BR112019014876A2 - composição líquida estável compreendendo toxina botulínica e método para estabilizar uma toxina botulínica - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a uma composição líquida estável compreendendo toxina botulínica como ingrediente ativo, pronta para uso sem necessidade de um processo de reconstituição e, particularmente, a uma composição capaz de impedir a agregação da toxina botulínica, mesmo quando em concentração baixa, para exibir elevada estabilidade, prevenir eficazmente a adsorção, etc., a um recipiente, para manter constante atividade da toxina para cada lote ou para cada frasco líquido. especificamente refere-se a uma composição líquida compreendendo (i) uma toxina botulínica como um ingrediente ativo, (ii) l-alanina ou metilcelulose, (iii) um surfactante não iônico e (iv) um tampão e, opcionalmente, um agente isotônico.

Description

COMPOSIÇÃO LÍQUIDA ESTÁVEL COMPREENDENDO TOXINA BOTULÍNICA E MÉTODO PARA ESTABILIZAR UMA TOXINA BOTULÍNICA
Campo de Aplicação
[001] A presente invenção trata de uma composição liquida estável compreendendo uma toxina botulinica como um ingrediente ativo que está pronta para uso sem a necessidade de um processo de reconstituição e, particularmente, a uma composição liquida capaz de impedir a agregação da toxina botulinica mesmo quando a toxina botulinica está compreendida em uma concentração baixa para desse modo exibir uma elevada estabilidade, e prevenir eficazmente a adsorção, etc., a um recipiente, para manter constantemente uma atividade da toxina botulinica para cada lote ou para cada frasco liquido.
[002] Especificamente, a presente invenção se refere à composição liquida compreendendo (1) uma toxina botulinica como um ingrediente ativo, (ii) L-alanina ou metilceluiose, (iii) um surfactante não iônico e (iv) um tampão e, opcionalmente , um agente isotônico.
[003] Além disso, a presente invenção se refere a um modo para estabilizar uma toxina botulinica utilizando uma composição liquida, a composição liquida compreendendo (1) uma toxina botulinica, (ii) L-alanina ou metilceluiose, (iii) um surfactante não iônico e (iv) um tampão e, opcionalmente, um agente isotônico.
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Estado da Técnica
[004] Uma variedade de cepas do gênero Clostridium que secretam toxinas neurotóxicas foi descoberta desde os anos 1890s, e características de toxinas secretadas por estas cepas foram identificadas nos últimos 70 anos (Schant, E. J. et al. , Microbiol. Rev., 56:80, 1992).
[005] A toxina com neurotoxicidade derivada das cepas do gênero Clostridium, isto é, a toxina botulínica, é classificada em 7 tipos dos tipos A até G de acordo com características sorológicas das mesmas. Cada toxina tem cerca de 150 kDa de proteína toxina, que é naturalmente composta de complexos que são combinados com várias proteínas não tóxicas. Um complexo médio (300 kDa) é composto de uma proteína toxina e uma proteína não-hemaglutinina não tóxica, e um complexo grande (450 kDa) e um complexo grande-grande (900 kDa) têm formas nas quais os complexos intermediários são combinados com hemaglutinina (Sugiyama, H., Microbiol. Rev., 44: 419, 1980) . Sabe-se que estas proteínas não-hemaglutininas não tóxicas protegem as toxinas de baixo pH e várias proteases no intestino.
[006] Em particular, verificou-se que quando a toxina botulínica do tipo A é administrada localmente a uma dosagem que não afeta sistemicamente o corpo humano, é possível paralisar músculos localizados de locais administrados localmente, em que a característica é utilizável amplamente para a remoção de rugas, usos terapêuticos de rigidez hemiplegia e paralisia cerebral, etc, e, portanto, a demanda vem crescendo rapidamente.
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[007] Entretanto, uma forma pronta para uso de composição liquida compreendendo uma toxina botulinica como um ingrediente ativo sem realizar um processo de reconstituição é preferencial tendo em vista a conveniência do usuário, mas a toxina botulinica tem uma desvantagem em que a estabilidade da toxina botulinica é grandemente reduzida em uma forma liquida, e assim, de modo a aumentar a estabilidade da proteina, foram preparadas preparações de toxina botulinica comerciais convencionais em uma forma liofilizada ou em uma forma de pó seco que é seco sob vácuo.
[008] No entanto, as formulações de pós secos preparadas por liofilização, etc., têm problemas em que, uma vez que é necessário realizar o processo de reconstituição durante a utilização, é inconveniente quando utilizado e o desvio da quantidade de toxina botulinica a ser administrada, particularmente desvios em vista de uma atividade, etc., ocorrem devido a erros de um processo de diluição no processo de reconstituição, etc. Assim, há uma demanda crescente por uma composição liquida capaz de melhorar a conveniência do usuário e minimizar erros no processo de reconstituição.
[009] Em particular, uma vez que a toxina botulinica é altamente tóxica, uma quantidade vestigial deve ser administrada para fins terapêuticos ou cosméticos e, deste modo, é preferencial a composição liquida de uma toxina botulinica a uma concentração inferior a uma composição liquida de uma toxina botulinica de concentração elevada.
