constante de deia pesada deia pesada cadeia leve cadeia leve MRAL-k0.Y192C 17 18 19 289 MRAL-k0.A193C 17 18 19 290 MRAL-k0.E195C 17 18 19 291 MRAL-k0.V196C 17 18 19 292 MRAL-k0.T197C 17 18 19 293 MRAL-k0.H198C 17 18 19 294 MRAL-k0.Q199C 17 18 19 295 MRAL-k0.G200C 17 18 19 296 MRAL-k0.L201C 17 18 19 297 MRAL-k0.S202C 17 18 19 298 MRAL-k0.S203C 17 18 19 299 MRAL-k0.P204C 17 18 19 300 MRAL-k0.V205C 17 18 19 301 MRAL-k0.T206C 17 18 19 302 MRAL-k0.K207C 17 18 19 303 MRAL-k0.S208C 17 18 19 304 MRAL-k0.F209C 17 18 19 305 MRAL-k0.N210C 17 18 19 306 MRAL-k0.R211C 17 18 19 307 MRAL-k0.G212C 17 18 19 308 MRAL-k0.E213C 17 18 19 309 Exemplo 6-2. Avaliação da fragmentação de Fab mediada por pro- tease de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições na cadeia leve

[00522] Utilizando uma protease que cliva a região de dobradiça de cadeia pesada do anticorpo para provocar a fragmentação de Fab, as variantes de MRA produzidas no Exemplo 6-1 foram examinadas para verificar se adquiriram resistência à protease de modo que sua frag-

mentação fosse inibida.

A protease utilizada foi Lys-C (Endoproteinase Lys-C Sequencing Grade) (SIGMA; 11047825001). A reação foi execu- tada sob as condições de 2 ng/μl de protease, 100 μg/ml de anticorpo, 80% de Tris-HCl 25 mM pH 8,0, 20% de PBS e 35 °C durante duas horas, ou sob as condições de 2 ng/μl de protease, 20 μg/ml de anti- corpo, 80% de Tris-HCl 25 mM pH 8,0, 20% de PBS e 35 °C durante uma hora.

A amostra foi então submetida à eletroforese capilar não redutora.

Wes (Protein Simple) foi utilizado para eletroforese capilar, e um anticorpo de cadeia anti-capa marcado com HRP (abcam; ab46527) foi utilizado para detecção.

Os resultados são mostrados nas Figs. 14 a 23. O tratamento com Lys-C de MRA provocou a clivagem da região de dobradiça de cadeia pesada, resultando no desapareci- mento da faixa de IgG em cerca de 150 kDa e no aparecimento da fai- xa de Fab em cerca de 50 kDa.

Para as variantes de MRA produzidas no Exemplo 6-1, algumas apresentaram a faixa do dímero Fab apare- cendo em cerca de 96 kDa e algumas apresentaram a faixa de IgG não digerida detectada em cerca de 150 kDa após o tratamento com protease.

A área de cada faixa obtida após o tratamento com protease foi enviada utilizando software exclusivo para Wes (Compass for SW; Protein Simple) para calcular a porcentagem das áreas da faixa de IgG não digerida, dímero Fab, etc.

A porcentagem calculada de cada faixa é mostrada na Tabela 10. Tabela 10 Nome do anticorpo IgG Fab-Fab Fab Cadeia pe- Cadeia leve (%) (%) (%) sada SEQ ID SEQ ID NO: NO: MRAL.T5C-k0 0,1 0 71,1 15 156 MRAL.Q6C-k0 0,1 0 74,5 15 157 MRAL.S7C-k0 0,2 0 68,8 15 158 MRAL.P8C-k0 sem sem sem 15 159 dados dados dados

Nome do anticorpo IgG Fab-Fab Fab Cadeia pe- Cadeia leve (%) (%) (%) sada SEQ ID SEQ ID NO: NO: MRAL.S9C-k0 0,3 0,4 82,9 15 160 MRAL.S10C-k0 0,2 0,4 85,8 15 161 MRAL.L11C-k0 0 0 83,4 15 162 MRAL.S12C-k0 0,9 0,4 87,2 15 163 MRAL.A13C-k0 0,1 0 88,6 15 164 MRAL.S14C-k0 0,3 0,6 85,9 15 165 MRAL.V15C-k0 0,2 0 84,8 15 166 MRAL.G16C-k0 0,8 0 82,3 15 167 MRAL.D17C-k0 0 0 92,3 15 168 MRAL.R18C-k0 0,2 0,4 87,1 15 169 MRAL.V19C-k0 0 0 63,3 15 170 MRAL.T20C-k0 0,5 0,6 83,6 15 171 MRAL.I21C-k0 0 0 5 15 172 MRAL.T22C-k0 0 0,3 89,5 15 173 MRAL.G57C-k0 0,2 0 91,7 15 174 MRAL.V58C-k0 0,4 0,7 88 15 175 MRAL.P59C-k0 0,7 1,5 94,6 15 176 MRAL.S60C-k0 0,1 0 86,9 15 177 MRAL.R61C-k0 0 0,3 86,9 15 178 MRAL.F62C-k0 0,2 0 60 15 179 MRAL.S63C-k0 0,5 0,6 88,1 15 180 MRAL.S65C-k0 0,4 0,8 83,3 15 181 MRAL.S67C-k0 1,5 0 72,8 15 182 MRAL.G68C-k0 0,7 0,9 83,9 15 183 MRAL.T69C-k0 1,1 0,6 86,4 15 184 MRAL.D70C-k0 0,8 0,9 88,2 15 185 MRAL.T72C-k0 0,6 0,7 90,1 15 186 MRAL.F73C-k0 0,3 0 59,5 15 187 MRAL.T74C-k0 0,2 0,6 95,6 15 188

Nome do anticorpo IgG Fab-Fab Fab Cadeia pe- Cadeia leve (%) (%) (%) sada SEQ ID SEQ ID NO: NO: MRAL.I75C-k0 sem sem sem 15 189 dados dados dados MRAL.S76C-k0 0,6 0,8 90,4 15 190 MRAL.S77C-k0 1,1 0 74,2 15 191 MRAL.L78C-k0 4,9 0 54,7 15 192 MRAL.Q79C-k0 1,2 0,6 93,1 15 193 MRAL.F98C-k0 0,6 0,8 71,8 15 194 MRAL.G99C-k0 0,6 0,4 88,2 15 195 MRAL.Q100C-k0 5 0,8 85 15 196 MRAL.G101C-k0 0,3 0,4 98,1 15 197 MRAL.T102C-k0 0,3 0 52,8 15 198 MRAL.K103C-k0 1,1 0,4 89,2 15 199 MRAL.V104C-k0 0,2 0,6 48,2 15 200 MRAL.E105C-k0 90,8 0 1,2 15 201 MRAL.I106C-k0 1,8 0 47,3 15 202 MRAL.K107C-k0 5,4 0 82,6 15 203 MRAL.A25C-k0 0,1 0,5 80 15 204 MRAL.S26C-k0 0,3 1,4 94 15 205 MRAL.Q27C-k0 0,3 1,3 94,6 15 206 MRAL.Y32C-k0 0 1,2 95,7 15 207 MRAL.L33C-k0 0 0 79,2 15 208 MRAL.N34C-k0 0,3 0,4 95,7 15 209 MRAL.Y50C-k0 0,4 1,3 97 15 210 MRAL.T51C-k0 0,2 1,2 96,9 15 211 MRAL.H55C-k0 0,2 1,5 95,7 15 212 MRAL.S56C-k0 0,1 0,8 97 15 213 MRAL.Y96C-k0 0,1 0,2 91,3 15 214 MRAL.T97C-k0 0,3 0,9 97,5 15 215 MRAL-k0.R108C sem sem sem 15 216 dados dados dados MRAL-k0.T109C 0,5 16 74,5 15 217

Nome do anticorpo IgG Fab-Fab Fab Cadeia pe- Cadeia leve (%) (%) (%) sada SEQ ID SEQ ID NO: NO: MRAL-k0.V110C 1,2 4 75 15 218 MRAL-k0.A111C 0,2 0,7 85,9 15 219 MRAL-k0.A112C 3,3 6,1 80,3 15 220 MRAL-k0.P113C sem sem sem 15 221 dados dados dados MRAL-k0.S114C 0,3 0,7 94 15 222 MRAL-k0.V115C 0 0,1 34,9 15 223 MRAL-k0.F116C 0,3 0,3 77,3 15 224 MRAL-k0.P120C 0 0 28,8 15 225 MRAL-k0.S121C 8,6 0 57,4 15 226 MRAL-k0.D122C 1,8 0,1 30,3 15 227 MRAL-k0.E123C 2,3 1,6 75,9 15 228 MRAL-k0.Q124C 1,3 0,9 50,4 15 229 MRAL-k0.L125C 0,4 0,1 66,6 15 230 MRAL-k0.K126C 59,3 9,9 16,5 15 231 MRAL-k0.S127C 0,3 0,9 79 15 232 MRAL-k0.G128C 0,2 7 71,5 15 233 MRAL-k0.T129C 0 0,4 76,2 15 234 MRAL-k0.A130C 0 0 49,9 15 235 MRAL-k0.S131C 0 0 16,7 15 236 MRAL-k0.L136C 0 0 15 15 237 MRAL-k0.N137C 0 0 47,5 15 238 MRAL-k0.N138C 0 0,5 86,8 15 239 MRAL-k0.F139C 0 0 0 15 240 MRAL-k0.Y140C 0 0 29,9 15 241 MRAL-k0.P141C 0,1 2,7 79,8 15 242 MRAL-k0.R142C 0 0,6 74,1 15 243 MRAL-k0.E143C 0 0,5 88,4 15 244 MRAL-k0.A144C 0 0,1 42,1 15 245 MRAL-k0.K145C 0 0,9 82,8 15 246

Nome do anticorpo IgG Fab-Fab Fab Cadeia pe- Cadeia leve (%) (%) (%) sada SEQ ID SEQ ID NO: NO: MRAL-k0.V146C 0 0 26,5 15 247 MRAL-k0.Q147C 0 1,8 78,5 15 248 MRAL-k0.W148C sem sem sem 15 249 dados dados dados MRAL-k0.K149C 0 0,6 79,5 15 250 MRAL-k0.V150C 0 0 34,8 15 251 MRAL-k0.D151C 2,7 14,9 66,5 15 252 MRAL-k0.N152C 1,2 58,4 26,8 15 253 MRAL-k0.A153C 0 7,1 71,8 15 254 MRAL-k0.L154C 0 2,3 66,5 15 255 MRAL-k0.Q155C 0 0,6 73,3 15 256 MRAL-k0.S156C 0,3 32,3 40,5 15 257 MRAL-k0.G157C 0 1,4 71,8 15 258 MRAL-k0.N158C 0 0,7 76,2 15 259 MRAL-k0.S159C 0 1,1 74,7 15 260 MRAL-k0.Q160C 0 1,5 78,5 15 261 MRAL-k0.E161C 0 1 79,8 15 262 MRAL-k0.S162C 0,6 1,6 86,7 15 263 MRAL-k0.V163C 0 1,7 87,1 15 264 MRAL-k0.T164C 0 2,6 84,3 15 265 MRAL-k0.E165C 0 0,6 89,5 15 266 MRAL-k0.Q166C 0 2 86,2 15 267 MRAL-k0.D167C 0 0,5 90,5 15 268 MRAL-k0.S168C 0 0,8 94,1 15 269 MRAL-k0.K169C 0 0,4 95,3 15 270 MRAL-k0.D170C 0,2 0,1 96 15 271 MRAL-k0.S171C 0 0,1 93,8 15 272 MRAL-k0.T172C 0 0 77,4 15 273 MRAL-k0.Y173C sem sem sem 15 274 dados dados dados MRAL-k0.S174C 0 0 65,8 15 275

Nome do anticorpo IgG Fab-Fab Fab Cadeia pe- Cadeia leve (%) (%) (%) sada SEQ ID SEQ ID NO: NO: MRAL-k0.L175C 0 0,2 59,3 15 276 MRAL-k0.T180C 0 0,3 93,3 15 277 MRAL-k0.L181C 1,3 0,6 86,4 15 278 MRAL-k0.S182C 0,9 1,9 95 15 279 MRAL-k0.K183C 4,4 0,9 90,7 15 280 MRAL-k0.A184C 1,6 27,9 67,7 15 281 MRAL-k0.D185C 0,5 1,1 96,5 15 282 MRAL-k0.Y186C 2,4 18,9 67,4 15 283 MRAL-k0.E187C 2,3 0 11,2 15 284 MRAL-k0.K188C 1,8 8,6 85,8 15 285 MRAL-k0.H189C 1 0,8 93 15 286 MRAL-k0.K190C 25,5 0,2 11,4 15 287 MRAL-k0.V191C 2,8 1,6 84 15 288 MRAL-k0.Y192C 0,4 1,1 67,5 15 289 MRAL-k0.A193C 1,7 1,4 94,5 15 290 MRAL-k0.E195C 0,9 1,7 95,5 15 291 MRAL-k0.V196C 1 1,1 67,5 15 292 MRAL-k0.T197C 0,8 1,5 94,8 15 293 MRAL-k0.H198C 0,7 1,3 85 15 294 MRAL-k0.Q199C 1,4 2,5 92,9 15 295 MRAL-k0.G200C 7,3 14,8 75,6 15 296 MRAL-k0.L201C 1,7 5 88 15 297 MRAL-k0.S202C 2,8 46,4 49,4 15 298 MRAL-k0.S203C 9,1 0 87,1 15 299 MRAL-k0.P204C 1 0 95,8 15 300 MRAL-k0.V205C 1,7 1 88,4 15 301 MRAL-k0.T206C 1,4 0,7 90,1 15 302 MRAL-k0.K207C 3,2 0,5 79,8 15 303 MRAL-k0.S208C 7,7 0,8 77,8 15 304 MRAL-k0.F209C 0 0 37,2 15 305

Nome do anticorpo IgG Fab-Fab Fab Cadeia pe- Cadeia leve (%) (%) (%) sada SEQ ID SEQ ID NO: NO: MRAL-k0.N210C 22,8 0 20,2 15 306 MRAL-k0.R211C 9,2 0 59,7 15 307 MRAL-k0.G212C 58,9 0 28,7 15 308 MRAL-k0.E213C 55,1 0 12,1 15 309

[00523] A partir deste resultado, observou-se que a substituição de cisteína na região variável de cadeia leve ou região constante de ca- deia leve melhorou a resistência à protease da região de dobradiça de cadeia pesada nas variantes de MRA mostradas na Tabela 11. Alter- nativamente, o resultado sugeriu que um dímero Fab era formado por uma ligação covalente entre o Fab-Fab. Tabela 11 Variantes de MRA SEQ ID NO: Nome do anticorpo Região va- Região Região va- Região riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada leve MRAL.Q100C-k0 17 18 196 20 MRAL.E105C-k0 17 18 201 20 MRAL.K107C-k0 17 18 203 20 MRAL-k0.T109C 17 18 19 217 MRAL-k0.A112C 17 18 19 220 MRAL-k0.S121C 17 18 19 226 MRAL-k0.K126C 17 18 19 231 MRAL-k0.G128C 17 18 19 233 MRAL-k0.D151C 17 18 19 252 MRAL-k0.N152C 17 18 19 253 MRAL-k0.A153C 17 18 19 254 MRAL-k0.S156C 17 18 19 257

SEQ ID NO: Nome do anticorpo Região va- Região Região va- Região riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada leve MRAL-k0.A184C 17 18 19 281 MRAL-k0.Y186C 17 18 19 283 MRAL-k0.K188C 17 18 19 285 MRAL-k0.K190C 17 18 19 287 MRAL-k0.G200C 17 18 19 296 MRAL-k0.L201C 17 18 19 297 MRAL-k0.S202C 17 18 19 298 MRAL-k0.S203C 17 18 19 299 MRAL-k0.S208C 17 18 19 304 MRAL-k0.N210C 17 18 19 306 MRAL-k0.R211C 17 18 19 307 MRAL-k0.G212C 17 18 19 308 MRAL-k0.E213C 17 18 19 309 Exemplo 7: Estudo de métodos para avaliar anticorpos com substitui- ção de cisteína Exemplo 7-1. Produção de anticorpos tendo substituição de cisteína na cadeia leve

[00524] O resíduo de aminoácido na posição 126 de acordo com a numeração de Kabat na região constante de cadeia leve (k0, SEQ ID NO: 20) de MRA, um anticorpo neutralizante de IL6R anti-humano (ca- deia pesada: MRAH-G1T4 (SEQ ID NO: 15), cadeia leve: MRAL-k0 (SEQ ID NO: 16)), foi substituído por cisteína para produzir uma vari- ante da região constante de cadeia leve de MRA, k0.K126C (SEQ ID No: 231). Esta variante da região constante de cadeia leve de MRA foi ligada com a região variável de cadeia leve de MRA (MRAL, SEQ ID NO: 19) para produzir uma variante de cadeia leve de MRA, e um ve-

tor de expressão que codifica o gene correspondente foi produzido por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

[00525] A variante de cadeia leve de MRA produzida acima foi combinada com a cadeia pesada de MRA. A variante de MRA resul- tante MRAL-k0.K126C (cadeia pesada: MRAH-G1T4 (SEQ ID NO: 15), região variável de cadeia leve: MRAL (SEQ ID NO: 19), região cons- tante de cadeia leve: k0.K126C (SEQ ID NO : 231)) foi expressa atra- vés da expressão transitória utilizando células FreeStyle293 (Invitro- gen) ou células Expi293 (Life technologies) por um método conhecido da pessoa versada na técnica e purificada com a Proteína A por um método conhecido da pessoa versada na técnica. Exemplo 7-2. Avaliação de eletroforese capilar mediada por protease de anticorpos com substituição de cisteína na cadeia leve

[00526] Utilizando uma protease que cliva a região de dobradiça de cadeia pesada do anticorpo para provocar a fragmentação de Fab, a variante de cadeia leve de MRA produzida no Exemplo 7-1 foi exami- nada para verificar se adquiriu resistência à protease de modo que sua fragmentação fosse inibida. A protease utilizada foi Lys-C (Endoprotei- nase Lys-C Sequencing Grade) (SIGMA; 11047825001). A reação foi executada sob as condições de 0,1, 0,4, 1,6 ou 6,4 ng/μl de protease, 100 μg/ml de anticorpo, 80% de Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, 20% de PBS e 35 °C durante duas horas. A amostra foi então submetida à eletrofo- rese capilar não redutora. Wes (Protein Simple) foi utilizado para ele- troforese capilar, e um anticorpo de cadeia anti-capa marcado com HRP (abcam; ab46527) ou um anticorpo Fc anti-humano marcado com HRP (Protein Simple; 043-491) foi utilizado para detecção. O resultado é mostrado na Fig. 24. Para MRA tratado com Lys-C, a detecção com o anticorpo de cadeia anti-capa mostrou o desaparecimento da faixa em cerca de 150 kDa e aparecimento de uma nova faixa em cerca de 50 kDa, e, em baixas concentrações de Lys-C, também mostraram o aparecimento de uma leve faixa em 113 kDa. A detecção com o anti- corpo Fc anti-humano mostrou o desaparecimento da faixa em cerca de 150 kDa e o aparecimento de uma nova faixa em cerca de 61 kDa e, em baixas concentrações de Lys-C, também mostrou o aparecimen- to de uma leve faixa em 113 kDa. Para a variante de MRA produzida no Exemplo 7-1, por outro lado, a faixa em cerca de 150 kDa quase não desapareceu e uma nova faixa apareceu em cerca de 96 kDa. A detecção com o anticorpo Fc anti-humano mostrou que a faixa em cer- ca de 150 kDa quase não desapareceu e uma nova faixa apareceu em torno de 61 kDa, e, em baixas concentrações de Lys-C, uma leve faixa também apareceu em 113 kDa. Os resultados acima sugeriram que, como mostrado na Fig. 25, a faixa em cerca de 150 kDa era IgG, a fai- xa em cerca de 113 kDa era uma forma de uma ramificação em que a dobradiça de cadeia pesada foi clivada uma vez, a faixa em cerca de 96 kDa era um dímero Fab, a faixa em torno de 61 kDa era Fc e a fai- xa em torno de 50 kDa era Fab. Exemplo 8: Avaliação de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições de IgG1 Exemplo 8-1. Produção de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições de IgG1

[00527] A cadeia pesada e a cadeia leve de um anticorpo neutrali- zante anti-IL6R humano, MRA-IgG1 (cadeia pesada: MRAH-G1T4 (SEQ ID NO: 15), cadeia leve: MRAL-k0 (SEQ ID NO: 16)), foram submetidas a um estudo em que um resíduo de aminoácido arbitrário estruturalmente exposto à superfície foi substituído por cisteína.

[00528] Os resíduos de aminoácido dentro da região variável de cadeia pesada MRA-IgG1 (MRAH, SEQ ID NO: 17) foram substituídos por cisteína para produzir variantes da região variável de cadeia pesa- da MRA-IgG1 mostrada na Tabela 12. Estas variantes da região variá- vel de cadeia pesada MRA-IgG1 foram cada uma ligada à região cons-

tante de cadeia pesada MRA-IgG1 (G1T4, SEQ ID NO: 18) para pro- duzir variantes de cadeia pesada MRA-IgG1, e os vetores de expres- são que codificam os genes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

Além disso, os resí- duos de aminoácido dentro da região constante de cadeia pesada MRA-IgG1 (G1T4, SEQ ID NO: 18) foram substituídos por cisteína pa- ra produzir variantes da região constante de cadeia pesada MRA-IgG1 mostradas na Tabela 13. Estas variantes da região constante de ca- deia pesada MRA-IgG1 foram, cada uma, ligada à região variável de cadeia pesada MRA-IgG1 (MRAH, SEQ ID NO: 17) para produzir vari- antes de cadeia pesada MRA-IgG1, e os vetores de expressão que codificam os genes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

Tabela 12 Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG1 teína (numeração de Kabat) NO: MRAH.Q5C 5 322 MRAH.E6C 6 323 MRAH.S7C 7 324 MRAH.G8C 8 325 MRAH.P9C 9 326 MRAH.G10C 10 327 MRAH.L11C 11 328 MRAH.V12C 12 329 MRAH.R13C 13 330 MRAH.P14C 14 331 MRAH.S15C 15 332 MRAH.Q16C 16 333 MRAH.T17C 17 334 MRAH.L18C 18 335 MRAH.S19C 19 336 MRAH.L20C 20 337

Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG1 teína (numeração de Kabat) NO: MRAH.T21C 21 338 MRAH.T23C 23 339 MRAH.S25C 25 340 MRAH.G26C 26 341 MRAH.S28C 28 342 MRAH.T30C 30 343 MRAH.S31C 31 344 MRAH.W35C 35 345 MRAH.S35aC 35a 346 MRAH.Y50C 50 347 MRAH.I51C 51 348 MRAH.S52C 52 349 MRAH.S62C 62 350 MRAH.L63C 63 351 MRAH.K64C 64 352 MRAH.S65C 65 353 MRAH.R66C 66 354 MRAH.V67C 67 355 MRAH.T68C 68 356 MRAH.L70C 70 357 MRAH.D72C 72 358 MRAH.T73C 73 359 MRAH.S74C 74 360 MRAH.K75C 75 361 MRAH.N76C 76 362 MRAH.Q77C 77 363 MRAH.S79C 79 364 MRAH.L80C 80 365 MRAH.R81C 81 366 MRAH.L82C 82 367 MRAH.S82aC 82a 368

Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG1 teína (numeração de Kabat) NO: MRAH.S82bC 82b 369 MRAH.V82cC 82c 370 MRAH.D101C 101 371 MRAH.Y102C 102 372 MRAH.S112C 112 373 MRAH.S113C 113 374

Tabela 13 Variante da região constante Posição da substituição de SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG1 cisteína (numeração da EU) NO: G1T4.A118C 118 375 G1T4.S119C 119 376 G1T4.T120C 120 377 G1T4.K121C 121 378 G1T4.G122C 122 379 G1T4.P123C 123 380 G1T4.S124C 124 381 G1T4.V125C 125 382 G1T4.F126C 126 383 G1T4.P127C 127 384 G1T4.S131C 131 385 G1T4.S132C 132 386 G1T4.K133C 133 387 G1T4.S134C 134 388 G1T4.T135C 135 389 G1T4.S136C 136 390 G1T4.G137C 137 391 G1T4.G138C 138 392 G1T4.T139C 139 393 G1T4.A140C 140 394 G1T4.A141C 141 395

Variante da região constante Posição da substituição de SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG1 cisteína (numeração da EU) NO: G1T4.D148C 148 396 G1T4.Y149C 149 397 G1T4.F150C 150 398 G1T4.P151C 151 399 G1T4.E152C 152 400 G1T4.P153C 153 401 G1T4.V154C 154 402 G1T4.T155C 155 403 G1T4.V156C 156 404 G1T4.S157C 157 405 G1T4.W158C 158 406 G1T4.N159C 159 407 G1T4.S160C 160 408 G1T4.G161C 161 409 G1T4.A162C 162 410 G1T4.L163C 163 411 G1T4.T164C 164 412 G1T4.S165C 165 413 G1T4.G166C 166 414 G1T4.V167C 167 415 G1T4.V173C 173 416 G1T4.L174C 174 417 G1T4.Q175C 175 418 G1T4.S176C 176 419 G1T4.S177C 177 420 G1T4.G178C 178 421 G1T4.L179C 179 422 G1T4.Y180C 180 423 G1T4.V186C 186 424 G1T4.T187C 187 425 G1T4.V188C 188 426

Variante da região constante Posição da substituição de SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG1 cisteína (numeração da EU) NO: G1T4.P189C 189 427 G1T4.S190C 190 428 G1T4.S191C 191 429 G1T4.S192C 192 430 G1T4.L193C 193 431 G1T4.G194C 194 432 G1T4.T195C 195 433 G1T4.Q196C 196 434 G1T4.T197C 197 435 G1T4.Y198C 198 436 G1T4.I199C 199 437 G1T4.N201C 201 438 G1T4.V202C 202 439 G1T4.N203C 203 440 G1T4.H204C 204 441 G1T4.K205C 205 442 G1T4.P206C 206 443 G1T4.S207C 207 444 G1T4.N208C 208 445 G1T4.T209C 209 446 G1T4.K210C 210 447 G1T4.V211C 211 448 G1T4.D212C 212 449 G1T4.K213C 213 450 G1T4.R214C 214 451 G1T4.V215C 215 452 G1T4.E216C 216 453 G1T4.P217C 217 454 G1T4.K218C 218 455 G1T4.S219C 219 456

[00529] Da mesma forma, os resíduos de aminoácido dentro da re- gião variável de cadeia leve MRA-IgG1 (MRAL, SEQ ID NO: 19) foram substituídos por cisteína para produzir variantes da região variável de cadeia leve MRA-IgG1 mostrada na Tabela 14. Estas variantes da re- gião variável de cadeia leve MRA-IgG1 foi cada uma ligada à região constante de cadeia leve MRA-IgG1 (k0, SEQ ID NO: 20) para produ- zir variantes de cadeia leve MRA-IgG1, e os vetores de expressão que codificam os genes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

Além disso, os resíduos de aminoácido na região constante de cadeia leve MRA-IgG1 (k0, SEQ ID NO: 20) foram substituídos por cisteína para produzir variantes da re- gião constante de cadeia leve MRA-IgG1 mostrada na Tabela 15. Es- tas variantes da região constante de cadeia pesada MRA-IgG1 foram, cada uma, ligada à região variável de cadeia leve MRA-IgG1 (MRAL, SEQ ID NO: 19) para produzir variantes de cadeia leve MRA-IgG1, e os vetores de expressão que codificam os genes correspondentes fo- ram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na téc- nica.

Tabela 14 Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia leve MRA-IgG1 teína (numeração de Kabat) NO: MRAL.T5C 5 457 MRAL.Q6C 6 458 MRAL.S7C 7 459 MRAL.P8C 8 460 MRAL.S9C 9 461 MRAL.S10C 10 462 MRAL.L11C 11 463 MRAL.S12C 12 464 MRAL.A13C 13 465 MRAL.S14C 14 466

Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia leve MRA-IgG1 teína (numeração de Kabat) NO: MRAL.V15C 15 467 MRAL.G16C 16 468 MRAL.D17C 17 469 MRAL.R18C 18 470 MRAL.V19C 19 471 MRAL.T20C 20 472 MRAL.I21C 21 473 MRAL.T22C 22 474 MRAL.A25C 25 475 MRAL.S26C 26 476 MRAL.Q27C 27 477 MRAL.Y32C 32 478 MRAL.L33C 33 479 MRAL.N34C 34 480 MRAL.Y50C 50 481 MRAL.T51C 51 482 MRAL.H55C 55 483 MRAL.S56C 56 484 MRAL.G57C 57 485 MRAL.V58C 58 486 MRAL.P59C 59 487 MRAL.S60C 60 488 MRAL.R61C 61 489 MRAL.F62C 62 490 MRAL.S63C 63 491 MRAL.S65C 65 492 MRAL.S67C 67 493 MRAL.G68C 68 494 MRAL.T69C 69 495 MRAL.D70C 70 496 MRAL.T72C 72 497

Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia leve MRA-IgG1 teína (numeração de Kabat) NO: MRAL.F73C 73 498 MRAL.T74C 74 499 MRAL.I75C 75 500 MRAL.S76C 76 501 MRAL.S77C 77 502 MRAL.L78C 78 503 MRAL.Q79C 79 504 MRAL.Y96C 96 505 MRAL.T97C 97 506 MRAL.F98C 98 507 MRAL.G99C 99 508 MRAL.Q100C 100 509 MRAL.G101C 101 510 MRAL.T102C 102 511 MRAL.K103C 103 512 MRAL.V104C 104 513 MRAL.E105C 105 514 MRAL.I106C 106 515 MRAL.K107C 107 516

Tabela 15 Variante da região constan- Posição da substituição de cis- SEQ ID te de cadeia leve MRA-IgG1 teína (numeração de Kabat) NO: k0.R108C 108 517 k0.T109C 109 518 k0.V110C 110 519 k0.A111C 111 520 k0.A112C 112 521 k0.P113C 113 522 k0.S114C 114 523 k0.V115C 115 524

Variante da região constan- Posição da substituição de cis- SEQ ID te de cadeia leve MRA-IgG1 teína (numeração de Kabat) NO: k0.F116C 116 525 k0.P120C 120 526 k0.S121C 121 527 k0.D122C 122 528 k0.E123C 123 529 k0.Q124C 124 530 k0.L125C 125 531 k0.K126C 126 532 k0.S127C 127 533 k0.G128C 128 534 k0.T129C 129 535 k0.A130C 130 536 k0.S131C 131 537 k0.L136C 136 538 k0.N137C 137 539 k0.N138C 138 540 k0.F139C 139 541 k0.Y140C 140 542 k0.P141C 141 543 k0.R142C 142 544 k0.E143C 143 545 k0.A144C 144 546 k0.K145C 145 547 k0.V146C 146 548 k0.Q147C 147 549 k0.W148C 148 550 k0.K149C 149 551 k0.V150C 150 552 k0.D151C 151 553 k0.N152C 152 554 k0.A153C 153 555

Variante da região constan- Posição da substituição de cis- SEQ ID te de cadeia leve MRA-IgG1 teína (numeração de Kabat) NO: k0.L154C 154 556 k0.Q155C 155 557 k0.S156C 156 558 k0.G157C 157 559 k0.N158C 158 560 k0.S159C 159 561 k0.Q160C 160 562 k0.E161C 161 563 k0.S162C 162 564 k0.V163C 163 565 k0.T164C 164 566 k0.E165C 165 567 k0.Q166C 166 568 k0.D167C 167 569 k0.S168C 168 570 k0.K169C 169 571 k0.D170C 170 572 k0.S171C 171 573 k0.T172C 172 574 k0.Y173C 173 575 k0.S174C 174 576 k0.L175C 175 577 k0.T180C 180 578 k0.L181C 181 579 k0.S182C 182 580 k0.K183C 183 581 k0.A184C 184 582 k0.D185C 185 583 k0.Y186C 186 584 k0.E187C 187 585 k0.K188C 188 586

Variante da região constan- Posição da substituição de cis- SEQ ID te de cadeia leve MRA-IgG1 teína (numeração de Kabat) NO: k0.H189C 189 587 k0.K190C 190 588 k0.V191C 191 589 k0.Y192C 192 590 k0.A193C 193 591 k0.E195C 195 592 k0.V196C 196 593 k0.T197C 197 594 k0.H198C 198 595 k0.Q199C 199 596 k0.G200C 200 597 k0.L201C 201 598 k0.S202C 202 599 k0.S203C 203 600 k0.P204C 204 601 k0.V205C 205 602 k0.T206C 206 603 k0.K207C 207 604 k0.S208C 208 605 k0.F209C 209 606 k0.N210C 210 607 k0.R211C 211 608 k0.G212C 212 609 k0.E213C 213 610

[00530] As variantes de cadeia pesada MRA-IgG1 produzidas aci- ma foram combinadas com a cadeia leve MRA-IgG1, ou a cadeia pe- sada MRA-IgG1 foi combinada com as variantes de cadeia leve MRA- IgG1. As variantes de cadeia pesada de MRA-IgG1 resultantes e vari- antes de cadeia leve de MRA-IgG1 mostradas nas Tabelas 16 e 17 foram expressas através da expressão transitória utilizando células

FreeStyle293 (Invitrogen) ou células Expi293 (Life technologies) por um método conhecido da pessoa versada na técnica, e purificadas com Proteína A por um método conhecido da pessoa versada na téc- nica.

