TW201928058A - 豬g-csf變異體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於豬粒細胞群落刺激因子(pG-CSF)之變異體。該等pG-CSF變異體可用於治療、預防或降低豬中細菌感染之發生率。揭示治療豬之方法。

Description

豬G-CSF變異體及其用途
本發明係關於合成胺基酸之變異體豬粒細胞群落刺激因子(pG-CSF)多肽。該合成胺基酸藉由聚(乙二醇)(PEG)分子之連接而修飾。使用該聚乙二醇化pG-CSF變異體以治療豬中之細菌感染。當豬為圍產期母豬時，細菌感染可為乳房炎、子宮炎及無乳症(MMA)症候群。降低懷孕母豬之細菌感染提高仔豬存活率。
傳染病在食物動物生產中之經濟影響在文獻中有充分記載。傳染病降低利潤、增加生產成本且危及食品，以及影響動物之效能、健康及福利。疾病會引起新生、幼齡(例如，替代牲畜)或成年動物之發病及死亡，從而產生對食物動物生產之破壞性影響。
在豬中，一種此類疾病可為乳房炎、子宮炎及無乳症(MMA)症候群。乳房炎為乳房之細菌感染。僅一或兩個腺體可受到影響，或感染可散佈至多個腺體。子宮炎為尿殖道之細菌感染，其有時呈現為外陰排出物。無乳症為藉由母豬之乳產生之減少或總損失。MMA症候群可為高度變化的且可不存在所有以上症狀。因此，MMA症候群可能難以偵測及診斷到，且其可能不會被偵測到直至哺乳仔豬顯示饑餓、體重減輕或甚至死亡之徵象。
因為MMA症候群難以偵測到，因此預防性治療係較佳的。不贊成在食物生產動物中使用抗生素，特定言之共享類抗生素，因此非抗生素療法在豬之治療中為較佳的。諸如pG-CSF之細胞介素可增加動物中之嗜中性白血球數目，因此引發先天免疫系統對細菌感染之快速反應。用PEG修改pG-CSF變異體可延長細胞介素之藥物動力學及穩定性，因此增強其效果。
可使用聚乙二醇化牛G-CSF以治療乳牛之乳房炎(WO2010/011735)。亦已描述聚乙二醇化人類G-CSF (WO2000/044785)。已提議將聚乙二醇化野生型豬G-CSF用於治療呼吸道感染，諸如病毒感染(WO2005/025593)。如本文中各種態樣中所揭示，聚乙二醇化pG-CSF變異體提高豬血液嗜中性白血球數目、降低MMA症候群在圍產期母豬中之發生率且/或提高仔豬存活率。
本發明提供具有以下之共同序列之豬粒細胞群落刺激因子(pG-CSF)變異體：X1 PLSPASSLPQSFLLKX2 LEQVRKIQADGAELQERLCATHKLCX3 PQELVLLGHSLGLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPELAPALDILQLDVTDLATNIWLQX4 EDLRX4 APASLPTQGTVPTFTSAFQRRAGGVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP (SEQ ID NO: 13)。變量X1 可為如在SEQ ID NO: 2及9中之二肽甲硫胺酸丙胺酸、如在SEQ ID NO: 7及10中之二肽正白胺酸丙胺酸、如在SEQ ID NO: 4及11中之丙胺酸，或如在SEQ ID NO: 8及12中不存在。變量X2 可為如在SEQ ID NO: 2、4、7及8中之半胱胺酸，或X2 可為如在SEQ ID NO: 9、10、11及12中之絲胺酸。變量X3 可為合成胺基酸。合成胺基酸可存在於如SEQ ID NO: 13中所示之位置43 (如給出於SEQ ID NO: 3中，相對於成熟野生型pG-CSF之位置)處。合成胺基酸可為對乙醯基苯丙胺酸(pAF)。變量X4 可為如在SEQ ID NO: 2、4、8、9、11及12中之甲硫胺酸，或X4 可為如在SEQ ID NO: 7及10中之正白胺酸。pAF合成胺基酸可共價連接於聚(乙二醇)(PEG)分子。PEG可具有約20 kD至約50 kD之分子量，或約30 kD之分子量。較佳地，PEG為線性PEG分子。
