JP2023123750A

JP2023123750A - ４’－エチルヌクレオシド類似体の酵素的合成

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Publication number: JP2023123750A
Application number: JP2023107449A
Authority: JP
Inventors: ハフマン，マーク・エー; A Huffman Mark; フリスコフスカ，アンナ; Fryszkowska Anna; コレフ，ジョシュア・エヌ; N Kolev Joshua; ディヴァイン，ポール・エヌ; N Devine Paul; カンポス，ケヴィン・アール; R Campos Kevin; トルッポ，マシュー; Truppo Matthew; ナウラット，クリストファー・シー; C Nawrat Christopher
Original assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2018-07-09
Filing date: 2023-06-29
Publication date: 2023-09-05
Also published as: CN112996511A; BR112021000202A2; EP3820473A4; CA3105823C; KR20210030399A; JP2021530479A; AU2019300832A1; US20220228184A1; CA3105823A1; EP3820473A1; JP7482188B2; JP2023012498A; WO2020014041A1; BR112021000202A8; BR112021000202B1; MX2021000278A

Abstract

【課題】中間体上の保護基の使用を排除し、グリコシル化の立体選択性を改善し、化合物を製造するのに必要なプロセス段階の数を減少させる、４’－エチニル２’－デオキシヌクレオシドおよびその類似体の合成法を提供する。【解決手段】４’－エチニル２’－デオキシヌクレオシドまたはその類似体の合成方法であって、マンガン（ＩＩ）塩を含む緩衝液中で化合物６．５TIFF2023123750000080.tif24145［式中、２Ｘ＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。］をプリンヌクレオシドホスホリラ－ゼおよびヌクレオ塩基もしくはその類似体と組合せることを含む、合成方法とする。【選択図】なし

Description

発明の背景

４’－エチニル２’－デオキシヌクレオシド類似体は、ＨＩＶ、ＡＩＤＳおよび関連疾患
に対する活性について知られている。

４’－エチニルヌクレオシド類似体の一例は、ｉｎｖｉｔｒｏ（Ｋａｗａｍｏｔｏ、Ｅ
．、ＳａｒａｆｉａｎｏｓＳ．Ｆ．ｅｔａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．；４０（１１）：２４１０－２０［２００８］；Ｏｈｒ
ｕｉ、Ｈ．、Ｈ．ｅｔａｌ．、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓ、２６，１５４３－１５４６［２００７］）およびｉｎｖｉｖｏ（Ｈａｔ
ｔｏｒｉ、Ｓ．、Ｋ．、Ｎａｋａｔａ、Ｈ．ｅｔａｌ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａ
ｌ．ＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，５３，３８８７－３８９
３［２００９］）でのＨＩＶ－１およびＳＩＶウイルス複製を遮断するヌクレオシド逆
転写酵素トランスロケ－ション阻害剤である、４’－エチニル２’－デオキシアデノシン
（ＥＦｄＡ、別名ＭＫ－８５９１）である。ＥＦｄＡは、米国特許第７，３３９，０５３
号（特許第’０５３号では、２’－デオキシ－４’－Ｃ－エチニル２－フルオロアデノシ
ンと称されている）でクレ－ムされている。ＥＦｄＡは次のような化学構造をもつ。

ＥＦｄＡは細胞内で代謝され、ＨＩＶ逆転写酵素を阻害する活性三リン酸アナボライトに
なる。入ってくるヌクレオチドの結合を阻害する３’－ＯＨ基を欠く、ＨＩＶ感染症の治
療に現在利用可能なヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬（ＮｓＲＴＩ）やヌクレオチド系逆
転写酵素阻害薬（ＮｔＲＴＩ）とは対照的に、ＥＦｄＡは３’－ＯＨ基を保持し、逆転写
酵素（ＲＴ）活性部位におけるプライマ－：鋳型の転座を妨げ、入ってくるデオキシリボ
ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の結合を妨げることにより、鎖タ－ミネ－タ－として
作用する。さらに、ＥＦｄＡの修飾リボ－ス環のパッカ－は、入ってくるヌクレオチドか
らのリン酸基転移が効率的でないベクタ－に３’－ＯＨを配置することにより、逆転写酵
素の阻害に寄与すると考えられている。（ＭｉｃｈａｉｌｉｄｉｓＥ，ｅｔａｌ．
，ＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＨＩＶ－１ｒｅｖｅｒ
ｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｂｙ４’－ethynyl－２－ｆｌｕｏｒｏ－２’－
ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉphospate，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８４：
３５６８１－３５６９１［２００９］；ＭｉｃｈａｉｌｉｄｉｓＥ，ｅｔａｌ
．，４’－ethynyl－２－ｆｌｕｏｒｏ－２’－ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ（Ｅ
ＦｄＡ）ｉｎｈｉｂｉｔｓＨＩＶ－１ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓ
ｅｗｉｔｈｍｕｌｔｉｐｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ
２８９：２４５３３－２４５４８［２０１４］）。

ｉｎｖｉｔｒｏのＨＩＶ複製アッセイでは、ＥＦｄＡは強力な抗レトロウイルス薬であ
り、評価された全てのサブタイプにわたって臨床分離株に対して同等の抗ウイルス活性を
示す。これは、リンパ系由来細胞株および末梢血単核細胞のいずれにおいても、ｉｎｖ
ｉｔｒｏで速やかに活性三リン酸に同化され、ＥＦｄＡ三リン酸（ＥＦｄＡ－ＴＰ）の細
胞内半減期は７２時間を超える。（Ｓｔｏｄｄａｒｔ，Ｃ．Ａ．，Ｇａｌｋｉｎａ
，ｅｔａｌ．，ＯｒａｌＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＮｕｃ
ｌｅｏｓｉｄｅＥＦｄＡ（４’－エチニル－２－Ｆｌｕｏｒｏ－２’－Ｄｅｏｘｙａ
ｄｅｎｏｓｉｎｅ）ＰｒｏｖｉｄｅｓＲａｐｉｄＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ＨＩＶＶｉｒｅｍｉａｉｎＨｕｍａｎｉｚｅｄＭｉｃｅａｎｄＦａｖｏｒａ
ｂｌｅＰｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｉｎＭｉｃｅａ
ｎｄｔｈｅＲｈｅｓｕｓＭａｃａｑｕｅ，ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２０１５Ｊｕｌ；５９（７）：４１９０－４１９８，オ
ンライン２０１５年５月４日発行）。

ＥＦｄＡは、ヒト化マウスモデルおよびＳＩＶ感染アカゲザルモデルを含むＨＩＶ感染の
動物モデルにおいて有効性を有することが示されている。マウスおよびアカゲザルに経口
投与したＥＦｄＡの薬物動態試験では、速やかな吸収と高い血漿中濃度が示されている。
アカゲザルから分離した末梢血単核細胞は、薬剤投与２４時間後にＳＩＶ感染に不応であ
ったことから、長い細胞内半減期が示された。（同書）

ＥＦｄＡを含む４’－エチニルヌクレオシド類似体の従来の合成は、エチニルデオキシリ
ボ－ス糖と２－フルオロアデニン（２－フルオロ－９Ｈ－プリン－６－アミンとも呼ばれ
る）ヌクレオ塩基との間のＣ－Ｎ結合の形成における低い立体選択性に悩まされている。
従来の合成では、合成効率を低下させるグリコシル化反応を行うために保護基も必要であ
る。

（ＫｅｉＦｕｋｕｙａｍａ，ｅｔａｌ．，ＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＥＦｄ
ＡｖｉａａＤｉａｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅＡｌｄｏｌＲｅａｃｔｉｏ
ｎｏｆａＰｒｏｔｅｃｔｅｄ３－ＫｅｔｏＦｕｒａｎｏｓｅ，Ｏｒｇａｎｉ
ｃＬｅｔｔｅｒｓ２０１５，１７（４），ｐｐ．８２８－８３１；ＤＯＩ：
１０．１０２１／ｏｌ５０３６５３５）に記載されている合成は、ジアステレオ選択的
反応を用いて３つの立体中心を設定する、Ｄ－グルコ－スジアセトニドからの１４工程合
成である。アノマ－中心の立体化学は、続いて加水分解と脱酸素によって除去される２′
－アセトキシ配向基をもつことによって制御される。この経路には４回のクロマトグラフ
ィ－による精製と、後期脱酸素に有毒な有機スズ試薬の化学量論的使用が必要である。

別の経路（ＭａｒｋＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，ｅｔａｌ．，Ｅｎａｎｔｉｏｓｅ
ｌｅｃｔｉｖｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ４′－ethyny.－２－ｆｌｕｏｒｏ－２′
－ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ（ＥＦｄＡ）ｖｉａＥｎｚｙｍａｔｉｃＤｅｓ
ｙｍｍｅｔｒｉｚａｔｉｏｎ，ＯｒｇａｎｉｃＬｅｔｔｅｒｓ２０１７，１９
（４），ｐｐ．９２６－９２９参照）では、酵素による非対称化により立体選択的に
完全置換４′カルビノ－ルが生成される。３’－立体中心は触媒的不斉移動水素化で設定
され、アノマ－１’－結合は基質制御を用いて適度な立体選択性で確立され、立体化学的
純度の向上は中間体の結晶化により達成される。この過程には１５工程を要し、保護基の
使用が必要であり、低立体選択性（１．８：１）でヌクレオ塩基と糖断片の間のグリコシ
ル結合を生成する。

Ｒ－グリセルアルデヒドアセトニドからＥＦｄＡを製造するための１２工程の合成が、Ｋ
ａｇｅｙａｍａ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＣｏｎｃｉｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏ
ｆｔｈｅＡｎｔｉ－ＨＩＶＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅＥＦｄＡ，Ｂｉｏｓｃｉ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１２，７６，ｐｐ．１２１９
ー１２２５；およびＥｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅＴｏｔａｌＳｙｎｔｈ
ｅｓｉｓｏｆｔｈｅＰｏｔｅｎｔＡｎｔｉ－ＨＩＶＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅＥ
ＦｄＡ，ＭａｓａｙｕｋｉＫａｇｅｙａｍａ，ｅｔａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｌｅｔｔｅｒｓ２０１１１３（１９），ｐｐ．５２６４－５２６６［ＤＯＩ
：１０．１０２１／ｏｌ２０２１１６ｋ］に記載されている。この合成はキラルな出発
物質を用いて、中程度のジアステレオ選択性をもつ３’立体中心を設定する。立体異性体
をクロマトグラフィ－で分離した後、新しい立体中心を用いてジアステレオ選択的アルキ
ン付加を誘導し、完全置換４′－立体中心を設定する。アノマ－１′－位は立体制御が少
なく、アノマ－を分離するにはクロマトグラフィ－が必要である。この経路では、二つの
異なる段階でジアステレオ異性体をクロマトグラフィ－で分離する必要があり、高価なキ
ラル出発物質から出発する。

Ｋｏｈｇｏ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ，ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＳｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄＡｎｔｉ－ＨＩＶＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆ４′－Ｃ－Ｃｙ
ａｎｏ－ａｎｄ４′－Ｃ－ethynyl－２′－ｄｅｏｘｙＰｕｒｉｎｅＮｕｃｌｅ
ｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＮｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，２００４，２３，ｐｐ．６７１－６９０［ＤＯＩ：
１０．１０８１／ＮＣＮ－１２００３７５０８］は、既存のヌクレオシドから開始し、
糖部分およびヌクレオ塩基部分の両方を修飾する合成経路を記載している。２－アミノ－
２′－デオキシアデノシンから始まる１８工程の合成で、全収率は２．５％と低い。

プリンヌクレオシドホスホリラ－ゼ（ＰＮＰ、ＥＣ２．４．２．１）のような酵素は、
高い立体選択性で、保護基を使用せずに、ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体中でグ
リコシル結合を形成できることが知られている。例えば、総説ＮｅｗＴｒｅｎｄｓｉ
ｎＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｋｈａｉｌｏｐｕｌ
ｏ，Ｉ．Ａ．，Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖ，Ａ．Ｉ，．ＡｃｔａＮａｔｕｒａｅ
２０１０，２，ｐｐ．３６－５８．を参照。しかし、ＰＮＰによって触媒される
反応を受けることができる糖断片の現在の範囲は、天然リボ－スおよびデオキシリボ－ス
のα－１－リン酸体とＣ２’およびＣ３’位置における小さなＨ、ＮＨ_２、またはＦ置換
基およびＣ５’ ＯＨ基の置換体を有する少数の類似体に限定されている。環上に炭素置
換基をもつ糖、あるいはＣ４’位に何らかの置換を用いるＰＮＰによって触媒されるグリ
コシル化に成功した報告はない。

ＰＮＰ触媒グリコシル化のためのリボ－スおよびデオキシリボ－スα－１－リン酸基質へ
のアクセスは、酵素ホスホペントムタ－ゼ（ＰＰＭ、ＥＣ５．４．２．７）による５’
－ヒドロキシル位から１’－ヒドロキシル位へのリン酸基の移動によって示されている（
Ｍｉｋｈａｉｌｏｐｕｌｏ、Ｉ．Ａ．前出参照）。しかし、この反応を触媒することがで
きる糖の範囲は、リボ－ス、アラビノ－ス、２－デオキシリボ－ス、および２，３－ジデ
オキシリボ－スに限定されている。他の置換基を含む糖リン酸との反応に成功した例は報
告されていない。

デオキシリボ－スリン酸アルドラ－ゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）酵素は、他の
短鎖アルデヒドへのアセトアルデヒドのアルド－ル付加を触媒することが知られている（
総説：ＳｔｅｐｈｅｎＭ．Ｄｅａｎ，ｅｔａｌ．，ＲｅｃｅｎｔＡｄｖａ
ｎｃｅｓｉｎＡｌｄｏｌａｓｅ－Ｃａｔａｌ－Ｃａｔｈ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａ
ｌ．２００７，３４９，ｐｐ．１３０８－１３２０；ＤＯＩ：１０．１
００２／ａｄｓｃ．２００７００１１５を参照）。しかし、アルデヒドへの完全置換炭素
αを有するアルデヒドでの例は報告されていない。

米国特許７，２２９，７９７号は、プリンヌクレオシドホスホリラ－ゼ（ＰＮＰ）の使用
により、さらにスクロ－スホスホリラ－ゼのような酵素を使用して無機リン酸副生成物を
除去し、平衡を駆動することにより、天然の非置換デオキシリボ－ス１－リン酸からデオ
キシリボヌクレオシドを生成することを記載している。当文献は、非天然の４－エチニル
Ｄ－２－デオキシリボ－ス１－リン酸からヌクレオシドを生成することができるＰＮＰ酵
素の創製のための酵素工学を開示しておらず、また、ＰＰＭおよびＤＥＲＡ酵素の工学を
介して、非天然の基質に作用するために、４－エチニルＤ－２－デオキシリボ－ス１－リ
ン酸を生成することができるＰＮＰ酵素も開示していない。

米国特許第７，３３９，０５３号米国特許７，２２９，７９７号

Ｋａｗａｍｏｔｏ、Ｅ．、ＳａｒａｆｉａｎｏｓＳ．Ｆ．ｅｔａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．；４０（１１）：２４１０－２０［２００８］；Ｏｈｒｕｉ、Ｈ．、Ｈ．ｅｔａｌ．、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ、２６，１５４３－１５４６［２００７］）Ｈａｔｔｏｒｉ、Ｓ．、Ｋ．、Ｎａｋａｔａ、Ｈ．ｅｔａｌ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，５３，３８８７－３８９３［２００９］ＭｉｃｈａｉｌｉｄｉｓＥ，ｅｔａｌ．，ＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＨＩＶ－１ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｂｙ４’－ethynyl－２－ｆｌｕｏｒｏ－２’－ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒiphosphate，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８４：３５６８１－３５６９１［２００９］ＭｉｃｈａｉｌｉｄｉｓＥ，ｅｔａｌ．，４’－エチニル－２－ｆｌｕｏｒｏ－２’－ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ（ＥＦｄＡ）ｉｎｈｉｂｉｔｓＨＩＶ－１ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｗｉｔｈｍｕｌｔｉｐｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８９：２４５３３－２４５４８［２０１４］）Ｓｔｏｄｄａｒｔ，Ｃ．Ａ．，Ｇａｌｋｉｎａ，ｅｔａｌ．，ＯｒａｌＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅＥＦｄＡ（４’－ethynyl－２－Ｆｌｕｏｒｏ－２’－Ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ）ＰｒｏｖｉｄｅｓＲａｐｉｄＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＩＶＶｉｒｅｍｉａｉｎＨｕｍａｎｉｚｅｄＭｉｃｅａｎｄＦａｖｏｒａｂｌｅＰｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｉｎＭｉｃｅａｎｄｔｈｅＲｈｅｓｕｓＭａｃａｑｕｅ，ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ，２０１５Ｊｕｌ；５９（７）：４１９０－４１９８，オンライン２０１５年５月４日発行ＫｅｉＦｕｋｕｙａｍａ，ｅｔａｌ．，ＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＥＦｄＡｖｉａａＤｉａｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅＡｌｄｏｌＲｅａｃｔｉｏｎｏｆａＰｒｏｔｅｃｔｅｄ３－ＫｅｔｏＦｕｒａｎｏｓｅ，ＯｒｇａｎｉｃＬｅｔｔｅｒｓ２０１５，１７（４），ｐｐ．８２８－８３１；ＤＯＩ：１０．１０２１／ｏｌ５０３６５３５ＭａｒｋＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，ｅｔａｌ．，ＥｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ４′－ethynyl－２－ｆｌｕｏｒｏ－２′－ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ（ＥＦｄＡ）ｖｉａＥｎｚｙｍａｔｉｃＤｅｓｙｍｍｅｔｒｉｚａｔｉｏｎ，ＯｒｇａｎｉｃＬｅｔｔｅｒｓ２０１７，１９（４），ｐｐ．９２６－９２９Ｋａｇｅｙａｍａ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＣｏｎｃｉｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔｈｅＡｎｔｉ－ＨＩＶＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅＥＦｄＡ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１２，７６，ｐｐ．１２１９ー１２２５ＥｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅＴｏｔａｌＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔｈｅＰｏｔｅｎｔＡｎｔｉ－ＨＩＶＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅＥＦｄＡ，ＭａｓａｙｕｋｉＫａｇｅｙａｍａ，ｅｔａｌ．，ＯｒｇａｎｉｃＬｅｔｔｅｒｓ２０１１１３（１９），ｐｐ．５２６４－５２６６［ＤＯＩ：１０．１０２１／ｏｌ２０２１１６ｋ］Ｋｏｈｇｏ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ，ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄＡｎｔｉ－ＨＩＶＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆ４′－Ｃ－Ｃｙａｎｏ－ａｎｄ４′－Ｃ－ethynyel－２′－ｄｅｏｘｙＰｕｒｉｎｅＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，２００４，２３，ｐｐ．６７１－６９０［ＤＯＩ：１０．１０８１／ＮＣＮ－１２００３７５０８］ＮｅｗＴｒｅｎｄｓｉｎＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｋｈａｉｌｏｐｕｌｏ，Ｉ．Ａ．，Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖ，Ａ．Ｉ，．ＡｃｔａＮａｔｕｒａｅ２０１０，２，ｐｐ．３６－５８．ＳｔｅｐｈｅｎＭ．Ｄｅａｎ，ｅｔａｌ．，ＲｅｃｅｎｔＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｌｄｏｌａｓｅ－Ｃａｔａｌ－Ｃａｔｈ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２００７，３４９，ｐｐ．１３０８－１３２０；ＤＯＩ：１０．１００２／ａｄｓｃ．２００７００１１５