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[010] No entanto, sabe-se que quando a toxina botulínica está presente em uma concentração baixa, tende a ser agregada entre si e ser adsorvida a um recipiente e, assim, a atividade desejada e suficiente da toxina botulínica não é exibida, ou melhor, a atividade da toxina se torna mais alta, etc., isto é, o desvio de atividade da toxina botulínica ocorre para cada lote ou para cada frasco de líquido, o que causa efeitos colaterais inesperados, e assim por diante, e não é fácil preparar uma composição líquida estabilizada tendo uma baixa concentração de toxina botulínica.
[011] Neste aspecto, existe uma necessidade urgente de uma nova forma de uma composição líquida capaz de melhorar a conveniência quando utilizada por um usuário, prevenindo eficazmente a agregação de uma toxina botulínica mesmo a uma baixa concentração de toxina botulínica, prevenindo eficientemente a toxina botulínica de ser adsorvida a um recipiente para manter constantemente uma atividade da toxina botulínica para cada lote ou para cada frasco de líquido.
Descrição Geral da Invenção
O Problema Técnico
[012] Um objetivo da presente invenção é proporcionar uma nova forma de uma composição líquida capaz de prevenir eficientemente a agregação de uma toxina botulínica mesmo a uma baixa concentração de toxina botulínica, impedindo eficientemente que a toxina botulínica seja adsorvida em um recipiente para desse modo manter constantemente uma atividade da toxina botulínica para cada lote ou para cada frasco líquido.
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A Solução Técnica
[013] De modo a alcançar os objetivos anteriores, a presente invenção proporciona uma composição liquida estável de uma toxina botulinica compreendendo (1) uma toxina botulinica como um ingrediente ativo, (ii) L-alanina ou metilcelulose, (iii) um surfactante não iônico e (iv) um tampão e, opcionalmente, um agente isotônico.
[014] Além disso, a presente invenção também proporciona um método para estabilizar uma toxina botulinica utilizando uma composição liquida, a composição liquida compreendendo (1) uma toxina botulinica, (ii) L-alanina ou metilcelulose, (iii) um surfactante não iônico e (iv) um tampão e, opcionalmente, um agente isotônico.
Melhor Modo de Realização da Invenção
[015] Salvo definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem os mesmos significados que os geralmente entendidos pelos especialistas na técnica aos quais a presente invenção se refere. Em geral, a nomenclatura utilizada na presente especificação é bem conhecida em campos técnicos e geralmente utilizada.
[016] Em um aspecto, a presente invenção se refere a uma composição líquida compreendendo (i) uma toxina botulinica como um ingrediente ativo, (ii) L-alanina ou metilcelulose, (iii) um
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6/26 surfactante não iônico e (iv) um tampão e, opcionalmente, um agente isotônico.
[017] Na presente invenção, o termo toxina botulínica é utilizado para abranger ambas as neurotoxinas (NTXs) produzidas por cepas de Clostridium botulinum ou seus mutantes e toxinas botulínicas modificadas, recombinantes, híbridas e quiméricas.
[018] A toxina botulínica recombinante pode ter uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada recombinantemente produzida por espécies não-Clostridium. Além disso, a toxina botulínica da presente invenção abrange os sorotipos A, B, C, D, E, F e G da toxina botulínica, e engloba não apenas complexos de toxina botulínica (isto é, complexos de 300, 600 e 900 kDa) mas também toxina botulínica pura (isto é, molécula neurotóxica de cerca de 150 kDa), ambas as quais são úteis na prática da presente invenção.
[019] De um modo preferencial, a toxina botulínica contida na composição líquida da presente invenção é uma toxina botulínica do tipo A.
[020] A composição líquida de acordo com a presente invenção pode conter a toxina botulínica em um teor de cerca de 10 a 200 unidades/mL ou cerca de 20 a 150 unidades/mL, preferencialmente cerca de 25 a 100 unidades/mL, ou 25 a 75 unidades/mL, e mais preferencialmente 25 a 50 unidades/ml, mas o teor da toxina botulínica não está limitado a estes.
[021] A composição líquida da toxina botulínica de acordo com a presente invenção confere hidrofobicidade utilizando L-alanina
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7/26 ou metilcelulose que um tipo de aminoácido não polar. A Lalanina pode aumentar a solubilidade da toxina botulinica através de um efeito hidrofóbico ou um efeito salino, e pode ajustar uma concentração micelar critica quando usada em combinação com um surfactante não iônico, em particular, polissorbato 20 ou polissorbato 80. A metilcelulose é um polímero que possui propriedades anfipáticas semelhantes ao polissorbato 20 ou ao polissorbato 80, mas possui sensibilidade à temperatura em uma forma diferente de surfactante, o que se espera que contribua para a estabilidade térmica.
[022] Na composição líquida da toxina botulinica de acordo com a presente invenção, a L-alanina pode ter um teor de 0,01 a 1% (p/v), preferencialmente 0,05 a 0,5% (p/v), e mais preferencialmente 0, 075 a 0,3% (p/v) com base no teor total da composição. Em uma modalidade exemplificativa, a L-alanina pode ter um teor de 0,1%(p/v) com base no teor total da composição.
[023] Na composição líquida da toxina botulinica de acordo com a presente invenção, a metil celulose pode ter um teor de 0,00001 a 0,1% (p/v), preferencialmente 0,0001 a 0,01% (p/v), e mais preferencialmente 0, 0005 a 0,0015% (p/v) com base no teor total da composição. Em uma modalidade exemplificativa, a metil celulose pode ter um teor de 0.00125 ou 0,000625 %(p/v) com base no teor total da composição.