Tabela 16 Nome da variante Região va- Região Região va- Região de cadeia MRA- riável de constante riável de constante IgG1 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: MRAH.Q5C-IgG1 322 18 19 20 MRAH.E6C-IgG1 323 18 19 20 MRAH.S7C-IgG1 324 18 19 20 MRAH.G8C-IgG1 325 18 19 20 MRAH.P9C-IgG1 326 18 19 20 MRAH.G10C-IgG1 327 18 19 20 MRAH.L11C-IgG1 328 18 19 20 MRAH.V12C-IgG1 329 18 19 20 MRAH.R13C-IgG1 330 18 19 20 MRAH.P14C-IgG1 331 18 19 20 MRAH.S15C-IgG1 332 18 19 20 MRAH.Q16C-IgG1 333 18 19 20 MRAH.T17C-IgG1 334 18 19 20 MRAH.L18C-IgG1 335 18 19 20 MRAH.S19C-IgG1 336 18 19 20 MRAH.L20C-IgG1 337 18 19 20 MRAH.T21C-IgG1 338 18 19 20 MRAH.T23C-IgG1 339 18 19 20 MRAH.S25C-IgG1 340 18 19 20 MRAH.G26C-IgG1 341 18 19 20 MRAH.S28C-IgG1 342 18 19 20 MRAH.T30C-IgG1 343 18 19 20 MRAH.S31C-IgG1 344 18 19 20

Nome da variante Região va- Região Região va- Região de cadeia MRA- riável de constante riável de constante IgG1 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: MRAH.W35C-IgG1 345 18 19 20 MRAH.S35aC-IgG1 346 18 19 20 MRAH.Y50C-IgG1 347 18 19 20 MRAH.I51C-IgG1 348 18 19 20 MRAH.S52C-IgG1 349 18 19 20 MRAH.S62C-IgG1 350 18 19 20 MRAH.L63C-IgG1 351 18 19 20 MRAH.K64C-IgG1 352 18 19 20 MRAH.S65C-IgG1 353 18 19 20 MRAH.R66C-IgG1 354 18 19 20 MRAH.V67C-IgG1 355 18 19 20 MRAH.T68C-IgG1 356 18 19 20 MRAH.L70C-IgG1 357 18 19 20 MRAH.D72C-IgG1 358 18 19 20 MRAH.T73C-IgG1 359 18 19 20 MRAH.S74C-IgG1 360 18 19 20 MRAH.K75C-IgG1 361 18 19 20 MRAH.N76C-IgG1 362 18 19 20 MRAH.Q77C-IgG1 363 18 19 20 MRAH.S79C-IgG1 364 18 19 20 MRAH.L80C-IgG1 365 18 19 20 MRAH.R81C-IgG1 366 18 19 20 MRAH.L82C-IgG1 367 18 19 20 MRAH.S82aC-IgG1 368 18 19 20 MRAH.S82bC-IgG1 369 18 19 20 MRAH.V82cC-IgG1 370 18 19 20 MRAH.D101C-IgG1 371 18 19 20 MRAH.Y102C-IgG1 372 18 19 20 MRAH.S112C-IgG1 373 18 19 20

Nome da variante Região va- Região Região va- Região de cadeia MRA- riável de constante riável de constante IgG1 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: MRAH.S113C-IgG1 374 18 19 20 G1T4.A118C-IgG1 17 375 19 20 G1T4.S119C-IgG1 17 376 19 20 G1T4.T120C-IgG1 17 377 19 20 G1T4.K121C-IgG1 17 378 19 20 G1T4.G122C-IgG1 17 379 19 20 G1T4.P123C-IgG1 17 380 19 20 G1T4.S124C-IgG1 17 381 19 20 G1T4.V125C-IgG1 17 382 19 20 G1T4.F126C-IgG1 17 383 19 20 G1T4.P127C-IgG1 17 384 19 20 G1T4.S131C-IgG1 17 385 19 20 G1T4.S132C-IgG1 17 386 19 20 G1T4.K133C-IgG1 17 387 19 20 G1T4.S134C-IgG1 17 388 19 20 G1T4.T135C-IgG1 17 389 19 20 G1T4.S136C-IgG1 17 390 19 20 G1T4.G137C-IgG1 17 391 19 20 G1T4.G138C-IgG1 17 392 19 20 G1T4.T139C-IgG1 17 393 19 20 G1T4.A140C-IgG1 17 394 19 20 G1T4.A141C-IgG1 17 395 19 20 G1T4.D148C-IgG1 17 396 19 20 G1T4.Y149C-IgG1 17 397 19 20 G1T4.F150C-IgG1 17 398 19 20 G1T4.P151C-IgG1 17 399 19 20 G1T4.E152C-IgG1 17 400 19 20 G1T4.P153C-IgG1 17 401 19 20 G1T4.V154C-IgG1 17 402 19 20

Nome da variante Região va- Região Região va- Região de cadeia MRA- riável de constante riável de constante IgG1 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: G1T4.T155C-IgG1 17 403 19 20 G1T4.V156C-IgG1 17 404 19 20 G1T4.S157C-IgG1 17 405 19 20 G1T4.W158C-IgG1 17 406 19 20 G1T4.N159C-IgG1 17 407 19 20 G1T4.S160C-IgG1 17 408 19 20 G1T4.G161C-IgG1 17 409 19 20 G1T4.A162C-IgG1 17 410 19 20 G1T4.L163C-IgG1 17 411 19 20 G1T4.T164C-IgG1 17 412 19 20 G1T4.S165C-IgG1 17 413 19 20 G1T4.G166C-IgG1 17 414 19 20 G1T4.V167C-IgG1 17 415 19 20 G1T4.V173C-IgG1 17 416 19 20 G1T4.L174C-IgG1 17 417 19 20 G1T4.Q175C-IgG1 17 418 19 20 G1T4.S176C-IgG1 17 419 19 20 G1T4.S177C-IgG1 17 420 19 20 G1T4.G178C-IgG1 17 421 19 20 G1T4.L179C-IgG1 17 422 19 20 G1T4.Y180C-IgG1 17 423 19 20 G1T4.V186C-IgG1 17 424 19 20 G1T4.T187C-IgG1 17 425 19 20 G1T4.V188C-IgG1 17 426 19 20 G1T4.P189C-IgG1 17 427 19 20 G1T4.S190C-IgG1 17 428 19 20 G1T4.S191C-IgG1 17 429 19 20 G1T4.S192C-IgG1 17 430 19 20 G1T4.L193C-IgG1 17 431 19 20

Nome da variante Região va- Região Região va- Região de cadeia MRA- riável de constante riável de constante IgG1 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: G1T4.G194C-IgG1 17 432 19 20 G1T4.T195C-IgG1 17 433 19 20 G1T4.Q196C-IgG1 17 434 19 20 G1T4.T197C-IgG1 17 435 19 20 G1T4.Y198C-IgG1 17 436 19 20 G1T4.I199C-IgG1 17 437 19 20 G1T4.N201C-IgG1 17 438 19 20 G1T4.V202C-IgG1 17 439 19 20 G1T4.N203C-IgG1 17 440 19 20 G1T4.H204C-IgG1 17 441 19 20 G1T4.K205C-IgG1 17 442 19 20 G1T4.P206C-IgG1 17 443 19 20 G1T4.S207C-IgG1 17 444 19 20 G1T4.N208C-IgG1 17 445 19 20 G1T4.T209C-IgG1 17 446 19 20 G1T4.K210C-IgG1 17 447 19 20 G1T4.V211C-IgG1 17 448 19 20 G1T4.D212C-IgG1 17 449 19 20 G1T4.K213C-IgG1 17 450 19 20 G1T4.R214C-IgG1 17 451 19 20 G1T4.V215C-IgG1 17 452 19 20 G1T4.E216C-IgG1 17 453 19 20 G1T4.P217C-IgG1 17 454 19 20 G1T4.K218C-IgG1 17 455 19 20 G1T4.S219C-IgG1 17 456 19 20

Tabela 17

Nome da variante Região va- Região Região va- Região de cadeia leve riável de constante riável de constante MRA-IgG1 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: MRAL.T5C-IgG1 17 18 457 20 MRAL.Q6C-IgG1 17 18 458 20 MRAL.S7C-IgG1 17 18 459 20 MRAL.P8C-IgG1 17 18 460 20 MRAL.S9C-IgG1 17 18 461 20 MRAL.S10C-IgG1 17 18 462 20 MRAL.L11C-IgG1 17 18 463 20 MRAL.S12C-IgG1 17 18 464 20 MRAL.A13C-IgG1 17 18 465 20 MRAL.S14C-IgG1 17 18 466 20 MRAL.V15C-IgG1 17 18 467 20 MRAL.G16C-IgG1 17 18 468 20 MRAL.D17C-IgG1 17 18 469 20 MRAL.R18C-IgG1 17 18 470 20 MRAL.V19C-IgG1 17 18 471 20 MRAL.T20C-IgG1 17 18 472 20 MRAL.I21C-IgG1 17 18 473 20 MRAL.T22C-IgG1 17 18 474 20 MRAL.A25C-IgG1 17 18 475 20 MRAL.S26C-IgG1 17 18 476 20 MRAL.Q27C-IgG1 17 18 477 20 MRAL.Y32C-IgG1 17 18 478 20 MRAL.L33C-IgG1 17 18 479 20 MRAL.N34C-IgG1 17 18 480 20 MRAL.Y50C-IgG1 17 18 481 20 MRAL.T51C-IgG1 17 18 482 20 MRAL.H55C-IgG1 17 18 483 20 MRAL.S56C-IgG1 17 18 484 20 MRAL.G57C-IgG1 17 18 485 20

Nome da variante Região va- Região Região va- Região de cadeia leve riável de constante riável de constante MRA-IgG1 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: MRAL.V58C-IgG1 17 18 486 20 MRAL.P59C-IgG1 17 18 487 20 MRAL.S60C-IgG1 17 18 488 20 MRAL.R61C-IgG1 17 18 489 20 MRAL.F62C-IgG1 17 18 490 20 MRAL.S63C-IgG1 17 18 491 20 MRAL.S65C-IgG1 17 18 492 20 MRAL.S67C-IgG1 17 18 493 20 MRAL.G68C-IgG1 17 18 494 20 MRAL.T69C-IgG1 17 18 495 20 MRAL.D70C-IgG1 17 18 496 20 MRAL.T72C-IgG1 17 18 497 20 MRAL.F73C-IgG1 17 18 498 20 MRAL.T74C-IgG1 17 18 499 20 MRAL.I75C-IgG1 17 18 500 20 MRAL.S76C-IgG1 17 18 501 20 MRAL.S77C-IgG1 17 18 502 20 MRAL.L78C-IgG1 17 18 503 20 MRAL.Q79C-IgG1 17 18 504 20 MRAL.Y96C-IgG1 17 18 505 20 MRAL.T97C-IgG1 17 18 506 20 MRAL.F98C-IgG1 17 18 507 20 MRAL.G99C-IgG1 17 18 508 20 MRAL.Q100C-IgG1 17 18 509 20 MRAL.G101C-IgG1 17 18 510 20 MRAL.T102C-IgG1 17 18 511 20 MRAL.K103C-IgG1 17 18 512 20 MRAL.V104C-IgG1 17 18 513 20 MRAL.E105C-IgG1 17 18 514 20

Nome da variante Região va- Região Região va- Região de cadeia leve riável de constante riável de constante MRA-IgG1 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: MRAL.I106C-IgG1 17 18 515 20 MRAL.K107C-IgG1 17 18 516 20 k0.R108C-IgG1 17 18 19 517 k0.T109C-IgG1 17 18 19 518 k0.V110C-IgG1 17 18 19 519 k0.A111C-IgG1 17 18 19 520 k0.A112C-IgG1 17 18 19 521 k0.P113C-IgG1 17 18 19 522 k0.S114C-IgG1 17 18 19 523 k0.V115C-IgG1 17 18 19 524 k0.F116C-IgG1 17 18 19 525 k0.P120C-IgG1 17 18 19 526 k0.S121C-IgG1 17 18 19 527 k0.D122C-IgG1 17 18 19 528 k0.E123C-IgG1 17 18 19 529 k0.Q124C-IgG1 17 18 19 530 k0.L125C-IgG1 17 18 19 531 k0.K126C-IgG1 17 18 19 532 k0.S127C-IgG1 17 18 19 533 k0.G128C-IgG1 17 18 19 534 k0.T129C-IgG1 17 18 19 535 k0.A130C-IgG1 17 18 19 536 k0.S131C-IgG1 17 18 19 537 k0.L136C-IgG1 17 18 19 538 k0.N137C-IgG1 17 18 19 539 k0.N138C-IgG1 17 18 19 540 k0.F139C-IgG1 17 18 19 541 k0.Y140C-IgG1 17 18 19 542 k0.P141C-IgG1 17 18 19 543

Nome da variante Região va- Região Região va- Região de cadeia leve riável de constante riável de constante MRA-IgG1 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: k0.R142C-IgG1 17 18 19 544 k0.E143C-IgG1 17 18 19 545 k0.A144C-IgG1 17 18 19 546 k0.K145C-IgG1 17 18 19 547 k0.V146C-IgG1 17 18 19 548 k0.Q147C-IgG1 17 18 19 549 k0.W148C-IgG1 17 18 19 550 k0.K149C-IgG1 17 18 19 551 k0.V150C-IgG1 17 18 19 552 k0.D151C-IgG1 17 18 19 553 k0.N152C-IgG1 17 18 19 554 k0.A153C-IgG1 17 18 19 555 k0.L154C-IgG1 17 18 19 556 k0.Q155C-IgG1 17 18 19 557 k0.S156C-IgG1 17 18 19 558 k0.G157C-IgG1 17 18 19 559 k0.N158C-IgG1 17 18 19 560 k0.S159C-IgG1 17 18 19 561 k0.Q160C-IgG1 17 18 19 562 k0.E161C-IgG1 17 18 19 563 k0.S162C-IgG1 17 18 19 564 k0.V163C-IgG1 17 18 19 565 k0.T164C-IgG1 17 18 19 566 k0.E165C-IgG1 17 18 19 567 k0.Q166C-IgG1 17 18 19 568 k0.D167C-IgG1 17 18 19 569 k0.S168C-IgG1 17 18 19 570 k0.K169C-IgG1 17 18 19 571 k0.D170C-IgG1 17 18 19 572

Nome da variante Região va- Região Região va- Região de cadeia leve riável de constante riável de constante MRA-IgG1 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: k0.S171C-IgG1 17 18 19 573 k0.T172C-IgG1 17 18 19 574 k0.Y173C-IgG1 17 18 19 575 k0.S174C-IgG1 17 18 19 576 k0.L175C-IgG1 17 18 19 577 k0.T180C-IgG1 17 18 19 578 k0.L181C-IgG1 17 18 19 579 k0.S182C-IgG1 17 18 19 580 k0.K183C-IgG1 17 18 19 581 k0.A184C-IgG1 17 18 19 582 k0.D185C-IgG1 17 18 19 583 k0.Y186C-IgG1 17 18 19 584 k0.E187C-IgG1 17 18 19 585 k0.K188C-IgG1 17 18 19 586 k0.H189C-IgG1 17 18 19 587 k0.K190C-IgG1 17 18 19 588 k0.V191C-IgG1 17 18 19 589 k0.Y192C-IgG1 17 18 19 590 k0.A193C-IgG1 17 18 19 591 k0.E195C-IgG1 17 18 19 592 k0.V196C-IgG1 17 18 19 593 k0.T197C-IgG1 17 18 19 594 k0.H198C-IgG1 17 18 19 595 k0.Q199C-IgG1 17 18 19 596 k0.G200C-IgG1 17 18 19 597 k0.L201C-IgG1 17 18 19 598 k0.S202C-IgG1 17 18 19 599 k0.S203C-IgG1 17 18 19 600 k0.P204C-IgG1 17 18 19 601

Nome da variante Região va- Região Região va- Região de cadeia leve riável de constante riável de constante MRA-IgG1 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: k0.V205C-IgG1 17 18 19 602 k0.T206C-IgG1 17 18 19 603 k0.K207C-IgG1 17 18 19 604 k0.S208C-IgG1 17 18 19 605 k0.F209C-IgG1 17 18 19 606 k0.N210C-IgG1 17 18 19 607 k0.R211C-IgG1 17 18 19 608 k0.G212C-IgG1 17 18 19 609 k0.E213C-IgG1 17 18 19 610 Exemplo 8-2. Avaliação da mobilidade eletroforética em gel de poliacri- lamida de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições de IgG1

[00531] Foi examinado com SDS-PAGE não redutora se as varian- tes de MRA-IgG1 produzidas no Exemplo 8-1 mostram uma mobilida- de eletroforética diferente para MRA-IgG1. A solução tampão de amostra (2ME-) (x4) (Wako; 198-13282) foi utilizada para a preparação de amostras de eletroforese, as amostras foram tratadas durante 10 minutos sob a condição de concentração de amostra de 50 μg/ml e 70 °C, e depois submetidas a SDS-PAGE não redutora. Em SDS-PAGE não redutora, a eletroforese foi realizada durante 90 minutos em 125 V, utilizando SDS-PAGE 4% mini 15well 1,0mm 15well (TEFCO; Cat#01-052-6). Em seguida, o gel foi corado com CBB, a imagem do gel foi capturada com ChemiDocTouchMP (BIORAD) e as faixas foram quantificadas com Image Lab (BIORAD).

[00532] A partir da imagem de gel obtida, as variantes foram classi- ficadas em 7 grupos de acordo com o padrão de faixa de cada uma das variantes MRA-IgG1: Única (uma faixa em uma região de peso molecular semelhante àquela de MRA-IgG1), Dupla (duas faixas em uma região de peso molecular semelhante àquela de MRA-IgG1), Tri- pla (três faixas em uma região de peso molecular semelhante àquela de MRA-IgG1), Várias (quatro ou mais faixas em uma região de peso molecular semelhante àquela de MRA-IgG1), LMW (faixa(s) em uma região de peso molecular mais baixa do que àquela de MRA-IgG1), HMW (faixa(s) em uma região de peso molecular mais elevada do que àquela de MRA-IgG1) e Fraco (faixas indistintas e difíceis de determi- nar). Em relação às variantes MRA-IgG1 classificadas como “Dupla”, uma das duas faixas apresentou a mesma mobilidade eletroforética que MRA-IgG1, enquanto que a outra faixa apresentou mobilidade li- geiramente mais rápida ou mais lenta.

Assim, para as variantes MRA- IgG1 classificadas como “Dupla”, também foi calculada a porcentagem das faixas com mobilidade diferente para MRA-IgG1 (porcentagem da nova faixa (%)). O agrupamento dos padrões de faixa para variantes de cadeia pesada MRA-IgG1 e variantes de cadeia leve MRA-IgG1 e os resultados de cálculo da porcentagem de faixa são mostrados res- pectivamente nas Tabelas 18 e 19. A partir das Tabelas 18 e 19, as variantes classificadas nos grupos Dupla e Tripla são mostradas na Tabela 20. Nestas variantes, é altamente provável que a substituição de cisteína provocou mudanças estruturais tais como reticulação de Fabs, que resultou na mudança na mobilidade eletroforética.

Observa- se que, embora a Tabela 19 indique "sem dados" para MRAL.K107C- IgG1, a posição 107 (numeração de Kabat), que é a posição de substi- tuição de cisteína nesta variante, é uma posição onde o resíduo estru- turalmente exposto à superfície está presente na região de dobradiça.

Assim, também nesta variante, é altamente provável que a substitui- ção de cisteína provoque mudanças estruturais, como a reticulação de Fabs, e resulte na mudança na mobilidade eletroforética.

Tabela 18 Nome da variante de cadeia pe- Grupo Porcentagem da no- sada MRA-IgG1 va faixa (%) MRAH.Q5C-IgG1 Única - MRAH.E6C-IgG1 Dupla 30,7 MRAH.S7C-IgG1 Única - MRAH.G8C-IgG1 Única - MRAH.P9C-IgG1 Única - MRAH.G10C-IgG1 Única - MRAH.L11C-IgG1 Única - MRAH.V12C-IgG1 Única - MRAH.R13C-IgG1 Única - MRAH.P14C-IgG1 Única - MRAH.S15C-IgG1 Única - MRAH.Q16C-IgG1 Única - MRAH.T17C-IgG1 Única - MRAH.L18C-IgG1 Fraca - MRAH.S19C-IgG1 Única - MRAH.L20C-IgG1 Fraca - MRAH.T21C-IgG1 Única - MRAH.T23C-IgG1 sem dados - MRAH.S25C-IgG1 Dupla 20,2 MRAH.G26C-IgG1 Dupla 14,5 MRAH.S28C-IgG1 Única - MRAH.T30C-IgG1 Única - MRAH.S31C-IgG1 Única - MRAH.W35C-IgG1 Fraca - MRAH.S35aC-IgG1 Fraca - MRAH.Y50C-IgG1 Única - MRAH.I51C-IgG1 Fraca - MRAH.S52C-IgG1 Única - MRAH.S62C-IgG1 Única - MRAH.L63C-IgG1 Única -

Nome da variante de cadeia pe- Grupo Porcentagem da no- sada MRA-IgG1 va faixa (%) MRAH.K64C-IgG1 Única - MRAH.S65C-IgG1 Única - MRAH.R66C-IgG1 Única - MRAH.V67C-IgG1 Única - MRAH.T68C-IgG1 Única - MRAH.L70C-IgG1 sem dados - MRAH.D72C-IgG1 Única - MRAH.T73C-IgG1 Única - MRAH.S74C-IgG1 Única - MRAH.K75C-IgG1 Única - MRAH.N76C-IgG1 Única - MRAH.Q77C-IgG1 Única - MRAH.S79C-IgG1 Única - MRAH.L80C-IgG1 Fraca - MRAH.R81C-IgG1 Única - MRAH.L82C-IgG1 Fraca - MRAH.S82aC-IgG1 Única - MRAH.S82bC-IgG1 Única - MRAH.V82cC-IgG1 Fraca - MRAH.D101C-IgG1 Única - MRAH.Y102C-IgG1 Única - MRAH.S112C-IgG1 Única - MRAH.S113C-IgG1 Única - G1T4.A118C-IgG1 Única - G1T4.S119C-IgG1 Dupla 18,4 G1T4.T120C-IgG1 Única - G1T4.K121C-IgG1 Única - G1T4.G122C-IgG1 Única - G1T4.P123C-IgG1 LMW - G1T4.S124C-IgG1 Única - G1T4.V125C-IgG1 LMW -

Nome da variante de cadeia pe- Grupo Porcentagem da no- sada MRA-IgG1 va faixa (%) G1T4.F126C-IgG1 Única - G1T4.P127C-IgG1 LMW - G1T4.S131C-IgG1 Tripla - G1T4.S132C-IgG1 Tripla - G1T4.K133C-IgG1 Tripla - G1T4.S134C-IgG1 Tripla - G1T4.T135C-IgG1 Tripla - G1T4.S136C-IgG1 Tripla - G1T4.G137C-IgG1 Tripla - G1T4.G138C-IgG1 Dupla 56,7 G1T4.T139C-IgG1 Única - G1T4.A140C-IgG1 Única - G1T4.A141C-IgG1 Fraca - G1T4.D148C-IgG1 Única - G1T4.Y149C-IgG1 Fraca - G1T4.F150C-IgG1 Única - G1T4.P151C-IgG1 Fraca - G1T4.E152C-IgG1 Única - G1T4.P153C-IgG1 Única - G1T4.V154C-IgG1 LMW - G1T4.T155C-IgG1 Única - G1T4.V156C-IgG1 LMW - G1T4.S157C-IgG1 Única - G1T4.W158C-IgG1 LMW - G1T4.N159C-IgG1 Dupla 24 G1T4.S160C-IgG1 Dupla 35,7 G1T4.G161C-IgG1 Dupla 27,2 G1T4.A162C-IgG1 Dupla 27,8 G1T4.L163C-IgG1 Dupla 16,7 G1T4.T164C-IgG1 Dupla 13,8 G1T4.S165C-IgG1 Única -

Nome da variante de cadeia pe- Grupo Porcentagem da no- sada MRA-IgG1 va faixa (%) G1T4.G166C-IgG1 Única - G1T4.V167C-IgG1 Única - G1T4.V173C-IgG1 Única - G1T4.L174C-IgG1 Única - G1T4.Q175C-IgG1 Única - G1T4.S176C-IgG1 Única - G1T4.S177C-IgG1 Única - G1T4.G178C-IgG1 Única - G1T4.L179C-IgG1 Única - G1T4.Y180C-IgG1 LMW - G1T4.V186C-IgG1 LMW - G1T4.T187C-IgG1 Única - G1T4.V188C-IgG1 LMW - G1T4.P189C-IgG1 sem dados - G1T4.S190C-IgG1 Dupla 31,8 G1T4.S191C-IgG1 Dupla 66,3 G1T4.S192C-IgG1 Dupla 26,8 G1T4.L193C-IgG1 LMW - G1T4.G194C-IgG1 Fraca - G1T4.T195C-IgG1 Dupla 78,1 G1T4.Q196C-IgG1 Dupla 27,4 G1T4.T197C-IgG1 Dupla 84,4 G1T4.Y198C-IgG1 Fraca - G1T4.I199C-IgG1 Única - G1T4.N201C-IgG1 Dupla 17,5 G1T4.V202C-IgG1 LMW - G1T4.N203C-IgG1 Dupla 17,2 G1T4.H204C-IgG1 Fraca - G1T4.K205C-IgG1 Dupla 18,4 G1T4.P206C-IgG1 Dupla 14,4 G1T4.S207C-IgG1 Dupla 21,5

Nome da variante de cadeia pe- Grupo Porcentagem da no- sada MRA-IgG1 va faixa (%) G1T4.N208C-IgG1 Dupla 16,1 G1T4.T209C-IgG1 Única - G1T4.K210C-IgG1 Única - G1T4.V211C-IgG1 Dupla 27,2 G1T4.D212C-IgG1 Dupla 28,2 G1T4.K213C-IgG1 LMW - G1T4.R214C-IgG1 LMW - G1T4.V215C-IgG1 LMW - G1T4.E216C-IgG1 LMW - G1T4.P217C-IgG1 LMW - G1T4.K218C-IgG1 Dupla 39,3 G1T4.S219C-IgG1 Dupla 68,7

Tabela 19 Nome da variante de cadeia leve Grupo Porcentagem da no- MRA-IgG1 va faixa (%) MRAL.T5C-IgG1 Única - MRAL.Q6C-IgG1 LMW - MRAL.S7C-IgG1 Única - MRAL.P8C-IgG1 sem dados - MRAL.S9C-IgG1 Única - MRAL.S10C-IgG1 Única - MRAL.L11C-IgG1 Única - MRAL.S12C-IgG1 Única - MRAL.A13C-IgG1 Única - MRAL.S14C-IgG1 Única - MRAL.V15C-IgG1 Única - MRAL.G16C-IgG1 Única - MRAL.D17C-IgG1 Única - MRAL.R18C-IgG1 Única - MRAL.V19C-IgG1 LMW -

Nome da variante de cadeia leve Grupo Porcentagem da no- MRA-IgG1 va faixa (%) MRAL.T20C-IgG1 Única - MRAL.I21C-IgG1 Dupla 68,9 MRAL.T22C-IgG1 Única - MRAL.A25C-IgG1 sem dados - MRAL.S26C-IgG1 sem dados - MRAL.Q27C-IgG1 Tripla - MRAL.Y32C-IgG1 Única - MRAL.L33C-IgG1 LMW - MRAL.N34C-IgG1 LMW - MRAL.Y50C-IgG1 Única - MRAL.T51C-IgG1 Única - MRAL.H55C-IgG1 Única - MRAL.S56C-IgG1 Única - MRAL.G57C-IgG1 Única - MRAL.V58C-IgG1 Dupla 17,4 MRAL.P59C-IgG1 Única - MRAL.S60C-IgG1 Única - MRAL.R61C-IgG1 Única - MRAL.F62C-IgG1 LMW - MRAL.S63C-IgG1 Única - MRAL.S65C-IgG1 Única - MRAL.S67C-IgG1 Única - MRAL.G68C-IgG1 Única - MRAL.T69C-IgG1 Única - MRAL.D70C-IgG1 Única - MRAL.T72C-IgG1 Única - MRAL.F73C-IgG1 LMW - MRAL.T74C-IgG1 Única - MRAL.I75C-IgG1 sem dados - MRAL.S76C-IgG1 Única - MRAL.S77C-IgG1 Dupla 18,1

Nome da variante de cadeia leve Grupo Porcentagem da no- MRA-IgG1 va faixa (%) MRAL.L78C-IgG1 LMW - MRAL.Q79C-IgG1 Única - MRAL.Y96C-IgG1 LMW - MRAL.T97C-IgG1 Única - MRAL.F98C-IgG1 LMW - MRAL.G99C-IgG1 sem dados - MRAL.Q100C-IgG1 Única - MRAL.G101C-IgG1 Única - MRAL.T102C-IgG1 LMW - MRAL.K103C-IgG1 Única - MRAL.V104C-IgG1 LMW - MRAL.E105C-IgG1 sem dados - MRAL.I106C-IgG1 Única - MRAL.K107C-IgG1 sem dados - k0.R108C-IgG1 Única - k0.T109C-IgG1 Dupla 23,1 k0.V110C-IgG1 Única - k0.A111C-IgG1 Única - k0.A112C-IgG1 Dupla 21,6 k0.P113C-IgG1 Única - k0.S114C-IgG1 Única - k0.V115C-IgG1 LMW - k0.F116C-IgG1 Única - k0.P120C-IgG1 LMW - k0.S121C-IgG1 Several - k0.D122C-IgG1 LMW - k0.E123C-IgG1 Dupla 18,1 k0.Q124C-IgG1 LMW - k0.L125C-IgG1 LMW - k0.K126C-IgG1 Tripla - k0.S127C-IgG1 Única -