本發明提供具有以下序列之豬粒細胞群落刺激因子(pG-CSF)變異體：MAPLSPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCATHKLC [pAF]PQELVLLGHSLGLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPELAPALDILQLDVTDLATNIWLQMEDLRMAPASLPTQGTVPTFTSAFQRRAGGVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP (SEQ ID NO: 2)，其中存在於位置43處之對乙醯基苯丙胺酸(pAF)合成胺基酸共價連接於30 kD線性PEG分子。
本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之pG-CSF變異體中之任一者，及至少一種醫藥學上可接受之載劑稀釋劑、或賦形劑。
本發明提供一種用於治療豬中之細菌感染之方法，該方法包含向對其有需要之豬投與治療有效量之本文所述的pG-CSF變異體中之任一者。細菌感染可為乳房炎、子宮炎及無乳症(MMA)症候群。需要治療之豬可為圍產期母豬。pG-CSF變異體之治療有效量可為約10-100 μg/kg動物重量，或約30-50 μg/kg動物重量，或約40 μg/kg動物重量。本文所述之pG-CSF變異體中之任一者的投與可在分娩之前(亦即在妊娠之第107天時或之後)或在分娩時出現至少7天或更少天數一次。在一些態樣中，治療豬中之細菌感染的方法可包含在分娩之後14天或更少天數內(亦即，在分娩之後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13天內或14天內)二次投與本文所述之pG-CSF變異體中的任一者。
本發明提供一種用於在豬中刺激先天性免疫反應之方法，該方法包含向對其有需要之豬投與治療有效量之本文所述的pG-CSF變異體中之任一者。需要刺激之豬可為圍產期母豬。在其他態樣中，需要刺激之豬可為具有受損或弱化之免疫系統的豬。在進一步態樣中，需要刺激之豬可為具有或處於患上感染(包括例如細菌感染或病毒感染)之風險的豬。在一些態樣中，該方法可刺激細胞介素(例如，干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、群落刺激因子(CSF)、及/或介白素(IL)之產生，且/或活化或增加免疫細胞之水準，該等免疫細胞諸如樹突狀細胞(DC)、淋巴細胞(例如，B細胞、T細胞及自然殺手(NK)細胞)及骨髓細胞(例如，肥大細胞、骨髓母細胞(例如，嗜鹼性球、嗜伊紅血球、嗜中性白血球、單核球及巨噬細胞))。在此等態樣之一些實施例中，該方法可藉由例如增強嗜中性白血球髓過氧化酶-過氧化氫-鹵化物參與之抗菌功能來刺激或增加嗜中性白血球抗菌功能。
在刺激先天性免疫反應之方法中，pG-CSF變異體之治療有效量可為約10-100 μg/kg動物重量，或約30-50 μg/kg動物重量，或約40 μg/kg動物重量。本文所述之pG-CSF變異體中之任一者的投與可在分娩之前(亦即在妊娠之第107天時或之後)或在分娩時出現至少7天或更少天數一次。在一些態樣中，治療豬中之細菌感染的方法可包含在分娩之後14天或更少天數內(亦即，在分娩之後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13天內或14天內)二次投與本文所述之pG-CSF變異體中的任一者。
本發明提供一種用於降低仔豬死亡率之方法，該方法包含向圍產期母豬投與治療有效量之本文所述之pG-CSF變異體中的任一者。pG-CSF變異體之治療有效量可為約10-100 μg/kg動物重量，或約30-50 μg/kg動物重量，或約40 μg/kg動物重量。本文所述之pG-CSF變異體中之任一者的投與可在分娩之前(亦即在妊娠之第107天時或之後)或在分娩時出現至少7天或更少天數一次。在一些態樣中，降低仔豬死亡率之方法可包含在分娩之後14天或更少天數內(亦即，在分娩之後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13天內或14天內)二次向圍產期母豬投與本文所述的pG-CSF變異體中之任一者。