[024] Na composição líquida da toxina botulinica da presente invenção, o surfactante não iônico pode ser polissorbato 20 ou polissorbato 80, mas não se limita a este. De um modo preferencial, o polissorbato 20 pode ser utilizado. Verifica-se que o surfactante não iônico, em particular, o polisorbato 20, é
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8/26 utilizado para impedir que a toxina botulínica seja adsorvida em um recipiente e aumenta grandemente a estabilidade da toxina botulínica, melhorando simultaneamente a hidrofobicidade e a interação da superfície e impedindo a adsorção ao recipiente. No entanto, quando o polisorbato 20 ou o polissorbato 80 é incluído na composição líquida, a toxina botulínica pode ser simultaneamente estabilizada, mas existe um problema em que uma atividade da toxina botulínica pode ser superior a um valor desej ado.
[025] De modo a resolver este problema, na presente invenção, verifica-se que quando o polissorbato 20 ou o polisorbato 80 é utilizado em uma quantidade vestigial variando entre 0,00001 e 0,1% (p/v), de preferência 0, 0001 a 0,01% (p/v) e, de um modo muito preferencial, 0, 0005 a 0,0015% (p/v) com base no teor total da composição, o problema de que a atividade da toxina botulínica elevada pode ser evitado e a adsorção ao recipiente pode ser eficazmente impedida para manter uma atividade da toxina botulínica para cada lote ou para cada frasco de líquido. Em uma modalidade exemplar, o teor de polissorbato 20 é 0,001 %(p/v) com base no teor total da composição.
[026] A composição líquida da toxina botulínica da presente invenção pode conter um tampão fisiologicamente compatível para manter o pH abaixo de um ponto isoelétrico, assegurando desse modo estabilidade a longo prazo. É necessário que o tampão fisiologicamente compatível seja capaz de manter o pH na faixa de 4,5 a 6,5, preferencialmente na faixa de 5,0 a 6,0, e o mais preferencialmente cerca de 5,5. Como o tampão fisiologicamente adequado, podem ser utilizados citrato de sódio, ácido
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9/26 succinico, ácido fosfórico, monofosfato de potássio, acetato de sódio, cloreto de sódio, etc. De preferência, o citrato de sódio pode ser utilizado como o tampão na composição liquida de acordo com a presente invenção. 0 tampão citrato de sódio é capaz de controlar a alteração do pH que tem um efeito sério na estabilidade no momento do armazenamento a longo prazo de drogas proteicas, mas tem uma possibilidade de diminuição do conteúdo e atividade (potência) quando usado em combinação com excipientes específicos, e assim, o uso do tampão de citrato de sódio precisa ser determinado pela realização de um teste de compatibilidade.
[027] O tampão fisiologicamente compatível na composição líquida da toxina botulínica da presente invenção pode ter um teor de 5 a 35 mM, preferencialmente 10 a 30 mM, e o mais preferencial 15 a 25 mM com base no teor total da composição. Em uma modalidade exemplificativa, o citrato de sódio a pH 5,5 está contido como o tampão fisiologicamente compatível no teor de 20 mM com base no teor total da composição. Verificou-se que a combinação de Lalanina e tampão citrato de sódio aumenta significativamente a estabilidade da toxina botulínica tipo A.
[028] Além disso, a composição líquida da toxina botulínica da presente invenção pode ainda compreender opcionalmente como um agente isotônico. Exemplos do agente isotônico podem compreender cloreto de sódio, glicerina, manitol, sacarose, cloreto de potássio, dextrose, etc. O conteúdo do agente isotônico pode ser 0,7 a 0,95% (p/v) com base no teor total da composição. De preferência, a composição líquida da toxina botulínica da presente invenção compreende 0,7 a 0,95% (p/v) e
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10/26 mais preferencialmente 0,9% (p/v) de cloreto de sódio como o agente isotônico.
[029] Em uma modalidade exemplificativa, a composição liquida da toxina botulinica da presente invenção pode conter 0,01 a 1% (p/v) de alanina, 0, 00001 a 0,1% (p/v) de polissorbato 20 ou polissorbato 80, 5 a 35 mM de citrato de sódio e 0,7 a 0,95% (p/v) do agente isotônico com base no teor total da composição.
[030] Em outra modalidade exemplificativa, uma injeção liquida da toxina botulinica tipo A da presente invenção pode conter 0,00001 a 0,1% (p/v) de metil celulose, 0,00001 a 0,1% (p/v) de polissorbato 20 ou polissorbato 80, 5 a 35 mM de citrato de sódio e 0,7 a 0,95% (p/v) do agente isotônico com base no teor total da composição.
[031] A composição liquida da toxina botulinica da presente invenção pode ser administrada através de vias convencionais de administração. Em algumas concretizações exemplificativas da presente invenção, a composição liquida da toxina botulinica é administrada por injeção intramuscular ou injeção subcutânea, que é um método de administração tópica, a um sujeito em necessidade da mesma. Uma vez que a composição liquida da toxina botulinica da presente invenção está em um estado liquido, é possível ser administrada diretamente sem realizar uma etapa de reconstituição quando utilizada. Adicionalmente, a toxina botulinica incluída na composição líquida da toxina botulinica de acordo com a presente invenção pode manter a estabilidade durante cerca de 12 semanas em temperatura ambiente ou até 5 semanas sob condições de estresse.
