BR112021000202B1 - Métodos para síntese enzimática de nucleosídeo 4'-etinila 2-desóxi e compostos - Google Patents

Métodos para síntese enzimática de nucleosídeo 4'-etinila 2-desóxi e compostos Download PDF

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Abstract

SÍNTESE ENZIMÁTICA DE ANÁLOGOS DE NUCLEOSÍDEO 4'-ETINILA. A presente invenção se refere a uma síntese enzimática de nucleosídeos de 4'-etinil-2'-desóxi e análogos dos mesmos, por exemplo EFdA, que elimina o uso de grupos de proteção nos intermediários, aprimora a estereosseletividade de glicosilação e reduz o número de etapas de processo necessárias para fazer os referidos compostos. Também se refere aos novos intermediários empregados no processo.

Description

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SUBMETIDA ELETRONICAMENTE
[001] A listagem de sequência do presente pedido é submetida eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequência formatada em ASCII com um nome de arquivo "24608WOPCT-SEQLIST-02JUl2019.txt", tendo uma data de criação em 2 de julho de 2019 e um tamanho de 80,5 kb. Esta listagem de sequência submetida via EFS-Web faz parte do relatório descritivo e é incorporada na presente invenção por referência na sua totalidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Os análogos de nucleosídeo 4'-etinil-2'-desóxi são conhecidos por sua atividade contra HIV, AIDS e doenças relacionadas.
Figure img0001
[003] Um exemplo de um análogo de nucleosídeo 4'-etinila é 4'-etinil-2- fluoro-2'-desoxiadenosina (EFdA, também conhecido como MK-8591), que é um inibidor de translocação de transcriptase reversa de nucleosídeo que bloqueia a replicação viral de HIV-1 e SIV in vitro (Kawamoto, A., Kodama, E., Sarafianos S. F. et al., Int. J. Biochem. Cell Biol.; 40(11):2410-20 [2008]; Ohrui, H., Kohgo, S., Hayakawa, H. et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 26, 1543-1546 [2007]) e in vivo (Hattori, S., Ide, K., Nakata, H. et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53, 3887-3893 [2009]). EFdA é reivindicado na Patente US No. 7,339,053 (referido na patente '053 como 2'-desóxi-4'-C-etinil-2- fluoroadenosina). EFdA tem a seguinte estrutura química:
Figure img0002
[004] EFdA é metabolizado nas células para seu anabólito trifosfato ativo que inibe a transcriptase reversa de HIV. Em contraste com inibidores de transcriptase reversa de nucleosídeos (NsRTIs) e inibidores de transcriptase reversa de nucleotídeos (NtRTIs) atualmente disponíveis para o tratamento de infecção por HIV que não têm um grupo 3'-OH para bloquear a incorporação do nucleotídeo de entrada, EFdA retém um grupo 3'OH e atua como um terminador de cadeia, impedindo a translocação do iniciador:modelo no sítio da transcriptase reversa (RT) e impedindo a ligação de trifosfatos de desoxirribonucleotídeos (dNTPs) de entrada. Além disso, acredita-se que o enrugamento do anel de ribose modificado de EFdA contribui para a inibição de transcriptase reversa, colocando o 3'-OH em um vetor no qual a fosfotransferência do nucleotídeo de entrada é ineficiente. (Michailidis E, et al., Mechanism of inhibition of HIV-1 reverse transcriptase by 4’-ethynyl-2-fluoro-2’- deoxyadenosine triphosphate, J Biol Chem 284:35681-35691 [2009]; Michailidis E, et al., 4’-Ethynyl-2-fluoro-2’-deoxyadenosine (EFdA) inhibits HIV-1 reverse transcriptase with multiple mechanisms, J Biol Chem 289:24533-24548 [2014]).
[005] Em ensaios de replicação de HIV in vitro, EFdA é um antirretroviral potente e exibe atividade antiviral comparável contra isolados clínicos em todos os subtipos que foram avaliados. É rapidamente anabolizado em ambas as linhagens de células derivadas de linfoides e em células mononucleares do sangue periférico para o trifosfato ativo in vitro, e a meia-vida intracelular do EFdA trifosfato (EFdA-TP) excede 72 horas. (Stoddart, CA, Galkina, et al., Oral Administration of the Nucleoside EFdA (4'-Ethynyl-2-Fluoro-2'-Deoxyadenosine) Provides Rapid Suppression of HIV Viremia in Humanized Mice and Favorable Pharmacokinetic Properties in Mice and the Rhesus Macaque, Antimicrob Agents Chemother, julho de 2015; 59 (7): 4190 4198, Publicado on-line em 4 de maio de 2015).
[006] EFdA demonstrou ter eficácia em modelos animais de infecção por HIV, incluindo modelos de camundongos humanizados e um modelo de macaco rhesus infectado com SIV. Estudos farmacocinéticos de EFdA administrado por via oral em camundongos e macacos rhesus demonstraram rápida absorção e altas concentrações plasmáticas. Uma longa meia-vida intracelular foi demonstrada pelo fato de que as células mononucleares do sangue periférico isoladas a partir do macaco rhesus foram refratárias à infecção por SIV 24 hr após a administração do fármaco. (Ibid.)
[007] Sínteses anteriores de análogos de nucleosídeo 4’-etinila incluindo EFdA sofrem de estereosseletividade modesta na formação da ligação C-N entre o açúcar etinil-desoxirribose e a nucleobase 2-fluoroadenina (também referida como 2-fluoro-9H-purin-6-amina). As sínteses anteriores também requerem grupos de proteção para realizar a reação de glicosilação que reduz a eficiência das sínteses.
[008] A síntese descrita em Kei Fukuyama, et al., Synthesis of EFdA via a Diastereoselective Aldol Reaction of a Protected 3-Keto Furanose, Organic Letters 2015, 17 (4), p. 828-831; DOI: 10,1021/ol5036535) é uma síntese de 14 etapas a partir de diacetonida de D-glicose que usa reações diastereosseletivas para configurar os três estereocentros. A estereoquímica do centro anomérico é controlada tendo-se um grupo direcionador 2‘ acetóxi que é subsequentemente removido por hidrólise e desoxigenação. Esta via requer 4 purificações cromatográficas e o uso estequiométrico de um reagente organoestânico tóxico para a desoxigenação de estágio final.
[009] Em outra via (ver Mark McLaughlin, et al., Enantioselective Synthesis of 4'-Ethynyl-2'-fluoro-deoxyadenosine (EFdA) via Enzymatic Desymmetrization, Organic Letters 2017, 19(4), p. 926-929), o 4'-carbinol totalmente substituído é gerado estereosseletivamente com uma desimetrização enzimática. O estereocentro 3‘ é configurado com uma hidrogenação de transferência assimétrica catalítica, e a ligação 1’ anomérica é estabelecida em estereosseletividade modesta usando controle de substrato, com uma atualização na pureza estereoquímica alcançada pela cristalização de um intermediário. Este processo requer 15 etapas, requer o uso de vários grupos de proteção e gera a ligação glicosila entre a nucleobase e os fragmentos de açúcar em baixa estereosseletividade (1,8:1).
[010] Uma síntese de 12 etapas para a elaboração de EFdA a partir de R- gliceraldeído acetonido é descrita em Kageyama, M., et al., Concise Synthesis of the Anti-HIV Nucleoside EFdA, Biosci. Biochem, 2012, 76, p. 1219-1225; e Enantiosselective Total Synthesis of the Potent Anti-HIV Nucleoside EFdA, Masayuki Kageyama, et al., Organic Letters 2011 13 (19), p. 5264-5266 [DOI: 10.1021/ol202116k]. As sínteses usam o material de partida quiral para configurar o estereocentro 3‘ com diastereosseletividade moderada. Após a separação cromatográfica dos estereoisômeros, o novo estereocentro é usado para guiar uma adição diastereosseletiva de alquino para configurar o estereocentro 4’ totalmente substituído. A posição 1’ anomérica é estabelecida com pouco estereocontrole e requer cromatografia para separar os anômeros. Esta via requer separação cromatográfica de diastereoisômeros em dois estágios diferentes e começa a partir de um material de partida quiral dispendioso.
[011] Kohgo, S., et al., Design, Efficient Synthesis, and Anti-HIV Activity of 4'-C-Cyano- and 4'-C-Ethynyl-2'-deoxy Purine Nucleosides, Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2004, 23, p. 671-690 [DOI: 10.1081/NCN- 120037508] descreve uma via sintética que começa a partir de um nucleosídeo existente e modifica ambas as porções de açúcar e de nucleobase. É uma síntese de 18 etapas começando a partir de 2-amino-2‘-desoxiadenosina com um baixo rendimento global de 2,5%.
[012] É conhecido que enzimas tais como a purina nucleosídeo fosforilase (PNP, EC 2.4.2.1) podem formar a ligação glicosila em nucleosídeos e análogos de nucleosídeos em alta estereosseletividade e sem o uso de grupos de proteção. Veja por exemplo a crítica: New Trends in Nucleoside Biotechnology, Mikhailopulo, I.A., Miroshnikov, A.I., Acta Naturae 2010; 2, p. 36-58. No entanto, o escopo atual dos fragmentos de açúcar capazes de ser submetido a reação catalisada por PNP foi limitado aos α-1-fosfatos de ribose natural e desoxirribose juntamente com um pequeno número de análogos com pequenos substituintes H, NH2 ou F nas posições C2’ e C3' e substituições do grupo C5’ OH. Não houve relatos de glicosilação catalisada por PNP com sucesso usando açúcares com substituintes de carbono no anel ou qualquer substituição na posição C4'.
[013] O acesso aos substratos de ribose e desoxirribose α-1-fosfato para a glicosilação catalisada por PNP foi demonstrado por translocação do grupo fosfato a partir da posição hidroxila 5’ para hidroxila 1' com a enzima fosfopentomutase (PPM, EC 5.4.2.7) (ver Mikhailopulo, I.A., et al. supra). No entanto, o escopo dos açúcares para os quais o PPM é capaz de catalisar esta reação foi limitado a ribose, arabinose, 2-desoxirribose e 2,3-didesoxirribose. Não foram relatados exemplos de reação bem-sucedida com fosfatos de açúcar contendo quaisquer substituintes adicionais.
[014] As enzimas desoxirribose fosfato aldolase (DERA, EC 4.1.2.4) são conhecidas por catalisar a adição de aldol de acetaldeído a outros aldeídos de cadeia curta (ver crítica: Stephen M. Dean, et al., Recent Advances in Aldolase- Catalyzed Asymmetric Synthesis, Adv. Synth. Catal. 2007, 349, p. 1308-1320; DOI: 10.1002/adsc.200700115). No entanto, nenhum exemplo foi relatado com aldeídos carregando um carbono α totalmente substituído para o aldeído.
[015] A Patente US 7,229,797 descreve a formação de desoxirribonucleosídeos a partir do desoxirribose 1-fosfato natural não substituído por uso de purina nucleosídeo fosforilase (PNP) e, adicionalmente, utilizando enzimas tais como a sacarose fosforilase para remover o subproduto de fosfato inorgânico e conduzir o equilíbrio. Não revela a engenharia enzimática para a criação de enzimas PNP que podem gerar nucleosídeos a partir do 4-etinil- D-2-desoxirribose 1-fosfato não natural, nem que através da engenharia de enzimas PPM e DERA para atuar em substratos não naturais, 4-etinil-D-2- desoxirribose 1-fosfato pode ser gerado.
[016] Em vista das opções sintéticas difíceis e demoradas desenvolvidas até agora para a produção de análogos de nucleosídeo 4'-etinila, seria desejável desenvolver uma síntese enzimática aprimorada para análogos de nucleosídeo 4'-etinila, tais como EFdA que reduz o número de etapas do processo, minimiza o uso de grupos de proteção, aprimora a estereosseletividade da glicosilação e evita o uso de materiais tóxicos.
[017] Surpreendentemente, verificou-se que as enzimas PPM também têm alguma atividade com o substituinte etinila de 3 átomos na posição 4 na ribose e que a atividade da enzima PPM poderia ser aprimorada pela introdução de mutações nas enzimas para desenvolver com sucesso uma reação para isomerização de 4-etinil-D-2-desoxirribose 5-fosfato (6) para 4-etinil-D-2- desoxirribose 1-fosfato (6.5) catalisado por PPM para permitir um método mais eficiente para a produção de nucleosídeos de 4'-etinil-2'-desóxi.
[018] Adicionalmente, verificou-se que as enzimas PNP também têm alguma atividade com o substituinte etinila de 3 átomos na posição 4 na desoxirribose e que a atividade da enzima PNP pode ser aprimorada pela introdução de mutações nas enzimas para desenvolver com sucesso uma reação de glicosilação catalisada por PNP para permitir um método mais eficiente para a produção de nucleosídeos de 4'-etinil-2'-desóxi.
[019] Um aprimoramento ainda maior no método sintético global veio da descoberta de que as enzimas DERA, particularmente o DERA de Shewanella halifaxensis, têm atividade para a reação aldólica com 2-etinil-gliceraldeído 3- fosfato que tem um carbono α totalmente substituído. Esta invenção permitiu a síntese eficiente de 4-etinil-D-2-desoxirribose 5-fosfato, um precursor de análogos de nucleosídeo 4'-etinil-2'-desóxi, por exemplo, incluindo EFdA.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[020] A presente invenção envolve o uso de enzimas manipuladas em uma nova síntese enzimática de análogos de nucleosídeo 4'-etinil-2'-desóxi, incluindo EFdA, que elimina o uso de grupos de proteção nos intermediários, aprimora a estereosseletividade de glicosilação e reduz notavelmente o número de etapas de processo necessárias para elaborar os referidos compostos comparados a métodos anteriores, dentre outros aprimoramentos de processo. Refere-se ainda a novos intermediários que são parte integrante do processo enzimático.
[021] O processo geral é resumido nos Esquema 1 e Esquema 2 a seguir; o último esquema fornece um método alternativo para fazer o composto 5:
Figure img0003
[022] A forma ácida ou sais de intermediários de fosfato podem ser empregados no processo descrito na presente invenção e não estão limitados a formas específicas de ácido ou sal fornecidas em exemplificações das etapas do processo na presente invenção. Para todos os intermediários de fosfato descritos na presente invenção, 2X+ representa qualquer combinação de dois prótons, um próton com outro cátion monovalente, dois cátions monovalentes (iguais ou diferentes) ou um cátion divalente. Os intermediários de fosfato esboçados na presente invenção com -HO3PO- da mesma forma podem ter qualquer combinação de dois prótons, um próton com um outro cátion monovalente, dois cátions monovalentes (iguais ou diferentes) ou um cátion divalente, associado ao grupo fosfato. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, sais de cálcio, magnésio ou zinco; sais mono ou di-sódio, sais mono ou di-potássio, sais mono ou di-lítio; sais mono ou di-amônio; ou sais mono- ou di-valentes com aminas primárias, secundárias ou terciárias.
[023] Como é bem entendido na técnica, os compostos intermediários mostrados ou nomeados na presente invenção como aldeído ou hidrato nas etapas sintéticas na presente invenção podem existir em qualquer forma ou uma mistura de tais formas nas reações descritas na presente invenção. Por exemplo, os compostos (4) e (5) são retratados no Esquema 1 como um hidrato e um aldeído, respectivamente, mas cada um pode existir em forma de hidrato ou aldeído ou uma mistura dos mesmos nas etapas de reação em que cada um está presente. Cada uma dessas formas é abrangida por referência aos números dos compostos (4) ou (5) dentro das etapas do processo da presente invenção:
Figure img0004
[024] O composto (3) é aquiral e pode ser mostrado na presente invenção como um dos seguintes:
Figure img0005
[025] O composto (6) pode existir em sua forma de anel ou como um aldeído ou hidrato de cadeia aberta, cada um como um ácido ou um sal do mesmo, nas etapas de reação em que está presente:
Figure img0006
aldeído ou hidrato de cadeia aberta
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[026] Nucleosídeos de 4'-etinil-2'-desóxi e análogos dos mesmo
Figure img0007
tendo uma ligação C-N anomérica foram explorados para atividade contra HIV, AIDS e doenças relacionadas. Nucleosídeos de 4'-Etinil-2'-desóxi e análogos dos mesmos compreendem uma 4'-etinil-2'-desoxirribose anexada através de uma ligação C-N anomérica a uma purina ou pirimidina nucleobase (adenina, guanina, citosina, timina ou uracila) ou uma purina ou pirimidina nucleobase modificada.
[027] Verificou-se que análogos de nucleosídeo 4'-etinil-2'-desóxi, tal como EFdA, podem ser sintetizados empregando um processo one-pot de etapa final, combinando 4-etinil-D-2-desoxirribose 5-fosfato (6) com duas enzimas , fosfopentomutase (PPM) [por exemplo, mas não limitado a SEQ ID NO: 8] e purina nucleosídeo fosforilase (PNP) [por exemplo, mas não limitado a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15], conforme mostrado no Esquema 2.
Figure img0008
[028] Conforme mostrado no Esquema 2, a etapa final da síntese emprega uma reação de 2 enzimas com uma 3^ enzima opcional para conduzir o equilíbrio da reação em direção ao produto final desejado. A etapa final começa com o composto (6) ou um sal do mesmo, em que (6) é 4-etinil-2-desoxirribose 5- fosfato em forma de anel conforme mostrado acima ou a forma de aldeído ou hidrato de cadeia aberta do mesmo.