４’－エチニルヌクレオシド類似体を製造するために現在までに開発された困難で長時間
の合成オプションを考慮すると、プロセス工程の数を減らし、保護基の使用を最小限にし
、グリコシル化の立体選択性を改善し、毒性物質の使用を回避する、ＥＦｄＡのような４
’－エチニルヌクレオシド類似体のための改良された酵素合成を開発することが望ましい
であろう。

発明を解決するための手段

驚くべきことに、ＰＰＭ酵素はリボ－ス上の４’位にある３－原子エチニル置換基に活性
を有し、当該酵素に突然変異を導入することにより、ＰＰＭ酵素活性を改善し、ＰＰＭに
よって触媒された４－エチニルＤ－２－デオキシリボ－ス５－リン酸（６．）の異性化反
応を成功裏に開発することができ、より効率的な４’－エチニル２－デオキシヌクレオシ
ドの産生方法が可能となることが見いだされた。

さらに、ＰＮＰエンザイムは、デオキシリボ－ス上の４位にある３原子エチニル置換基に
活性を有しており、当該酵素に突然変異を導入することにより、ＰＰＭ酵素活性を改善し
、ＰＰＭによって触媒された糖修飾反応を改善し、より効率的な４’－エチニル２－デオ
キシヌクレオシドの産生方法が可能となることも見いだされた。

全体的な合成方法への更なる改良は、ＤＥＲＡ酵素、特にＳｈｅｗａｎｅｌｌａｈａｌ
ｉｆａｘｅｎｓｉｓ由来のＤＥＲＡが、完全置換α－炭素を有する２－エチニル－グリセ
ルアルデヒド３－リン酸とのアルド－ル反応の活性を有するという知見からもたらされた
。この発見は、例えばＥＦｄＡを含む４’－エチニル２’－デオキシヌクレオシド類似体
の前駆体である４－エチニルＤ－２－デオキシリボ－ス５－リン酸の効率的な合成を可能
にした。

発明の概要

本発明は、中間体上の保護基の使用を排除し、グリコシル化の立体選択性を改善し、他の
プロセス改善の中でもとりわけ、以前の方法と比較して前記化合物を作製するために必要
とされるプロセス工程の数を大幅に減少させる、ＥＦｄＡを含む、４’－エチニル２’－
デオキシヌクレオシド類似体の新規な酵素合成における操作された酵素の使用を含む。本
発明は更に、酵素プロセスの不可欠な部分である新規中間体に関するものである。

全体的なプロセスは、以下の反応式１および反応式２に要約される。後者の反応式は、化
合物５を作製するための代替的な方法を提供する。

リン酸中間体の酸形態または塩が、本明細書に記載されるプロセスにおいて使用すること
ができ、本明細書のプロセス段階の例示で提供される特定の酸形態または塩形態に限定さ
れるものではない。本明細書に記載される全てのリン酸中間体について、２Ｘ^＋は、２つ
のプロトン、１つのプロトンと１つの他の一価のカチオン、２つの一価のカチオン（同一
または異なる）または１つの二価のカチオンの任意の組み合わせを表す。

^{同様に、－ＨＯ} _３ ^{ＰＯで示されたリン酸中間体は、２つのプロトン、１つのプロトンと１}
^{つの他の一価のカチオン、２つの一価のカチオン（同一または異なった）または１つの二}
^{価のカチオンの任意の組合せを有することができる。例としては、カルシウム、マグネシ}
^{ウム、または亜鉛の塩；モノまたはジナトリウム塩、モノまたはジカリウム塩、モノまた}
^{はジリチウム塩；モノまたはジアンモニウム塩；または第一級、第二級または第三級アミ}
^{ンを有する一価または二価の塩が挙げられるが、これらに限定されない。}

当技術分野でよく理解されているように、本明細書中の合成工程においてアルデヒドまた
は水和物として本明細書中に示されるかまたは命名される中間化合物は、本明細書中に記
載される反応において、そのような形態のいずれかの形態またはそのような形態の混合物
で存在し得る。例えば、化合物（４）および（５）は、それぞれ反応式１において水和物
およびアルデヒドとして描かれているが、それぞれが存在する反応段階において、水和物
またはアルデヒド形態またはそれらの混合物として存在することができる。このような形
態の各々は、本明細書の工程内の化合物番号（４）または（５）を参照することによって
包含される。

化合物（３）はアキラルであり、本明細書中では以下のいずれかで示され得る。

化合物（６）は、その環状または開鎖アルデヒドもしくは水和物として、それぞれが存在
する反応段階において、酸またはその塩として存在することができる。

発明の詳細な説明

アノマ－Ｃ－Ｎ結合を有する４－エチニル２－デオキシ核酸及びその類似体

は、ＨＩＶ、ＡＩＤＳおよび関連疾患に対する活性について探求されている。４’－エチ
ニル２’－デオキシヌクレオシドおよびその類似体は、プリンまたはピリミジンヌクレオ
塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル）または修飾プリンまたは
ピリミジンヌクレオ塩基へのアノマ－Ｃ－Ｎ結合を介して結合した４’－エチニル２’－
デオキシリボ－スを含む。

４－エチニル２’－デオキシヌクレオシド類似体、例えばＥＦｄＡは、４－エチニルＤ－
２－デオキシリボ－ス５－リン酸（６）と２つの酵素、ホスホペントムタ－ゼ（ＰＰＭ）
［例えば、配列番号：８。但しこれに限定されない］およびプリンヌクレオシドホスホ
リラ－ゼ（ＰＮＰ）［例えば、配列番号：９、配列番号：１５］とを組み合わせること
により、最終段階のワンポット法を用いて合成できることが、反応式２に示されている。

反応式２に示すように、合成の最終段階では、（３番目の酵素を用いてもよい）２酵素反
応を用いて、反応の平衡を目的の最終生成物に向かわせる。最終段階は、化合物（６）ま
たはその塩で始まり、ここで（６）は、上記のような環状の４－エチニル２－デオキシリ
ボ－ス５－リン酸またはその開鎖アルデヒドもしくは水和物の形態である。

化合物（６）は、マンガン（ＩＩ）塩を含み適宜ｐＨ約６．５～８．０、またはそれ以上
、特に約７．０～７．５の範囲に調整された緩衝溶液中で、ホスホペントムタ－ゼ（ＰＰ
Ｍ）、プリンヌクレオシドホスホリラ－ゼ（ＰＮＰ）、スクロ－スホスホリラ－ゼ、スク
ロ－ス、および非置換または置換アデニンなどのヌクレオ塩基と組み合わせられる。ショ
糖：化合物（６）のモル比は、約１：１から４：１までであり得るが、これに限定されな
い。このワンポット反応の成分は、任意の順序で組み合わせることができる。

反応は、酵素を変性させない温度範囲内、例えば約３０～４５℃で撹拌し、より詳細には
約３５～４５℃で撹拌する。ある程度までは、より冷たい温度で反応することがあるが、
反応速度を遅くするであろう。

適切なｐＨを有し、マンガン（ＩＩ）塩を含有する任意の緩衝液が、反応において使用さ
れ得る。このような緩衝剤の例としては、トリエタノ－ルアミン；ＰＩＰＥＳ、例えば
、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）；ＭＯＰＳ、例えば、３－（
Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸または３－モルホリノプロパン－１－スルホン酸；
ＨＥＰＥＳ、例えば、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン
酸または２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸
；ＴＲＩＳ、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまたは２－アミノ－２
－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオ－ル；およびＢＩＳ－ＴＲＩＳメタン、
例えば、２－［ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－（ヒドロキシメチル）プロ
パン－１，３ジオ－ルである。特に、緩衝液はトリエタノ－ルアミンである。緩衝剤中の
マンガン（ＩＩ）塩分は、例えば、塩化マンガン、塩化マンガン水和物、臭化マンガン、
ヨウ化マンガン、硝酸マンガン、および／または硫酸マンガンなどである。緩衝液中のマ
ンガン濃度は約０．０５ｍＭ～約１０ｍＭの範囲にあり、特に約５ｍＭである。

平衡反応は、スクロ－スをＤ－フルクト－スとα－Ｄ－グルコ－ス－１－リン酸にリン酸
化分解することによって、副生成物である無機リン酸塩を消費することによって最終生成
物の高い変換に前進させることができる。これは、反応混合物に添加されたスクロ－スホ
スホリラ－ゼ（ＥＣ２．４．１．７）によって触媒される。しかし、スクロ－スホスホ
リラ－ゼおよびスクロ－スを用いる代わりに、リン酸塩を除去するための他の任意の選択
肢、例えば、反応へのカルシウム、マグネシウム、またはマンガンの添加を用いてリン酸
塩を沈殿させることができる。この非常に効率的で生態に優しい過程は、保護基や有機溶
媒を使わずに非常に高い立体選択性で糖とヌクレオ塩基との間にアノマ－結合を形成し、
ワンポット反応として行うことができるという利点がある。

一旦反応が完了すると、最終生成物の結晶化による単離および濾過による収集、または適
当な溶媒への抽出後の結晶化など、限定されるわけではないが、当業者に知られている標
準的な手順を用いて、最終生成物を単離することができる。

反応式２Ａに示すように、合成の最終段階では、（第４の酵素を用いてもよい）３酵素反
応を用いて、反応の均衡を所望の最終生成物に向かって駆動することができる。最終段階
は化合物（５）またはその塩で始まり、ここで（５）は（Ｒ）－２－エチニルグリセルア
ルデヒド３－リン酸またはその水和物の形態である。

化合物（５）は、マンガン（ＩＩ）塩を含み適宜ｐＨを約４～１０の範囲、または特に約
６．５～８．０、またはそれ以上、特に約７．０～７．５の範囲に調整された緩衝溶液中
で、デオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼ（ＤＥＲＡ）、アセトアルデヒド、ホスホペ
ントムタ－ゼ（ＰＰＭ）、プリンヌクレオシドホスホリラ－ゼ（ＰＮＰ）、スクロ－スホ
スホリラ－ゼ、スクロ－ス、およびそれらのヌクレオ塩基または類似体、例えば非置換ま
たは置換アデニンと組み合わせられる。ショ糖：化合物（５）のモル比は、約１：１から
４：１までであり得るが、これに限定されない。このワンポット反応の成分は、任意の順
序で組み合わせることができる。

反応は、酵素を変性させない温度範囲内、例えば、約３０～４５℃、または特に約３５～
４５℃で行われる。ある程度までは、より冷たい温度が働くことがあるが、反応速度を遅
くするであろう。

アセトアルデヒドを溶液として加え、特に、イソプロピルアルコ－ル中の４０重量％溶液
として加える。反応には、アセトアルデヒドまたはニ－ト（ｎｅａｔ）アセトアルデヒド
の任意の適当な溶液を用いることができる。このような溶液の例としては、イソプロパノ
－ル中のアセトアルデヒド溶液、エタノ－ル中のアセトアルデヒド溶液、水中のアセトア
ルデヒド溶液、ＴＨＦ中のアセトアルデヒド溶液が挙げられるが、これらに限定されない
。アルデヒド：化合物（５）のモル比は、限定されるわけではないが、約０．５：１～４
：１、より詳細には１．５：１とすることができる。

適切なｐＨを有し、マンガン（ＩＩ）塩を含有する任意の緩衝液が、反応において使用さ
れ得る。このような緩衝剤の例としては、トリエタノ－ルアミン；ＰＩＰＥＳ、例えば
、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）；ＭＯＰＳ、例えば、３－（
Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸または３－モルホリノプロパン－１－スルホン酸；
ＨＥＰＥＳ、例えば、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン
酸または２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸
；ＴＲＩＳ、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまたは２－アミノ－２
－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオ－ル；およびＢＩＳ－ＴＲＩＳメタン、
例えば、２－［ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－（ヒドロキシメチル）プロ
パン－１，３－ジオ－ルが含まれる。特に、緩衝液はトリエタノ－ルアミンである。緩衝
剤中のマンガン（ＩＩ）塩分は、例えば、塩化マンガン、塩化マンガン水和物、臭化マン
ガン、ヨウ化マンガン、硝酸マンガン、および／または硫酸マンガンなどである。緩衝液
中のマンガン濃度は約０．０５ｍＭ～約１０ｍＭの範囲にあり、特に約５ｍＭである。

平衡反応は、スクロ－スをＤ－フルクト－スとα－Ｄ－グルコ－ス－１－リン酸にリン酸
化分解することによって、副生成物である無機リン酸塩を消費することによって最終生成
物の高い変換に前進させることができる。これは、反応混合物に添加されたスクロ－スホ
スホリラ－ゼ（ＥＣ２．４．１．７）によって触媒される。しかし、スクロ－スホスホ
リラ－ゼおよびスクロ－スを用いる代わりに、リン酸塩を除去するための他の任意の選択
肢、例えば、反応へのカルシウム、マグネシウム、またはマンガンの添加を用いて、リン
酸塩を沈殿させることができる。この非常に効率的で生態に優しい過程は、保護基や有機
溶媒を使わずに非常に高い立体選択性で糖とヌクレオ塩基との間にアノマ－結合を形成し
、ワンポット反応として行うことができるという利点がある。

最終生成物４’－エチニル２’－デオキシヌクレオシドおよびその類似体の合成のための
本工程で使用されるいくつかの上流中間体も、反応式３（反応式３Ａおよび反応式３Ｂ）
に示すような酵素反応法を用いて製造される。

化合物４：オキシダ－ゼ反応

反応式３に示すように、（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド（４）は、ガラクト－
スオキシダ－ゼと２－エチニルプロパン－１，２，３－トリオ－ル（３）とを、ｐＨが約
３～１０、あるいはそれ以上、特に約６～８の範囲になるように適宜調整した緩衝液中で
反応させて調製する。適当なｐＨ範囲を有する任意の緩衝液、例えば、リン酸ナトリウム
；酢酸ナトリウム；ＰＩＰＥＳ、例えば、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンス
ルホン酸）；ＭＯＰＳ、例えば３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸または３－
ピペラジンエタンスルホン酸；ＨＥＰＥＳ、例えば４－（２－ヒドロキシエチル）－１
－ピペラジンスルホン酸または２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イ
ル］エタンスルホン酸；ＴＲＩＳ、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
または２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオ－ル；およびＴＲ
ＩＳメタン、例えば２－［ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－（ヒドロキシメ
チル）プロパン－１，３－ジオ－ル；ホウ酸；ＣＡＰＳ、例えばＮ－シクロヘキシル－
３－アミノプロパンスルホン酸；ＭＥＳ、例えば２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホ
ン酸；ＣＨＥＳ、例えば、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸、グリシ
ン、またはビシン（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）；リン酸ナトリウ
ムが好ましい。

銅とペルオキシダ－ゼは両方ともガラクト－スオキシダ－ゼ（ＧＯａｓｅ）を活性化する
反応に使われる。銅はＣｕＳＯ_４、Ｃｕ（ＯＡｃ）_２、ＣｕＣｌ_２、Ｃｕ（ＩＩ）または
Ｃｕ（Ｉ）の他の塩を加えることによって反応混合物に供給される。ペルオキシダ－ゼは
西洋ワサビペルオキシダ－ゼ、または他の生物に由来するペルオキシダ－ゼであってもよ
いし、フェリシアニド、イリデ－ト、マンガン（ＩＩＩ）塩、過硫酸塩および他の１つま
たは２つの電子酸化剤、または無機または有機酸化剤などの酸化剤によって置換すること
ができる。好ましくは、ペルオキシダ－ゼは西洋ワサビペルオキシダ－ゼである。ＧＯａ
ｓｅの不活性化を防ぐためにカタラ－ゼも加えられる。カタラ－ゼは、哺乳動物源（ウシ
）から、またはコリネバクテリウム、アスペルギルス、またはこの目的のために当該技術
分野で知られている他の生物などの細菌または真菌源からのものであり得る。

反応は酸素の存在下で進行する。１つの便利な方法は、空気との反応をスパ－ジ（ｓｐａ
ｒｇｅ）することである。あるいは、過酸化水素／カタラ－ゼ、ス－パ－オキシド、また
はこの目的のための当該分野で公知の他の方法の使用などの、酸素を生成するための他の
システムを使用することができる。

反応は、基質濃度が１０～１８０ｇ／Ｌ程度、特に２０～５０ｇ／Ｌ程度で行うことがで
きる。この反応は約０～４０℃、特に約１０～３０℃の温度で行うことができる。

化合物８：アミナ－ル生成

反応式３Ａに例示されるように、（Ｒ）－２－エチニル－グリセルアルデヒド（４）は、
それを、安定なＮ，Ｎ－アセタ－ルまたはＮ，Ｏ－アセタ－ルを形成する任意のアミン、
ジアミンまたはアミノアルコ－ル、例えば、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエタン－１，２－ジア
ミン、Ｎ，Ｎ’－ジメチルエタン－１，２－ジアミン、Ｎ，Ｎ’－ジフェニルエタン－１
，２－ジアミン、およびＮ－ベンジルエタノ－ルアミンと反応させることによって、その
アミン形態（例えば、化合物８）で単離することができるが、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエタ
ン－１，２－ジアミンが好ましい。反応は、アミナ－ルの分解を避けるために、有機溶媒
中、約５０℃以下、好ましくは２０～３０℃の温度で行われる。水と混和しない任意の溶
媒、例えば、ＭＴＢＥ、２－ＭｅＴＨＦ、ＣＰＭＥ、ジエチルエ－テル、ジイソプロピル
エ－テル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、トルエン、ＤＣＭ、またはこれらの混合物を
用いることができるが、これらに限定されない。反応は、基質濃度が１０～１００ｇ／Ｌ
程度、特に２０～５０ｇ／Ｌ程度で行うことができる。

任意に、有機溶媒、例えばＭＴＢＥ、２－ＭｅＴＨＦ、ＣＰＭＥ、ジエチルエ－テル、ジ
イソプロピルエ－テル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、トルエン、ＤＣＭまたはこれら
の混合物から結晶化することによりアミナ－ルをさらに精製することができ、ＭＴＢＥが
好ましい。結晶化はアミナ－ルの分解を避けるために、例えば約４０℃で５０℃以下で行
われる。

反応は酸素不在で進行する。１つの簡便な方法は、Ｎ_２による反応の注入撹拌（ｓｐａｒ
ｇｅ）である。あるいは、アルゴン、ヘリウム、またはこのために当技術分野で知られて
いる他の方法の使用のような、酸素を排除するための他のシステムを使用することができ
る。