Nome da variante de cadeia leve Grupo Porcentagem da no- MRA-IgG1 va faixa (%) k0.G128C-IgG1 Dupla 19,4 k0.T129C-IgG1 Única - k0.A130C-IgG1 LMW - k0.S131C-IgG1 LMW - k0.L136C-IgG1 LMW - k0.N137C-IgG1 LMW - k0.N138C-IgG1 Única - k0.F139C-IgG1 LMW - k0.Y140C-IgG1 LMW - k0.P141C-IgG1 Única - k0.R142C-IgG1 Única - k0.E143C-IgG1 Única - k0.A144C-IgG1 LMW - k0.K145C-IgG1 Única - k0.V146C-IgG1 LMW - k0.Q147C-IgG1 Única - k0.W148C-IgG1 LMW - k0.K149C-IgG1 Única - k0.V150C-IgG1 LMW - k0.D151C-IgG1 Única - k0.N152C-IgG1 Dupla 62,4 k0.A153C-IgG1 Única - k0.L154C-IgG1 Única - k0.Q155C-IgG1 Única - k0.S156C-IgG1 HMW - k0.G157C-IgG1 Única - k0.N158C-IgG1 Única - k0.S159C-IgG1 Única - k0.Q160C-IgG1 Única - k0.E161C-IgG1 Única - k0.S162C-IgG1 Única -

Nome da variante de cadeia leve Grupo Porcentagem da no- MRA-IgG1 va faixa (%) k0.V163C-IgG1 Única - k0.T164C-IgG1 Única - k0.E165C-IgG1 Única - k0.Q166C-IgG1 Única - k0.D167C-IgG1 Única - k0.S168C-IgG1 Única - k0.K169C-IgG1 Única - k0.D170C-IgG1 Única - k0.S171C-IgG1 Única - k0.T172C-IgG1 LMW - k0.Y173C-IgG1 LMW - k0.S174C-IgG1 Única - k0.L175C-IgG1 LMW - k0.T180C-IgG1 Única - k0.L181C-IgG1 Única - k0.S182C-IgG1 Única - k0.K183C-IgG1 Única - k0.A184C-IgG1 Única - k0.D185C-IgG1 Única - k0.Y186C-IgG1 Dupla 26,3 k0.E187C-IgG1 LMW - k0.K188C-IgG1 Única - k0.H189C-IgG1 Tripla - k0.K190C-IgG1 LMW - k0.V191C-IgG1 LMW - k0.Y192C-IgG1 Única - k0.A193C-IgG1 Única - k0.E195C-IgG1 Única - k0.V196C-IgG1 Única - k0.T197C-IgG1 Única - k0.H198C-IgG1 Fraca -

Nome da variante de cadeia leve Grupo Porcentagem da no- MRA-IgG1 va faixa (%) k0.Q199C-IgG1 Única - k0.G200C-IgG1 Dupla 18,7 k0.L201C-IgG1 Única - k0.S202C-IgG1 Dupla 42,3 k0.S203C-IgG1 Dupla 45,5 k0.P204C-IgG1 Única - k0.V205C-IgG1 Única - k0.T206C-IgG1 Única - k0.K207C-IgG1 Única - k0.S208C-IgG1 Única - k0.F209C-IgG1 LMW - k0.N210C-IgG1 LMW - k0.R211C-IgG1 Única - k0.G212C-IgG1 Dupla 68,5 k0.E213C-IgG1 LMW -

Tabela 20 Nome da variante MRA-IgG1 Grupo Porcentagem da nova faixa (%) MRAH.E6C-IgG1 Dupla 30,7 MRAH.S25C-IgG1 Dupla 20,2 MRAH.G26C-IgG1 Dupla 14,5 G1T4.S119C-IgG1 Dupla 18,4 G1T4.S131C-IgG1 Tripla - G1T4.S132C-IgG1 Tripla - G1T4.K133C-IgG1 Tripla - G1T4.S134C-IgG1 Tripla - G1T4.T135C-IgG1 Tripla - G1T4.S136C-IgG1 Tripla - G1T4.G137C-IgG1 Tripla - G1T4.G138C-IgG1 Dupla 56,7 G1T4.N159C-IgG1 Dupla 24 G1T4.S160C-IgG1 Dupla 35,7 G1T4.G161C-IgG1 Dupla 27,2 G1T4.A162C-IgG1 Dupla 27,8 G1T4.L163C-IgG1 Dupla 16,7 G1T4.T164C-IgG1 Dupla 13,8 G1T4.S190C-IgG1 Dupla 31,8 G1T4.S191C-IgG1 Dupla 66,3 G1T4.S192C-IgG1 Dupla 26,8 G1T4.T195C-IgG1 Dupla 78,1 G1T4.Q196C-IgG1 Dupla 27,4 G1T4.T197C-IgG1 Dupla 84,4 G1T4.N201C-IgG1 Dupla 17,5 G1T4.N203C-IgG1 Dupla 17,2 G1T4.K205C-IgG1 Dupla 18,4 G1T4.P206C-IgG1 Dupla 14,4 G1T4.S207C-IgG1 Dupla 21,5 G1T4.N208C-IgG1 Dupla 16,1

Nome da variante MRA-IgG1 Grupo Porcentagem da nova faixa (%) G1T4.V211C-IgG1 Dupla 27,2 G1T4.D212C-IgG1 Dupla 28,2 G1T4.K218C-IgG1 Dupla 39,3 G1T4.S219C-IgG1 Dupla 68,7 MRAL.I21C-IgG1 Dupla 68,9 MRAL.Q27C-IgG1 Tripla - MRAL.V58C-IgG1 Dupla 17,4 MRAL.S77C-IgG1 Dupla 18,1 k0.T109C-IgG1 Dupla 23,1 k0.A112C-IgG1 Dupla 21,6 k0.E123C-IgG1 Dupla 18,1 k0.K126C-IgG1 Tripla - k0.G128C-IgG1 Dupla 19,4 k0.N152C-IgG1 Dupla 62,4 k0.Y186C-IgG1 Dupla 26,3 k0.H189C-IgG1 Tripla - k0.G200C-IgG1 Dupla 18,7 k0.S202C-IgG1 Dupla 42,3 k0.S203C-IgG1 Dupla 45,5 k0.G212C-IgG1 Dupla 68,5 Exemplo 9: Avaliação de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições de IgG4 Exemplo 9-1. Produção de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições de IgG4

[00533] A cadeia pesada e a cadeia leve de um anticorpo neutrali- zante IL6R anti-humano, MRA-IgG4 (cadeia pesada: MRAH-G4T1 (SEQ ID NO: 310), cadeia leve: MRAL-k0 (SEQ ID NO: 16)), foram submetidas a um estudo em que um resíduo de aminoácido arbitrário estruturalmente exposto à superfície foi substituído por cisteína.

[00534] Resíduos de aminoácido dentro da região variável de ca- deia pesada MRA-IgG4 (MRAH, SEQ ID NO: 17) foram substituídos por cisteína para produzir variantes da região variável de cadeia pesa- da MRA-IgG4 mostrada na Tabela 21. Estas variantes da região variá- vel da cadeia pesada MRA-IgG4 foram cada uma ligada com a região constante de cadeia pesada MRA-IgG4 (G4T1, SEQ ID NO: 311) para produzir as variantes de cadeia pesada MRA-IgG4, e os vetores de expressão que codificam os genes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

Além disso, os resíduos de aminoácido dentro da região constante de cadeia pe- sada MRA-IgG4 (G4T1, SEQ ID NO: 311) foram substituídos por ciste- ína para produzir variantes da região constante de cadeia pesada MRA-IgG4 mostradas na Tabela 22. Estas variantes da região cons- tante de cadeia pesada MRA-IgG4 foram ligadas à região variável de cadeia pesada MRA-IgG4 (MRAH, SEQ ID NO: 17) para produzir vari- antes de cadeia pesada MRA-IgG4, e os vetores de expressão que codificam os genes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

Tabela 21 Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG4 teína (numeração de Kabat) NO: MRAH.Q5C 5 322 MRAH.E6C 6 323 MRAH.S7C 7 324 MRAH.G8C 8 325 MRAH.P9C 9 326 MRAH.G10C 10 327 MRAH.L11C 11 328 MRAH.V12C 12 329 MRAH.R13C 13 330 MRAH.P14C 14 331

Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG4 teína (numeração de Kabat) NO: MRAH.S15C 15 332 MRAH.Q16C 16 333 MRAH.T17C 17 334 MRAH.L18C 18 335 MRAH.S19C 19 336 MRAH.L20C 20 337 MRAH.T21C 21 338 MRAH.T23C 23 339 MRAH.S25C 25 340 MRAH.G26C 26 341 MRAH.S28C 28 342 MRAH.T30C 30 343 MRAH.S31C 31 344 MRAH.W35C 35 345 MRAH.S35aC 35a 346 MRAH.Y50C 50 347 MRAH.I51C 51 348 MRAH.S52C 52 349 MRAH.S62C 62 350 MRAH.L63C 63 351 MRAH.K64C 64 352 MRAH.S65C 65 353 MRAH.R66C 66 354 MRAH.V67C 67 355 MRAH.T68C 68 356 MRAH.L70C 70 357 MRAH.D72C 72 358 MRAH.T73C 73 359 MRAH.S74C 74 360 MRAH.K75C 75 361 MRAH.N76C 76 362

Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG4 teína (numeração de Kabat) NO: MRAH.Q77C 77 363 MRAH.S79C 79 364 MRAH.L80C 80 365 MRAH.R81C 81 366 MRAH.L82C 82 367 MRAH.S82aC 82a 368 MRAH.S82bC 82b 369 MRAH.V82cC 82c 370 MRAH.D101C 101 371 MRAH.Y102C 102 372 MRAH.S112C 112 373 MRAH.S113C 113 374

Tabela 22 Variante da região constante Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG4 teína (numeração da EU) NO: G4T1.A118C 118 611 G4T1.S119C 119 612 G4T1.T120C 120 613 G4T1.K121C 121 614 G4T1.G122C 122 615 G4T1.P123C 123 616 G4T1.S124C 124 617 G4T1.V125C 125 618 G4T1.F126C 126 619 G4T1.P127C 127 620 G4T1.S132C 132 621 G4T1.R133C 133 622 G4T1.S134C 134 623 G4T1.T135C 135 624 G4T1.S136C 136 625

Variante da região constante Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG4 teína (numeração da EU) NO: G4T1.E137C 137 626 G4T1.S138C 138 627 G4T1.T139C 139 628 G4T1.A140C 140 629 G4T1.A141C 141 630 G4T1.D148C 148 631 G4T1.Y149C 149 632 G4T1.F150C 150 633 G4T1.P151C 151 634 G4T1.E152C 152 635 G4T1.P153C 153 636 G4T1.V154C 154 637 G4T1.T155C 155 638 G4T1.V156C 156 639 G4T1.S157C 157 640 G4T1.W158C 158 641 G4T1.N159C 159 642 G4T1.S160C 160 643 G4T1.G161C 161 644 G4T1.A162C 162 645 G4T1.L163C 163 646 G4T1.T164C 164 647 G4T1.S165C 165 648 G4T1.G166C 166 649 G4T1.V167C 167 650 G4T1.V173C 173 651 G4T1.L174C 174 652 G4T1.Q175C 175 653 G4T1.S176C 176 654 G4T1.S177C 177 655 G4T1.G178C 178 656

Variante da região constante Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG4 teína (numeração da EU) NO: G4T1.L179C 179 657 G4T1.Y180C 180 658 G4T1.V186C 186 659 G4T1.T187C 187 660 G4T1.V188C 188 661 G4T1.P189C 189 662 G4T1.S190C 190 663 G4T1.S191C 191 664 G4T1.S192C 192 665 G4T1.L193C 193 666 G4T1.G194C 194 667 G4T1.T195C 195 668 G4T1.Q196C 196 669 G4T1.T197C 197 670 G4T1.Y198C 198 671 G4T1.T199C 199 672 G4T1.N201C 201 673 G4T1.V202C 202 674 G4T1.D203C 203 675 G4T1.H204C 204 676 G4T1.K205C 205 677 G4T1.P206C 206 678 G4T1.S207C 207 679 G4T1.N208C 208 680 G4T1.T209C 209 681 G4T1.K210C 210 682 G4T1.V211C 211 683 G4T1.D212C 212 684 G4T1.K213C 213 685 G4T1.R214C 214 686 G4T1.V215C 215 687

Variante da região constante Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG4 teína (numeração da EU) NO: G4T1.E216C 216 688 G4T1.S217C 217 689 G4T1.K218C 218 690

[00535] As variantes de cadeia pesada MRA-IgG4 produzidas aci- ma foram combinadas com a cadeia leve MRA-IgG4, ou a cadeia pe- sada MRA-IgG4 foi combinada com as variantes de cadeia leve MRA- IgG4 produzidas no Exemplo 8-1. As variantes de cadeia pesada MRA-IgG4 e as variantes de cadeia leve MRA-IgG4 mostradas nas Tabelas 23 e 24 foram expressas através da expressão transitória uti- lizando células FreeStyle293 (Invitrogen) ou células Expi293 (Life technologies) por um método conhecido da pessoa versada na técni- ca, e purificadas com Proteína A por um método conhecido da pessoa versada na técnica. Tabela 23 Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia pesada MRA- riável de constante riável de constante IgG4 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: MRAH.Q5C-IgG4 322 311 19 20 MRAH.E6C-IgG4 323 311 19 20 MRAH.S7C-IgG4 324 311 19 20 MRAH.G8C-IgG4 325 311 19 20 MRAH.P9C-IgG4 326 311 19 20 MRAH.G10C-IgG4 327 311 19 20 MRAH.L11C-IgG4 328 311 19 20 MRAH.V12C-IgG4 329 311 19 20 MRAH.R13C-IgG4 330 311 19 20 MRAH.P14C-IgG4 331 311 19 20

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia pesada MRA- riável de constante riável de constante IgG4 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: MRAH.S15C-IgG4 332 311 19 20 MRAH.Q16C-IgG4 333 311 19 20 MRAH.T17C-IgG4 334 311 19 20 MRAH.L18C-IgG4 335 311 19 20 MRAH.S19C-IgG4 336 311 19 20 MRAH.L20C-IgG4 337 311 19 20 MRAH.T21C-IgG4 338 311 19 20 MRAH.T23C-IgG4 339 311 19 20 MRAH.S25C-IgG4 340 311 19 20 MRAH.G26C-IgG4 341 311 19 20 MRAH.S28C-IgG4 342 311 19 20 MRAH.T30C-IgG4 343 311 19 20 MRAH.S31C-IgG4 344 311 19 20 MRAH.W35C-IgG4 345 311 19 20 MRAH.S35aC-IgG4 346 311 19 20 MRAH.Y50C-IgG4 347 311 19 20 MRAH.I51C-IgG4 348 311 19 20 MRAH.S52C-IgG4 349 311 19 20 MRAH.S62C-IgG4 350 311 19 20 MRAH.L63C-IgG4 351 311 19 20 MRAH.K64C-IgG4 352 311 19 20 MRAH.S65C-IgG4 353 311 19 20 MRAH.R66C-IgG4 354 311 19 20 MRAH.V67C-IgG4 355 311 19 20 MRAH.T68C-IgG4 356 311 19 20 MRAH.L70C-IgG4 357 311 19 20 MRAH.D72C-IgG4 358 311 19 20 MRAH.T73C-IgG4 359 311 19 20

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia pesada MRA- riável de constante riável de constante IgG4 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: MRAH.S74C-IgG4 360 311 19 20 MRAH.K75C-IgG4 361 311 19 20 MRAH.N76C-IgG4 362 311 19 20 MRAH.Q77C-IgG4 363 311 19 20 MRAH.S79C-IgG4 364 311 19 20 MRAH.L80C-IgG4 365 311 19 20 MRAH.R81C-IgG4 366 311 19 20 MRAH.L82C-IgG4 367 311 19 20 MRAH.S82aC-IgG4 368 311 19 20 MRAH.S82bC-IgG4 369 311 19 20 MRAH.V82cC-IgG4 370 311 19 20 MRAH.D101C-IgG4 371 311 19 20 MRAH.Y102C-IgG4 372 311 19 20 MRAH.S112C-IgG4 373 311 19 20 MRAH.S113C-IgG4 374 311 19 20 G4T1.A118C-IgG4 17 611 19 20 G4T1.S119C-IgG4 17 612 19 20 G4T1.T120C-IgG4 17 613 19 20 G4T1.K121C-IgG4 17 614 19 20 G4T1.G122C-IgG4 17 615 19 20 G4T1.P123C-IgG4 17 616 19 20 G4T1.S124C-IgG4 17 617 19 20 G4T1.V125C-IgG4 17 618 19 20 G4T1.F126C-IgG4 17 619 19 20 G4T1.P127C-IgG4 17 620 19 20 G4T1.S132C-IgG4 17 621 19 20 G4T1.R133C-IgG4 17 622 19 20 G4T1.S134C-IgG4 17 623 19 20

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia pesada MRA- riável de constante riável de constante IgG4 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: G4T1.T135C-IgG4 17 624 19 20 G4T1.S136C-IgG4 17 625 19 20 G4T1.E137C-IgG4 17 626 19 20 G4T1.S138C-IgG4 17 627 19 20 G4T1.T139C-IgG4 17 628 19 20 G4T1.A140C-IgG4 17 629 19 20 G4T1.A141C-IgG4 17 630 19 20 G4T1.D148C-IgG4 17 631 19 20 G4T1.Y149C-IgG4 17 632 19 20 G4T1.F150C-IgG4 17 633 19 20 G4T1.P151C-IgG4 17 634 19 20 G4T1.E152C-IgG4 17 635 19 20 G4T1.P153C-IgG4 17 636 19 20 G4T1.V154C-IgG4 17 637 19 20 G4T1.T155C-IgG4 17 638 19 20 G4T1.V156C-IgG4 17 639 19 20 G4T1.S157C-IgG4 17 640 19 20 G4T1.W158C-IgG4 17 641 19 20 G4T1.N159C-IgG4 17 642 19 20 G4T1.S160C-IgG4 17 643 19 20 G4T1.G161C-IgG4 17 644 19 20 G4T1.A162C-IgG4 17 645 19 20 G4T1.L163C-IgG4 17 646 19 20 G4T1.T164C-IgG4 17 647 19 20 G4T1.S165C-IgG4 17 648 19 20 G4T1.G166C-IgG4 17 649 19 20 G4T1.V167C-IgG4 17 650 19 20 G4T1.V173C-IgG4 17 651 19 20

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia pesada MRA- riável de constante riável de constante IgG4 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: G4T1.L174C-IgG4 17 652 19 20 G4T1.Q175C-IgG4 17 653 19 20 G4T1.S176C-IgG4 17 654 19 20 G4T1.S177C-IgG4 17 655 19 20 G4T1.G178C-IgG4 17 656 19 20 G4T1.L179C-IgG4 17 657 19 20 G4T1.Y180C-IgG4 17 658 19 20 G4T1.V186C-IgG4 17 659 19 20 G4T1.T187C-IgG4 17 660 19 20 G4T1.V188C-IgG4 17 661 19 20 G4T1.P189C-IgG4 17 662 19 20 G4T1.S190C-IgG4 17 663 19 20 G4T1.S191C-IgG4 17 664 19 20 G4T1.S192C-IgG4 17 665 19 20 G4T1.L193C-IgG4 17 666 19 20 G4T1.G194C-IgG4 17 667 19 20 G4T1.T195C-IgG4 17 668 19 20 G4T1.Q196C-IgG4 17 669 19 20 G4T1.T197C-IgG4 17 670 19 20 G4T1.Y198C-IgG4 17 671 19 20 G4T1.T199C-IgG4 17 672 19 20 G4T1.N201C-IgG4 17 673 19 20 G4T1.V202C-IgG4 17 674 19 20 G4T1.D203C-IgG4 17 675 19 20 G4T1.H204C-IgG4 17 676 19 20 G4T1.K205C-IgG4 17 677 19 20 G4T1.P206C-IgG4 17 678 19 20 G4T1.S207C-IgG4 17 679 19 20

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia pesada MRA- riável de constante riável de constante IgG4 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: G4T1.N208C-IgG4 17 680 19 20 G4T1.T209C-IgG4 17 681 19 20 G4T1.K210C-IgG4 17 682 19 20 G4T1.V211C-IgG4 17 683 19 20 G4T1.D212C-IgG4 17 684 19 20 G4T1.K213C-IgG4 17 685 19 20 G4T1.R214C-IgG4 17 686 19 20 G4T1.V215C-IgG4 17 687 19 20 G4T1.E216C-IgG4 17 688 19 20 G4T1.S217C-IgG4 17 689 19 20 G4T1.K218C-IgG4 17 690 19 20

Tabela 24 Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve MRA-IgG4 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: MRAL.T5C-IgG4 17 311 457 20 MRAL.Q6C-IgG4 17 311 458 20 MRAL.S7C-IgG4 17 311 459 20 MRAL.P8C-IgG4 17 311 460 20 MRAL.S9C-IgG4 17 311 461 20 MRAL.S10C-IgG4 17 311 462 20 MRAL.L11C-IgG4 17 311 463 20 MRAL.S12C-IgG4 17 311 464 20 MRAL.A13C-IgG4 17 311 465 20

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve MRA-IgG4 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: MRAL.S14C-IgG4 17 311 466 20 MRAL.V15C-IgG4 17 311 467 20 MRAL.G16C-IgG4 17 311 468 20 MRAL.D17C-IgG4 17 311 469 20 MRAL.R18C-IgG4 17 311 470 20 MRAL.V19C-IgG4 17 311 471 20 MRAL.T20C-IgG4 17 311 472 20 MRAL.I21C-IgG4 17 311 473 20 MRAL.T22C-IgG4 17 311 474 20 MRAL.A25C-IgG4 17 311 475 20 MRAL.S26C-IgG4 17 311 476 20 MRAL.Q27C-IgG4 17 311 477 20 MRAL.Y32C-IgG4 17 311 478 20 MRAL.L33C-IgG4 17 311 479 20 MRAL.N34C-IgG4 17 311 480 20 MRAL.Y50C-IgG4 17 311 481 20 MRAL.T51C-IgG4 17 311 482 20 MRAL.H55C-IgG4 17 311 483 20 MRAL.S56C-IgG4 17 311 484 20 MRAL.G57C-IgG4 17 311 485 20 MRAL.V58C-IgG4 17 311 486 20 MRAL.P59C-IgG4 17 311 487 20 MRAL.S60C-IgG4 17 311 488 20 MRAL.R61C-IgG4 17 311 489 20 MRAL.F62C-IgG4 17 311 490 20 MRAL.S63C-IgG4 17 311 491 20 MRAL.S65C-IgG4 17 311 492 20 MRAL.S67C-IgG4 17 311 493 20

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve MRA-IgG4 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: MRAL.G68C-IgG4 17 311 494 20 MRAL.T69C-IgG4 17 311 495 20 MRAL.D70C-IgG4 17 311 496 20 MRAL.T72C-IgG4 17 311 497 20 MRAL.F73C-IgG4 17 311 498 20 MRAL.T74C-IgG4 17 311 499 20 MRAL.I75C-IgG4 17 311 500 20 MRAL.S76C-IgG4 17 311 501 20 MRAL.S77C-IgG4 17 311 502 20 MRAL.L78C-IgG4 17 311 503 20 MRAL.Q79C-IgG4 17 311 504 20 MRAL.Y96C-IgG4 17 311 505 20 MRAL.T97C-IgG4 17 311 506 20 MRAL.F98C-IgG4 17 311 507 20 MRAL.G99C-IgG4 17 311 508 20 MRAL.Q100C-IgG4 17 311 509 20 MRAL.G101C-IgG4 17 311 510 20 MRAL.T102C-IgG4 17 311 511 20 MRAL.K103C-IgG4 17 311 512 20 MRAL.V104C-IgG4 17 311 513 20 MRAL.E105C-IgG4 17 311 514 20 MRAL.I106C-IgG4 17 311 515 20 MRAL.K107C-IgG4 17 311 516 20 k0.R108C-IgG4 17 311 19 517 k0.T109C-IgG4 17 311 19 518 k0.V110C-IgG4 17 311 19 519 k0.A111C-IgG4 17 311 19 520 k0.A112C-IgG4 17 311 19 521

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve MRA-IgG4 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: k0.P113C-IgG4 17 311 19 522 k0.S114C-IgG4 17 311 19 523 k0.V115C-IgG4 17 311 19 524 k0.F116C-IgG4 17 311 19 525 k0.P120C-IgG4 17 311 19 526 k0.S121C-IgG4 17 311 19 527 k0.D122C-IgG4 17 311 19 528 k0.E123C-IgG4 17 311 19 529 k0.Q124C-IgG4 17 311 19 530 k0.L125C-IgG4 17 311 19 531 k0.K126C-IgG4 17 311 19 532 k0.S127C-IgG4 17 311 19 533 k0.G128C-IgG4 17 311 19 534 k0.T129C-IgG4 17 311 19 535 k0.A130C-IgG4 17 311 19 536 k0.S131C-IgG4 17 311 19 537 k0.L136C-IgG4 17 311 19 538 k0.N137C-IgG4 17 311 19 539 k0.N138C-IgG4 17 311 19 540 k0.F139C-IgG4 17 311 19 541 k0.Y140C-IgG4 17 311 19 542 k0.P141C-IgG4 17 311 19 543 k0.R142C-IgG4 17 311 19 544 k0.E143C-IgG4 17 311 19 545 k0.A144C-IgG4 17 311 19 546 k0.K145C-IgG4 17 311 19 547 k0.V146C-IgG4 17 311 19 548 k0.Q147C-IgG4 17 311 19 549

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve MRA-IgG4 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: k0.W148C-IgG4 17 311 19 550 k0.K149C-IgG4 17 311 19 551 k0.V150C-IgG4 17 311 19 552 k0.D151C-IgG4 17 311 19 553 k0.N152C-IgG4 17 311 19 554 k0.A153C-IgG4 17 311 19 555 k0.L154C-IgG4 17 311 19 556 k0.Q155C-IgG4 17 311 19 557 k0.S156C-IgG4 17 311 19 558 k0.G157C-IgG4 17 311 19 559 k0.N158C-IgG4 17 311 19 560 k0.S159C-IgG4 17 311 19 561 k0.Q160C-IgG4 17 311 19 562 k0.E161C-IgG4 17 311 19 563 k0.S162C-IgG4 17 311 19 564 k0.V163C-IgG4 17 311 19 565 k0.T164C-IgG4 17 311 19 566 k0.E165C-IgG4 17 311 19 567 k0.Q166C-IgG4 17 311 19 568 k0.D167C-IgG4 17 311 19 569 k0.S168C-IgG4 17 311 19 570 k0.K169C-IgG4 17 311 19 571 k0.D170C-IgG4 17 311 19 572 k0.S171C-IgG4 17 311 19 573 k0.T172C-IgG4 17 311 19 574 k0.Y173C-IgG4 17 311 19 575 k0.S174C-IgG4 17 311 19 576 k0.L175C-IgG4 17 311 19 577

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve MRA-IgG4 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: k0.T180C-IgG4 17 311 19 578 k0.L181C-IgG4 17 311 19 579 k0.S182C-IgG4 17 311 19 580 k0.K183C-IgG4 17 311 19 581 k0.A184C-IgG4 17 311 19 582 k0.D185C-IgG4 17 311 19 583 k0.Y186C-IgG4 17 311 19 584 k0.E187C-IgG4 17 311 19 585 k0.K188C-IgG4 17 311 19 586 k0.H189C-IgG4 17 311 19 587 k0.K190C-IgG4 17 311 19 588 k0.V191C-IgG4 17 311 19 589 k0.Y192C-IgG4 17 311 19 590 k0.A193C-IgG4 17 311 19 591 k0.E195C-IgG4 17 311 19 592 k0.V196C-IgG4 17 311 19 593 k0.T197C-IgG4 17 311 19 594 k0.H198C-IgG4 17 311 19 595 k0.Q199C-IgG4 17 311 19 596 k0.G200C-IgG4 17 311 19 597 k0.L201C-IgG4 17 311 19 598 k0.S202C-IgG4 17 311 19 599 k0.S203C-IgG4 17 311 19 600 k0.P204C-IgG4 17 311 19 601 k0.V205C-IgG4 17 311 19 602 k0.T206C-IgG4 17 311 19 603 k0.K207C-IgG4 17 311 19 604 k0.S208C-IgG4 17 311 19 605

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve MRA-IgG4 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: k0.F209C-IgG4 17 311 19 606 k0.N210C-IgG4 17 311 19 607 k0.R211C-IgG4 17 311 19 608 k0.G212C-IgG4 17 311 19 609 k0.E213C-IgG4 17 311 19 610 Exemplo 9-2. Avaliação da mobilidade eletroforética em gel de poliacri- lamida de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições de IgG4

[00536] Similarmente ao Exemplo 8-2, a SDS-PAGE não redutora foi realizada com as variantes MRA-IgG4 produzidas no Exemplo 9-1, a imagem de gel foi capturada e as faixas foram quantificadas.

[00537] A partir da imagem de gel obtida, as variantes foram classi- ficadas em 7 grupos de acordo com o padrão de faixa de cada uma das variantes MRA-IgG4: Única (uma faixa em uma região de peso molecular semelhante àquela de MRA-IgG4), Dupla (duas faixas em uma região de peso molecular semelhante àquela de MRA-IgG4), Tri- pla (três faixas em uma região de peso molecular semelhante àquela de MRA-IgG4), Várias (quatro ou mais faixas em uma região de peso molecular semelhante àquela de MRA-IgG4), LMW (faixa(s) em uma região de peso molecular mais baixo do que aquela de MRA-IgG4), HMW (faixa(s) em uma região de peso molecular mais elevado do que aquela de MRA-IgG4) e Fraco (faixas indistintas e difíceis de determi- nar). Em relação às variantes do MRA-IgG4 classificadas como “Du- pla”, uma das duas faixas apresentou a mesma mobilidade eletroforé- tica que o MRA-IgG4, enquanto que a outra faixa apresentou mobili-

dade ligeiramente mais rápida ou mais lenta.

Assim, para as variantes MRA-IgG4 classificadas como “Duplas”, também foi calculada a por- centagem das faixas com mobilidade diferente para MRA-IgG4 (por- centagem de nova faixa (%)). O agrupamento dos padrões de faixa para variantes de cadeia pesada MRA-IgG4 e variantes de cadeia leve MRA-IgG4, e os resultados de cálculo da porcentagem de faixa são mostrados respectivamente nas Tabelas 25 e 26. A partir das Tabelas 25 e 26, as variantes classificadas em grupos de Dupla e Tripla são mostradas na Tabela 27. Nessas variantes, é altamente provável que a substituição de cisteína provocou mudanças estruturais, tais como reticulação de Fabs, que resultou na mudança na mobilidade eletrofo- rética.

Observa-se que, embora a Tabela 26 indique "sem dados" para MRAL.K107C-IgG4, a posição 107 (numeração de Kabat), que é a po- sição de substituição de cisteína nesta variante, é uma posição onde o resíduo estruturalmente exposto à superfície está presente na região de dobradiça.

Assim, também nesta variante, é altamente provável que a substituição de cisteína provoque mudanças estruturais tais como a reticulação de Fabs, e resulte na mudança na mobilidade eletroforéti- ca.

