CS254375B1 - Biokatalyzátor pro přípravu purinových 2'-deoxy-p—D-ribonukleosidů - Google Patents

Abstract

Řešení se týká vytvoření vhodného imobilizovaného biokatalyzátoru na bázi alginátového gelu a jeho použití k efektivnější přípravě 2-deoxy-beta-D- -ribonukleosidů, tj. látek, které jsou významnými biologicky účinnými látkami a cherapeutiky. Podstata spočívá v tom, že imobilizovanou složku biokatalyzátoru na bázi alginátového gelu tvoří buňky bakterií Escherichia coli SPT-. Uvedený biokatalyzátor se s výhodou použije pro přípravu 9-/2-deoxy-beta-D-riboťuranosyl/ purinů, 9-/2-deoxy-beta-D- -riboruranosyl/-6-metylpurinu, 2'-deoxyadenosinu nebo 2'-deoxyguanosinu.

Description

Vynález se týká biokatalyzátoru pro přípravu purinových 2'-deoxy-beta-ribonukleaaidů.

Biokatalyzátory na bázi alginátovýoh gelů s obsahem vázaných íntaktních buněk mikroorganismů /např. bakterií, kvasinek nebo nižších hub/ jsou používané v moderních biotechnologických postupech výroby nejrůznějšich sloučenin. Jejich podstatou je skutečnost, že některé enzymy si při imobilizaci zachovávají aktivitu jako v živných buňkách /vyšší než isolované enzymy/ a mohou proto velmi účinně katalysovat biotransformace vhodných substrátů. Výhodou užití těchto biokatalyzátorů je např. skutečnost, že vzniklé látky nejsou dále transformovány /jak tomu může být v nejmobilizovaných rostoucích buňkách/ a dále snadné provedení reakce /a především isolace/ produktů.

Mezi významné látky takto připravované patří např. L-aminokyseliny, chirální alkoholy, imobilizované buňky slouží k selektivním transformacím v řadě steroidů aj. Významné je také použití biokatalyzátorů tohoto typu pro výrobu složitých sloučenin, které se nesnadno vyrábí klasickými chemickými postupy. Mezi takové látky patří např. 2-deoxyrbeta-D-ribonukleosidy pyrimidinových a purinových bází. Tyto sloučeniny mají mimořádný význam jako složky deoxyribonukleovýoh kyselin, i jako prekurzory jejich biosyntézy v živných buňkách.

Četné látky tohoto typu odvozené od chemicky obměněných pyrimidinových a purinových bází jsou významné jako biologicky účinné látky i jako chemoterapeutika.

Přirozené deoxyribonukleosidy mají značnou důležitost také jako suroviny pro syntézu oligodeoxyribonukleotidů s uplatněním v genovém inženýrství.

Pro přípravu přirozených 2-deoxyribonukleosidů je nejvhodnějším zdrojem deoxyribonukleová kyselina (DNK), získávaná nejvýhodněji z mlíči ryb. Štěpení DNK se musí provádět působením enzymů a ceny takto získaných materiálů jsou vysoké. Další možností přípravy je konverze ze snáze dostupných beta-D- ribonukleosidů, záskávaných z ribonukleových kyselin; pro tento účel bylo popsáno mnoho reakcí, ale dobře zvládnuta je pouze příprava pyrimidinových 2-deoxy-beta-D-ribonukleosidů.

Chemické syntézy 2-deoxy-beta-ribonukleosidú se provádějí reakcí vhodných derivátů heterocyklických bází s aktivovanými sloučeninami 3,5-disubstituované 2-deoxy-D-robofuranosy.

Při těchto reakcích vznikají obvykle směsi anomerů, které je třeba dělit. V poslední době byly popsány i postupy, které ve zvláštních případech dovolují připravit téměř čisté beta-anomery purinových 2-deoxyribonukleosidů s modifikovanou bází tzv. reakcí fázového přenosu (např. F. Seela a A. Kehne: Liebigs Ann. Chem. 1983, 876) nebo reakcí sodných solí purinových bází s 3,5-disubstituovaným 2-deoxy-D-ribofuranosylchloridem (Kazimierczuk Z., Cottam H.B., Revankar G. R. Robins R.K.: J. Amer. Chem. Soc. 106, 6 379 (1984).

Biotechnologický způsob přípravy nukleosidů popisuje např. japonský patent č. 63 393, založený na reakčich katalysovanýoh nukleosidfosforylasami obsaženými v různých mikroorganismech Tento postup je však vhodný především pro přípravu ribonukleosidů.