化合物４：アミナ－ル８からのアルデヒド４の再生

（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド（４）は、アミナ－ルの分解を避けるために、
水と混和しない有機溶媒の存在下、５０℃以下の温度、例えば約０～１５℃で、有機また
は無機酸と反応させることによって、それぞれのアミナ－ルから再生することができる。
任意の有機酸または無機酸、例えば、ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、カン
ホレスルホン酸、酢酸、塩酸、リン酸、硫酸が使用され得るが、これらに限定されない。
Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエタン－１，２－ジアミンビスｐ－トルエンスルホン酸塩の水への
溶解度が低いため、アミナ－ル８との反応ではｐ－トルエンスルホン酸が好ましい。水と
混和しない任意の溶媒、例えば、ＭＴＢＥ、２－ＭｅＴＨＦ、ＣＰＭＥ、ジエチルエ－テ
ル、ジイソプロピルエ－テル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、トルエン、ＤＣＭまたは
これらの混合物；ＭＴＢＥおよび２－ＭｅＴＨＦが好ましい。反応は、約５～１００ｇ／
Ｌ、特に２０～５０ｇ／Ｌの基質濃度で行うことができる。

任意に、アルデヒド４溶液を樹脂でさらに処理して、過剰の有機酸または無機酸を除去す
ることができる。樹脂処理は、ＤＯＷＥＸ（商標）ＭＡＲＡＴＨＯＮ（商標）Ａ樹脂
（水酸化物型）やＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（登録商標）１５樹脂（水素型）などの塩基性樹
脂、またはその混合物、望ましくはＤＯＷＥＸ（商標）ＭＡＲＡＴＨＯＮ（商標）Ａ
樹脂（水酸化物型）とＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（登録商標）１５樹脂の混合物で行うことが
できる。

任意に、アルデヒド４溶液を真空下でさらに蒸発させるか、またはガスで掃引して、過剰
の有機溶媒を除去することができる。

化合物５：キナ－ゼ反応

図式３および図式３Ａに示すように、（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３－リン
酸水和物（５）は、大腸菌由来のパントテン酸キナ－ゼ（ＰａｎＫ）野生型またはその変
種を、適宜約４～１０の範囲、好ましくは約６．５～８．５、より好ましくは５．５～８
．５のｐＨに調整した緩衝溶液中において、化合物（４）と反応させることにより調製さ
れる。適当なｐＨ範囲を有する緩衝剤が使用でき、例えば（但し、これらに限定されるも
のではない）、リン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳ、例えば、ピペラジン－Ｎ，Ｎ′－ビス（
２－エタンスルホン酸）；Ｂｉｓ－ＴＲＩＳメタン、例えば、２－［ビス（２－ヒドロキ
シエチル）アミノ］－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオ－ル；ホウ酸塩
、ＨＥＰＥＳ、例えば、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンスルホン酸又は
２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸；トリエ
タノ－ルアミンおよびＴＲＩＳ、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまた
は２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオ－ルが使用でき、リン
酸ナトリウムが好ましい。例えば、リン酸ナトリウムが好ましい。反応は、任意の適切な
２価金属塩、例えば、マグネシウム塩、例えば塩化マグネシウム、およびコバルト、マン
ガン、亜鉛またはカルシウムの塩の存在下で行うことができるが、これらに限定されない
。

この反応は、５’－三リン酸（ＡＴＰ）への再生を必要とするリン酸源としてアデノシン
５’－二リン酸（ＡＤＰ）を利用する。ＡＴＰはその場で生成され、その後、ＡＤＰ、ア
デノシン５’－一リン酸（ＡＭＰ）またはアデノシンから公知の任意の方法によって再生
され得る。たとえば、アセチルリン酸と酢酸キナ－ゼの組合せは、ＡＤＰをＡＴＰに再生
するのに用いることができる。たとえば、ピルビン酸、リン酸、酸素の存在下では、ピル
ビン酸オキシダ－ゼとカタラ－ゼの組合せがアセチルリン酸を生成するので、酢酸キナ－
ゼの存在下でＡＤＰをＡＴＰに再生するのに用いることができる。

反応は、約１０～１００ｇ／Ｌ、特に約２０～４０ｇ／Ｌの基質濃度で行うことができる
。この反応は約０～４０℃、特に約１０～２５℃の温度で行うことができる。

反応は、樹脂に固定したパントテン酸キナ－ゼ（ＰａｎＫ）でも、あるいは樹脂に固定し
たＰａｎＫと酢酸キナ－ゼの両方でも行うことができる。当該技術分野で公知の任意の適
切な酵素固定化方法、例えば、固定化金属イオンアフィニティ－クロマトグラフィ－（Ｉ
ＭＡＣ）樹脂、または他の生物学的タグを用いたアフィニティ－樹脂固定化、共価固定化
、イオン樹脂上の固定化、吸着による固定化、カプセル化、および／または架橋酵素を用
いるが、これらに限定されない。例えば、金属イオン親和性クロマトグラフィ－（ＩＭＡ
Ｃ）樹脂を使用することができ、またはＩＭＡＣ樹脂と二価カチオンの任意の適切な組合
せを使用することができ、ここでカチオンは、例えば、ニッケル、コバルト、銅、亜鉛、
鉄、および／またはアルミニウムであり得るが、これらに限定されない。特に、ニッケル
を帯びたＩＭＡＣ樹脂が使用できる。好ましくは、酢酸キナ－ゼおよびパントテン酸キナ
－ゼ（ＰａｎＫ）の両方が樹脂上に固定化される。

化合物９：キナ－ゼ反応

反応式３Ｂに示すように、（Ｓ）－２－エチニルプロパン－１，３－トリオ－ル１－リン
酸（９）は、大腸菌由来のパントテン酸キナ－ゼ（ＰａｎＫ）野生型またはその変種を、
適宜ｐＨ約４～１０の範囲、好ましくは約６．５～８．５、より好ましくは５．５．～８
．５で調整した緩衝溶液中において、化合物（３）と反応させることにより調製される。
適当なｐＨ範囲を有する緩衝剤が使用でき、例えば（但し、これらに限定されるものでは
ない）、リン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳ、例えば、ピペラジン－Ｎ，Ｎ′－ビス（２－エ
タンスルホン酸）；Ｂｉｓ－ＴＲＩＳメタン、例えば、２－［ビス（２－ヒドロキシエチ
ル）アミノ］－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオ－ル；ホウ酸塩、ＨＥ
ＰＥＳ、例えば、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンスルホン酸又は２－［
４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸；とりえたノ－
ルアミンおよびＴＲＩＳ、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまたは２－
アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオ－ルが使用でき、リン酸ナト
リウムが好ましい。例えば、リン酸ナトリウムが好ましい。反応は、任意の適切な二価金
属塩、例えば、マグネシウム塩、例えば塩化マグネシウム、およびコバルト、マンガン、
亜鉛またはカルシウムの塩の存在下で行うことができるが、これらに限定されない。

この反応は、５’－三リン酸（ＡＴＰ）への再生を必要とするリン酸源としてアデノシン
５’－二リン酸（ＡＤＰ）を利用する。ＡＴＰはその場で生成され、その後、ＡＤＰ、ア
デノシン５’－一リン酸（ＡＭＰ）またはアデノシンから公知の任意の方法によって再生
され得る。たとえば、アセチルリン酸と酢酸キナ－ゼの組合せは、ＡＤＰをＡＴＰに再生
するのに用いることができる。代わりに、（ａ）ピルビン酸、リン酸および酸素の存在下
でのピルビン酸オキシダ－ゼ、カタラ－ゼおよび酢酸キナ－ゼの組合せを用いてＡＤＰを
ＡＴＰに再生することができる、または（ｂ）ピルビン酸、リン酸および酢酸キナ－ゼの
存在下でのピルビン酸オキシダ－ゼ、カタラ－ゼおよび酢酸キナ－ゼの組合せと、アセチ
ルリン酸および酢酸キナ－ゼとの組合せを用いて、ＡＤＰからのＡＴＰ再生に用いること
ができる。

化合物５：オキシダ－ゼ反応

反応式３Ｂに示すように、（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド水和物３－リン酸（
５）は、ガラクト－スオキシダ－ゼと（Ｓ）－２－エチニルプロパン－１，２，３－トリ
オ－ル１－リン酸（９）とを、ｐＨを約３～１０、あるいは特に約６～８の範囲に調整し
た緩衝液中で反応させて調製する。適当なｐＨ範囲を有する任意の緩衝液が使用でき、例
えば（但し、これらに限定されるものではない）、リン酸ナトリウム；酢酸ナトリウム；
ＰＩＰＥＳ、例えばピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）；ＭＯＰＳ
、例えば３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸または３－ピペラジンエタンスルホ
ン酸；ＨＥＰＥＳ、例えば４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンスルホン酸
または２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸；
ＴＲＩＳ、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまたは２－アミノ－２－（
ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオ－ル；Ｂｉｓ－ＴＲＩＳメタン、例えば、２
－［ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，
３－ジオ－ル；ホウ酸塩；ＣＡＰＳ、例えば、Ｎ－シクロエキシル－３－アミノプロパン
スルホン酸；グリシン；またはビシン（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン
）；リン酸ナトリウムが使用でき、リン酸ナトリウムが好ましい。

銅とペルオキシダ－ゼは両方ともガラクト－スオキシダ－ゼ（ＧＯａｓｅ）を活性化する
反応に使われる。銅はＣｕＳＯ_４、Ｃｕ（ＯＡｃ）_２、ＣｕＣｌ_２、またはＣｕ（ＩＩ）
もしくはＣｕ（Ｉ）の他の塩を加えることによって反応混合物に供給される。ペルオキシ
ダ－ゼは西洋ワサビペルオキシダ－ゼ、または他の生物に由来するペルオキシダ－ゼであ
ってもよく、フェリシアニド、イリデ－ト、マンガン（ＩＩＩ）塩、過硫酸塩および他の
１つまたは２つの電子酸化剤、または無機または有機酸化剤などの酸化剤によって置換す
ることができる。好ましくは、ペルオキシダ－ゼは西洋ワサビペルオキシダ－ゼである。
ＧＯａｓｅの不活性化を防ぐためにカタラ－ゼも加えられる。カタラ－ゼは、哺乳動物源
（ウシ）から、またはコリネバクテリウム、アスペルギルス、またはこの目的のために当
該技術分野で知られている他の生物などの細菌または真菌源からのものであり得る。

化合物６：デオキシリボ－ス－ホスフェイトアルドラス（ＤＥＲＡ）反応

既知のプロセスよりも化合物（６）を生産するためのこの新しいル－トの重要な利点は、
保護基を使用せずに正しい酸化状態で糖骨格を作り出すことである。

４－エチニルＤ－２－デオキシリボ－ス５－リン酸（６）は、デオキシリボ－ス－リン酸
アルドラ－ゼ（ＤＥＲＡ）と（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３－リン酸（５）
を酸又は塩とし、必要に応じてｐＨを約５～９又はそれ以上、特に約６～８の範囲に調整
した水溶液中のアセトアルデヒドを反応させて調製する。（５）の塩の例には、カルシウ
ム、マグネシウム、亜鉛、モノ－もしくはジ－Ｎａ塩、モノ－もしくはジ－Ｋ塩、または
モノ－もしくはジ－Ｌｉ塩；モノ－もしくはジ－アンモニウムもしくは塩；または第一級
、第二級もしくは第三級アミンを有する一価もしくは二価の塩が含まれるが、これらに限
定されない。反応は開放容器で行うか、またはアセトアルデヒドの蒸発を防ぐため密閉容
器で行うことが望ましい。

反応は約１０～１００ｇ／Ｌ、特に約３０～６０ｇ／Ｌの基質濃度で行うことができる。
約０～４０℃、特に約２５～３５℃の温度で実施することができる。

この反応は緩衝剤なしで行うことができる。或いは、以下の緩衝剤を用いることができる
が、これらに限定されるものではない：トリエタノ－ルアミン；リン酸塩；ＭＯＰＳ、
例えば、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸または３－モルホリノプロパン－１
－スルホン酸；ＨＥＰＥＳ、例えば、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジン
エタンスルホン酸または２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エ
タンスルホン酸；ＢＩＳ－ＴＲＩＳメタン、例えば、２－［ビス（２－ヒドロキシエチ
ル）アミノ］－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオ－ル；ホウ酸塩；Ｐ
ＩＰＥＳ、例えば、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）；ＭＥＳ、
例えば、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸；およびホウ酸塩；または適切なｐＨ
範囲を有し、一級アミン基を有さない他の緩衝剤。

１つ以上の酵素の使用を含む本明細書に記載されるプロセスの各工程および方法は、この
１つ以上の酵素を変性させない温度で実施される。１つ以上の酵素の使用を含む本明細書
に記載のプロセスの各工程および方法は、約３～１０または約４～１０の範囲のｐＨで行
うことができる。

「ヌクレオ塩基」（または「窒素塩基」または「塩基」）は、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの
核酸のピリミジンまたはプリン複素環である。本明細書中で使用される場合、ヌクレオ塩
基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル、ならびに非天然修飾を有
するヌクレオ塩基、例えば、塩基が１つ以上の非天然置換基を有するヌクレオ塩基、また
はアノマ－Ｃ－Ｎ結合への任意の変化を除く塩基におけるヘテロ原子に影響を及ぼす修飾
を含む。

４’－エチニル２’－デオキヌクレオシドはヌクレオ塩基を含む。本明細書中で使用され
る場合、４’－エチニル２’－デオキシヌクレオシドの類似体は、ヌクレオシドの塩基に
対する非天然修飾、例えば、塩基が１つ以上の非天然置換基を有すること、またはアノマ
－Ｃ－Ｎ結合への変換を除く塩基におけるヘテロ原子に影響する修飾を意味する。

本明細書中で使用される場合、「ホスホペントムタ－ゼ」（「ＰＰＭ」）酵素（例えば、
ＥＣ５．４．２．７）は、リボ－ス１－リン酸からリボ－ス５－リン酸への可逆的異性
化およびデオキシリボ－スリン酸およびリボ－スリン酸およびデオキシリボ－スリン酸の
類似体などの関連化合物を触媒する酵素である。

本明細書中で用いる「プリンヌクレオシドホスホリラ－ゼ」（「ＰＮＰ」）酵素（ＥＣ
２．４．２．２）は、プリンリボヌクレオシドおよび関連化合物（例えば、リボヌクレオ
シドおよびデオキシリボヌクレオシドのデオキシリボヌクレオシドおよび類似体）の遊離
プリン塩基およびリボ－ス－１－リン酸（およびその類似体）への可逆的リン酸化を触媒
する酵素である。

本明細書中で使用される場合、「ショ糖ホスホリラ－ゼ」（「ＳＰ」）酵素（ＥＣ２．
４．１．７）は、ショ糖のＤ－フルクト－ス塩基およびグルコ－ス－１－リン酸への可逆
的リン酸化を触媒する酵素である（およびその類似体）。スクロ－スホスホリラ－ゼ（Ｓ
Ｐ）とスクロ－スとの併用は、プリンヌクレオシドホスホリラ－ゼ（ＰＮＰ）およびホス
ホムタ－ゼ（ＰＰＭ）と併用して、反応から遊離リン酸イオンを除去するために用いられ
、ここで、酵素の組合せはヌクレオシドＭＫ－８５９１（ＥＦｄＡ）の形成を触媒するが
、いくつかの実施形態においては、当該技術分野で知られている他の方法で置き換えるこ
とができる。

本明細書中で用いる場合、「デオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼ」（「ＤＥＲＡ」）
（例えば、ＥＣ４．１．２．４）は、可逆的に炭素－炭素結合を切断または生成するリ
ア－ゼのファミリ－中の酵素を指す。本明細書中で使用されるデオキシリボ－ス－リン酸
アルドラ－ゼは、天然に存在する（野生型）デオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼなら
びにヒト操作によって生成される非天然に存在する工学的ポリペプチドを含む。野生型デ
オキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼは、２－デオキシ－Ｄ－リボ－ス５－リン酸からＤ
－グリセルアルデヒド３－リン酸とアセトアルデヒドへの可逆反応を触媒する。

本明細書中で用いる場合、「パントテン酸キナ－ゼ」、（「ＰａｎＫ」）は、天然形でパ
ントテン酸をリン酸化して４’－ホスホパントテン酸を生成する酵素（ＥＣ２．７．１
．３３）を指す。このようなＰａｎＫ酵素に由来する変異体酵素は、そのような変異体が
パントテン酸に対して自然の機能を保持するかどうかにかかわらず、Ｄ－エチニルグリセ
ルアルデヒドの３’ＯＨ－基に対する活性および立体選択性の改善を示す可能性がある。

本明細書で用いる場合、”ガラクト－スオキシダ－ゼ”（”ＧＯａｓｅ”；ＥＣ１．
１．３．９）酵素は銅依存性酵素であり、二分子酸素の存在下では、第一級アルコ－ルの
対応するアルデヒドへの酸化を触媒する。これらは位置特異的にもエナンチオ特異的にも
作用し、官能基保護をほとんど、あるいは全く必要としない合成アプロ－チを可能にし、
所望の立体異性体を生じる。酸化の様式は穏やかであり、活性がアルコ－ルの対応するカ
ルボン酸への過剰酸化を導かないように制御されている。

本明細書中で用いられる場合、「西洋ワサビペルオキシダ－ゼ」（ＨＲＰ、ＥＣ１．１
１．１．７）酵素は、正常なＧＯａｓｅ触媒サイクルの間に生じる活性部位の不活性な酸
化還元状態を酸化することによって、ＧＯａｓｅ触媒活性を活性化し、維持する鉄依存性
酵素である。Ｉ型ＨＲＰは、本明細書に含まれる実施例において触媒様式で使用されるが
、このクラスまたは他の酵素クラスに属する他の電子伝達酵素および同様の役割を果たす
化学化合物を排除することを意図しない。

本明細書中で使用される場合、「カタラ－ゼ」は、ガラクト－スオキシダ－ゼまたはピル
ビン酸オキシダ－ゼ反応の副生成物である過酸化水素に作用するヘム依存性酵素（ＥＣ
１．１１．１．６）を指し、この過酸化水素はガラクト－スオキシダ－ゼまたはピルビン
酸オキシダ－ゼ反応の副生成物であり、これら酵素を一定レベル以上で不活化する。カタ
ラ－ゼは、過酸化水素を水および酸素に変換するために、本明細書の実施例において触媒
維持酵素として使用され、一方、いくつかの実施形態では、過酸化水素の電気化学的分解
などの他の方法で置き換えることができる。ヘム依存性カタラ－ゼは、本明細書に含まれ
る実施例において触媒様式で採用されているが、この役割を果たし得るこのクラスに属す
る他の酵素が存在するので、この役割に限定されることは意味されない。

ここで用いられる場合、「酢酸キナ－ゼ」（「ＡｃＫ」）は、酢酸およびアデノシン三リ
ン酸（ＡＴＰ）からのアセチルリン酸の生成を触媒する酵素（ＥＣ２．７．２．１）を
意味する。逆反応も触媒でき、アセチルリン酸の存在下でアデノシン５’－二リン酸（Ａ
ＤＰ）をアデノシン５’－三リン酸（ＡＴＰ）にリン酸化する。酢酸キナ－ゼは、本明細
書の実施例においてパントテン酸キナ－ゼ（ＰａｎＫ）によって必要とされるＡＴＰをリ
サイクルするために使用されるが、いくつかの実施形態においては、アセチルリン酸酢酸
キナ－ゼリサイクリング組合せは、当該技術分野で知られている他の方法によって置き換
えることができる。