Tabela 25 Nome da variante de cadeia Grupo Porcentagem da pesada MRA-IgG4 nova faixa (%) MRAH.Q5C-IgG4 Única - MRAH.E6C-IgG4 Dupla 5,8 MRAH.S7C-IgG4 Única - MRAH.G8C-IgG4 Única - MRAH.P9C-IgG4 Única - MRAH.G10C-IgG4 Única - MRAH.L11C-IgG4 Única - MRAH.V12C-IgG4 Fraca - MRAH.R13C-IgG4 Única -

Nome da variante de cadeia Grupo Porcentagem da pesada MRA-IgG4 nova faixa (%) MRAH.P14C-IgG4 Única - MRAH.S15C-IgG4 Única - MRAH.Q16C-IgG4 Única - MRAH.T17C-IgG4 Única - MRAH.L18C-IgG4 LMW - MRAH.S19C-IgG4 Única - MRAH.L20C-IgG4 LMW - MRAH.T21C-IgG4 Única - MRAH.T23C-IgG4 Única - MRAH.S25C-IgG4 Dupla 62,1 MRAH.G26C-IgG4 Dupla 9,4 MRAH.S28C-IgG4 Única - MRAH.T30C-IgG4 Única - MRAH.S31C-IgG4 Única - MRAH.W35C-IgG4 LMW - MRAH.S35aC-IgG4 LMW - MRAH.Y50C-IgG4 Única - MRAH.I51C-IgG4 LMW - MRAH.S52C-IgG4 Única - MRAH.S62C-IgG4 Única - MRAH.L63C-IgG4 Única - MRAH.K64C-IgG4 Única - MRAH.S65C-IgG4 Única - MRAH.R66C-IgG4 Única - MRAH.V67C-IgG4 LMW - MRAH.T68C-IgG4 Única - MRAH.L70C-IgG4 Única - MRAH.D72C-IgG4 Única - MRAH.T73C-IgG4 Única - MRAH.S74C-IgG4 Dupla 5,3 MRAH.K75C-IgG4 Única -

Nome da variante de cadeia Grupo Porcentagem da pesada MRA-IgG4 nova faixa (%) MRAH.N76C-IgG4 Única - MRAH.Q77C-IgG4 Única - MRAH.S79C-IgG4 Única - MRAH.L80C-IgG4 LMW - MRAH.R81C-IgG4 Única - MRAH.L82C-IgG4 LMW - MRAH.S82aC-IgG4 Única - MRAH.S82bC-IgG4 Única - MRAH.V82cC-IgG4 LMW - MRAH.D101C-IgG4 Única - MRAH.Y102C-IgG4 Única - MRAH.S112C-IgG4 Única - MRAH.S113C-IgG4 Única - G4T1.A118C-IgG4 Única - G4T1.S119C-IgG4 Dupla 11 G4T1.T120C-IgG4 Única - G4T1.K121C-IgG4 Única - G4T1.G122C-IgG4 Única - G4T1.P123C-IgG4 LMW - G4T1.S124C-IgG4 Única - G4T1.V125C-IgG4 LMW - G4T1.F126C-IgG4 LMW - G4T1.P127C-IgG4 LMW - G4T1.S132C-IgG4 Tripla - G4T1.R133C-IgG4 Dupla 82,9 G4T1.S134C-IgG4 Dupla 80,4 G4T1.T135C-IgG4 Dupla 88,6 G4T1.S136C-IgG4 Dupla 82,4 G4T1.E137C-IgG4 Dupla 44,7 G4T1.S138C-IgG4 Dupla 52,6 G4T1.T139C-IgG4 Única -

Nome da variante de cadeia Grupo Porcentagem da pesada MRA-IgG4 nova faixa (%) G4T1.A140C-IgG4 Tripla - G4T1.A141C-IgG4 Única - G4T1.D148C-IgG4 Única - G4T1.Y149C-IgG4 Fraca - G4T1.F150C-IgG4 Única - G4T1.P151C-IgG4 LMW - G4T1.E152C-IgG4 Única - G4T1.P153C-IgG4 Única - G4T1.V154C-IgG4 LMW - G4T1.T155C-IgG4 Única - G4T1.V156C-IgG4 LMW - G4T1.S157C-IgG4 Única - G4T1.W158C-IgG4 LMW - G4T1.N159C-IgG4 Dupla 19,9 G4T1.S160C-IgG4 Dupla 29,5 G4T1.G161C-IgG4 Dupla 21,4 G4T1.A162C-IgG4 Dupla 35,6 G4T1.L163C-IgG4 Dupla 21,1 G4T1.T164C-IgG4 Dupla 12,8 G4T1.S165C-IgG4 Dupla 17 G4T1.G166C-IgG4 Dupla 13 G4T1.V167C-IgG4 Dupla 20,4 G4T1.V173C-IgG4 Dupla 15,6 G4T1.L174C-IgG4 Dupla 18,6 G4T1.Q175C-IgG4 Única - G4T1.S176C-IgG4 Dupla 20,3 G4T1.S177C-IgG4 Única - G4T1.G178C-IgG4 Dupla 22,5 G4T1.L179C-IgG4 Dupla 26,1 G4T1.Y180C-IgG4 LMW - G4T1.V186C-IgG4 LMW -

Nome da variante de cadeia Grupo Porcentagem da pesada MRA-IgG4 nova faixa (%) G4T1.T187C-IgG4 Dupla 23,3 G4T1.V188C-IgG4 Dupla 25,5 G4T1.P189C-IgG4 Dupla 30,4 G4T1.S190C-IgG4 Dupla 54,7 G4T1.S191C-IgG4 Dupla 78,3 G4T1.S192C-IgG4 Dupla 46,9 G4T1.L193C-IgG4 Dupla 89,5 G4T1.G194C-IgG4 Dupla 89,2 G4T1.T195C-IgG4 Dupla 90,3 G4T1.Q196C-IgG4 Dupla 63,4 G4T1.T197C-IgG4 Dupla 79,8 G4T1.Y198C-IgG4 LMW - G4T1.T199C-IgG4 LMW - G4T1.N201C-IgG4 LMW - G4T1.V202C-IgG4 LMW - G4T1.D203C-IgG4 LMW - G4T1.H204C-IgG4 LMW - G4T1.K205C-IgG4 LMW - G4T1.P206C-IgG4 LMW - G4T1.S207C-IgG4 LMW - G4T1.N208C-IgG4 LMW - G4T1.T209C-IgG4 LMW - G4T1.K210C-IgG4 Única - G4T1.V211C-IgG4 Única - G4T1.D212C-IgG4 Única - G4T1.K213C-IgG4 Tripla - G4T1.R214C-IgG4 Única - G4T1.V215C-IgG4 Dupla 57,3 G4T1.E216C-IgG4 Única - G4T1.S217C-IgG4 Única - G4T1.K218C-IgG4 Única -

Tabela 26 Nome da variante de cadeia Grupo Porcentagem da leve MRA-IgG4 nova faixa (%) MRAL.T5C-IgG4 HMW - MRAL.Q6C-IgG4 Fraca - MRAL.S7C-IgG4 Única - MRAL.P8C-IgG4 sem dados - MRAL.S9C-IgG4 Única - MRAL.S10C-IgG4 Única - MRAL.L11C-IgG4 Única - MRAL.S12C-IgG4 Única - MRAL.A13C-IgG4 Única - MRAL.S14C-IgG4 Única - MRAL.V15C-IgG4 Única - MRAL.G16C-IgG4 Única - MRAL.D17C-IgG4 Única - MRAL.R18C-IgG4 Única - MRAL.V19C-IgG4 Dupla 29,2 MRAL.T20C-IgG4 Única - MRAL.I21C-IgG4 Fraca - MRAL.T22C-IgG4 Única - MRAL.A25C-IgG4 Fraca - MRAL.S26C-IgG4 Única - MRAL.Q27C-IgG4 Única - MRAL.Y32C-IgG4 Única - MRAL.L33C-IgG4 Fraca - MRAL.N34C-IgG4 Fraca - MRAL.Y50C-IgG4 Única - MRAL.T51C-IgG4 Única - MRAL.H55C-IgG4 Única - MRAL.S56C-IgG4 Dupla 12,2 MRAL.G57C-IgG4 Dupla 13,5

Nome da variante de cadeia Grupo Porcentagem da leve MRA-IgG4 nova faixa (%) MRAL.V58C-IgG4 Dupla 12,3 MRAL.P59C-IgG4 Dupla 3,4 MRAL.S60C-IgG4 Dupla 17,9 MRAL.R61C-IgG4 Única - MRAL.F62C-IgG4 Dupla 39,1 MRAL.S63C-IgG4 Única - MRAL.S65C-IgG4 Única - MRAL.S67C-IgG4 Única - MRAL.G68C-IgG4 Única - MRAL.T69C-IgG4 Única - MRAL.D70C-IgG4 Única - MRAL.T72C-IgG4 Única - MRAL.F73C-IgG4 Dupla 36,9 MRAL.T74C-IgG4 Única - MRAL.I75C-IgG4 sem dados - MRAL.S76C-IgG4 Única - MRAL.S77C-IgG4 Dupla 51,2 MRAL.L78C-IgG4 Fraca - MRAL.Q79C-IgG4 Única - MRAL.Y96C-IgG4 Fraca - MRAL.T97C-IgG4 Única - MRAL.F98C-IgG4 Fraca - MRAL.G99C-IgG4 Dupla 26,7 MRAL.Q100C-IgG4 Única - MRAL.G101C-IgG4 Única - MRAL.T102C-IgG4 Fraca - MRAL.K103C-IgG4 Única - MRAL.V104C-IgG4 Fraca - MRAL.E105C-IgG4 Única - MRAL.I106C-IgG4 Fraca - MRAL.K107C-IgG4 sem dados -

Nome da variante de cadeia Grupo Porcentagem da leve MRA-IgG4 nova faixa (%) k0.R108C-IgG4 Única - k0.T109C-IgG4 Dupla 14,5 k0.V110C-IgG4 Dupla 13,2 k0.A111C-IgG4 Única - k0.A112C-IgG4 Dupla 12 k0.P113C-IgG4 Única - k0.S114C-IgG4 Única - k0.V115C-IgG4 Fraca - k0.F116C-IgG4 Tripla - k0.P120C-IgG4 Fraca - k0.S121C-IgG4 Única - k0.D122C-IgG4 LMW - k0.E123C-IgG4 Única - k0.Q124C-IgG4 Fraca - k0.L125C-IgG4 Única - k0.K126C-IgG4 Dupla 86,3 k0.S127C-IgG4 Única - k0.G128C-IgG4 Única - k0.T129C-IgG4 Única - k0.A130C-IgG4 Fraca - k0.S131C-IgG4 LMW - k0.L136C-IgG4 LMW - k0.N137C-IgG4 Tripla - k0.N138C-IgG4 Única - k0.F139C-IgG4 LMW - k0.Y140C-IgG4 LMW - k0.P141C-IgG4 Única - k0.R142C-IgG4 Única - k0.E143C-IgG4 Única - k0.A144C-IgG4 LMW - k0.K145C-IgG4 Única -

Nome da variante de cadeia Grupo Porcentagem da leve MRA-IgG4 nova faixa (%) k0.V146C-IgG4 LMW - k0.Q147C-IgG4 Única - k0.W148C-IgG4 LMW - k0.K149C-IgG4 Única - k0.V150C-IgG4 LMW - k0.D151C-IgG4 Dupla 21,9 k0.N152C-IgG4 Dupla 68,7 k0.A153C-IgG4 Única - k0.L154C-IgG4 Única - k0.Q155C-IgG4 Única - k0.S156C-IgG4 HMW - k0.G157C-IgG4 Única - k0.N158C-IgG4 Única - k0.S159C-IgG4 Única - k0.Q160C-IgG4 Única - k0.E161C-IgG4 Única - k0.S162C-IgG4 Única - k0.V163C-IgG4 Única - k0.T164C-IgG4 Única - k0.E165C-IgG4 Única - k0.Q166C-IgG4 Única - k0.D167C-IgG4 Única - k0.S168C-IgG4 Única - k0.K169C-IgG4 Única - k0.D170C-IgG4 Única - k0.S171C-IgG4 Única - k0.T172C-IgG4 Fraca - k0.Y173C-IgG4 Fraca - k0.S174C-IgG4 Fraca - k0.L175C-IgG4 Fraca - k0.T180C-IgG4 Única -

Nome da variante de cadeia Grupo Porcentagem da leve MRA-IgG4 nova faixa (%) k0.L181C-IgG4 Fraca - k0.S182C-IgG4 Única - k0.K183C-IgG4 Única - k0.A184C-IgG4 Dupla 11,8 k0.D185C-IgG4 Única - k0.Y186C-IgG4 Dupla 31,7 k0.E187C-IgG4 LMW - k0.K188C-IgG4 Única - k0.H189C-IgG4 Fraca - k0.K190C-IgG4 LMW - k0.V191C-IgG4 LMW - k0.Y192C-IgG4 Fraca - k0.A193C-IgG4 Única - k0.E195C-IgG4 Única - k0.V196C-IgG4 Fraca - k0.T197C-IgG4 Única - k0.H198C-IgG4 Fraca - k0.Q199C-IgG4 Única - k0.G200C-IgG4 Dupla 21,7 k0.L201C-IgG4 Dupla 3,7 k0.S202C-IgG4 Dupla 61,5 k0.S203C-IgG4 Dupla 39 k0.P204C-IgG4 Única - k0.V205C-IgG4 Única - k0.T206C-IgG4 Única - k0.K207C-IgG4 Única - k0.S208C-IgG4 Única - k0.F209C-IgG4 Dupla 82,2 k0.N210C-IgG4 LMW - k0.R211C-IgG4 Dupla 12,1 k0.G212C-IgG4 Dupla 25,6

Nome da variante de cadeia Grupo Porcentagem da leve MRA-IgG4 nova faixa (%) k0.E213C-IgG4 Dupla 90,9

Tabela 27 Nome da variante MRA-IgG4 Grupo Porcentagem da nova faixa (%) MRAH.E6C-IgG4 Dupla 5,8 MRAH.S25C-IgG4 Dupla 62,1 MRAH.G26C-IgG4 Dupla 9,4 MRAH.S74C-IgG4 Dupla 5,3 G4T1.S119C-IgG4 Dupla 11 G4T1.S132C-IgG4 Tripla - G4T1.R133C-IgG4 Dupla 82,9 G4T1.S134C-IgG4 Dupla 80,4 G4T1.T135C-IgG4 Dupla 88,6 G4T1.S136C-IgG4 Dupla 82,4 G4T1.E137C-IgG4 Dupla 44,7 G4T1.S138C-IgG4 Dupla 52,6 G4T1.A140C-IgG4 Tripla - G4T1.N159C-IgG4 Dupla 19,9 G4T1.S160C-IgG4 Dupla 29,5 G4T1.G161C-IgG4 Dupla 21,4 G4T1.A162C-IgG4 Dupla 35,6 G4T1.L163C-IgG4 Dupla 21,1 G4T1.T164C-IgG4 Dupla 12,8 G4T1.S165C-IgG4 Dupla 17 G4T1.G166C-IgG4 Dupla 13 G4T1.V167C-IgG4 Dupla 20,4 G4T1.V173C-IgG4 Dupla 15,6 G4T1.L174C-IgG4 Dupla 18,6 G4T1.S176C-IgG4 Dupla 20,3 G4T1.G178C-IgG4 Dupla 22,5

Nome da variante MRA-IgG4 Grupo Porcentagem da nova faixa (%) G4T1.L179C-IgG4 Dupla 26,1 G4T1.T187C-IgG4 Dupla 23,3 G4T1.V188C-IgG4 Dupla 25,5 G4T1.P189C-IgG4 Dupla 30,4 G4T1.S190C-IgG4 Dupla 54,7 G4T1.S191C-IgG4 Dupla 78,3 G4T1.S192C-IgG4 Dupla 46,9 G4T1.L193C-IgG4 Dupla 89,5 G4T1.G194C-IgG4 Dupla 89,2 G4T1.T195C-IgG4 Dupla 90,3 G4T1.Q196C-IgG4 Dupla 63,4 G4T1.T197C-IgG4 Dupla 79,8 G4T1.K213C-IgG4 Tripla - G4T1.V215C-IgG4 Dupla 57,3 MRAL.V19C-IgG4 Dupla 29,2 MRAL.S56C-IgG4 Dupla 12,2 MRAL.G57C-IgG4 Dupla 13,5 MRAL.V58C-IgG4 Dupla 12,3 MRAL.P59C-IgG4 Dupla 3,4 MRAL.S60C-IgG4 Dupla 17,9 MRAL.F62C-IgG4 Dupla 39,1 MRAL.F73C-IgG4 Dupla 36,9 MRAL.S77C-IgG4 Dupla 51,2 MRAL.G99C-IgG4 Dupla 26,7 k0.T109C-IgG4 Dupla 14,5 k0.V110C-IgG4 Dupla 13,2 k0.A112C-IgG4 Dupla 12 k0.F116C-IgG4 Tripla - k0.K126C-IgG4 Dupla 86,3 k0.N137C-IgG4 Tripla - k0.D151C-IgG4 Dupla 21,9

Nome da variante MRA-IgG4 Grupo Porcentagem da nova faixa (%) k0.N152C-IgG4 Dupla 68,7 k0.A184C-IgG4 Dupla 11,8 k0.Y186C-IgG4 Dupla 31,7 k0.G200C-IgG4 Dupla 21,7 k0.L201C-IgG4 Dupla 3,7 k0.S202C-IgG4 Dupla 61,5 k0.S203C-IgG4 Dupla 39 k0.F209C-IgG4 Dupla 82,2 k0.R211C-IgG4 Dupla 12,1 k0.G212C-IgG4 Dupla 25,6 k0.E213C-IgG4 Dupla 90,9 Exemplo 10: Avaliação de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições de IgG2 Exemplo 10-1. Produção de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições de IgG2

[00538] A cadeia pesada e a cadeia leve de um anticorpo neutrali- zante IL6R anti-humano, MRA-IgG2 (cadeia pesada: MRAH-G2d (SEQ ID NO: 312), cadeia leve: MRAL-k0 (SEQ ID NO: 16)), foram submeti- das a um estudo em que um resíduo de aminoácido arbitrário estrutu- ralmente exposto à superfície foi substituído por cisteína.

[00539] Os resíduos de aminoácido dentro da região variável de cadeia pesada MRA-IgG2 (MRAH, SEQ ID NO: 17) foram substituídos por cisteína para produzir variantes da região variável de cadeia pesa- da MRA-IgG2 mostradas na Tabela 28. Estas variantes da região vari- ável de cadeia pesada MRA-IgG2 foram cada uma ligada à região constante de cadeia pesada MRA-IgG2 (G2d, SEQ ID NO: 313) para produzir variantes de cadeia pesada MRA-IgG2, e os vetores de ex- pressão que codificam os genes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica. Além disso,

os resíduos de aminoácido na região constante de cadeia pesada MRA-IgG2 (G2d, SEQ ID NO: 313) foram substituídos por cisteína pa- ra produzir variantes da região constante de cadeia pesada MRA-IgG2 mostradas na Tabela 29. Estas variantes da região constante de ca- deia pesada MRA-IgG2 foram cada uma ligada com a região variável de cadeia pesada MRA-IgG2 (MRAH, SEQ ID NO: 17) para produzir variantes de cadeia pesada MRA-IgG2 e os vetores de expressão que codificam os genes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

Tabela 28 Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG2 teína (numeração de Kabat) NO: MRAH.Q5C 5 322 MRAH.E6C 6 323 MRAH.S7C 7 324 MRAH.G8C 8 325 MRAH.P9C 9 326 MRAH.G10C 10 327 MRAH.L11C 11 328 MRAH.V12C 12 329 MRAH.R13C 13 330 MRAH.P14C 14 331 MRAH.S15C 15 332 MRAH.Q16C 16 333 MRAH.T17C 17 334 MRAH.L18C 18 335 MRAH.S19C 19 336 MRAH.L20C 20 337 MRAH.T21C 21 338 MRAH.T23C 23 339 MRAH.S25C 25 340 MRAH.G26C 26 341

Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG2 teína (numeração de Kabat) NO: MRAH.S28C 28 342 MRAH.T30C 30 343 MRAH.S31C 31 344 MRAH.W35C 35 345 MRAH.S35aC 35a 346 MRAH.Y50C 50 347 MRAH.I51C 51 348 MRAH.S52C 52 349 MRAH.S62C 62 350 MRAH.L63C 63 351 MRAH.K64C 64 352 MRAH.S65C 65 353 MRAH.R66C 66 354 MRAH.V67C 67 355 MRAH.T68C 68 356 MRAH.L70C 70 357 MRAH.D72C 72 358 MRAH.T73C 73 359 MRAH.S74C 74 360 MRAH.K75C 75 361 MRAH.N76C 76 362 MRAH.Q77C 77 363 MRAH.S79C 79 364 MRAH.L80C 80 365 MRAH.R81C 81 366 MRAH.L82C 82 367 MRAH.S82aC 82a 368 MRAH.S82bC 82b 369 MRAH.V82cC 82c 370 MRAH.D101C 101 371 MRAH.Y102C 102 372

Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG2 teína (numeração de Kabat) NO: MRAH.S112C 112 373 MRAH.S113C 113 374

Tabela 29 Variante da região constante Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG2 teína (numeração da EU) NO: G2d.A118C 118 691 G2d.S119C 119 692 G2d.T120C 120 693 G2d.K121C 121 694 G2d.G122C 122 695 G2d.P123C 123 696 G2d.S124C 124 697 G2d.V125C 125 698 G2d.F126C 126 699 G2d.P127C 127 700 G2d.S132C 132 701 G2d.R133C 133 702 G2d.S134C 134 703 G2d.T135C 135 704 G2d.S136C 136 705 G2d.E137C 137 706 G2d.S138C 138 707 G2d.T139C 139 708 G2d.A140C 140 709 G2d.A141C 141 710 G2d.D148C 148 711 G2d.Y149C 149 712 G2d.F150C 150 713 G2d.P151C 151 714 G2d.E152C 152 715

Variante da região constante Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG2 teína (numeração da EU) NO: G2d.P153C 153 716 G2d.V154C 154 717 G2d.T155C 155 718 G2d.V156C 156 719 G2d.S157C 157 720 G2d.W158C 158 721 G2d.N159C 159 722 G2d.S160C 160 723 G2d.G161C 161 724 G2d.A162C 162 725 G2d.L163C 163 726 G2d.T164C 164 727 G2d.S165C 165 728 G2d.G166C 166 729 G2d.V167C 167 730 G2d.V173C 173 731 G2d.L174C 174 732 G2d.Q175C 175 733 G2d.S176C 176 734 G2d.S177C 177 735 G2d.G178C 178 736 G2d.L179C 179 737 G2d.Y180C 180 738 G2d.V186C 186 739 G2d.T187C 187 740 G2d.V188C 188 741 G2d.P189C 189 742 G2d.S190C 190 743 G2d.S191C 191 744 G2d.N192C 192 745 G2d.F193C 193 746

Variante da região constante Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia pesada MRA-IgG2 teína (numeração da EU) NO: G2d.G194C 194 747 G2d.T195C 195 748 G2d.Q196C 196 749 G2d.T197C 197 750 G2d.Y198C 198 751 G2d.T199C 199 752 G2d.N201C 201 753 G2d.V202C 202 754 G2d.D203C 203 755 G2d.H204C 204 756 G2d.K205C 205 757 G2d.P206C 206 758 G2d.S207C 207 759 G2d.N208C 208 760 G2d.T209C 209 761 G2d.K210C 210 762 G2d.V211C 211 763 G2d.D212C 212 764 G2d.K213C 213 765 G2d.T214C 214 766 G2d.V215C 215 767 G2d.E216C 216 768 G2d.R217C 217 769 G2d.K218C 218 770

[00540] As variantes de cadeia pesada MRA-IgG2 produzidas aci- ma foram combinadas com a cadeia leve MRA-IgG2, ou a cadeia pe- sada MRA-IgG2 foi combinada com as variantes de cadeia leve MRA- IgG2 produzidas no Exemplo 8-1. As variantes de cadeia pesada MRA-IgG2 e as variantes de cadeia leve MRA-IgG2 mostradas nas Tabelas 30 e 31 foram expressas através da expressão transitória uti-

lizando células FreeStyle293 (Invitrogen) ou células Expi293 (Life technologies) por um método conhecido da pessoa versada na técni- ca, e purificadas com Proteína A por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

Tabela 30 Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia pesada MRA- riável de constante riável de constante IgG2 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: MRAH.Q5C-IgG2 322 313 19 20 MRAH.E6C-IgG2 323 313 19 20 MRAH.S7C-IgG2 324 313 19 20 MRAH.G8C-IgG2 325 313 19 20 MRAH.P9C-IgG2 326 313 19 20 MRAH.G10C-IgG2 327 313 19 20 MRAH.L11C-IgG2 328 313 19 20 MRAH.V12C-IgG2 329 313 19 20 MRAH.R13C-IgG2 330 313 19 20 MRAH.P14C-IgG2 331 313 19 20 MRAH.S15C-IgG2 332 313 19 20 MRAH.Q16C-IgG2 333 313 19 20 MRAH.T17C-IgG2 334 313 19 20 MRAH.L18C-IgG2 335 313 19 20 MRAH.S19C-IgG2 336 313 19 20 MRAH.L20C-IgG2 337 313 19 20 MRAH.T21C-IgG2 338 313 19 20 MRAH.T23C-IgG2 339 313 19 20 MRAH.S25C-IgG2 340 313 19 20 MRAH.G26C-IgG2 341 313 19 20 MRAH.S28C-IgG2 342 313 19 20 MRAH.T30C-IgG2 343 313 19 20

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia pesada MRA- riável de constante riável de constante IgG2 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: MRAH.S31C-IgG2 344 313 19 20 MRAH.W35C-IgG2 345 313 19 20 MRAH.S35aC-IgG2 346 313 19 20 MRAH.Y50C-IgG2 347 313 19 20 MRAH.I51C-IgG2 348 313 19 20 MRAH.S52C-IgG2 349 313 19 20 MRAH.S62C-IgG2 350 313 19 20 MRAH.L63C-IgG2 351 313 19 20 MRAH.K64C-IgG2 352 313 19 20 MRAH.S65C-IgG2 353 313 19 20 MRAH.R66C-IgG2 354 313 19 20 MRAH.V67C-IgG2 355 313 19 20 MRAH.T68C-IgG2 356 313 19 20 MRAH.L70C-IgG2 357 313 19 20 MRAH.D72C-IgG2 358 313 19 20 MRAH.T73C-IgG2 359 313 19 20 MRAH.S74C-IgG2 360 313 19 20 MRAH.K75C-IgG2 361 313 19 20 MRAH.N76C-IgG2 362 313 19 20 MRAH.Q77C-IgG2 363 313 19 20 MRAH.S79C-IgG2 364 313 19 20 MRAH.L80C-IgG2 365 313 19 20 MRAH.R81C-IgG2 366 313 19 20 MRAH.L82C-IgG2 367 313 19 20 MRAH.S82aC-IgG2 368 313 19 20 MRAH.S82bC-IgG2 369 313 19 20 MRAH.V82cC-IgG2 370 313 19 20 MRAH.D101C-IgG2 371 313 19 20

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia pesada MRA- riável de constante riável de constante IgG2 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: MRAH.Y102C-IgG2 372 313 19 20 MRAH.S112C-IgG2 373 313 19 20 MRAH.S113C-IgG2 374 313 19 20 G2d.A118C-IgG2 17 691 19 20 G2d.S119C-IgG2 17 692 19 20 G2d.T120C-IgG2 17 693 19 20 G2d.K121C-IgG2 17 694 19 20 G2d.G122C-IgG2 17 695 19 20 G2d.P123C-IgG2 17 696 19 20 G2d.S124C-IgG2 17 697 19 20 G2d.V125C-IgG2 17 698 19 20 G2d.F126C-IgG2 17 699 19 20 G2d.P127C-IgG2 17 700 19 20 G2d.S132C-IgG2 17 701 19 20 G2d.R133C-IgG2 17 702 19 20 G2d.S134C-IgG2 17 703 19 20 G2d.T135C-IgG2 17 704 19 20 G2d.S136C-IgG2 17 705 19 20 G2d.E137C-IgG2 17 706 19 20 G2d.S138C-IgG2 17 707 19 20 G2d.T139C-IgG2 17 708 19 20 G2d.A140C-IgG2 17 709 19 20 G2d.A141C-IgG2 17 710 19 20 G2d.D148C-IgG2 17 711 19 20 G2d.Y149C-IgG2 17 712 19 20 G2d.F150C-IgG2 17 713 19 20 G2d.P151C-IgG2 17 714 19 20 G2d.E152C-IgG2 17 715 19 20

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia pesada MRA- riável de constante riável de constante IgG2 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: G2d.P153C-IgG2 17 716 19 20 G2d.V154C-IgG2 17 717 19 20 G2d.T155C-IgG2 17 718 19 20 G2d.V156C-IgG2 17 719 19 20 G2d.S157C-IgG2 17 720 19 20 G2d.W158C-IgG2 17 721 19 20 G2d.N159C-IgG2 17 722 19 20 G2d.S160C-IgG2 17 723 19 20 G2d.G161C-IgG2 17 724 19 20 G2d.A162C-IgG2 17 725 19 20 G2d.L163C-IgG2 17 726 19 20 G2d.T164C-IgG2 17 727 19 20 G2d.S165C-IgG2 17 728 19 20 G2d.G166C-IgG2 17 729 19 20 G2d.V167C-IgG2 17 730 19 20 G2d.V173C-IgG2 17 731 19 20 G2d.L174C-IgG2 17 732 19 20 G2d.Q175C-IgG2 17 733 19 20 G2d.S176C-IgG2 17 734 19 20 G2d.S177C-IgG2 17 735 19 20 G2d.G178C-IgG2 17 736 19 20 G2d.L179C-IgG2 17 737 19 20 G2d.Y180C-IgG2 17 738 19 20 G2d.V186C-IgG2 17 739 19 20 G2d.T187C-IgG2 17 740 19 20 G2d.V188C-IgG2 17 741 19 20 G2d.P189C-IgG2 17 742 19 20 G2d.S190C-IgG2 17 743 19 20

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia pesada MRA- riável de constante riável de constante IgG2 cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: G2d.S191C-IgG2 17 744 19 20 G2d.N192C-IgG2 17 745 19 20 G2d.F193C-IgG2 17 746 19 20 G2d.G194C-IgG2 17 747 19 20 G2d.T195C-IgG2 17 748 19 20 G2d.Q196C-IgG2 17 749 19 20 G2d.T197C-IgG2 17 750 19 20 G2d.Y198C-IgG2 17 751 19 20 G2d.T199C-IgG2 17 752 19 20 G2d.N201C-IgG2 17 753 19 20 G2d.V202C-IgG2 17 754 19 20 G2d.D203C-IgG2 17 755 19 20 G2d.H204C-IgG2 17 756 19 20 G2d.K205C-IgG2 17 757 19 20 G2d.P206C-IgG2 17 758 19 20 G2d.S207C-IgG2 17 759 19 20 G2d.N208C-IgG2 17 760 19 20 G2d.T209C-IgG2 17 761 19 20 G2d.K210C-IgG2 17 762 19 20 G2d.V211C-IgG2 17 763 19 20 G2d.D212C-IgG2 17 764 19 20 G2d.K213C-IgG2 17 765 19 20 G2d.T214C-IgG2 17 766 19 20 G2d.V215C-IgG2 17 767 19 20 G2d.E216C-IgG2 17 768 19 20 G2d.R217C-IgG2 17 769 19 20 G2d.K218C-IgG2 17 770 19 20