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[032] A composição liquida estabilizada da toxina botulinica da presente invenção é utilizável para o tratamento de distúrbios neuromusculares caracterizados por um músculo esquelético hiperativo. Além disso, a composição liquida da toxina botulinica da presente invenção pode ser utilizada para várias finalidades, tais como tratamento de doenças e aumento da beleza, etc., para dor de cabeça, enxaqueca, cefaleia tensional, dor de cabeça sinusal, dor de cabeça cervical, distúrbio da transpiração, hiperidrose axilar, hiperidrose das mãos, hiperidrose dos pés, sindrome de Frey, linha hipercinética da pele, rugas faciais, rugas franzidas, rugas próximas à boca, prega nasolabial, distúrbios cutâneos, acalasia, estrabismo, fissura anal crônica, convulsões palpebrais, dor musculoesquelética, fibromialgia, pancreatite, taquicardia, hipertrofia da próstata, prostatite, retenção urinária, incontinência urinária, bexiga irritável, convulsão facial de meio-lado, tremor, cãibras musculares, distúrbio gastrointestinal, diabetes, sialismo, distúrbio cooperativo detrusor-esfincteriano, rigidez pós-acidente vascular cerebral, paralisia cerebral pediátrica, espasmo muscular liso, restenose, distonia local, epilepsia, distonia cervical, distúrbio da tireoide, hipercalcemia, distúrbio obsessivo, dor da artrite, sindrome de Raynaud, distensão das estrias, adesão peritoneal, vasoespasmo, coriza, contratura muscular, distonia laringea, cãibras de caligrafia e sindrome do túnel do carpo, etc.
[033] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para estabilizar uma toxina botulinica utilizando uma composição liquida, compreendendo a composição liquida (1) uma toxina botulinica, (ii) L-alanina ou metil celulose, (iii) um
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12/26 surfactante não iônico e (iv) um tampão e, opcionaimente, um agente isotônico.
[034] Em uma modalidade exemplificativa, a presente invenção se refere a um método para estabilizar uma preparação de toxina botulinica compreendendo a formação de uma composição liquida combinando (i) uma toxina botulinica com (ii) L-alanina, (iii) polissorbato 20 ou polissorbato 80, (iv) citrato de sódio, e opcionaimente cloreto de sódio que é um agente isotônico, em que a alanina tem um teor de 0,01 a 1% (p/v), o polissorbato 20 ou polissorbato 80 tem um teor de 0,00001 a 0,1% (p/v) , o citrato de sódio tem uma concentração de 5 a 35 mM e o cloreto de sódio que é o agente isotônico tem um teor de 0,7 a 0,95% (p/v) com base no teor total da composição liquida.
[035] Em outra modalidade exemplificativa, a presente invenção se refere a um método para estabilizar uma preparação de toxina botulinica compreendendo a formação de uma composição liquida ao misturar (i) uma toxina botulinica com (ii) metil celulose, (iii) polissorbato 20 ou polissorbato 80, (iv) citrato de sódio, e opcionaimente cloreto de sódio que é um agente isotônico, em que a metil celulose tem um teor de 0, 00001 a 0,1% (p/v), o polissorbato 20 ou polissorbato 80 tem um teor de 0,00001 a 0,1% (p/v), o citrato de sódio tem uma concentração de 5 a 35 mM e o cloreto de sódio que é o agente isotônico tem um teor de 0,7 a 0,95% (p/v) com base na composição liquida total.
[036] Uma vez que a preparação de toxina botulinica estabilizada pelo método da presente invenção é utilizável como uma injeção tal como uma preparação liquida, não é necessário um processo de
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13/26 reconstituição separado antes da utilização e, assim, a preparação de toxina botulínica pode ser convenientemente utilizada e pode ser armazenada em um estado estável por cerca de 6 meses ou mais.
Exemplos
[037] A seguir, a presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos seguintes Exemplos. No entanto, os Exemplos seguintes são apenas para exemplificar a presente invenção e será evidente para os especialistas na técnica que o escopo da presente invenção não se considera limitado a estes Exemplos.
Exemplo 1: Avaliação do teor de toxina botulínica de acordo com os tipos e conteúdos do excipiente anfipático
[038] De modo a encontrar um excipiente adequado para aumentar a estabilidade da toxina botulínica, foram adicionados vários tipos de excipientes anfipáticos à toxina de Clostridium botulinum do tipo A e, em seguida, os efeitos dos tipos e conteúdos dos excipientes anfipáticos no teor de toxina botulínica foram avaliados por Teste ELISA utilizando o leitor de microplacas Versamax BC-138 e BC-378 (Molecular Devices, LLC) . Um tampão citrato de sódio (doravante referido como tampão SC ou solução tampão SC) e um tampão de cloreto de sódio foram utilizados como tampões. Salvo indicação em contrário, foi utilizado o tampão de citrato de sódio preparado compreendendo 0,9% (p/v) de cloreto de sódio como um agente isotônico.
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[039] A toxina botulinica tipo A usada no teste foi preparada pelo método descrito na Patente Coreana No. 1,339,349.