本發明提供本文所述之pG-CSF變異體中的任一者在製造用於豬中之細菌感染之藥物中的用途。細菌感染可為MMA症候群。豬可為圍產期母豬。本發明提供本文所述之pG-CSF變異體中的任一者在製造用於降低仔豬死亡率之藥物中的用途。
本發明提供本文所述之pG-CSF變異體中之任一者以供用於療法中。療法可為豬中之細菌感染之症候群的治療。細菌感染可為MMA症候群。豬可為圍產期母豬。療法可降低仔豬死亡率。可以約10-100 μg/kg動物重量，或約30-50 μg/kg動物重量，或約40 μg/kg動物重量向圍產期母豬投與pG-CSF變異體。可在分娩之前(亦即在妊娠之第107天時或之後)或在分娩時至少7天或更短天數一次投與pG-CSF變異體。可在分娩之後14天或更短天數給予圍產期母豬二次投與。
「細菌感染」為在動物之皮膚、黏膜、腺體、眼、耳、尿殖道、消化道、肺、血液或器官上或內之一或多種細菌種類的生長。可將細菌分類於無色桿菌、放線桿菌、放線菌、芽孢桿菌、博德氏桿菌、布氏桿菌、梭菌、棒狀桿菌、丹毒菌、大腸桿菌、嗜血桿菌、克雷伯氏菌、鉤端螺旋體、李氏菌、黴漿菌、巴氏桿菌、變形桿菌、假單胞菌、沙門氏菌、球狀菌、葡萄球菌、鏈球菌或弧菌之屬內之種類。
如本文所使用之術語「豬」(porcine)係指豬(pig)，尤其家豬(domestic pig、Sus scrofa domesticus 或Sus domesticus )且可包含小型豬以及飼養以用於肉類生產之彼等品種。「豬(pig/swine/porcine)」意在包括所有豬品種。
將圍產期母豬定義為在妊娠之最後一週至分娩後前幾週內之懷孕母豬。分娩或生產通常發生在約妊娠之114天。圍產期母豬可為約妊娠之100天至約分娩後14天之懷孕母豬。仔豬為自出生至在約3週齡斷奶的豬。
「合成胺基酸」係指並非20種常見胺基酸或吡咯離胺酸或硒半胱胺酸中之一者的胺基酸。此類合成胺基酸之實例包括(但不限於)對乙醯基苯丙胺酸(pAF)、乙醯基葡糖胺基-L-絲胺酸及N-乙醯基葡糖胺基-L-蘇胺酸。一些合成胺基酸及其併入至多肽中及後續修飾描述於WO2010/011735及WO2005/074650中。
如本文中所使用，術語「治療(treating/to treat/treatment)」包括抑制、減緩、終止、減輕、改善或逆轉症狀、病症、病況或疾病之進展或嚴重程度。在一些態樣中，本發明提供在動物中對未觀測到或未偵測到之症狀、病症、病況或疾病之預防性治療具有特異性的方法，該動物可處於患上一或多種此類症狀、病症、病況或疾病之風險。在一些態樣中，治療將以治療方式應用。
如使用之術語「有效量」係指將具有所需影響(諸如預防、治療或降低豬中之細菌感染)之被投與的pG-CSF變異體的量。當豬為圍產期母豬時，治療母豬中之細菌感染可提高仔豬之存活率。有效量可隨諸如母豬之重量之因素變化。
「投與」意謂注射治療有效量之化合物及含有所揭示之該等化合物的組合物。例如(但不限於)，投與可為肌肉內(i.m)或皮下(s.c.)。
術語「約」應為一般熟習此項技術者理解，且將視其被使用之上下文在一定程度上變化。如本文所使用，「約」意謂涵蓋±10%、±5%或±1%之變化形式(亦即，±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%或±1%)。
本發明之pG-CSF變異體可容易地於不同細胞(包括哺乳動物細胞；細菌細胞，諸如大腸桿菌、枯草桿菌或螢光假單胞菌)及/或真菌或酵母細胞中產生。可使用此項技術中熟知的技術培養宿主細胞。可藉由熟知方法將含有所關注之聚核苷酸序列(例如，pG-CSF之變異體及表現控制序列)向量轉型成宿主細胞，該等方法視細胞宿主之類型而變化。舉例而言，氯化鈣轉型方法通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他真核宿主細胞。可採用蛋白提純之不同方法且此類方法為本領域中已知的且描述於(例如)Deutscher，Method in Enzymology 182:83-89 (1990)及Scopes，Protein Purification : Principles and Practice ，第3版，Springer，NY (1994)中。