[029] O composto (6) é combinado com fosfopentomutase (PPM), purina nucleosídeo fosforilase (PNP), sacarose fosforilase, sacarose e uma nucleobase, por exemplo, adenina não substituída ou substituída, em uma solução tamponada contendo um sal de manganês (II) e ajustada conforme necessário para um pH em uma faixa de cerca de 6,5 a 8,0, ou mais particularmente de cerca de 7,0 a 7,5. Uma razão molar de sacarose:composto (6) pode ser, mas não está limitada a, de cerca de 1:1 a 4:1. Os componentes dessa reação one-pot podem ser combinados em qualquer ordem.
[030] A reação é agitada dentro de uma faixa de temperatura que não desnatura as enzimas, por exemplo, de cerca de 30 a 45 °C e mais particularmente de cerca de 35 a 45 °C. Até um certo ponto, temperaturas mais frias podem funcionar, mas diminuirão a taxa de reação.
[031] Qualquer tampão com um pH adequado e contendo um sal de manganês (II) pode ser usado na reação. Exemplos de tais tampões incluem, mas não estão limitados a: trietanolamina; PIPES, por exemplo piperazina-N,N'- bis(ácido 2-etanossulfônico); MOPS, por exemplo, ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico ou ácido 3-morfolinopropano-1-sulfônico; HEPES, por exemplo, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico ou ácido 2-[4- (2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico; TRIS, por exemplo, tris(hidroximetil)aminometano ou 2-Amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol; e BIS-TRIS metano, por exemplo, 2-[Bis(2-hidroxietil)amino]-2- (hidroximetil)propano-1,3-diol. Mais particularmente, o tampão é trietanolamina. O sal de manganês (II) no tampão pode ser, por exemplo, cloreto de manganês, hidrato de cloreto de manganês, brometo de manganês, iodeto de manganês, nitrato de manganês e/ou sulfato de manganês. A concentração de manganês no tampão pode variar de cerca de 0,05 mM a cerca de 10 mM e, particularmente, é cerca de 5 mM.
[032] A reação de equilíbrio pode ser conduzida para a alta conversão do produto final pelo consumo do subproduto de sal de fosfato inorgânico por fosforólise de sacarose para D-frutose e α-D-glicose-1-fosfato, catalisada por sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7) adicionada à mistura de reação. No entanto, quaisquer outras opções para remover fosfato durante a reação podem ser empregadas, por exemplo, adicionar cálcio, magnésio ou manganês à reação para precipitar um sal de fosfato em vez de usar sacarose fosforilase e sacarose. Este processo altamente eficiente e ecologicamente correto tem a vantagem de formar a ligação anomérica entre o açúcar e a nucleobase com estereosseletividade muito alta sem o uso de grupos de proteção ou solventes orgânicos e pode ser realizado como uma reação one-pot.
[033] Uma vez que a reação está completa, o produto final pode ser isolado usando procedimentos padrão conhecidos por técnicos no assunto, tais como, mas não se limitando a, isolamento por cristalização do produto final e coleta por filtração ou extração em um solvente apropriado seguido por cristalização.
[034] Conforme mostrado no Esquema 2A, a etapa final da síntese pode, alternativamente, empregar uma reação de 3 enzimas com uma 4- enzima opcional para conduzir o equilíbrio da reação em direção ao produto final desejado. A etapa final começa com o composto (5) ou um sal do mesmo, em que (5) é (R)-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato ou uma forma de hidrato do mesmo.
[035] O composto (5) é combinado com desoxirribose-fosfato aldolase (DERA), acetaldeído, fosfopentomutase (PPM), purina nucleosídeo fosforilase (PNP), sacarose fosforilase, sacarose e uma nucleobase ou um análogo dos mesmos, por exemplo, uma adenina não substituída ou substituída, em uma solução tamponada contendo um sal de manganês (II) e ajustada conforme necessário para um pH em uma faixa de cerca de 4 a 10, ou particularmente de cerca de 6,5 a 8,0, ou mais particularmente de cerca de 7,0 a 7,5. Uma razão molar de sacarose:composto (5) pode ser, mas não está limitada a, de cerca de 1:1 a 4:1. Os componentes dessa reação one-pot podem ser combinados em qualquer ordem.
[036] A reação é realizada dentro de uma faixa de temperatura que não desnatura as enzimas, por exemplo, de cerca de 30 a 45 °C, ou particularmente de cerca de 35 a 45 °C. Até um certo ponto, temperaturas mais frias podem funcionar, mas diminuirão a taxa de reação.
[037] O acetaldeído é adicionado como uma solução e, mais particularmente, como uma solução de 40% em peso em álcool isopropílico. Qualquer solução adequada de acetaldeído ou acetaldeído puro pode ser usada na reação. Exemplos de tais soluções incluem, mas não estão limitados a: solução de acetaldeído em isopropanol, solução de acetaldeído em etanol, solução de acetaldeído em água, solução de acetaldeído em THF. Uma razão molar de aldeído:composto (5) pode ser, mas não está limitada a, de cerca de 0,5:1 a 4:1 e, mais particularmente, 1,5:1.
[038] Qualquer tampão com um pH adequado e contendo um sal de manganês (II) pode ser usado na reação. Exemplos de tais tampões incluem, mas não estão limitados a: trietanolamina; PIPES, por exemplo piperazina-N,N'- bis(ácido 2-etanossulfônico); MOPS, por exemplo, ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico ou ácido 3-morfolinopropano-1-sulfônico; HEPES, por exemplo, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico ou ácido 2-[4- (2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico; TRIS, por exemplo, tris(hidroximetil)aminometano ou 2-Amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol; e BIS-TRIS metano, por exemplo, 2-[Bis(2-hidroxietil)amino]-2- (hidroximetil)propano-1,3-diol. Mais particularmente, o tampão é trietanolamina. O sal de manganês (II) no tampão pode ser, por exemplo, cloreto de manganês, hidrato de cloreto de manganês, brometo de manganês, iodeto de manganês, nitrato de manganês e/ou sulfato de manganês. A concentração de manganês no tampão pode variar de cerca de 0,05 mM a cerca de 10 mM e, particularmente, é cerca de 5 mM.
[039] A reação de equilíbrio pode ser conduzida para a alta conversão do produto final pelo consumo do subproduto de sal de fosfato inorgânico por fosforólise de sacarose para D-frutose e α-D-glicose-1-fosfato, catalisada por sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7) adicionada à mistura de reação. No entanto, quaisquer outras opções para remover fosfato durante a reação podem ser empregadas, por exemplo, adicionar cálcio, magnésio ou manganês à reação para precipitar um sal de fosfato em vez de usar sacarose fosforilase e sacarose. Este processo altamente eficiente e ecologicamente correto tem a vantagem de formar a ligação anomérica entre o açúcar e a nucleobase com estereosseletividade muito alta sem o uso de grupos de proteção ou solventes orgânicos e pode ser realizado como uma reação one pot.
[040] Uma vez que a reação está completa, o produto final pode ser isolado usando procedimentos padrão conhecidos por técnicos no assunto, tais como, mas não se limitando a, isolamento por cristalização do produto final e coleta por filtração ou extração em um solvente apropriado seguido por cristalização.
[041] Vários intermediários a montante usados no presente processo para a síntese do produto final de nucleosídeos de 4'-etinil-2'-desóxi e análogos dos mesmos também são feitos usando métodos de reação enzimática conforme mostrado no Esquema 3; Esquema 3A e Esquema 3B.
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Composto 4: Reação de Oxidase
[042] Conforme mostrado no Esquema 3, (R)-2-etinil-gliceraldeído (4) é preparado pela reação de galactose oxidase com 2-etinil-propano-1,2,3-triol (3) em uma solução tamponada ajustada conforme necessário a um pH em uma faixa de cerca de 3 a 10, ou mais particularmente de cerca de 6 a 8. Qualquer tampão tendo uma faixa de pH adequada pode ser usado, por exemplo, mas não limitado a, fosfato de sódio; acetato de sódio; PIPES, por exemplo, piperazina- N,N'-bis(ácido 2-etanossulfônico); MOPS, por exemplo, ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico ou ácido 3-morfolinopropano-1-sulfônico; HEPES, por exemplo, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico ou ácido 2-[4- (2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico; TRIS, por exemplo, tris(hidroximetil)aminometano ou 2-Amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol; e BIS-TRIS metano, por exemplo, 2-[Bis(2-hidroxietil)amino]-2- (hidroximetil)propano-1,3-diol; borato; CAPS, por exemplo, ácido N-ciclohexil-3- aminopropanossulfônico; MES, por exemplo, ácido 2-(N- morfolino)etanossulfônico; CHES, por exemplo, ácido N-Ciclohexil-2- aminoetanossulfônico; Glicina; ou Bicina (N,N-Bis(2-hidroxietil)glicina); com fosfato de sódio sendo preferido.
[043] Cobre e uma peroxidase são ambos usados na reação para ativar a galactose oxidase (GOase). O cobre pode ser suprida à mistura de reação pela adição de CuSO4, Cu(OAc)2, CuCl2 ou outros sais de Cu(II) ou Cu(I). A peroxidase pode ser uma peroxidase de rábano, ou uma peroxidase derivada de outros organismos, ou pode ser substituída por um oxidante, tal como ferricianeto, iridato, sais de manganês (III), sais de persulfato e outros oxidantes de um elétron ou dois elétrons, ou oxidantes inorgânicos ou orgânicos. Preferencialmente, a peroxidase é uma peroxidase de rábano. Uma catalase também é adicionada para ajudar a impedir a desativação de GOase. A catalase pode ser de uma fonte de mamífero (bovino) ou de uma fonte de bactérias ou fungos, tais como Corynebacterium, Aspergillus ou outros organismos conhecidos na técnica para esta finalidade.
[044] A reação prossegue na presença de oxigênio. Um método conveniente é aspersão da reação com ar. Alternativamente, outros sistemas para gerar oxigênio podem ser empregados, tais como peróxido de hidrogênio/catalase, superóxido ou uso de outros métodos conhecidos na técnica para esta finalidade.
[045] A reação pode ser realizada com uma concentração de substrato de cerca de 10 a 180 g/L e particularmente 20 a 50 g/L. A reação pode ser executada a uma temperatura de cerca de 0 a 40 °C, e particularmente de cerca de 10 a 30 °C.
Composto 8: Formação aminal
[046] Conforme exemplificado no Esquema 3A, (R)-2-etinil-gliceraldeído (4) pode ser isolado em sua forma aminal (por exemplo, composto 8) ao reagir com qualquer amina, diamina ou aminoálcool que forme um N, N-acetal ou N,O- acetal, por exemplo, mas não limitado a, N,N'-dibenziletano-1,2-diamina, N,N’- dimetiletano-1,2-diamina, N,N'-difeniletano-1,2-diamina, e N- benziletanolamina; com N,N’-dibenziletano-1,2-diamina sendo preferido. A reação é realizada em um solvente orgânico a uma temperatura igual ou abaixo de cerca de 50 °C, preferencialmente de 20 a 30 °C, para evitar a decomposição do aminal. Qualquer solvente que seja não miscível com água pode ser usado, por exemplo, mas não limitado a, MTBE, 2-MeTHF, CPME, éter dietílico, éter diisopropílico, acetato de etila, acetato de isopropila, tolueno, DCM ou uma mistura dos mesmos, com MTBE sendo preferido. A reação pode ser realizada com uma concentração de substrato de cerca de 10 a 100 g/L e particularmente 20 a 50 g/L.
[047] Opcionalmente, o aminal pode ser adicionalmente purificado por cristalização a partir de um solvente orgânico, por exemplo, mas não limitado a, MTBE, 2-MeTHF, CPME, éter dietílico, éter diisopropílico, acetato de etila, acetato de isopropila, tolueno, DCM ou uma mistura dos mesmos, com MTBE sendo preferido. A cristalização é realizada a uma temperatura a ou abaixo de 50 °C, por exemplo, cerca de 40 °C, para evitar a decomposição do aminal.
[048] A reação prossegue na ausência de oxigênio. Um método conveniente é aspersão da reação com N2. Alternativamente, outros sistemas para excluir oxigênio podem ser empregados, tais como argônio, hélio, ou o uso de outros métodos conhecidos na técnica para esta finalidade. Composto 4: Regeneração de aldeído 4 a partir do aminal 8
[049] (R)-2-etinil-gliceraldeído (4) pode ser regenerado a partir de seu respectivo aminal, reagindo-o com um ácido orgânico ou inorgânico na presença de solvente orgânico que não é miscível com água, a uma temperatura igual ou abaixo de 50 °C, por exemplo, de cerca de 0 a 15 °C, para evitar a decomposição do aminal. Qualquer ácido orgânico ou inorgânico pode ser usado, por exemplo, mas não limitado a, ácido p-toluenossulfônico, ácido metanossulfônico, ácido canforossulfônico, ácido acético, ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico. Ácido p-toluenossulfônico é preferido na reação com aminal 8 devido à baixa solubilidade do sal de N,N'-dibenziletano-1,2-diamina bis p-toluenossulfonato em água. Qualquer solvente que seja não miscível com água pode ser usado, por exemplo, mas não limitado a, MTBE, 2-MeTHF, CPME, éter dietílico, éter diisopropílico, acetato de etila, acetato de isopropila, tolueno, DCM ou uma mistura dos mesmos; com MTBE e 2-MeTHF sendo preferidos. A reação pode ser realizada com uma concentração de substrato de cerca de 5 a 100 g/L e particularmente 20 a 50 g/L.
[050] Opcionalmente, a solução de aldeído 4 pode ser tratada adicionalmente com uma resina para remover o excesso do ácido orgânico ou inorgânico. O tratamento de resina pode ser realizado com resinas básicas, tais como resina DOWEX™ MARATHON™ A (forma de hidróxido) e resina AMBERLYST® 15 (forma de hidrogênio), ou a mistura das mesmas, preferencialmente uma mistura de resina DOWEX™ MARATHON™ A (forma de hidróxido) e resina AMBERLYST® 15.
[051] Opcionalmente, a solução de aldeído 4 pode ser adicionalmente evaporada sob vácuo ou varrida com um gás para remover o excesso de solvente orgânico. Composto 5: Reação Quinase
Figure img0010
[052] Conforme mostrado no Esquema 3 e Esquema 3A, hidrato de (R)-2- etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5) é preparado ao reagir pantotenato quinase (PanK) de tipo selvagem a partir de E. coli ou uma variante da mesma, com o composto (4) em uma solução tamponada ajustada conforme necessário a um pH em uma faixa de cerca de 4 a 10, ou particularmente cerca de 6,5 a 8,5 ou mais particularmente 5,5 a 8,5. Qualquer tampão com uma faixa de pH adequada pode ser usado, por exemplo, mas não limitado a, fosfato de sódio, PIPES, por exemplo, piperazina-N, N'-bis (ácido 2-etanossulfônico); BIS-TRIS metano, por exemplo, 2-[Bis(2-hidroxietil)amino]-2-(hidroximetil)propano-1,3- diol; borato; HEPES, por exemplo, ácido 4-(2-hidroxietil)-1- piperazinetanossulfônico ou ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il] etanossulfônico; trietanolamina e TRIS, por exemplo, TRIS, por exemplo, tris(hidroximetil)aminometano ou 2-Amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol; com fosfato de sódio sendo preferido. A reação pode ser realizada na presença de qualquer sal de metal bivalente adequado, por exemplo, mas não limitado a um sal de magnésio, por exemplo cloreto de magnésio e sais de cobalto, manganês, zinco ou cálcio.
[053] Essa reação utiliza adenosina 5'-difosfato (ADP) como a fonte de fosfato que requer regeneração para 5'-trifosfato (ATP). O ATP pode ser gerado in situ e subsequentemente regenerado por qualquer método conhecido na técnica a partir de ADP, adenosina 5'-monofosfato (AMP) ou adenosina. Por exemplo, uma combinação de acetil fosfato juntamente com acetato quinase pode ser usada para regenerar ADP em ATP. Por exemplo, na presença de piruvato, fosfato e oxigênio, uma combinação de piruvato oxidase e catalase gera acetil fosfato e, portanto, na presença de acetato quinase, pode ser usada para regenerar ADP em ATP.
[054] A reação pode ser realizada com uma concentração de substrato de cerca de 10 a 100 g/L e particularmente cerca de 20 a 40 g/L. A reação pode ser executada a uma temperatura de cerca de 0 a 40 °C, e particularmente a cerca de 10 a 25 °C.
