BR112020007037A2 - variantes de g-csf porcino e seus usos - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a variantes de fator estimulante de colônia de granulócitos porcinos (pG-CSF). As variantes de pG-CSF são úteis no tratamento, prevenção ou redução da incidência de infecções bacterianas em suínos. Métodos de tratamento de suínos são revelados.

Description

“VARIANTES DE G-CSF PORCINO E SEUS USOS”
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade de Pedido de patente provisório de número de série 62/570.877, depositado em quarta-feira, 11 de outubro de 2017 que está aqui incorporado em sua totalidade a título de referência.
[002] A presente invenção refere-se a polipeptídeos de fator estimulante de colônia de granulócitos porcinos variantes (pG-CSF) contendo um aminoácido sintético. O aminoácido sintético é modificado por ligação de uma molécula de poli(etileno glicol) (PEG). A variante de pG-CSF PEGuilada é usada para tratar infecções bacterianas em um suíno. Quando o suíno for uma porca periparturiente, a infecção bacteriana pode ser mastite, metrite e síndrome de agalactia (MMA). A redução de infecções bacterianas em porcas prenhes aumenta a sobrevivência de leitões.
[003] O impacto econômico de doenças infecciosas na produção de alimentos de origem animal é bem documentado. As doenças infecciosas reduzem os lucros, aumentam os custos de produção e comprometem produtos alimentícios, bem como afetam o desempenho, a saúde e o bem-estar do animal. As doenças podem causar morbidade e mortalidade de animais recém-nascidos, jovens (por exemplo, estoque de reposição) ou adultos, resultando em efeitos devastadores na produção de alimentos de origem animal.
[004] Em porcinos, tal doença pode ser mastite, metrite e síndrome de agalactia (MMA). Mastite é uma infecção bacteriana do úbere. Apenas uma ou duas glândulas podem ser afetadas ou a infecção poderia se espalhar para várias glândulas.. Metrite é uma infecção bacteriana do trato urogenital, às vezes apresentada como descargas vulvares. Agalactica é uma redução, ou a perda total de produção de leite por uma porca. Síndrome de MMA pode ser altamente variável e pode não apresentar os sintomas acima. Dessa forma, a detecção e o diagnóstico da síndrome de MMA podem ser difíceis, e pode não ser detectada até um leitão lactante mostrar sinais de fome, perda de peso ou até morte.
[005] Como a síndrome de MMA é difícil de detectar, um tratamento profilático é preferível. O uso de antibióticos, particularmente antibióticos de classe compartilhada, é desencorajado em animais produtores de alimentos, portanto, uma terapia sem antibióticos é preferível no tratamento de porcinos. Uma citocina como o pG-CSF poderia aumentar os números de neutrófilos em um animal, dessa forma, estimulando o sistema imunológico inato a responder rapidamente a uma infecção bacteriana. A modificação de uma variante de pG-CSF com PEG poderia prolongar a farmacocinética e a estabilidade da citocina, dessa forma, potencializando seus efeitos.
[006] Um G-CSF bovino PEGuilado pode ser usado para tratar mastite em gado leiteiro (WO2010/011735). G-CSF humano PEGuilado também foi descrito (WO2000/044785). Um G-CSF porcino do tipo selvagem PEGuilado foi proposto para o tratamento de infecções respiratórias, como infecções virais (WO2005/025593). Como revelado em vários aspectos no presente documento, uma variante de pG-CSF PEGuilado eleva o número de neutrófilos no sangue porcino, reduz a incidência da síndrome de MMA em porcas periparturientes e/ou aumenta a sobrevivência dos leitões.
[007] A presente invenção fornece variantes de fator estimulante de colônia de granulócitos porcinos (pG-CSF) que têm uma sequência consenso de: X1PLSPASSLPQSFLLKX2LEQVRKIQADGAELQERLCATHKLCX3PQELVLLGHSLGL
PQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPELAPALDILQLDVTDLA TNIWLQX4EDLRX4APASLPTQGTVPTFTSAFQRRAGGVLVVSQLQSFLELAYRVLRY LAEP (SEQ ID NO: 13). A variável X1 pode ser o dipeptídeo metionina e alanina como nas SEQ ID NOs: 2 e 9, o dipeptídeo norleucina e alanina como nas SEQ ID NOs:7 e 10, alanina como nas SEQ ID NOs:4 e 11, ou ausente como nas SEQ ID NOs: 8 e 12. A variável X2 pode ser cisteína como nas SEQ ID NOs: 2, 4, 7 e 8, ou
X2 pode ser serina como nas SEQ ID NOs: 9, 10, 11 e 12. A variável X3 pode ser um aminoácido sintético. O aminoácido sintético pode estar presente na posição 43 (posição relativa ao pG-CSF do tipo selvagem maduro como determinado na SEQ ID NO: 3) conforme mostrado na SEQ ID NO: 13. O aminoácido sintético pode ser para- acetil fenilalanina (pAF). A variável X4 pode ser metionina nas SEQ ID NOs:2, 4, 8, 9, 11 e 12, ou X4 pode ser norleucina como nas SEQ ID NOs:7 e 10. O aminoácido sintético pAF pode ser covalentemente ligado a uma molécula de poli(etileno glicol) (PEG). O PEG pode ter um peso molecular de cerca de 20 kD a cerca de 50 kD, ou um peso molecular de cerca de 30 kD. De preferência, o PEG é uma molécula de PEG linear.