可根據已知方法調配聚乙二醇化pG-CSF變異體以製備藥學上適用之組合物。在一些態樣中，調配物為用適當高純度之稀釋劑或水溶液與視情況選用之醫藥學上可接受之載劑、防腐劑、賦形劑或穩定劑復原的穩定冷凍產物(參見Remington，The Science and Practice of Pharmacy ，第19版，Gennaro編，Mack Publishing Co.，Easton，PA 1995)。
可用醫藥學上可接受之緩衝劑調配聚乙二醇化pG-CSF變異體，且可調節pH以提供可接受之穩定性及投與用於之pH。在一些非限制性實例中，投與可接受之pH可在約5至約8之範圍內(亦即，約5、約6、約7或約8)。此外，可將本發明之聚乙二醇化pG-CSF組合物置放於容器中，該容器諸如小瓶、筒、筆式遞送裝置、注射器、靜脈內投藥管或靜脈內投藥包。
以下實驗實例說明pG-CSF變異體及其在治療豬中之細菌感染(諸如圍產期母豬中之MMA症候群)中之用途。降低母豬中之細菌感染之發生率亦降低仔豬死亡率。應瞭解，其他實施例及用途對熟習此項技術者而言將為顯而易見的，且本發明不限於此等特定說明性實例或較佳實施例。
實例1
藉由將TAG終止密碼子引入於所選擇之位置中藉由定點PCR突變誘發產生豬粒細胞群落刺激因子(pG-CSF) cDNA (GenBank寄存編號U68481.1)之不同變異體。此外，cDNA編碼信號序列之部分由單個甲硫胺酸密碼子(亦即ATG)替代。舉例而言，具有經改變之信號序列之cDNA編碼野生型成熟pG-CSF可為：

(SEQ ID NO: 5)。此變異體將編碼以下多肽：

(SEQ ID NO: 1)。若需要TAG終止密碼子以替代H43殘基，則cDNA序列可為：

(SEQ ID NO: 6)。所得多肽將為：

(SEQ ID NO: 2)，其中如下所述，「x」指示用合成胺基酸替代之H43殘基。
將質體編碼變異體轉型為含有用於併入合成胺基酸對乙醯基苯丙胺酸(pAF)之擴增基因密碼系統組分之大腸桿菌細胞。將經轉型細胞生長於補充有pAF之培養基中且誘發以表現具有併入至指示位點中之pAF的pG-CSF。該表現系統已描述於例如WO 2010/011735中(以引用之方式併入本文中)，且為此項技術中一般已知的。
用阿拉伯糖誘發經轉染之cDNA變異體之表現、收集細胞，且將目標pG-CSF pAF位點變異體分離且藉由逆相高壓液相層析(RP-HPLC)純化。將經活化之30 kD線性胺氧基-PEG與併入之pAF在具體位點處結合。藉由層析自過量PEG及未共軛pG-CSF變異體純化PEG-pG-CSF共軛物。
實例2
藉由變異體誘發M-NSF-60細胞(ATCC CRL-1838)增殖之能力量測聚乙二醇化pG-CSF (PEG-pG-CSF)變異體之活體外生物活性。藉由與用野生型(WT) pG-CSF產生之標準曲線比較來確定變異體能夠實現50%之最大增殖(EC50 )的濃度。基於如實例1中所呈現之表述及此處所描述之生物檢定的結果，選擇PEG-pG-CSF變異體以用於進一步研究。
在嚙齒動物模型中測試所選擇之候選PEG-pG-CSF變異體之活體內活性。以每公斤體重0.25 mg用PEG-pG-CSF變異體治療史泊格多利大白鼠(3隻/組)。在0 (預給藥)、1、3、6、24、48、56、72、96、144、192及264小時採集血液樣本以用於藥物動力學(PK)分析，且在24、48、72及96小時採集樣本以用於全血細胞計數(CBC分析)。CBC分析中之初始量測結果為存在之嗜中性白血球的數目。H43變異體比其他測試之變異體刺激更高水準之嗜中性白血球發展。所有變異體均具有類似PK概況。
實例3