本明細書中で用いる「ピルビン酸オキシダ－ゼ」（「ＰＯ」）は、フラビンアデニンジヌ
クレオチド（ＦＡＤ）およびチアミン二リン酸に依存する酵素（ＥＣ１．２．３．３）
を意味する。ピルビン酸オキシダ－ゼはオキシドレダクタ－ゼファミリ－に属する酵素で
あり、特に酸素を受容体とする供与体のアルデヒド基またはオキソ基に作用し、ピルビン
酸、リン酸イオンと二分子酸素との化学反応を触媒してアセチルリン酸、二酸化炭素およ
び過酸化水素を生成する。ピルビン酸オキシダ－ゼ（ＰＯ）は、本明細書の例において、
酢酸キナ－ゼ（ＡｃＫ）および触媒性ＡＴＰ再生組合せとして、酢酸キナ－ゼ（ＡｃＫ）
およびカタラ－ゼと組み合わせて用いられ、ここで、当該酵素の組合せは、酸素、ピルビ
ン酸およびリン酸イオンの存在下でＡＤＰからＡＴＰの生成を触媒するが、一方、いくつ
かの実施形態においては、それは当技術分野で知られている他の方法で置き換えることが
できる。

本明細書中で使用される「野生型」および「天然に存在する」酵素は、天然中に見出され
る形態を意味する。例えば、野生型ポリペプチド配列とは、自然界の供給源から単離する
ことができ、かつヒトの操作によって意図的に改変されていない生物に存在する配列であ
る。

本明細書中で使用される場合、「操作された」、「変異体」、「突然変異体」および「非
天然に存在する」とは、天然に存在しないであろう方法で改変された、ポリペプチドを含
む酵素、または物質の天然もしくは天然の形態に対応する物質を指す。いくつかの実施形
態において、ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドと同一であるが、合成材料お
よび／または組換え技術を用いる操作によって産生または誘導される。

酵素に関する「配列同一性のパ－センテ－ジ」、「同一性のパ－センテ－ジ」、「同一性
のパ－センテ－ジ」、および「同一性のパ－センテ－ジ」は、本明細書中では、ポリヌク
レオチド配列またはポリペプチド配列間の比較を指して用いられ、比較ウインドウ上の２
つの最適アラインメントされた配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウイ
ンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適ア
ラインメントのための参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含
み得る。パ－センテ－ジは、同一のヌクレオ塩基またはアミノ酸残基のいずれかが両方の
配列で生じる位置の数、またはヌクレオ塩基またはアミノ酸残基がギャップと整列して一
致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較のウインドウにおける位置の総数で除し
、結果に１００を乗じて配列同一性のパ－センテ－ジを生じることによって計算される。
最適アラインメントおよびパ－セント配列同一性の決定は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ
２．０アルゴリズムを用いて行われる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，
１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０およびＡｌｔｓｃ
ｈｕｌｅｔａｌ．，１９７７，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３３８
９－３４０２を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａ
ｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎのウェブサイトを通じて公開されている。

簡潔に言えば、ＢＬＡＳＴ分析は、まず、デ－タベ－スシ－クエンス中の同じ長さの単語
と一致するか、または同じ長さの単語と一致するときにある正値閾値スコアＴを満足する
、問合せシ－クエンス中の長さＷの短い単語を同定することによって、高スコアシ－クエ
ンスペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは近隣単語スコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ
ら、前出）と呼ばれる。これらの最初の近傍単語ヒットは、それらを含むより長いＨＳＰ
を見つけるための探索を開始するためのシ－ドとして作用する。次に、累積アラインメン
トスコアを増加できる限り、各シ－ケンスに沿って両方向に単語ヒットを拡張する。累積
スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメ－タＭ（１対のマッチング残基に対する報
酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチング残基に対するペナルティスコア；常に＜
０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて
累積スコアを算出する。各方向の単語ヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積ア
ラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘによって低下する；累積スコアがゼロまた
はそれ以下になる、１つ以上のマイナススコアの残基アラインメントが蓄積する；または
どちらかのシ－ケンスの末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメ－タＷ、Ｔ、お
よびＸは、位置合わせの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオ
チド配列の場合）では、語長（Ｗ）１１、期待ユ－ロング１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、およ
び両鎖の比較を欠損として使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラム
は、３のワ－ルドレングス（Ｗ）、１０の期待ユ－ロ（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２ス
コアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，
ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９：１０９１５参照）を欠損とし
て使用する。

ＢＬＡＳＴと同様に機能する他の多くのアルゴリズムが、２つのシ－クエンスのパ－セン
ト同一性を提供するために利用できる。比較のための配列の最適アラインメントは、例え
ば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖの局所的相同性アルゴリ
ズム、１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ
ａｎｄＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌの相同性アルゴリズム、Ｐｅａｒｓ
ｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃの類似性検索、アルゴリズム（Ｇ
ＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケ－ジにおけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡ
ＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュ－タ画像または目視検査（一般に、Ｃｕｒｒｅｎ
ｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａ
ｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒ
ｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎＷｉ
ｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９５Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂ
ｅｌ）との共同ベンチャ－を参照）によって、行うことができる。さらに、配列アライン
メントおよびパ－セント配列同一性の決定は、ＧＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケ
－ジ（Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプ
ログラムを使用することができる。この場合、デフォルトパラメ－タを使用する。

「実質的同一性」とは、少なくとも２０残基位置の比較ウィンドウ、しばしば少なくとも
３０～５０残基のウィンドウにわたる参照配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、
８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、
９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたは
ポリペプチド配列であって、比較ウィンドウにわたる参照配列の合計２０パ－セント以下
の欠失または付加を含む配列と比較することによって、配列同一性のパ－センテ－ジが計
算される、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す。ポリペプチドに適用される
具体的な実施形態では、「実質的な同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列が、
デフォルトギャップ重みを用いたプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって、
最適にアラインメントされた場合、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくと
も８９％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９９％
の配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存
的アミノ酸置換によって異なる。

「立体選択性」とは、ある立体異性体が別の立体異性体よりも化学的または酵素的に優先
的に生成することをいう。立体選択性は部分的であり、一方の立体異性体の生成が他方よ
り有利な場合もあれば、一方の立体異性体しか形成されない場合もある。立体異性体がエ
ナンチオマ－である場合、立体選択性はエナンチオ選択性と呼ばれ、両方の合計における
一方のエナンチオマ－の分率（典型的にはパ－センテ－ジとして報告される）である。公
式［メジャ－エナンチオマ－－マイナ－エナンチオマ－］／［メジャ－エナンチオマ－＋
マイナ－エナンチオマ－］に従って計算されたエナンチオマ－過剰（ｅ．）として当該技
術分野で一般的に（典型的にはパ－センテ－ジとして）代替的に報告される。立体異性体
がジアステレオ異性体である場合、立体選択性はジアステレオ選択性と呼ばれ、２つのジ
アステレオマ－の混合物中の１つのジアステレオマ－の割合（典型的にはパ－センテ－ジ
で報告される）であり、一般的にジアステレオマ－過剰（ｄ．ｅ．）として代替的に報告
される。鏡像異性体過剰とジアステレオマ－過剰は立体異性体過剰のタイプである。

語句「適切な反応条件」は、本発明で使用される各ポリペプチドが基質を所望の生成物化
合物に変換することができる酵素変換反応溶液中の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、
温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指す。いくつかの例示的な適当な反応条件が
本明細書に提供される。

本明細書中で使用される場合、酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」は、本明細
書中で使用される操作された酵素によって作用される化合物または分子を指す。

本明細書中で使用される、酵素変換プロセスとの関連における「生成物」とは、基質に対
する酵素ポリペプチドの作用に起因する化合物または分子を意味する。

本明細書中で使用されるように、反応中に存在する特定の成分（例えば、酵素）が、目的
の成分が存在しない場合と比較して、より多くの製品を生成させる場合に、反応からの製
品（例えば、４’－エチニル２’－デオキシリボ－スリン酸類似体または４’－エチニル
２’－デオキシヌクレオシド類似体）の収率を増加させる。

本明細書中で使用される「平衡」または「平衡」とは、化学反応または酵素反応において
化学種の定常状態濃度（例えば、２種のＡおよびＢの相互変換）をもたらす過程を指し、
これには、化学反応または酵素反応の前進速度定数および逆速度定数によって決定される
立体異性体の相互変換が含まれる。

「鏡像異性体過剰」（ｅｅ）は、キラルな物質に用いられる純度の測定値である。これは
、試料中に一方の鏡像異性体が他方の鏡像異性体よりも多く含まれている度合いを反映し
ている。例えば、ラセミ体の混合物は鏡像異性体過剰０％であるが、完全に純粋なエナン
チオマ－が１個の場合はｅ．ｅ．が１００％であり、一方のエナンチオマ－が７０％、他
方のエナンチオマ－が３０％の試料ではｅ．ｅ．が４０％（７０％～３０％）である。ジ
アステレオマ－過剰（ｄｅ）は、混合物中に２つのジアステレオ異性体のみが存在する場
合と同様に計算される。

「タンパク質」、「酵素」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、本明細書中では
、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、１
０ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合によって共有結合した少なくとも２つの
アミノ酸のポリマ－を意味するために互換的に使用される。この定義の中に含まれるもの
は、Ｄ－およびＬ－アミノ酸、ならびにＤ－およびＬ－アミノ酸の混合物である。

ここでいう「約」とは、ある特定の値に対して許容可能な誤差を意味する。ある場合には
、「約」とは、所定の値範囲の下端および上端において０．０５％、０．５％、１．０％
または２．０％以内を意味する。ｐＨに関しては、「約」とは、プラスまたはマイナス０
．５を意味する。

本明細書中で使用される「実質的に純粋な」ポリペプチドまたは「精製された」タンパク
質は、そのポリペプチド種が存在する優勢な種である（すなわち、モルまたは重量ベ－ス
では、組成物中の他の任意の個々の高分子種よりも多い）組成を意味し、一般に、対象種
がモルまたは重量％で存在する高分子種の少なくとも約５０％を含む場合に、実質的に精
製された組成である。しかし、いくつかの実施形態において、ポリペプチドを含む組成物
は、５０％未満の純度のポリペプチドを含む（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、
約４０％、または約５０％）。一般に、実質的に純粋なポリペプチド組成物は、組成物中
に存在する全ての高分子種をモル％または重量％で、約６０％以上、約７０％以上、約８
０％以上、約９０％以上、約９５％以上、および約９８％以上含む。いくつかの実施形態
において、ポリペプチドは、本質的に均一性に精製され（すなわち、汚染種は、従来の検
出方法によって組成物中で検出され得ない）、ここで、組成物は、本質的に単一の高分子
種からなる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、元素イオン種は巨大分子種とは考え
られない。いくつかの実施形態において、単離されたポリペプチドは実質的に純粋なポリ
ペプチド組成物である。

本明細書中で使用される場合、酵素の「改善された特性」は、酵素の少なくとも１つの改
善された特性を指す。いくつかの実施形態において、本発明は、それぞれ、参照ＰＰＭ、
ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰまたはＧＯａｓｅポリペプチド、および／ま
たはそれぞれ野生型ＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰまたはＧＯａｓ
ｅポリペプチド、および／またはそれぞれ、他の改変されたＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、
ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰまたはＧＯａｓｅポリペプチドと比較していずれかの酵素特性の
改善を示す組換えＰＰＭ、ＰＮＰ，ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰおよび／またはＧ
Ｏａｓｅポリパプチドを利用する。したがって、「改良」のレベルを決定し、野生型を含
む種々のポリペプチドならびに操作されたポリペプチド間で比較することができる。改良
された特性には、タンパク質発現の増加、意図された産物の産生の増加、基質特異性また
は親和性の増加（すなわち、基質に対する活性の増加）、熱活性の増加、熱安定性、ｐＨ
活性の増加、安定性の増加、酵素活性の増加、比活性の増加、基質または最終産物阻害に
対する抵抗性の増加、化学的安定性の増加、化学選択性の改善、溶媒安定性の改善、酸性
ｐＨに対する耐性の増加、タンパク質分解活性に対する耐性の増加（すなわち、タンパク
質分解に対する感受性の低下）、凝集の減少、溶解性の増加、および温度プロファイルの
変化などの特性が含まれるが、これらに限定されない。追加の実施態様において、この用
語は、ＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰおよび／またはＧＯａｓｅ酵
素の少なくとも１つの改良特性を参照して使用される。いくつかの実施形態において、本
発明は、それぞれ参照ＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰおよび／また
はＧＯａｓｅポリペプチドと比較して、任意の酵素特性において改良を示す改良型ＰＰＭ
、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＳＰおよび／またはＧＯａｓｅポリペプチド；および／
または他の改変型ＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰおよび／またはＧ
Ｏａｓｅポリペプチドをそれぞれ使用する。したがって、「改良」のレベルを決定し、野
生型を含む種々のポリペプチドならびに操作されたポリペプチド間で比較することができ
る。

ここでいう「変換」とは、対応する生成物への基質の酵素的変換（又は生体内変換）を意
味し、「パ－セント」変換とは、特定の条件下で一定期間内に生成物に変換される基質の
パ－セントを意味する。したがって、ポリペプチドの「酵素活性」又は「活性」は、特定
の期間における生成物への基質のパ－セント変換として表すことができる。

本明細書中で用いる「立体選択性」とは、ある立体異性体が別の立体異性体よりも化学的
または酵素的反応で優先的に生成することを意味する。立体選択性は部分的であり、一方
の立体異性体の生成が他方より有利な場合もあれば、一方の立体異性体しか形成されない
場合もある。立体異性体がエナンチオマ－である場合、立体選択性はエナンチオ選択性と
呼ばれ、両方の合計における一方のエナンチオマ－の分率（典型的にはパ－センテ－ジと
して報告される）である。それは、公式［メジャ－エナンチオマ－－マイナ－エナンチオ
マ－］／［メジャ－エナンチオマ－＋マイナ－エナンチオマ－］に従って、そこから計算
されるエナンチオマ－過剰（「ｅ．ｅ．」）として、当該技術分野において一般的に（典
型的にパ－センテ－ジとして）代替的に報告される。立体異性体がジアステレオ異性体で
ある場合、立体選択性はジアステレオ選択性と呼ばれ、２つのジアステレオマ－の混合物
中の１つのジアステレオマ－の割合（典型的にはパ－センテ－ジで報告される）であり、
一般的にジアステレオマ－過剰（”ｄ．ｅ．”）として代替的に報告される。鏡像異性体
過剰とジアステレオマ－過剰は立体異性体過剰のタイプである。

本発明は、操作されたＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰおよびＧＯａ
ｓｅポリペプチド、特に配列番号１～２１を有するもの、および配列番号１～２１の各々
の保存的に修飾された変種と呼ばれる１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む配列の使用を
包含する。

本明細書中で用いられる「保存的」アミノ酸置換とは、タンパク質の生物学的活性を変化
させることなく頻繁に変化させることができるように、類似の特性（例えば、酸性、塩基
性、正または負に荷電した、極性または非極性、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格のコ
ンホメ－ションおよび剛性など）を有するタンパク質中のアミノ酸の置換を指す。これに
は、ポリペプチド中のアミノ酸の、同一または類似の規定されたクラスのアミノ酸内の異
なるアミノ酸による１つまたは複数の置換が含まれる。当業者は、一般に、ポリペプチド
の非必須領域における単一アミノ酸置換は、生物活性を実質的に変化させないことを認識
している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら（１９８７）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
ｏｆｔｈｅＧｅｎｅ，ＴｈｅＢｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕｍｍｉｎｇｓＰｕｂ．
Ｃｏ．，ｐ．２２４（第４版）を参照されたい）。さらに、構造的または機能的に類
似したアミノ酸の置換は、生物活性を破壊する可能性が低い。例を挙げ、限定するわけで
はないが、いくつかの実施形態において、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は別の脂肪族アミ
ノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）で置換される；ヒド
ロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セ
リンおよびトレオニン）で置換される；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有
する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒス
チジン）で置換される；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、別のアミノ酸（例えば、リジン
およびアルギニン）で置換される；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別の
アミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換される；および／または
疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸で置換される
。さらなる例示的な保存的アミノ酸置換を表１に示す。

用語「アミノ酸置換セット」または「置換セット」とは、参照配列と比較して、ポリペプ
チド配列中のアミノ酸置換のグル－プを意味する。置換セットは、１、２、３、４、５、
６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のアミノ酸置換
を有することができる。

「機能的フラグメント」とは、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失および／ま
たは内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、それが比較される配列中の対応する位
置と同一であり（例えば、本発明で使用される完全長の操作されたＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥ
ＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰまたはＧＯａｓｅ酵素）、完全長ポリペプチドの活性の実
質的に全てを保持するポリペプチドを指す。

本明細書中で使用される「欠失」とは、参照ポリペプチドから１以上のアミノ酸を除去す
ることによるポリペプチドの修飾を意味する。欠失は、１個以上のアミノ酸、２個以上の
アミノ酸、５個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸、または
２０個以上のアミノ酸の除去、全アミノ酸数の最大１０％、または参照酵素を構成する全
アミノ酸数の最大２０％を含むことができ、一方、酵素活性を保持し、および／または操
作されたＰＰＭ、ＰＮＰ、ＤＥＲＡ、ＰａｎＫ、ＡｃＫ、ＳＰまたはＧＯａｓｅ酵素の改
良された特性を保持することができる。欠失はポリペプチドの内部部分および／または末
端部分に向けることができる。様々な実施形態において、欠失は連続セグメントを含み得
るか、または不連続であり得る。欠失は典型的にはアミノ酸配列の”－”で示されている
。

本明細書中で使用される「挿入」とは、参照ポリペプチドからの１以上のアミノ酸の付加
によるポリペプチドを意味する。挿入は、ポリペプチドの内部部分、またはカルボキシ末
端もしくはアミノ末端にあり得る。本明細書中で使用される挿入物には、当該技術分野で
公知である融合タンパク質が含まれる。挿入は、アミノ酸の連続したセグメントであって
もよいし、自然界に存在するポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸によって隔てられてい
てもよい。

ここで使用される追加の頭字語および略語は以下の通りである：

実験手順
２－エチニル－２－ヒドロキシプロパン－１，３－ジイルジアセテ－トの合成（２）
方法Ａ：

ＴＨＦ（１０００ｍＬ）中のジアセトキシアセトン（１）の－３５℃溶液（１５９ｇ、
９１４．０ｍｍｏｌ）に、－２０℃以下に温度を維持したＴＨＦ中の塩化エチニルマグネ
シウム０．５Ｍ溶液１６００ｍＬを加えた。反応が完了した後、４００ｍＬのメチルｔｅ
ｒｔ－ブチルエ－テル（ＭＴＢＥ）中の酢酸（７８ｍＬ）を－２０℃以下に保ちながら滴
加した。その後、ＭＴＢＥ（８００ｍＬ）を加え、室温まで加温した。水中の飽和Ｎａ
Ｃｌ（１０００ｍＬ）を加え、続いて水中の飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（１０５０ｍＬ）を加え
た。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上に乾燥し、蒸発させて、化合物（２）を油状物とし
て得た（１６０ｇ、８８％）。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）： δ
４．２６（ｄｄ，４Ｈ），２．５５（ｓ，１Ｈ），２．１４（ｓ，
６Ｈ）．