[055] A reação também pode ser realizada com pantotenato quinase (PanK) imobilizado em uma resina, ou com ambos PanK e acetato quinase imobilizados na resina. Qualquer método de imobilização de enzima adequado conhecido na técnica pode ser usado, por exemplo, mas não se limitando a, resina de Cromatografia de Afinidade de Íon de Metal Imobilizado (IMAC), ou uma imobilização de resina de afinidade usando outros marcadores biológicos, imobilização covalente, imobilização em resinas iônicas, imobilização por adsorção, encapsulação e/ou enzimas reticuladas. Por exemplo, a Resina de Cromatografia de Afinidade de Íon de Metal (IMAC) pode ser usada, ou qualquer combinação adequada de resina IMAC e cátion bivalente pode ser usada, em que o cátion pode ser, por exemplo, mas não limitado a, níquel, cobalto, cobre, zinco, ferro e/ou alumínio. Particularmente, a resina IMAC carregada com níquel pode ser usada. Preferencialmente, tanto acetato quinase como pantotenato quinase (PanK) são imobilizados na resina. Composto 9: Reação Quinase
Figure img0011
[056] Conforme mostrado no Esquema 3B, (S)-2-etinil-propano-1,2,3-triol 1-fosfato (9) é preparado ao reagir pantotenato quinase (PanK) de tipo selvagem de E. coli ou uma variante da mesma, com o composto (3) em uma solução tamponada ajustada conforme necessário a um pH em uma faixa de cerca de 4 a 10, ou particularmente cerca de 6,5 a 8,5 ou mais particularmente 5,5 a 8,5. Qualquer tampão tendo uma faixa de pH adequada pode ser usado, por exemplo, mas não limitado a, fosfato de sódio, PIPES, por exemplo, piperazina- N, N'-bis (ácido 2-etanossulfônico); BIS-TRIS metano, por exemplo, 2-[Bis(2- hidroxietil)amino]-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol; borato; HEPES, por exemplo, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico ou ácido 2-[4-(2- hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico; trietanolamina e TRIS, por exemplo, tris(hidroximetil)aminometano ou 2-Amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol; com fosfato de sódio sendo preferido. A reação pode ser realizada na presença de qualquer sal de metal bivalente adequado, por exemplo, mas não limitado a um sal de magnésio, por exemplo, cloreto de magnésio e sais de cobalto, manganês, zinco ou cálcio.
[057] Essa reação utiliza adenosina 5'-difosfato (ADP) como a fonte de fosfato que requer regeneração para 5'-trifosfato (ATP). O ATP pode ser gerado in situ e subsequentemente regenerado por qualquer método conhecido na técnica a partir de ADP, adenosina 5'-monofosfato (AMP) ou adenosina. Por exemplo, uma combinação de acetil fosfato juntamente com acetato quinase pode ser usada para regenerar ADP em ATP. Alternativamente, (a) uma combinação de piruvato oxidase, catalase e acetato quinase na presença de piruvato, fosfato e oxigênio pode ser usada para regenerar ADP em ATP, ou (b) uma combinação de piruvato oxidase, catalase e acetato quinase na presença de piruvato, fosfato e oxigênio em combinação com acetil fosfato e acetato quinase podem ser usados para a regeneração de ATP a partir de ADP.
[058] A reação pode ser realizada com uma concentração de substrato de cerca de 10 a 100 g/L e particularmente cerca de 20 a 40 g/L. A reação pode ser executada a uma temperatura de cerca de 0 a 40 °C, e particularmente a cerca de 10 a 25 °C.
[059] A reação também pode ser realizada com pantotenato quinase (PanK) imobilizado em uma resina, ou com PanK e acetato quinase imobilizados na resina. Qualquer método de imobilização de enzima adequado conhecido na técnica pode ser usado, por exemplo, mas não se limitando a, resina de Cromatografia de Afinidade de Íon de Metal Imobilizado (IMAC), ou uma imobilização de resina de afinidade usando outros marcadores biológicos, imobilização co-valente, imobilização em resinas iônicas, imobilização por adsorção, encapsulação e/ou enzimas reticuladas. Por exemplo, a Resina de Cromatografia de Afinidade de Íon de Metal (IMAC) pode ser usada, ou qualquer combinação adequada de resina IMAC e cátion bivalente pode ser usada, em que o cátion pode ser, por exemplo, mas não limitado a, níquel, cobalto, cobre, zinco, ferro e/ou alumínio. Particularmente, a resina IMAC carregada com níquel pode ser usada. Preferencialmente, ambos acetato quinase e pantotenato quinase (PanK) são imobilizados na resina. Composto 5: Reação de Oxidase
Figure img0012
[060] Conforme mostrado no Esquema 3B, hidrato de (R)-2-etinil- gliceraldeído 3-fosfato (5) é preparado ao reagir galactose oxidase com (S)-2- etinil-propano-1,2,3-triol 1-fosfato (9) em uma solução tamponada ajustada conforme necessário a um pH em uma faixa de cerca de 3 a 10, ou mais particularmente de cerca de 6 a 8. Qualquer tampão tendo uma faixa de pH adequada pode ser usado, por exemplo, mas não limitado a, fosfato de sódio; acetato de sódio; PIPES, por exemplo piperazina-N,N'-bis(ácido 2- etanossulfônico); MOPS, por exemplo, ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico ou ácido 3-morfolinopropano-1-sulfônico; HEPES, por exemplo, ácido 4-(2- hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico ou ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1- il]etanossulfônico; TRIS, por exemplo, tris(hidroximetil)aminometano ou 2- Amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol; e BIS-TRIS metano, por exemplo, 2- [Bis(2-hidroxietil)amino]-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol; borato; CAPS, por exemplo, ácido N-ciclohexil-3-aminopropanossulfônico; MES, por exemplo, ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico; CHES, por exemplo, ácido N-Ciclohexil-2- aminoetanossulfônico; Glicina; ou Bicina (N,N-Bis(2-hidroxietil)glicina); com fosfato de sódio sendo preferido.
[061] Cobre e uma peroxidase são ambos usados na reação para ativar a galactose oxidase (GOase). O cobre pode ser fornecido à mistura de reação pela adição de CuSO4, Cu(OAc)2, CuCl2 ou outros sais de Cu(II) ou Cu(I). A peroxidase pode ser uma peroxidase de rábano, ou uma peroxidase derivada de outros organismos, ou pode ser substituída por um oxidante, tal como ferricianeto, iridato, sais de manganês (III), sais de persulfato e outros oxidantes de um elétron ou dois elétrons, ou oxidantes inorgânicos ou orgânicos. Preferencialmente, a peroxidase é uma peroxidase de rábano. Uma catalase também é adicionada para ajudar a impedir a desativação de GOase. A catalase pode ser de uma fonte de mamífero (bovino) ou de uma fonte de bactérias ou fungos, tais como Corynebacterium, Aspergillus ou outros organismos conhecidos na técnica para esta finalidade.
[062] A reação prossegue na presença de oxigênio. Um método conveniente é aspersão da reação com ar. Alternativamente, outros sistemas para gerar oxigênio podem ser empregados, tais como peróxido de hidrogênio/catalase, superóxido ou uso de outros métodos conhecidos na técnica para esta finalidade.
[063] A reação pode ser realizada com uma concentração de substrato de cerca de 10 a 180 g/L e particularmente 20 a 50 g/L. A reação pode ser executada a uma temperatura de cerca de 0 a 40 °C, e particularmente de cerca de 10 a 30 °C. Composto 6: Reação de desoxirribose-fosfato aldolase (DERA)
[064] Uma vantagem importante desta nova via para produção de composto (6) sobre processos conhecidos anteriores é que ela cria a estrutura de açúcar no estado de oxidação correto, sem o uso de grupos de proteção.
[065] 4-etinil-D-2-desoxirribose 5-fosfato (6) é preparado pela reação de desoxirribose-fosfato aldolase (DERA) com (R)-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5) como um ácido ou sal do mesmo, e acetaldeído em uma solução aquosa ajustada conforme necessário a um pH em uma faixa de cerca de 5 a 9, ou mais particularmente cerca de 6 a 8. Exemplos de sais de (5) incluem, mas não estão limitados a, sais de cálcio, magnésio, zinco, sais mono ou di-Na, sais mono ou di- K, ou sais mono ou di-Li; sais mono ou di-amônio; ou sais mono- ou di-valentes com aminas primárias, secundárias ou terciárias. A reação pode ser realizada em um recipiente aberto ou é preferencialmente realizada em um recipiente selado para impedir a evaporação de acetaldeído.
[066] A reação pode ser realizada com uma concentração de substrato de cerca de 10 a 100 g/L, particularmente cerca de 30 a 60 g/L. Ela pode ser executada a uma temperatura de cerca de 0 a 40 °C, e particularmente de cerca de 25 a 35 °C.
[067] A reação pode ser executada sem quaisquer tampões. Alternativamente, os tampões podem ser usados, por exemplo, mas não se limitando a, trietanolamina; fosfato; MOPS, por exemplo, ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico ou ácido 3-morfolinopropano-1-sulfônico; HEPES, por exemplo, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico ou ácido 2-[4- (2-hidroxietil)piperazin-1-il] etanossulfônico; BIS-TRIS metano, por exemplo, 2- [Bis(2-hidroxietil)amino]-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol; borato; PIPES, por exemplo, piperazina-N,N’-bis(ácido 2-etanossulfônico); MES, por exemplo, ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico; e borato; ou outros tampões tendo uma faixa de pH adequada que não tenham quaisquer grupos amina primária.
[068] Cada etapa e método dos processos descritos na presente invenção que compreendem o uso de uma ou mais enzimas são realizados a uma temperatura que não desnatura a referida uma ou mais enzimas. Cada etapa e método dos processos descritos na presente invenção que compreendem o uso de uma ou mais enzimas podem ser realizados a um pH em uma faixa de cerca de 3 a 10 ou de cerca de 4 a 10.
[069] Uma "nucleobase" (ou "base nitrogenada" ou "base") é um heterociclo de purina ou pirimidina de ácidos nucleicos, tais como DNA e RNA. Conforme usado na presente invenção, a nucleobase inclui adenina, guanina, citosina, timina ou uracila, bem como nucleobases com modificações não naturais, por exemplo, em que a base tem um ou mais substituintes não naturais, ou uma modificação que afeta heteroátomo(s) em uma base excluindo qualquer alteração na ligação C-N anomérica.
[070] Um nucleosídeo 4'-etinil-2'-desóxi contém uma nucleobase. Conforme usado na presente invenção, um análogo de um nucleosídeo 4'-etinil- 2'-desóxi significa uma modificação não natural da base do nucleosídeo, por exemplo, em que a base tem um ou mais substituintes não naturais, ou uma modificação que afeta o(s) heteroátomo(s) na base, excluindo qualquer alteração na ligação C-N anomérica.
[071] Conforme usado na presente invenção, as enzimas "fosfopentomutase" ("PPM") (por exemplo, EC 5.4.2.7) são enzimas que catalisam a isomerização reversível de ribose 1-fosfato em ribose 5-fosfato e compostos relacionados, tais como fosfato de desoxirribose e análogos de ribose fosfato e fosfato de desoxirribose.
[072] Conforme usado na presente invenção, as enzimas "purina nucleosídeo fosforilase" ("PNP") (EC 2.4.2.2) são enzimas que catalisam a fosforólise reversível de ribonucleosídeos de purina e compostos relacionados (por exemplo, desoxirribonucleosídeos e análogos de ribonucleosídeos e desoxirribonucleosídeos) para a base de purina livre e ribose-1-fosfato (e análogos do mesmo).
[073] Conforme usado na presente invenção, as enzimas "sacarose fosforilase" ("SP") (EC 2.4.1.7) são enzimas que catalisam a fosforólise reversível da sacarose em base de D-frutose e glicose-1-fosfato (e análogos do mesmo). A sacarose fosforilase (SP) em combinação com a sacarose é empregada em combinação com a purina nucleosídeo fosforilase (PNP) e a fosfomutase (PPM) para remover íons fosfato livres da reação, onde a combinação das enzimas catalisa a formação de nucleosídeo MK-8591 (EFdA), enquanto em algumas modalidades ele poderia ser substituído por outros métodos conhecidos na técnica.
[074] Conforme usado na presente invenção, "desoxirribose-fosfato aldolase" ("DERA") (por exemplo, EC 4.1.2.4) refere-se a uma enzima em uma família de liases que clivam reversivelmente ou criam ligações carbono-carbono. As desoxirribose-fosfato aldolases, conforme usadas na presente invenção, incluem desoxirribose-fosfato aldolase de ocorrência natural (tipo selvagem), bem como polipeptídeos manipulados de ocorrência não natural gerados por manipulação humana. A desoxirribose-fosfato aldolase de tipo selvagem catalisa a reação reversível de 2-desóxi-D-ribose 5-fosfato em D-gliceraldeído 3-fosfato e acetaldeído.
[075] Conforme usado na presente invenção, "pantotenato quinase" ("PanK") refere-se a enzimas (EC 2.7.1.33) que na natureza fosforilam o pantotenato para formar 4'-fosfopantotenato. Enzimas variantes derivadas de tais enzimas PanK podem exibir atividade e estereosseletividade aprimoradas em relação ao grupo 3'OH de D-etinilgliceraldeído, independentemente de tais variantes reterem sua função natural em relação ao pantotenato.
[076] Conforme usado na presente invenção, as enzimas "galactose oxidase" ("GOase"; EC 1.1.3.9) são enzimas dependentes de cobre que, na presença de oxigênio bimolecular, catalisam a oxidação de álcoois primários aos aldeídos correspondentes. Elas atuam de maneiras regio e enantioespecíficas, permitindo abordagens sintéticas que requerem pouca ou nenhuma proteção do grupo funcional e rendem o estereoisômero desejado. A maneira de oxidação é suave e controlada, de tal modo que a atividade não leve à oxidação excessiva do álcool em seu ácido carboxílico correspondente.
[077] Conforme usado na presente invenção, a enzima "peroxidase de rábano" (HRP, EC 1.11.1.7) é uma enzima dependente de ferro que ativa e mantém a atividade catalítica GOase por oxidação de um estado redox inativo do sítio ativo que ocorre durante a ciclagem catalítica GOase normal. HRP tipo I é empregado de maneira catalítica nos exemplos incluídos na presente invenção, no entanto, não se destina a ser exclusivo neste papel, uma vez que há outras enzimas de transferência de elétrons que pertencem a esta e a outras classes de enzimas, bem como reagentes químicos que podem cumprir este papel.
[078] Conforme usado na presente invenção, "catalase" refere-se a uma enzima dependente de heme (EC 1.11.1.6) que atua no peróxido de hidrogênio, um subproduto de reações de galactose oxidase ou piruvato oxidase, que pode tornar as enzimas inativas acima de certos níveis de peróxido de hidrogênio. A catalase é empregada como uma enzima de manutenção catalítica nos exemplos na presente invenção para converter peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, enquanto em algumas modalidades ela poderia ser substituída por outros métodos, tais como decomposição eletroquímica de peróxido de hidrogênio. Uma catalase dependente de heme é empregada de maneira catalítica nos exemplos incluídos na presente invenção, no entanto, não se destina a ser exclusiva neste papel, uma vez que há outras enzimas que pertencem a esta classe que podem cumprir este papel.
[079] Conforme usado na presente invenção, "acetato quinase" ("AcK") refere-se a uma enzima (EC 2.7.2.1), que catalisa a formação de acetil fosfato a partir de acetato e adenosina trifosfato (ATP). Também pode catalisar a reação reversa, onde fosforila a adenosina 5'-difosfato (ADP) em adenosina 5'-trifosfato (ATP) na presença de acetil fosfato. Acetato quinase é empregada para reciclar ATP necessário para pantotenato quinase (PanK) nos exemplos na presente invenção, enquanto em algumas modalidades a combinação de reciclagem de acetil fosfato-acetato quinase poderia ser substituída por outros métodos conhecidos na técnica.
[080] Conforme usado na presente invenção, "piruvato oxidase" ("PO") refere-se a uma enzima (EC 1.2.3.3) dependente do dinucleotídeo de flavina e adenina (FAD) e Difosfato de tiamina. A piruvato oxidase é uma enzima pertencente à família de oxidorredutases, especificamente aquelas que atuam no grupo aldeído ou oxo de um doador com oxigênio como aceitador e ela catalisa a reação química entre piruvato, íon fosfato e oxigênio bimolecular para formar acetil fosfato, dióxido de carbono e peróxido de hidrogênio. A piruvato oxidase (PO) é empregada em combinação com acetato quinase (AcK) e catalase como uma combinação regeneradora de ATP catalítica nos exemplos na presente invenção, onde a combinação das enzimas catalisa a formação de ATP a partir de ADP na presença de oxigênio, piruvato e íons fosfato, enquanto em algumas modalidades ele poderia ser substituído por outros métodos conhecidos na técnica.
[081] Conforme usado na presente invenção, a enzima "de tipo selvagem" e "de ocorrência natural" se refere à forma encontrada na natureza. Por exemplo, uma sequência polipeptídica de tipo selvagem é uma sequência presente em um organismo que pode ser isolada de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada por manipulação humana.
[082] Conforme usado na presente invenção, "manipulado", "variante", "mutante" e "de ocorrência não natural" quando usado com referência a uma enzima incluindo um polipeptídeo, refere-se a um material ou um material correspondente à forma natural ou nativa do material, que foi modificado de uma maneira que não existiria na natureza. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é idêntico a um polipeptídeo de ocorrência natural, mas é produzido ou derivado de materiais sintéticos e/ou por manipulação usando técnicas recombinantes.
[083] "Porcentagem de identidade de sequência", "identidade percentual" e "percentual idêntico" em relação às enzimas são usadas na presente invenção para se referir a comparações entre sequências polinucleotídicas ou sequências polipeptídicas e são determinadas pela comparação de duas sequências alinhadas de forma otimizada em uma janela de comparação, em que a porção da sequência polinucleotídica ou polipeptídica na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação com a sequência de referência para alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências ou uma base de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido está alinhado com uma lacuna para render o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para render a porcentagem de identidade de sequência. A determinação de identidade de sequência percentual e alinhamento ideal é realizada usando os algoritmos BLAST e BLAST 2.0 (ver, por exemplo, Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403410 e Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402). O software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do website do National Center for Biotechnology Information.