[008] A presente invenção fornece uma variante de fator estimulante de colônia de granulócitos porcinos (pG-CSF) que têm uma sequência de: MAPLSPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCATHKLC[pAF]PQELVLLGHSL
GLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPELAPALDILQLDVTD
LATNIWLQMEDLRMAPASLPTQGTVPTFTSAFQRRAGGVLVVSQLQSFLELAYRVLR YLAEP (SEQ ID NO: 2), em que um aminoácido sintético para-acetil fenilalanina (pAF) presente na posição 43 é covalentemente ligado a uma molécula de PEG linear de 30 kD.
[009] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende qualquer uma das variantes de pG-CSF descritas no presente documento, e pelo menos um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[010] A presente invenção fornece um método de tratamento de uma infecção bacteriana em um suíno que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das variantes de pG-CSF descritas no presente documento ao suíno em necessidade da mesma. A infecção bacteriana pode ser mastite, metrite e síndrome de agalactia (MMA). O suíno em necessidade de tratamento pode ser uma porca periparturiente. A quantidade terapeuticamente eficaz de uma variante de pG-CSF pode ser cerca de 10 a 100 μg/kg de peso do animal, ou cerca de 30 a 50 μg/kg de peso do animal ou cerca de 40 μg/kg de peso do animal. A administração de qualquer uma das variantes de pG-CSF descritas no presente documento pode ocorrer pelo menos uma vez 7 dias ou menos antes do parto (ou seja, no ou após o 107º dia de gestação), ou no parto. Em alguns aspectos, o método de tratamento de uma infecção bacteriana em um suíno pode compreender uma segunda administração de qualquer uma das variantes de pG- CSF descritas no presente documento dentro de 14 dias ou menos após o parto (ou seja, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou dentro de 14 dias após o parto).
[011] A presente invenção fornece um método de estimulação de resposta imunológica inata em um suíno que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das variantes de pG-CSF descritas no presente documento ao suíno em necessidade da mesma. O suíno em necessidade de estimulação pode ser uma porca periparturiente. Em outros aspectos, o suíno em necessidade de estimulação pode ser um suíno com um sistema imunológico comprometido ou enfraquecido. Em aspectos adicionais, o suíno em necessidade de estimulação pode ser um suíno que tem ou está em risco de desenvolver uma infecção incluindo, por exemplo, uma infecção bacteriana ou uma infecção viral. Em alguns aspectos, o método pode estimular a produção de citocinas (por exemplo, interferons (IFNs), fatores de necrose tumoral (TNFs), fatores estimulantes de colônia (CSFs), e/ou interleucinas (ILs)), e/ou ativar ou aumentar os níveis de células imunes como células dendríticas (DCs), linfócitos (por exemplo, células B, células T e células exterminadoras naturais (NK)) e mielócitos (por exemplo, mastócitos, mieloblastos (por exemplo, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, monócitos e macrófagos)). Em algumas modalidades desses aspectos, o método pode estimular ou aprimorar a função antibacteriana de neutrófilos, por exemplo, aumentando a função antibacteriana mediada por mieloperoxidase dos neutrófilos-peróxido de hidrogênio-haleto.
[012] Nos métodos que estimulam a resposta imunológica inata, a quantidade terapeuticamente eficaz de uma variante de pG-CSF pode ser cerca de 10 a 100 μg/kg de peso do animal, ou cerca de 30 a 50 μg/kg de peso do animal ou cerca de 40 μg/kg de peso do animal. A administração de qualquer uma das variantes de pG-CSF descritas no presente documento pode ocorrer pelo menos uma vez 7 dias ou menos antes do parto (ou seja, no ou após o 107º dia de gestação), ou no parto. Em alguns aspectos, o método de tratamento de uma infecção bacteriana em um suíno pode compreender uma segunda administração de qualquer uma das variantes de pG-CSF descritas no presente documento dentro de 14 dias ou menos após o parto (ou seja, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou dentro de 14 dias após o parto).
[013] A presente invenção fornece um método para reduzir a mortalidade de leitões que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das variantes de pG-CSF descritas no presente documento a uma porca periparturiente. A quantidade terapeuticamente eficaz de uma variante de pG- CSF pode ser cerca de 10 a -100 μg/kg de peso do animal, ou cerca de 30 a 50 μg/kg de peso do animal ou cerca de 40 μg/kg de peso do animal. A administração de qualquer uma das variantes de pG-CSF descritas no presente documento pode ocorrer pelo menos uma vez 7 dias ou menos antes do parto (ou seja, no ou após o 107º dia de gestação), ou no parto. Em alguns aspectos, o método de redução de mortalidade de leitões pode compreender uma segunda administração à porca periparturiente de qualquer uma das variantes de pG-CSF descritas no presente documento dentro de 14 dias ou menos após o parto (ou seja, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou dentro de 14 dias após o parto).
[014] A presente invenção fornece o uso de qualquer uma das variantes de pG-CSF descritas no presente documento na fabricação de um medicamento para uma infecção bacteriana em um suíno. A infecção bacteriana pode ser síndrome de MMA. O suíno pode ser uma porca periparturiente. A presente invenção fornece o uso de qualquer uma das variantes de pG-CSF descritas no presente documento na fabricação de um medicamento para reduzir a mortalidade de leitões.