２－エチニルプロパン－１，２，３－トリオ－ルの合成（３）
方法Ｂ：

２－エチニル２－ヒドロキシプロパン－１，３－ジイルジアセテ－ト（２）（７０ｇ、３
５０ｍｍｏｌ）のエタノ－ル溶液に、メトキシレ－トナトリウムのメタノ－ル溶液（６９
．９ｍＬ、３５．０ｍｍｏｌ）０．５Ｍを室温（ｒｔ）で加えた。反応はｒｔで２時間（
ｈ）撹拌して終了した。溶媒を蒸発させ、残留物を１００ｍＬの水に再溶解し、３×５０
ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。水層を窒素で散布して残留溶媒を除去し、核磁気共鳴（ＮＭ
Ｒ）（内部標準としてマレイン酸）で測定したところ、２－エチニルプロパン－１，２
，３－トリオ－ル（３）（１０８ｇ、収率１００％）の４０．９％溶液を得た。１ＨＮ
ＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）： δ ３．６０（ｄｄ，４Ｈ），２．８
５（ｓ，１Ｈ）．

（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド（４）の代替調製
Ｃ１方法：

攪拌した反応器中で、消泡剤２０４（ＳｉｇｍａＡ６４２６、１滴～２０μＬ）を含む
リン酸ナトリウム緩衝液（３０ｍＬ、１００ｍＭ、ｐＨ７．０）中の２－エチニルプロ
パン－１、２、３－トリオ－ル（３）（１．１ｇ、９．４７ｍｍｏｌ）を１２．５ｓｃ
ｃｍでスパ－グしながら３０℃に加温した。ガラクト－スオキシダ－ゼ（ＧＯＯア－ゼ、
配列番号：１）（２５０ｍｇ）、ホ－スラジッシュペルオキシダ－ゼ（Ｉ型、５ｍｇ）お
よびウシカタラ－ゼ＊＊（５ｍｇ）をリン酸ナトリウム緩衝液（５ｍＬ、１００ｍＭ、ｐ
Ｈ７．０）に溶解し、その後ＣｕＳＯ４水溶液（１００ｍＭ、１５０μＬ）を加えた。
反応混合物を空気散布しながら６００ｒｐｍで４７時間撹拌し、（Ｒ）－２－エチニルグ
リセルアルデヒド（４）を４７％転化率（ＮＭＲによる）および７２％ｅ．ｅ．で得た
。（本剤は単離されなかった。）１ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）： δ
４．２９（ｓ，１Ｈ），３．６５（ｄｄ，２Ｈ），２．８３（ｓ，１Ｈ
）．
＊西洋ワサビペルオキシダ－ゼ：ワサビ根（Ａｍｏｒａｃｉａｒｕｓｔｉｃａｎａ）
から単離したＳＩＧＭＡ（Ｐ８１２５）から市販のワサビＩ型由来の野生型ペルオキシ
ダ－ゼ。
＊＊ウシカタラ－ゼ：ウシ供給源由来のヘム依存性カタラ－ゼ、シグマ（Ｃ１３４５）
から市販

Ｃ２方法：

脱イオン水（５６．２ｋｇ）を入れた１００Ｌのジャケット炉に、リン酸ナトリウム（
１．２１２ｋｇ、１０mole）を加えた。２５℃で１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液（８５２
．６ｇ）を用いてｐＨを７．０２に調整した。反応器にアンチフォ－ム２０４（Ａ６４２
６、１０ｍＬ）を入れ、続いてＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ（６．５ｇ）を入れた。ガラクト－
スオキシダ－ゼ（４５１．２ｇ）（配列番号１０）を添加し、空気でスパ－ジしながら
１５分間撹拌した。西洋ワサビペルオキシダ－ゼ＊（２００．２ｇ）とカタラ－ゼ＊＊（
５０２．６ｇ）を加え、反応器を水（２．０ｋｇ）で洗浄した。次に水（９．４８％、３
０．３４ｋｇ、２４．７２ｍｏｌ）中の２－エチニルプロパン－１，２，３－トリオ－ル
（３）溶液を加え、続いて消泡剤２０４（Ａ６４２６、１０ｍＬ）を追加した。反応は空
気でスパ－ジし、一晩かき混ぜて（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド（４）９４．
０ｋｇを６６％変換（ＮＭＲによる）と８４％ｅ．ｅ．で得た。分析の結果、６０％：
１ＨＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，５００ＭＨｚ）： δ ４．２９（ｓ，１Ｈ）、３．６
５（ｄｄ，２Ｈ）、２．８３（ｓ，１Ｈ）となる。
＊西洋ワサビペルオキシダ－ゼ：西洋ワサビ根（Ａｍｏｒａｃｉａｒｕｓｔｉｃａｎ
ａ）から単離されたトヨボ（ＰＥＯ－３０１）から市販されている、精製されたワサビ由
来の野生型ペルオキシダ－ゼ。
＊＊ウシカタラ－ゼ：ウシ供給源由来のヘム依存性カタラ－ゼで、Ｓｉｇｍａ（Ｃ１
３４５）から市販されている。

上記反応はガラクト－スオキシダ－ゼ（配列番号１１）を用いても行い、生成物（４）は
６７％変換（ＮＭＲによる）および８８％ｅ．ｅ．で得られ、分析収率は５９％：１
ＨＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，５００ＭＨｚ）： δ ４．２９（ｓ，１Ｈ）、３．６５（
ｄｄ，２Ｈ）、２．８３（ｓ，１Ｈ）であった。

Ｃ３方法：

スパ－ジャ－（ｓｐａｒｇｅｒ）とフロ－コントロ－ラを搭載した１００ｍＬイ－ジ－マ
ックス容器に、水（８２ｍＬ）とＰＩＰＥＳカリウム緩衝液（５ｍＬ、０．５Ｍ）を充填
した。２５℃で５ＭのＫＯＨ液を用いてｐＨを７．５に調整した。消泡剤２０４（２００
μＬ）を加え、続いて進化ガラクト－スオキシダ－ゼ（配列番号：１７、４５０ｍｇ酵素
粉末）と硫酸銅（ＩＩ）五水和物（１００μＬ，１００ｍＭ）を加えた。反応混合物を１
２５標準立方センチ／分（ｓｃｃｍ）の空気で１５分間スパ－ジした。ウシカタラ－ゼ（
Ｃ１３４５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１５０ｍｇ、２０００～５０００Ｕ／ｍｇ
、０．７５ＭＵ）を加え、続いて西洋ワサビペルオキシダ－ゼ（ＨＲＰ、Ｔｏｙｏｂｏ
ＰＥＯ－３０１、１００ｍｇ、１３０Ｕ／ｍｇ、１．３ｋＵ）と２－エチニルプロ
パン－１、２、３－トリオ－ル（３）の水溶液（２５ｗｔ％，１２ｍＬ，２５．８ｍｍ
ｏｌ）を加えた。反応液を１２５ｓｃｃｍのエアレ－ションで３０℃でかき混ぜ、２０
時間かけてＥａｓｙＳａｍｐｌｅｒを用いてサンプリングし、７０％転換が得られ、５
８％アッセイ収率および９９％ｅ．ｅ．で化合物（４）（（Ｒ）－２－エチニルグリセ
ルアルデヒド）を生成した。１ＨＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，５００ＭＨｚ）： δ４．２９（
ｓ，１Ｈ），３．６５（ｄｄ，２Ｈ），２．８３（ｓ，１Ｈ）。粗反応流は直接、次のリ
ン酸化段階に運ばれた。

Ｃ４方法：固定化ガラクト－スオキシダ－ゼによる酸化

酵素固定化手順：
ＮｕｖｉａＩＭＡＣＮｉ帯電樹脂（沈降容量に基づく１６ｍＬ）をフィルタ－漏斗に
加え、バインディング緩衝液（１０カラム容量、１６０ｍＬ；５００ｍＭ塩化ナトリウ
ム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭイミダゾ－ル、ｐＨ８．０）で洗浄し、樹脂
保存液を除去した。容器内で進化したガラクト－スオキシダ－ゼ（配列番号：１７、２．
００ｇ）凍結乾燥粉末を硫酸銅（ＩＩ）溶液（１００μＭ；５．００ｍＬ）に再懸濁し、
結合緩衝液（５０ｍＬ）および樹脂を添加した。溶液は２０℃で５時間回転ミキサを用い
て混合した。この樹脂を、結合緩衝液（１０カラム容量、１６０ｍＬ）およびカリウムＰ
ＩＰＥＳ緩衝液（１０カラム容量、１６０ｍＬ；５０ｍＭ、ｐＨ７．５）でろ過洗浄
し、反応中に直接使用した。

反応手順：
スパ－ジャ－とフロ－コントロ－ラを搭載した１００ｍＬイ－ジ－マックス容器に、水（
８２ｍＬ）とＰＩＰＥＳカリウム緩衝液（５ｍＬ、１Ｍ）を入れた。２５℃で５ＭのＫＯ
Ｈ液を用いてｐＨを７．５に調整した。消泡剤２０４（２００μＬ）を添加し、続いて樹
脂に固定化した進化ガラクト－スオキシダ－ゼ（配列番号：１７、樹脂６ｍＬ当たり酵素
粉末７５０ｍｇ）および硫酸銅（ＩＩ）五水和物（１００μＬ，１００ｍＭ）を添加した
。反応混合物を１２５標準立方センチ／分（ｓｃｃｍ）の空気で１５分間スパ－ジした。
ウシカタラ－ゼ（Ｃ１３４５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、２１０ｍｇ、２０００～５
０００Ｕ／ｍｇ、１．０５ＭＵ）を加え、続いて西洋ワサビペルオキシダ－ゼ（ＨＲ
Ｐ、ＴｏｙｏｂｏＰＥＯ－３０１、１００ｍｇ、１３０Ｕ／ｍｇ、１．３ｋＵ）と
２－エチニルプロパン－１、２、３－トリオ－ル（３）の水溶液（２５ｗｔ％，１３ｍＬ
，２９．４ｍｍｏｌ反応混合物を２５℃で撹拌し、曝気を１２５ｓｃｃｍで行った。
２２時間後に反応は９１％に達し、２００ｍＭ（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド
（４）溶液（１００ｍＬ、６８％アッセイ収率、９７％ｅ．ｅ．１ＨＮＭＲ（Ｄ_２
Ｏ，５００ＭＨｚ）： δ４．２９（ｓ，１Ｈ），３．６５（ｄｄ，２Ｈ），２．８３（
ｓ，１Ｈ）となった。粗反応流は直接、次のリン酸化段階に運ばれた。

Ｃ５方法：アミナ－ル（８）の生成を介したアルデヒドの任意単離
ステップ１：（Ｓ）－２－（１，３－ジベンジルイミダゾリジン－２－イル）ブト
－３－エン－１，２－ジオ－ルの調製

窒素バブラ－、機械的撹拌器および熱電対を備えた１００Ｌジャケット付き円筒容器に
、（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド（４）、２６．０ｋｇ、１．８５重量％アル
デヒド、３．６４ｍｏｌ）を含む粗オキシダ－ゼ反応流を入れ、Ｎ２雰囲気で不活性化し
た。水溶液を２０℃に加温し、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデカン－１－アミンオキシド（ＤＤＡ
Ｏ）（水中３０重量％、７９８ｇ、０．９６ｍｏｌ；）を加えた後、ＭＴＢＥ（５５
．３ｋｇ，７６Ｌ）とＮ，Ｎ’－ジベンジルエタン－１，２－ジアミン（１．５５ｋｇ
，６．４３ｍｏｌ）を加えた。茶色の二相性混合物を、窒素雰囲気下、２０℃で一晩撹拌
した。１７時間後、撹拌を停止し、有機相を除去し、廃棄した。（Ｓ）－２－（１、３－
ジベンジルイミダゾリジン－２－イル）しかし－３－イン－１、２－ジオ－ル（５６．５
ｋｇ、２．０２重量％アミナ－ル、３．３９ｍｍｏｌ、９３％アッセイ収率）の淡褐色Ｍ
ＴＢＥ溶液を得た。

６種類の同様のＭＴＢＥ溶液を、一回の蒸留および結晶化段階（合計３７４．４ｋｇの溶
液中で、７．９１ｋｇのアミナ－ルを含む）で一緒に処理した。

機械的撹拌器、蒸留ヘッド（－２０℃の冷却器）および熱電対を備えた５０Ｌのジャケ
ット付き円筒容器にアミナ－ル溶液（４５Ｌ）を装填し、容器（６５～９５ｔｏｒｒ）
に真空を加え、ジャケットを４０℃に設定した。溶媒は３５Ｌの容量に達するまで蒸留
により除去した。この時点で、内部温度は６．１℃で、オフホワイトの固体が結晶化し始
めていた。残りのＭＴＢＥ溶液は、３５～４０Ｌの一定容積と０～１０℃の内部温度を
維持しながら、ゆっくりと加えた。ＭＴＢＥ溶液がすべて添加されると、容量は２５Ｌ
に減少した。蒸留を停止し、容器に窒素を不活性化し、ジャケット温度を１０℃に低下さ
せた。得られた淡黄色懸濁液をこの温度で２時間置き、固体をろ過により回収した。フィ
ルタ－ケ－キを冷（－２℃）ＭＴＢＥ（１２．７ｋｇ）で洗浄した後、窒素流下で７時間
乾燥した。（Ｓ）－２－（１、３－ジベンジルイミダゾリジン－２－イル）－しかし－３
－イン－１、２－ジオ－ルをオフホワイト結晶固体（５．７５ｋｇ）として得た。１Ｈ
ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．４２－７．３５（ｍ，
４Ｈ），７．３２（ｔｄ，Ｊ＝７．５，１．６Ｈｚ，４Ｈ），７．
２７－７．２１（ｍ，２Ｈ），５．１０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，
１Ｈ），５．０３（ｓ，１Ｈ），４．２８（ｄ，Ｊ＝１３．３Ｈｚ，
１Ｈ），４．１６（ｄ，Ｊ＝１３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｓ，
１Ｈ），３．７０－３．５８（ｍ，４Ｈ），３．２１（ｄ，Ｊ＝
０．９Ｈｚ，１Ｈ），２．９０－２．８０（ｍ，２Ｈ），２．６０－
２．５１（ｍ，２Ｈ）．１３ＣＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）
δ １４０．０，１４０．０，１２８．５，１２８．３，１２８．２，１
２８．１，１２６．８，１２６．８，８８．６，８６．９，７５．０，７４
．０，６６．４，６０．７，６０．５，５０．４，５０．３，３９．５．Ｈ
Ｒ－ＭＳ（ＥＳＩ）アミナル（Ｍ＋Ｈ＋）Ｃ２１Ｈ２５Ｎ２Ｏ２＋３３７：計算値
１９１１；３３７．検出値１９２２。

ステップ２アミナ－ル（８）から（Ｒ）－２－エチニル－グリセルアルデヒド（４）の
調製

窒素バブラ－と機械的撹拌器を備えた４Ｌジャケット付き円筒容器に、ＴｓＯＨ・Ｈ_２Ｏ
（１２．０ｇ、６３．１ｍｍｏｌ）、水（６０ｍＬ）、（Ｓ）－２－（１、３－ジベンジ
ルイミダゾリジン－２－イル）ブタ－３－イン－１、２－ジオ－ル（１１０ｇ、３２７ｍ
ｍｏｌ）とＭＴＢＥ（１７００ｍＬ）を入れた。二相混合物を窒素下に置き、ジャケッ
ト温度を１５℃に設定した。ＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（１１４ｇ、５９９．３ｍｍｏｌ）の水溶
液（６００ｍＬ）をかき混ぜながら１．５時間かけて滴加した（２００ｒｐｍ）。添加終
了後、ジャケット温度を５℃に下げ、得られたスラリ－を１時間置いたた。固形物はろ過
により除去し、冷水（２７０ｍＬ）で洗浄した。二相溶液を分離漏斗に移し、有機相を除
去し、廃棄した。水相をＤＯＷＥＸ（商標）ＭＡＲＡＴＨＯＮ（商標）Ａ樹脂（水酸
化物形態、１１．０ｇ）およびＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（登録商標）１５樹脂（水素形態、
１１．０ｇ）で処理し、一方、Ｎ２で２００ｓｃｃｍの速度で２４時間スパ－ジし、残
留ＭＴＢＥを除去した。この樹脂をろ過により除去し（Ｒ）－２－ヒドロキシ－２－（ヒ
ドロキシメチル）ブタ－３－イナ－ル（７７４ｇ、４．６重量％アルデヒド、８２％収率
）の無色水溶液を得た。１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ） δ ５．０１
（ｓ，１Ｈ），３．７７（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），３．７３
（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），２．９２（ｓ，１Ｈ）．１３Ｃ
ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ） δ １２９．４，１２５．４，９０．３，
８１．０，７６．０，７３．９，６５．３。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ａｌｄｅｈｙ
ｄｅｄｉｍｅｒ（２Ｍ＋Ｎａ^＋）Ｃ１０Ｈ１２ＮａＯ６^＋計算値２５１．
０５２６；検出値２５１．０５３０．

（Ｒ）－２－エチニル－グリセルアルデヒド３－リン酸塩（５）の代替調製法：
Ｄ１方法：アセテ－トキナ－ゼ：ＡＴＰ再生系

撹拌リアクタ－内で、ＨＥＰＥＳ緩衝液（６６ｍＭ、ｐＨ７．５、３０ｍＬ）中のアデ
ノシン二リン酸二ナトリウム塩（４０ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）および塩化マグネシウ
ム（３８ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）の溶液に（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド
（４）（１．９ｍＬ、水中２１０ｇ／Ｌ溶液、３．５１ｍｍｏｌ）を加え、続いて酢酸キ
ナ－ゼ（配列番号３）（４０ｍｇ）、およびパントテン酸キナ－ゼ（配列番号２）（１２
０ｍｇ）を加えた。反応混合物を２５℃に加温し、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ
７．５、１０ｍＬ）中のアセチルリン酸リチウムカリウム塩溶液（１．３ｇ、７．０１
ｍｍｏｌ）を４時間かけて滴加し、５Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．５に維持し
た。反応を１８時間撹拌して（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３－リン酸（５）
を８５％変換（ＨＰＬＣによる）で与えた（生成物は単離されなかった）。１ＨＮＭＲ
（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）： δ ５．０２（ｓ，１Ｈ），４．００（ｄ
ｑ，２Ｈ），２．８８（ｓ，１Ｈ）．ＬＣ－ＭＳ：（ＥＳ，ｍ／ｚ）：
Ｃ５Ｈ７Ｏ６Ｐ（Ｍ－Ｈ）：測定値１９３．１；検出値１９３．０．