[084] Resumidamente, as análises BLAST envolvem primeiro a identificação de pares de sequência de alta pontuação (HSPs), identificando palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação de limiar de valor positivo T quando alinhada com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é referido como o limiar de pontuação de palavra de vizinhança (Altschul et al., supra). Essas ocorrências de palavras de vizinhança iniciais atuam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos que os contenham. As ocorrências de palavras são então estendidas em ambas as direções ao longo de cada sequência, na medida em que a pontuação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada. Pontuações cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre>0) e N (pontuação de penalidade para resíduos incompatíveis; sempre <0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão das ocorrências da palavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa cai pela quantidade X de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou o final de qualquer sequência é atingido. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa € de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa €(E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sci EUA 89:10915).
[085] Vários outros algoritmos estão disponíveis que funcionam de forma semelhante ao BLAST ao fornecer identidade percentual para duas sequências. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido , por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, pelo método de busca de similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2444, por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software GCG Wisconsin) ou por inspeção visual (ver geralmente, Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., eds., Current Protocols, uma joint venture entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento de 1995) (Ausubel)). Adicionalmente, a determinação de alinhamento de sequência e identidade de sequência percentual pode empregar os programas BESTFIT ou GAP no pacote de software GCG Wisconsin (Accelerys, Madison WI), usando parâmetros padrão fornecidos.
[086] "Identidade substancial" refere-se a uma sequência polinucleotídica ou polipeptídica que tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência, em comparação com uma sequência de referência ao longo de uma janela de comparação de pelo menos 20 posições de resíduo, frequentemente ao longo de uma janela de pelo menos 30-50 resíduos, em que a porcentagem de identidade de sequência é calculada comparando-se a sequência de referência com uma sequência que inclui deleções ou adições que totalizam 20 por cento ou menos da sequência de referência ao longo da janela de comparação. Em modalidades específicas aplicadas a polipeptídeos, o termo "identidade substancial" significa que duas sequências polipeptídicas, quando idealmente alinhadas, tais como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilham pelo menos 80 por cento de identidade de sequência, preferencialmente pelo menos 89 por cento da identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 95 por cento de identidade de sequência ou mais (por exemplo, 99 por cento de identidade de sequência). Preferencialmente, posições de resíduos que não são idênticas diferem em substituições de aminoácidos conservativas.
[087] "Estereosseletividade" refere-se à formação preferencial em uma reação química ou enzimática de um estereoisômero sobre outro. A estereosseletividade pode ser parcial, onde a formação de um estereoisômero é favorecida em relação ao outro, ou pode ser completa quando apenas um estereoisômero é formado. Quando os estereoisômeros são enantiômeros, a estereosseletividade é referida como enantiosseletividade, a fração (tipicamente reportada como uma porcentagem) de um enantiômero na soma de ambos. Alternativamente, é comumente reportado na técnica (tipicamente como uma porcentagem) como o excesso enantiomérico (e.e.) calculado a partir do mesmo de acordo com a fórmula [enantiômero maior - enantiômero menor]/[enantiômero maior + enantiômero menor]. Quando os estereoisômeros são diastereoisômeros, a estereosseletividade é referida como diastereosseletividade, a fração (tipicamente reportada como uma porcentagem) de um diastereoisômero em uma mistura de dois diastereoisômeros, alternativamente reportada comumente como o excesso diastereomérico (d.e.). O excesso enantiomérico e o excesso diastereomérico são tipos de excesso estereomérico.
[088] A frase "condições de reação adequadas" refere-se àquelas condições na solução de reação de conversão enzimática (por exemplo, faixas de carga de enzima, carga de substrato, temperatura, pH, tampões, cossolventes, etc.) sob as quais cada polipeptídeo usado na presente invenção é capaz de converter um substrato no composto de produto desejado. Algumas condições de reação adequadas exemplares são fornecidas na presente invenção.
[089] Conforme usado na presente invenção, "substrato" no contexto de um processo de reação de conversão enzimática refere-se ao composto ou molécula em que atuam as enzimas manipuladas usadas na presente invenção.
[090] Conforme usado na presente invenção, "produto" no contexto de um processo de conversão enzimática refere-se ao composto ou molécula resultante da ação de um polipeptídeo enzimático em um substrato.
[091] Conforme usado na presente invenção, "aumentar" o rendimento de um produto (por exemplo, um análogo de fosfato de 4'-etinil-2'-desoxirribose ou análogo de nucleosídeo 4'-etinil-2'-desóxi) a partir de uma reação ocorre quando um componente particular presente durante a reação (por exemplo, uma enzima) faz com que mais produto seja produzido, em comparação com uma reação conduzida nas mesmas condições com o mesmo substrato, mas na ausência do componente de interesse.
[092] Conforme usado na presente invenção, "equilibrar" ou "equilíbrio", conforme usado na presente invenção, refere-se ao processo que resulta em uma concentração de estado regular de espécies químicas em uma reação química ou enzimática (por exemplo, interconversão de duas espécies A e B), incluindo a interconversão de estereoisômeros, conforme determinado pela constante de velocidade direta e a constante de velocidade reversa da reação química ou enzimática.
[093] “Excesso enantiomérico” (ee) é uma medida de pureza usada para substâncias quirais. Ela reflete o grau em que uma amostra contém um enantiômero em maiores quantidades do que os outros. Por exemplo, uma mistura racêmica tem um e.e. de 0%, enquanto um único enantiômero completamente puro tem um e.e. de 100%; e uma amostra com 70% de um enantiômero e 30% do outro tem um e.e. de 40% (70% - 30%). O excesso de diastereoisômero (de) é calculado da mesma maneira que o e.e. quando apenas dois diastereoisômeros estão presentes na mistura.
[094] "Proteína", "enzima", "polipeptídeo" e "peptídeo" são usados de maneira intercambiável na presente invenção para denotar um polímero de pelo menos dois aminoácidos ligados covalentemente por uma ligação amida, independentemente do comprimento ou modificação pós-translacional (por exemplo, glicosilação, fosforilação, lipidação, miristilação, ubiquitinação etc.). Incluídos nesta definição estão os aminoácidos D e L e misturas de aminoácidos D e L.
[095] Conforme usado na presente invenção, o termo "cerca de" significa um erro aceitável para um valor particular. Em alguns casos, "cerca de" significa dentro de 0,05%, 0,5%, 1,0% ou 2,0% na extremidade inferior e na extremidade superior da faixa de valor dada. Com relação ao pH, "cerca de" significa mais ou menos 0,5.
[096] Conforme usado na presente invenção, polipeptídeo "substancialmente puro" ou proteína "purificada" refere-se a uma composição na qual a espécie de polipeptídeo é a espécie predominante presente (ou seja, em uma base molar ou de peso é mais abundante do que qualquer outra espécie macromolecular individual na composição ), e é geralmente uma composição substancialmente purificada quando a espécie objeto compreende pelo menos cerca de 50 porcento das espécies macromoleculares presentes por mol ou % em peso. No entanto, em algumas modalidades, a composição compreendendo o polipeptídeo compreende polipeptídeo que é menos do que 50% puro (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40% ou cerca de 50%). Geralmente, uma composição polipeptídica substancialmente pura compreende cerca de 60% ou mais, cerca de 70% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais, cerca de 95% ou mais, e cerca de 98% ou mais de todas as espécies macromoleculares por mol ou % em peso presente na composição. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é purificado até a homogeneidade essencial (ou seja, as espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais), em que a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular. Espécies de solvente, moléculas pequenas (<500 Daltons), e espécies de íons elementares não são consideradas espécies macromoleculares. Em algumas modalidades, os polipeptídeos isolados são composições polipeptídicas substancialmente puras.
[097] Conforme usado na presente invenção, "propriedade aprimorada" de uma enzima se refere a pelo menos uma propriedade aprimorada de uma enzima. Em algumas modalidades, a presente invenção emprega polipeptídeos PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP e/ou GOase manipulados que exibem um aprimoramento em qualquer propriedade da enzima em comparação com um PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP ou polipeptídeo Goase de referência, respectivamente, e/ou um polipeptídeo PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP ou GOase de tipo selvagem, respectivamente, e/ou outro polipeptídeo PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP ou GOase manipulado, respectivamente. Assim, o nível de "aprimoramento" pode ser determinado e comparado entre os vários polipeptídeos, incluindo o tipo selvagem, bem como polipeptídeos manipulados. As propriedades aprimoradas incluem, mas não estão limitadas a tais propriedades como expressão de proteína aumentada, produção do produto pretendido aumentada, especificidade ou afinidade do substrato aumentada (ou seja, atividade no substrato aumentada), termoatividade aumentada, termoestabilidade aumentada, atividade do pH aumentada, estabilidade aumentada, atividade enzimática aumentada, atividade específica aumentada, resistência ao substrato ou inibição do produto final aumentada, estabilidade química aumentada, quimiosseletividade aprimorada, estabilidade do solvente aprimorada, tolerância ao pH ácido aumentada, tolerância à atividade proteolítica (ou seja, redução da sensibilidade à proteólise) aumentada, agregação reduzida, solubilidade aumentada e perfil de temperatura alterado. Em modalidades adicionais, o termo é usado em referência a pelo menos uma propriedade aprimorada das enzimas PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP e/ou GOase. Em algumas modalidades, a presente invenção emprega polipeptídeos PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP e/ou GOase manipulados que exibem um aprimoramento em qualquer propriedade da enzima em comparação com um polipeptídeo PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP e/ou Goase de referência, respectivamente; e/ou um polipeptídeo de tipo selvagem, e/ou outro polipeptídeo PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP e/ou GOase manipulado, respectivamente. Assim, o nível de "aprimoramento" pode ser determinado e comparado entre os vários polipeptídeos, incluindo o tipo selvagem, bem como polipeptídeos manipulados.
[098] Conforme usado na presente invenção, "conversão" ("conv" ou "conv.") refere-se à conversão enzimática (ou biotransformação) de um(uns) substrato(s) para o(s) produto(s) correspondente(s). Conversão “percentual” refere-se ao percentual do substrato que é convertido no produto dentro de um período de tempo em condições especificadas. Assim, a "atividade enzimática" ou "atividade" de um polipeptídeo pode ser expressa como a conversão percentual do substrato no produto em um período específico.
[099] Conforme usado na presente invenção, "estereosseletividade" refere-se à formação preferencial em uma reação química ou enzimática de um estereoisômero sobre outro. A estereosseletividade pode ser parcial, onde a formação de um estereoisômero é favorecida em relação ao outro, ou pode ser completa quando apenas um estereoisômero é formado. Quando os estereoisômeros são enantiômeros, a estereosseletividade é referida como enantiosseletividade, a fração (tipicamente reportada como uma porcentagem) de um enantiômero na soma de ambos. Alternativamente, é comumente reportado na técnica (tipicamente como uma porcentagem) como o excesso enantiomérico (“e.e.”) calculado a partir do mesmo de acordo com a fórmula [enantiômero maior - enantiômero menor]/[enantiômero maior + enantiômero menor]. Quando os estereoisômeros são diastereoisômeros, a estereosseletividade é referida como diastereosseletividade, a fração (tipicamente reportada como uma porcentagem) de um diastereoisômero em uma mistura de dois diastereoisômeros, alternativamente reportada comumente como o excesso diastereomérico (“d.e.”). O excesso enantiomérico e o excesso diastereomérico são tipos de excesso estereomérico.
[100] A presente invenção de processo abrange o uso de polipeptídeos PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP e GOase manipulados, particularmente aqueles tendo SEQ ID NO.s 1 a 21, e as referidas sequências que compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas que podem ser referidas como variantes modificadas conservativamente de cada uma das SEQ ID NO.s 1 a 21.
[101] Conforme usado na presente invenção, substituição de aminoácidos “conservativa” e refere-se a substituições de aminoácidos em uma proteína por outros aminoácidos tendo características semelhantes (por exemplo, ácido, base, carregado positiva ou negativamente, polar ou não polares, tamanho de cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, conformação e rigidez da cadeia principal etc.), de modo que as alterações possam ser feitas frequentemente sem alterar a atividade biológica da proteína. Isto inclui uma ou mais substituições de um aminoácido no polipeptídeo por um aminoácido diferente dentro da classe de aminoácidos definida igual ou semelhante. Os técnicos no assunto reconhecem que, em geral, as substituições únicas de aminoácidos em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4^ Ed.)). Adicionalmente, é menos provável que substituições de aminoácidos estrutural ou funcionalmente semelhantes perturbem a atividade biológica. A título de exemplo e não como limitação, em algumas modalidades, um aminoácido com uma cadeia lateral alifática é substituído por outro aminoácido alifático (por exemplo, alanina, valina, leucina e isoleucina); um aminoácido com uma cadeia lateral de hidroxila é substituído por outro aminoácido com uma cadeia lateral de hidroxila (por exemplo, serina e treonina); um aminoácido tendo cadeias laterais aromáticas é substituído por outro aminoácido tendo uma cadeia lateral aromática (por exemplo, fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina); um aminoácido com uma cadeia lateral básica é substituído por outro aminoácido com uma cadeia lateral básica (por exemplo, lisina e arginina); um aminoácido com uma cadeia lateral ácida é substituído por outro aminoácido com uma cadeia lateral ácida (por exemplo, ácido aspártico ou ácido glutâmico); e/ou um aminoácido hidrofóbico ou hidrofílico é substituído por outro aminoácido hidrofóbico ou hidrofílico, respectivamente. Substituições de aminoácidos conservativas exemplares adicionais são apresentadas na Tabela 1. TABELA 1. Substituições de Aminoácidos Conservativas Exemplares
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[102] O termo "conjunto de substituição de aminoácidos" ou "conjunto de substituição" refere-se a um grupo de substituições de aminoácidos em uma sequência polipeptídica, em comparação com uma sequência de referência. Um conjunto de substituição pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições de aminoácidos.
[103] Um "fragmento funcional" refere-se a um polipeptídeo que tem uma(s) deleção(ões) amino-terminal(is) e/ou e/ou carboxiterminal(is) e/ou deleções internas, mas onde a sequência de aminoácidos restante é idêntica às posições correspondentes na sequência a qual está sendo comparada (por exemplo, uma enzima PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP ou GOase manipulada de comprimento total usada na presente invenção) e que retém substancialmente toda a atividade do polipeptídeo de comprimento total.
[104] Conforme usado na presente invenção, "deleção" refere-se à modificação ao polipeptídeo pela remoção de um ou mais aminoácidos a partir do polipeptídeo de referência. As deleções podem compreender a remoção de 1 ou mais aminoácidos, 2 ou mais aminoácidos, 5 ou mais aminoácidos, 10 ou mais aminoácidos, 15 ou mais aminoácidos, ou 20 ou mais aminoácidos, até 10% do número total de aminoácidos, ou até 20% do número total de aminoácidos que constituem a enzima de referência, enquanto retêm a atividade enzimática e/ou retêm as propriedades aprimoradas de uma enzima PPM, PNP, DERA, PanK, AcK, SP ou GOase manipulada. As deleções podem ser direcionadas às porções internas e/ou às porções terminais do polipeptídeo. Em várias modalidades, a deleção pode compreender um segmento contínuo ou pode ser descontínua. As deleções são normalmente indicadas por “-“ nas sequências de aminoácidos.
[105] Conforme usado na presente invenção, "inserção" refere-se à modificação ao polipeptídeo pela adição de um ou mais aminoácidos a partir do polipeptídeo de referência. As inserções podem ser nas porções internas do polipeptídeo ou no terminal carbóxi ou amino. As inserções, conforme usadas na presente invenção, incluem proteínas de fusão, como é conhecido na técnica. A inserção pode ser um segmento contíguo de aminoácidos ou separada por um ou mais dos aminoácidos no polipeptídeo de ocorrência natural.