Tabela 31 Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve MRA-IgG2 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: MRAL.T5C-IgG2 17 313 457 20 MRAL.Q6C-IgG2 17 313 458 20 MRAL.S7C-IgG2 17 313 459 20 MRAL.P8C-IgG2 17 313 460 20 MRAL.S9C-IgG2 17 313 461 20 MRAL.S10C-IgG2 17 313 462 20 MRAL.L11C-IgG2 17 313 463 20 MRAL.S12C-IgG2 17 313 464 20 MRAL.A13C-IgG2 17 313 465 20 MRAL.S14C-IgG2 17 313 466 20 MRAL.V15C-IgG2 17 313 467 20 MRAL.G16C-IgG2 17 313 468 20 MRAL.D17C-IgG2 17 313 469 20 MRAL.R18C-IgG2 17 313 470 20 MRAL.V19C-IgG2 17 313 471 20 MRAL.T20C-IgG2 17 313 472 20 MRAL.I21C-IgG2 17 313 473 20 MRAL.T22C-IgG2 17 313 474 20 MRAL.A25C-IgG2 17 313 475 20 MRAL.S26C-IgG2 17 313 476 20 MRAL.Q27C-IgG2 17 313 477 20 MRAL.Y32C-IgG2 17 313 478 20 MRAL.L33C-IgG2 17 313 479 20 MRAL.N34C-IgG2 17 313 480 20 MRAL.Y50C-IgG2 17 313 481 20 MRAL.T51C-IgG2 17 313 482 20 MRAL.H55C-IgG2 17 313 483 20

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve MRA-IgG2 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: MRAL.S56C-IgG2 17 313 484 20 MRAL.G57C-IgG2 17 313 485 20 MRAL.V58C-IgG2 17 313 486 20 MRAL.P59C-IgG2 17 313 487 20 MRAL.S60C-IgG2 17 313 488 20 MRAL.R61C-IgG2 17 313 489 20 MRAL.F62C-IgG2 17 313 490 20 MRAL.S63C-IgG2 17 313 491 20 MRAL.S65C-IgG2 17 313 492 20 MRAL.S67C-IgG2 17 313 493 20 MRAL.G68C-IgG2 17 313 494 20 MRAL.T69C-IgG2 17 313 495 20 MRAL.D70C-IgG2 17 313 496 20 MRAL.T72C-IgG2 17 313 497 20 MRAL.F73C-IgG2 17 313 498 20 MRAL.T74C-IgG2 17 313 499 20 MRAL.I75C-IgG2 17 313 500 20 MRAL.S76C-IgG2 17 313 501 20 MRAL.S77C-IgG2 17 313 502 20 MRAL.L78C-IgG2 17 313 503 20 MRAL.Q79C-IgG2 17 313 504 20 MRAL.Y96C-IgG2 17 313 505 20 MRAL.T97C-IgG2 17 313 506 20 MRAL.F98C-IgG2 17 313 507 20 MRAL.G99C-IgG2 17 313 508 20 MRAL.Q100C-IgG2 17 313 509 20 MRAL.G101C-IgG2 17 313 510 20 MRAL.T102C-IgG2 17 313 511 20

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve MRA-IgG2 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: MRAL.K103C-IgG2 17 313 512 20 MRAL.V104C-IgG2 17 313 513 20 MRAL.E105C-IgG2 17 313 514 20 MRAL.I106C-IgG2 17 313 515 20 MRAL.K107C-IgG2 17 313 516 20 k0.R108C-IgG2 17 313 19 517 k0.T109C-IgG2 17 313 19 518 k0.V110C-IgG2 17 313 19 519 k0.A111C-IgG2 17 313 19 520 k0.A112C-IgG2 17 313 19 521 k0.P113C-IgG2 17 313 19 522 k0.S114C-IgG2 17 313 19 523 k0.V115C-IgG2 17 313 19 524 k0.F116C-IgG2 17 313 19 525 k0.P120C-IgG2 17 313 19 526 k0.S121C-IgG2 17 313 19 527 k0.D122C-IgG2 17 313 19 528 k0.E123C-IgG2 17 313 19 529 k0.Q124C-IgG2 17 313 19 530 k0.L125C-IgG2 17 313 19 531 k0.K126C-IgG2 17 313 19 532 k0.S127C-IgG2 17 313 19 533 k0.G128C-IgG2 17 313 19 534 k0.T129C-IgG2 17 313 19 535 k0.A130C-IgG2 17 313 19 536 k0.S131C-IgG2 17 313 19 537 k0.L136C-IgG2 17 313 19 538 k0.N137C-IgG2 17 313 19 539

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve MRA-IgG2 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: k0.N138C-IgG2 17 313 19 540 k0.F139C-IgG2 17 313 19 541 k0.Y140C-IgG2 17 313 19 542 k0.P141C-IgG2 17 313 19 543 k0.R142C-IgG2 17 313 19 544 k0.E143C-IgG2 17 313 19 545 k0.A144C-IgG2 17 313 19 546 k0.K145C-IgG2 17 313 19 547 k0.V146C-IgG2 17 313 19 548 k0.Q147C-IgG2 17 313 19 549 k0.W148C-IgG2 17 313 19 550 k0.K149C-IgG2 17 313 19 551 k0.V150C-IgG2 17 313 19 552 k0.D151C-IgG2 17 313 19 553 k0.N152C-IgG2 17 313 19 554 k0.A153C-IgG2 17 313 19 555 k0.L154C-IgG2 17 313 19 556 k0.Q155C-IgG2 17 313 19 557 k0.S156C-IgG2 17 313 19 558 k0.G157C-IgG2 17 313 19 559 k0.N158C-IgG2 17 313 19 560 k0.S159C-IgG2 17 313 19 561 k0.Q160C-IgG2 17 313 19 562 k0.E161C-IgG2 17 313 19 563 k0.S162C-IgG2 17 313 19 564 k0.V163C-IgG2 17 313 19 565 k0.T164C-IgG2 17 313 19 566 k0.E165C-IgG2 17 313 19 567

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve MRA-IgG2 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: k0.Q166C-IgG2 17 313 19 568 k0.D167C-IgG2 17 313 19 569 k0.S168C-IgG2 17 313 19 570 k0.K169C-IgG2 17 313 19 571 k0.D170C-IgG2 17 313 19 572 k0.S171C-IgG2 17 313 19 573 k0.T172C-IgG2 17 313 19 574 k0.Y173C-IgG2 17 313 19 575 k0.S174C-IgG2 17 313 19 576 k0.L175C-IgG2 17 313 19 577 k0.T180C-IgG2 17 313 19 578 k0.L181C-IgG2 17 313 19 579 k0.S182C-IgG2 17 313 19 580 k0.K183C-IgG2 17 313 19 581 k0.A184C-IgG2 17 313 19 582 k0.D185C-IgG2 17 313 19 583 k0.Y186C-IgG2 17 313 19 584 k0.E187C-IgG2 17 313 19 585 k0.K188C-IgG2 17 313 19 586 k0.H189C-IgG2 17 313 19 587 k0.K190C-IgG2 17 313 19 588 k0.V191C-IgG2 17 313 19 589 k0.Y192C-IgG2 17 313 19 590 k0.A193C-IgG2 17 313 19 591 k0.E195C-IgG2 17 313 19 592 k0.V196C-IgG2 17 313 19 593 k0.T197C-IgG2 17 313 19 594 k0.H198C-IgG2 17 313 19 595

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve MRA-IgG2 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID leve SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: k0.Q199C-IgG2 17 313 19 596 k0.G200C-IgG2 17 313 19 597 k0.L201C-IgG2 17 313 19 598 k0.S202C-IgG2 17 313 19 599 k0.S203C-IgG2 17 313 19 600 k0.P204C-IgG2 17 313 19 601 k0.V205C-IgG2 17 313 19 602 k0.T206C-IgG2 17 313 19 603 k0.K207C-IgG2 17 313 19 604 k0.S208C-IgG2 17 313 19 605 k0.F209C-IgG2 17 313 19 606 k0.N210C-IgG2 17 313 19 607 k0.R211C-IgG2 17 313 19 608 k0.G212C-IgG2 17 313 19 609 k0.E213C-IgG2 17 313 19 610 Exemplo 10-2. Avaliação da mobilidade eletroforética em gel de polia- crilamida de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posi- ções de IgG2

[00541] Similarmente ao Exemplo 8-2, a SDS-PAGE não redutora foi realizada com as variantes MRA-IgG2 produzidas no Exemplo 10-1, a imagem de gel foi capturada e as faixas foram analisadas.

[00542] A partir da imagem de gel obtida, as variantes foram classi- ficadas em 7 grupos de acordo com o padrão de faixa de cada uma das variantes MRA-IgG2: Única (uma faixa em uma região de peso molecular próxima a 140 kDa), Dupla (duas faixas em uma região de peso molecular próxima a 140 kDa), Tripla (três faixas em uma região de peso molecular próxima a 140 kDa), Várias (quatro ou mais faixas em uma região de peso molecular próxima a 140 kDa), LMW (faixa(s) em uma região de peso molecular mais baixo do que próxima a 140 kDa), HMW (faixa(s) em uma região de peso molecular mais elevado do que próxima a 140 kDa) e Fraco (faixas indistintas e difíceis de de- terminar). Os resultados de agrupamento dos padrões de faixa para as variantes de cadeia pesada MRA-IgG2 e as variantes de cadeia leve MRA-IgG2 são mostrados respectivamente nas Tabelas 32 e 33. A partir das Tabelas 32 e 33, as variantes classificadas em grupos de Dupla e Tripla são mostradas na Tabela 34. Observa-se que, embora a Tabela 33 indique "sem dados" para MRAL.K107C-IgG2, a posição 107 (numeração de Kabat), que é a posição de substituição de cisteína nesta variante, é uma posição onde o resíduo estruturalmente exposto à superfície está presente na região de dobradiça.

Consequentemente, esta variante também pode ser classificada como “Dupla”. Tabela 32 Nome da variante de cadeia pesada MRA-IgG2 Grupo MRAH.Q5C-IgG2 Dupla MRAH.E6C-IgG2 Dupla MRAH.S7C-IgG2 Fraca MRAH.G8C-IgG2 Dupla MRAH.P9C-IgG2 Dupla MRAH.G10C-IgG2 Dupla MRAH.L11C-IgG2 Dupla MRAH.V12C-IgG2 Dupla MRAH.R13C-IgG2 Dupla MRAH.P14C-IgG2 Dupla MRAH.S15C-IgG2 Dupla MRAH.Q16C-IgG2 Dupla MRAH.T17C-IgG2 Dupla MRAH.L18C-IgG2 Fraca

Nome da variante de cadeia pesada MRA-IgG2 Grupo MRAH.S19C-IgG2 Dupla MRAH.L20C-IgG2 Fraca MRAH.T21C-IgG2 Dupla MRAH.T23C-IgG2 Dupla MRAH.S25C-IgG2 Dupla MRAH.G26C-IgG2 Dupla MRAH.S28C-IgG2 Dupla MRAH.T30C-IgG2 Dupla MRAH.S31C-IgG2 Dupla MRAH.W35C-IgG2 Dupla MRAH.S35aC-IgG2 Fraca MRAH.Y50C-IgG2 Fraca MRAH.I51C-IgG2 Dupla MRAH.S52C-IgG2 Dupla MRAH.S62C-IgG2 Dupla MRAH.L63C-IgG2 Dupla MRAH.K64C-IgG2 Dupla MRAH.S65C-IgG2 Dupla MRAH.R66C-IgG2 Dupla MRAH.V67C-IgG2 Fraca MRAH.T68C-IgG2 Dupla MRAH.L70C-IgG2 Dupla MRAH.D72C-IgG2 Dupla MRAH.T73C-IgG2 Dupla MRAH.S74C-IgG2 HMW MRAH.K75C-IgG2 Dupla MRAH.N76C-IgG2 sem dados MRAH.Q77C-IgG2 Dupla MRAH.S79C-IgG2 Dupla MRAH.L80C-IgG2 Fraca MRAH.R81C-IgG2 Dupla MRAH.L82C-IgG2 Fraca

Nome da variante de cadeia pesada MRA-IgG2 Grupo MRAH.S82aC-IgG2 Dupla MRAH.S82bC-IgG2 Dupla MRAH.V82cC-IgG2 Fraca MRAH.D101C-IgG2 Dupla MRAH.Y102C-IgG2 Dupla MRAH.S112C-IgG2 Dupla MRAH.S113C-IgG2 Dupla G2d.A118C-IgG2 LMW G2d.S119C-IgG2 Dupla G2d.T120C-IgG2 Dupla G2d.K121C-IgG2 Dupla G2d.G122C-IgG2 Dupla G2d.P123C-IgG2 LMW G2d.S124C-IgG2 Dupla G2d.V125C-IgG2 LMW G2d.F126C-IgG2 Dupla G2d.P127C-IgG2 Fraca G2d.S132C-IgG2 Dupla G2d.R133C-IgG2 Dupla G2d.S134C-IgG2 Dupla G2d.T135C-IgG2 Dupla G2d.S136C-IgG2 Dupla G2d.E137C-IgG2 Dupla G2d.S138C-IgG2 Dupla G2d.T139C-IgG2 Fraca G2d.A140C-IgG2 Dupla G2d.A141C-IgG2 Fraca G2d.D148C-IgG2 Dupla G2d.Y149C-IgG2 Dupla G2d.F150C-IgG2 LMW G2d.P151C-IgG2 sem dados G2d.E152C-IgG2 LMW

Nome da variante de cadeia pesada MRA-IgG2 Grupo G2d.P153C-IgG2 HMW G2d.V154C-IgG2 Fraca G2d.T155C-IgG2 Dupla G2d.V156C-IgG2 Dupla G2d.S157C-IgG2 sem dados G2d.W158C-IgG2 sem dados G2d.N159C-IgG2 Dupla G2d.S160C-IgG2 Dupla G2d.G161C-IgG2 Dupla G2d.A162C-IgG2 Dupla G2d.L163C-IgG2 Dupla G2d.T164C-IgG2 Dupla G2d.S165C-IgG2 LMW G2d.G166C-IgG2 Fraca G2d.V167C-IgG2 Dupla G2d.V173C-IgG2 Dupla G2d.L174C-IgG2 LMW G2d.Q175C-IgG2 Dupla G2d.S176C-IgG2 Dupla G2d.S177C-IgG2 Dupla G2d.G178C-IgG2 Dupla G2d.L179C-IgG2 Dupla G2d.Y180C-IgG2 LMW G2d.V186C-IgG2 LMW G2d.T187C-IgG2 Dupla G2d.V188C-IgG2 Dupla G2d.P189C-IgG2 Dupla G2d.S190C-IgG2 Dupla G2d.S191C-IgG2 Dupla G2d.N192C-IgG2 Dupla G2d.F193C-IgG2 Dupla G2d.G194C-IgG2 Dupla

Nome da variante de cadeia pesada MRA-IgG2 Grupo G2d.T195C-IgG2 Dupla G2d.Q196C-IgG2 Dupla G2d.T197C-IgG2 Dupla G2d.Y198C-IgG2 LMW G2d.T199C-IgG2 LMW G2d.N201C-IgG2 LMW G2d.V202C-IgG2 LMW G2d.D203C-IgG2 LMW G2d.H204C-IgG2 LMW G2d.K205C-IgG2 LMW G2d.P206C-IgG2 LMW G2d.S207C-IgG2 LMW G2d.N208C-IgG2 Dupla G2d.T209C-IgG2 Dupla G2d.K210C-IgG2 Dupla G2d.V211C-IgG2 Dupla G2d.D212C-IgG2 Dupla G2d.K213C-IgG2 Dupla G2d.T214C-IgG2 Única G2d.V215C-IgG2 Única G2d.E216C-IgG2 Única G2d.R217C-IgG2 Dupla G2d.K218C-IgG2 Dupla

Tabela 33 Nome da variante de cadeia leve MRA-IgG2 Grupo MRAL.T5C-IgG2 Dupla MRAL.Q6C-IgG2 Fraca MRAL.S7C-IgG2 Dupla MRAL.P8C-IgG2 sem dados MRAL.S9C-IgG2 Dupla MRAL.S10C-IgG2 Dupla

Nome da variante de cadeia leve MRA-IgG2 Grupo MRAL.L11C-IgG2 Dupla MRAL.S12C-IgG2 Dupla MRAL.A13C-IgG2 Dupla MRAL.S14C-IgG2 Dupla MRAL.V15C-IgG2 Dupla MRAL.G16C-IgG2 Dupla MRAL.D17C-IgG2 Dupla MRAL.R18C-IgG2 Dupla MRAL.V19C-IgG2 Dupla MRAL.T20C-IgG2 Dupla MRAL.I21C-IgG2 Dupla MRAL.T22C-IgG2 Dupla MRAL.A25C-IgG2 Fraca MRAL.S26C-IgG2 Dupla MRAL.Q27C-IgG2 Dupla MRAL.Y32C-IgG2 Dupla MRAL.L33C-IgG2 Fraca MRAL.N34C-IgG2 Fraca MRAL.Y50C-IgG2 Dupla MRAL.T51C-IgG2 Dupla MRAL.H55C-IgG2 Dupla MRAL.S56C-IgG2 Dupla MRAL.G57C-IgG2 Dupla MRAL.V58C-IgG2 Dupla MRAL.P59C-IgG2 Dupla MRAL.S60C-IgG2 Dupla MRAL.R61C-IgG2 Dupla MRAL.F62C-IgG2 Fraca MRAL.S63C-IgG2 Dupla MRAL.S65C-IgG2 Dupla MRAL.S67C-IgG2 Dupla MRAL.G68C-IgG2 Dupla

Nome da variante de cadeia leve MRA-IgG2 Grupo MRAL.T69C-IgG2 Dupla MRAL.D70C-IgG2 Dupla MRAL.T72C-IgG2 Dupla MRAL.F73C-IgG2 Fraca MRAL.T74C-IgG2 Dupla MRAL.I75C-IgG2 sem dados MRAL.S76C-IgG2 Dupla MRAL.S77C-IgG2 Dupla MRAL.L78C-IgG2 Fraca MRAL.Q79C-IgG2 Dupla MRAL.Y96C-IgG2 Fraca MRAL.T97C-IgG2 Dupla MRAL.F98C-IgG2 Fraca MRAL.G99C-IgG2 Dupla MRAL.Q100C-IgG2 Dupla MRAL.G101C-IgG2 Dupla MRAL.T102C-IgG2 Fraca MRAL.K103C-IgG2 Dupla MRAL.V104C-IgG2 Fraca MRAL.E105C-IgG2 Dupla MRAL.I106C-IgG2 Fraca MRAL.K107C-IgG2 sem dados k0.R108C-IgG2 Dupla k0.T109C-IgG2 Dupla k0.V110C-IgG2 Dupla k0.A111C-IgG2 Dupla k0.A112C-IgG2 Dupla k0.P113C-IgG2 Dupla k0.S114C-IgG2 Dupla k0.V115C-IgG2 Fraca k0.F116C-IgG2 Dupla k0.P120C-IgG2 Fraca

Nome da variante de cadeia leve MRA-IgG2 Grupo k0.S121C-IgG2 Fraca k0.D122C-IgG2 LMW k0.E123C-IgG2 Dupla k0.Q124C-IgG2 Fraca k0.L125C-IgG2 Dupla k0.K126C-IgG2 Tripla k0.S127C-IgG2 Dupla k0.G128C-IgG2 Dupla k0.T129C-IgG2 Dupla k0.A130C-IgG2 Fraca k0.S131C-IgG2 Fraca k0.L136C-IgG2 Fraca k0.N137C-IgG2 sem dados k0.N138C-IgG2 Dupla k0.F139C-IgG2 Fraca k0.Y140C-IgG2 Fraca k0.P141C-IgG2 Dupla k0.R142C-IgG2 Dupla k0.E143C-IgG2 Dupla k0.A144C-IgG2 Dupla k0.K145C-IgG2 Dupla k0.V146C-IgG2 Fraca k0.Q147C-IgG2 Dupla k0.W148C-IgG2 sem dados k0.K149C-IgG2 Dupla k0.V150C-IgG2 Fraca k0.D151C-IgG2 Dupla k0.N152C-IgG2 Dupla k0.A153C-IgG2 Dupla k0.L154C-IgG2 Dupla k0.Q155C-IgG2 Dupla k0.S156C-IgG2 Dupla

Nome da variante de cadeia leve MRA-IgG2 Grupo k0.G157C-IgG2 Dupla k0.N158C-IgG2 Dupla k0.S159C-IgG2 Dupla k0.Q160C-IgG2 Dupla k0.E161C-IgG2 Dupla k0.S162C-IgG2 Dupla k0.V163C-IgG2 Dupla k0.T164C-IgG2 Dupla k0.E165C-IgG2 Dupla k0.Q166C-IgG2 Dupla k0.D167C-IgG2 Dupla k0.S168C-IgG2 Dupla k0.K169C-IgG2 Dupla k0.D170C-IgG2 Dupla k0.S171C-IgG2 Dupla k0.T172C-IgG2 Dupla k0.Y173C-IgG2 Fraca k0.S174C-IgG2 Fraca k0.L175C-IgG2 Fraca k0.T180C-IgG2 Dupla k0.L181C-IgG2 Dupla k0.S182C-IgG2 Dupla k0.K183C-IgG2 Dupla k0.A184C-IgG2 Dupla k0.D185C-IgG2 Dupla k0.Y186C-IgG2 Dupla k0.E187C-IgG2 LMW k0.K188C-IgG2 Dupla k0.H189C-IgG2 Fraca k0.K190C-IgG2 LMW k0.V191C-IgG2 Dupla k0.Y192C-IgG2 Dupla

Nome da variante de cadeia leve MRA-IgG2 Grupo k0.A193C-IgG2 Dupla k0.E195C-IgG2 Dupla k0.V196C-IgG2 Dupla k0.T197C-IgG2 Dupla k0.H198C-IgG2 Fraca k0.Q199C-IgG2 Dupla k0.G200C-IgG2 Tripla k0.L201C-IgG2 Tripla k0.S202C-IgG2 Dupla k0.S203C-IgG2 Tripla k0.P204C-IgG2 Dupla k0.V205C-IgG2 Tripla k0.T206C-IgG2 Dupla k0.K207C-IgG2 Tripla k0.S208C-IgG2 Dupla k0.F209C-IgG2 LMW k0.N210C-IgG2 LMW k0.R211C-IgG2 LMW k0.G212C-IgG2 Dupla k0.E213C-IgG2 Dupla

Tabela 34 Nome da variante MRA-IgG2 Grupo MRAH.Q5C-IgG2 Dupla MRAH.E6C-IgG2 Dupla MRAH.G8C-IgG2 Dupla MRAH.P9C-IgG2 Dupla MRAH.G10C-IgG2 Dupla MRAH.L11C-IgG2 Dupla MRAH.V12C-IgG2 Dupla MRAH.R13C-IgG2 Dupla MRAH.P14C-IgG2 Dupla

Nome da variante MRA-IgG2 Grupo MRAH.S15C-IgG2 Dupla MRAH.Q16C-IgG2 Dupla MRAH.T17C-IgG2 Dupla MRAH.S19C-IgG2 Dupla MRAH.T21C-IgG2 Dupla MRAH.T23C-IgG2 Dupla MRAH.S25C-IgG2 Dupla MRAH.G26C-IgG2 Dupla MRAH.S28C-IgG2 Dupla MRAH.T30C-IgG2 Dupla MRAH.S31C-IgG2 Dupla MRAH.W35C-IgG2 Dupla MRAH.I51C-IgG2 Dupla MRAH.S52C-IgG2 Dupla MRAH.S62C-IgG2 Dupla MRAH.L63C-IgG2 Dupla MRAH.K64C-IgG2 Dupla MRAH.S65C-IgG2 Dupla MRAH.R66C-IgG2 Dupla MRAH.T68C-IgG2 Dupla MRAH.L70C-IgG2 Dupla MRAH.D72C-IgG2 Dupla MRAH.T73C-IgG2 Dupla MRAH.K75C-IgG2 Dupla MRAH.Q77C-IgG2 Dupla MRAH.S79C-IgG2 Dupla MRAH.R81C-IgG2 Dupla MRAH.S82aC-IgG2 Dupla MRAH.S82bC-IgG2 Dupla MRAH.D101C-IgG2 Dupla MRAH.Y102C-IgG2 Dupla MRAH.S112C-IgG2 Dupla

Nome da variante MRA-IgG2 Grupo MRAH.S113C-IgG2 Dupla G2d.S119C-IgG2 Dupla G2d.T120C-IgG2 Dupla G2d.K121C-IgG2 Dupla G2d.G122C-IgG2 Dupla G2d.S124C-IgG2 Dupla G2d.F126C-IgG2 Dupla G2d.S132C-IgG2 Dupla G2d.R133C-IgG2 Dupla G2d.S134C-IgG2 Dupla G2d.T135C-IgG2 Dupla G2d.S136C-IgG2 Dupla G2d.E137C-IgG2 Dupla G2d.S138C-IgG2 Dupla G2d.A140C-IgG2 Dupla G2d.D148C-IgG2 Dupla G2d.Y149C-IgG2 Dupla G2d.T155C-IgG2 Dupla G2d.V156C-IgG2 Dupla G2d.N159C-IgG2 Dupla G2d.S160C-IgG2 Dupla G2d.G161C-IgG2 Dupla G2d.A162C-IgG2 Dupla G2d.L163C-IgG2 Dupla G2d.T164C-IgG2 Dupla G2d.V167C-IgG2 Dupla G2d.V173C-IgG2 Dupla G2d.Q175C-IgG2 Dupla G2d.S176C-IgG2 Dupla G2d.S177C-IgG2 Dupla G2d.G178C-IgG2 Dupla G2d.L179C-IgG2 Dupla

Nome da variante MRA-IgG2 Grupo G2d.T187C-IgG2 Dupla G2d.V188C-IgG2 Dupla G2d.P189C-IgG2 Dupla G2d.S190C-IgG2 Dupla G2d.S191C-IgG2 Dupla G2d.N192C-IgG2 Dupla G2d.F193C-IgG2 Dupla G2d.G194C-IgG2 Dupla G2d.T195C-IgG2 Dupla G2d.Q196C-IgG2 Dupla G2d.T197C-IgG2 Dupla G2d.N208C-IgG2 Dupla G2d.T209C-IgG2 Dupla G2d.K210C-IgG2 Dupla G2d.V211C-IgG2 Dupla G2d.D212C-IgG2 Dupla G2d.K213C-IgG2 Dupla G2d.R217C-IgG2 Dupla G2d.K218C-IgG2 Dupla MRAL.T5C-IgG2 Dupla MRAL.S7C-IgG2 Dupla MRAL.S9C-IgG2 Dupla MRAL.S10C-IgG2 Dupla MRAL.L11C-IgG2 Dupla MRAL.S12C-IgG2 Dupla MRAL.A13C-IgG2 Dupla MRAL.S14C-IgG2 Dupla MRAL.V15C-IgG2 Dupla MRAL.G16C-IgG2 Dupla MRAL.D17C-IgG2 Dupla MRAL.R18C-IgG2 Dupla MRAL.V19C-IgG2 Dupla

Nome da variante MRA-IgG2 Grupo MRAL.T20C-IgG2 Dupla MRAL.I21C-IgG2 Dupla MRAL.T22C-IgG2 Dupla MRAL.S26C-IgG2 Dupla MRAL.Q27C-IgG2 Dupla MRAL.Y32C-IgG2 Dupla MRAL.Y50C-IgG2 Dupla MRAL.T51C-IgG2 Dupla MRAL.H55C-IgG2 Dupla MRAL.S56C-IgG2 Dupla MRAL.G57C-IgG2 Dupla MRAL.V58C-IgG2 Dupla MRAL.P59C-IgG2 Dupla MRAL.S60C-IgG2 Dupla MRAL.R61C-IgG2 Dupla MRAL.S63C-IgG2 Dupla MRAL.S65C-IgG2 Dupla MRAL.S67C-IgG2 Dupla MRAL.G68C-IgG2 Dupla MRAL.T69C-IgG2 Dupla MRAL.D70C-IgG2 Dupla MRAL.T72C-IgG2 Dupla MRAL.T74C-IgG2 Dupla MRAL.S76C-IgG2 Dupla MRAL.S77C-IgG2 Dupla MRAL.Q79C-IgG2 Dupla MRAL.T97C-IgG2 Dupla MRAL.G99C-IgG2 Dupla MRAL.Q100C-IgG2 Dupla MRAL.G101C-IgG2 Dupla MRAL.K103C-IgG2 Dupla MRAL.E105C-IgG2 Dupla

Nome da variante MRA-IgG2 Grupo k0.R108C-IgG2 Dupla k0.T109C-IgG2 Dupla k0.V110C-IgG2 Dupla k0.A111C-IgG2 Dupla k0.A112C-IgG2 Dupla k0.P113C-IgG2 Dupla k0.S114C-IgG2 Dupla k0.F116C-IgG2 Dupla k0.E123C-IgG2 Dupla k0.L125C-IgG2 Dupla k0.K126C-IgG2 Tripla k0.S127C-IgG2 Dupla k0.G128C-IgG2 Dupla k0.T129C-IgG2 Dupla k0.N138C-IgG2 Dupla k0.P141C-IgG2 Dupla k0.R142C-IgG2 Dupla k0.E143C-IgG2 Dupla k0.A144C-IgG2 Dupla k0.K145C-IgG2 Dupla k0.Q147C-IgG2 Dupla k0.K149C-IgG2 Dupla k0.D151C-IgG2 Dupla k0.N152C-IgG2 Dupla k0.A153C-IgG2 Dupla k0.L154C-IgG2 Dupla k0.Q155C-IgG2 Dupla k0.S156C-IgG2 Dupla k0.G157C-IgG2 Dupla k0.N158C-IgG2 Dupla k0.S159C-IgG2 Dupla k0.Q160C-IgG2 Dupla

Nome da variante MRA-IgG2 Grupo k0.E161C-IgG2 Dupla k0.S162C-IgG2 Dupla k0.V163C-IgG2 Dupla k0.T164C-IgG2 Dupla k0.E165C-IgG2 Dupla k0.Q166C-IgG2 Dupla k0.D167C-IgG2 Dupla k0.S168C-IgG2 Dupla k0.K169C-IgG2 Dupla k0.D170C-IgG2 Dupla k0.S171C-IgG2 Dupla k0.T172C-IgG2 Dupla k0.T180C-IgG2 Dupla k0.L181C-IgG2 Dupla k0.S182C-IgG2 Dupla k0.K183C-IgG2 Dupla k0.A184C-IgG2 Dupla k0.D185C-IgG2 Dupla k0.Y186C-IgG2 Dupla k0.K188C-IgG2 Dupla k0.V191C-IgG2 Dupla k0.Y192C-IgG2 Dupla k0.A193C-IgG2 Dupla k0.E195C-IgG2 Dupla k0.V196C-IgG2 Dupla k0.T197C-IgG2 Dupla k0.Q199C-IgG2 Dupla k0.G200C-IgG2 Tripla k0.L201C-IgG2 Tripla k0.S202C-IgG2 Dupla k0.S203C-IgG2 Tripla k0.P204C-IgG2 Dupla

Nome da variante MRA-IgG2 Grupo k0.V205C-IgG2 Tripla k0.T206C-IgG2 Dupla k0.K207C-IgG2 Tripla k0.S208C-IgG2 Dupla k0.G212C-IgG2 Dupla k0.E213C-IgG2 Dupla Exemplo 11: Avaliação de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições da cadeia Lambda Exemplo 11-1. Produção de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições da cadeia Lambda

[00543] A cadeia leve (cadeia Lambda) de um anticorpo neutrali- zante CXCL10 anti-humano, G7-IgG1 (cadeia pesada: G7H-G1T4 (SEQ ID NO: 314), cadeia leve: G7L-LT0 (SEQ ID NO: 316)), foi sub- metida a um estudo em que um resíduo de aminoácido arbitrário estru- turalmente exposto à superfície foi substituído por cisteína.