[015] A presente invenção fornece qualquer uma das variantes de pG-CSF descritas no presente documento para uso na terapia. A terapia pode ser o tratamento de uma síndrome de infecção bacteriana em um suíno. A infecção bacteriana pode ser síndrome de MMA. O suíno pode ser uma porca periparturiente.
A terapia pode ser a redução de mortalidade de leitões. A variante de pG-CSF pode ser administrada a uma porca periparturiente em cerca de 10 a 100 μg/kg de peso do animal, ou cerca de 30 a 50 μg/kg de peso do animal ou cerca de 40 μg/kg de peso do animal. A variante de pG-CSF pode ser administrada pelo menos uma vez 7 dias ou menos antes do parto (ou seja, no ou após o 107º dia de gestação), ou no parto. Uma segunda administração pode ser aplicada à porca periparturiente 14 dias ou menos após o parto.
[016] Uma “infecção bacteriana” é o crescimento de uma ou mais espécies bacterianas sobre ou dentro da pele, membranas mucosas, glândulas, olhos, ouvidos, trato urogenital, trato digestivo, pulmões, sangue ou órgãos de um animal.
As bactérias podem ser uma espécie classificada dentro dos gêneros de Achromobacter, Actinobacillus, Actinomyces, Bacillus, Bordatella, Brucella, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Escherichia, Haemophilus, Klebsiella, Leptospira, Listeria, Mycoplasma, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Sphaerophorus, Staphylococcus, Streptococcusou Vibrio.
[017] O termo "porcino" como usado no presente documento, refere-se a um porco, especialmente o porco doméstico (Sus scrofa domesticus ou Sus domesticus)
e pode incluir porcos em miniatura bem como aquelas raças criadas para produção de carne. Por “porco”, “suíno” ou “porcino” entende-se todas as raças de porco.
[018] A porca periparturiente é definida como o porcino fêmea prenhe dentro das últimas semanas de gestação durante as primeiras semanas após o parto. O parto tipicamente ocorre em cerca de 114 dias de gestação. Uma porca periparturiente poderia ser um suíno fêmea prenhe de cerca de 100 dias de gestação a cerca de 14 dias após o parto. Um leitão é um suíno desde o nascimento até o desmame com cerca de 3 semanas de idade.
[019] Um "aminoácido sintético" refere-se a um aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina ou selenocisteína. Exemplos de tais aminoácidos incluem, porém sem limitação para-acetil fenilalanina (pAF), acetilglucosaminil-L-serina e N- acetil glicosaminil-L-treonina. Alguns aminoácidos sintéticos e sua incorporação em polipeptídeos e modificação subsequente são descritos no documento WO2010/011735 e no documento WO2005/074650.
[020] Como usado no presente documento, os termos “tratando”, “tratar” ou “tratamento” incluem restringir, desacelerar, parar, reduzir, melhorar ou reverter a progressão ou gravidade de um sintoma, distúrbio, condição ou doença. Em alguns aspectos, a revelação fornece métodos específicos para o tratamento profilático de um sintoma, distúrbio, condição ou doença que não é observado ou detectado em um animal que pode estar em risco de desenvolver um ou mais desses sintomas, distúrbio, condição ou doença. Em alguns aspectos, um tratamento será terapeuticamente aplicado.
[021] O termo "quantidade eficaz" como usado refere-se àquela quantidade da variante de pG-CSF que é administrada que terá o efeito desejado, como prevenir, tratar ou reduzir uma infecção bacteriana em um porcino. Quando o porcino for uma porca periparturiente, o tratamento de infecções bacterianas na porca pode aumentar a sobrevivência de leitões. A quantidade eficaz pode variar com fatores como o peso da porca.
[022] Por “administração” entende-se a injeção de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos e composições contendo os ditos compostos revelados. Por exemplo, sem limitação, a administração pode ser intramuscular (i.m) ou subcutânea (s.c.).
[023] O termo “cerca de” será entendido pelos versados na técnica e variará até certo ponto dependendo do contexto em que o mesmo é usado. Como usado no presente documento, “cerca de” destina-se a abranger variações de ±10%, ±5%, ou ±1% (i.e., ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2% ou ±1%).
[024] As variantes de pG-CSF da presente invenção podem ser prontamente produzidas em uma variedade de células incluindo células de mamíferos, células bacterianas como E. coli, Bacillus subtilis ou Pseudomonas fluorescence e/ou em células fúngicas ou de levedura. As células hospedeiras podem ser cultivadas usando técnicas bem conhecidas. Os vetores contendo as sequências de polinucleotídeos de interesse (por exemplo, as variantes de pG-CSF e sequências de controle de expressão) podem ser transferidos dentro da célula hospedeira por métodos bem conhecidos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular.
Por exemplo, o método de transformação com cloreto de cálcio é comumente utilizado para células procarióticas, enquanto o tratamento com fosfato de cálcio ou eletroporação pode ser usado para outras células hospedeiras eucarióticas. Vários métodos de purificação de proteína podem ser empregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) e Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3a Edição, Springer, NY (1994).
[025] As variantes de pG-CSF PEGuiladas podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis. Em alguns aspectos, uma formulação é um produto liofilizado estável que é reconstituído com um diluente adequado ou uma solução aquosa de alta pureza com veículos, conservantes, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis (consultar Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19a ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995).