Naproti tomu lze syntézu 2-deoxy-beta-D-ribonukleosidů uskutečnit enzymová katalysovanou reakcí přirozených i modifikovaných heterocyklických bází (purinových, pyrimidinových) s 2-deoxy-beta-D-ribonukleosidy v přítomnosti enzymu deoxyribosyltransferasy. Některé mikroorganismy, např. rodu Lactobacillus (Cardinaud R. , Methods Enzymol. 51, 446 (1978) jsou zvláště bohatým zdrojem tohoto enzymu. Při této reakci, která se provádí ve vodném prostředí za téměř neutrálních podmínek, dochází k přenosu cukerného zbytku z nukleosidu (donoru) na heterocyklickou bázi (akceptor). Tyto reakce byly již použity pro přípravu pyrimidinových i purinových deoxyribonukleosidů (Holguin J., Cardinaud R.; Eur. J. Biochem. 54, 505 (1975); Holguin J., Cardinaud R., Salemink C.A.: Eur. J. Biochem. 54, 515 (1975); Baranski K.,

Bardos T.J., Bloch A., Kalman T.I.: Biochem. Pharmacol. 18, 347 (1969); VŘtruba I., Holý A., Wightman R.: Biochim. Biophys. Acta 324, 14 (1973); M.Ch. Huang, Hatfield K., Roetker A.W. , ílontgomery J.A., Blakley R.L. : Biochem. Pharmacol. 30, 2 663 (1981); M.Ch. Huang, Montgomery J. A., Thorpe Μ., Stewart E.L., Secrist III. J.A., Barkley R.L.: Arch. Biochem. Biophys.

222, 133 (1983); Carson D.A., Wasson D.B., Kaye J., Ullman B., Martin jr. D.W., Robins R.K.,

Montgomery J.A,: Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.77, 6 865 (1980)). Výhodou postupu je výhradní vznik beta-anomeru a možnost částečné regenerace donoru i nevyužité báze. Nevýhodou dosavadního provedení je nutnost alespoň částečně purifikovat potřebný enzym, čímž se omezuje praktické použití metody.

Mezi purinovými deoxyribonukleosidy zaujímají zvláštní místo kromě cytostatika 9-(2-deoxy-beta-D-ribofuranosyl)-6-thioguaninu 9-(2)deoxy-beta-D-ribofuranosyl)deriváty 2,6-diaminopurinu, 2-fluoradeninu a především 9-(2-deoxy-beta-D-ribofuranosyl)-6-metylpurin. Tato látka projevuje vysokou a selektivní toxicitu vůči buňkám infikovaným mykoplasmou. (U.S. Patent 4 387 161). Infekce mykoplasmou má velkou důležitost pro zachování čistoty tkáňových kultur eukaryontních buněk při kultivaci a studiu virů, při genové manipulaci a při výrobě protilátek a vakcin v lidské a veterinární medicíně. 9-(2-Deoxy-beta-D-ribofuranosyl)-6-metylpurin byl dosud připravován obtížnou chemickou syntézou (Robins M.J., Robins R.K.: J. Amer. Chem. Soc.

87, 4 934 (1965); Montgomery J.A. , Hewson K.: J. Med. Chem. 11, 48 (1968) nebo transdeoxyribosylací z 6-raetylpurinu a 2~-deoxythymidinu v přítomnosti isolované deoxyribosyltransferasy z Lactobacillus helveticus (McGarrity G.J., Carson D.A. : Exp. Cell Res. 139., 199 (1982)).

Důležitými purinovými deoxyribonukleosidy jsou dále 2-deoxyadenosin a 2”-deoxyguanosin, potřebné pro chemickou syntézu genů. Jejich příprava chemickou syntézou (Kazimierczuk a další, viz výše) nebo konverzí z ribonukleosidů (Robins M.J., Wilson J.S., Hansske F.:

J. Amer. Chem. Soc. 105, 4 059 (1983); Lessor R.A. , Leonard N.J.: J. Org. Chem. 46, 4 300 (1981)) je sice možná, ale ekonomicky málo výhodná. Pro výrobu 2'-deoxyadenosinu enzymovou transdeoxyribosylací je hlavním nedostatkem špatná rozpustnost adeninu a rovněž nutnost zbavit uvedený enzym kontaminující adenosinaminasy, která vzniklý produkt snadno degraduje. Hlavní překážkou užití transdeoxyribosylace pro výrobu 2'-deoxyguanosinu je mimořádně nízká rozpustnost guaninu i 2'-deoxyguanosinu, což snižuje výtěžky a znesnadňuje isolaci produktu reakce.