[00544] Os resíduos de aminoácidos dentro da região variável de cadeia leve G7-IgG1 (G7L, SEQ ID NO: 317) foram substituídos por cisteína para produzir variantes da região variável de cadeia leve G7- IgG1 mostrada na Tabela 35. Estas variantes da região variável de ca- deia leve G7-IgG1 foram cada uma ligada à região constante de ca- deia leve G7-IgG1 (LT0, SEQ ID NO: 318) para produzir variantes de cadeia leve G7-IgG1, e os vetores de expressão que codificam os ge- nes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica. Além disso, os resíduos de aminoácido dentro da região constante de cadeia leve G7-IgG1 (LT0, SEQ ID NO: 318) foram substituídos por cisteína para produzir variantes da região constante de cadeia leve G7-IgG1 mostrada na Tabela 36. Estas vari- antes da região constante de cadeia pesada G7-IgG1 foram cada uma ligada à região variável de cadeia leve G7-IgG1 (G7L, SEQ ID NO:

317) para produzir variantes de cadeia leve G7-IgG1, e os vetores de expressão que codificam os genes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

Tabela 35 Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia leve G7-IgG1 teína (numeração de Kabat) NO: G7L.T5C 5 771 G7L.Q6C 6 772 G7L.P7C 7 773 G7L.P8C 8 774 G7L.S9C 9 775 G7L.A11C 11 776 G7L.S12C 12 777 G7L.G13C 13 778 G7L.T14C 14 779 G7L.P15C 15 780 G7L.G16C 16 781 G7L.Q17C 17 782 G7L.R18C 18 783 G7L.V19C 19 784 G7L.T20C 20 785 G7L.I21C 21 786 G7L.S22C 22 787 G7L.G25C 25 788 G7L.S26C 26 789 G7L.S27C 27 790 G7L.S27aC 27a 791 G7L.T32C 32 792 G7L.V33C 33 793 G7L.N34C 34 794 G7L.N50C 50 795 G7L.N51C 51 796 G7L.P55C 55 797

Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia leve G7-IgG1 teína (numeração de Kabat) NO: G7L.S56C 56 798 G7L.G57C 57 799 G7L.I58C 58 800 G7L.P59C 59 801 G7L.D60C 60 802 G7L.R61C 61 803 G7L.F62C 62 804 G7L.S63C 63 805 G7L.S65C 65 806 G7L.S67C 67 807 G7L.G68C 68 808 G7L.T69C 69 809 G7L.S70C 70 810 G7L.S72C 72 811 G7L.L73C 73 812 G7L.V74C 74 813 G7L.I75C 75 814 G7L.S76C 76 815 G7L.G77C 77 816 G7L.L78C 78 817 G7L.Q79C 79 818 G7L.R96C 96 819 G7L.V97C 97 820 G7L.F98C 98 821 G7L.G99C 99 822 G7L.G100C 100 823 G7L.G101C 101 824 G7L.T102C 102 825 G7L.K103C 103 826 G7L.L104C 104 827 G7L.T105C 105 828

Variante da região variável Posição da substituição de cis- SEQ ID de cadeia leve G7-IgG1 teína (numeração de Kabat) NO: G7L.V106C 106 829 G7L.L106aC 106a 830

Tabela 36 Variante da região cons- Posição da substituição de cis- SEQ ID tante de cadeia leve G7- teína (numeração de Kabat) NO: IgG1 LT0.Q108C 108 831 LT0.P109C 109 832 LT0.K110C 110 833 LT0.A111C 111 834 LT0.A112C 112 835 LT0.P113C 113 836 LT0.S114C 114 837 LT0.V115C 115 838 LT0.T116C 116 839 LT0.P120C 120 840 LT0.S121C 121 841 LT0.S122C 122 842 LT0.E123C 123 843 LT0.E124C 124 844 LT0.L125C 125 845 LT0.Q126C 126 846 LT0.A127C 127 847 LT0.N128C 128 848 LT0.K129C 129 849 LT0.A130C 130 850 LT0.T131C 131 851 LT0.I136C 136 852 LT0.S137C 137 853 LT0.D138C 138 854

Variante da região cons- Posição da substituição de cis- SEQ ID tante de cadeia leve G7- teína (numeração de Kabat) NO: IgG1 LT0.F139C 139 855 LT0.Y140C 140 856 LT0.P141C 141 857 LT0.G142C 142 858 LT0.A143C 143 859 LT0.V144C 144 860 LT0.T145C 145 861 LT0.V146C 146 862 LT0.A147C 147 863 LT0.W148C 148 864 LT0.K149C 149 865 LT0.A150C 150 866 LT0.D151C 151 867 LT0.S152C 152 868 LT0.S153C 153 869 LT0.P154C 154 870 LT0.V155C 155 871 LT0.K156C 156 872 LT0.A157C 157 873 LT0.G158C 158 874 LT0.V159C 159 875 LT0.E160C 160 876 LT0.T161C 161 877 LT0.T162C 162 878 LT0.T163C 163 879 LT0.P164C 164 880 LT0.S165C 165 881 LT0.K166C 166 882 LT0.Q167C 167 883 LT0.S168C 168 884

Variante da região cons- Posição da substituição de cis- SEQ ID tante de cadeia leve G7- teína (numeração de Kabat) NO: IgG1 LT0.N170C 170 885 LT0.N171C 171 886 LT0.K172C 172 887 LT0.Y173C 173 888 LT0.A174C 174 889 LT0.A175C 175 890 LT0.S180C 180 891 LT0.L181C 181 892 LT0.T182C 182 893 LT0.P183C 183 894 LT0.E184C 184 895 LT0.Q185C 185 896 LT0.W186C 186 897 LT0.K187C 187 898 LT0.S188C 188 899 LT0.H189C 189 900 LT0.R190C 190 901 LT0.S191C 191 902 LT0.Y192C 192 903 LT0.S193C 193 904 LT0.Q195C 195 905 LT0.V196C 196 906 LT0.T197C 197 907 LT0.H198C 198 908 LT0.E199C 199 909 LT0.G200C 200 910 LT0.S203C 203 911 LT0.T204C 204 912 LT0.V205C 205 913 LT0.E206C 206 914

Variante da região cons- Posição da substituição de cis- SEQ ID tante de cadeia leve G7- teína (numeração de Kabat) NO: IgG1 LT0.K207C 207 915 LT0.T208C 208 916 LT0.V209C 209 917 LT0.A210C 210 918 LT0.P211C 211 919 LT0.T212C 212 920 LT0.E213C 213 921

[00545] As variantes de cadeia leve G7-IgG1 produzidas acima fo- ram combinadas com a cadeia pesada G7-IgG1 e as variantes de ca- deia leve G7-IgG1 resultantes mostradas na Tabela 37 foram expres- sas através da expressão transitória utilizando células FreeStyle293 (Invitrogen) ou células Expi293 (Life technologies) por um método co- nhecido da pessoa versada na técnica e purificadas com Proteína A por um método conhecido da pessoa versada na técnica. Tabela 37 Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve G7-IgG1 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: G7L.T5C-IgG1 315 18 771 318 G7L.Q6C-IgG1 315 18 772 318 G7L.P7C-IgG1 315 18 773 318 G7L.P8C-IgG1 315 18 774 318 G7L.S9C-IgG1 315 18 775 318 G7L.A11C-IgG1 315 18 776 318 G7L.S12C-IgG1 315 18 777 318 G7L.G13C-IgG1 315 18 778 318 G7L.T14C-IgG1 315 18 779 318

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve G7-IgG1 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: G7L.P15C-IgG1 315 18 780 318 G7L.G16C-IgG1 315 18 781 318 G7L.Q17C-IgG1 315 18 782 318 G7L.R18C-IgG1 315 18 783 318 G7L.V19C-IgG1 315 18 784 318 G7L.T20C-IgG1 315 18 785 318 G7L.I21C-IgG1 315 18 786 318 G7L.S22C-IgG1 315 18 787 318 G7L.G25C-IgG1 315 18 788 318 G7L.S26C-IgG1 315 18 789 318 G7L.S27C-IgG1 315 18 790 318 G7L.S27aC-IgG1 315 18 791 318 G7L.T32C-IgG1 315 18 792 318 G7L.V33C-IgG1 315 18 793 318 G7L.N34C-IgG1 315 18 794 318 G7L.N50C-IgG1 315 18 795 318 G7L.N51C-IgG1 315 18 796 318 G7L.P55C-IgG1 315 18 797 318 G7L.S56C-IgG1 315 18 798 318 G7L.G57C-IgG1 315 18 799 318 G7L.I58C-IgG1 315 18 800 318 G7L.P59C-IgG1 315 18 801 318 G7L.D60C-IgG1 315 18 802 318 G7L.R61C-IgG1 315 18 803 318 G7L.F62C-IgG1 315 18 804 318 G7L.S63C-IgG1 315 18 805 318 G7L.S65C-IgG1 315 18 806 318 G7L.S67C-IgG1 315 18 807 318 G7L.G68C-IgG1 315 18 808 318

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve G7-IgG1 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: G7L.T69C-IgG1 315 18 809 318 G7L.S70C-IgG1 315 18 810 318 G7L.S72C-IgG1 315 18 811 318 G7L.L73C-IgG1 315 18 812 318 G7L.V74C-IgG1 315 18 813 318 G7L.I75C-IgG1 315 18 814 318 G7L.S76C-IgG1 315 18 815 318 G7L.G77C-IgG1 315 18 816 318 G7L.L78C-IgG1 315 18 817 318 G7L.Q79C-IgG1 315 18 818 318 G7L.R96C-IgG1 315 18 819 318 G7L.V97C-IgG1 315 18 820 318 G7L.F98C-IgG1 315 18 821 318 G7L.G99C-IgG1 315 18 822 318 G7L.G100C-IgG1 315 18 823 318 G7L.G101C-IgG1 315 18 824 318 G7L.T102C-IgG1 315 18 825 318 G7L.K103C-IgG1 315 18 826 318 G7L.L104C-IgG1 315 18 827 318 G7L.T105C-IgG1 315 18 828 318 G7L.V106C-IgG1 315 18 829 318 G7L.L106aC-IgG1 315 18 830 318 LT0.Q108C-IgG1 315 18 317 831 LT0.P109C-IgG1 315 18 317 832 LT0.K110C-IgG1 315 18 317 833 LT0.A111C-IgG1 315 18 317 834 LT0.A112C-IgG1 315 18 317 835 LT0.P113C-IgG1 315 18 317 836 LT0.S114C-IgG1 315 18 317 837

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve G7-IgG1 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: LT0.V115C-IgG1 315 18 317 838 LT0.T116C-IgG1 315 18 317 839 LT0.P120C-IgG1 315 18 317 840 LT0.S121C-IgG1 315 18 317 841 LT0.S122C-IgG1 315 18 317 842 LT0.E123C-IgG1 315 18 317 843 LT0.E124C-IgG1 315 18 317 844 LT0.L125C-IgG1 315 18 317 845 LT0.Q126C-IgG1 315 18 317 846 LT0.A127C-IgG1 315 18 317 847 LT0.N128C-IgG1 315 18 317 848 LT0.K129C-IgG1 315 18 317 849 LT0.A130C-IgG1 315 18 317 850 LT0.T131C-IgG1 315 18 317 851 LT0.I136C-IgG1 315 18 317 852 LT0.S137C-IgG1 315 18 317 853 LT0.D138C-IgG1 315 18 317 854 LT0.F139C-IgG1 315 18 317 855 LT0.Y140C-IgG1 315 18 317 856 LT0.P141C-IgG1 315 18 317 857 LT0.G142C-IgG1 315 18 317 858 LT0.A143C-IgG1 315 18 317 859 LT0.V144C-IgG1 315 18 317 860 LT0.T145C-IgG1 315 18 317 861 LT0.V146C-IgG1 315 18 317 862 LT0.A147C-IgG1 315 18 317 863 LT0.W148C-IgG1 315 18 317 864 LT0.K149C-IgG1 315 18 317 865 LT0.A150C-IgG1 315 18 317 866

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve G7-IgG1 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: LT0.D151C-IgG1 315 18 317 867 LT0.S152C-IgG1 315 18 317 868 LT0.S153C-IgG1 315 18 317 869 LT0.P154C-IgG1 315 18 317 870 LT0.V155C-IgG1 315 18 317 871 LT0.K156C-IgG1 315 18 317 872 LT0.A157C-IgG1 315 18 317 873 LT0.G158C-IgG1 315 18 317 874 LT0.V159C-IgG1 315 18 317 875 LT0.E160C-IgG1 315 18 317 876 LT0.T161C-IgG1 315 18 317 877 LT0.T162C-IgG1 315 18 317 878 LT0.T163C-IgG1 315 18 317 879 LT0.P164C-IgG1 315 18 317 880 LT0.S165C-IgG1 315 18 317 881 LT0.K166C-IgG1 315 18 317 882 LT0.Q167C-IgG1 315 18 317 883 LT0.S168C-IgG1 315 18 317 884 LT0.N170C-IgG1 315 18 317 885 LT0.N171C-IgG1 315 18 317 886 LT0.K172C-IgG1 315 18 317 887 LT0.Y173C-IgG1 315 18 317 888 LT0.A174C-IgG1 315 18 317 889 LT0.A175C-IgG1 315 18 317 890 LT0.S180C-IgG1 315 18 317 891 LT0.L181C-IgG1 315 18 317 892 LT0.T182C-IgG1 315 18 317 893 LT0.P183C-IgG1 315 18 317 894 LT0.E184C-IgG1 315 18 317 895

Nome da variante de Região va- Região Região va- Região cadeia leve G7-IgG1 riável de constante riável de constante cadeia pe- de cadeia cadeia leve de cadeia sada pesada SEQ ID NO: leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: LT0.Q185C-IgG1 315 18 317 896 LT0.W186C-IgG1 315 18 317 897 LT0.K187C-IgG1 315 18 317 898 LT0.S188C-IgG1 315 18 317 899 LT0.H189C-IgG1 315 18 317 900 LT0.R190C-IgG1 315 18 317 901 LT0.S191C-IgG1 315 18 317 902 LT0.Y192C-IgG1 315 18 317 903 LT0.S193C-IgG1 315 18 317 904 LT0.Q195C-IgG1 315 18 317 905 LT0.V196C-IgG1 315 18 317 906 LT0.T197C-IgG1 315 18 317 907 LT0.H198C-IgG1 315 18 317 908 LT0.E199C-IgG1 315 18 317 909 LT0.G200C-IgG1 315 18 317 910 LT0.S203C-IgG1 315 18 317 911 LT0.T204C-IgG1 315 18 317 912 LT0.V205C-IgG1 315 18 317 913 LT0.E206C-IgG1 315 18 317 914 LT0.K207C-IgG1 315 18 317 915 LT0.T208C-IgG1 315 18 317 916 LT0.V209C-IgG1 315 18 317 917 LT0.A210C-IgG1 315 18 317 918 LT0.P211C-IgG1 315 18 317 919 LT0.T212C-IgG1 315 18 317 920 LT0.E213C-IgG1 315 18 317 921

Exemplo 11-2. Avaliação da mobilidade eletroforética em gel de polia- crilamida de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posi-

ções da cadeia Lambda

[00546] Similarmente ao Exemplo 8-2, a SDS-PAGE não redutora foi realizada com as variantes G7-IgG1 produzidas no Exemplo 11-1, a imagem de gel foi capturada e as faixas foram quantificadas.

[00547] A partir da imagem de gel obtida, as variantes foram captu- radas em 7 grupos de acordo com o padrão de faixa de cada uma das variantes G7-IgG1: Única (uma faixa em uma região de peso molecu- lar semelhante àquela de G7-IgG1), Dupla (duas faixas em uma região de peso molecular semelhante àquela de G7-IgG1), Tripla (três faixas em uma região de peso molecular semelhante àquela de G7-IgG1), Várias (quatro ou mais faixas em uma região de peso molecular seme- lhante àquela de G7-IgG1), LMW (faixa(s) em uma região de peso mo- lecular mais baixo do que aquela de G7-IgG1), HMW (faixa(s) em uma região de peso molecular mais elevado do que aquela de G7-IgG1) e Fraco (faixas indistintas e difíceis de determinar). Em relação às vari- antes G7-IgG1 classificadas como “Dupla”, uma das duas faixas apre- sentou a mesma mobilidade eletroforética que G7-IgG1 enquanto que a outra faixa apresentou mobilidade ligeiramente mais rápida ou mais lenta. Assim, para as variantes G7-IgG1 classificadas como “Dupla”, também foi calculada a porcentagem das faixas que apresentam mo- bilidade diferente para G7-IgG1 (porcentagem de nova faixa (%)). O agrupamento dos padrões de faixa para as variantes de cadeia leve G7-IgG1 e os resultados do cálculo da porcentagem da faixa são mos- trados na Tabela 38. A partir da Tabela 38, as variantes classificadas nos grupos Dupla e Tripla são mostradas na Tabela 39. Nestas varian- tes, é altamente provável que a substituição de cisteína provocou mu- danças estruturais tais como reticulação de Fabs, o que resultou na mudança na mobilidade eletroforética. Neste exemplo, a variante na qual o resíduo de aminoácido na posição 107a (numeração de Kabat) foi substituído por cisteína não foi avaliada. No entanto, a posição

107a (numeração de Kabat) é uma posição onde o resíduo estrutural- mente exposto à superfície está presente na região de dobradiça.

As- sim, também nesta variante, é altamente provável que a substituição de cisteína provoque mudanças estruturais tais como a reticulação de Fabs, e resulte na mudança na mobilidade eletroforética.

Tabela 38 Nome da variante de Grupo Porcentagem da nova cadeia leve G7-IgG1 faixa (%) G7L.T5C-IgG1 Única - G7L.Q6C-IgG1 Tripla - G7L.P7C-IgG1 Única - G7L.P8C-IgG1 Única - G7L.S9C-IgG1 Única - G7L.A11C-IgG1 Única - G7L.S12C-IgG1 Única - G7L.G13C-IgG1 Única - G7L.T14C-IgG1 Única - G7L.P15C-IgG1 Única - G7L.G16C-IgG1 Fraca - G7L.Q17C-IgG1 Única - G7L.R18C-IgG1 Única - G7L.V19C-IgG1 Dupla 32,3 G7L.T20C-IgG1 Única - G7L.I21C-IgG1 Fraca - G7L.S22C-IgG1 Única - G7L.G25C-IgG1 Única - G7L.S26C-IgG1 Única - G7L.S27C-IgG1 Única - G7L.S27aC-IgG1 Única - G7L.T32C-IgG1 Única - G7L.V33C-IgG1 Tripla - G7L.N34C-IgG1 Dupla 43,8 G7L.N50C-IgG1 Única -

Nome da variante de Grupo Porcentagem da nova cadeia leve G7-IgG1 faixa (%) G7L.N51C-IgG1 Única - G7L.P55C-IgG1 Única - G7L.S56C-IgG1 Única - G7L.G57C-IgG1 Única - G7L.I58C-IgG1 Única - G7L.P59C-IgG1 Única - G7L.D60C-IgG1 Única - G7L.R61C-IgG1 Única - G7L.F62C-IgG1 Fraca - G7L.S63C-IgG1 Única - G7L.S65C-IgG1 Única - G7L.S67C-IgG1 Única - G7L.G68C-IgG1 Única - G7L.T69C-IgG1 Única - G7L.S70C-IgG1 Única - G7L.S72C-IgG1 Única - G7L.L73C-IgG1 Fraca - G7L.V74C-IgG1 Única - G7L.I75C-IgG1 Fraca - G7L.S76C-IgG1 Única - G7L.G77C-IgG1 Única - G7L.L78C-IgG1 Fraca - G7L.Q79C-IgG1 Única - G7L.R96C-IgG1 Única - G7L.V97C-IgG1 Fraca - G7L.F98C-IgG1 Única - G7L.G99C-IgG1 Fraca - G7L.G100C-IgG1 Única - G7L.G101C-IgG1 Única - G7L.T102C-IgG1 Fraca - G7L.K103C-IgG1 Única -

Nome da variante de Grupo Porcentagem da nova cadeia leve G7-IgG1 faixa (%) G7L.L104C-IgG1 Fraca - G7L.T105C-IgG1 Única - G7L.V106C-IgG1 Fraca - G7L.L106aC-IgG1 Única - LT0.Q108C-IgG1 Dupla 10,6 LT0.P109C-IgG1 Dupla 42,9 LT0.K110C-IgG1 Única - LT0.A111C-IgG1 Única - LT0.A112C-IgG1 Única - LT0.P113C-IgG1 LMW - LT0.S114C-IgG1 Única - LT0.V115C-IgG1 LMW - LT0.T116C-IgG1 Única - LT0.P120C-IgG1 LMW - LT0.S121C-IgG1 LMW - LT0.S122C-IgG1 sem dados - LT0.E123C-IgG1 Dupla 57,5 LT0.E124C-IgG1 LMW - LT0.L125C-IgG1 LMW - LT0.Q126C-IgG1 Tripla - LT0.A127C-IgG1 Única - LT0.N128C-IgG1 Única - LT0.K129C-IgG1 Única - LT0.A130C-IgG1 LMW - LT0.T131C-IgG1 LMW - LT0.I136C-IgG1 LMW - LT0.S137C-IgG1 Única - LT0.D138C-IgG1 Única - LT0.F139C-IgG1 LMW - LT0.Y140C-IgG1 Única - LT0.P141C-IgG1 Única -

Nome da variante de Grupo Porcentagem da nova cadeia leve G7-IgG1 faixa (%) LT0.G142C-IgG1 Única - LT0.A143C-IgG1 Única - LT0.V144C-IgG1 LMW - LT0.T145C-IgG1 Única - LT0.V146C-IgG1 LMW - LT0.A147C-IgG1 Única - LT0.W148C-IgG1 sem dados - LT0.K149C-IgG1 Única - LT0.A150C-IgG1 Única - LT0.D151C-IgG1 Única - LT0.S152C-IgG1 Única - LT0.S153C-IgG1 Única - LT0.P154C-IgG1 Única - LT0.V155C-IgG1 Única - LT0.K156C-IgG1 Única - LT0.A157C-IgG1 Única - LT0.G158C-IgG1 sem dados - LT0.V159C-IgG1 Única - LT0.E160C-IgG1 Única - LT0.T161C-IgG1 Única - LT0.T162C-IgG1 Única - LT0.T163C-IgG1 Única - LT0.P164C-IgG1 Única - LT0.S165C-IgG1 Única - LT0.K166C-IgG1 Única - LT0.Q167C-IgG1 Única - LT0.S168C-IgG1 Única - LT0.N170C-IgG1 Única - LT0.N171C-IgG1 Única - LT0.K172C-IgG1 Única - LT0.Y173C-IgG1 Única -

Nome da variante de Grupo Porcentagem da nova cadeia leve G7-IgG1 faixa (%) LT0.A174C-IgG1 LMW - LT0.A175C-IgG1 LMW - LT0.S180C-IgG1 Única - LT0.L181C-IgG1 Única - LT0.T182C-IgG1 Única - LT0.P183C-IgG1 LMW - LT0.E184C-IgG1 Única - LT0.Q185C-IgG1 Única - LT0.W186C-IgG1 LMW - LT0.K187C-IgG1 LMW - LT0.S188C-IgG1 LMW - LT0.H189C-IgG1 LMW - LT0.R190C-IgG1 LMW - LT0.S191C-IgG1 Única - LT0.Y192C-IgG1 Única - LT0.S193C-IgG1 Única - LT0.Q195C-IgG1 Dupla 30,1 LT0.V196C-IgG1 Dupla 82,9 LT0.T197C-IgG1 Única - LT0.H198C-IgG1 Fraca - LT0.E199C-IgG1 Única - LT0.G200C-IgG1 Dupla 15,5 LT0.S203C-IgG1 Dupla 32,4 LT0.T204C-IgG1 Única - LT0.V205C-IgG1 Única - LT0.E206C-IgG1 Única - LT0.K207C-IgG1 Única - LT0.T208C-IgG1 Única - LT0.V209C-IgG1 LMW - LT0.A210C-IgG1 LMW - LT0.P211C-IgG1 Fraca -

Nome da variante de Grupo Porcentagem da nova cadeia leve G7-IgG1 faixa (%) LT0.T212C-IgG1 LMW - LT0.E213C-IgG1 Única - Tabela 39 Nome da variante de Grupo Porcentagem da nova cadeia leve G7-IgG1 faixa (%) G7L.Q6C-IgG1 Tripla - G7L.V19C-IgG1 Dupla 32,3 G7L.V33C-IgG1 Tripla - G7L.N34C-IgG1 Dupla 43,8 LT0.Q108C-IgG1 Dupla 10,6 LT0.P109C-IgG1 Dupla 42,9 LT0.E123C-IgG1 Dupla 57,5 LT0.Q126C-IgG1 Tripla - LT0.Q195C-IgG1 Dupla 30,1 LT0.V196C-IgG1 Dupla 82,9 LT0.G200C-IgG1 Dupla 15,5 LT0.S203C-IgG1 Dupla 32,4 Exemplo 12: Avaliação de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições de VHH Exemplo 12-1. Produção de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posições de VHH

[00548] Um anti-IL6R humano que neutraliza VHH, IL6R90 (SEQ ID NO: 319) foi fundido com uma região Fc de IgG1 humana (G1T3dCH1dC, SEQ ID NO: 320) para produzir IL6R90-Fc (IL6R90- G1T3dCH1dC, SEQ ID NO: 321), e isso foi submetido a um estudo no qual um resíduo de aminoácido arbitrário entre a região IL6R90 estru- turalmente exposta à superfície foi substituído por cisteína.

[00549] Os resíduos de aminoácido dentro da região IL6R90 foram substituídos por cisteína, e os vetores de expressão que codificam os genes das variantes da região IL6R90-Fc VHH mostradas na Tabela 40 foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

Estas variantes da região IL6R90-Fc VHH foram cada uma ligada à região Fc de IgG1 humana (G1T3dCH1dC, SEQ ID NO: 320) para produzir variantes IL6R90-Fc, e os vetores de expressão que co- dificam os genes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

Tabela 40 Variante da região Posição da substituição de cisteí- SEQ ID IL6R90-Fc VHH na (numeração de Kabat) NO: IL6R90.E1C 1 922 IL6R90.V2C 2 923 IL6R90.Q3C 3 924 IL6R90.L4C 4 925 IL6R90.V5C 5 926 IL6R90.E6C 6 927 IL6R90.S7C 7 928 IL6R90.G8C 8 929 IL6R90.G9C 9 930 IL6R90.G10C 10 931 IL6R90.L11C 11 932 IL6R90.V12C 12 933 IL6R90.Q13C 13 934 IL6R90.P14C 14 935 IL6R90.G15C 15 936 IL6R90.G16C 16 937 IL6R90.S17C 17 938 IL6R90.L18C 18 939 IL6R90.R19C 19 940 IL6R90.L20C 20 941 IL6R90.S21C 21 942

Variante da região Posição da substituição de cisteí- SEQ ID IL6R90-Fc VHH na (numeração de Kabat) NO: IL6R90.A23C 23 943 IL6R90.A24C 24 944 IL6R90.S25C 25 945 IL6R90.G26C 26 946 IL6R90.F27C 27 947 IL6R90.T28C 28 948 IL6R90.F29C 29 949 IL6R90.D30C 30 950 IL6R90.W36C 36 951 IL6R90.V37C 37 952 IL6R90.R38C 38 953 IL6R90.Q39C 39 954 IL6R90.A40C 40 955 IL6R90.P41C 41 956 IL6R90.G42C 42 957 IL6R90.K43C 43 958 IL6R90.A44C 44 959 IL6R90.L45C 45 960 IL6R90.E46C 46 961 IL6R90.W47C 47 962 IL6R90.V48C 48 963 IL6R90.S49C 49 964 IL6R90.R66C 66 965 IL6R90.F67C 67 966 IL6R90.T68C 68 967 IL6R90.I69C 69 968 IL6R90.S70C 70 969 IL6R90.R71C 71 970 IL6R90.D72C 72 971 IL6R90.N73C 73 972 IL6R90.A74C 74 973

Variante da região Posição da substituição de cisteí- SEQ ID IL6R90-Fc VHH na (numeração de Kabat) NO: IL6R90.K75C 75 974 IL6R90.N76C 76 975 IL6R90.T77C 77 976 IL6R90.L78C 78 977 IL6R90.Y79C 79 978 IL6R90.L80C 80 979 IL6R90.Q81C 81 980 IL6R90.M82C 82 981 IL6R90.N82aC 82a 982 IL6R90.S82bC 82b 983 IL6R90.L82cC 82c 984 IL6R90.R83C 83 985 IL6R90.P84C 84 986 IL6R90.E85C 85 987 IL6R90.D86C 86 988 IL6R90.T87C 87 989 IL6R90.A88C 88 990 IL6R90.V89C 89 991 IL6R90.Y90C 90 992 IL6R90.Y91C 91 993 IL6R90.V93C 93 994 IL6R90.K94C 94 995 IL6R90.W103C 103 996 IL6R90.G104C 104 997 IL6R90.Q105C 105 998 IL6R90.G106C 106 999 IL6R90.T107C 107 1000 IL6R90.L108C 108 1001 IL6R90.V109C 109 1002 IL6R90.T110C 110 1003 IL6R90.V111C 111 1004

Variante da região Posição da substituição de cisteí- SEQ ID IL6R90-Fc VHH na (numeração de Kabat) NO: IL6R90.S112C 112 1005 IL6R90.S113C 113 1006

[00550] As variantes de IL6R90-Fc produzidas acima e mostradas na Tabela 41 foram expressas através da expressão transitória utili- zando células FreeStyle293 (Invitrogen) ou células Expi293 (Life technologies) por um método conhecido da pessoa versada na técnica e purificadas com Proteína A por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

Tabela 41 Nome da variante Região VHH SEQ ID Região Fc SEQ ID NO: IL6R90-Fc NO: IL6R90.E1C-Fc 922 320 IL6R90.V2C-Fc 923 320 IL6R90.Q3C-Fc 924 320 IL6R90.L4C-Fc 925 320 IL6R90.V5C-Fc 926 320 IL6R90.E6C-Fc 927 320 IL6R90.S7C-Fc 928 320 IL6R90.G8C-Fc 929 320 IL6R90.G9C-Fc 930 320 IL6R90.G10C-Fc 931 320 IL6R90.L11C-Fc 932 320 IL6R90.V12C-Fc 933 320 IL6R90.Q13C-Fc 934 320 IL6R90.P14C-Fc 935 320 IL6R90.G15C-Fc 936 320 IL6R90.G16C-Fc 937 320 IL6R90.S17C-Fc 938 320 IL6R90.L18C-Fc 939 320 IL6R90.R19C-Fc 940 320 IL6R90.L20C-Fc 941 320 IL6R90.S21C-Fc 942 320 IL6R90.A23C-Fc 943 320 IL6R90.A24C-Fc 944 320 IL6R90.S25C-Fc 945 320 IL6R90.G26C-Fc 946 320 IL6R90.F27C-Fc 947 320 IL6R90.T28C-Fc 948 320 IL6R90.F29C-Fc 949 320 IL6R90.D30C-Fc 950 320 IL6R90.W36C-Fc 951 320

Nome da variante Região VHH SEQ ID Região Fc SEQ ID NO: IL6R90-Fc NO: IL6R90.V37C-Fc 952 320 IL6R90.R38C-Fc 953 320 IL6R90.Q39C-Fc 954 320 IL6R90.A40C-Fc 955 320 IL6R90.P41C-Fc 956 320 IL6R90.G42C-Fc 957 320 IL6R90.K43C-Fc 958 320 IL6R90.A44C-Fc 959 320 IL6R90.L45C-Fc 960 320 IL6R90.E46C-Fc 961 320 IL6R90.W47C-Fc 962 320 IL6R90.V48C-Fc 963 320 IL6R90.S49C-Fc 964 320 IL6R90.R66C-Fc 965 320 IL6R90.F67C-Fc 966 320 IL6R90.T68C-Fc 967 320 IL6R90.I69C-Fc 968 320 IL6R90.S70C-Fc 969 320 IL6R90.R71C-Fc 970 320 IL6R90.D72C-Fc 971 320 IL6R90.N73C-Fc 972 320 IL6R90.A74C-Fc 973 320 IL6R90.K75C-Fc 974 320 IL6R90.N76C-Fc 975 320 IL6R90.T77C-Fc 976 320 IL6R90.L78C-Fc 977 320 IL6R90.Y79C-Fc 978 320 IL6R90.L80C-Fc 979 320 IL6R90.Q81C-Fc 980 320 IL6R90.M82C-Fc 981 320 IL6R90.N82aC-Fc 982 320

Nome da variante Região VHH SEQ ID Região Fc SEQ ID NO: IL6R90-Fc NO: IL6R90.S82bC-Fc 983 320 IL6R90.L82cC-Fc 984 320 IL6R90.R83C-Fc 985 320 IL6R90.P84C-Fc 986 320 IL6R90.E85C-Fc 987 320 IL6R90.D86C-Fc 988 320 IL6R90.T87C-Fc 989 320 IL6R90.A88C-Fc 990 320 IL6R90.V89C-Fc 991 320 IL6R90.Y90C-Fc 992 320 IL6R90.Y91C-Fc 993 320 IL6R90.V93C-Fc 994 320 IL6R90.K94C-Fc 995 320 IL6R90.W103C-Fc 996 320 IL6R90.G104C-Fc 997 320 IL6R90.Q105C-Fc 998 320 IL6R90.G106C-Fc 999 320 IL6R90.T107C-Fc 1000 320 IL6R90.L108C-Fc 1001 320 IL6R90.V109C-Fc 1002 320 IL6R90.T110C-Fc 1003 320 IL6R90.V111C-Fc 1004 320 IL6R90.S112C-Fc 1005 320 IL6R90.S113C-Fc 1006 320 Exemplo 12-2. Avaliação da mobilidade eletroforética em gel de polia- crilamida de anticorpos tendo substituição de cisteína em várias posi- ções de VHH

[00551] Foi examinado com SDS-PAGE não redutor se as variantes IL6R90-Fc produzidas no Exemplo 12-1 apresentam uma mobilidade eletroforética diferente para IL6R90-Fc. A solução tampão de amostra

(2ME-) (x4) (Wako; 198-13282) foi utilizada para a preparação de amostras de eletroforese, as amostras foram tratadas durante 10 mi- nutos sob a condição de concentração de amostra de 50 μg/ml e 70 °C, e então submetidas a SDS-PAGE não redutora. O gel Mini- PROTEAN TGX Precast 4-20% de 15well (BIORAD; 456-1096) foi uti- lizado para a SDS-PAGE não redutora e a eletroforese foi realizada em 200 V durante 2,5 horas. Em seguida, o gel foi corado com CBB, a imagem do gel foi capturada com ChemiDocTouchMP (BIORAD), e as faixas foram quantificadas com Image Lab (BIORAD).