Ｄ２方法：ピルビン酸オキシダ－ゼＡＴＰ再生系

攪拌反応器において、７６ｍＬの水ｐＨ７．５中のピルビン酸ナトリウム（３．１１ｇ
、２８ｍｍｏｌ）およびリン酸（０．５２３ｍＬ、７．７１ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｒ）
－２－エチニルグリセルアルデヒド（４）（３．８ｍＬ、水中２１０ｇ／Ｌ溶液、７．０
１ｍｍｏｌ）、アデノシン二リン酸二ナトリウム塩（８０ｍｇ、０．１７４ｍｍｏｌ）、
チアミンピロリン酸（４０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）、フラビンアデニンジヌクレオチ
ド二ナトリウム塩水和物（６４ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）、および塩化マグネシウム（
４００μＬ、水中１Ｍ溶液、０．４ｍｍｏｌ）を入れた。ｐＨを５Ｍ水酸化ナトリウムで
７．５に再調整し、反応容量を水で８０ｍＬに再調整した。酢酸キナ－ゼ（配列番号：３
）（８０ｍｇ）、ピルビン酸オキシダ－ゼ（配列番号：４）（８０ｍｇ、凍結乾燥細胞遊
離抽出物）、パントテン酸キナ－ゼ（配列番号：２）（４００ｍｇ）、およびカタラ－ゼ
（８００ μＬ、硫酸アンモニウム懸濁液ＣＡＴ－１０１、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓ
）を添加した。反応物を空気スパ－ジしながら５００ｒｐｍおよび３０℃で７２時間撹拌
すると、９５％転化率（ＨＰＬＣによる）で（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３
－リン酸５が得られた（生成物は単離されなかった）。１ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４０
０ＭＨｚ）： δ ５．０２（ｓ，１Ｈ），４．００（ｄｑ，２Ｈ），
２．８８（ｓ，１Ｈ）．ＬＣ－ＭＳ：（ＥＳ，ｍ／ｚ）：ｃａｌｃｕｌａｔｅ
ｄｆｏｒＣ５Ｈ７Ｏ６Ｐ（Ｍ－Ｈ）：１９３．１；検出値１９３．０．

上記反応はパントテン酸キナ－ゼ（配列番号１３）を用いても行い、生成物５は６６％変
換で得られた。（本剤は単離されなかった。）１ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨ
ｚ）： δ ５．０２（ｓ，１Ｈ），４．００（ｄｑ，２Ｈ），２．８８
（ｓ，１Ｈ）．

Ｄ３方法：アセテ－トキナ－ゼ：固定化酵素を用いたＡＴＰ再生系

酵素固定化手順：
ＮＵＶＩＡ（登録商標）固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ－（ＩＭＡＣ）
ニッケル帯電樹脂（沈降容量に基づく１６８ｍＬ）をフィルタ－漏斗に加え、結合緩衝液
（１．６Ｌ；塩化ナトリウム５００ｍＭ、リン酸ナトリウム５０ｍＭ、ｐＨ８．０）で
洗浄した。容器中で、パントテン酸キナ－ゼ（８．４ｇ）（配列番号：１２）および酢
酸キナ－ゼ（２．８ｇ）（配列番号：３）を結合緩衝液（５００ｍＬ）に溶解した。洗
浄した樹脂を容器に仕込み、溶液を２０℃で４時間攪拌した。樹脂をろ過し、最初に結合
緩衝液（１．６Ｌ）で洗浄し、続いてピペラジン－Ｎ，Ｎ′－ビス（２－エタンスルホン
酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝液（８４０ｍＬ；５０ｍＭ，ｐＨ６．５）で洗浄した。
洗浄した樹脂は次の段階で直接使用した。

反応手順：
１Ｌ反応器に、水（６０８．７ｇ、４．６重量％、２１２ｍｍｏｌ）中の（Ｒ）－２－エ
チニルグリセルアルデヒド（４）の溶液を入れ、５℃に冷却した。冷却溶液ピペラジン－
Ｎ，Ｎ′－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝液（３２．７ｍＬ、１Ｍ
、ｐＨ６．５、３２．７ｍｍｏｌ）、塩化マグネシウム（９．３３ｍＬ、１Ｍ、９．３
３ｍｍｏｌ）、アセチルリン酸二アンモニウム塩（５１．８ｇ、２６５ｍｍｏｌ）、アデ
ノシン二リン酸二ナトリウム塩水和物（１．１７ｇ、２．１２ｍｍｏｌ）及び水（１９２
ｍＬ）を加えた。溶液を撹拌し、５ＮのＫＯＨを用いてｐＨを６．４に調整した。反応を
２０℃に加温し、パントテン酸キナ－ゼ（配列番号１２）および酢酸キナ－ゼ（配列番号
３）を固定化した樹脂１６８ｍＬを加えた。反応をｐＨ６．４に維持するために用いた５
ＮＫＯＨで１０時間撹拌し、（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３－りん酸（５
）を９２％変換（ＨＰＬＣによる）及び９１％収率（内部標準として塩化テトラフェニル
ホスホニウムによる３１ＰＮＭＲによる）で与えた（生成物は単離されなかった）。１
ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）： δ ５．０２（ｓ，１Ｈ），４．
００（ｄｑ，２Ｈ），２．８８（ｓ，１Ｈ）．ＬＣ－ＭＳ：（ＥＳ，ｍ
／ｚ）：Ｃ５Ｈ７Ｏ６Ｐ（Ｍ－Ｈ）：計算値１９３．１；検出値１９３．０．

４－エチニルＤ－２－デオキシリボ－ス５－リン酸（６）の合成
方法Ｅ：

（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３－リン酸塩（５）（５、２０ｍＬ、５．３ｍ
ｍｏｌ）の水溶液に、アセトアルデヒドの水溶液（４０ｗｔ．％、２．０２ｍＬ、１５
．９ｍｍｏｌ）を室温で加えた後トリエタノ－ルアミン塩酸塩緩衝液（１ｍＬ、１Ｍ、
ｐＨ７）中の２５ｍｇデオキシリボ－ス－リン酸塩アルドラ－ゼ（ＤＥＲＡ）（配列
番号６）を加えた。反応器を密封し、混合物を３０℃と６００ｒｐｍで一夜撹拌し、９９
％ｃｏｎｖ中に４－エチニルＤ－２－デオキシリボ－ス５－りん酸（６）を得た。９９
％、すなわち１：１アノマ－混合物として９９％ｄ．ｅ．（生成物は単離されなかった
）。α－アノ－マ：１ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、６００ＭＨｚ） δ５．３１（ｔ、１Ｈ
）、４．１３（ｔ、１Ｈ）、３．８１～３．７２（ｍ、２Ｈ）、２．８９（ｓ、１Ｈ）、
２．４２～２．３４（ｍ、１Ｈ）、１．８７～１．７９（ｍ、１Ｈ）、１３ＣＮＭＲ
（Ｄ２Ｏ、１５１ＭＨｚ） δ９７．７（ｓ）、８１．４（ｄ）、７９．４（ｓ）、７８
．９（ｓ）、７１．１（ｓ）、６７．７（ｄ）、３９．６（ｓ）。β－アノ－マ：１Ｈ
ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、６００ＭＨｚ） δ ５．４０（ｄｄ、１Ｈ）、４．２８（ｔ、１
Ｈ）、３．８８～３．８０（ｍ、２Ｈ）、２．８７（ｓ、１Ｈ）、２．１３～２．０６（
ｍ、１Ｈ）、２．０４～１．９７（ｍ、１Ｈ）、１３ＣＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、１５１ＭＨ
ｚ） δ ９７．３（ｓ）、８２．２（ｄ）、７８．７（ｓ）、７８．５（ｓ）、７１．
３（ｓ）、６８．４（ｄ）、３９．６（ｓ）。ＬＣ－ＭＳ：（ＥＳ，ｍ／ｚ）：Ｃ
７Ｈ１０Ｏ７Ｐ（Ｍ－Ｈ）：２３７．０；検出値２３７．０

（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－２－フルオロ－９Ｈ－プリン－９－イル）－
２－エチニル２－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－３－オ－ル一水和物（７）
［別名４’－エチニル２－フルオロ－２’－デオキシアデノシンまたはＥＦｄＡ］の代替
調製法

Ｆ１方法

リン酸水素アンモニウム（（２Ｒ、３Ｓ）－２－エチニル３、５－ジヒドロキシテトラヒ
ドロフラン－２－イル）メチル（１．００ｇ、３．９１ｍｍｏｌ）をｐＨ７．５緩衝液
（５ｍＭＭｎＣｌ_２を含む１００ｍＭｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ・ＨＣｌ）１
０ｍＬに溶解した。溶液のｐＨは５ＮのＮａＯＨで７．３に調整した。溶液に２－フルオ
ロアデニン（０．５９９ｇ、３．９１ｍｍｏｌ）およびショ糖（２．６８ｇ、７．８２ｍ
ｍｏｌ）を加えた。酵素溶液は、ホスホペントムタ－ゼ（配列番号：８）（１００ｍｇ）
、プリンヌクレオシドホスホリラ－ゼ（配列番号：９）（５０ｍｇ）及びショ糖ホスホリ
ラ－ゼ（配列番号：７）（１０ｍｇ）をｐＨ７．５緩衝液１０ｍＬに溶解して調製した
。酵素溶液を試薬混合物に添加し、得られた懸濁液を４０℃で振盪した。２０時間後、懸
濁液を０℃に冷却し、ろ過して冷水で洗浄した。固体を吸引乾燥し、標記化合物（１．１
２ｇ，９２％）を単一異性体とした。
^{１ＨＮＭＲ：（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，ｐｐｍ）： δ ７．６８}
^{（ｂｒｓ，２Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．}
^{４４（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），５．５２（ｄ，Ｊ＝５．６}
^{Ｈｚ，１Ｈ），５．２７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４４}
^{（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），３．６０（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈ}
^{ｚ，１Ｈ），３．５３（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４８（}
^{ｓ，１Ｈ），２．４８－２．４１（ｍ，１Ｈ），２．３７－２．３０（ｍ，}
^{１Ｈ）．１３ＣＮＭＲ（１５０．９２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，ｐｐｍ）}
^{δ １５８．５（ｄ，ＪＣＦ＝２０３．５），１５７．６（ｄ，ＪＣＦ}
^{＝２１．２），１５０．２（ｄ，ＪＣＦ＝２０．２），１３９．７（ｄ}
^{，ＪＣＦ＝２．４），１１７．４（ｄ，ＪＣＦ＝４．０），８５．１}
^{，８２．０，８１．４，７８．７，７０．１，６４．２，３８．１．ＬＣ－}
^{ＭＳ：（ＥＳ，ｍ／ｚ）：Ｃ１２Ｈ１２ＦＮ５Ｏ３（Ｍ＋Ｎａ）：３１６．０}
^{８２２；計算値３１６．０８１８。}

このステップで使用したＰＰＭおよびＰＮＰ酵素は、それぞれ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ）由来の酵素からの突然変異に由来した。この段階で用いたスクロ－ス
ホスホリラ－ゼ（ＳＰ）はアロスカルドビア・オンニコレンスに由来した；他の生物に由
来するＳＰも用いることができた。

Ｆ２方法：

ピペラジン－Ｎ，Ｎ′－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝液を含む（
Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３－リン酸（５）（９５０ｍＬ、１５７ｍｍｏｌ
）の約５．５～６．０のｐＨの水溶液にトリエタノ－ルアミン（７．０９ｇ、４７．５ｍ
ｍｏｌ）を加えた。溶液のｐＨは、水酸化カリウム（８ｍＬ、８Ｍ）を用いて７．１から
７．６に調整した。塩化マンガン（ＩＩ）水和物（０．５９２ｇ、４．７０ミリモル）を
添加し、次いでスクロ－ス（１６１ｇ、４７０ミリモル）を添加し、ｐＨ７．５を得て、
溶液に、以下の酵素：デオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼ（配列番号：１４）（４６
１ｍｇ）、スクロ－スホスホリラ－ゼ（配列番号：７）（４９４ｍｇ）、ホスホペントム
タ－ゼ（配列番号：８）（２．６３ｇ）、およびプリンヌクレオシドホスホリラ－ゼ（配
列番号：１５）（６５９ｍｇ）を添加した。酵素が溶解したら、２－フルオロアデニン（
１９．８０ｇ、１２５ｍｍｏｌ）を加えた。反応を３５℃に加熱し、アセトアルデヒドを
加えた（イソプロピルアルコ－ル中４０ｗｔ％、２９．８ｍＬ、２３５ｍｍｏｌ）。２時
間反応させた後、混合物にＥＦｄＡ結晶生成物（０．９６ｇ，２ｍｏｌ％）を播種した。
３５℃で２６時間反応させた後、スラリ－を０℃に冷却し、固体を濾過、水で２回洗浄す
ることによって収集した（４０ｍＬｅａ．）。固体を窒素スイ－プ下で乾燥した。４３
．２ｇ、９２重量％、９６．２％の補正値が得られる。^１ＨＮＭＲ：（３００Ｍ
Ｈｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，ｐｐｍ）： δ ７．６８（ｂｒｓ，２Ｈ），７．
３２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．４４（ｔ，Ｊ＝５．８
Ｈｚ，１Ｈ），５．５２（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２７
（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈ
ｚ，１Ｈ），３．６０（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５３（
ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４８（ｓ，１Ｈ），２．４８－２
．４１（ｍ，１Ｈ），２．３７－２．３０（ｍ，１Ｈ）．^１３Ｃ核磁気共鳴
（１５０．９２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，ｐｐｍ） δ１５８．５（ｄ，ＪＣＦ
＝２０３．５），１５７．６（ｄ，ＪＣＦ＝２１．２），１５０．２（ｄ，Ｊ
ＣＦ＝２０．２），１３９．７（ｄ，ＪＣＦ＝２．４），１１７．４（ｄ，
ＪＣＦ＝４．０），８５．１，８２．０，８１．４，７８．７，７０．１，６４．２
，３８．１。ＬＣ－ＭＳ：（ＥＳ，ｍ／ｚ）：Ｃ１２Ｈ１２ＦＮ５Ｏ３（Ｍ＋Ｎ
ａ）：３１６．０８２２；計算値３１６．０８１８。

（Ｓ）－２－エチニル－プロパン－１，２，３－トリオ－ル１－リン酸塩（９）の
代替調製方法
Ｇ１方法：アセテ－トキナ－ゼ：酵素配列番号２および配列番号３を用いたＡＴＰ再生系

５０ｍＬのリアクタ－に２－エチニルプロパン－１，２，３－トリオ－ル（３）の水溶液
（９．２９ｇ、９．４６ｗｔ％、７．５７ｍｍｏｌ）カリウムＰＩＰＥＳ緩衝液（１．０
２ｍＬ、１Ｍ、ｐＨ６．５、１．０２ｍｍｏｌ）、塩化マグネシウム（２９２μＬ、１
Ｍ、０．２９２ｍｍｏｌ）、アセチルリン酸二アンモニウム塩（１．８５１ｇ、８９ｗｔ
％、９．４６ｍｍｏｌ）、アデノシン二リン酸二ナトリウム塩水和物（ＡＤＰ、４２ｍｇ
、０．０７６ｍｍｏｌ、０．０１ｅｑ）、および水（２８ｍL）を入れた。５ＭのＫＯ
Ｈを用いてｐＨを６．４に調整し、溶液を２０℃に加温し、進化した（evolved）パント
テン酸キナ－ゼＰａｎＫ配列番号２（２６４ｍｇ）および酢酸キナ－ゼＡｃＫ配列番
号３（８８ｍｇ）を追加した。反応は５ＮのＫＯＨを用いてｐＨを６．４に維持して１６
時間撹拌した。最終反応含量は（Ｓ）－２－エチニルプロパン－１，２，３－トリオ－ル
１－ホスフェ－ト（９）を＞９５％ｅ．ｅ．及び９９％転化率（^３１Ｐ－ＮＭＲ）で
与えた。生成物は単離されなかった。^１ＨＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，５００ＭＨｚ）
δ ３．８９（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１
Ｈ），３．６５（ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ），２．９３（ｓ，
１Ｈ）．^１３ＣＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，１２６ＭＨｚ） δ ８２．９（ｓ）
，７５．１（ｓ），７１．０（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），６７．０（
ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ），６４．７（ｓ）．３１ＰＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，
２０２ＭＨｚ） δ ３．３９．ＨＲＭＳ：（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）：［Ｍ－１］^－
Ｃ_５Ｈ_８Ｏ_６Ｐ：１９５．００５８；検出値１９５．００６８［Ｍ－Ｈ］
^－：１９５．００５８。

Ｇ２方法：アセテ－トキナ－ゼ：酵素配列番号２０および配列番号２１を用いたＡＴＰ再
生系。

ジャケット反応器水溶液に２－エチニルプロパン－１、２、３－トリオ－ル（３）（１１
．４７ｋｇ、８．７重量％、８．６１モル）および水（７．５ｋｇ）を入れ、次いで１Ｍ
ＢＩＳ－ＴＲＩＳメタン緩衝液ｐＨ６．５（１Ｌ）および塩化マグネシウム（４１．
４ｇ）を入れた。ＡＴＰ（４８ｇ、０．０８６ｍｏｌ、０．０１当量）及びリン酸ジア
ンモニウムアセチル２．０２１ｋｇ、８９％、１０．３３ｍｍｏｌ）を加え、２０℃まで
加温し、ＫＯＨ（２７０．４ｇ）を用いてｐＨを６．８に再調整した。進化した（evol
ved）パントテン酸キナ－ゼ配列番号２０（２０．４ｇ）および進化した酢酸キナ－ゼ配
列番号２１（３ｇ）を固体として装填した。この反応を２０℃で１６時間撹拌したところ
、ｐＨは５．５に低下した。２－エチニルプロパン－１，２，３－トリオ－ル（３）の定
量変換を^１Ｈと３１ＰＮＭＲで判断して得た。そのような調製された（Ｓ）－２－エ
チニルプロパン－１，２，３－トリオ－ル１－リン酸（９）液（３９７ｍＭ、２２．５ｋ
ｇ、９８％の収率）は、さらなる浄化を行わずに、その後の酸化段階で使用した。^１Ｈ
ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，５００ＭＨｚ） δ ３．８９（ｍ，２Ｈ），３．７
２（ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ），３．６５（ｄ，Ｊ＝１１
．６Ｈｚ，１Ｈ），２．９３（ｓ，１Ｈ）．

Ｇ３方法：アセテ－トキナ－ゼ：酵素配列番号２０および配列番号２と重水素化化合物（
３）を用いて絶対立体化学を帰属させ、脱対称性のリン酸化を実証する。

進化したパントテン酸キナ－ゼ配列番号２０（１０ｇ／Ｌ水溶液１００μＬ）と進化した
酢酸キナ－ゼ配列番号２１（２ｇ／L水溶液１００μL）を、リン酸ジアンモニウムアセチ
ル（４１ｍｇ）、２－エチニルプロパン－１、１－ｄ２－１、２、３－トリオ－ル（（Ｒ
）－３－ｄ２、２０ｍｇ、１７０μｍｏｌ）、塩化マグネシウム（水中１Ｍ溶液１０μＬ
）、ＡＤＰ（水中１００ｇ／Ｌ溶液１０μＬ）及びリン酸ナトリウム緩衝液（水中１Ｍ
溶液１０μＬ）を水中（８００μL）に含むｐH６．５の溶液に加えた。この反応をｒｔで
２４時間インキュベ－トし、重水素化２－エチニルプロパン－１，２，３－トリオ－ル１
－りん酸類似体（Ｓ）－９－（３，３－ｄ２）および（Ｓ）－９－（１，１－ｄ２）を９
５：５比および９９％の全収率で得た。^３１ＰＮＭＲによりリン酸化化合物の比率を
約９５：５と決定し、プロ－（Ｓ）ヒドロキシル基（すなわち脱対称性リン酸化）での２
－エチニルプロパン－１、２、３－トリオ－ル（３）の立体選択的リン酸化を確認した。
^１ＨＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ、５００ＭＨｚ） δ３．８９（ｍ、２Ｈ）、３．７２（ｄ、
Ｊ＝１１．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．６５（ｄ、Ｊ＝１１．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．９
３（ｓ，１Ｈ）。^１３ＣＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，１２６ＭＨｚ） δ ８２．９
（ｓ），７５．１（ｓ），７１．０（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），６７．
０（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ），６４．７（ｓ）．