Uvedené nevýhody přípravy purinových 2'-deoxyribonukleosidů chemickými metodami i enzymatickou transdeoxyribosylací odstraňuje předmětný vynález biokatalyzátoru pro přípravu purinových 2'-deoxyribonukleosidů, který sestává z alginátového gelu obsahujícího zmobilizované buňky bakterií Escherichia coli SPT , kterého lze s výhodou použít pro přípravu 9-/2-deoxy/-beta-D-ribofuranosyl/purinů obecného vzorce I

kde R¹ je vodík, metylskupina, amino-, alkylamino, dialkylaminoslupina, kde alkyl je tvořen řetězcem s 1 až 3 uhlíky, hydroxyskupina, dimetylaminometylenaminoskupina, metylthioskupina 2 nebo halogen, R je vodík, metylskupina, amino, dimetylaminomet,ylenamino, metylthioskupina 3 „ nebo halogen, a R je vodík nebo aminoskupina. Jeho použiti spočívá v tom, že se roztok nebo suspense purinové báze obecného vzorce II /11/

3 —3 “1 kde R až R mají shodný význam jako ve vzorci I ve výsledné koncentraci 10 mol 1 až 10 1 mol 1 1 ve vodném pufru o pH 5,0 až 8,0, s výhodou octanu amonného nebo TRIS-hydrochloridu, který obsahuje 2'-deoxy-beta-D-ribonukleosid obecného vzorce III

kde j_e vodík nebo metylskupina s výhodou 2'-deoxyuridin, a to v molárním poměru 1:1 až 1:10 vztaženo na látku vzorce II, míchá s biokatalyzátorem v objemových poměrech 100:1 až 1:1 vztaženo na biokatalyzátor nebo nechá protékat sloupcem biokatalyzátoru, a to při teplotě 20 °C až 45 °C, a látka obecného vzorce I se ze směsi isoluje filtrací a chromatografií, s výhodou na papíře nebo na sloupci hydrofobizovaného silikagelu ve vodě.

Biokatalyzátoru je možno také s výhodou použít pro přípravu látek obecného vzorce I,

3 kde R až R mají stejný význam jako ve vzorci I, značených nuklidy vodíku, uhlíku a heteroaatomů, s výhodou radionuklidy vodíku a uhlíku, spočívají v tom, že se látka vzorce II, nebo látka vzorce II obsahující nuklidy atomů vodíku, uhlíku nebo heteroatomů uvede do reakce s látkou vzorce III, nebo s látkou III obsahující nuklidy vodíku nebo uhlíku v cukerné části a s biokatalyzátorem, a výsledný produkt vzorce I se z reakční směsi isoluje chromatografií na papíře nebo kapalinovou chromatografií.

Dalším příkladem výhodného použití biokatalyzátoru je jeho použití pro přípravu.9-/2-deoxy-beta-D-ribofuranosyl/-6-metylpurinu vzorce IV

OH spočívající v tom, že se 6-metylpurin vzorce V

CH₃

uvede do reakce s látkou vzorce III v přítomnosti biokatalyzátoru a produkt vzorce IV se z reakční směsi isoluje chromatografií na hydrofibizovaném silikagelu, s výhodou oktadecyl-silikagelu, ve vodě.

Výhodné je i použití biokatalyzátoru pro přípravu 2'-deoxyadenosinu vzorce VI

NH,

°A>

(VI)

OH spočívající v tom, že se N^-dimetylaminometylenadenin vzorce VII n=ch-n(ch₃)₂

H (VII) uvede do reakce s látkou vzorce III v přítomnosti biokatalyzátoru, reakční směs se po filtraci zředí stejným objemem koncentrovaného vodného amoniaku, ponechá 2 až 24 hod při teplotě 20 °C až 50 °C, odpaří při sníženém tlaku a látka vzorce VI se ze směsi isoluje chromatografii, s výhodou na oktadecyl-silikagelu ve vodě, a pro přípravu 2'-deoxyguanosinu vzorce VIII

O h₂n

HO

HN

Ja, dt;>

(VIII)

OH spočívající v tom, že se N -dimetylaminometylenguanin vzorce IX

HN |ch₃)₂n-ch=

O do

H (IX) uvede do reakce s látkou vzorce III a s biokatalyzátorem, chromatografii na oktadecyl-silikagelu se isoluje látka vzorce X

(X) která se ponechá reagovat s vodným roztokem obsahujícím 10 až 25 I hmotnostních amonikau, a to při teplotách 20 °C až 50 °C a látka vzorce VIII se po odpaření při sníženém tlaku isoluje krystalisací.

Vynález vychází z poznatku, že v auxotrofním mutantu thymin-dependentnlho kmene bakterií Escherichia coli (SPT ) je vysoká hladina deoxyribqsyltransferasy. Tento kmen bakterií byl již použit pro enzymovou syntézu radioaktivně značených 5'-deoxyribonukleotidů thyminu (Čs. aut. osv. 172 684): bezbuněčný extrakt z buněk tohoto mutanta katalyzuje transformaci thyminu na 2'-deoxythymidin-5'-monofosfát. S využitím 2-deoxyribosa-l-fosfátu (nebo 2'-deoxyadenosinu) jako zdroje deoxyribosylové funkce dochází nejprve k transdeoxyribosylaci thyminu za vzniku 2'-deoxythymidinu a k jeho následné fosforylaci dalšími enzymy v tomto extraktu přítomnými. Předmětný vynález využívá sice téhož kmene SPT , liší se však od uvedeného použití v těchto podstatných ohledech: (a) biokatalyzátor dle vynálezu využívá celých bakteriálních buněk, které jsou však imobilizovány v gelovém materiálu, (b) Za těchto podmínek se uplatní výhradně transdeoxyribosylačni reakce bez následujících fosforylaci a degradací vzniklých sloučenin, (o) Donorem deoxyribosylového zbytku je pyrimidinový 2'-deoxyribonukleosid. Novost předmětného vynálezu spočívá v tom, že využívá jiné enzymové aktivity, obsažené v těchto buňkách, která s použitím pyrimidinových deoxyribonukleosidů jako donorů umožňuje připravit purinové 2-deoxyribonukleosidy z heterocyklických bází.