[00552] A partir da imagem de gel obtida, as variantes foram classi- ficadas em 7 grupos de acordo com o padrão de faixa de cada uma das variantes IL6R90-Fc: Única (uma faixa em uma região de peso molecular semelhante àquela de IL6R90-Fc), Dupla (duas faixas em uma região de peso molecular semelhante àquela de IL6R90-Fc), Tri- pla (três faixas em uma região de peso molecular semelhante àquela de IL6R90-Fc), Várias (quatro ou mais faixas em uma região de peso molecular semelhante àquela de IL6R90-Fc), LMW (faixa(s) em uma região de peso molecular mais baixo do que aquela de IL6R90-Fc), HMW (faixa(s) em uma região de peso molecular mais elevado do que aquela de IL6R90-Fc) e Fraco (faixas indistintas e difíceis de determi- nar). Em relação às variantes IL6R90-Fc classificadas como “Dupla”, uma das duas faixas apresentou a mesma mobilidade eletroforética que IL6R90-Fc enquanto que a outra faixa apresentou mobilidade ligei- ramente mais rápida ou mais lenta. Assim, para as variantes IL6R90- Fc classificadas como “Dupla”, também foi calculada a porcentagem das faixas que apresentam mobilidade diferente para G7-IgG1 (por- centagem de nova faixa (%)). O agrupamento dos padrões de faixa para as variantes IL6R90-Fc e os resultados de cálculo da porcenta- gem da faixa são mostrados na Tabela 42. A partir da Tabela 42, as variantes classificadas nos grupos Dupla e Tripla são mostradas na

Tabela 43. Nestas variantes, é altamente provável que a substituição de cisteína provocou mudanças estruturais tais como reticulação de VHHs, o que resultou na mudança na mobilidade eletroforética.

Tabela 42 Nome da variante Grupo Porcentagem da nova IL6R90-Fc faixa (%) IL6R90.E1C-Fc Única - IL6R90.V2C-Fc Única - IL6R90.Q3C-Fc Única - IL6R90.L4C-Fc Tripla - IL6R90.V5C-Fc Única - IL6R90.E6C-Fc Dupla 65,2 IL6R90.S7C-Fc Dupla 16,4 IL6R90.G8C-Fc Dupla 38,4 IL6R90.G9C-Fc Dupla 71,8 IL6R90.G10C-Fc Dupla 9,7 IL6R90.L11C-Fc Dupla 59,8 IL6R90.V12C-Fc Dupla 24,8 IL6R90.Q13C-Fc sem dados - IL6R90.P14C-Fc Dupla 16,8 IL6R90.G15C-Fc Dupla 18,6 IL6R90.G16C-Fc Única - IL6R90.S17C-Fc Dupla 16,6 IL6R90.L18C-Fc Única - IL6R90.R19C-Fc Única - IL6R90.L20C-Fc Dupla 57,4 IL6R90.S21C-Fc Única - IL6R90.A23C-Fc Única - IL6R90.A24C-Fc Dupla 59,3 IL6R90.S25C-Fc Única - IL6R90.G26C-Fc Única - IL6R90.F27C-Fc Dupla 61,5 IL6R90.T28C-Fc Única -

Nome da variante Grupo Porcentagem da nova IL6R90-Fc faixa (%) IL6R90.F29C-Fc Dupla 56,7 IL6R90.D30C-Fc Única - IL6R90.W36C-Fc sem dados - IL6R90.V37C-Fc Única - IL6R90.R38C-Fc Dupla 64,5 IL6R90.Q39C-Fc Dupla 12,9 IL6R90.A40C-Fc Dupla 3,2 IL6R90.P41C-Fc Dupla 15,9 IL6R90.G42C-Fc HMW - IL6R90.K43C-Fc Dupla 9,2 IL6R90.A44C-Fc Dupla 17,9 IL6R90.L45C-Fc Dupla 15,4 IL6R90.E46C-Fc Dupla 16,4 IL6R90.W47C-Fc Dupla 12,6 IL6R90.V48C-Fc Dupla 14,7 IL6R90.S49C-Fc Dupla 54,1 IL6R90.R66C-Fc Única - IL6R90.F67C-Fc Dupla 34,8 IL6R90.T68C-Fc Única - IL6R90.I69C-Fc Dupla 57,5 IL6R90.S70C-Fc Única - IL6R90.R71C-Fc Dupla 34,3 IL6R90.D72C-Fc Única - IL6R90.N73C-Fc Única - IL6R90.A74C-Fc Única - IL6R90.K75C-Fc Única - IL6R90.N76C-Fc Única - IL6R90.T77C-Fc Única - IL6R90.L78C-Fc Dupla 40,6 IL6R90.Y79C-Fc Única - IL6R90.L80C-Fc Dupla 54,7

Nome da variante Grupo Porcentagem da nova IL6R90-Fc faixa (%) IL6R90.Q81C-Fc Única - IL6R90.M82C-Fc Dupla 47,7 IL6R90.N82aC-Fc Única - IL6R90.S82bC-Fc HMW - IL6R90.L82cC-Fc Dupla 73,2 IL6R90.R83C-Fc Única - IL6R90.P84C-Fc Única - IL6R90.E85C-Fc Dupla 9,4 IL6R90.D86C-Fc sem dados - IL6R90.T87C-Fc Única - IL6R90.A88C-Fc Dupla 66,5 IL6R90.V89C-Fc LMW - IL6R90.Y90C-Fc sem dados - IL6R90.Y91C-Fc Tripla - IL6R90.V93C-Fc Tripla - IL6R90.K94C-Fc Dupla 37,7 IL6R90.W103C-Fc Única - IL6R90.G104C-Fc sem dados - IL6R90.Q105C-Fc Única - IL6R90.G106C-Fc sem dados - IL6R90.T107C-Fc Dupla 53,6 IL6R90.L108C-Fc Única - IL6R90.V109C-Fc Fraca - IL6R90.T110C-Fc Única - IL6R90.V111C-Fc Única - IL6R90.S112C-Fc Única - IL6R90.S113C-Fc Única -

Tabela 43 Nome da variante Grupo Porcentagem da nova IL6R90-Fc faixa (%) IL6R90.L4C-Fc Tripla - IL6R90.E6C-Fc Dupla 65,2 IL6R90.S7C-Fc Dupla 16,4 IL6R90.G8C-Fc Dupla 38,4 IL6R90.G9C-Fc Dupla 71,8 IL6R90.G10C-Fc Dupla 9,7 IL6R90.L11C-Fc Dupla 59,8 IL6R90.V12C-Fc Dupla 24,8 IL6R90.P14C-Fc Dupla 16,8 IL6R90.G15C-Fc Dupla 18,6 IL6R90.S17C-Fc Dupla 16,6 IL6R90.L20C-Fc Dupla 57,4 IL6R90.A24C-Fc Dupla 59,3 IL6R90.F27C-Fc Dupla 61,5 IL6R90.F29C-Fc Dupla 56,7 IL6R90.R38C-Fc Dupla 64,5 IL6R90.Q39C-Fc Dupla 12,9 IL6R90.A40C-Fc Dupla 3,2 IL6R90.P41C-Fc Dupla 15,9 IL6R90.K43C-Fc Dupla 9,2 IL6R90.A44C-Fc Dupla 17,9 IL6R90.L45C-Fc Dupla 15,4 IL6R90.E46C-Fc Dupla 16,4 IL6R90.W47C-Fc Dupla 12,6 IL6R90.V48C-Fc Dupla 14,7 IL6R90.S49C-Fc Dupla 54,1 IL6R90.F67C-Fc Dupla 34,8 IL6R90.I69C-Fc Dupla 57,5 IL6R90.R71C-Fc Dupla 34,3 IL6R90.L78C-Fc Dupla 40,6

Nome da variante Grupo Porcentagem da nova IL6R90-Fc faixa (%) IL6R90.L80C-Fc Dupla 54,7 IL6R90.M82C-Fc Dupla 47,7 IL6R90.L82cC-Fc Dupla 73,2 IL6R90.E85C-Fc Dupla 9,4 IL6R90.A88C-Fc Dupla 66,5 IL6R90.Y91C-Fc Tripla - IL6R90.V93C-Fc Tripla - IL6R90.K94C-Fc Dupla 37,7 IL6R90.T107C-Fc Dupla 53,6 Exemplo 13: Avaliação da atividade agonista de CD3 de anticorpos tendo substituição de cisteína dentro do Fab Exemplo 13-1. Produção de anticorpos tendo substituição de cisteína na região constante

[00553] Um anticorpo agonista CD3 anti-humano, OKT3 (cadeia pesada: OKT3VH0000-G1T4 (SEQ ID NO: 1007), cadeia leve: OKT3VL0000-KT0 (SEQ ID NO: 1008)), foi submetido a um estudo em que um resíduo de aminoácido arbitrário estruturalmente exposto à superfície foi substituído por cisteína.

[00554] Os resíduos de aminoácido dentro da região constante de cadeia pesada OKT3 (G1T4, SEQ ID NO: 1009) foram substituídos por cisteína para produzir variantes da região constante de cadeia pesada OKT3 mostradas na Tabela 44. Estas variantes da região constante de cadeia pesada OKT3 foram cada uma ligada com a região variável de cadeia pesada OKT3 (OKT3VH0000, SEQ ID NO: 1010) para produzir variantes de cadeia pesada OKT3, e os vetores de expressão que co- dificam os genes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica.

Tabela 44 Variante da região constante Posição da substituição de SEQ ID de cadeia pesada OKT3 cisteína (numeração da EU) NO: G1T4.T135C 135 1017 G1T4.S136C 136 1018 G1T4.S191C 191 1019

[00555] Da mesma forma, um resíduo de aminoácido dentro da re- gião constante de cadeia leve OKT3 (KT0, SEQ ID NO: 1011) foi subs- tituído por cisteína para produzir uma variante da região constante de cadeia leve OKT3 mostrada na Tabela 45. Esta variante da região constante de cadeia leve OKT3 foi ligada com a região variável de ca- deia leve OKT3 (OKT3VL0000, SEQ ID NO: 1012) para produzir uma variante de cadeia leve OKT3, e um vetor de expressão que codifica o gene correspondente foi produzido por um método conhecido da pes- soa versada na técnica. Tabela 45 Variante da região constan- Posição da substituição de cis- SEQ ID te de cadeia leve OKT3 teína (numeração de Kabat) NO: KT0.K126C 126 1020

[00556] As variantes de cadeia pesada OKT3 e a variante de cadeia leve OKT3 produzidas acima foram combinadas com a cadeia leve OKT3 e a cadeia pesada OKT3, e as variantes OKT3 mostradas na Tabela 46 foram expressas através da expressão transitória utilizando células FreeStyle293 (Invitrogen) ou células Expi293 (Life technologi- es) por um método conhecido da pessoa versada na técnica, e purifi- cadas com Proteína A por um método conhecido da pessoa versada na técnica. Além disso, um anticorpo anti-KLH, IC17 ((cadeia pesada: IC17HdK-G1T4 (SEQ ID NO: 1013), cadeia leve: IC17L-k0 (SEQ ID NO: 1014)) foi preparado de forma semelhante como um controle ne-

gativo. Tabela 46 Nome do anticorpo Região vari- Região Região vari- Região ável de ca- constante de ável de ca- constante de deia pesada cadeia pe- deia leve cadeia leve SEQ ID NO: sada SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: H_T135C 1010 1017 1012 1011 H_S136C 1010 1018 1012 1011 H_S191C 1010 1019 1012 1011 L_K126C 1010 1009 1012 1020 Exemplo 13-2. Preparação da suspensão de células Jurkat

[00557] Células Jurkat (células efetoras TCR/CD3 (NFAT), Prome- ga) foram coletadas de frascos. As células foram lavadas com tampão de ensaio (meio RPMI 1640 (Gibco), 10% de FBS (HyClone), 1% de aminoácidos não essenciais MEM (Invitrogen) e piruvato de sódio 1 mM (Invitrogen)) e, em seguida, colocadas em suspensão em 3 x 106 células/ml em tampão de ensaio. Esta suspensão de células Jurkat foi submetida a experiências subsequentes. Exemplo 13-3. Preparação da solução de reagente de luminescência

[00558] 100 ml de Bio-Glo Luciferase Assay Buffer (Promega) foram adicionados ao frasco de Bio-Glo Luciferase Assay Substrate (Prome- ga) e misturados por inversão. O frasco foi protegido da luz e congela- do a -20 °C. Esta solução reagente de luminescência foi submetida a experimentos subsequentes. Exemplo 13-4. Avaliação da ativação de células T de anticorpos tendo substituição de cisteína na região constante

[00559] A ativação de células T através da sinalização de agonista foi avaliada com base na alteração da dobra da luminescência de luci- ferase. As células Jurkat acima mencionadas são células transforma- das com um gene repórter de luciferase tendo uma sequência respon-

siva a NFAT. Quando as células são estimuladas por um anticorpo an- ti-TCR/CD3, a via de NFAT é ativada por meio de sinalização intrace- lular, induzindo assim a expressão da luciferase. A suspensão de célu- las Jurkat preparada conforme descrito acima foi adicionada a uma placa branca de fundo plano de 384 cavidades em 10 μl por cavidade (3 x 104 células/cavidade). Em seguida, a solução de anticorpo prepa- rada em cada concentração (10.000, 1.000, 100, 10, 1 e 0,1 ng/ml) foi adicionada a 20 μl por cavidade. Esta placa foi deixada em uma incu- badora de CO2 5% a 37 °C durante 24 horas. Após a incubação, a so- lução do reagente de luminescência foi descongelada e 30 μl da solu- ção foram adicionados a cada cavidade. A placa foi então deixada re- pousar na temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência da luciferase em cada cavidade da placa foi medida utilizando um lu- minômetro. A quantidade de luminescência (dobro) foi determinada dividindo a quantidade de luminescência nas cavidades adicionadas com o anticorpo pela quantidade de luminescência nas cavidades sem o anticorpo.

[00560] Como um resultado, entre as variantes OKT3 tendo substi- tuição de cisteína na região constante, múltiplas variantes aumentaram muito o estado ativado por células T em comparação com OKT3, como mostrado na Fig. 26. Este resultado mostra que existem várias modifi- cações de cisteína que podem reticular Fabs e aumentar as atividades do agonista CD3. Exemplo 14: Avaliação da atividade do agonista CD3 de anticorpos tendo diferentes substituições de cisteína nos dois Fabs Exemplo 14-1. Produção de anticorpos tendo substituição de cisteína heteróloga na região constante

[00561] Um anticorpo agonista CD3 anti-humano, OKT3 (cadeia pesada: OKT3VH0000-G1T4 (SEQ ID NO: 1007), cadeia leve: OKT3VL0000-KT0 (SEQ ID NO: 1008)), foi submetido a um estudo em que um resíduo de aminoácido arbitrário estruturalmente exposto à superfície foi substituído por cisteína.

[00562] Um resíduo de aminoácido dentro da região 1 constante de cadeia pesada OKT3 (G1T4k, SEQ ID NO: 1015) foi substituído por cisteína para produzir uma variante da região constante de cadeia pe- sada OKT3 mostrada na Tabela 47. Esta variante da região constante de cadeia pesada OKT3 foi ligada à região variável de cadeia pesada OKT3 (OKT3VH0000, SEQ ID NO: 1010) para produzir a variante 1 de cadeia pesada OKT3, e um vetor de expressão que codifica o gene correspondente foi produzido por um método conhecido da pessoa versada na técnica. Da mesma forma, os resíduos de aminoácido den- tro da região constante 2 de cadeia pesada OKT3 (G1T4h, SEQ ID NO: 1016) foram substituídos por cisteína para produzir variantes da região constante de cadeia pesada OKT3 mostradas na Tabela 48. Estas variantes da região constante de cadeia pesada OKT3 foram cada uma ligada à região variável de cadeia pesada OKT3 (OKT3VH0000, SEQ ID NO: 1010) para produzir a variante 2 de ca- deia pesada OKT3 e os vetores de expressão que codificam os genes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pes- soa versada na técnica. Nota-se que as regiões constantes de cadeia pesada 1 e 2 neste exemplo são introduzidas com a modificação Knobs-into-Holes (KiH) na região CH3 para promover a heterodimeri- zação. Tabela 47 Variante da região 1 constan- Posição da substituição de SEQ ID te de cadeia pesada OKT3 cisteína (numeração da EU) NO: G1T4k.S191C 191 1022

Tabela 48 Variante da região 2 constan- Posição da substituição de SEQ ID te de cadeia pesada OKT3 cisteína (numeração da EU) NO: G1T4h.V188C 188 1023 G1T4h.P189C 189 1024 G1T4h.S190C 190 1025 G1T4h.S191C 191 1026 G1T4h.S192C 192 1027 G1T4h.L193C 193 1028 G1T4h.G194C 194 1029

[00563] A variante 1 de cadeia pesada OKT3 produzida acima e a variante 2 de cadeia pesada OKT3 foram combinadas com a cadeia leve OKT3, e as variantes OKT3 mostradas na Tabela 49 foram ex- pressas através da expressão transitória utilizando células FreeS- tyle293 (Invitrogen) ou células Expi293 (Life technologies) por um mé- todo conhecido da pessoa versada na técnica e purificadas com Prote- ína A por um método conhecido da pessoa versada na técnica. Além disso, um anticorpo anti-KLH, IC17 (cadeia pesada: IC17HdK-G1T4 (SEQ ID NO: 1013), cadeia leve: IC17L-k0 (SEQ ID NO: 1014)) foi preparado de forma semelhante como um controle negativo. Tabela 49 Nome do anticorpo Variante de cadeia pe- Variante de cadeia pe- Região Região sada 1 sada 2 variável cons- Região Região Região Região de ca- tante de variável de constante variável de constante deia leve cadeia cadeia pe- de cadeia cadeia pe- de cadeia SEQ ID leve sada SEQ pesada sada SEQ pesada NO: SEQ ID ID NO: SEQ ID ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: OKT3_KiH 1010 1015 1010 1016 1012 1011 H_S191C_KiH 1010 1022 1010 1026 1012 1011 H_S191C/V188C_KiH 1010 1022 1010 1023 1012 1011 H_S191C/P189C_KiH 1010 1022 1010 1024 1012 1011 H_S191C/S190C_KiH 1010 1022 1010 1025 1012 1011

Nome do anticorpo Variante de cadeia pe- Variante de cadeia pe- Região Região sada 1 sada 2 variável cons- Região Região Região Região de ca- tante de variável de constante variável de constante deia leve cadeia cadeia pe- de cadeia cadeia pe- de cadeia SEQ ID leve sada SEQ pesada sada SEQ pesada NO: SEQ ID ID NO: SEQ ID ID NO: SEQ ID NO: NO: NO: H_S191C/S192C_KiH 1010 1022 1010 1027 1012 1011 H_S191C/L193C_KiH 1010 1022 1010 1028 1012 1011 H_S191C/G194C_KiH 1010 1022 1010 1029 1012 1011 Exemplo 14-2. Preparação da suspensão de células Jurkat

[00564] A suspensão de células Jurkat foi preparada como no Exemplo 13-2. Exemplo 14-3. Preparação da solução de reagente de luminescência

[00565] A solução de reagente de luminescência foi preparada co- mo no Exemplo 13-3. Exemplo 14-4. Avaliação da ativação de células T de anticorpos tendo substituição de cisteína heteróloga na região constante

[00566] A ativação de células T foi avaliada como no Exemplo 13-4.

[00567] Como um resultado, as variantes OKT3 tendo diferentes substituições de cisteína nas duas regiões constantes do anticorpo aumentaram muito o estado ativado por células T em comparação com OKT3, como mostrado na Fig. 27. Este resultado mostra que mesmo diferentes substituições de cisteína entre os Fabs podem reticular Fabs e aumentar as atividades agonistas de CD3. Exemplo 15: Avaliação da atividade agonista de CD3 de anticorpos tendo modificação de carga dentro do Fab Exemplo 15-1. Produção de anticorpos tendo substituição de aminoá- cido carregado na região constante

[00568] A cadeia pesada de um anticorpo agonista CD3 anti- humano, OKT3 (cadeia pesada: OKT3VH0000-G1T4 (SEQ ID NO: 1007), cadeia leve: OKT3VL0000-KT0 (SEQ ID NO: 1008)), foi subme-

tida a um estudo no qual um resíduo de aminoácido arbitrário estrutu- ralmente exposto à superfície foi substituído por um aminoácido carre- gado.

[00569] Os resíduos de aminoácido na região constante 1 de cadeia pesada OKT3 (G1T4k, SEQ ID NO: 1015) foram substituídos por argi- nina (R) ou lisina (K) para produzir uma variante da região constante de cadeia pesada OKT3 mostrada na Tabela 50. Esta variante da re- gião constante de cadeia pesada OKT3 foi ligada com a região variá- vel de cadeia pesada OKT3 (OKT3VH0000, SEQ ID NO: 1010) para produzir a variante 1 de cadeia pesada OKT3 e um vetor de expressão que codifica o gene correspondente foi produzido por um método co- nhecido da pessoa versada na técnica. Similarmente, os resíduos de aminoácido dentro da região constante 2 de cadeia pesada OKT3 (G1T4h, SEQ ID NO: 1016) foram substituídos por ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E) para produzir variantes da região constante de cadeia pesada OKT3 mostradas na Tabela 51. Estas variantes da re- gião constante de cadeia pesada OKT3 foram, cada uma, ligada à re- gião variável de cadeia pesada OKT3 (OKT3VH0000, SEQ ID NO: 1010) para produzir a variante 2 de cadeia pesada OKT3, e os vetores de expressão que codificam os genes correspondentes foram produzi- dos por um método conhecido da pessoa versada na técnica. Obser- va-se que as regiões CH3 das regiões constantes de cadeia pesada 1 e 2 neste exemplo são introduzidas com a modificação Knobs-into- Holes (KiH) para promover a heterodimerização. Tabela 50 Variante da região Modificação de aminoácido SEQ ID constante 1 de cadeia (numeração da EU) NO: pesada OKT3 G1T4k0004 S134R/T135R/S136R/G137R/S191R/ 1030 S192R/L193R/G194R/T195R/Q196R

Tabela 51 Variante da região Modificação de aminoácido (numera- SEQ ID constante 2 de cadeia ção da EU) NO: pesada OKT3 G1T4h0004 S134D/T135D/S136D/G137D/S191D/ 1031 S192D/L193D/G194D/T195D/Q196D G1T4h0006 S134E/T135E/S136E/G137E/S191E/ 1032 S192E/L193E/G194E/T195E/Q196E

[00570] A variante 1 de cadeia pesada OKT3 e a variante 2 de ca- deia pesada OKT3 produzidas acima foram combinadas com a cadeia leve OKT3, e as variantes OKT3 mostradas na Tabela 52 foram ex- pressas através da expressão transitória utilizando células FreeS- tyle293 (Invitrogen) ou células Expi293 (Life technologies) por um mé- todo conhecido da pessoa versada na técnica e purificadas com Prote- ína A por um método conhecido da pessoa versada na técnica. Além disso, um anticorpo anti-KLH, IC17 (cadeia pesada: IC17HdK-G1T4 (SEQ ID NO: 1013), cadeia leve: IC17L-k0 (SEQ ID NO: 1014)) foi preparado de forma semelhante como um controle negativo. Tabela 52 Nome do anticorpo Variante de cadeia Variante de cadeia Região Região pesada 1 pesada 2 variável constante Região Região Região Região de cadeia de cadeia variável de constante variável de constante leve SEQ leve SEQ cadeia de cadeia cadeia de cadeia ID NO: ID NO: pesada pesada pesada pesada

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: NO: NO: NO: OKT3_KiH 1010 1015 1010 1016 1012 1011 0004//0004 1010 1030 1010 1031 1012 1011 0004//0006 1010 1030 1010 1032 1012 1011 0004//OKT3 1010 1030 1010 1016 1012 1011 OKT3//0004 1010 1015 1010 1031 1012 1011 OKT3//0006 1010 1015 1010 1032 1012 1011 Exemplo 15-2. Preparação da suspensão de células Jurkat

[00571] A suspensão de células Jurkat foi preparada como no Exemplo 13-2. Exemplo 15-3. Preparação da solução de reagente de luminescência

[00572] A solução de reagente de luminescência foi preparada co- mo no Exemplo 13-3. Exemplo 15-4. Avaliação da ativação de células T de anticorpos tendo substituição com aminoácidos diferentes de cisteína na região cons- tante

[00573] A ativação de células T foi avaliada como no Exemplo 13-4.

[00574] Como um resultado, as variantes OKT3 introduzidas com substituição de aminoácido positivamente carregado em uma região constante e com substituição de aminoácido negativamente carregado na outra região constante aumentaram muito o estado ativado por cé- lulas T em comparação com OKT3 como mostrado na Fig. 28. En- quanto isso, as variantes OKT3 introduzidas com substituição de ami- noácido positiva ou negativamente carregado em uma região constan- te e sem modificação na outra região constante dificilmente alteraram o estado ativado por células T em comparação com OKT3. Este resul- tado mostra que não apenas a substituição de cisteína, mas também a substituição de aminoácido carregado, podem reticular Fabs por liga- ção não covalente e aumentar as atividades agonistas de CD3. Exemplo 16: Avaliação da atividade agonista de CD3 de anticorpos tendo substituição de cisteína dentro do Fab e sem ligações de dissul- feto na região de dobradiça Exemplo 16-1. Produção de anticorpos tendo substituição de cisteína dentro do Fab e sem ligações de dissulfeto na região de dobradiça

[00575] A cadeia pesada de um anticorpo agonista CD3 anti- humano, OKT3 (cadeia pesada: OKT3VH0000-G1T4 (SEQ ID NO: 1007), cadeia leve: OKT3VL0000-KT0 (SEQ ID NO: 1008)), foi subme- tida a um estudo no qual as ligações de dissulfeto na região de dobra-

diça foram removidas e um resíduo de aminoácido estruturalmente ex- posto à superfície foi substituído por cisteína.

[00576] Cisteína na região de dobradiça da região constante de ca- deia pesada OKT3 (G1T4, SEQ ID NO: 1009) foi substituída por serina para produzir variantes da região constante de cadeia pesada OKT3 mostradas na Tabela 53. O resíduo de aminoácido na posição 191 (numeração da EU) dessas variantes da região constante de cadeia pesada OKT3 foi substituído por cisteína para produzir variantes da região constante de cadeia pesada OKT3 mostradas na Tabela 54. Essas variantes da região constante de cadeia pesada OKT3 foram ligadas à região variável de cadeia pesada OKT3 (OKT3VH0000, SEQ ID NO: 1010) para produzir variantes de cadeia pesada OKT3, e os vetores de expressão que codificam os genes correspondentes foram produzidos por um método conhecido da pessoa versada na técnica. Tabela 53 Variante da região constante Modificação de aminoácido SEQ ID de cadeia pesada OKT3 (numeração da EU) NO: G1T4.dh1 C226S 1033 G1T4.dh2 C229S 1034 G1T4.dh3 C226S/C229S 1035 Tabela 54 Variante da região constante Modificação de aminoácido SEQ ID de cadeia pesada OKT3 (numeração da EU) NO: G1T4.S191C.dh1 S191C/C226S 1036 G1T4.S191C.dh2 S191C/C229S 1037 G1T4.S191C.dh3 S191C/C226S/C229S 1038

[00577] As variantes de cadeia pesada OKT3 produzidas acima fo- ram combinadas com a cadeia leve OKT3, e as variantes OKT3 mos- tradas na Tabela 55 foram expressas através da expressão transitória utilizando células FreeStyle293 (Invitrogen) ou células Expi293 (Life technologies) por um método conhecido da pessoa versada na técni- ca, e purificadas com Proteína A por um método conhecido da pessoa versada na técnica. Além disso, um anticorpo anti-KLH, IC17 (cadeia pesada: IC17HdK-G1T4 (SEQ ID NO: 1013), cadeia leve: IC17L-k0 (SEQ ID NO: 1014)) foi preparado de forma semelhante como um con- trole negativo. Tabela 55 Nome do anti- Região vari- Região cons- Região vari- Região cons- corpo ável de ca- tante de ca- ável de ca- tante de ca- deia pesada deia pesada deia leve deia leve SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: dh1 1010 1033 1012 1011 dh2 1010 1034 1012 1011 dh3 1010 1035 1012 1011 H_S191C_dh1 1010 1036 1012 1011 H_S191C_dh2 1010 1037 1012 1011 H_S191C_dh3 1010 1038 1012 1011 Exemplo 16-2. Preparação da suspensão de células Jurkat

[00578] A suspensão de células Jurkat foi preparada como no Exemplo 13-2. Exemplo 16-3. Preparação da solução de reagente de luminescência

[00579] A solução de reagente de luminescência foi preparada co- mo no Exemplo 13-3. Exemplo 16-4. Avaliação da ativação de células T de anticorpos tendo substituição de cisteína dentro do Fab e sem ligações de dissulfeto na região de dobradiça

[00580] A ativação de células T foi avaliada como no Exemplo 13-4.