[026] A variante de pG-CSF PEGuilada pode ser formulada com um tampão farmaceuticamente aceitável, e o pH ajustado para fornecer estabilidade aceitável, e um pH aceitável para administração. Em alguns exemplos não limitadores, um pH aceitável para administração pode estar e uma faixa de cerca de 5 a cerca de 8 (ou seja, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7 ou cerca de 8). Além disso, as composições de pG-CSF PEGuiladas da presente invenção podem ser colocadas em um recipiente como um frasco, um cartucho, um dispositivo de aplicação por caneta, uma seringa, tubo para administração intravenosa ou um saco de administração intravenosa.
[027] Os exemplos experimentais a seguir são ilustrativos de variantes de pG-CSF, e seu uso no tratamento de infecções bacterianas em suínos, como síndrome de MMA em uma porca periparturiente. A redução da incidência de infecções bacterianas na porca também reduz a mortalidade de leitões. Será entendido que outras modalidades e usos serão evidentes aos versados na técnica e que a invenção não se limita a esses exemplos ilustrativos específicos ou modalidades preferenciais.
EXEMPLO 1
[028] Variantes diferentes do cDNA (número de acesso ao Genbank U68481.1) de fator estimulante de colônia de granulócitos porcinos (pG-CSF) são geradas introduzindo um códon de parada de TAG nas posições selecionadas por mutagênese por PCR sítio-dirigida. Também, a porção do cDNA que codifica a sequência de sinais é substituída por um único códon de metionina (ou seja, ATG).
Por exemplo, um cDNA que codifica pG-CSF maduro do tipo selvagem com a sequência de sinais alterada poderia ser: 1 atggcccctc tcagccctgc cagctccctg ccccagagct tcctgctcaa gtgcttagag 61 caagtgagga aaatccaggc tgatggcgcc gagctgcagg agaggctgtg tgccacccac 121 aagctgtgcc acccccagga gctggtgctg ctcgggcact ctctgggcct cccccaggct 181 tccctgagca gctgctccag ccaggccctg cagctgactg gctgcctgaa ccaactgcat 241 ggcggcctcg tcctctacca gggcctcctg caggccctgg cgggcatctc cccagagctg 301 gcccccgccc tggacatact gcagctggat gtcaccgact tagccaccaa catctggctg 361 cagatggaag acctgaggat ggccccggcc tcgcttccca cccagggcac cgtgccgacc 421 ttcacctcgg ccttccagcg ccgggcagga ggggtcctgg ttgtctccca gctgcagagc 481 ttcctggagc tggcgtaccg tgtcctgcgc tacctcgccg agccctga (SEQ ID NO: 5). Essa variante poderia codificar um polipeptídeo de: 1 MAPLSPASSL PQSFLLKCLE QVRKIQADGA ELQERLCATH
KLCHPQELVL LGHSLGLPQA 61 SLSSCSSQAL QLTGCLNQLH GGLVLYQGLL QALAGISPEL
APALDILQLD VTDLATNIWL 121 QMEDLRMAPA SLPTQGTVPT FTSAFQRRAG GVLVVSQLQS
FLELAYRVLR YLAEP (SEQ ID NO: 1). Se for desejado que o códon de parada de TAG substitua o resíduo H43, a sequência de cDNA poderia ser: 1 atggcccctc tcagccctgc cagctccctg ccccagagct tcctgctcaa gtgcttagag 61 caagtgagga aaatccaggc tgatggcgcc gagctgcagg agaggctgtg tgccacccac 121 aagctgtgct agccccagga gctggtgctg ctcgggcact ctctgggcct cccccaggct 181 tccctgagca gctgctccag ccaggccctg cagctgactg gctgcctgaa ccaactgcat 241 ggcggcctcg tcctctacca gggcctcctg caggccctgg cgggcatctc cccagagctg 301 gcccccgccc tggacatact gcagctggat gtcaccgact tagccaccaa catctggctg 361 cagatggaag acctgaggat ggccccggcc tcgcttccca cccagggcac cgtgccgacc 421 ttcacctcgg ccttccagcg ccgggcagga ggggtcctgg ttgtctccca gctgcagagc
481 ttcctggagc tggcgtaccg tgtcctgcgc tacctcgccg agccctga (SEQ ID NO: 6). O polipeptídeo resultante poderia ser: 1 MAPLSPASSL PQSFLLKCLE QVRKIQADGA ELQERLCATH KLCxPQELVL LGHSLGLPQA 61 SLSSCSSQAL QLTGCLNQLH GGLVLYQGLL QALAGISPEL
APALDILQLD VTDLATNIWL 121 QMEDLRMAPA SLPTQGTVPT FTSAFQRRAG GVLVVSQLQS
FLELAYRVLR YLAEP (SEQ ID NO: 2), em que o “x” indica o resíduo H43 substituído por um aminoácido sintético, como descrito abaixo.
[029] Os plasmídeos que codificam as variantes são transformadas em células de E. coli contendo os componentes de sistema de código genético expandido para incorporação do aminoácido sintético para-acetil fenilalanina (pAF).
As células transformadas são desenvolvidas em meios suplementados com pAF e induzidas para expressar pG-CSF com pAF incorporado nos sãos indicados. O sistema de expressão foi descrito, por exemplo, no documento WO 2010/011735 (incorporado no presente documento a título de referência), e é geralmente conhecido na técnica.