[106] Acrônimos e abreviações adicionais usados na presente invenção são os seguintes:
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Preparação de diacetato de 2-etinil-2-hidroxipropano-1,3-diila (2) Método A:
Figure img0017
[107] A uma solução de diacetoxiacetona (1) a -35 °C (159 g, 914,0 mmol) em THF (1000 mL) foram adicionados 1600 mL de uma solução a 0,5 M de cloreto de etinilmagnésio em THF mantendo a temperatura abaixo de -20 °C. Após a reação ter atingido a conclusão, ácido acético (78 mL) em 400 mL de éter metil terc-butílico (MTBE) foi adicionado gota a gota mantendo a temperatura abaixo de -20 °C. MTBE (800 mL) foi então adicionado e a mistura foi aquecida até temperatura ambiente. NaCl saturado em água (1000 mL) foi adicionado seguido por solução saturada de NH4Cl em água (1050 mL). A camada orgânica foi separada, seca sobre Na2SO4 e evaporada para dar o composto (2) como um óleo (160 g, 88%). 1H NMR (CDCl3, 500MHz,) δ 4,26 (dd, 4 H), 2,55 (s, 1H), 2,14 (s, 6H). Preparação de 2-etinil-propano-1,2,3-triol (3) Método B:
Figure img0018
[108] A uma solução de diacetato de 2-etinil-2-hidroxipropano-1,3-diila (2) (70 g, 350 mmol) em etanol foi adicionada uma solução a 0,5 M de metoxilato de sódio em metanol (69,9 mL, 35,0 mmol) à temperatura ambiente (rt). A reação foi agitada a rt por 2 horas (h) para atingir a conclusão. Os solventes foram evaporados e o resíduo foi redissolvido em 100 mL de água e extraído com 3 x 50 mL de MTBE. A camada aquosa foi aspergida com nitrogênio para remover solventes residuais para dar uma solução de 40,9% de 2-etinilpropano-1,2,3-triol (3) (108 g, rendimento de 100%) conforme determinado por ressonância magnética nuclear (NMR) (ácido maleico como padrão interno). 1H NMR (D2O, 500MHz) δ 3,60 (dd, 4 H), 2,85 (s, 1H). Preparações Alternativas de (R)-2-etinil-gliceraldeído (4) Método C1:
Figure img0019
[109] Em um reator agitado, 2-etinilpropano-1,2,3-triol (3) (1,1 g, 9,47 mmol) em tampão de fosfato de sódio (30 mL, 100 mM, pH 7,0) contendo antiespumante 204 (Sigma A6426, 1 gota ~ 20 μL) foi aquecido a 30 °C com aspersão de ar a 12,5 sccm. Galactose oxidase (GOase, SEQ ID NO.: 1) (250 mg), Peroxidase de rábano* (Tipo I, 5 mg) e catalase bovina** (5 mg) dissolvida em tampão de fosfato de sódio (5 mL 100 mM, pH 7,0) foram adicionados ao reator, seguido pela adição de solução aq. de CuSO4 (100 mM, 150 μL). A mistura de reação foi agitada a 600 rpm com aspersão de ar por 47h para dar (R)-2-etinil- gliceraldeído (4) em 47% de conversão (por NMR) e 72% e.e. . (O produto não foi isolado). 1H NMR (D2O, 500 MHz): δ 4,29 (s, 1H), 3,65 (dd, 2H), 2,83 (s, 1H). 1 Peroxidase de rábano: peroxidase de tipo selvagem a partir de rábano Tipo I, comercialmente disponível pela SIGMA (P8125), isolada a partir de raízes de rábano (Amoracia rusticana). 2 * Catalase bovina: catalase dependente de heme de origem bovina, disponível comercialmente pela Sigma (C1345). Método C2:
Figure img0020
[110] Em um reator revestido de 100 L agitado carregado com água deionizada (56,2 kg), foi adicionado di-hidrogenofosfato de sódio (1,212 kg, 10 mols). O pH foi ajustado para 7,02 usando solução de hidróxido de sódio a 10 N (852,6 g) a 25 °C. O reator foi carregado com Antiespumante 204 (A6426, 10 mL), seguido por CuSO4^ 5H2O (6,5 g). Galactose oxidase (451,2 g) (SEQ ID NO.: 10) foi adicionada e agitada por 15 min enquanto aspergida com ar. Foram adicionadas peroxidase de rábano* (200,2 g) e catalase** (502,6 g) e o reator foi enxaguado com água (2,0 kg). Em seguida solução de 2-etinilpropano-1,2,3-triol (3) em água (9,48%, 30,34 kg, 24,72 mol) foi adicionada seguida por uma porção adicional de Antiespumante 204 (A6426, 10 mL). A reação foi espargida com ar e agitada durante a noite para dar 94,0 kg de (R)-2-etinil-gliceraldeído (4) em 66% de conversão (por NMR) e 84% e.e. Rendimento de ensaio de 60%: 1H NMR (D2O, 500 MHz): δ 4,29 (s, 1H), 3,65 (dd, 2H), 2,83 (s, 1H). 1 Peroxidase de rábano: peroxidase de tipo selvagem a partir de rábano purificado, comercialmente disponível pela Toyobo (PEO-301), isolada a partir de raízes de rábano (Amoracia rusticana). 2 * Catalase bovina: catalase dependente de heme de origem bovina, disponível comercialmente pela Sigma (C1345).
[111] A reação acima também foi realizada usando a galactose oxidase (SEQ ID NO: 11) e o produto (4) foi obtido em 67% de conversão (por NMR) e 88% e.e. e rendimento de ensaio 59%: 1H NMR (D2O, 500 MHz): δ 4,29 (s, 1H), 3,65 (dd, 2H), 2,83 (s, 1H). Método C3:
Figure img0021
[112] Em um recipiente EasyMax de 100 mL equipado com aspersor e controlador de fluxo, foram carregados água (82 mL) e tampão de potássio PIPES (5 mL, 0,5 M). O pH foi ajustado para 7,5 usando solução de KOH a 5 M a 25 °C. Antiespumante 204 (200 μL) foi adicionado, seguido por galactose oxidase evoluída (SEQ ID NO: 17, 450 mg de pó de enzima) e sulfato de cobre (II) pentahidratado (100 μL, 100 mM). A mistura de reação foi aspergida com ar a 125 centímetros cúbicos padrão por minuto (sccm) por 15 min. Catalase bovina (C1345, Sigma-Aldrich, 150 mg, 2000-5000 U/mg, 0,75 MU) foi carregada, seguida por peroxidase de rábano (HRP, Toyobo PEO-301, 100 mg, 130 U/mg, 1,3 kU) e a solução aquosa de 2-etinil-propano-1,2,3-triol (3) (25% em peso, 12 mL, 25,8 mmol). A mistura de reação foi agitada a 30 °C com aeração a 125 sccm e amostrada usando EasySampler por 20h para dar 70% de conversão e formar composto (4) ((R)-2-etinil-gliceraldeído) em 58% de rendimento de ensaio e 99% e.e. 1H NMR (D2O, 500 MHz): δ 4,29 (s, 1H), 3,65 (dd, 2H), 2,83 (s, 1H). A corrente de reação bruta foi transportada diretamente para a etapa de fosforilação subsequente. Método C4: Oxidação com galactose oxidase imobilizada
Figure img0022
Procedimento de imobilização enzimática:
[113] A resina carregada de Ni Nuvia IMAC (16 mL com base no volume assentado) foi adicionada a um funil de filtro e lavada com tampão de ligação (10 volumes de coluna, 160 mL; cloreto de sódio a 500 mM, fosfato de sódio a 50 mM, imidazol a 15 mM, pH 8,0) para remover a solução de armazenamento de resina. Em um recipiente, pós liofilizados de galactose oxidase evoluída (SEQ ID NO.: 17, 2,00 g) foram ressuspensos em solução de sulfato de cobre (II) (100 μM; 5,00 mL), seguido pela adição de tampão de ligação (50 mL) e da resina. A solução foi misturada usando um misturador rotativo a 20 °C por 5h. A resina foi filtrada e lavada com tampão de ligação (10 volumes de coluna, 160 mL) e tampão PIPES de potássio (10 volumes de coluna, 160 mL; 50 mM, pH 7,5) e foi usada diretamente em uma reação. Procedimento de reação:
[114] Em um recipiente EasyMax de 100 mL equipado com aspersor e controlador de fluxo, foram carregados água (82 mL) e tampão de potássio PIPES (5 mL, 1 M). O pH foi ajustado para 7,5 usando solução de KOH a 5 M a 25 °C. Antiespumante 204 (200 μL) foi adicionado, seguido por galactose oxidase evoluída imobilizada na resina (SEQ ID NO: 17, 750 mg de pó de enzima por 6 mL de resina) e sulfato de cobre (II) pentahidratado (100 μL, 100 mM). A mistura de reação foi aspergida com ar a 125 centímetros cúbicos padrão por minuto (sccm) por 15 min. Catalase bovina (C1345, Sigma-Aldrich, 210 mg, 2000-5000 U/mg, 1,05 MU) foi carregada, seguida por peroxidase de rábano (HRP, Toyobo PEO- 301, 100 mg, 130 U/mg, 1,3 kU) e a solução aquosa de 2-etinil-propano-1,2,3- triol (3) (25% em peso, 13 mL, 29,4 mmol). A mistura reacional foi agitada a 25 °C com aeração a 125 sccm. Após 22h, a reação atingiu 91% de conversão para dar solução de (R)-2-etinil-gliceraldeído (4) a 200 mM (100 mL, rendimento de ensaio de 68%, 97% e.e. 1H NMR (D2O, 500 MHz): δ 4,29 (s, 1H), 3,65 (dd, 2H), 2,83 (s, 1H). A corrente de reação bruta foi transportada diretamente para a etapa de fosforilação subsequente. Método C5: Isolamento opcional de aldeído via formação de aminal (8) Etapa 1: Preparação de (S)-2-(1,3-dibenzilimidazolidin-2-il)but-3-ino-1,2- diol
Figure img0023
[115] Um recipiente cilíndrico revestido de 100 L equipado com borbulhador de nitrogênio, agitador mecânico e termopar foi carregado com corrente de reação de oxidase bruta contendo (R)-2-etinilgliceraldeído ((4), 26,0 kg, 1,85% em peso de aldeído, 3,64 mol) e inerte com atmosfera de N2. A solução aquosa foi aquecida a 20 °C e óxido de N, N-dimetildodecano-1-amina (DDAO) (30% em peso em água, 798 g, 0,96 mol;) foi adicionado, seguido por MTBE (55,3 kg, 76 L) e N, N'-dibenziletano-1,2-diamina (1,55 kg, 6,43 mol). A mistura bifásica, marrom, foi agitada durante a noite a 20 °C sob atmosfera de nitrogênio. Após 17 horas a agitação foi parada e a fase orgânica foi removida e descartada. Uma solução de MTBE marrom claro de (S)-2-(1,3-dibenzilimidazolidin-2-il)but-3-ino- 1,2-diol (56,5 kg, 2,02% em peso de aminal, 3,39 mmol, 93% de rendimento de ensaio) foi obtida.
[116] Seis soluções de MTBE semelhantes foram processadas juntas em uma única etapa de destilação e cristalização (no total, 374,4 kg de solução, contendo 7,91 kg de aminal).
[117] Um recipiente cilíndrico revestido de 50 L equipado com agitador mecânico, cabeça de destilação (condensador a -20 °C) e termopar foi carregado com solução aminal (45 L). Vácuo foi aplicado ao recipiente (65 95 torr) e o revestimento foi configurado para 40 ° C. O solvente foi removido por destilação até um volume de 35 L ter sido atingido. Neste ponto, a temperatura interna era de 6,1 °C e um sólido esbranquiçado começou a cristalizar. O restante da solução de MTBE foi adicionado lentamente, mantendo um volume constante de 35-40 L e uma temperatura interna de 0-10 °C. Uma vez que toda a solução de MTBE foi adicionada, o volume foi diminuído para 25 L. A destilação foi interrompida, o recipiente foi inertizado com nitrogênio e a temperatura de revestimento foi diminuída para 10 °C. A suspensão amarela pálida resultante foi maturada a esta temperatura por 2 horas e os sólidos foram coletados por filtração. O bolo de filtração foi lavado com MTBE frio (-2 °C) (12,7 kg) e depois seco sob fluxo de nitrogênio por 7 horas. (S)-2-(1,3-dibenzilimidazolidin-2-il)-but-3-ino-1,2-diol foi obtido como um sólido cristalino esbranquiçado (5,75 kg). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7,42 - 7,35 (m, 4H), 7,32 (td, J= 7,5, 1,6 Hz, 4H), 7,27 - 7,21 (m, 2H), 5,10 (t, J= 5,6 Hz, 1H), 5,03 (s, 1H), 4,28 (d, J= 13,3Hz, 1H), 4,16 (d, J= 13,3 Hz, 1H), 3,76 (s, 1H), 3,70 3,58 (m, 4H), 3,21 (d, J=0,9 Hz, 1H), 2,90 - 2,80 (m, 2H), 2,60-2,51 (m, 2H).13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 140,0, 140,0, 128,5, 128,3, 128,2, 128,1, 126,8, 126,8, 88,6, 86,9, 75,0, 74,0, 66,4, 60,7, 60,5, 50,4, 50,3, 39,5. HR-MS (ESI) Aminal (M + H+) C21H25N2O2+ calculado 337,1911; encontrado 337,1922. Etapa 2: Preparação de (R )-2-etinil-gliceraldeído (4) a partir de aminal (8)
Figure img0024
[118] Um recipiente cilíndrico revestido 4 L equipado com borbulhador de nitrogênio e agitador mecânico foi carregado com de TsOH^O (12,0 g, 63,1 mmol), água (60 mL), (S)-2-(1,3-dibenzilimidazolidin-2-il)but-3-ino-1,2-diol (110 g, 327 mmol) e MTBE (1700 mL). A mistura bifásica foi colocada sob nitrogênio e a temperatura de revestimento foi configurada para 15 °C. Uma solução de TsOH^O (114 g, 599,3 mmol) em água (600 mL) foi adicionada gota a gota ao longo de 1,5 horas com agitação superior (200 rpm). Após completada a adição, a temperatura de revestimento foi baixada para 5 °C e a pasta resultante foi maturada por 1 hora. Os sólidos foram removidos por filtração e lavados com água fria (270 mL). A solução bifásica foi transferida para um funil de separação e a fase orgânica foi removida e descartada. A fase aquosa foi tratada com resina DOWEX™ MARATHON™ A (forma de hidróxido, 11,0 g) e resina AMBERLYST® 15 (forma de hidrogênio, 11,0 g) enquanto aspergida com N2 a uma taxa de 200 sccm por 24 horas para remover MTBE residual. As resinas foram removidas por filtração para dar uma solução aquosa incolor de (R)-2-hidroxi-2- (hidroximetil)but-3-inal (774 g, 4,6% em peso de aldeído, 82% de rendimento). 1H NMR (500 MHz, D2O) δ 5,01 (s, 1H), 3,77 (d, J= 11,7 Hz, 1H), 3,73 (d, J= 11,7 Hz, 1H), 2,92 (s, 1H). 13C NMR (126 MHz, D2O) δ 129,4, 125,4, 90,3, 81,0, 76,0, 73,9, 65,3. HRMS (ESI) Dímero de aldeído (2M + Na+) C10H12NaO6+ calculado 251,0526; encontrado 251,0530. Preparações Alternativas de (R )-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5): Método D1: Acetato quinase: Sistema de regeneração de ATP
Figure img0025
[119] Em um reator agitado, a uma solução de sal dissódico de difosfato de adenosina (40 mg, 0,087 mmol) e cloreto de magnésio (38 mg, 0,400 mmol) em tampão HEPES (66 mM, pH 7,5, 30 mL) foi adicionado (R)-2-etinil-gliceraldeído (4) (1,9 mL, solução de 210 g/L em água, 3,51 mmol), seguido por acetato quinase (SEQ ID NO: 3) (40 mg) e pantotenato quinase (SEQ ID NO: 2) (120 mg). A mistura de reação foi aquecida a 25 °C e uma solução de sal de potássio de lítio acetil fosfato (1,3 g, 7,01 mmol) em tampão HEPES (50 mM, pH 7,5, 10 mL) foi adicionada gota a gota ao longo de 4 horas, com pH mantido em 7,5 usando hidróxido de sódio a 5M. A reação foi agitada por 18 horas para dar (R)--2-etinil- gliceraldeído 3-fosfato (5) em 85% de conversão (por HPLC) (O produto não foi isolado). 1H NMR (D2O, 400 MHz): δ 5,02 (s, 1H), 4,00 (dq, 2 H), 2,88 (s, 1H). LC- MS: (ES, m/z): calculado para C5H7O6P (M-H): 193,1; encontrado 193,0. Método D2: Sistema de regeneração de ATP piruvato oxidase
Figure img0026
[120] Em um reator agitado, uma solução de piruvato de sódio (3,11 g, 28 mmol) e ácido fosfórico (0,523 mL, 7,71 mmol) em 76 mL de água pH 7,5 foi carregada com (R)-2-etinil-gliceraldeído (4) (3,8 mL, solução de 210 g/L em água, 7,01 mmol), sal dissódico de difosfato de adenosina (80 mg, 0,174 mmol), pirofosfato de tiamina (40 mg, 0,086 mmol), hidrato de sal dissódico de dinucleotídeo de flavina e adenina (64 mg, 0,077 mmol) e cloreto de magnésio (400 μL, solução em água a 1 M, 0,4 mmol). O pH foi reajustado para 7,5 com hidróxido de sódio aq. a 5M e o volume de reação foi reajustado para 80 mL com água. Acetato quinase (SEQ ID NO: 3) (80 mg), piruvato oxidase (SEQ ID NO: 4) (80 mg, extrato livre de células liofilizadas), pantotenato quinase (SEQ ID NO: 2) (400 mg) e catalase (800 μL, suspensão de sulfato de amônio CAT-101, Biocatalytics) foram adicionados. A reação foi agitada a 500 rpm e 30 °C com aspersão de ar por 72 horas para dar (R)--2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato 5 em 95% de conversão (por HPLC) (O produto não foi isolado). 1H NMR (D2O, 400 MHz): δ 5,02 (s, 1H), 4,00 (dq, 2 H), 2,88 (s, 1H). LC-MS: (ES, m/z): calculado para C5H7O6P (M-H): 193,1; encontrado 193,0.