[00581] Como um resultado, as variantes OKT3 com apenas as li- gações de dissulfeto na região de dobradiça removidas reduziram ou dificilmente alteraram o estado ativado por células T em comparação com OKT3, como mostrado na Fig. 29. Por outro lado, as variantes OKT3 com as ligações de dissulfeto na região de dobradiça removidas e introduzidas com substituição de cisteína na região constante au- mentou muito o estado ativado por células T em comparação com OKT3. Este resultado mostra que mesmo quando não existe nenhuma ligação de dissulfeto na região de dobradiça, a substituição de cisteína dentro do Fab pode reticular Fabs e aumentar as atividades agonistas de CD3. Exemplo 17: Produção de vetores de expressão para anticorpos modi- ficados e expressão e purificação de anticorpos modificados

[00582] Um gene de anticorpo inserido em um vetor de expressão para células de animais foi submetido à substituição da sequência de resíduos de aminoácido por um método conhecido da pessoa versada na técnica utilizando PCR, o kit de clonagem In-Fusion Advantage PCR (TAKARA), ou semelhante, para construir um vetor de expressão para um anticorpo modificado. A sequência de nucleotídeo do vetor de expressão resultante foi determinada por um método conhecido da pessoa versada na técnica. O vetor de expressão produzido foi intro- duzido transitoriamente em células FreeStyle293® ou Expi293® (Invi- trogen) e as células foram deixadas expressar o anticorpo modificado no sobrenadante de cultura. O anticorpo modificado foi purificado a partir do sobrenadante de cultura obtido por um método conhecido da pessoa versada na técnica utilizando Proteína A e semelhantes. A ab- sorbância em 280 nm foi medida utilizando um espectrofotômetro. Um coeficiente de absorção foi calculado a partir do valor medido utilizan- do o método PACE e utilizado para calcular a concentração de anti- corpo (Protein Science 1995;4:2411-2423). Exemplo 18: Preparação de anticorpos biespecíficos

[00583] O anticorpo purificado foi dialisado em TBS ou tampão PBS e a sua concentração foi ajustada para 1 mg ml. Como um tampão de reação 10x, foi preparado 2-MEA (SIGMA) 250 mM. Dois anticorpos homodiméricos diferentes preparados no Exemplo 17 foram mistura- dos em quantidades iguais. A esta mistura, um volume 1/10 do tampão de reação 10x foi adicionado e misturado. A mistura foi deixada repou- sar a 37 °C durante 90 minutos. Após a reação, a mistura foi dialisada em TBS ou PBS para obter uma solução de um anticorpo biespecífico no qual os dois anticorpos diferentes acima foram heterodimerizados. A concentração de anticorpo foi medida pelo método acima menciona- do e o anticorpo foi submetido a experiências subsequentes. Exemplo 19: Avaliação da atividade agonista Exemplo 19-1. Preparação de suspensão de células Jurkat

[00584] Células Jurkat (células efetoras TCR/CD3 (NFAT), Prome- ga) foram coletadas de frascos. As células foram lavadas com tampão de ensaio (meio RPMI 1640 (Gibco), 10% de FBS (HyClone), 1% de aminoácidos não essenciais MEM (Invitrogen) e piruvato de sódio 1 mM (Invitrogen)) e, em seguida, colocadas em suspensão em 3 x 106 células/ml em tampão de ensaio. Esta suspensão de células Jurkat foi submetida a experiências subsequentes. Exemplo 19-2. Preparação da solução de reagente de luminescência

[00585] 100 ml de Bio-Glo Luciferase Assay Buffer (Promega) foram adicionados ao frasco de Bio-Glo Luciferase Assay Substrate (Prome- ga) e misturados por inversão. O frasco foi protegido da luz e congela- do a -20 °C. Esta solução reagente de luminescência foi submetida a experimentos subsequentes. Exemplo 19-3. Ensaio de ativação de células T

[00586] A ativação de células T através da sinalização de agonista foi avaliada com base na alteração da dobra da luminescência da luci- ferase. As células Jurkat acima mencionadas são células transforma- das com um gene repórter de luciferase tendo uma sequência respon- siva a NFAT. Quando as células são estimuladas por um anticorpo an-

ti-TCR/CD3, a via de NFAT é ativada por meio de sinalização intrace- lular, induzindo assim a expressão da luciferase. A suspensão de célu- las Jurkat preparada conforme descrito acima foi adicionada a uma placa branca de fundo plano de 384 cavidades em 10 μl por cavidade (3 x 104 células/cavidade). Em seguida, a solução de anticorpo prepa- rada em cada concentração (150, 15, 1,5, 0,15, 0,015, 0,0015, 0,00015 e 0,000015 nM) foi adicionada a 20 μl por cavidade. Esta pla- ca foi deixada repousar em uma incubadora de CO2 5% a 37 °C duran- te 24 horas. Após a incubação, a solução do reagente de luminescên- cia foi descongelada e 30 μl da solução foram adicionados a cada ca- vidade. A placa foi então deixada repousar na temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência de luciferase em cada cavidade da placa foi medida utilizando um luminômetro. Exemplo 20: Avaliação da atividade agonista de anticorpos biparatópi- cos CD3 utilizando células Jurkat

[00587] Os anticorpos foram preparados e suas atividades foram avaliadas de acordo com os Exemplos 17, 18 e 19. Os anticorpos utili- zados neste Exemplo são mostrados na Tabela 56. Tabela 56 Nome do anti- SEQ ID NO (Anti- SEQ ID NO (Anti- Forma mole- corpo corpo 1): corpo 2): cular Cadeia Cadeia Cadeia Cadeia pesada leve pesada leve CD3-G1sLL 1039 1040 - - Anticorpo mo- noespecífico CD3//OKT3-G1s 1041 1042 1043 1044 Anticorpo bi- específico CD3//OKT3- 1045 1046 1047 1048 Anticorpo bi- G1sHH específico CD3//OKT3- 1049 1050 1051 1052 Anticorpo bi- G1sLH específico

Nome do anti- SEQ ID NO (Anti- SEQ ID NO (Anti- Forma mole- corpo corpo 1): corpo 2): cular Cadeia Cadeia Cadeia Cadeia pesada leve pesada leve OKT3-G1s 1053 1054 - - Anticorpo mo- noespecífico OKT3-G1sHH 1055 1056 - - Anticorpo mo- noespecífico CD3-G1sLL + 1057 1058 1059 1060 Anticorpo mo- OKT3-G1s noespecífico

[00588] Como um resultado, as moléculas modificadas com uma ligação de dissulfeto adicional que liga o Fab-Fab de dois tipos de an- ticorpos biespecíficos anti-CD3 apresentaram sinalização mediada por CD3 variada em comparação com anticorpos biespecíficos sem a liga- ção de dissulfeto adicional como mostrado na Fig. 30.

[00589] Este resultado sugere que a introdução de modificações da presente invenção pode aumentar ou diminuir a atividade agonista possuída por moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas tendo epítopos diferentes para o mesmo alvo. Exemplo 21: Avaliação da atividade agonista de CD137 utilizando cé- lulas Jurkat

[00590] Os anticorpos foram preparados e suas atividades foram avaliadas de acordo com os Exemplos 17, 18 e 19. Os anticorpos utili- zados neste Exemplo foram como se segue: um anticorpo anti-CD137 comum, um anticorpo introduzido com uma mutação que promove a associação de anticorpos (hexamerização) em sua região constante de cadeia pesada e anticorpos modificados produzidos pela ligação do Fab-Fab de cada um dos anticorpos acima com uma ligação de dissul- feto adicional.

[00591] A ativação de células T através da sinalização de agonista foi avaliada com base na alteração da dobra da luminescência de luci-

ferase. As células da linhagem celular GloResponseTM NF-κB-Luc2/4- 1BB Jurkat (Promega) são células transformadas com um gene repór- ter de luciferase tendo uma sequência responsiva a NFAT. Quando as células são estimuladas por um anticorpo anti-CD137, a via da NFAT é ativada por meio de sinalização intracelular, induzindo assim a expres- são da luciferase. A suspensão de células Jurkat preparada em 2 x 106 células/ml com meio de ensaio (99% RPMI, 1% FBS) foi adicionada a uma placa branca de fundo plano de 96 cavidades em 25 μl por cavi- dade (5 x 104 células/cavidade). Em seguida, a solução de anticorpo contendo ATP ou a solução de anticorpo sem ATP preparada em cada concentração de anticorpo (concentração final: 45, 15, 5, 1,667, 0,556, 0,185, 0,062 e 0,021 μg/ml) foi adicionada em 25 μl por cavidade. A concentração final de ATP foi de 250 nM. Esta placa foi deixada re- pousar em uma incubadora de CO2 5% a 37 °C durante 6 horas. Após a incubação, a solução do reagente de luminescência foi descongela- da e 75 μl da solução foram adicionados a cada cavidade. A placa foi então deixada repousar na temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência de luciferase em cada cavidade da placa foi medida utilizando um luminômetro. O valor da luminescência de cada cavidade dividido pelo valor da luminescência da cavidade sem adição de anti- corpos foi definido como dobra luminescente, e serviu como indicador para avaliação da atividade de cada anticorpo.

[00592] Como um resultado, os anticorpos introduzidos com a modi- ficação de hexamerização mostraram aumento da atividade agonista em comparação com um anticorpo anti-CD137 comum. Além disso, em anticorpos modificados onde cada um dos anticorpos foi introduzi- do com ligações de dissulfeto adicionais, foi observado aumento sinér- gico na atividade agonista.

[00593] Este resultado sugere que a introdução de modificações da presente invenção pode aumentar a atividade de um anticorpo de agonista anti-CD137. Exemplo 22: Avaliação da atividade agonista de anticorpos biespecífi- cos CD3//PD1 utilizando células Jurkat Exemplo 22-1

[00594] Os anticorpos foram preparados e suas atividades foram avaliadas de acordo com os Exemplos 17, 18 e 19. Os anticorpos utili- zados neste Exemplo são mostrados na Tabela 58. Tabela 58 Nome do anti- SEQ ID NO (Anti- SEQ ID NO (Anti- Forma mole- corpo corpo 1): corpo 2): cular Cadeia Cadeia Cadeia Cadeia pesada leve pesada leve OKT3//117- 1113 1114 1115 1116 Anticorpo bi- G1silent específico OKT3//117- 1117 1118 1119 1120 Anticorpo bi- G1silentLL específico OKT3//117- 1121 1122 1123 1124 Anticorpo bi- G1silentHH específico OKT3//117- 1125 1126 1127 1128 Anticorpo bi- G1silentHL específico OKT3//10- 1129 1130 1131 1132 Anticorpo bi- G1silent específico OKT3//10- 1133 1134 1135 1136 Anticorpo bi- G1silentHH específico OKT3//10- 1137 1138 1139 1140 Anticorpo bi- G1silentHL específico CD3//949- 1141 1142 1143 1144 Anticorpo bi- G1silent específico CD3//949- 1145 1146 1147 1148 Anticorpo bi- G1silentLL específico CD3//949- 1149 1150 1151 1152 Anticorpo bi- G1silentHH específico CD3//949- 1153 1154 1155 1156 Anticorpo bi- G1silentLH específico

Nome do anti- SEQ ID NO (Anti- SEQ ID NO (Anti- Forma mole- corpo corpo 1): corpo 2): cular Cadeia Cadeia Cadeia Cadeia pesada leve pesada leve CD3//949- 1157 1158 1159 1160 Anticorpo bi- G1silentHL específico OKT3//949- 1161 1162 1163 1164 Anticorpo bi- G1silent específico OKT3//949- 1165 1166 1167 1168 Anticorpo bi- G1silentLL específico OKT3//949- 1169 1170 1171 1172 Anticorpo bi- G1silentHH específico OKT3//949- 1173 1174 1175 1176 Anticorpo bi- G1silentHL específico

[00595] Como um resultado, em múltiplos anticorpos biespecíficos que consistem em uma combinação de um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-PD1, as moléculas modificadas com uma ligação de dis- sulfeto adicional que ligam o Fab-Fab apresentaram uma sinalização mediada por CD3 e/ou PD1 muito variada em comparação com os an- ticorpos biespecíficos sem a ligação de dissulfeto adicional, como mostrado na Fig. 31.

[00596] Este resultado sugere que a introdução de modificações da presente invenção pode aumentar ou diminuir a atividade agonista possuída pelas moléculas de ligação ao antígeno, tais como anticor- pos. Exemplo 22-2

[00597] Os anticorpos foram preparados e suas atividades foram avaliadas de acordo com os Exemplos 2, 3 e 4. Os anticorpos utiliza- dos neste Exemplo são mostrados na Tabela 59.

Tabela 59 Nome do anti- SEQ ID NO (Anti- SEQ ID NO (Anti- Forma mole- corpo corpo 1): corpo 2): cular Cadeia Cadeia Cadeia Cadeia pesada leve pesada leve OKT3//949- 1161 1162 1163 1164 Anticorpo G1silent biespecífico OKT3//949- 1169 1170 1171 1172 Anticorpo G1silentHH biespecífico OKT3//949- 1173 1174 1175 1176 Anticorpo G1silentHL biespecífico OKT3//949- 1165 1166 1167 1168 Anticorpo G1silentLL biespecífico OKT3//949- 1177 1178 1179 1180 Anticorpo G1silentLH biespecífico

[00598] A presença ou ausência de sinalização de agonista PD-1 foi avaliada pela relação do sinal fluorescente de BRET quando PD-1 está na adjacência de SHP2 (618 nm) e na luminescência que se origina de SHP2, que é o doador (460 nm). Um dia antes do ensaio, as células de apresentação de antígeno que expressam PD-L1 (Promega, #J109A) foram semeadas em meio F-12 contendo FBS 10% (Gibco, 11765-054) em uma placa de 96 cavidades (Costar, #3917) em 4,0 x 104 células/100 μl/cavidade, e as células foram cultivadas em uma in- cubadora de CO2 durante 16 a 24 horas a 37 °C. No dia do ensaio, HaloTag nanoBRET 618 Ligand (Promega, #G980A) foi diluído 250 vezes com Opti-MEM (Gibco, #31985-062). O meio para o cultivo de células apresentadoras de antígeno de expressão de PD-L1 foi remo- vido e o HaloTag nanoBRET 618 Ligand diluído foi adicionado a 25 μl/cavidade. A amostra para avaliação diluída com Opti-MEM contendo 10 μg/ml de anticorpos inibidores de PD-L1 (40, 8 e 1,6 μg/ml) foi adi- cionada em 25 μl/cavidade. Células PD-1/SHP2 Jurkat (Promega,

#CS2009A01) foram adicionadas à placa de 96 cavidades acima men- cionada em 5 x 104 células/50 μl/cavidade, cuidadosamente colocadas em suspensão e, em seguida, incubadas em uma incubadora de CO2 durante 2,5 horas a 37 °C. O substrato NanoBRET Nano-Glo (Prome- ga, #N157A) foi diluído 100 vezes com Opti-MEM, e este foi adiciona- do em 25 μl/cavidade na placa de 96 cavidades após a incubação. A placa foi deixada na temperatura ambiente durante 30 minutos, e de- pois o Em460mM e o Em618nm foram medidos utilizando Envision (PerkinElmer, 2104 EnVision). Os valores obtidos foram aplicados à seguinte equação para o cálculo da BRET Ratio (mBU).

mBu médiaexperimental mBu médiasem PD _ controle de bloco L1

[00599] Como um resultado, nos anticorpos biespecíficos que con- sistem em um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-PD1, as molécu- las modificadas com uma ligação de dissulfeto adicional que liga o Fab-Fab mostraram sinalização mediada por CD3 e/ou PD1 muito va- riada em comparação com anticorpos biespecíficos sem a ligação de dissulfeto adicional, como mostrado na Fig. 32. Exemplo 23: Avaliação da atividade agonista de anticorpos biespecífi- cos de fixação CD28/CD3 Exemplo 23-1. Ensaio de inibição do crescimento celular em tempo real (ensaio xCELLigence)

[00600] Os anticorpos foram preparados de acordo com os Exem- plos 17 e 18. Os anticorpos utilizados neste Exemplo são mostrados na Tabela 60.

Tabela 60 Nome do anticorpo SEQ ID NO (Anti- SEQ ID NO (Anti- Forma mole- corpo 1): corpo 2): cular Cadeia Cadeia Cadeia Cadeia pesada leve pesada leve GPC3/attCE115 1181 1182 1183 1184 Anticorpo biespecífico GPC3/attCE115_LL 1185 1186 1187 1188 Anticorpo biespecífico KLH/fixação CD3 1189 1190 1191 1192 Anticorpo biespecífico GPC3/fixação CD3 1193 1194 1195 1196 Anticorpo biespecífico CD28/fixação CD3 1197 1198 1199 1200 Anticorpo biespecífico CD28/fixação 1201 1202 1203 1204 Anticorpo CD3_HH biespecífico

[00601] O efeito inibidor do crescimento de células cancerosas de- pendente de células T dos anticorpos foi avaliado utilizando o instru- mento xCELLigence RTCA MP (ACEA Biosciences). Células da linha- gem celular de câncer de fígado humano SK-Hep-1 forçadas a expres- sar Glypican-3 (GPC3) (SEQ ID NO: 1241) (SK-pca31a), foram utiliza- das como células alvo, e células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC: Cellular Technology Limited (CTL)) foram utilizadas como células efetoras. 1 x 104 células de SK-pca31a foram semeadas na E-Plate 96 (ACEA Biosciences). No dia seguinte foram adicionadas 2 x 105 células de PBMC e anticorpos para preparar uma concentração final de 0,001, 0,01, 0,1, 1 ou 10 μg/ml. O crescimento celular foi moni- torado a cada 15 minutos com xCELLigence, e o cultivo continuou por 72 horas. O efeito inibidor do crescimento celular (CGI: %) foi calcula- do pela seguinte equação. CGI (%) = 100 - (CIAb × 100 / CINoAb)

[00602] Na equação acima, "CIAb" é o índice celular para uma cavi- dade 72 horas após a adição de um anticorpo (índice de crescimento celular medido com xCELLigence). Além disso, "CINoAb" é o índice ce- lular para uma cavidade após 72 horas sem adição de anticorpo. Exemplo 23-2. Ensaio de produção de citocinas

[00603] A produção de citocinas a partir de células T por anticorpos foi avaliada conforme examinado abaixo.

[00604] SK-pca31a foi utilizada como a célula alvo e PBMC (Cellu- lar Technology Limited (CTL)) foi utilizada como a célula efetora. 1 x 104 células de SK-pca31a foram semeadas em uma placa de 96 cavi- dades. No dia seguinte foram adicionados 2 x 105 células de PBMC e anticorpos para preparar uma concentração final de 0,01, 0,1, 1 ou 10 μg/ml. O sobrenadante da cultura foi coletado após 72 horas e a IL-6 humana foi medida utilizando AlphaLISA (PerkinElmer). Resultados

[00605] O uso combinado de anticorpo biespecífico de fixação CD28/CD3 e anticorpo biespecífico de CD3 atenuado por ligação GPC3 não resultou em efeitos inibidores do crescimento celular. No entanto, os efeitos inibitórios sobre o crescimento de células cancero- sas foram observados através da aplicação de modificações para a introdução de uma ligação de dissulfeto adicional entre o Fab-Fab do anticorpo biespecífico de fixação CD28/CD3 (Figs. 33 e 35). Além dis- so, a produção de citocinas foi observada quando um anticorpo bies- pecífico de fixação CD28/CD3 introduzido com a modificação mencio- nada acima e um anticorpo biespecífico CD3 atenuado por ligação GPC3 foram cocultivados com a cepa que expressa GPC3 e PBMC; no entanto, a mera adição de um anticorpo biespecífico de fixação CD28/CD3 introduzido com a modificação observada acima e um anti- corpo biespecífico CD3 atenuado por ligação GPC3 em PBMC não resultou na produção de citocinas (Figs. 34 e 36). Consequentemente,

foi sugerido que o efeito do anticorpo biespecífico de fixação CD28/CD3 introduzido com a modificação observada acima e o anti- corpo biespecífico CD3 atenuado por ligação GPC3 na inibição do crescimento de células cancerosas e indução da produção de citocinas em células T depende da expressão do antígeno de câncer. Exemplo 24: Avaliação da atividade agonista de anticorpos biespecífi- cos CD8/CD28

[00606] Os anticorpos foram preparados de acordo com os Exem- plos 17 e 18. Os anticorpos utilizados neste Exemplo são mostrados na Tabela 61. Tabela 61 Nome do anti- SEQ ID NO (Anti- SEQ ID NO (Anti- Forma mole- corpo corpo 1): corpo 2): cular Cadeia Cadeia Cadeia Cadeia pesada leve pesada leve KLH-P587 1205 1206 - - Anticorpo mo- noespecífico CD8/CD28- 1207 1208 1209 1210 Anticorpo bi- P587 específico CD8/CD28- 1211 1212 1213 1214 Anticorpo bi- P587(HH) específico CD8/CD28- 1219 1220 1221 1222 Anticorpo bi- P587(LL) específico CD8/CD28- 1223 1224 1225 1226 Anticorpo bi- P587(HL) específico CD8/CD28- 1227 1228 1229 1230 Anticorpo bi- P587(LH) específico

[00607] Células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) isoladas de amostras de sangue de voluntários saudáveis foram utilizadas para avaliar a amostra preparada. Heparina (0,5 ml) foi misturada com 50 ml de sangue e foi posteriormente diluída com 50 ml de PBS. PBMCs humanas foram isoladas pelas seguintes duas etapas. Na etapa 1, Leucosep (greiner bio-one) adicionado com Ficoll-

Paque PLUS (GE Healthcare) foi centrifugado em 1000 x g durante 1 minuto sob temperatura ambiente, depois o sangue diluído com PBS foi adicionado e a mistura foi centrifugada em 400 x g durante 30 minu- tos em temperatura ambiente. Na etapa 2, a camada de células bran- cas foi coletada do tubo após centrifugação e depois lavada com 60 ml de PBS (Wako). As PBMCs humanas isoladas foram ajustadas em uma densidade celular de 1 x 107/ml com um meio (soro humano 5% (SIGMA), AIM-V 95% (Thermo Fischer Scientific)). A suspensão de células resultante foi semeada nas cavidades de uma placa de 24 ca- vidades em 1 ml/cavidade e a placa foi incubada em uma incubadora de CO2 5% a 37 °C.

[00608] Dois dias mais tarde, o meio foi removido das células se- meadas e as células foram lavadas com 500 μl de PBS e, em seguida, coletadas com accutase (nacalai tesque). Logo depois, as células fo- ram ajustadas para formar uma densidade celular de 1 x 106/ml com solução ViaFluor 405 (Biotium) diluída com PBS para formar uma con- centração final de 2 μM e, depois, deixada em repouso a 37 °C duran- te 15 minutos. Subsequentemente, as células foram colocadas em suspensão novamente com um meio e então semeadas nas cavidades de uma placa de 96 cavidades em 2 x 105 células por cavidade. Solu- ção de anticorpo foi adicionada para preparar uma concentração final de 0,1, 1 e 10 μg/ml, e as células foram cultivadas em uma incubadora de CO2 5% durante 4 dias a 37 °C.

[00609] Após o término do cultivo, a porcentagem de células culti- vadas foi investigada utilizando um citômetro de fluxo (BD LSRFortes- sa (TM) X-20 (BD Biosciences)) (FCM). A porcentagem de células cul- tivadas foi calculada a partir da porcentagem de intensidade de fluo- rescência ViaFluor 405 reduzida. Anticorpo anti-CD8α marcado com fluorescência, anticorpo anti-CD4, anticorpo anti-Foxp3 e semelhantes foram utilizados para executar uma análise com células T positivas pa-

ra CD8α e células T reguladoras (Treg). Como um resultado, o aumen- to na atividade foi observado em alguns espécimes, como mostrado na Fig. 37. Exemplo 25: Avaliação da formação de ligação de dissulfeto entre as cisteínas introduzidas

[00610] Os anticorpos modificados foram produzidos através da in- trodução de cisteína nas cadeias leve e pesada de um modelo de anti- corpo humanizado, e a formação de ligação de dissulfeto entre as cis- teínas recentemente introduzidas foi avaliada. A avaliação foi realizada através da incubação dos anticorpos da amostra em tampão de fosfato 20 mM (pH 7,0) com quimiotripsina e detecção da massa de peptídeos que se presume serem produzidos a partir da sequência de aminoáci- do de cada anticorpo, utilizando LC/MS. Cada anticorpo foi preparado de acordo com os Exemplos 17 e 18. Os anticorpos utilizados neste Exemplo são mostrados na Tabela 62. Tabela 62 Nome do anti- SEQ ID NO (Anti- SEQ ID NO (Anti- Forma molecu- corpo corpo 1): corpo 2): lar Cadeia Cadeia Cadeia Cadeia pesada leve pesada leve MRA-G1_LL 1231 1232 - - Anticorpo mo- noespecífico MRA-G2_LL 1233 1234 - - Anticorpo mo- noespecífico MRA-G4_LL 1235 1236 - - Anticorpo mo- noespecífico MRA- 1237 1238 - - Anticorpo mo- G1T4.S191C noespecífico MRA- 1239 1240 - - Anticorpo mo- G1T4.A162C noespecífico

[00611] Em primeiro lugar, anticorpos modificados de subclasse di- ferente (IgG1, IgG2 e IgG4) em que a lisina na posição 126 (numera-

ção de Kabat) da cadeia leve foi substituída por cisteína foram anali- sados. Como um resultado, em todos os anticorpos analisados, com- ponentes que correspondem à massa teórica de um peptídeo tendo uma ligação de dissulfeto entre as cisteínas na posição 126 foram de- tectados, como mostrado na Tabela 63. Além disso, este componente desapareceu quando tris(2-carboxietil)fosfina, que possui o efeito redu- tor de ligações de dissulfeto, foi adicionada à amostra de IgG1, suge- rindo que uma ligação de dissulfeto é formada entre as cisteínas na posição 126 neste peptídeo. Ao mesmo tempo, foi sugerido que a dife- rença na subclasse não afeta esta formação de ligação de dissulfeto. Tabela 63 Peptídeo íon Massa Valor meiddo (Da) teórica IgG1 IgG2 IgG4 (Da) não re- reduzido não redu- não redu- duzido zido zido ((IFPPS- [M+4H]4+ 1640,2 1640,2 n.d. 1460,2 1460,2 DEQLC126SGTASVVCL)- [M+5H]5+ 1168,3 1168,4 n.d. 1168,4 1168,3 (ACEVTHQGL))2 [M+6H]6* 973,8 973,8 n.d. 973,8 973,8 n.d.: não detectado

[00612] Depois, a análise foi executada em anticorpos modificados nos quais a alanina na posição 162 (numeração da EU) ou serina na posição 191 (numeração EU) de cadeia pesada de IgG1 foi substituída por cisteína. Como um resultado, os componentes que correspondem à massa teórica de um peptídeo tendo uma ligação de dissulfeto entre as cisteínas introduzidas foram detectados, como mostrado respecti- vamente nas Tabelas 64 e 65. Além disso, este componente desapa- receu quando tris(2-carboxietil)fosfina foi adicionada na amostra de um anticorpo modificado introduzido com cisteína na posição 191 (Tabela 65). Do exposto, foi sugerido que uma ligação de dissulfeto é formada entre cisteínas também introduzidas na cadeia pesada.

Tabela 64 Peptídeo Íon Massa teórica Valor medido (Da) (Da) (NSGC162L)2 [M+H]+ 983,4 983,4 [M+2H]2+ 492,2 492,2 Tabela 65 Peptídeo Íon Massa teó- Valor medido (Da) rica (Da) não reduzido reduzido (SLSSVVTV- [M+2H]2+ 1827,9 1827,9 n.d. PSC191SLGTQTY)2 [M+3H]3+ 1218,9 1218,9 n.d. n.d.: não detectado

[00613] Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de compreensão, as descrições e exemplos não devem ser interpreta- dos como limitativos do escopo da invenção. As divulgações de todas as patentes e literatura científica citadas nesta invenção são expres- samente incorporadas em sua totalidade por referência. [Aplicabilidade Industrial]

[00614] Em uma modalidade não limitativa, a molécula de ligação ao antígeno da presente invenção é útil pelo fato de que pode conter várias moléculas de antígeno em posições espacialmente próximas, regular a interação entre várias moléculas de antígeno e/ou regular a ativação de várias moléculas de antígeno que são ativadas pela asso- ciação entre si. Em outras modalidades, a molécula de ligação ao an- tígeno da presente invenção é útil pelo fato de que possui maior resis- tência à clivagem por protease em comparação com as moléculas de ligação ao antígeno convencionais.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ligação ao antígeno que compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um segundo domínio de li- gação ao antígeno, caracterizada pelo fato de que os dois domínios de ligação ao antígeno estão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações.

2. Molécula de ligação ao antígeno, de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma das liga- ções que ligam os dois domínios de ligação ao antígeno é uma ligação covalente.

3. Molécula de ligação ao antígeno, de acordo com a rei- vindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos primeiro e segundo domínios de ligação ao antígeno compreende um fragmento de anticorpo que se liga a um antígeno particular.

4. Molécula de ligação ao antígeno, de acordo com a rei- vindicação 3, caracterizada pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um Fab, Fab', scFab, Fv, scFv ou anticorpo de domínio único.

5. Molécula de ligação ao antígeno, de acordo com a rei- vindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos resíduos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domí- nios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região constante.

6. Molécula de ligação ao antígeno, de acordo com a rei- vindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma região variável.

7. Molécula de ligação ao antígeno, de acordo com qual- quer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de liga-

ção ao antígeno estão ligados entre si por meio de duas ou mais liga- ções.

8. Molécula de ligação ao antígeno, de acordo com a rei- vindicação 7, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos resí- duos de aminoácido a partir dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro de uma regi- ão de dobradiça.

9. Molécula de ligação ao antígeno, de acordo com a rei- vindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos resíduos de aminoácido dos quais as ligações entre os domínios de ligação ao antígeno se originam está presente dentro do fragmento de anticorpo, e pelo menos um dos referidos resíduos de aminoácido está presente dentro de uma região de dobradiça.

10. Molécula de ligação ao antígeno, de acordo com qual- quer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende uma região Fc.

11. Molécula de ligação ao antígeno, de acordo com qual- quer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizada pelo fato de que possui atividade de regulação da interação entre duas moléculas de antígeno.

12. Molécula de ligação ao antígeno, de acordo com qual- quer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizada pelo fato de que possui resistência à clivagem por protease.

13. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ligação ao antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, e um veículo farmaceutica- mente aceitável.

14. Método para regular a interação entre duas moléculas de antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma molécula de ligação ao antígeno compre-

endendo dois domínios de ligação ao antígeno, (b) adicionar à molécula de ligação ao antígeno pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno entre si, e (c) colocar em contato a molécula de ligação ao antígeno produzida em (b) com as duas moléculas de antígeno.

15. Método para produzir uma molécula de ligação ao antí- geno que possui atividade de regulação da interação entre duas molé- culas de antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo um se- gundo domínio de ligação ao antígeno, (b) introduzir uma mutação nos ácidos nucleicos que codifi- cam os dois domínios de ligação ao antígeno de tal modo que pelo menos uma ligação que liga os dois domínios de ligação ao antígeno seja adicionada, (c) introduzir os ácidos nucleicos produzidos em (b) em uma célula hospedeira, (d) cultivar a célula hospedeira de tal modo que os dois po- lipeptídeos sejam expressos, e (e) obter uma molécula de ligação ao antígeno que é um polipeptídeo compreendendo o primeiro e o segundo domínios de liga- ção ao antígeno, em que os dois domínios de ligação ao antígeno es- tão ligados entre si por meio de uma ou mais ligações.