[030] A expressão das variantes de cDNA transfectadas é induzida com arabinose, as células são coletadas, e as variantes de sítio de pAF de pG-CSF alvo são isoladas e purificadas por cromatografia líquida de alta pressão em fase reversa (RP-HPLC). Um amino óxi-PEG linear de 30 kD ativado é conjugado especificamente no sítio ao pAF incorporado. Os conjugados PEG-pG-CSF são purificados a partir de PEG em excesso e variantes de pG-CSF não conjugados por cromatografia.
EXEMPLO 2
[031] A atividade biológica in vitro de variantes de pG-CSF PEGuiladas
(PEG-pG-CSF) é medida pela capacidade de as variantes induzirem a proliferação de células M-NSF-60 (ATCC CRL-1838). A concentração das variantes capazes de realizar 50% de proliferação máxima (EC50) é determinada por comparação com uma curva padrão gerada com pG-CSF do tipo selvagem (WT). Com base nos resultados de expressão conforme apresentado no Exemplo 1 e nas análises biológicas descritas aqui, as variantes de PEG-pG-CSF são selecionadas para estudo adicional.
[032] A atividade in vivo das variantes de PEG-pG-CSF candidatas selecionadas é testada em um modelo de roedor. Ratos Sprague Dawley (3/grupo) são tratados com 0,25 mg/kg de peso corporal com uma variante de PEG-pG-CSF.
As amostras sanguíneas são coletadas 0 (pré-dosagem), 1, 3, 6, 24, 48, 56, 72, 96, 144, 192 e 264 horas para análise farmacocinética (PK), e amostras são coletadas 24, 48, 72 e 96 horas para um hemograma completo (análise de CBC). A medição primária na análise de CBC é o número de neutrófilos presentes. Uma variante de H43 estimula um nível mais alto de desenvolvimento de neutrófilos do que outras variantes testadas. Todas as variantes têm perfis de PK similares.
EXEMPLO 3
[033] O H43pAF de PEG-pG-CSF é preparado conforme exposto a seguir.
Como no Exemplo 1, a expressão das variantes de cDNA transfectadas é induzida com arabinose, as células são coletadas, e a variante de sítio de H43pAF de pG- CSF é isolada, desnaturada e renaturada e purificada por cromatografia líquida por troca de cátions (CEX), usando CAPTO Adhere Impres (GE Healthcare Lifesciences). Brevemente, a variante de H43pAF de pG-CSF não peguilada é carregada na coluna a uma concentração de 1 a 5 mg/ml de resina. A coluna é lavada com cinco volumes de coluna (CV) a 30 mM de acetato de sódio a pH 4,5. A eluição da variante de H43pAF de pG-CSF ocorre com um gradiente linear de tampão de eluição (30 mM de acetato de sódio, 0,5 M de NaCl, Ph 4,5), lavando com tampão de eluição a 0 a 100% em 20 CV.
[034] Com base na análise de espectroscopia de massa (MS) de H43pAF de pG-CSF, os peptídeos isolados incluem um pico principal representado pela SEQ ID NO: 2 e vários contaminantes diferentes. Os contaminantes incluem a perda da metionina N-terminal (SEQ ID NO: 4), perda tanto da metionina N-terminal como da alanina (SEQ ID NO: 8), e a substituição de norleucina pela metionina N-terminal (SEQ ID NO: 7). Sabe-se que a norleucina é incorretamente incorporada em vez do aminoácido metionina na fermentação de alta densidade com E. coli. A incorporação de norleucina é reduzida usando uma ou mais das seguintes etapas: alimentar as soluções de fermentação com metionina; fermentação com meio complexo em vez de meio definido (o meio complexo tem um ou mais componentes não definidos, incluindo, porém sem limitação, glicerol, sais, aminoácidos, vitaminas, extratos de levedura, hidrolisados vegetais e animais, peptonas e triptonas); e/ou reduzir a temperatura da mistura de reação de fermentação após a indução.
[035] A variante de H43pAF de pG-CSF é retirada do grupo de cromatografia por troca catiônica após o uso da cromatografia Capto SP Impres e o tampão é trocado em 30 mM de acetato de sódio, sacarose a 4%, pH 4,0 usando um cassete de filtração por fluxo tangencial de MWCO de 10kDa. A variante de H43pAF de pG- CSF é então concentrada a cerca de 8,0 mg/ml usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de acordo com as instruções do fabricante. Uma vez concentrado, PEG linear 30K (PEG pode ser comercialmente adquirido junto à NOF America Corporation or EMD Merck, por exemplo) é adicionado em uma razão molar de 6:1 de PEG para variante de H43pAF de pG-CSF. A mistura de PEG / variante de pG-CSF é então incubada a cerca de 28°C durante pelo menos 21 horas. Esse método resulta em >98% da variante de pG-CSF que é conjugado com PEG. A variante peguilada pode ser, então, purificada por CEX como acima. Quando testada no bioensaio com células M-NSF-60 (Exemplo 2), a variante de H43pAF de PEG-pG-CSF tem uma
EC50 de pelo menos 0,40 ng/ml, demonstrando características de ligação e potência satisfatórias.
[036] As amostras são congeladas e descongeladas em cinco ciclos por congelamento a 0°C em tubos de 1,5 ml e descongelamento em um banho-maria à temperatura ambiente. Não é observado um impacto significativo no perfil proteico de alto peso molecular (HMW) durante cinco ciclos de congelamento- descongelamento, demonstrando a estabilidade da variante em solução.