如下製備PEG-pG-CSF H43pAF。如在實例1中，用阿拉伯糖誘發經轉染之cDNA變異體之表現、收集細胞，且將pG-CSF H43pAF位點變異體分離、變性且再摺疊，且藉由陽離子交換液相層析(CEX)，使用CAPTO Adhere Impres (GE Healthcare Lifesciences)來純化。簡言之，將未聚乙二醇化pG-CSF H43pAF變異體裝載至管柱上直至1-5 mg/mL樹脂之濃度。用五管柱體積(CV) 30 mM pH為4.5之乙酸鈉洗滌管柱。用線性梯度之溶離緩衝液(30 mM乙酸鈉，0.5 M NaCl，pH 4.5)，藉由在20 CV內之0-100%溶離緩衝液洗滌來進行pG-CSF H43pAF變異體之溶離。
基於對pG-CSF H43pAF之質譜(MS)分析，經分離之肽包括由SEQ ID NO: 2表示之主峰及若干不同污染物。污染物包括N端甲硫胺酸之缺失(SEQ ID NO: 4)、N端甲硫胺酸及丙胺酸兩者之缺失(SEQ ID NO: 8)及用正白胺酸取代N端甲硫胺酸(SEQ ID NO: 7)。已知正白胺酸在大腸桿菌高密度醱酵中代替胺基酸甲硫胺酸而被錯誤併入。藉由使用以下步驟中之一或多者來減少正白胺酸併入：用甲硫胺酸向醱酵溶液進料；用複合培養基代替限定培養基醱酵(複合培養基在其中具有一或多種非限定組分，包括但限於丙三醇、鹽、胺基酸、維生素、酵母提取物、植物及動物水解產物、蛋白腖及胰化蛋白)；及/或降低誘發後醱酵反應混合物之溫度。
在使用Capto SP Impres層析法之後將pG-CSF H43pAF變異體自陽離子交換層析池取出，且使用10 kDa MWCO切向流過濾卡匣將緩衝劑交換為30 mM乙酸鈉、4%蔗糖、pH 4.0。根據製造商之說明書使用Amicon Ultra離心過濾器，將pG-CSF H43pAF變異體接著濃縮至約8.0 mg/mL。在濃縮後，以6:1莫耳比之PEG比pG-CSF H43pAF變異體添加30 K線性PEG (舉例而言，PEG可商購自NOF America Corporation或EMD Merck)。將PEG/pG-CSF變異體混合物接著在約28℃下培育至少21小時。此方法導致＞98%之pG-CSF變異體與PEG共軛。如上所述，可將聚乙二醇化變異體接著藉由CEX純化。當在M-NSF-60細胞生物分析(實例2)中測試時，PEG-pG-CSF H43pAF變異體之EC50 為至少0.40 ng/mL，表明良好結合及效能特徵。
藉由在0℃下在1.5 mL管中冷凍且在室溫水浴中解凍而將樣本冷凍及解凍五個循環。在五個循環之冷凍-解凍內未觀測到對高分子量(HMW)蛋白質譜之顯著影響，表明變異體在溶液中之穩定性。
產生兩個額外pG-CSF H43pAF變異體以試圖提高再摺疊效率及變異體在50℃下之熱穩定性。將半胱胺酸17改為丙胺酸(C17A)或絲胺酸(C17S，SEQ ID NO:9-12)。此等突變未提高再摺疊率，但C17A之熱穩定性降低。PEG-pG-CSF H43pAF/C17S之EC50 的確略有提高，為0.26 ng/mL。
實例4
向母豬投與PEG-pG-CSF H43pAF變異體以表徵血液嗜中性白血球之變化。藉由肌肉內注射在頸側來給予年齡為1.5-5歲且平均體重為269.7 kg之六頭母豬40 μg/kg之PEG-pG-CSF H43pAF變異體。以8.2 mg/mL之濃度、將PEG-pG-CSF H43pAF變異體懸浮於30 mM檸檬酸鈉、250 mM精胺酸、pH 6.0中。在起始治療之後動物不接收任何伴隨藥物治療。未觀測到不良跡象。
在給藥之前第0天及給藥後第2、7、10、14、17及21天採集血液。針對每一母豬測定嗜中性白血球計數且每日測定治療之平均值。用PEG-pG-CSF H43pAF變異體之單次劑量之治療導致在三週時段內的血液嗜中性白血球計數之可量測的增加(表1)。將預計額外劑量以刺激較高嗜中性白血球水準之維護。
表1。PEG-pG-CSF H43pAF變異體對平均每日血液嗜中性白血球計數之影響。
實例5