[121] A reação acima também foi realizada usando a pantotenato quinase (SEQ ID NO: 13) e o produto 5 foi obtido em 66% de conversão. (O produto não foi isolado). 1H NMR (D2O, 400 MHz): δ 5,02 (s, 1H), 4,00 (dq, 2 H), 2,88 (s, 1H). Método D3: Acetato quinase: Sistema de regeneração de ATP usando enzimas imobilizadas
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Procedimento de imobilização enzimática:
[122] Resina NUVIA™ de Cromatografia de Afinidade por Íons Metálicos Imobilizados (IMAC) carregada de níquel (168 mL com base no volume assentado) foi adicionada a um funil de filtro e lavada com tampão de ligação (1,6 L; cloreto de sódio a 500 mM, fosfato de sódio a 50 mM, pH 8,0). Em um recipiente, pantotenato quinase (8,4 g) (SEQ ID NO: 12) e acetato quinase (2,8 g) (SEQ ID NO: 3) foram dissolvidos em tampão de ligação (500 mL). A resina lavada foi carregada ao recipiente e a solução foi agitada por 4 horas a 20 °C. A resina foi filtrada e lavada primeiro com tampão de ligação (1,6 L) seguido por tampão de piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanossulfônico) (PIPES) (840 mL; 50 mM, pH 6,5). A resina lavada foi usada diretamente na próxima etapa. Procedimento de reação:
[123] Para um reator de 1 L, uma solução de (R)-2-etinil-gliceraldeído (4) em água (608,7 g, 4,6% em peso, 212 mmol) foi carregada e resfriada a 5 °C. À solução resfriada foram adicionados tampão de piperazina-N,N'-bis(ácido 2- etanossulfônico) (PIPES) (32,7 mL, 1 M, pH 6,5, 32,7 mmol), cloreto de magnésio (9,33 mL, 1 M, 9,33 mmol), sal de acetil fosfato diamônio (51,8 g, 265 mmol), hidrato de sal dissódico de difosfato de adenosina (1,17 g, 2,12 mmol) e água (192 mL). A solução foi deixada a agitar e o pH foi ajustado para 6,4 usando KOH a 5 N. A reação foi aquecida a 20 °C e 168 mL de resina com pantotenato quinase co-imobilizada (SEQ ID NO: 12) e acetato quinase (SEQ ID NO: 3) foram adicionados. A reação foi agitada por 10 horas com KOH a 5 N usado para manter um pH de 6,4 para dar (R)-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5) em 92% de conversão (por HPLC) e 91% de rendimento (por 31P RMN com cloreto de tetrafenilfosfônio como padrão interno) (o produto não foi isolado). 1H NMR (D2O, 400 MHz): δ 5,02 (s, 1H), 4,00 (dq, 2 H), 2,88 (s, 1H). LC-MS: (ES, m/z): calculado para C5H7O6P (M-H): 193,1; encontrado 193,0. Preparação de 4-etinil-D-2-desoxirribose 5-fosfato (6) Método E:
Figure img0028
[124] A uma solução de (R)-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5) (5, 20 mL, 5,3 mmol) em água, uma solução de acetaldeído em água (40% em peso, 2,02 mL, 15,9 mmol) foi adicionada à temperatura ambiente, seguida pela adição de desoxirribose-fosfato aldolase (DERA) (SEQ ID NO: 6), solução de 25 mg em tampão de cloridrato de trietanolamina (1 mL, 1 M, pH 7,0). O reator foi selado e a mistura foi agitada durante a noite a 30 °C e 600 rpm para dar 4-etinil-D-2- desoxirribose 5-fosfato (6) em 99% conv. e 99% e.e., 99% d.e. como uma mistura de anômero 1:1 (O produto não foi isolado), a-anômero: 1NMR (D2O, 600 MHz) δ 5,31 (t, 1H), 4,13 (t, 1H), 3,81-3,72 (m, 2H), 2,89 (s, 1H), 2,42-2,34 (m, 1H), 1,871,79 (m, 1H); 13NMR (D2O, 151 MHz) δ 97,7 (s), 81,4 (d), 79,4 (s), 78,9 (s), 71,1 (s), 67,7 (d), 39,6 (s). β-an0mero: 1H NMR (D2O, 600 MHz) δ 5,40 (dd, 1H), 4,28 (t, 1H), 3,88-3,80 (m, 2H), 2,87 (s, 1H), 2,13-2,06 (m, 1H), 2,04-1,97 (m, 1H); 13C NMR (D2O, 151 MHz) δ 97,3 (s), 82,2 (d), 78,7 (s), 78,5 (s), 71,3 (s), 68,4 (d), 39,6 (s). LC-MS: (ES, m/z): calculado para C7H10O7P (M-H): 237,0; encontrado 237,0. Preparações alternativas de mono-hidrato de (2R,3S,5R)-5-(6-amino-2- fluoro-9H-purin-9-il)-2-etinil-2-(hidroximetil)tetrahidrofuran-3-ol (7) [nome alternativo 4'-etinil-2-flu oro-2'-desoxiadenosina ou EFdA] Método F1:
Figure img0029
[125] Fosfato de amônio ((2R, 3S)-2-etinil-3,5-di-hidroxitetra-hidrofuran-2- il)metil hidrogenofosfato (1,00 g, 3,91 mmol) foi dissolvido em 10 mL de tampão de pH 7,5 (trietanolamina - HCl a 100 mM contendo MnCl2 a 5 mM). O pH da solução foi ajustado para 7,3 com NaOH a 5N. À solução foi adicionado 2- fluoroadenina (0,599 g, 3,91 mmol) e sacarose (2,68 g, 7,82 mmol). A solução de enzima foi preparada ao dissolver fosfopentomutase (SEQ ID NO: 8) (100 mg), purina nucleosídeo fosforilase (SEQ ID NO: 9) (50 mg) e sacarose fosforilase (SEQ ID NO: 7) (10 mg) em 10 mL do tampão de pH 7,5. A solução de enzima foi adicionada à mistura de reagentes e a suspensão resultante foi misturada a 40 °C. Após 20 h, a suspensão foi resfriada a 0 °C e filtrada, enxaguada com água fria. O sólido foi seco por sucção para dar o composto de título (1,12 g, 92% ) como um único isômero.
[126] 1H NMR: (300 MHz, DMSO-d6, ppm): δ 7,68 (br s, 2H), 7,32 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,44 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 5,52 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,27 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,44 (q, J = 6,4 Hz, 1H), 3,60 (q, J = 6,0 Hz, 1H), 3,53 (q, J = 6,4 Hz, 1H), 3,48 (s, 1H), 2,48-2,41 (m, 1H), 2,37-2,30 (m, 1H). 13C NMR (150,92 MHz, DMSO-d6, ppm) δ 158,5 (d, JCF = 203,5), 157,6 (d, JCF = 21,2), 150,2 (d, JCF = 20,2), 139,7 (d, JCF = 2,4), 117,4 (d, JCF = 4,0), 85,1, 82,0, 81,4, 78,7, 70,1, 64,2, 38,1. LC-MS: (ES, m/z): calculado para C12H12FN5O3 (M+Na): 316,0822; encontrado 316,0818.
[127] As enzimas PPM e PNP usadas nesta etapa foram, cada uma, derivadas de mutações das enzimas de E. coli (Escherichia coli) A sacarose fosforilase (SP) usada nesta etapa foi derivada de Alloscardovia omnicolens; SP derivada de outros organismos também pode ser usada. Método F2:
Figure img0030
[128] A uma solução aquosa de (R)-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5) (950 mL, 157 mmol) contendo tampão de piperazina-N,N'-bis(ácido 2- etanossulfônico) (PIPES) a um pH de cerca de 5,5 a 6,0 foi adicionada trietanolamina (7,09 g, 47,5 mmol). O pH da solução foi ajustado de 7,1 para 7,6 usando hidróxido de potássio (8 mL, 8 M). Hidrato de cloreto de manganês (II) (0,592 g, 4,70 mmol) foi adicionado seguido por sacarose (161 g, 470 mmol), dando um pH de 7,5. Foram adicionadas as seguintes enzimas à solução: desoxirribose-fosfato aldolase (SEQ ID NO: 14) (461 mg), sacarose fosforilase (SEQ ID NO: 7) (494 mg), fosfopentomutase (SEQ ID NO: 8)(2,63 g) e purina nucleosídeo fosforilase (SEQ ID NO: 15) (659 mg). Uma vez que as enzimas foram dissolvidas, 2-fluoroadenina (19,80 g, 125 mmol) foi adicionada. A reação foi aquecida a 35 °C e acetaldeído foi adicionado (40% em peso em álcool isopropílico, 29,8 mL, 235 mmol). Após reagir por 2h, a mistura foi semeada com o produto cristalino EFdA (0,96 g, 2 mol%). Após reagir ao longo de 26 h a 35 °C, a pasta foi resfriada a 0 °C e os sólidos foram coletados por filtração, lavando com água duas vezes (40 mL cada). Os sólidos foram secos sob uma varredura de nitrogênio. Rendimento de 43,2 g, 92% em peso, 96,2% corrigido. 1H NMR: (300 MHz, DMSO-d6, ppm): δ 7,68 (br s, 2H), 7,32 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,44 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 5,52 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,27 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,44 (q, J = 6,4 Hz, 1H), 3,60 (q, J = 6,0 Hz, 1H), 3,53 (q, J = 6,4 Hz, 1H), 3,48 (s, 1H), 2,48-2,41 (m, 1H), 2,37-2,30 (m, 1H). 13C NMR (150,92 MHz, DMSO-d6, ppm) δ 158,5 (d, JCF = 203,5), 157,6 (d, JCF = 21,2), 150,2 (d, JCF = 20,2), 139,7 (d, JCF = 2,4), 117,4 (d, JCF = 4,0), 85,1, 82,0, 81,4, 78,7, 70,1, 64,2, 38,1. LC-MS: (ES, m/z): calculado para C12H12FN5O3 (M+Na): 316,0822; encontrado 316,0818. Preparações Alternativas de (S )-2-etinil-propano-1,2,3-triol I 1-fosfato (9): Método G1: Acetato quinase: Sistema de regeneração de ATP usando enzimas SEQ. ID No: 2 e SEQ. ID No: 3
Figure img0031
[129] Um reator de 50 mL foi carregado com uma solução de 2-etinil- propano-1,2,3-triol (3) em água (9,29 g, 9,46% em peso, 7,57 mmol) de tampão PIPES de potássio (1,02 mL, 1 M, pH 6,5, 1,02 mmol), cloreto de magnésio (292 μL, 1 M, 0,292 mmol), sal de acetil fosfato diamônio (1,851 g, 89% em peso, 9,46 mmol), hidrato de sal dissódico de difosfato de adenosina (ADP, 42 mg, 0,076 mmol, 0,01 eq.) e água (28 mL). O pH foi ajustado para 6,4 usando KOH a 5 M, a solução foi aquecida a 20 °C e pantotenato quinase PanK evoluída SEQ. ID No: 2 (264 mg) e acetato quinase AcK SEQ. ID No: 3 (88 mg) foram adicionados. A reação foi agitada durante 16 horas com pH mantido a 6,4 usando KOH a 5N. O conteúdo final da reação forneceu (S)-2-etinil-propano-1,2,3-triol 1-fosfato (9) em >95% e.e. e 99% de conversão (por 31P NMR). O produto não foi isolado. 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 3,89 (m, 2H), 3,72 (d, J = 11.6 Hz, 1 H), 3,65 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 2,93 (s, 1H). 13C NMR (D2O, 126 MHz) δ 82,9 (s), 75,1 (s), 71,0 (d, J = 6,9 Hz), 67,0 (d, J = 4,5 Hz), 64,7 (s). 31P NMR (D2O, 202 MHz) δ 3,39. HRMS-MS: (ESI, m/z): calculado para [M-1]-C5H8O6P: 195,0058; encontrado 195,0068 [M-H]-: 195,0058. Método G2: Acetato quinase: Sistema de regeneração de ATP usando enzima SEQ. ID No: 20 e enzima SEQ. ID No: 21
Figure img0032
[130] A um reator revestido, solução aquosa de 2-etinil-propano-1,2,3-triol (3) (11,47 kg, 8,7% em peso, 8,61 mol) e água (7,5 kg) foi carregada, seguida por tampão de BIS-TRIS metano a 1M pH 6,5 (1 L) e cloreto de magnésio (41,4 g). ATP (48g, 0,086 mol, 0,01 equivalente) e acetil fosfato de diamônio (2,021 kg, 89%, 10,33 mmol) foram adicionados, a solução foi aquecida até 20°C e o pH da solução foi reajustado para 6,8 usando KOH (270,4 g). Pantotenato quinase evoluída SEQ. ID No: 20 (20,4 g) e acetato quinase evoluída SEQ. ID No .: 21 (3 g) foram então carregados como sólidos. A reação foi agitada a 20°C por 16h, durante as quais o pH caiu para 5,5. Conversão quantitativa de 2-etinil-propano- 1,2,3-triol (3) foi obtida conforme julgado por 1H e 31P NMR. Tal solução (S)-2- etinil-propano-1,2,3-triol 1-fosfato (9) preparada (397 mM, 22,5 kg, 98% de rendimento) foi usada na etapa de oxidação subsequente sem qualquer purificação adicional. 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 3,89 (m, 2H), 3,72 (d, J = 11.6 Hz, 1 H), 3,65 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 2,93 (s, 1H). Método G3: Acetato quinase: Sistema de regeneração de ATP usando a enzima SEQ. ID No: 20 e enzima SEQ. ID No: 21 com composto deuterado (3) para atribuir estereoquímica absoluta e demonstrar a fosforilação de desimetrização.