[040] Para o teste ELISA, os padrões da toxina botulinica do tipo A (Daewoong Pharmaceutical) diluídos para várias concentrações e uma composição líquida de acordo com a presente invenção foram dispensados em uma placa de 96 poços revestida com antitoxina botulinica do tipo A (NIBSC, 59/021) e o teste ELISA foi realizado usando uma técnica Sandwich ELISA.
[041] Os respectivos padrões e a composição líquida foram submetidos a reações de anticorpos primários e secundários, seguido de reação com um substrato. Em seguida, mediu-se uma atividade da composição líquida de acordo com uma curva padrão do padrão medindo a absorbância a um comprimento de onda de 450 a 540 nm. A seguir, outros métodos de ELISA na presente invenção foram também testados pelo mesmo método, e os conteúdos foram calculados.
[042] Os resultados do teste foram expressos em percentagem em comparação com o grupo de controle (0,02% de albumina de soro humano, 0,9% de cloreto de sódio) adicionado à mesma concentração estoque (2 ng/ml) como cada composição. O excipiente foi adicionado a cada conteúdo mostrado na Tabela 1 para preparar 1 L de um líquido excipiente, e depois a toxina botulinica foi adicionada a uma concentração de 40 U/ml, e o teor reduzido em comparação com 40 U/ml foi confirmado.
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[Tabela 1] Efeitos dos tipos e conteúdos dos excipíentes anfipáticos no conteúdo de toxina botulínica
No. de Lote Excipíentes Anfipáticos Conteúdos (p/v%) Tampão Taxa de concentração
1 PEG 400 5 0,9% NaCl 2%
2 PEG 400 5 Tampão SC (pH 5,5) 11%
3 PEG 400 0,5 0,9% NaCl 7%
4 PEG 400 0,5 Tampão SC (pH 5,5) 9%
5 PEG 400 0,05 0,9% NaCl 3%
6 PEG 400 0,05 Tampão SC (pH 5,5) 8%
7 Metil celulose 0,05 0,9% NaCl 117%
8 Metil celulose 0,05 Tampão SC (pH 5,5) 99%
9 Metil celulose 0,01 0,9% NaCl 104%
10 Metil celulose 0,01 Tampão SC (pH 5,5) 103%
11 Metil celulose 0,002 0,9% NaCl 81%
12 Metil celulose 0,002 Tampão SC (pH 5,5) 96%
13 CMC sod. 0,1 0,9% NaCl 10%
14 CMC sod. 0,1 Tampão SC (pH 5,5) 24%
15 CMC sod. 0,02 0,9% NaCl 12%
16 CMC sod. 0,02 Tampão SC (pH 5,5) 18%
17 CMC sod. 0,004 0,9% NaCl 15%
18 CMC sod. 0,004 Tampão SC (pH 5,5) 17%
19 PVPK 17 1 0,9% NaCl 46%
20 PVPK 17 1 Tampão S.C (pH 5,5) 84%
21 PVPK 17 0,2 0.9% NaCl 15%
22 PVPK 17 0,2 Tampão S.C (pH 5,5) 74%
23 PVPK 17 0,04 0.9% NaCl 66%
24 PVPK 17 0,04 Tampão S.C (pH 5,5) 74%
25 Polissorbato 20 0,05 0.9% NaCl 99%
26 Polissorbato 20 0,05 Tampão S.C (pH 5,5) 93%
27 Polissorbato 20 0,01 0.9% NaCl 93%
28 Polissorbato 20 0,01 Tampão S.C (pH 5,5) 96%
29 Polissorbato 20 0,002 0.9% NaCl 91%
30 Polissorbato 20 0,002 Tampão S.C (pH 5,5) 101%
[043] Como mostrado na Tabela 1, foi confirmado que quando a metil celulose ou polissorbato 20 foi adicionado, a atividade da toxina botulínica tipo A foi mantida alta. Pelo contrário, quando PEG 400, carboximetil celulose de sódio (CMC sod.) ou povidona K17 (PVPK17) foi adicionado, a atividade da toxina
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16/26 botulínica do tipo A foi reduzida. Consequentemente, na presente invenção , utilizou-se metilcelulose ou polissorbato 20 como um excipiente anfipático para estabilizar a toxina botulínica. Além disso, pode ser confirmado que quando o tampão, em particular, um tampão citrato de sódio ou um tampão de cloreto de sódio foi utilizado em conjunto, uma propriedade em que uma atividade da toxina botulínica do tipo A é mantida, ou seja, propriedade de estabilidade diferente.
Exemplo 2: Outro excipiente utilizável em combinação com polissorbato 20
[044] A concentração máxima disponível de polissorbato 20 foi confirmada, e foi avaliado um efeito no teor de toxina botulínica quando utilizado em combinação com outro excipiente enquanto foi estabelecido o polissorbato 20 como um excipiente básico. O polissorbato 20 foi selecionado como um excipiente primário de acordo com os resultados do Exemplo 1, e a triagem para cada excipiente utilizando o método de teste ELISA foi realizada.
[045] Como os estabilizadores que se espera que funcionem juntamente com o polissorbato 20 selecionado, a L-prolina e a Lalanina foram adicionados como excipientes candidatos tendo em consideração propriedades físicas tais como hidrofobicidade, pKa, valor de pKb e ponto isoelétrico do aminoácido, etc. Uma vez que é necessário um estabilizador adicional, bem como o polissorbato 20, para manter a estabilidade estrutural da proteína, foram selecionados dois aminoácidos, L-prolina e Lalanina, tendo em consideração o pKa 6,0 da toxina botulínica A.