向圍產期母豬投與PEG-pG-CSF H43pAF變異體以表徵對乳房炎、子宮炎及無乳症(MMA)症候群及仔豬存活率之影響。
將在妊娠之95-100天之母豬置放於中分娩箱中且遵循衛生畜牧規範直至每一母豬之妊娠的107天。在第107天時，收集血液且接著用任一如在實例4中之40 μg/kg的PEG-pG-CSF H43pAF變異體或作為陰性對照之氯化鈉溶液治療母豬(25頭/組)。接著將母豬置放於不衛生狀況中以刺激MMA之發展。不衛生狀況包括將墊子置放在分娩箱之格柵底板上以允許墊料及廢棄材料積聚。此外，使用水、糞便及松樹木屑(2:1:1)之混合物以染污箱。不給予母豬催產素或皮質類固醇藥物。在妊娠之第107天開始每日一次在上午在每一母豬上收集臨床觀測結果及直腸溫度且繼續直至診斷MMA，此時母豬具有所有所收集之樣本且接著自該研究移除、給予治療且回復衛生箱狀況。所收集之樣本包括血液、職場溫度及感染腺體之拭子。
分娩通常發生在妊娠之第114天。在出生12小時內將仔豬稱重且標記。每日兩次對仔豬進行臨床觀測，且亦出生之後第3、7及21天量測重量。
使用疾病之每一協定定義，在兩組之間觀測到極少差異。然而，當自疾病之定義移除外陰排出物時，疾病之發生率在PEG-pG-CSF治療組中降低超過50%。治療組與對照組相比亦具有較高數目之斷奶仔豬(表2)。
表2。PEG-pG-CSF對MMA發生率及仔豬存活率之影響。

Claims (40)

  1. 一種豬粒細胞群落刺激因子(pG-CSF)變異體，其由以下序列組成： X1 PLSPASSLPQSFLLKX2 LEQVRKIQADGAELQERLCATHKLC (pAF)PQELVLLGHSLGLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPELAPALDILQLDVTDLATNIWLQX3 EDLRX3 APASLPTQGTVPTFTSAFQRRAGGVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP (SEQ ID NO: 13)； 其中X1 選自以下之群：甲硫胺酸丙胺酸、正白胺酸丙胺酸、僅丙胺酸及無胺基酸； 其中X2 為半胱胺酸或絲胺酸； 其中X3 為甲硫胺酸或正白胺酸；及 其中存在於位置43處之對乙醯基苯丙胺酸(pAF)合成胺基酸共價連接於聚(乙二醇) (PEG)。
  2. 如請求項1之pG-CSF變異體，其中該PEG具有約20 kD至約50 kD之分子量。
  3. 如請求項1或2之pG-CSF變異體，其中該PEG具有約30 kD之分子量。
  4. 如請求項1至3中任一項之pG-CSF變異體，其中該PEG為線性的。
  5. 一種豬粒細胞群落刺激因子(pG-CSF)變異體，其由以下胺基酸序列組成： MAPLSPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCATHKLC (pAF)PQELVLLGHSLGLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPEL APALDILQLDVTDLATNIWLQMEDLRMAPASLPTQGTVPTFTSAFQRRAG GVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP (SEQ ID NO: 2)， 其中存在於位置43處之對乙醯基苯丙胺酸(pAF)合成胺基酸共價連接於30 kD線性PEG。
  6. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之pG-CSF變異體及至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  7. 一種用於治療豬中之細菌感染之方法，其包含向對其有需要之該豬投與治療有效量的如請求項1至5之pG-CSF變異體或如請求項6之醫藥組合物。
  8. 如請求項7之方法，其中該細菌感染為乳房炎、子宮炎及無乳症(MMA)症候群。