[037] Duas variantes adicionais de H43pAF de pG-CSF são geradas para tentar melhorar a eficiência de renaturação e a termoestabilidade da variante a 50 ºC. A cisteína 17 é alterada para alanina (C17A) ou para serina (C17S, SEQ ID NOs: 9 a 12). Essas mutações não aprimoram o rendimento de renaturação, porém C17A reduziu a termoestabilidade. H43pAF/C17S de PEG-pG-CSF tem uma EC50 ligeiramente aprimorada de 0,26 ng/ml.
EXEMPLO 4
[038] A variante de H43pAF de PEG-pG-CSF é administrada a porcas para caracterizar alterações em neutrófilos no sangue. Seis porcas de 1,5 a 5 anos de idade e um peso corporal médio de 269,7 kg recebem 40 g/kg da variante de H43pAF de PEG-pG-CSF por injeção intramuscular no lado do pescoço. A variante de H43pAF de PEG-pG-CSF é suspensa em 30 mM de citrato de sódio, 250 mM de arginina, pH 6,0 a uma concentração de 8,2 mg/ml. Os animais não recebem qualquer medicação concomitante após o início do tratamento. Nenhuma reação adversa é observada.
[039] O sangue é coletado no dia 0 antes da dosagem e nos dias 2, 7, 10, 14, 17 e 21 após a dosagem. As contagens de neutrófilos são determinadas para cada porca e uma média para o tratamento é determinada para cada dia. O tratamento com uma dose única da variante de H43pAF de PEG-pG-CSF resulta em aumentos mensuráveis na contagem de neutrófilos no sangue durante um período de três semanas (Tabela 1). Doses adicionais poderiam ser esperadas para estimular a manutenção dos níveis mais altos de neutrófilos.
Tabela 1. Efeito de variante de H43pAF de PEG-pG-CSF sobre a contagem média diária de neutrófilos no sangue.
Dia 0 2 7 10 14 17 21 Neutrófilos (1000/l) 4,65 43,68 25,08 30,1 18,53 15,14 9,83 EXEMPLO 5
[040] A variante de H43pAF de PEG-pG-CSF é administrada a porcas periparturientes para caracterizar o efeito em mastite, metrite e síndrome de agalactia (MMA) e na sobrevivência de leitões.
[041] Porcas com 95 a 100 dias de gestação são colocadas em caixas de gestação e práticas de higiene são seguidas até o dia 107 de gestação para cada porca. No dia 107, o sangue é coletado e, então, as porcas (25 por grupo) são tratadas com 40 µg/kg da variante de H43pAF de PEG-pG-CSF como no Exemplo 4 ou com uma solução de cloreto de sódio como um controle negativo. As porcas são, então, colocadas em condições anti-higiênicas para estimular o desenvolvimento de MMA. As condições não higiênicas incluem a colocação de um feltro no piso ripado da caixa de gestação para permitir o revestimento e o acúmulo de resíduos.
Também, uma mistura de água, fezes e serragem (2: 1: 1) é usada para contaminar as caixas. Fármacos oxitócicos ou corticosteroides não são administrados às porcas.
As observações clínicas e as temperaturas retais são coletadas em cada porca uma vez ao dia pela manhã, começando no dia 107 da gestação e continuando até o diagnóstico de MMA, momento em que a porca tem todas as amostras coletadas e, então, é removida do estudo, recebeu tratamento e as condições higiênicas da caixa retornadas. As amostras coletadas incluem sangue, temperatura retal, e esfregaços de glândulas infectadas.
[042] O parto ocorre tipicamente no dia 114 de gestação. Os leitões são pesados e marcados dentro de 12 horas após o nascimento. As observações clínicas dos leitões são feitas duas vezes ao dia, e os pesos também são medidos nos dias 3, 7 e 21 após o nascimento.
[043] Com o uso da definição de doença por protocolo, pouca diferença foi observada entre os dois grupos. Entretanto, quando a descarga vulvar foi removida da definição de doença, a incidência da doença foi reduzida em mais de 50% no grupo tratado com PEG-pG-CSF. O grupo tratado também tinha um número maior de leitões desmamados em comparação com o grupo de controle (Tabela 2).
Tabela 2. Efeito de PEG-pG-CSF sobre a incidência de MMA e sobrevivência de leitões.