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[046] Um teste de potência animal foi conduzido através da
administração de soluções padrões nas quais a toxina botulínica
do tipo A na forma de pó seco é diluída para várias
concentrações e a composição líquida de acordo com a presente
invenção na cavidade peritoneal de 10 camundongos ICR (4 semanas de idade, peso corporal: 18 a 22 g) (0,1 ml/camundongo), respectivamente, e o número de animais mortos e o número de animais sobreviventes foram confirmados por 3 dias, e então, uma atividade foi calculada usando um programa estatístico (programa StatPlus® 2009 (Release 5.9.8, AnalystSoft) ) . Daqui em diante, outros testes de potência animal na presente invenção foram também realizados pelo mesmo método e a atividade foi calculada.
[Tabela 2] Resultados para uso combinado de polissorbato 20 com aminoácidos
No. de Lote Excipiente 1 Conteúdo (p/v%) Excipiente 2 Conteúdo (p/v%) Tampão ELISA Teste de potência animal
NBT- 251- L169 L-alanina (25mM) 0.223 polissorbato 20 0.5 N/A 117% 143.8%
NBT- 251- L163 L-alanina (25mM) 0.223 polissorbato 20 1 N/A 79% N/A
NBT- 251- L164 L-alanina (25mM) 0.223 polissorbato 20 2 N/A 48% N/A
NBT- 251- L165 L-prolina (25mM) 0.29 polissorbato 20 0.5 N/A 86% N/A
NBT- 251- L166 L-prolina (25mM) 0.29 polissorbato 20 1 N/A 65% N/A
NBT- 251- L167 L-prolina (25mM) 0.29 polissorbato 20 2 N/A 35% N/A
N/A; Não aplicado
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[047] Quando a quantidade de toxina botulínica tratada a uma concentração de 40 U/ml foi convertida em 100%, e analisada pelo método ELISA, o conteúdo da toxina botulínica diminuiu para 80% ou menos quando o teor de polissorbato 20 foi de 1% ou mais, mostrando a diminuição do conteúdo. Como resultado da realização de um teste de potência animal utilizando o grupo de teste NBT-25I-L169, que é o único grupo que mantém 100% de conteúdo, a atividade foi de 143,8% em comparação com o valor de 100% do conteúdo, e a atividade foi altamente avaliada. Além disso, quando o polissorbato 20 foi usado em combinação com Lalanina, um valor de conteúdo inicial da toxina botulínica tipo A foi alto no teste ELISA quando comparado ao polissorbato 20 foi usado em combinação com L-prolina e, portanto, polissorbato 20 e L-alanina foram utilizados em conjunto na presente invenção.
Exemplo 3: Efeito da combinação de polissorbato 20 e L-alanina na potência
[048] De modo a confirmar o efeito do polissorbato 20 e Lalanina que foram selecionados através do Exemplo 2 na atividade (potência) da toxina botulínica, polissorbato 20 e L-alanina foram adicionados em conjunto para preparar uma formulação de toxina botulínica do tipo A como descrito abaixo, e o efeito sobre a atividade (potência) do mesmo foi confirmado.
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[Tabela 3] Resultados da potência de medição na combinação de polissorbato 20 e L-alanina
No. de Lote Excipiente 1 Conteúdo (p/v %) Excipiente 2 Conteúdo (p/v %) Potência animal (%)
NBTS 501- T009 polissorbato 20 0,015 L-alanina 0,01 120,7
NBTS 501- T010 polissorbato 20 0,015 L-alanina 0,01 114,3
NBTS 501- T021 polissorbato 20 0,1 L-alanina 0,1 201,4
NBTS 501- T022 polissorbato 20 0,1 L-alanina 0,1 142
NBTS 501- T007 polissorbato 20 0,1 L-alanina 0,2 148,2
NBTS 501- T008 polissorbato 20 0,1 L-alanina 0,2 136, 8
[049] A Tabela 3 mostra que, mesmo através do mesmo conteúdo de polissorbato 20 e L-alanina foram usados sob as mesmas condições experimentais, a atividade (potência) da toxina botulínica tipo A foi diferente para cada lote, e a atividade foi avaliada excessivamente. Por outro lado, a alta avaliação da atividade da toxina botulínica do polissorbato 20 continua até que a concentração de polissorbato 20 seja de até 0,015%, indicando que o fluxo de valores para cada lote produzido não é constante e instável. Uma vez que este fenômeno foi considerado causado por polissorbato 20 com propriedade anfipática, foi confirmado que era necessário incluir polissorbato 20 na composição líquida em um conteúdo capaz de manter a atividade (potência) da toxina botulínica constantemente.
Exemplo 4: Avaliação de potência de acordo com o conteúdo de polissorbato 20
[050] De modo a investigar o efeito do teor de polissorbato 20 na potência da toxina botulínica, realizou-se uma triagem de
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20/26 potência animal da formulação líquida com a composição seguinte, alterando o conteúdo. Os testes de potência animal do polissorbato 20 em várias concentrações foram conduzidos conforme descrito abaixo para confirmar se a atividade foi altamente avaliada de acordo com a concentração do polissorbato 20. O citrato de sódio 5 mM foi usado para compensar um fenômeno que a estabilidade da proteína é reduzida pela diminuição do polissorbato 20.