Figure img0033
[131] Pantotenato quinase evoluída SEQ. ID No: 20 (100 μL de solução de 10 g/L em água) e acetato quinase evoluída SEQ ID No.: 21 (100 μL de solução 2g/L em água) foram adicionados a uma solução contendo acetil fosfato de diamônio (41 mg), 2-etinil-propano-1,1-d2-1,2,3-triol ((R) -3-d2, 20 mg, 170 μmol), cloreto de magnésio (10 μL de solução a 1 M em água), ADP (10 μL de solução 100 g/L em água) e tampão de fosfato de sódio (10 μL de solução a 1 M em água) em água (800 μL) a pH 6,5. A reação foi incubada por 24h à temperatura ambiente para dar análogos de 2-etinil-propano-1,2,3-triol 1- fosfato deuterado (S)-9-(3,3-d2) e (S)-9-(1,1-d2) na razão de 95: 5 e rendimento total de 99%. A razão de compostos fosforilados foi determinada por 31P NMR como sendo ~95:5, confirmando a fosforilação estereosseletiva do 2-etinil- propano-1,2,3-triol (3) no grupo hidroxila pró-(S) (isto é, uma fosforilação desimetrizante). 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 3,89 (m, 2H), 3,72 (d, J = 11.6 Hz, 1 H), 3,65 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 2,93 (s, 1H). 13C NMR (D2O, 126 MHz) δ 82,9 (s), 75,1 (s), 71,0 (d, J = 6,9 Hz), 67,0 (d, J = 4,5 Hz), 64,7 (s). Método G4: Acetato quinase: Sistema de regeneração de ATP usando enzimas imobilizadas SEQ. ID No: 20 e enzima SEQ. ID No.: 21
Figure img0034
Procedimento de imobilização enzimática: A resina carregada de Ni Nuvia IMAC (75 mL com base no volume assentado) foi adicionada a um funil de filtro e lavada com água (9 volumes de coluna, 3 x 225 mL) e tampão de ligação (1 volume de coluna, 75 mL; cloreto de sódio a 500 mM, fosfato de sódio a 50 mM, imidazol a 15 mM, pH 8,0). Em um recipiente, pó liofilizado de pantotenato quinase (SEQ ID NO: 20, 6,0 g) foi ressuspenso em tampão de ligação (200 mL) e a resina lavada foi adicionada. A solução foi misturada usando um misturador rotativo a 25 °C por 6h. A resina foi filtrada e lavada com tampão de ligação (6 volumes de coluna, 6 x 225 mL) e tampão BIS-TRIS (8 volumes de coluna, 600 mL; 50 mM, pH 6,2). Procedimento de reação:
[132] Uma solução aquosa de 2-etinil-propano-1,2,3-triol (3) (574 g, 8,7% em peso, 0,430 mol) e água (350 mL) foi carregada, seguida por tampão de BISTRIS metano a 1M pH 6,5 (50 mL) e cloreto de magnésio (2,033 g, 0,01 mol). ATP (2,37g, 0,0043 mol, 0,01 equivalente) e acetil fosfato de diamônio (101 g, 89%, 0,530 mmol, 1,2 eq) foram adicionados, a solução foi aquecida até 20°C e o pH da solução foi reajustado para 6,8 usando KOH a 5 M. Resina com pantotenato quinase imobilizada SEQ. ID No: 20 (25 mL) e acetato quinase evoluída SEQ. ID No .: 21 (0,15 g) foram então carregados como sólidos. A reação foi agitada a 20 °C por 16h, durante as quais o pH caiu para 5,5. Conversão quantitativa de 2- etinil-propano-1,2,3-triol (3) para (S)-2-etinil-propano-1,2,3-triol 1-fosfato (9) foi obtida conforme julgado por 1H e 31P NMR. 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 3,89 (m, 2H), 3,72 (d, J = 11.6 Hz, 1 H), 3,65 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 2,93 (s, 1H). Preparações Alternativas de (R )-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5): Método H1: Galactose oxidases imobilizadas SEQ ID No: 16
Figure img0035
Procedimento de imobilização enzimática:
[133] A resina carregada de Ni Nuvia IMAC (10 mL com base no volume assentado) foi adicionada a um funil de filtro e lavada com tampão de ligação (10 volumes de coluna, 100 mL; cloreto de sódio a 500 mM, fosfato de sódio a 50 mM, imidazol a 15 mM, pH 8,0) para remover a solução de armazenamento de resina e dar 16 g de resina lavada. Pós liofilizados de galactose oxidase evoluída em um recipiente (SEQ ID NO.: 16, 750 mg) foram ressuspensos em solução de sulfato de cobre (II) (100 μM; 5,00 mL), seguido pela adição de tampão de ligação (20 mL) e da resina lavada (3,0 g). A solução foi misturada usando um misturador rotativo a 20°C por 5h. A resina foi filtrada e lavada com tampão de ligação (10 volumes de coluna, 100 mL) e tampão BIS-TRIS (10 volumes de coluna, 100 mL; 50 mM, pH 7,5) e foi usada diretamente na reação de glicosilação. Procedimento de reação:
[134] A resina com galactose oxidase imobilizada SEQ ID NO: 16 (3,0 g) foi adicionada a uma solução de (S)-2-etinil-propano-1,2,3-triol 1-fosfato (9, 5,4 mmol, 270 mM, 20 mL) em tampão de BIS-TRIS metano (35 mM, pH ajustado para 7,2), seguido pela adição de solução de sulfato de cobre (II) em água (30 μL, 100 mM) e peroxidase de rábano (PEO-301, 18 mg) e catalase bovina (C1345, 120 mg) ressuspensa em água (600 μL). A reação foi selada com membrana permeável a gás e misturada vigorosamente a 22°C por 4 dias para atingir a conversão final de 77% e dar (R)-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5) em 95% e.e. A resina enzimática foi filtrada e a solução do (R)-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5) foi usada diretamente na reação de glicosilação. 1H NMR (D2O, 400 MHz): δ 5,02 (s, 1H), 4,00 (dq, 2 H), 2,88 (s, 1H). LC-MS: (ES, m/z): calculado para C5H7O6P (M-H): 193,1; encontrado 193,0. Método H2: Galactose oxidases imobilizadas SEQ ID No.: 17
Figure img0036
Procedimento de imobilização enzimática:
[135] A resina carregada de Ni Nuvia IMAC (10 mL com base no volume assentado) foi adicionada a um funil de filtro e lavada com tampão de ligação (10 volumes de coluna, 100 mL; cloreto de sódio a 500 mM, fosfato de sódio a 50 mM, imidazol a 15 mM, pH 8,0) para remover a solução de armazenamento de resina e dar 16 g de resina lavada. Pós liofilizados de galactose oxidase evoluída em um recipiente (SEQ ID NO.: 16, 750 mg) foram ressuspensos em solução de sulfato de cobre (II) (100 μM; 5,00 mL), seguido pela adição de tampão de ligação (20 mL) e da resina lavada (3,0 g). A solução foi misturada usando um misturador rotativo a 20 °C por 5h. A resina foi filtrada e lavada com tampão de ligação (10 volumes de coluna, 100 mL) e tampão BIS-TRIS metano (10 volumes de coluna, 100 mL; 50 mM, pH 7,5) e foi usada diretamente na reação. Procedimento de reação:
[136] A resina com galactose oxidase evoluída imobilizada SEQ ID NO.: 17 (3,0 g) foi adicionada a uma solução de (S)-2-etinil-propano-1,2,3-triol 1-fosfato (9, 5,4 mmol, 270 mM, 20 mL) em tampão de BIS-TRIS metano (35 mM, pH ajustado para 7,2), seguido pela adição de solução de sulfato de cobre (II) em água (30 μL, 100 mM) e peroxidase de rábano (PEO -301, 18 mg) e catalase bovina (C1345, 120 mg) ressuspensa em água (600 μL). A reação foi selada com membrana permeável a gás e misturada vigorosamente a 22°C por 4 dias para atingir a conversão final de 77% e dar (R)-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5) em 95% e.e. A resina enzimática foi filtrada e a solução do (R)-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5) foi usada diretamente na reação de glicosilação. 1H NMR (D2O, 400 MHz): δ 5,02 (s, 1H), 4,00 (dq, 2 H), 2,88 (s, 1H). LC-MS: (ES, m/z): calculado para C5H7O6P (M-H): 193,1; encontrado 193,0. Método H3: Galactose oxidases imobilizadas SEQ ID No.: 18
Figure img0037
Procedimento de imobilização enzimática:
[137] A resina carregada de Ni Nuvia IMAC (3 mL com base no volume assentado) foi adicionada a um funil de filtro e lavada com tampão de ligação (10 volumes de coluna, 30 mL; cloreto de sódio a 500 mM, fosfato de sódio a 50 mM, imidazol a 15 mM, pH 8,0) para remover a solução de armazenamento de resina e dar 2,4 g de resina lavada. Pós liofilizados de galactose oxidase evoluída em uma ampola (SEQ ID NO.: 18, 75mg) foram ressuspensos em solução de sulfato de cobre (II) (100 μM; 1,00 mL), seguido pela adição de tampão de ligação (5 mL) e da resina. A solução foi misturada usando um misturador rotativo a 20 °C por 5h. A resina foi filtrada e lavada com tampão de ligação (10 volumes de coluna, 4 mL) e tampão de BIS-TRIS metano (10 volumes de coluna, 4 mL; 50 mM, pH 7,5) e foi usada diretamente em uma reação. Procedimento de reação:
[138] GOase evoluída imobilizada SEQ ID NO: 18 foi adicionada (400 mg) a uma solução de (S)-2-etinil-propano-1,2,3-triol 1- fosfato ((9), 5,4 mmol, 270 mM, 1 mL) em tampão de BIS-TRIS metano (35 mM, pH ajustado para 7,2), seguido pela adição de peroxidase de rábano (PEO-301, 1 mg) e catalase de Corynebacterium glutamicum (Roche, liofilizado, # 11650645103, 3 mg) ressuspenso em água (100 μL). A reação foi selada com membrana permeável a gás e misturada vigorosamente a 30 °C por 48h. A conversão final após 2 dias atingiu 90% de conversão e o (R)-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5)> 99% e.e. A resina enzimática foi filtrada e a solução do (R)-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5) foi usada diretamente sem purificação adicional. 1H NMR (D2O, 400 MHz): δ 5,02 (s, 1H), 4,00 (dq, 2 H), 2,88 (s, 1H). LC-MS: (ES, m/z): calculado para C5H7O6P (M-H): 193,1; encontrado 193,0. Método H4: Galactose oxidases imobilizadas SEQ ID No: 19
Figure img0038
Procedimento de imobilização enzimática:
[139] A resina carregada de Ni Nuvia IMAC (3 mL com base no volume assentado) foi adicionada a um funil de filtro e lavada com tampão de ligação (10 volumes de coluna, 30 mL; cloreto de sódio a 500 mM, fosfato de sódio a 50 mM, imidazol a 15 mM, pH 8,0) para remover a solução de armazenamento de resina e dar 2,4 g de resina lavada. Pós liofilizados de galactose oxidase evoluída em um recipiente (SEQ ID NO: 19, 75mg) foram ressuspensos em solução de sulfato de cobre (II) (100 μM; 1,00 mL), seguido pela adição de tampão de ligação (5 mL) e da resina lavada (400 mg). A solução foi misturada usando um misturador rotativo a 20 °C por 5h. A resina foi filtrada e lavada com tampão de ligação (10 volumes de coluna, 4 mL) e tampão de BIS-TRIS metano (10 volumes de coluna, 4 mL; 50 mM, pH 7,5) e foi usada diretamente em uma reação. Procedimento de reação:
[140] GOase evoluída imobilizada SEQ ID NO: 18 foi adicionada (400 mg) a uma solução de (S)-2-etinil-propano-1,2,3-triol 1-fosfato (9, 5,4 mmol, 270 mM, 1 mL) em tampão de BIS-TRIS metano (35 mM, pH ajustado para 7,2), seguido pela adição de peroxidase de rábano (PEO-301, 1 mg) e catalase de Corynebacterium glutamicum (Roche, liofilizado, # 11650645103, 3 mg) ressuspenso em água (100 μL). A reação foi selada com membrana permeável a gás e misturada vigorosamente a 30 °C por 48h. A conversão final após 2 dias atingiu 100% de conversão e (R)-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5) foi obtido em >99% e.e. A resina enzimática foi filtrada e a solução de (R)-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato (5) foi usada diretamente sem purificação adicional. 1H NMR (D2O, 400 MHz): δ 5,02 (s, 1H), 4,00 (dq, 2 H), 2,88 (s, 1H). LC-MS: (ES, m/z): calculado para C5H7O6P (M-H): 193,1; encontrado 193,0.
[141] "Aminoácidos" são referidos na presente invenção por seus comumente conhecidos pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica da IUPAC-IUB. Para os fins da descrição na presente invenção, os códigos usados para os aminoácidos geneticamente codificados para as enzimas usadas nos métodos na presente invenção são convencionais na Tabela 2:
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[142] Os números de ID de sequência para as enzimas empregadas, ou que poderiam ser empregadas, no processo para sintetizar EFdA descrito na presente invenção e nas etapas de processo exemplificadas nos Procedimentos Experimentais descritos na presente invenção são fornecidos, mas não se limitam a, aqueles na Tabela 3.
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[143] Peroxidase de rábano silvestre: peroxidase de tipo selvagem a partir de rábano silvestre Tipo I, comercialmente disponível pela SIGMA (P8125), isolada a partir de raízes de rábano (Amoracia rusticana).
[144] Catalase: (1) Catalase de tipo selvagem a partir de fígado bovino, comercialmente disponível pela SIGMA (C1345); ou (2) CAT-101, Biocatalytics; ou a partir de Corynebacterium glutamicum (Roche, #11650645103).
[145] Modalidades adicionais desta invenção incluem, mas não estão limitadas a, uso das seguintes enzimas nas etapas de processo sintético descritas na presente invenção para produção de um nucleosídeo 4’-etinil 2’-desóxi ou um análogo do mesmo, por exemplo, EFdA. A. Uma purina nucleosídeo fosforilase. 1A. Uma purina nucleosídeo fosforilase manipulada compreendendo uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99% ou mais identidade de sequência para a SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 15, ou um fragmento funcional da mesma, em que a sequência polipeptídica da referida purina nucleosídeo fosforilase manipulada compreende pelo menos uma substituição de aminoácido ou conjunto de substituição de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 15. 2A. A purina nucleosídeo fosforilase manipulada de 1A, em que a referida purina nucleosídeo fosforilase manipulada compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 15. 3A. Uma purina nucleosídeo fosforilase manipulada que é composta pela sequência polipeptídica conforme apresentada na SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 15. A4. A purina nucleosídeo fosforilase manipulada de qualquer uma de 1A a 3A, que compreende pelo menos uma propriedade aprimorada em comparação com a purina nucleosídeo fosforilase E. coli de tipo selvagem. 5A. A purina nucleosídeo fosforilase manipulada de 4A, em que a referida propriedade aprimorada compreende atividade aprimorada no composto de substrato 6.5 (em sua forma de anel ou como um aldeído ou hidrato de cadeia aberta, ou um sal de qualquer um dos anteriores) em comparação com a purina nucleosídeo fosforilase E. coli de tipo selvagem. 6A. A purina nucleosídeo fosforilase manipulada de 4A, em que a referida propriedade aprimorada compreende produção aprimorada de EFdA (composto 7) em comparação com a purina nucleosídeo fosforilase E. colide tipo selvagem. 7A. A purina nucleosídeo fosforilase manipulada de qualquer uma de A1 a 6A, em que a referida purina nucleosídeo fosforilase manipulada é purificada. 8A. A purina nucleosídeo fosforilase manipulada de qualquer uma de 1A a 7A, em que a pelo menos uma substituição de aminoácido (ou seja, uma ou mais substituição(ões) de aminoácidos) são substituição(ões) de aminoácidos conservativa(s). B. Uma fosfopentomutase. 18. Uma fosfopentomutase manipulada compreendendo uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência para a SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, em que a sequência polipeptídica da referida fosfopentomutase manipulada compreende pelo menos uma substituição de aminoácido ou conjunto de substituição de aminoácido em comparação com SEQ ID NO 8. 28. A fosfopentomutase manipulada de 1B, em que a referida fosfopentomutase manipulada compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO.: 8. 38. Uma fosfopentomutase manipulada que é composta pela sequência polipeptídica conforme apresentada na SEQ ID NO.: 8. 48. A fosfopentomutase manipulada de qualquer uma de 1B a 3B, que compreende pelo menos uma propriedade aprimorada em comparação com a fosfopentomutase de E. coli de tipo selvagem. 58. A fosfopentomutase manipulada de 4B, em que a referida propriedade aprimorada compreende atividade aprimorada no composto de substrato 6 (em sua forma de anel ou como um aldeído ou hidrato de cadeia aberta, ou um sal de qualquer um dos anteriores) em comparação com a fosfopentomutase de E. coli de tipo selvagem. 68. A fosfopentomutase manipulada de 4B, em que a referida propriedade aprimorada compreende a produção aprimorada do composto 6.5 ou composto 7 (EFdA) em comparação com a fosfopentomutase de E. colide tipo selvagem. 78. A fosfopentomutase manipulada de qualquer uma de 1B a 6B, em que a referida fosfopentomutase manipulada é purificada. 88. A fosfopentomutase manipulada de qualquer uma de 1B a 7B, em que a pelo menos uma substituição de aminoácido (ou seja, uma ou mais substituição(ões) de aminoácidos) são substituição(ões) de aminoácidos conservativa(s). C. Uma desoxirribose-fosfato aldolase. 1C. Uma desoxirribose-fosfato aldolase que é composta pelo tipo selvagem a partir da sequência polipeptídica de Shewanella halifaxensis conforme apresentada na SEQ ID NO.: 5. 2C. Uma desoxirribose-fosfato aldolase manipulada que é composta pela sequência polipeptídica conforme apresentada na SEQ ID NO.: 6 ou SEQ ID NO: 14. 3C. A desoxirribose-fosfato aldolase manipulada, em que a referida desoxirribose-fosfato aldolase manipulada compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 ou SEQ ID NO.: 14. 4C. Uma desoxirribose-fosfato aldolase manipulada compreendendo uma sequência polipeptídica com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99% ou mais identidade de sequência para a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 14, ou um fragmento funcional do mesmo, em que a sequência polipeptídica da referida desoxirribose-fosfato aldolase manipulada compreende pelo menos uma substituição de aminoácido ou conjunto de substituição de aminoácido em comparação com SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 ou SEQ ID NO: 14. 5C. A desoxirribose-fosfato aldolase de qualquer uma de 1C a 4C, que tem atividade no composto de substrato 5 (R-2-etinil-gliceraldeído3-fosfato, o hidrato do mesmo ou um sal de qualquer um dos anteriores). 6C. A desoxirribose-fosfato aldolase de qualquer uma de 1C a 5C, que compreende a habilidade de produzir o composto 6 (4-etinil-D-2-desoxirribose 5-fosfato ou o aldeído de cadeia aberta ou forma de hidrato do mesmo, ou um sal de qualquer um dos anteriores) sem a necessidade de grupos de proteção no composto de substrato 5 ((R)-2-etinil-gliceraldeído3-fosfato, o hidrato do mesmo ou um sal de qualquer um dos anteriores) durante a reação. 7C. A desoxirribose-fosfato aldolase manipulada de qualquer uma de 2C a 6C, em que a desoxirribose-fosfato aldolase tem uma propriedade aprimorada que compreende a produção aprimorada do composto 6 (4-etinil-D-2- desoxirribose 5-fosfato, ou o aldeído de cadeia aberta ou forma de hidrato do mesmo, ou um sal de qualquer um dos anteriores) como comparado a desoxirribose-fosfato aldolase Shewanella halifaxensis de tipo selvagem. 8C. A desoxirribose-fosfato aldolase de qualquer um de 1C a 7C, em que a referida desoxirribose-fosfato aldolase é purificada. 9C. A desoxirribose-fosfato aldolase manipulada de qualquer uma de 2C a 7C, em que a pelo menos uma substituição de aminoácido (ou seja, uma ou mais substituição(ões) de aminoácidos) são substituição(ões) de aminoácidos conservativa(s). D. Uma pantotenato quinase. 