Za podmínek podle vynálezu probíhá specificky syntéza uvedených látek, takže odpadá nutnost příslušný enzym isolovat nebo čistit a výrazně se zjednodušuje isolaoe reakčních produktů vzorce I.

Příprava biokatalyzátoru je velice jednoduchá: Suspense buněk bakterií Escherichia coli SPT se uvede do alginátového sólu ve vodě (výsledný obsah 10 až 25 % hmotnostních biomasy) a výsledný sol je převede do gelové formy vkapáním do vodného roztoku solí, např. chloridu vápenatého. Takto připravený biokatalyzátor je dostatečně stálý a neztrácí enzymovou aktivitu po několika týdnech pří teplotách slabě nad bodem mrazu. Jeho regenerace po reakci není účelná, i když jej lze opakovaně pro reakci použít.

Enzymová reakce probíhá v heterogenní směsi biokatalyzátoru a vodných pufrovanýoh roztoků obou substrátů rekace. Jako optimální hodnota pH se osvědčilo pH 5,2 až 7,0 a nízká iontová síla pufru. Pro preparativnl účely lze použít bud těkavého pufru (např. trietylamoniumhydrogenkarbonátu) nebo s výhodou 0,05 mol 1 octanu amonného pH 5,8 až 5,9. Mohou být použity i jiné roztoky pufrů, např. s obsahem TRIS nebo pufrační roztoky fosfátové či mravenčanové.

Reakce se provádí mírným třepáním biokatalyzátoru s roztokem obou reakčních komponent nebo čerpáním tohoto roztoku přes sloupec biokatalyzátoru. Heterocyklické purinové báze vzorce II jsou v některých případech málo rozpustné ve vodě, přesto lze však reakci úspěšně provést i s látkou v pufračním roztoku suspendovanou, protože vznikající produkt vzorce I je ve vodě většinou dobře rozpustný. Jako donor deoxyribosylového zbytku lze použít např.

komerčně dostupný 2'-deoxythymidin vzorce III (R = metyl), ale nejvhodnější je pro tento účel 2'-deoxyuridin (III, R = H). Tato látka je dobře rozpustná ve vodě a je snadno dostupná bud z uridinu nebo totální syntézou z D-arabinosy (Čs. aut. osv. 166 523, 167 733) a je levnější než výše uvedený 2'-deoxythymidin.

Reakce probíhá při teplotách od 20 °C do 40 °C, s výhodou při 37 °C. Rychlost a výtěžek syntézy lze ovlivnit poměrem biokatalyzátoru a reaktanů, vzájemným poměrem reaktantů, jejich koncentrací a reakční dobou. Pro dosažení optimálních výsledků a maximální efektivnosti provedení se osvědčil molární poměr látky II (akceptor) a 2'- deoxyuridinu (donor) 1:2 až 1:3. Pro preparativnl účely lze s výhodou použít roztoky o výsledné koncentraci až 0,2 mol l’¹ na donor a 0,01 mol 1^-^ na akceptor, tj. s pouhým pětinásobkem koncentrace solí v pufračním roztoku. Množství použitého biokatalyzátoru záleží na jeho zrnění: při standardním provedení (průměr geolvých kuliček 5 až 6 mm) se s výhodou používá 10 až 100 kuliček biokatalyzátoru na 10 ml reakční směsi. Toto množství záleží na kvalitě buněčného materiálu, relativním množství imobilizovaných buněk (vztaženo na objem biokatalyzátoru/i na chemických vlastnostech akceptoru. Reakční rychlost lze zvýšit přidáním dalšího biokatalyzátoru. Rovnovážného stavu reakce se obvykle dosáhne v intervalu 2 až 10 hodin.

Pro přerušení reakce se inkubační směs dekantuje od biokytalyzátoru a k odstranění případně uvolněných buněčných zbytků a jiných částic se zfiltruje přes membránové filtry.