Ｇ４方法：アセテ－トキナ－ゼ：固定化酵素配列番号２０および配列番号２１を用いたＡ
ＴＰ再生系。

酵素固定化手順：
ＮｕｖｉａＩＭＡＣＮｉ荷電樹脂（沈降容量に基づく７５ｍＬ）をフィルタ－漏斗に
加え、水（９カラム容量、３×２２５ｍＬ）及び結合緩衝液（１カラム容量、７５ｍＬ；
５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭイミダゾ－ル、ｐＨ
８．０）で洗浄した。容器中でパントテン酸キナ－ゼ（配列番号：２０、６．０ｇ）凍
結乾燥粉末を結合緩衝液（２００ｍＬ）に再懸濁し、洗浄した樹脂を加えた。２５℃で６
時間回転ミキサ－を用いて混和した。この樹脂をろ過し、結合緩衝液（６カラム容量、６
ｘ２２５ｍＬ）およびＢＩＳ－ＴＲＩＳ緩衝液（８カラム容量、６００ｍＬ；５０
ｍＭ、ｐＨ６．２）で洗浄した。
反応手順：
２－エチニルプロパン－１、２、３－トリオ－ル（３）（５７４ｇ、８．７％重量、０．
４３０ｍｏｌ）と水（３５０ｍＬ）の水溶液をジャケット付き反応器に入れ、続いて１Ｍ
ＢＩＳ－ＴＲＩＳメタン緩衝液ｐＨ６．５（５０ｍＬ）と塩化マグネシウム（２．０
３３ｇ，０．０１ｍｏｌ）を加えた。ＡＴＰ（２．３７ｇ、０．００４３モル、０．０
１当量）とリン酸ジアモニウム（１０１ｇ、８９％、０．５３０ｍｍｏｌ、１．２当量）
を加え、２０℃まで加温し、５ＭＫＯＨを用いて液体のｐＨを６．８に再調整した。パ
ントテン酸キナ－ゼ配列番号２０および進化した酢酸キナ－ゼ配列番号２１（０．１５ｇ
）を固定化した樹脂（２５ｍＬ）を固体として装填した。反応は２０℃で１６時間撹拌し
、その間ｐＨは５．５に低下した。２－エチニルプロパン－１、２、３－トリオ－ル（３
）の（Ｓ）－２－エチニルプロパン－１、２、３－トリオ－ル１－りん酸（９）への定量
的転換を^１Ｈと^３１ＰＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ、５００ＭＨｚ） δ３．８９（ｍ、２Ｈ
）、３．７２（ｄ、Ｊ＝１１．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．６５（ｄ、Ｊ＝１１．６Ｈ
ｚ、１Ｈ）、２．９３（ｓ、１Ｈ）で判断して得た。

（Ｒ）－２－エチニル－グリセルアルデヒド３－リン酸塩（５）の代替調製法：
Ｈ１方法：固定化ガラクト－スオキシダ－ゼ配列番号１６

酵素固定化手順：
ＮｕｖｉａＩＭＡＣＮｉ帯電樹脂（沈降容量に基づき１０ｍＬ）をフィルタ－漏斗に
加え、バインディング緩衝液（１０カラム容量、１００ｍＬ；５００ｍＭ塩化ナトリウ
ム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭイミダゾ－ル、ｐＨ８．０）で洗浄し、樹脂
保存液を除去し、洗浄した樹脂１６ｇを得た。容器内で進化させたガラクト－スオキシダ
－ゼ（配列番号：１６、７５０ｍｇ）凍結乾燥粉末を硫酸銅（ＩＩ）溶液（１００μＭ；
５．００ｍＬ）に再懸濁し、結合緩衝液（２０ｍＬ）および洗浄した樹脂（３．０ｇ）を
添加した。２０℃で５時間回転ミキサ－を用いて混和した。この樹脂をバインディング緩
衝液（１０カラム容量、１００ｍＬ）およびＢＩＳ－ＴＲＩＳ緩衝液（１０カラム容量、
１００ｍＬ；５０ｍＭ、ｐＨ７．５）でろ過洗浄し、グリコシル化反応に直接使用し
た。

反応手順：
固定化ガラクト－スオキシダ－ゼ配列番号１６（３．０ｇ）の樹脂をＢＩＳ－ＴＲＩＳメ
タン緩衝液（３５ｍＭ、ｐＨ７．２に調整）中の（Ｓ）－２－エチニルプロパン－１、２
、３－トリオ－ル１－りん酸（９、５．４ｍｍｏｌ、２７０ｍＭ、２０ｍＬ）の溶液に加
え、続いて水中の硫酸銅（ＩＩ）溶液（３０μＬ、１００ｍＭ）、及び水（６００μＬ）
中に再懸濁させた西洋ワサビペルオキシダ－ゼ（ＰＥＯ－３０１、１８ｍｇ）とウシカタ
ラ－ゼ（Ｃ１３４５、１２０ｍｇ）を加えた。この反応物を気体透過性膜で封じ、２２℃
で４日間激しく振り混ぜて７７％の最終転換に達し、（Ｒ）－２－エチニルグリセルアル
デヒド３－リン酸（５）を９５％ｅ．e．で得た。酵素樹脂をろ過し、（Ｒ）－２－エ
チニルグリセルアルデヒド３－リン酸（５）の溶液をグリコシル化反応に直接用いた。１
ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）： δ ５．０２（ｓ，１Ｈ），４．
００（ｄｑ，２Ｈ），２．８８（ｓ，１Ｈ）．ＬＣ－ＭＳ：（ＥＳ，ｍ
／ｚ）：Ｃ５Ｈ７Ｏ６Ｐ（Ｍ－Ｈ）：測定値１９３．１；検出値１９３．０．

Ｈ２方法：固定化ガラクト－スオキシダ－ゼ配列番号１７

酵素固定化手順：
ＮｕｖｉａＩＭＡＣＮｉ帯電樹脂（沈降容量に基づき１０ｍＬ）をフィルタ－漏斗に
加え、バインディング緩衝液（１０カラム容量、１００ｍＬ；５００ｍＭ塩化ナトリウ
ム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭイミダゾ－ル、ｐＨ８．０）で洗浄し、樹脂
保存液を除去し、洗浄した樹脂１６ｇを得た。容器内で、進化したガラクト－スオキシダ
－ゼ（配列番号：１６、７５０ｍｇ）凍結乾燥粉末を硫酸銅（ＩＩ）溶液（１００μＭ；
５．００ｍＬ）に再懸濁し、結合緩衝液（２０ｍＬ）と洗浄した樹脂（３．０ｇ）を添加
した。２０℃で５時間回転ミキサ－を用いて混和した。この樹脂をバインディング緩衝液
（１０カラム容量、１００ｍＬ）およびＢＩＳ－ＴＲＩＳメタン緩衝液（１０カラム容量
、１００ｍＬ；５０ｍＭ、ｐＨ７．５）でろ過洗浄し、反応に直接使用した。
反応手順：
固定化されたガラクト－スオキシダ－ゼＳＥＱＩＤＮＯ．：１７（３．０ｇ）を、Ｂ
ＩＳ－ＴＲＩＳメタン緩衝液（３５ｍＭ、ｐＨ７．２に調整）中の（Ｓ）－２－エチニル
プロパン－１、２、３－トリオ－ル１－リン酸（９、５．４ｍｍｏｌ、２７０ｍＭ、２０
ｍＬ）の溶液に加え、続いて水（３０μＬ、１００ｍＭ）中の硫酸銅（ＩＩ）溶液、及び
水（６００μL）に再懸濁させた西洋ワサビペルオキシダ－ゼ（ＰＥＯ－３０１、１８ｍ
ｇ）とウシカタラ－ゼ（Ｃ１３４５、１２０ｍｇ）を加えた。この反応を気体透過性膜で
封じ、２２℃で４日間激しく振り混ぜて７７％の最終転換に達し、（Ｒ）－２－エチニル
グリセルアルデヒド３－りん酸（５）を９５％ｅ．ｅ．で得た。酵素樹脂を濾別し、（
Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３－ホスフェ－ト（５）の溶液をグリコシル化反
応に直接使用した。１ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）： δ ５．０２（
ｓ，１Ｈ），４．００（ｄｑ，２Ｈ），２．８８（ｓ，１Ｈ）．ＬＣ－
ＭＳ：（ＥＳ，ｍ／ｚ）：ｒＣ５Ｈ７Ｏ６Ｐ（Ｍ－Ｈ）：計算値１９３．１
；検出値１９３．０．

Ｈ３方法：固定化ガラクト－スオキシダ－ゼ配列番号１８

酵素固定化手順：
ＮｕｖｉａＩＭＡＣＮｉ帯電樹脂（沈降容量に基づく３ｍＬ）をフィルタ－漏斗に加
え、バインディング緩衝液（１０カラム容量、３０ｍＬ；５００ｍＭ塩化ナトリウム、
５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭイミダゾ－ル、ｐＨ８．０）で洗浄し、樹脂保存
液を除去し、洗浄した樹脂２．４ｇを得た。バイアル進化ガラクト－スオキシダ－ゼ（配
列番号：１８、７５ｍｇ）凍結乾燥粉末を硫酸銅（ＩＩ）溶液（１００μＭ；１．００ｍ
Ｌ）に再懸濁し、結合緩衝液（５ｍＬ）と洗浄樹脂（４００ｍｇ）を添加した。２０℃で
５時間回転ミキサ－を用いて混和した。この樹脂を、結合緩衝液（１０カラム容量、４ｍ
Ｌ）およびＢＩＳ－ＴＲＩＳメタン緩衝液（１０カラム容量、４ｍＬ；５０ｍＭ、ｐＨ
７．５）でろ過洗浄し、反応に直接使用した。
反応手順：
固定化した進化したＧＯａｓｅＳＥＱＩＤＮＯ．：１８（４００ｍｇ）をＢＩＳ－
ＴＲＩＳメタン緩衝液（３５ｍＭ、ｐＨ７．２に調整）中の（Ｓ）－２－エチニル－ｐｒ
ｏｐａｎｅ－１，２，３－ｔｒｉｏｌ１－リン酸塩溶液（（９）、５．４ｍｍｏｌ、２
７０ｍＭ、１ｍＬ）に添加した後、水（１００ μL）に再懸濁させた西洋ワサビペルオ
キシダ－ゼ（ＰＥＯ－３０１、１ｍｇ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕ
ｔａｍｉｃｕｍ由来のカタラ－ゼ（ロシュ、凍結乾燥剤、＃１１６５０６４５１０３、３
ｍｇ）を加えた。この反応を気体透過性膜で封じ、３０℃で４８時間激しく振とうした。
２日後の最終変換は９０％変換に達し、（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３－り
ん酸（５）＞９９％ｅ．ｅ．であった。酵素樹脂を濾別し、（Ｒ）－２－エチニルグリ
セルアルデヒド３－ホスフェ－ト（５）の溶液をさらに精製することなく直接使用した。
１ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）： δ ５．０２（ｓ，１Ｈ），４
．００（ｄｑ，２Ｈ），２．８８（ｓ，１Ｈ）．ＬＣ－ＭＳ：（ＥＳ，
ｍ／ｚ）：ｒＣ５Ｈ７Ｏ６Ｐ（Ｍ－Ｈ）：計算値１９３．１；検出値１９３．
０．

Ｈ４方法：固定化ガラクト－スオキシダ－ゼ配列番号１９

酵素固定化手順：
ＮｕｖｉａＩＭＡＣＮｉ帯電樹脂（沈降容量に基づく３ｍＬ）をフィルタ－漏斗に加
え、バインディング緩衝液（１０カラム容量、３０ｍＬ；５００ｍＭ塩化ナトリウム、
５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭイミダゾ－ル、ｐＨ８．０）で洗浄し、樹脂保存
液を除去し、洗浄した樹脂２．４ｇを得た。容器に進化したガラクト－スオキシダ－ゼ（
配列番号：１９、７５ｍｇ）凍結乾燥粉末を硫酸銅（ＩＩ）溶液（１００μＭ；１．００
ｍＬ）に再懸濁し、結合緩衝液（５ｍＬ）と洗浄樹脂（４００ｍｇ）を添加した。２０℃
で５時間回転ミキサ－を用いて混和した。この樹脂を、結合緩衝液（１０カラム容量、４
ｍＬ）およびＢＩＳ－ＴＲＩＳメタン緩衝液（１０カラム容量、４ｍＬ；５０ｍＭ、ｐ
Ｈ７．５）でろ過洗浄し、反応に直接使用した。
反応手順：
固定化ＧＯａｓｅ配列番号１８をＢＩＳ－ＴＲＩＳメタン緩衝液（３５ｍＭ、ｐＨ７．
２に調整）中の（Ｓ）－２－エチニル－ｐｒｏｐａｎｅ－１，２，３－ｔｒｉｏｌ１－
リン酸塩溶液（９、５．４ｍｍｏｌ、２７０ｍＭ、１ｍＬ）に添加（４００ｍｇ）した後
、水（１００μＬ）に再懸濁した西洋ワサビペルオキシダ－ゼ（ＰＥＯ－３０１、１ｍｇ
）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のカタラ－ゼ（ロ
シュ、凍結乾燥剤、＃１１６５０６４５１０３、３ｍｇ）を加えた。この反応液を気体透
過性膜で封じ、３０℃で４８時間激しく振とうした。２日後の最終変換は１００％の変換
に達し、（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３－りん酸（５）は＞９９％ｅ．ｅ
．で得られた。酵素樹脂を濾別し、（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３－ホスフ
ェ－ト（５）の溶液をさらに精製することなく直接使用した。１ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，
４００ＭＨｚ）： δ ５．０２（ｓ，１Ｈ），４．００（ｄｑ，２Ｈ
），２．８８（ｓ，１Ｈ）．ＬＣ－ＭＳ：（ＥＳ，ｍ／ｚ）：Ｃ５Ｈ７Ｏ６
Ｐ（Ｍ－Ｈ）：計算値１９３．１；検出値１９３．０．

「アミノ酸」は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢＢＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａ
ｔｕｒｅＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨されている１文字記号のいずれかによって本
明細書中で言及されている。本明細書中の記載の目的のために、本明細書中の方法で使用
される酵素のために遺伝的にコ－ドされるアミノ酸のために使用されるコ－ドは、表２に
おいて慣用的である：

本明細書に記載されるＥＦｄＡを合成するための工程および本明細書に記載される実験手
順における例示された工程において使用される、または使用され得る酵素の配列番号が、
表３のものに限定されるものではないが、提供される。

西洋ワサビペルオキシダ－ゼ：ワサビ根（Ａｍｏｒａｃｉａｒｕｓｔｉｃａｎａ）から
単離した、ＳＩＧＭＡ（Ｐ８１２５）から市販のワサビＩ型由来の野生型ペルオキシダ
－ゼ。

カタラ－ゼ：（１）ＳＩＧＭＡ（Ｃ１３４５）から市販のウシ肝臓由来の野生型カタラ－
ゼ；または（２）ＣＡＴ－１０１、生体触媒；または（３）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６５０６４５１０３）由来。

本発明の追加の実施形態は、限定されるものではないが、４’－エチニル２’－デオキシ
ヌクレオシドまたはその類似体、例えば、ＥＦｄＡを産生するための本明細書に記載され
る合成プロセス段階における以下の酵素の使用を含む。

Ａ．プリンヌクレオシドホスホリラ－ゼ。
１Ａ．配列番号：９または配列番号：１５と少なくとも８５％、８６％、８７％、
８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、
９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作された
プリンヌクレオシドホスホリラ－ゼであって、前記操作されたプリンヌクレオシドホスホ
リラ－ゼのポリペプチド配列が、配列番号：９または配列番号：１５と比較して、少なく
とも１つのアミノ酸置換またはアミノ酸置換セットを含む、操作されたプリンヌクレオシ
ドホスホリラ－ゼ。
２Ａ．前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ－ゼが、配列番号９または配列番
号１５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるポリペプチ
ド配列を含む、１Ａに記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ－ゼ。
３Ａ．操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ－ゼであって、配列番号９又は配列番
号１５に記載のポリペプチド配列を含むもの。
Ａ４．野生型大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラ－ゼと比較して少なくとも１つの改
良特性を含む、１Ａ～３Ａのいずれか１つの操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ－
ゼ。
５Ａ．改良された特性が、野生型Ｅ．ｃｏｌｉプリンヌクレオシドホスホリラ－ゼと
比較して、基質化合物６．５（その環状または開鎖アルデヒドもしくは水和物、または前
記のいずれかの塩）に対する改良された活性を含む、４Ａ記載の操作されたプリンヌクレ
オシドホスホリラ－ゼ。
６Ａ．改良された特性が、野生型Ｅ．ｃｏｌｉプリンヌクレオシドホスホリラ－ゼと
比較して、ＥＦｄＡ（化合物７）の改良された産生を含む、４Ａ記載の操作されたプリ
ンヌクレオシドホスホリラ－ゼ。
７Ａ．前記操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ－ゼが精製される、Ａ１～６Ａの
いずれか一項に記載の操作されたプリンヌクレオシドホスホリラ－ゼ。
８Ａ．少なくとも１つのアミノ酸置換（すなわち、１つ以上のアミノ酸置換）が保存的
アミノ酸置換である、１Ａ～７Ａのいずれか１つの操作プリンヌクレオシドホスホリラ－
ゼ。

Ｂ．ホスホペントムタ－ゼ。
１Ｂ．配列番号８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同
一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む操作されたホスホペントム
タ－ゼであって、前記操作されたホスホペントムタ－ゼのポリペプチド配列が、配列番号
８と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換またはアミノ酸置換セットを含む、操作さ
れたホスホペントムタ－ゼ。
２Ｂ．遺伝子操作されたホスホペントムタ－ゼが、配列番号：８と少なくとも８５％、
８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、
９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が同一のポリペプチド配列を含む、１Ｂ
記載の操作されたホスホペントムタ－ゼ。
３Ｂ．配列番号：８に記載のポリペプチド配列からなる、操作されたホスホペントムタ
－ゼ。
４Ｂ．野生型Ｅ．ｃｏｌｉホスホペントムタ－ゼと比較して少なくとも１つの改良特
性を含む、１Ｂ～３Ｂのいずれか１つの操作されたホスホペントムタ－ゼ。
５Ｂ．改良された特性が、野生型Ｅ．ｃｏｌｉホスホペントムタ－ゼと比較して、基
質化合物６（その環状または開鎖アルデヒドもしくは水和物、または前記のいずれかの塩
）に対する改良された活性を含む、４Ｂ記載の操作されたホスホペントムタ－ゼ。
６Ｂ．改良された特性が、野生型Ｅ．ｃｏｌｉホスホペントムタ－ゼと比較して、化
合物６．５または化合物７（ＥＦｄＡ）の改良された産生を含む、４Ｂ記載の操作された
ホスホペントムタ－ゼ。
７Ｂ．操作されたホスホペントムタ－ゼが精製される、１Ｂ～６Ｂのいずれか１つの操
作されたホスホペントムタ－ゼ。
８Ｂ．少なくとも１つのアミノ酸置換（すなわち、１つ以上のアミノ酸置換）が保存的
アミノ酸置換である、１Ｂ～７Ｂのいずれか１つの操作されたホスホペントムタ－ゼ。