1D. Uma pantotenato quinase manipulada compreendendo uma sequência polipeptídica com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99% ou mais identidade de sequência para a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 20, ou um fragmento funcional do mesmo, em que a sequência polipeptídica da referida pantotenato quinase manipulada compreende pelo menos uma substituição de aminoácido ou conjunto de substituição de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13 ou SEQ ID NO: 20. 2D. A pantotenato quinase manipulada de 1D, em que a referida pantotenato quinase manipulada compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13 ou SEQ ID NO.: 20. 3D. Uma pantotenato quinase manipulada que é composta pela sequência polipeptídica conforme apresentada na SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13 ou SEQ ID NO.: 20. 4D. A pantotenato quinase manipulada de qualquer uma de 1D a 3D, que compreende pelo menos uma propriedade aprimorada em comparação com a pantotenato quinase de E. coli de tipo selvagem. 5D. A pantotenato quinase manipulada de 4D, em que a referida propriedade aprimorada compreende atividade aprimorada no composto de substrato 4 ((R)-2-etinil-gliceraldeído ou forma de hidrato do mesmo) em comparação com pantotenato quinase de E. coli de tipo selvagem. 6D. A pantotenato quinase manipulada de 5D, em que a referida propriedade aprimorada compreende produção aprimorada de composto 5 ((R)- 2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato), em comparação com pantotenato quinase de tipo selvagem. 7D. A pantotenato quinase manipulada de 4D, em que a referida propriedade aprimorada compreende atividade aprimorada no composto de substrato 3 (2-etinil-propano-1,2,3-triol) em comparação com pantotenato quinase de e. coli de tipo selvagem. 8D. A pantotenato quinase manipulada de 7D, em que a referida propriedade aprimorada compreende produção aprimorada do composto 9 ((S)- 2-etinil-propano-1,2,3-triol 1-fosfato), em comparação com pantotenato quinase de tipo selvagem. 9D. A pantotenato quinase manipulada de qualquer uma de 1D a 8D, em que a referida pantotenato quinase é purificada. 10D. A pantotenato quinase manipulada de qualquer uma de 1D a 9D, em que a pelo menos uma substituição de aminoácido (ou seja, uma ou mais substituição(ões) de aminoácidos) são substituição(ões) de aminoácidos conservativa(s). E. Uma galactose oxidase. 1E. Uma galactose oxidase manipulada compreendendo uma sequência polipeptídica com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99% ou mais identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, 10, 11, 16, 17, 18 ou 19, ou um fragmento funcional do mesmo, em que a sequência polipeptídica da referida galactose oxidase manipulada compreende pelo menos uma substituição de aminoácido ou conjunto de substituição de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 1, 10, 11, 16, 17, 18 ou 19. 2E. A galactose oxidase manipulada de 1E, em que a referida galactose oxidase manipulada compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a SEQ ID NO.: 1, 10, 11, 16, 17, 18 ou 19. 3E. Uma galactose oxidase manipulada que é composta pela sequência polipeptídica conforme apresentada na SEQ ID NO.: 1, 10, 11, 16, 17, 18 ou 19. 4E. A galactose oxidase manipulada de qualquer uma de 1E a 3E, que compreende pelo menos uma propriedade aprimorada em comparação com a galactose oxidase de F. graminearum de tipo selvagem. 5E. A galactose oxidase manipulada de 4E, em que a referida propriedade aprimorada compreende atividade aprimorada em um substrato que é um álcool primário em comparação com galactose oxidase de F. graminearum de tipo selvagem. 6E. A galactose oxidase manipulada de 4E, em que a referida propriedade aprimorada compreende atividade aprimorada no composto de substrato 3 (2-etinilpropano-1,2,3-triol) em comparação com galactose oxidase de F. graminearum de tipo selvagem. 7E. A galactose oxidase manipulada de 6E, em que a referida propriedade aprimorada compreende produção aprimorada do composto 4 ((R)- 2-etinil-gliceraldeído ou forma de hidrato do mesmo) em comparação com galactose oxidase de F. graminearum de tipo selvagem. 8E. A galactose oxidase manipulada de 4E, em que a referida propriedade aprimorada compreende produção aprimorada do composto 9 ((S)- 2-etinil-propano-1,2,3-triol 1-fosfato), em comparação com galactose oxidase de F. graminearum de tipo selvagem. 9E. A galactose oxidase manipulada de 8E, em que a referida propriedade aprimorada compreende atividade aprimorada no composto de substrato 5 ((R)-2-etinil-gliceraldeído 3-fosfato ou forma de hidrato do mesmo), em comparação com galactose oxidase de F. graminearum de tipo selvagem. 10E. A galactose oxidase manipulada de qualquer uma de 1E a 9E, em que a referida galactose oxidase é purificada. 11E. A galactose oxidase manipulada de qualquer uma de 1E a 10E, em que a pelo menos uma substituição de aminoácido (ou seja, uma ou mais substituição(ões) de aminoácidos) são substituição(ões) de aminoácidos conservativa(s). F. Uma acetato quinase. 1F. Uma acetato quinase, a qual é compreendida pelo tipo selvagem a partir da sequência polipeptídica de Thermotoga maritima conforme apresentada na SEQ ID NO.: 3 ou SEQ ID NO: 21. 2F. Uma acetato quinase manipulada, em que a referida acetato quinase manipulada compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a SEQ ID NO.: 3 ou SEQ ID NO.: 21. 3F. Uma acetato quinase manipulada compreendendo uma sequência polipeptídica que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a SEQ ID NO.: 3 ou SEQ ID NO.: 21, ou um fragmento funcional do mesmo, em que a sequência polipeptídica da referida galactose oxidase manipulada compreende pelo menos uma substituição de aminoácido ou conjunto de substituição de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 21. 4F. A acetato quinase de 2F ou 3F, que compreende pelo menos uma propriedade aprimorada em comparação com a acetato quinase de T. maritima de tipo selvagem. 5F. A acetato quinase de 4F, em que a referida propriedade aprimorada compreende atividade aprimorada para reciclagem de cofator ATP na reação de fosforilação no composto de substrato 4 ((R)-2-etinil-gliceraldeído ou forma de hidrato do mesmo) em comparação com acetato quinase de Thermotoga maritima de tipo selvagem. 6F. A acetato quinase de 5F, em que a referida propriedade aprimorada compreende a produção aprimorada do composto 5 ((R)-2-etinil-gliceraldeído 3- fosfato ou uma forma de hidrato do mesmo ou um sal de qualquer um dos anteriores) em comparação com a acetato quinase de Thermotoga maritima de tipo selvagem. 7F. A acetato quinase manipulada de 4F, em que a referida propriedade aprimorada compreende atividade aprimorada para reciclagem de cofator ATP na reação de fosforilação no composto de substrato 3 (2-etinil-propano-1,2,3- triol) em comparação com acetato quinase de Thermotoga maritima de tipo selvagem. 8F. A acetato quinase de 7F, em que a referida propriedade aprimorada compreende a produção aprimorada do composto 9 ((S)-2-etinil-propano-1,2,3- triol 1-fosfato ou um sal de qualquer um dos anteriores) em comparação com a acetato quinase de Thermotoga maritima de tipo selvagem. 9F. A acetato quinase de qualquer uma de 1F a 8F, em que a referida acetato quinase é purificada. 10F. A acetato quinase manipulada de qualquer uma de 2F a 7F, em que pelo menos uma substituição de aminoácido (ou seja, uma ou mais substituição(ões) de aminoácidos são substituição(ões) de aminoácidos conservativa(s).

Claims (37)

1. Método para sintetizar um nucleosídeo 4’-etinil 2’-desóxi, caracterizado pelo fato de que compreende combinar o composto 6.5:
Figure img0052
com purina nucleosídeo fosforilase e uma nucleobase, em uma solução tamponada contendo um sal de manganês (II), e em que 2X+ é (a) dois prótons, (b) um próton e um cátion monovalente, (c) dois cátions monovalentes em que cada cátion é igual ou diferente, ou (d) um cátion divalente.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o nucleosídeo 4’-etinil 2’-desóxi é:
Figure img0053
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente isolar:
Figure img0054
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para sintetizar um nucleosídeo 4’-etinil 2’-desóxi compreendendo adicionalmente combinar o composto 6
Figure img0055
e fosfopentomutase com a purina nucleosídeo fosforilase e a nucleobase na solução tamponada contendo um sal de manganês (II).
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente remover subproduto de fosfato inorgânico da mistura de reação.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende remover subproduto de fosfato inorgânico da solução de reação por (a) adição de sacarose fosforilase e sacarose à mistura de reação ou (b) adição de cálcio, magnésio ou manganês à mistura de reação.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente isolar o nucleosídeo 4’-etinil 2’-desóxi.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o nucleosídeo 4’-etinil 2’-desóxi é:
Figure img0056
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente isolar:
Figure img0057
10. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de sintetizar o composto 6, em que a síntese compreende combinar o composto 5
Figure img0058
com acetaldeído e desoxirribose-fosfato aldolase em uma solução aquosa para produzir o composto 6; em que 2X+ é (a) dois prótons, (b) um próton e um cátion monovalente, (c) dois cátions monovalentes em que cada cátion é igual ou diferente, ou (d) um cátion divalente.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a reação é realizada em um recipiente selado.
12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de sintetizar o composto 5, em que a síntese compreende: (i) combinar o composto 4
Figure img0059
com pantotenato quinase em uma solução tamponada na presença de um sal de metal bivalente com ATP como uma fonte de fosfato, em que o ATP é regenerado in situ para produzir o composto 5, ou (ii) combinar o composto 9:
Figure img0060
com galactose oxidase em uma solução tamponada na presença de oxigênio, catalase e uma peroxidase ou um oxidante químico, para produzir o composto 5, em que 2X+ é (a) dois prótons, (b) um próton e um cátion monovalente, (c) dois cátions monovalentes em que cada cátion é igual ou diferente, ou (d) um cátion divalente.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o ATP é regenerado in situ empregando (a) acetil fosfato e acetato quinase, ou (b) piruvato oxidase, catalase e acetato quinase na presença de piruvato, fosfato e oxigênio ou (c) uma combinação dos mesmos.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que (a) a pantotenato quinase é imobilizada ou (b) a pantotenato quinase e a acetato quinase são imobilizadas.
15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de sintetizar o composto 4, em que a síntese compreende combinar o composto 3
Figure img0061
com (a) galactose oxidase, cobre, catalase e (b) peroxidase ou um oxidante; na presença de oxigênio, em uma solução tamponada para produzir o composto 4.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a galactose oxidase é imobilizada.
17. Método para sintetizar um nucleosídeo 4’-etinil 2’-desóxi, caracterizado pelo fato de que compreende combinar o composto 5
Figure img0062
acetaldeído e uma nucleobase com desoxirribose-fosfato aldolase, fosfopentomutase e purina nucleosídeo fosforilase em uma solução tamponada contendo um sal de manganês (II), em que 2X+ é (a) dois prótons, (b) um próton e um cátion monovalente, (c) dois cátions monovalentes em que cada cátion é igual ou diferente, ou (d) um cátion divalente.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente remover subproduto de fosfato inorgânico da mistura de reação.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende remover subproduto de fosfato inorgânico da mistura de reação por (a) adição de sacarose fosforilase e sacarose à mistura de reação ou (b) adição de cálcio, magnésio, ou manganês à mistura de reação.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente isolar o nucleosídeo 4’-etinil 2’-desóxi.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o nucleosídeo 4’-etinil 2’-desóxi é:
Figure img0063
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente isolar:
Figure img0064
23. Método para sintetizar composto 6.5
Figure img0065
caracterizado pelo fato de que compreende combinar o composto 6
Figure img0066
com fosfopentomutase em uma solução tamponada contendo um sal de manganês (II), em que 2X+ é (a) dois prótons, (b) um próton e um cátion monovalente, (c) dois cátions monovalentes em que cada cátion é igual ou diferente, ou (d) um cátion divalente.
24. Método para sintetizar o composto 6
Figure img0067
caracterizado pelo fato de que compreende combinar o composto 5
Figure img0068
com acetaldeído e desoxirribose-fosfato aldolase em uma solução aquosa para produzir o composto 6; em que 2X+ é (a) dois prótons, (b) um próton e um cátion monovalente, (c) dois cátions monovalentes em que cada cátion é igual ou diferente, ou (d) um cátion divalente.
25. Método para sintetizar o composto 5:
Figure img0069
caracterizado pelo fato de que compreende combinar o composto 4
Figure img0070
com pantotenato quinase em uma solução tamponada na presença de um sal de metal bivalente, com ATP como uma fonte de fosfato em que o ATP é regenerado in situ, e em que 2X+ é (a) dois prótons, (b) um próton e um cátion monovalente, (c) dois cátions monovalentes em que cada cátion é igual ou diferente, ou (d) um cátion divalente.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o ATP é regenerado in situ empregando (a) acetil fosfato e acetato quinase, ou (b) piruvato oxidase, catalase e acetato quinase na presença de piruvato, fosfato e oxigênio ou (c) uma combinação dos mesmos.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que (a) a pantotenato quinase é imobilizada ou (b) a pantotenato quinase e a acetato quinase são imobilizadas.
28. Método para sintetizar o composto 4
Figure img0071
caracterizado pelo fato de que compreende combinar o composto 3
Figure img0072
com (a) galactose oxidase, cobre, catalase e (b) peroxidase ou um oxidante; na presença de oxigênio, em uma solução tamponada para produzir o composto 4.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a galactose oxidase é imobilizada.
30. Método para isolar o composto 4
Figure img0073
caracterizado pelo fato de que compreende: (1) reagir o composto 4 com uma amina, diamina ou aminoálcool que forma um N,N-acetal ou N,O-acetal estável, em um solvente orgânico que não é miscível com água, na ausência de oxigênio para formar um aminal; e (2) reagir o aminal com um ácido orgânico ou inorgânico na presença de solvente orgânico que não é miscível com água para regenerar o composto 4.
31. Método para sintetizar o composto 5
Figure img0074
caracterizado pelo fato de que compreende combinar o composto 9
Figure img0075
com galactose oxidase em uma solução tamponada na presença de oxigênio, catalase e uma peroxidase ou um oxidante químico, para produzir o composto 5, em que 2X+ é (a) dois prótons, (b) um próton e um cátion monovalente, (c) dois cátions monovalentes em que cada cátion é igual ou diferente, ou (d) um cátion divalente.
32. Método para sintetizar o composto 9
Figure img0076
caracterizado pelo fato de que compreende combinar o composto 3
Figure img0077
com pantotenato quinase em uma solução tamponada na presença de um sal de metal bivalente com ATP como uma fonte de fosfato, em que o ATP é regenerado in situ para produzir o composto (9), em que 2X+ é (a) dois prótons, (b) um próton e um cátion monovalente, (c) dois cátions monovalentes em que cada cátion é igual ou diferente, ou (d) um cátion divalente.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, 31 e 32, caracterizado pelo fato de que a purina nucleosídeo fosforilase, a fosfopentomutase, a desoxirribose-fosfato aldolase, a pantotenato quinase, a galactose oxidase e/ou a acetato quinase são modificadas.
34. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula 4:
Figure img0078
35. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula 5
Figure img0079
m que 2X+ é (a) dois prótons, (b) um próton e um cátion monovalente, (c) dois cátions monovalentes em que cada cátion é igual ou diferente, ou (d) um cátion divalente.
36. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula 6:
Figure img0080
em que 2X+ é (a) dois prótons, (b) um próton e um cátion monovalente, (c) dois cátions monovalentes em que cada cátion é igual ou diferente, ou (d) um cátion divalente.
37. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula 6.5:
Figure img0081
em que 2X+ é (a) dois prótons, (b) um próton e um cátion monovalente, (c) dois cátions monovalentes em que cada cátion é igual ou diferente, ou (d) um cátion divalente.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA128041C2 (uk) 2019-01-25 2024-03-20 Браун Юніверсіті Спосіб лікування пов'язаного з віком запалення у пацієнта
US20220251523A1 (en) * 2019-07-02 2022-08-11 Codexis, Inc. Engineered acetate kinase variant enzymes
KR20220126256A (ko) 2021-03-08 2022-09-15 주식회사 엘지에너지솔루션 전지셀 및 이를 제조하는 전지셀 제조 장치
IL305928A (en) 2021-04-02 2023-11-01 Codexis Inc Transgenic enzymes of acetate kinase variant
CN116855471B (zh) * 2023-09-04 2023-11-28 江苏申基生物科技有限公司 一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体及其应用
CN117143942A (zh) * 2023-10-30 2023-12-01 泰兴合全药业有限公司 3’-氨基-2’,3’-双脱氧鸟苷5’-三磷酸的合成方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0011521B8 (pt) * 1999-05-12 2021-05-25 Yamasa Corp compostos nucleósidos de purina de 4 -c-etinila
ATE431416T1 (de) 1999-08-20 2009-05-15 Pasteur Institut Enzymatische synthese von deoxyribonucleotiden
JP4058663B2 (ja) * 2000-09-22 2008-03-12 有機合成薬品工業株式会社 リボース１−リン酸類及びヌクレオシド化合物の製造方法
JP4058667B2 (ja) 2001-08-31 2008-03-12 有機合成薬品工業株式会社 ２’−デオキシヌクレオシド化合物の製造方法
JP2003250570A (ja) 2002-03-04 2003-09-09 Yuki Gosei Kogyo Co Ltd ２’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製造方法及びこの中間体の製造方法、並びにこれらに使用する２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ遺伝子
CA2502109C (en) 2004-03-24 2010-02-23 Yamasa Corporation 4'-c-substituted-2-haloadenosine derivative
JP5120949B2 (ja) * 2008-07-28 2013-01-16 独立行政法人産業技術総合研究所 白色蛍光体の製造方法
EP3608330B1 (en) * 2008-12-16 2022-11-09 Genzyme Corporation Synthetic intermediates for preparing oligosaccharide-protein conjugates
WO2015143712A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. 4'-substituted nucleoside reverse transcriptase inhibitors
WO2020014050A1 (en) * 2018-07-09 2020-01-16 Codexis, Inc. Engineered pantothenate kinase variant enzymes
US11034948B2 (en) * 2018-07-09 2021-06-15 Codexis, Inc. Engineered phosphopentomutase variant enzymes
SG11202012111UA (en) * 2018-07-09 2021-01-28 Codexis Inc Engineered purine nucleoside phosphorylase variant enzymes
US11274286B2 (en) * 2018-07-09 2022-03-15 Codexis, Inc. Engineered deoxyribose-phosphate aldolases

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