Takto získaná směs obsahuje obvykle čtyři komponenty: uráčil a 2'-deoxyuridin (resp. thymin a 2'-deoxythymidin) v poměru ca 1:1, výchozí heterocyklickou bázi a reakční produkt. Konverze na látku vzorce I činí obvykle 70 až 100 %. Chemické vlastnosti těchto složek dovolují ve většině případů snadnou isolaci produktu i regeneraci ostatních složek směsi. Pro dělení lze užít např. ionexové chromatografie na katexu, papírové rozdělovači chromatografie nebo chromatografie, na hydrofobisovaném silikagélu (např. oktadecyl-silikagelu) ve vodném prostředí. Při tomto postupu lze přímo aplikovat bez předchozí koncentrace reakční směs po ultrafiltraci na sloupec sorbentu.

Eluci vodou se vymývají postupně soli, uráčil a 2'-deoxyuridin, který lze dobře regenerovat. Dalším promýváním vodou nebo vodnými roztoky s rostoucí koncentrací etanolu, metanolu nebo dioxanu se eluuje postupně výchozí heterocyklická báze vzorce II a konečně čistý reakční produkt I. Po odpaření ve vakuu a případné krystalisaci z vhodného rozpouštědla se tento produkt získá ve zcela čistém stavu.

Reakce probíhá se sloučeninami substituovanými v polohách 2,6 i 8 purinového kruhu a není doprovázena vedlejšími reakcemi. V dobrém preparativním výtěžku lze připravit např. 6-metylpurin-2'-deoxyribonukleosid (IV) (viz výše). U adeninu může při prodloužené reakční době vznikat 2'-deoxyinosiď jako produkt deaminace reakčního produktu. Obě látky lze snadno dělit; pro ekonomickou přípravu důležitého 2'-deoxyadenosinu (VI) je však možno s výhodou použít variantu, při které je adenin nahrazen N^-dimetylaminometylenadeninem vzorce VII, snadno z adeninu dostupným (Okumura K. a další, J. Org. Chem. 36, 1 573 (1971)). Vznikající produkt transdeoxyribosylace se adenosindeaminasou nedeaminuje. Působením slabě alkalického prostředí, např. vodných roztoků amoniaku, se z této látky získá čistý 2'-deoxyadenosin. Protože výchozí báze VII je ve vodě dobře rozpustná, lze tuto variantu použít pro přípravu 2'-deoxyadenosinu ve velkém měřítku.

Obdobného postupu lze užít i pro přípravu 2'-deoxyguanosinu vzorce VIII. V tomto případě je omezujícím faktorem velmi nízká rozpustnost guaninu ve vodném prostředí. Reakcí guaninu s dineopentylacetalem dimetylformamidu při zvýšené teplotě se snadno připraví N -dimetylaminometylenguanin (IX), ve vodě podstatné rozpustnější. Po provedeni syntézy za obvyklých podmínek se nejprve isoluje reakční produkt vzorce X chremaťógrafií na oktadecyl-silikagelu a působením vodných roztoků amoniaku se snadno převede na 2'-deoxyguanosin.

Biokatalyzátor dle vynálezu je použitelný i pro přípravu purinových 2'—deoxyribonukleosidů značených nuklidy (radicnuklidy) vodíku, uhlíku i dalších atomů. Podle okolností lze užít bud značeného akceptoru nebo donoru nebo obou.značených komponent (2'-deoxyuridin značený v cukerné části) a získat produkty značené na jedné nebo obou částech molekuly. Postup provedení umožňuje snadnou regeneraci značených prekursorů.

Způsob syntézy purinových 2'-deoxyribonukleosidů, založený na použití biokatalyzátoru, tak umožňuje účinnou přípravu těchto důležitých látek ve vysokém výtěžku z dostupných surovin, s nízkým přístrojovými i energetickými nároky a s možností snadné isolace produktů i regenerace výchozích surovin.

V dalším je vynález osvětlen na příkladech přípravy předmětného biokatalyzátoru a jeho použití pro přípravu purinových 2'-deoxyrobonukleosidů, aniž se tím jakkoli omezuje.

Přikladl

Příprava biokatalyzátoru s obsahem buněk Escherichia ooli SPT . Směs 0,75 g alginátu (např. Protanal LF, výrobek firmy Protan A/S.P.O., Drammen, Norsko) a 15 ml vody se míchá do vzniku sólu. Do tohoto sólu se postupně vmíchá 2,5 g mokré hmotnosti biomasy bakterielních buněk Escherichia coli SPT (připravené podle Cs. aut. osv. 172 684) předem suspendovaných v 10 ml 0,9% vodného roztoku chloridu draselného. Vzniklá homogenní směs se nechá odkapávat ze skleněné kolony o vnitřním průměru 2,4 cm do stálé míchaného 2% roztoku chloridu vápenatého ve vodě (100 ml) za teploty 20 až 25 °C. V roztoku chloridu vápenatého se tvoří kuličky gelu, které jsou po 6 hodinách dostatečně mechanicky pevné. Roztok se oddekantuje a gelové kuličky promyjí dekantací 0,05 mol 1 octanem amonným. Tento materiál se použije jako biokatalyzátor v dalších příkladech.