  9. 如請求項7或8之方法，其中該豬為圍產期母豬。
  10. 如請求項7至9中任一項之方法，其中pG-CSF之該治療有效量為約10-100 μg/kg動物重量。
  11. 如請求項7至9中任一項之方法，其中pG-CSF之該治療有效量為約30-50 μg/kg動物重量。
  12. 如請求項7至9中任一項之方法，其中pG-CSF之該治療有效量為約40 μg/kg動物重量。
  13. 如請求項7至12中任一項之方法，其中該投與在分娩之前7天內發生至少一次。
  14. 如請求項7至13中任一項之方法，其中該投與發生在分娩時。
  15. 如請求項7至14中任一項之方法，其進一步包含在不遲於分娩之後14天之二次投與。
  16. 一種用於降低仔豬死亡率之方法，其包含向圍產期母豬投與治療有效量之如請求項1至5之pG-CSF變異體或如請求項6之醫藥組合物。
  17. 如請求項16之方法，其中pG-CSF之該治療有效量為約10-100 μg/kg動物重量。
  18. 如請求項16之方法，其中pG-CSF之該治療有效量為約30-50 μg/kg動物重量。
  19. 如請求項16之方法，其中pG-CSF之該治療有效量為約40 μg/kg動物重量。
  20. 如請求項16至19中任一項之方法，其中該投與在分娩之前7天內發生至少一次。
  21. 如請求項16至20中任一項之方法，其中該投與發生在分娩時。
  22. 如請求項16至21中任一項之方法，其進一步包含在不遲於分娩之後14天之二次投與。
  23. 一種用於刺激豬中之先天性免疫反應之方法，其包含向對其有需要之該豬投與治療有效量的如請求項1至5之pG-CSF變異體或如請求項6之醫藥組合物。
  24. 如請求項7之方法，其中該先天性免疫反應包含增加嗜中性白血球抗菌功能、細胞介素水準、活化或增加樹突狀細胞之水準、活化或增加淋巴細胞之水準、或活化或增加骨髓細胞之水準、或其任何組合。
  25. 如請求項23或24之方法，其中該豬為圍產期母豬。
  26. 如請求項23至25中任一項之方法，其中pG-CSF之該治療有效量為約10-100 μg/kg動物重量。
  27. 如請求項23至25中任一項之方法，其中pG-CSF之該治療有效量為約30-50 μg/kg動物重量。
  28. 如請求項23至25中任一項之方法，其中pG-CSF之該治療有效量為約40 μg/kg動物重量。
  29. 如請求項23至28中任一項之方法，其中該投與在分娩之前7天內發生至少一次。
  30. 如請求項23至29中任一項之方法，其中該投與發生在分娩時。
  31. 如請求項23至30中任一項之方法，其進一步包含在不遲於分娩之後14天之二次投與。
  32. 如請求項1至5中任一項之pG-CSF變異體，其係用於療法中。
  33. 如請求項1至5中任一項之pG-CSF變異體，其係用於治療豬中之細菌感染。
  34. 如請求項1至5中任一項之pG-CSF變異體，其係用於治療圍產期母豬中之細菌感染。
  35. 如請求項1至5中任一項之pG-CSF變異體，其係用於增加圍產期母豬中之嗜中性白血球水準。
  36. 如請求項1至5中任一項之pG-CSF變異體，其係用於降低仔豬死亡率，其中向圍產期母豬投與該pG-CSF變異體以治療細菌感染。
  37. 如請求項32至36中任一項使用之pG-CSF變異體，其中以約10-100 μg/kg動物重量、約30 -50 μg/kg動物重量或約40 μg/kg動物重量投與該pG-CSF變異體。
  38. 如請求項32至37中任一項使用之pG-CSF變異體，其中在分娩之前7天內投與該pG-CSF變異體至少一次。
  39. 如請求項32至37中任一項使用之pG-CSF變異體，其中在分娩時投與該pG-CSF變異體。
  40. 如請求項32至39中任一項使用之pG-CSF變異體，其中在不遲於分娩之後14天投與pG-CSF變異體之二次劑量。
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