[Tabela 4] Resultados da medição da potência animal de acordo com o conteúdo de polissorbato 20
No. de lote L-alanina (p/v %) polissorbato 20 (p/v %) Tampão Potência animal (p/v %)
NBTS-50-T078 0,1 0,0025 tampão S.C 5 mM, pH5,5 132.6
NBTS-50-T079 0,1 0,001 tampão S.C 5 mM, pH5,5 121,1
NBTS-50-T080 0,1 0,00075 tampão S.C 5 mM, pH5,5 114,4
NBTS-50-T081 0,1 0,0005 tampão S.C 5 mM, pH5,5 109,5
[051] No teste para a avaliação da atividade da toxina botulinica através do teste de potência animal, 80 a 125% poderíam ser aceitos como um intervalo adequado. Este é um fenômeno causado pela variação no teste de potência animal e, portanto, o grau é significativamente grande em comparação com os métodos de teste gerais. Como mostrado na Tabela 4 acima, foi confirmado que o título da toxina botulinica era de 114,4%, o que era estável, mesmo quando uma quantidade muito pequena de polissorbato 20, por exemplo, uma quantidade vestigial de 0,00075% (p/v) foi usada.
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Exemplo 5: Avaliação do título e estabilidade de acordo com a concentração de L-alanina
[052] De modo a investigar o efeito do teor de L-alanina na potência da toxina botulínica, uma triagem de potência animal foi conduzida pela alteração dos teores de L-alanina. De modo a confirmar o efeito da L-alanina na ação sinérgica da potência do polissorbato 20 e o efeito da L-alanina na interação com o tampão citrato de sódio e estabilidade, prepararam-se injeções líquidas com tampão citrato de sódio 5 mM e polissorbato 0,001%. A L-alanina foi usada nas concentrações de 0,1%, 0,02% e 0,05%, e a estabilidade sob condições de estresse entre 0,1% e 0,02% foi comparada e avaliada.
[053] Na avaliação da estabilidade sob condições de estresse, as condições de estresse foram determinadas a 40°C e 75% de UR de acordo com a notificação do KFDA, ou a 37°C para comparar e avaliar o aspecto de redução de potência considerando estabilidade térmica da toxina botulínica tipo A e o cronograma de teste de potência animal. Daqui em diante, todas as avaliações de estabilidade sob condições de estresse foram realizadas usando o mesmo método.
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[Tabela 5] Resultados da medição da potência e estabilidade animal de acordo com a concentração de L-alanina
No. de lote Lalanina (p/v %) polissorbato 20 (p/v %) Tampão Título Animal (%) 1 semana sem condições de estresse 3 semanas sem condições de estresse
NBTS- 50- T084 0,1 0,001 5 mM Tampão S . C pH5,5 103,5 103,8 89,4
NBTS- 50- T082 0,05 0,001 5 mM Tampão S . C pH5,5 104,4 N/A
NBTS- 50- T083 0,02 0,001 5 mM Tampão S . C pH5,5 110,1 84,7 74,4
[054] Pode-se confirmar que quanto maior o teor de L-alanina, maior a estabilidade sob condições de estresse, e uma ação sinérgica do título de polissorbato 20 também foi parcialmente suprimida. Antecipou-se que a L-alanina afetou uma concentração micelar crítica de polissorbato 20, e foi confirmado que a combinação com 0,1% de L-alanina teve apenas 14% de redução de atividade por 3 semanas sob condições de estresse. Em vista dos resultados acima, a estabilidade foi particularmente excelente quando a concentração de L-alanina foi de 0,1%.
Exemplo 6: Avaliação da atividade e estabilidade da toxina botulínica do tipo A por tampão
[055] O tampão da composição líquida foi selecionado tendo em consideração o ponto isoelétrico da toxina botulínica do tipo A. O tampão citrato de sódio e cloreto de sódio que possuem uma capacidade tamponante abaixo de pH 6,0, um ponto isoelétrico da
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23/26 toxina botulínica e que são os mais comumente utilizados em produtos para administração muscular, confirmando assim a segurança, foram determinados como um tampão primário da formulação. Em todas as presentes experiências, o tampão citrato de sódio foi preparado compreendendo 0,9% (p v) de cloreto de sódio como um agente isotônico, salvo indicação em contrário.
[056] A preparação de toxina botulínica do tipo A foi preparada combinando (i) L-alanina ou metil celulose e (ii) polissorbato 20 com qualquer um de (iii) dois tampões, tampão citrato de sódio (pH 5,5) e 0,9% (p/v) cloreto de sódio. Os tipos e concentrações de excipíentes adicionados à toxina de Clostridium botulinum tipo A estão resumidos na Tabela 6 abaixo.
[057] Após o tampão ter sido preparado, L-alanina, metil celulose e polissorbato 20 foram adicionados para corresponder a cada concentração, preparando assim uma solução de excipiente. Em seguida, a toxina botulínica foi adicionada para ter uma concentração de 40 U/ml.