Příklad 2

Obecný postup přípravy 2'-deoxyribonukleosidů vzorce I. K roztoku 25 /umolů heterocyklické báze vzorce II a 11,4 mg (100 /umol)' 2'-deoxyuridinu v 5 ml 0,05 mol 1 ¹ octanu amonného pH 5,8 se přidá 7 kuliček biokatalyzátoru podle příkladu 1 a směs se míchá pomalým kýváním při 37 °C v lázni Alikvoty 10 /ll inkubačni směsi se odebírají v intervalech 2 a 4 hod a analysují kapalinovou chromatografii na koloně Silasorb 300 £18 (4 x 20 mm) ve směsi 0,05 mol 1 ⁷ octanu triethylamonném a metanolu podle údajů tabulky 2. Rychlost eluce 0,6 ml/min, detekce při 254 nm. Polochy píku látek I a II se integrují a vypočte se konverze na látku I. Tyto údaje jsou uvedeny v tabulce 1.

Příklad 3

Srovnáni dnorové účinnosti 2'-deoxyuridinu a 2'-deoxythymidinu. Reakce se provede podle příkladu 2 s použitím 25 /umolů 6-metylpurinu a 50 /umolů 2'-deoxyuridinu v 5 ml pufru nebo s použitím 25 /umolů 6-metylpurinu a 50 /umolů 2'-deoxythymidinu v 5 ml pufru. Přidá se 7 kuliček biokatalyzátoru podle přikladu 1 do každé směsi a- míchá kývavým .pohybem při 37 °C. Po 4 hod se alikvoty 10 /ul směsí analysují podle příkladu 2. Při reakci s 2'-deoxyuridinem je konverze 6-metylpurinu na 9-(2-deoxy-beta-ribofuranosyl)-6-metylpurin 54,5 %, při reakci s 2'-deoxythymidinom 52,5 %.

Příklad 4

Příprava 9-(2-deoxy-beta-D-ribofuranosyl)-6-metylpurinu. K roztoku 1 g 2'-deoxyuridinu a 0,30 g 6-metylpurinu ve 100 ml 0,025 ml.l fosfátového pufru pH 6,9 dle Sorensena se přidá 150 kuliček biokatalyzátoru podle příkladu 1 a směs se míchá kývavým pohybem při 37 °C 7 hodin. Roztok se dekantuje a kuličky promyjí 10 ml vody. Tento roztok se filtruje přes membránový filtr (Millipore 0,4 /u) a nanese na sloupec 190 ml oktadecyl-silikagelu (30/u), ekvilibrovaný vodou. Sloupec se eluuje vodou při průtokové rychlosti 2 ml/min a přůběh eluce monitoruje na přístroji Uvicord LKB (Uppsala, Švédsko) pri 254 nm. Postupně se eluuje uráčil a 2'-deoxyuridin, kvalita frakcí (10 min-intervaly) se prověřuje analýsou podle příkladu 2 v 0,05 mol l^-7 octanu trietylamonném. Frakce 2'-deoxyuridinu se spojí, odpaří při 40 °C/2 kPa zbytek krystaluje z etanol-etheru. Získá se 128 mg 2'-deoxyuridinu zpět.

Další elucí vodou se získá 6-metylpurin (po krystalisaci z etanol-petroletheru výtěžek 90 mg). Potom se kolona promývá za stejných podmínek směsí metanolu a vody (1:9) a jímá se hlavní frakce, absorbující v ultrafialovém světle. Po jejím odpaření ve vakuu se odparek rekrystaluje z etanol-petroletheru. Získá se 447 mg (80‘ %) 9-(2-deoxy-beta-D-ribofuranosyl)-6-metylpurinu b.t. 161 °C. Pro (250,3) vypočteno: 52,79 % C, 5,64 % H, 22,39 % N;

nalezeno 52,85 % C, 5,56 % H, 22,14 % N. Hmotové spektrum: M⁺ 250. UV-Spektrum:A_max ^{265 nm (£}max ^{7 000) při pH 7}' Anax ^{263 nm (£}max ^{7 900) při pH 12}’

Příklad 5

Příprava 2'-deoxyadenosinu. K roztoku 76,4 mg (0,4 mmol) N^-dimetylaminometylenadeninu a 182,4 mg (0,8 mmol) 2'-deoxyuridinu v 10 ml 0,05 mol.l octanu amonného pH 5,8 se přidá 100 kuliček biokatalyzátoru podle příkladu 1 a směs se inkubuje při 37 °C za pomalého kývání 18 hodin. Roztok se oddekantuje, nahradí čerstvou směsí (viz výše) a inkubuje 3 h za stejných podmínek. Tentýž postup se opakuje ještě jednou. Spojené dekantované roztoky (30 ml) se zfiltrují podle, příkladu 3 a filtrát se smísí se stejným objemem konc. vodného amoniaku. Směs se ponechá stát při teplotě místnosti 18 h a odpaří při 40 °C/2 kPa.