Variável Controle PEG-pG-CSF valor P Porcas (número/grupo) MMA 36% (9/25) 32% (8/35) 1,0000 MMA excluindo a descarga 28% (7/25) 12% (3/25) 0,2890 vulvar Leitões (Std. Erro de Média) Número de nascidos/ninhada 13,3 (0,78) 13,1 (0,72) 0,8567 Número de 8,3 (0,61) 9,4 (0,61) 0,2056 desmamados/ninhada Porcentagem de 65,3 (4,5) 72,4 (4,3) 0,2590 sobrevivência Faixa de 0 a 100% 38 a 100% n/a sobrevivência/ninhada Peso ao desmame 5,9 (0,21) 5,7 (0,19) 0,5944
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <210> 1
<211> 175
<212> PRT
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Artificial
<400> 1
Met Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys His Pro Gln Glu Leu
35 40 45
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser
50 55 60
Cys Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His
65 70 75 80
Gly Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile
85 90 95
Ser Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr
Asp Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala
115 120 125
Pro Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala
130 135 140
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser
145 150 155 160
Phe Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro
165 170 175
<210> 2
<211> 175
<212> PRT
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Artificial
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> Xaa é pAF
<400> 2
Met Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu
35 40 45
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser
50 55 60
Cys Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His
65 70 75 80
Gly Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile
85 90 95
Ser Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr
100 105 110
Asp Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala
115 120 125
Pro Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser
145 150 155 160
Phe Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro
165 170 175
<210> 3
<211> 174
<212> PRT
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Natural
<400> 3
Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln
20 25 30
Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys His Pro Gln Glu Leu Val
35 40 45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser Cys
Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly
65 70 75 80
Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser
85 90 95
Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp
100 105 110
Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala Pro
115 120 125
Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe
130 135 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser Phe
145 150 155 160
Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro
165 170
<210> 4
<211> 174
<212> PRT
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Artificial
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Xaa é pAF
<400> 4
Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln
20 25 30
Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu Val
35 40 45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser Cys
50 55 60
Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly
65 70 75 80
Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser
Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp
100 105 110
Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala Pro
115 120 125
Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe
130 135 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser Phe
145 150 155 160
Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro
165 170
<210> 5
<211> 528
<212> DNA
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> cDNA (artificial) codifica a SEQ ID NO: 1&3
<400> 5 atggcccctc tcagccctgc cagctccctg ccccagagct tcctgctcaa gtgcttagag 60 caagtgagga aaatccaggc tgatggcgcc gagctgcagg agaggctgtg tgccacccac 120 aagctgtgcc acccccagga gctggtgctg ctcgggcact ctctgggcct cccccaggct 180 tccctgagca gctgctccag ccaggccctg cagctgactg gctgcctgaa ccaactgcat 240 ggcggcctcg tcctctacca gggcctcctg caggccctgg cgggcatctc cccagagctg 300 gcccccgccc tggacatact gcagctggat gtcaccgact tagccaccaa catctggctg 360 cagatggaag acctgaggat ggccccggcc tcgcttccca cccagggcac cgtgccgacc 420 ttcacctcgg ccttccagcg ccgggcagga ggggtcctgg ttgtctccca gctgcagagc 480 ttcctggagc tggcgtaccg tgtcctgcgc tacctcgccg agccctga 528
<210> 6
<211> 528
<212> DNA
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> cDNA (artificial) codifica a SEQ ID NO: 2&4
<400> 6 atggcccctc tcagccctgc cagctccctg ccccagagct tcctgctcaa gtgcttagag 60 caagtgagga aaatccaggc tgatggcgcc gagctgcagg agaggctgtg tgccacccac 120 aagctgtgct agccccagga gctggtgctg ctcgggcact ctctgggcct cccccaggct 180 tccctgagca gctgctccag ccaggccctg cagctgactg gctgcctgaa ccaactgcat 240 ggcggcctcg tcctctacca gggcctcctg caggccctgg cgggcatctc cccagagctg 300 gcccccgccc tggacatact gcagctggat gtcaccgact tagccaccaa catctggctg 360 cagatggaag acctgaggat ggccccggcc tcgcttccca cccagggcac cgtgccgacc 420 ttcacctcgg ccttccagcg ccgggcagga ggggtcctgg ttgtctccca gctgcagagc 480 ttcctggagc tggcgtaccg tgtcctgcgc tacctcgccg agccctga 528
<210> 7
<211> 175
<212> PRT
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Artificial
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa é norleucina ou metionina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> Xaa é pAF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (122)..(122)
<223> Xaa é norleucina ou metionina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (127)..(127)
<223> Xaa é norleucina ou metionina
<400> 7
Xaa Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu
35 40 45
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser
50 55 60
Cys Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His
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Gly Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile
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100 105 110
Asp Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Xaa Glu Asp Leu Arg Xaa Ala
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Pro Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala
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Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser
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Phe Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro
165 170 175
<210> 8
<211> 173
<212> PRT
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Artificial
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> Xaa é pAF
<400> 8
Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys
1 5 10 15
Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln Glu
20 25 30
Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu Val Leu
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Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser Cys Ser
50 55 60
Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly Gly
65 70 75 80
Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro
85 90 95
Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp Leu
100 105 110
Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala Pro Ala
115 120 125
Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe Gln
130 135 140
Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser Phe Leu
145 150 155 160
Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro
165 170
<210> 9
<211> 175
<212> PRT
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Artificial
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> Xaa é pAF
<400> 9
Met Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu
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Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu
35 40 45
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser
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<210> 10
<211> 175
<212> PRT
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Artificial
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa é norleucina ou metionina
<220>
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<223> Xaa é pAF
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa é norleucina ou metionina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (127)..(127)
<223> Xaa é norleucina ou metionina
<400> 10
Xaa Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu
20 25 30
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Asp Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Xaa Glu Asp Leu Arg Xaa Ala
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130 135 140
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<211> 174
<212> PRT
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Artificial