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[Tabela 6] Resultados da estabilidade de medição na toxina botulinica Tipo A de acordo com os tipos de tampões
No. de lote Lalanina (p/v %) Metil celulose (p/v %) Polissorbato 20 (p/v %) Tampão Título animal (%) 1 semanais sem condições de estresse 2 semanas sem condições de estresse
NBTS- 50- T068 0,1 0,001 0.9% NaCl 116 96 72,8
NBTS- 50- T070 0,00125 0,001 0.9% NaCl 93,1 56, 5 N/A
NBTS- 50- T076 0,1 0,001 5mM Tampão S . C (pH 5,5), 0.9% NaCl 111.9 92.9 73
NBTS- 50- T077 0,00125 0,001 5mM Tampão S . C (pH 5,5), 0.9% NaCl 128.6 86, 7 86, 7
[058] Como resultados experimentais, como mostrado na Tabela 6, quando o tampão de cloreto de sódio a 0,9% (p/v) foi utilizado, a combinação de metil celulose e polissorbato 20 apresentou estabilidade muito baixa sob condições de estresse. Por outro lado, a combinação de L-alanina e polissorbato 20 apresentou redução de atividade menor que a da metil celulose e polissorbato 20 em 1 semana sob condições de estresse em relação a 0 semana.
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[059] Entretanto, quando o tampão citrato de sódio foi utilizado, a estabilidade da combinação de metil celulose e polissorbato 20 foi suficientemente aumentada, e a estabilidade foi mantida entre 1 semana e 2 semanas sob condições de estresse.
[060] Isto é, pode ser confirmado que, quando o tampão citrato de sódio foi usado, a manutenção da estabilidade foi melhorada. Isso ocorre porque a estabilidade da toxina botulinica podería ser mantida em pH 6, 0 ou menor e fenômenos como a oxidação ocorrendo em ambientes como condições de estresse, etc., poderíam ser aliviados pela função do tampão citrato de sódio.
[Tabela 7] Resultados da medição da potência e estabilidade animal através da potência animal (2o teste) de acordo com a concentração de tampão citrato de sódio (pH 5,5)
No. de lote Lalanina (%) polissorbato 20 (%) Tampão S.C (pH 5,5), 0.9% NaCl) Potência animal (%) 1 semana sem condições de estresse 2 semanas sem condições de estresse
NBTS-50- T076 0,1 0,001 5mM 111,9 92,9 73
NBTS-50- T084 o,l 0,001 lOmM 103,5 103,8 82,1
NBTS-50- T085 0,1 0,001 2 0mM 106, 6 97,5 89,4
[061] Além disso, nos resultados do teste secundário, foi confirmado que 10 mM ou mais de tampão citrato de sódio contribuiu parcialmente para a manutenção da estabilidade sob condições de estresse. Em particular, a estabilidade foi a mais alta quando foi utilizado tampão citrato de sódio 20 mM.
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Aplicabilidade Industrial
[062] A composição líquida da toxina botulínica de acordo com a presente invenção que é pronta para uso sem realizar um processo de reconstituição e, deste modo, é possível melhorar a conveniência do usuário e reduzir um desvio da atividade da toxina botulínica devido a erros de diluição no processo de reconstituição, etc. Além disso, a composição líquida de acordo com a presente invenção evita eficientemente que a toxina botulínica se agregue mesmo a uma baixa concentração de toxina botulínica para desse modo ter estabilidade de armazenamento extremamente excelente e evita eficazmente a adsorção da toxina botulínica a um recipiente, mantendo assim constantemente uma atividade da toxina botulínica para cada lote ou para cada frasco líquido.
[063] Embora modalidades específicas da presente invenção sejam descritas em detalhes, será evidente para os especialistas na técnica que a descrição específica é apenas uma modalidade exemplificativa desejável e não deve ser interpretada como limitante do escopo da presente invenção. Por conseguinte, o escopo substancial da presente invenção é definido pelas reivindicações anexas e seu equivalente.

Claims (3)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição liquida estável caracterizada por compreender (1) uma toxina botulinica, (ii) L-alanina ou metilceluiose, (iii) um surfactante não iônico e (iv) um tampão.
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caracterizada por compreender 0, 00001 a 0,1 % (p/v) de polissorbato 20 ou polissorbato 80 baseado no teor total da composição. 7. Composição líquida, de acordo com a reivindicação 1,
caracterizada por compreender 5 a 35 mM de citrato de sódio como um tampão com base no teor total da composição.
8. Composição liquida, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda um agente isotônico e o agente isotônico está compreendido com um teor de 0,7 a 0,95% (p/v) com base no teor total da composição.
9. Composição líquida, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pela composição estar pronta para ser utilizada para injeção.
10. Método para estabilizar uma toxina botulinica caracterizado por utilizar uma composição líquida compreendendo (i) uma toxina botulinica, (ii) L-alanina ou metilcelulose, (iii) um surfactante não iônico e (iv) um tampão.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela
Petição 870200051120, de 24/04/2020, pág. 7/8
2. Composição líquida, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a toxina botulinica ser uma toxina botulinica do tipo A.
3. Composição líquida, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender 0,01 a 1% (p/v) de L-alanina com base no teor total da composição.
4. Composição líquida, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender 0,00001 a 0,1% (p/v) de metil celulose com base no teor total da composição.
5. Composição líquida, de acordo com reivindicação caracterizada pelo surfactante polissorbato 20 ou polissorbato 80.
6. Composição líquida, de acordo com reivindicação
Petição 870200051120, de 24/04/2020, pág. 6/8
3/3 composição líquida compreender ainda um agente isotônico.
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B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B07G Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette]
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