Odparek v 10 ml vody se vnese na sloupec 100 ml Amberlitu IRC 50 (H⁺ forma) a sloupec se promývá vodou do ztráty UV-absorpce. Poté se zředěným (1:10) vodným amoniakem eluuje UV-absorbující podíl adeninových sloučeni, který se odpaří za týchž podmínek. Tento odparek se v 5 ml vody vnese na sloupec 90 ml oktadecyl-silikagelu (30 /u) a sloupec se eluuje vodou (2 ml/min). Po skončení eluce adeninu se dále pokračuje elucí směsí metanolu a vody (1:9). Ultrafialová absorpce označuje eluci produktu. Tento podíl se spojí, odpaří za výše uvedených podmínek a krystaluje z etanol-etheru. Získá se 138 mg (62 %) 2'-deoxyadenosinu, identického s autentickým materiálem (Calbiochem, USA) podle papírové chromatografie a kapalinové chromatografie (viz tab. 1).

Přiklad 6

Příprava N²-dimetylaminoetylen-2'-deoxyguanosinu. Ke směsi 3 g guaninu a 90 ml dimetylformamidu se přidá 15 ml dineopentylacetátu dimetylformamidu a směs se míchá při 110 °C pod chlorkalciovým uzávěrem do vzniku čirého roztoku. Odpaří se při 60 °C/13 Pa, přidá 50 ml etanolu a ca 2 g pevného kysličníku uhličitého. Po jeho rozpuštění se směs znovu odpaří při 40 °C/2 kPa a zbytek se krystaluje z vody. Získá se 3,5 g (85 %) N²-dimetylaminometylenguaninu, netaje do 260 °C. Pro ^gH^^NgOg (206,2) vypočteno: 46,59 %, 4,89 % H,

40,76 % N; nalezeno: 46,40 % C, 4,82 % H, 40,74 % N. Hmotové spektrum: M⁺ 206.

K roztoku 206 mg této látky a 456 mg 2-deoxyuridinu v 25 ml 0,05 mol 1 octanu amonného pH 5,8 se přidá 120 kuliček biokatalyzátoru podle příkladu 1 a směs se míchá kýváním při 37 °C 30 hodin. Roztok se oddekantuje, filtruje přes membránový filtrát se nanese na sloupec oktadecyl-silikagelu (viz příklad 3). Sloupec se eluuje nejprve vodou (2 ml/min) do odstranění uracilu a 2-dexyuridinu (viz příklad 3) a potom směsí metanol-voda 2 , (5:95) do vymyti frakce N -dimetylaminometylenguaninu. Nakonec se eluci sloupce směsi metanol-voda (9:1) získá produkt, který se po odpaření při 40 °C/2 kPa sráží z metanolu etherem. Získá se 161 mg (50 %) N²-dimetylaminometylen-2'-deoxyguanosinu, b.t. 154 °C.

Pro ^C']_3^íí]_8^N6°4 (³²²'³) vypočteno: 48,44 % C, 5,63 % H, 26,08 % N; nalezeno: 48,27 % C,

5,46 % H, 26,18 % N. UV-Spektrum:Λ 235 nm (č 17 300), 290 nm (£ 23 700) (ve vodě).

' · ' ť _max max nax

Příklad 7

Příprava 2 -deoxyguanosinu. Roztok 100 mg N^x'-dimetylaminometylen-2'-deoxyguanos j nu připraveného podle příkladu 6 ve směsi 5 ml vody a 2 ml konc. vodného amoniaku se por;· ohá stát 18 h při 20 °C a směs se odpaří ve vakuu. Získá se kvantitativní výtěžek chromatograf icky (papírová a kapalinová chromatografie) čistého 2'-deoxyguanosinu identického s autentickým materiálem (Calbiochem, USA).

Příklad 8

Příprava [‘¹‘^C-guaninJ-2'-deoxyguanosinu. V 10 ml lékovce se vakuově odpaří 1,85 MBq [jj-l^c^-guaninu (specifická aktivita 6,5 GBq/mmol), přidá se 2 ml 0,05 mol 1 octanu amonného pH 5,8, 3 kuličky biokatalyzátoru podle příkladu 1 a 1 ml roztoku 6 0/ug 2-deoxyuridinu ve vodě. Směs se inkubuje 60 min při 37 °C, roztok se přenese kvantitativně do jiné 10 ml lékovky a zahustí ve vakuu (2 kPa) nad kysličníkem fosforečným na objem ca 50/ul. Tento koncentrát se aplikuje ve třech dávkách na kolonu Silasorbu (viz příklad 2) a chromatografie se provádí v 0,05 mol 1 octanu trietylamonném. Získané podíly 2'-deoxyguanosinu se odpaří při 40 °C/2 kPa a doplní do 1 ml vodou. Obsah 2'-deoxyguanosinu, stanovený měřením redioaktivity alikvotu, je 0,74 MBq (výtěžek 40 %).