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Xaa é pAF
<400> 11
Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln
20 25 30
Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu Val
35 40 45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser Cys
50 55 60
Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly
65 70 75 80
Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser
85 90 95
Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp
Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala Pro
115 120 125
Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe
130 135 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser Phe
145 150 155 160
Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro
165 170
<210> 12
<211> 173
<212> PRT
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Artificial
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> Xaa é pAF
<400> 12
Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser
1 5 10 15
Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln Glu
20 25 30
Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu Val Leu
35 40 45
Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser Cys Ser
50 55 60
Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly Gly
65 70 75 80
Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro
85 90 95
Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp Leu
100 105 110
Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala Pro Ala
115 120 125
Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe Gln
130 135 140
Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser Phe Leu
145 150 155 160
Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro
165 170
<210> 13
<211> 174
<212> PRT
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Artificial
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa é metionina-alanina, norleucina-alanina, alanina, ou sem aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa é cisteína ou serina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Xaa é pAF
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (121)..(121)
<223> Xaa é metionina ou norleucina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (126)..(126)
<223> Xaa é metionina ou norleucina
<400> 13
Xaa Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
1 5 10 15
Xaa Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln
20 25 30
Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu Val
35 40 45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser Cys
50 55 60
Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly
65 70 75 80
Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser
85 90 95
Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp
100 105 110
Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Xaa Glu Asp Leu Arg Xaa Ala Pro
115 120 125
Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe
130 135 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser Phe
145 150 155 160
Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro
165 170

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES
1. Variante de fator estimulante de colônia de granulócitos porcinos (pG- CSF) CARACTERIZADA pelo fato de que a dita variante consiste em uma sequência de: X1PLSPASSLPQSFLLKX2LEQVRKIQADGAELQERLCATHKLC(pAF)PQELV
LLGHSLGLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPELAPALDIL QLDVTDLATNIWLQX3EDLRX3APASLPTQGTVPTFTSAFQRRAGGVLVVSQLQSFLE LAYRVLRYLAEP (SEQ ID NO: 13); em que X1 é selecionado a partir do grupo de metionina e alanina, norleucina e alanina, apenas alanina, e nenhum aminoácido); em que X2 é cisteína ou serina; em que X3 é metionina ou norleucina; e em que um aminoácido sintético para-acetil fenilalanina (pAF) presente na posição 43 é covalentemente ligado a um poli(etileno glicol) (PEG).
2. Variante de pG-CSF, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o PEG tem um peso molecular de cerca de 20 kD a cerca de 50 kD.
3. Variante de pG-CSF, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o PEG tem um peso molecular de cerca de 30 kD.
4. Variante de pG-CSF, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o PEG é linear.
5. Variante de fator estimulante de colônia de granulócitos porcinos (pG- CSF) CARACTERIZADA pelo fato de que a dita variante consiste em uma sequência de aminoácidos de: MAPLSPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCATHKLC(pAF)PQELVLLGHS
LGLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPEL
APALDILQLDVTDLATNIWLQMEDLRMAPASLPTQGTVPTFTSAFQRRAG
GVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP (SEQ ID NO: 2), em que um aminoácido sintético para-acetil fenilalanina (pAF) presente na posição 43 é covalentemente ligado a um PEG linear de 30 kD.
6. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a variante de pG-CSF, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e pelo menos um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
7. Método de prevenção ou redução da incidência de uma infecção bacteriana em um porcino CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da variante de pG- CSF, conforme definido nas reivindicações 1 a 5, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, ao porcino em necessidade da mesma.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a infecção bacteriana é mastite, metrite e síndrome de agalactia (MMA).
9. Método, de acordo com as reivindicações 7 ou 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o porcino é uma porca periparturiente.
10. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de pG- CSF é cerca de 10 a 100 μg/kg de peso do animal.
11. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de pG- CSF é cerca de 30 a 50 μg/kg de peso do animal.
12. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de pG- CSF é cerca de 40 μg/kg de peso do animal.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração ocorre pelo menos uma vez dentro de 7 dias antes do parto.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração ocorre no parto.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente uma segunda administração no máximo até 14 dias após o parto.
16. Método de redução da mortalidade de leitões CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da variante de pG-CSF, conforme definido nas reivindicações 1 a 5, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, a uma porca periparturiente.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de pG-CSF é cerca de 10 a 100 μg/kg de peso do animal.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de pG-CSF é cerca de 30 a 50 μg/kg de peso do animal.
19. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de pG-CSF é cerca de 40 μg/kg de peso do animal.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração ocorre pelo menos uma vez dentro de 7 dias antes do parto.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração ocorre no parto.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente uma segunda administração no máximo até 14 dias após o parto.
23. Método de estimulação de resposta imunológica inata em um porcino CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da variante de pG-CSF, conforme definido nas reivindicações 1 a 5, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, ao porcino em necessidade da mesma.
24. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a resposta imunológica inata compreende aumentar a função antibacteriana de neutrófilos, níveis de citocina, ativar ou aumentar os níveis de células dendríticas, ativar ou aumentar os níveis de linfócitos, ou ativar ou aumentar os níveis de mielócitos, ou qualquer combinação dos mesmos.
25. Método, de acordo com as reivindicações 23 ou 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o porcino é uma porca periparturiente.
26. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 23 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de pG- CSF é cerca de 10 a 100 μg/kg de peso do animal.
27. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 23 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de pG- CSF é cerca de 30 a 50 μg/kg de peso do animal.
28. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 23 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de pG- CSF é cerca de 40 μg/kg de peso do animal.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração ocorre pelo menos uma vez dentro de 7 dias antes do parto.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração ocorre no parto.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 30,
CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente uma segunda administração no máximo até 14 dias após o parto.
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