Ｃ．デオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼ。
１Ｃ．配列番号：５に記載のＳｈｅｗａｎｅｌｌａｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓポリペ
プチド配列由来の野生型からなるデオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼ。
２Ｃ．操作されたデオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼであって、配列番号：６又は
配列番号：１４に記載のポリペプチド配列を含むもの。
３Ｃ．前記操作されたデオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼが、配列番号５、配列番
号６または配列番号１４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％
、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一
であるポリペプチド配列を含む、操作されたデオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼ。
４Ｃ．配列番号：５、配列番号：６もしくは配列番号：１４に対して少なくとも８５％
、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチド配列、または
配列番号：５、配列番号：６もしくは配列番号：１４に対して少なくとも１つのアミノ酸
置換もしくはアミノ酸置換セットを含む、ポリペプチド配列を含む、操作されたデオキシ
リボ－ス－リン酸アルドラ－ゼ、またはその機能的フラグメント
５Ｃ．基質化合物５（（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３－リン酸、その水和
物又は上記のいずれかの塩）に活動を有する１Ｃ～４Ｃのいずれかのデオキシリボ－ス－
リン酸アルドラ－ゼ。
６Ｃ．反応中に基質化合物５（（（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３－リン酸
、その水和物、又は前記のいずれかの塩）上の保護基を必要とせずに化合物６（４－エチ
ニルＤ－２－デオキシリボ－ス５－リン酸、又はその開鎖アルデヒドもしくは水和物形態
、又は前記のいずれかの塩）を生成する能力を含む、１Ｃ～５Ｃのいずれか１つのデオキ
シリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼ。
７Ｃ．デオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼが、野生型Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｈａ
ｌｉｆａｘｅｎｓｉｓデオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼと比較して、化合物６（４
－エチニルＤ－２－デオキシリボ－ス５－リン酸、またはその開鎖アルデヒドもしくは水
和物形態、または前記のいずれかの塩）の改良された産生を含む改良された特性を有する
、２Ｃ～６Ｃのいずれか１つの操作されたデオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼ。
８Ｃ．デオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼが精製される、１Ｃ～７Ｃのいずれか１
つのデオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼ。
９Ｃ．少なくとも１つのアミノ酸置換（すなわち、１つ以上のアミノ酸置換）が保存的
アミノ酸置換である、２Ｃ～７Ｃのいずれか１つの操作されたデオキシリボ－ス－リン酸
アルドラ－ゼ。

Ｄ．パントテン酸キナ－ゼ。
１Ｄ．少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性をＳＥＱ
ＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ．：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ．：１３または
ＳＥＱＩＤＮＯ．：２０、またはそれらの機能性フラグメントに有するポリペプチド
配列を含み、ここに、前記工学的パントテン酸キナ－ゼのポリペプチド配列は、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ．：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ．：１３またはＳ
ＥＱＩＤＮＯ．：２０と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換またはアミノ酸置
換セットを含む、工学的パントテン酸キナ－ゼ。
２Ｄ．前記操作されたパントテン酸キナ－ゼが、配列番号２、配列番号１２、配列番号
１３または配列番号２０と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％
、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一
であるポリペプチド配列を含む、１Ｄに記載の操作されたパントテン酸キナ－ゼ。
３Ｄ．操作されたパントテン酸キナ－ゼであって、配列番号：２、配列番号：１２、配
列番号：１３または配列番号：２０に記載のポリペプチド配列を含むもの。
４Ｄ．野生型Ｅ．ｃｏｌｉパントテン酸キナ－ゼと比較して少なくとも１つの改良特
性を含む、１Ｄ～３Ｄのいずれか１つの操作されたパントテン酸キナ－ゼ。
５Ｄ．改良された特性が、野生型ｅと比較して基質化合物４（（Ｒ）－２－エチニルグ
リセルアルデヒドまたはその水和物形態）に対する改良された活動を含む、４Ｄ記載の操
作されたパントテン酸キナ－ゼ。大腸菌のパントテン酸キナ－ゼ。
６Ｄ．改良された特性が、野生型パントテン酸キナ－ゼと比較して、化合物５（（Ｒ）
－２－エチニルグリセルアルデヒド３－リン酸）の改良された産生を含む、５Ｄ記載の操
作されたパントテン酸キナ－ゼ。
７Ｄ．改良された特性が、野生型ｅと比較して基質化合物３（２－エチニルプロパン－
１，２，３－トリオ－ル）に対する改良された活性を含む、４Ｄ記載の操作されたパント
テン酸キナ－ゼ。大腸菌のパントテン酸キナ－ゼ。
８Ｄ．改良された特性が、野生型パントテン酸キナ－ゼと比較して、化合物９（（Ｓ）
－２－エチニルプロパン－１，２，３－トリオ－ル１－リン酸）の改良された産生を含む
、７Ｄ記載の操作されたパントテン酸キナ－ゼ。
９Ｄ．パントテン酸キナ－ゼが精製される、１Ｄ～８Ｄのいずれか１つの操作されたパ
ントテン酸キナ－ゼ。
１０Ｄ．少なくとも１つのアミノ酸置換（すなわち、１つ以上のアミノ酸置換）が保存
的アミノ酸置換である、１Ｄ～９Ｄのいずれか１つの操作されたパントテン酸キナ－ゼ。

Ｅ．ガラクト－スオキシダ－ゼ。
１Ｅ．少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性をＳＥＱ
ＩＤＮＯｓ．：１、１０、１１、１６、１７、１８または１９に有するポリペプチド
配列、またはそれらの機能性フラグメントを含む工学的ガラクト－スオキシダ－ゼであっ
て、前記工学的ガラクト－スオキシダ－ゼのポリペプチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯｓ
．：１、１０、１１、１６、１７、１８または１９と比較して、少なくとも１つのアミノ
酸置換またはアミノ酸置換セットを含む、工学的ガラクト－スオキシダ－ゼ。
２Ｅ．遺伝子操作されたガラクト－スオキシダ－ゼが、配列ＩＤＮＯ：１、１０、１
１、１６、１７、１８または１９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
またはそれ以上であるポリペプチド配列を含む、１Ｅ記載の操作されたガラクト－スオキ
シダ－ゼ。
３Ｅ．操作されたガラクト－スオキシダ－ゼであって、配列番号１、１０、１１、１６
、１７、１８又は１９に示されるポリペプチド配列を含むもの。
４Ｅ．野生型Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍガラクト－スオキシダ－ゼと比較して少な
くとも１つの改良特性を含む、１Ｅ～３Ｅのいずれか１つの操作されたガラクト－スオキ
シダ－ゼ。
５Ｅ．改良された特性が、野生型Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍガラクト－スオキシダ
－ゼと比較して、第一級アルコ－ルである基質に対する改良された活性を含む、４Ｅ記載
の操作されたガラクト－スオキシダ－ゼ。
６Ｅ．改良された特性が、野生型Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍガラクト－スオキシダ
－ゼと比較して基質化合物３（２－エチニルプロパン－１，２，３－トリオ－ル）に対す
る改良された活動を含む、４Ｅの操作されたガラクト－スオキシダ－ゼ。
７Ｅ．改良された特性が、野生型Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍガラクト－スオキシダ
－ゼと比較して、化合物４（（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒドまたはその水和物
形態）の改良された生産を含む、６Ｅの操作されたガラクト－スオキシダ－ゼ。
８Ｅ．改良された特性が、野生型Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍガラクト－スオキシダ
－ゼと比較して、基質化合物９（（（Ｓ）－２－エチニルプロパン－１，２，３－トリオ
－ル１－リン酸）に対する改良された活性を含む、４Ｅの操作されたガラクト－スオキシ
ダ－ゼ。
９Ｅ．改良された特性が、野生型Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍガラクト－スオキシダ
－ゼと比較して、化合物５（（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３－リン酸または
その水和物形態）の改良された生産を含む、８Ｅ記載の操作されたガラクト－スオキシダ
－ゼ。
１０Ｅ．前記ガラクト－スオキシダ－ゼが精製される、１Ｅ～９Ｅのいずれか１つの操
作されたガラクト－スオキシダ－ゼ。
１１Ｅ．少なくとも１つのアミノ酸置換（すなわち、１つ以上のアミノ酸置換）が保存
的アミノ酸置換である、１Ｅ～１０Ｅのいずれか１つの操作されたガラクト－スオキシダ
－ゼ。

Ｆ．酢酸キナ－ゼ。
１Ｆ．配列番号：３または配列番号：２１に記載のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔ
ｉｍａポリペプチド配列由来の野生型からなる酢酸キナ－ゼ。
２Ｆ．操作されたアセテ－トキナ－ゼであって、前記操作されたアセテ－トキナ－ゼが
、配列番号３または配列番号２１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
以上同一であるポリペプチド配列を含む、操作されたアセテ－トキナ－ゼ。
３Ｆ．配列番号：３または配列番号：２１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８
８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作された
酢酸キナ－ゼ、ここで操作された酢酸キナ－ゼのポリペプチド配列は、配列番号：３また
は配列番号：２１と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換またはアミノ酸置換セット
を含む、操作された酢酸キナ－ゼ。
４Ｆ．野生型Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ酢酸キナ－ゼと比較して少なくとも１つの改良特
性を含む２Ｆまたは３Ｆの酢酸キナ－ゼ。
５Ｆ．改良された特性が、野生型Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａａｃｅｔ
ａｔｅキナ－ゼと比較して、基質化合物４（（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒドま
たはその水和物形態）上のリン酸化反応におけるＡＴＰ－補因子リサイクリングのための
改良された活性を含む、４Ｆ記載の酢酸キナ－ゼ。
６Ｆ．改良された特性が、野生型Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａａｃｅｔ
ａｔｅキナ－ゼと比較して、化合物５（（Ｒ）－２－エチニルグリセルアルデヒド３－リ
ン酸またはその水和物形態、または前記のいずれかの塩）の改良された産生を含む、５Ｆ
記載の酢酸キナ－ゼ。
７Ｆ．前記改良された特性が、野生型Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａａｃ
ｅｔａｔｅキナ－ゼと比較して、基質化合物３（２－エチニルプロパン－１，２，３－ト
リオ－ル）上のリン酸化反応におけるＡＴＰ－補因子リサイクリングのための改良された
活性を含む、４Ｆ記載の酢酸キナ－ゼ。
８Ｆ．前記改良された特性が、野生型Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａａｃ
ｅｔａｔｅキナ－ゼと比較して、化合物９（（（Ｓ）－２エチニル－ｐｒｏｐａｎｅ－１
，２，３－ｔｒｉｏｌ１－リン酸塩）またはそのいずれかの塩の改良された生産を含む
、７Ｆ記載の酢酸キナ－ゼ。
９Ｆ．前記酢酸キナ－ゼが精製される、１Ｆ～８Ｆのいずれか一項に記載の酢酸キナ－
ゼ。
１０Ｆ．少なくとも１つのアミノ酸置換（すなわち、１つ以上のアミノ酸置換）が保存
的アミノ酸置換である、２Ｆ～７Ｆのいずれか１つの操作された酢酸キナ－ゼ。

Claims

４’－エチニル２’－デオキシヌクレオシドまたはその類似体の合成方法であって、マン
ガン（ＩＩ）塩を含む緩衝液中で化合物６．５

［式中、２Ｘ^＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、
（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。
］
をプリンヌクレオシドホスホリラ－ゼおよびヌクレオ塩基もしくはその類似体と組合せる
ことを含む、前記方法。
４’－エチニル２’－デオキシヌクレオシドまたはその類似体が

である、請求項１に記載の方法。
化合物

を単離することをさらに含む、請求項１または２記載の方法
マンガン（ＩＩ）塩を含む緩衝液中で化合物６

およびホスホペントムタ－ゼをプリンヌクレオシドホスホリラ－ゼおよびヌクレオシド塩
基と組み合わせることをさらに含む、請求項１に記載の４’－エチニル２’－デオキシヌ
クレオシドまたはその類似体の合成方法。
反応溶液から無機リン酸副生成物を除去することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
（ａ）反応混合物にスクロ－スホスホリラ－ゼおよびスクロ－スを加えること、または、
（ｂ）反応混合物にカルシウム、マグネシウムまたはマンガンを加えることにより、反応
溶液から無機リン酸副生成物を除去することを含む、請求項５に記載の方法。
４’－エチニル２’－デオキシヌクレオシドまたはその類似体を単離することをさらに含
む、請求項４から６のいずれか１項に記載の方法。
４’－エチニル２’－デオキシヌクレオシドまたはその類似体が

である、請求項．４から６のいずれか１項に記載の方法。
化合物

を単離することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
化合物６を合成する工程をさらに含む請求項４に記載の方法であって、水溶液中で化合物
５

［式中、２Ｘ^＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、
（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。
］
をアセトアルデヒドおよびデオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼと組み合わせて化合物
６を生成することを含む、前記方法。
反応が密閉容器で実施される、請求項１０に記載の方法。
化合物５を合成する工程をさらに含む請求項１０または１１に記載の方法であって、化合
物４

を、２価金属塩の存在下で緩衝液中のパントテン酸キナ－ゼと組み合わせ、その場で再生
したＡＴＰをリン酸源として組み合わせて、化合物５を生成する前記方法。
（ａ）アセチルリン酸および酢酸キナ－ゼ、または（ｂ）ピルビン酸、リン酸および酸素
の存在下でのピルビン酸オキシダ－ゼ、カタラ－ゼおよび酢酸キナ－ゼ、または（ｃ）そ
れらの組合せを用いて、その場でＡＴＰを再生する、請求項１２に記載の方法。
（ａ）パントテン酸キナ－ゼが固定されているか、または、（ｂ）パントテン酸キナ－ゼ
と酢酸キナ－ゼが固定されている、請求項１３に記載の方法。
化合物４を合成する工程をさらに含む請求項１２に記載の方法であって、該合成が、酸素
の存在下で、緩衝液中において、化合物３

をガラクト－スオキシダ－ゼ、銅、カタラ－ゼおよびパ－オキシダ－ゼまたは酸化剤と組
み合わせて、化合物４を生成させることを含む、前記方法。
ガラクト－スオキシダ－ゼが固定されている、請求項１５に記載の方法。
４’－エチニル２’－デオキシヌクレオシドまたはその類似体の合成方法であって、マン
ガン（ＩＩ）塩を含む緩衝液中において、化合物５

［式中、２Ｘ^＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、
（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。
］、
アセトアルデヒドおよびヌクレオ塩基またはその類似体を、デオキシリボ－ス－リン酸ア
ルドラ－ゼ、ホスホペントムタ－ゼおよびプリンヌクレオシドホスホリラ－ゼと組み合わ
せることを含む、前記方法。
反応混合物から無機リン酸副生成物を除去することをさらに含む、請求項１７に記載の方
法。
（ａ）反応混合物にスクロ－スホスホリラ－ゼおよびスクロ－スを加えること、または、
（ｂ）反応混合物にカルシウム、マグネシウムまたはマンガンを加えることにより、反応
混合物から無機リン酸副生成物を除去することを含む、請求項１８に記載の方法。
４’－エチニル２’－デオキシヌクレオシドを単離することをさらに含む、請求項１７か
ら１９のいずれか１項に記載の方法。
４’－エチニル２’－デオキシヌクレオシドが

である、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
化合物

を単離することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
化合物６．５

［式中、２Ｘ^＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、
（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。
］
を合成する方法であって、マンガン（ＩＩ）塩を含む緩衝液中において化合物６

［式中、２Ｘ^＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、
（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。
］
をホスホペントムタ－ゼと組み合わせることを含む、前記方法。
化合物６

［式中、２Ｘ^＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、
（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。
］
を合成する方法であって、化合物５

［式中、２Ｘ^＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、
（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。
］
を水溶液中でアセトアルデヒトおよびデオキシリボ－ス－リン酸アルドラ－ゼと組み合わ
せて化合物６を生成することを含む、前記方法。
化合物５

［式中、２Ｘ^＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、
（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。
］
を合成する方法であって、化合物４

を、２価金属塩の存在下で緩衝液中のパントテン酸キナ－ゼと組合せ、その場で再生した
ＡＴＰをリン酸源として組み合わせることを含む、前記方法。
（ａ）アセチルリン酸および酢酸キナ－ゼ、または（ｂ）ピルビン酸、リン酸および酸素
の存在下でのピルビン酸オキシダ－ゼ、カタラ－ゼおよび酢酸キナ－ゼ、または（ｃ）そ
れらの組合せを用いて、その場でＡＴＰを再生する、請求項２５に記載の方法。
（ａ）パントテン酸キナ－ゼが固定されているか、または、（ｂ）パントテン酸キナ－ゼ
と酢酸キナ－ゼが固定されている、請求項２６に記載の方法。
化合物４

を合成する方法であって、化合物３

を、ガラクト－スオキシダ－ゼ、銅、カタラ－ゼ、およびペルオキシダ－ゼ、または酸化
剤と、酸素の存在下、緩衝溶液中で組み合わせて、化合物４を生成させることを含む、前
記方法。
ガラクト－スオキシダ－ゼが固定されている、請求項２８に記載の方法。
化合物４

を単離する方法であって、
（１）酸素の不在下で、水と混和しない有機溶媒中で安定なＮ，Ｎ－アセタ－ルまたはＮ
，Ｏ－アセタ－ルを生成するアミン、ジアミンまたはアミノアルコ－ルと化合物４を反応
させてアミナ－ルを形成し、
（２）水と混和しない有機溶媒の存在下でアミナ－ルを有機酸または無機酸と反応させて
化合物４を再生することを含む、前記方法。
化合物５

［式中、２Ｘ^＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、
（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。
］
を合成する方法であって、化合物９

［式中、２Ｘ^＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、
（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。
］
を、酸素、カタラ－ゼおよびペルオキシダ－ゼもしくは化学酸化剤のいずれかの存在下で
、緩衝液中のガラクト－スオキシダ－ゼと組み合わせて化合物５を生成することを含む、
前記方法。
化合物９

［式中、２Ｘ^＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、
（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。
］
を合成する方法であって、化合物３

を、２価金属塩の存在下で緩衝液中のパントテン酸キナ－ゼと組み合わせ、その場で再生
したＡＴＰをリン酸源として組み合わせて、化合物９を生成する前記方法。
下記式の化合物。
下記式の化合物。
下記式の化合物。

［式中、２Ｘ^＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、
（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。
］
下記式の化合物。

［式中、２Ｘ^＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、
（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。
］
下記式の化合物。

［式中、２Ｘ^＋は（ａ）２つのプロトン、（ｂ）１つのプロトンと１つの１価カチオン、
（ｃ）同一または異なる２つの１価カチオン、または（ｄ）１つの２価カチオンである。
］