Příklad 9

Určení vlivu poměru donor:akceptor. Do čtyř 25 ml baněk se naváží po 5 mg 6-metylpurinu a postupně 8,75 mg, 17,5 mg, 26,25 mg a 35 mg 2'-deoxyuridinu. Do baněk se přidá 5 ml 0,05 ,ol 1 ¹ octanu amonného pH 5,8 a vždy 5 kuliček biokatalyzátoru podle příkladu 1.

Po 90 minutách inkubace při 37 °C se konverze na 2'-deoxyribosid stanoví způsobem popsaným v příkladu 2. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 3. Zvyšování poměru donor:akceptor nad hodnotu 2,0 nemá vliv na konverzi za podmínek syntézy.

Přikladlo

Určení vlivu pH na průběh syntézy. Do 25 ml baněk se naváží po 5 mg 6-metylpurinu a 17,5 mg 2'-deoxyuridinu a přidá se 5 ml 0,05 mol 1 ¹ pufru (octanu amonného pH 5,2 až 6,2 nebo fosforečnanu dle Sorensena o pH 6,9). Baňky se inkubují 90 min při 37 °C po přidání 5 kuliček biokatalyzátoru podle příkladu 1 a konverze se stanoví metodou podle příkladu 2. Získané hodnoty jsou uvedeny v tabulce 4. Optimální hodnota pH pro tuto syntézu je 5,8.

Tabulka 1

Syntéza 9-(2-deoxy-beta-D-ribofuranosyl)purinů^a Láká I

Konverze i

R

CH3	H	H	64,5
nh2	H	H	63,51
CH3NH	H	H	64,5
(ch3)2h	H	H	70,0
(CH3)2N-CH=N	H	H	75,0
NH2	CH3	H	67,0
NH2	nh2	H	46,0
™2	H	NH2	21,0
Cl	H	H	63,5
Cl	Cl	H	33,0
II	nh2	H	46,0
NH2	SCK3	H	72,0
OH	H	H	38,5
OH	NH2	H	34,0
OH	(CH3)2n-ch=n	H	58,0
sch3	H	H	63,0
aViz příklad 2;	toho 11 % 2'-deoxyinosinu	vzniklého	deaminací

·.

Tabulka 2

Kapalinová chromatografie látek vzorce I a II k^a

R	R‘	RJ	Sl	S2	S3	S4	S5
NH2	H	Η I	6,59	3,59
		II	3,10	2,46
ch3nh	H	Η I			6,36
		II			4,55
(ch3)2n	H	Η I				4,69
		II				4,03
(CH3)2N-CH=N	H	Η I				2,05
		II				1,69
NH2	CH3	Η I			4,61
		II			2,79
NH2	NH2	Η I			1,84
		II			1,28
NH2	SCÍ13	Η I				3,90
		II				3,45
NH2	H	NHO I			3,17
		2 II			1,66
H	nh2	Η I			1,89
		II			1,08
CH3	H	Η I			2,90
		II			1,75
Cl	H	Η I			3,55
		II			2,18
Cl	Cl	Η I					2,79
		II					1,69
OH	H	Η I	1,88	1,09
		II	0,77	0,54
OH	NH2	Η I			1,02
		II			0,17
OH	(ch3)	ON-CH=N Η I			3,93
		2 II			2,26
SCH3	H	Η I					2,31
		II					2,26
Uráčil			0,35	0,23
2‘”-Deoxyuridin			0,98	0,53	0,41	0,12	0,08
2'-Deoxythymidin					0,85
Thymin					0,40

^ak = (t_R~t )/t , kde t_R je retenční čas a t je mrtvý čas kolony; viz příklad 2.

h -1

Směsi metanol: 0,05 mol 1 octan trietylamonný pH 7,0: Sl 2,5:97,5, S2 5:95, S3 1:9, S4 1:4, S5 25:75.

Tabulka 3

Vliv poměru donor:akceptor na syntézu 9-(2-deoxy-beta-D-ribofuranosyl)-6-metylpurinu^a

Molární poměr 2‘-deoxyuridin: 6-metylpurin Konverze 6-metylpurinu, % ^lViz příklad 9.

Tabulka 4

Vliv pH na enzymovou syntézu 9-(2-deoxy-beta-D-ribofuranosyl)-6-metylpurinu^a pH Konverze

5,2	29
5,5	31
5,8	33
6,2	28
6,9	23
7,9	18

^aViz příklad 10.

Claims (1)

1, Biokatalyzátor pro přípravu purinových 2'-deoxyribonukleosidů vyznačený tím, že sestává z alginátového gelu obsahujícího imobilizované buňky bakteriií Escherichia coli SPT“.