TWI653048B - 含有肉毒桿菌毒素的穩定液體組合物 - Google Patents

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Abstract

本揭露涉及一種穩定的液體組合物包含一肉毒桿菌毒素作為活性成分，其是即用型(ready-to-use)而不需要重組過程，特別是涉及當肉毒桿菌毒素濃度低時能夠預防肉毒桿菌毒素聚集的液體組合物，從而表現出高穩定性，且有效地防止對容器的吸附等，以保持每批次或每個液體瓶的肉毒桿菌毒素的活性。具體來說，本揭露涉及液體組合物包含(i)一肉毒桿菌毒素作為活性成分、(ii)L-丙氨酸(L-alanine)或甲基纖維素(methyl cellulose)、(iii)一非離子表面活性劑，和(iv)緩衝劑，以及選用的一等滲劑。

Description

含有肉毒桿菌毒素的穩定液體組合物
本揭露涉及一種穩定的液體組合物包含一肉毒桿菌毒素(botulinum toxin)作為活性成分，其是即用型(ready-to-use)而不需要一重組過程(reconstitution process)，特別是涉及當肉毒桿菌毒素濃度低時能夠預防肉毒桿菌毒素聚集的液體組合物，從而表現出高穩定性，且有效地防止對容器的吸附等，以保持每批次或每個液體瓶的肉毒桿菌毒素的活性。
具體來說，本揭露涉及液體組合物包含(i)作為活性成分的一肉毒桿菌毒素，(ii)L-丙氨酸(L-alanine)或甲基纖維素(methyl cellulose)，(iii)一非離子表面活性劑，以及(iv)一緩衝劑，以及選用的一等滲劑。
此外，本揭露涉及使用液體組合物以穩定肉毒桿菌毒素的方法，該液體組合物包含(i)作為活性成分的一肉毒桿菌毒素，(ii)L-丙氨酸(L-alanine)或甲基纖維素(methyl cellulose)，(iii)一非離子表面活性劑，以及(iv)一緩衝劑，以及選用的一等滲劑。
自19世紀90年代以來，已發現了分泌神經毒素的各種梭菌屬菌株(Clostridium genus strains)，這些菌株分泌的毒素的特徵已經在過去70年中獲得鑑定(Schant, E. J. et al., Microbiol. Rev., 56:80, 1992)。
從梭菌屬菌株衍生具有神經毒性的毒素，即肉毒桿菌毒素，根據其血清學特性從A至G類分為7種類型。每種毒素具有大約150kDa的毒素蛋白，其由與幾種無毒蛋白結合的複合物自然地組成。介質複合物(300kDa)由一毒素蛋白和一無毒非血凝素蛋白所組成，大型的複合物(450kDa)和大型-大型複合物(900kDa)具有中間體複合物與血凝素組合的形式(Sugiyama, H., Microbiol. Rev., 44: 419, 1980)。已知這些無毒非血凝素蛋白可以在低pH值和腸道中各種蛋白酶的環境下保護毒素。
特別地，已發現當Ａ型肉毒桿菌毒素(botulinum toxin type A)以不影響人體的劑量局部施用時，可使局部施用部位的局部肌肉癱瘓，其特徵在於可廣泛用於除皺、僵硬偏癱(stiffness hemiplegia)和腦癱等的治療用途，因此需求增長迅速。
同時，考慮到使用者的便利性，較佳地是使用一種包含肉毒桿菌毒素以作為活性成分而不需要重組過程(reconstitution process)的即用型(ready-to-use)液體組合物。但肉毒桿菌毒素的缺點在於肉毒桿菌毒素的穩定性在液態時大幅下降，因此為了提高蛋白質的穩定性，傳統的商業性肉毒桿菌製劑是以真空乾燥的凍乾形式(lyophilized form)或真空乾燥的乾粉形式(dry powder form)來製備。
然而，通過凍乾等製備的乾粉配方的問題在於，由於需要在使用過程中進行重組，所以不方便使用，並且由於重組過程等中的稀釋錯誤，肉毒桿菌毒素量產生偏差，特別是產生活性的偏差。因此，對於能夠提高使用者便利性的液體組合物的需求不斷增長，以最小化重組過程中的錯誤。
特別的是，由於肉毒桿菌毒素毒性高，因此治療或美容用途應以微量施予。因此，較低濃度的肉毒桿菌毒素的液體組合物較高濃度的肉毒桿菌毒素的液體組合物佳。
然而，已知當肉毒桿菌毒素以低濃度存在時，其傾向於彼此聚集並被吸附到容器上，因此沒有展現肉毒桿菌毒素所預期的活性，或者毒素的活性變得更高等，也就是說，每批或每個液體瓶的肉毒桿菌毒素產生活性偏差，這導致意想不到的副作用等。因此，製備具有低濃度肉毒桿菌毒素的穩定液體組合物並不容易。
在這方面，迫切需要一種新穎的液體組合物形式，能夠提高使用時的方便性，即使肉毒桿菌毒素在低濃度下也能有效防止肉毒桿菌毒素聚集，並有效防止肉毒桿菌毒素被吸附到容器上，以持續維持每批或各液體瓶的肉毒桿菌毒素的活性。
本揭露的一目的是提供即使在低肉毒桿菌毒素濃度下，也能有效防止肉毒桿菌毒素聚集的一種液體組合物的新形式，有效防止肉毒桿菌毒素吸附到容器，從而持續維持每個批次或每個液體瓶內肉毒桿菌毒素的活性。
為了實現上述目的，本揭露提供一種穩定肉毒桿菌毒素的液體組合物，包含(i)作為活性成分的一肉毒桿菌毒素，(ii)L-丙氨酸(L-alanine)或甲基纖維素(methyl cellulose)，(iii)一非離子表面活性劑，以及(iv)一緩衝劑，以及選用的一等滲劑。
此外，本揭露涉及使用液體組合物以穩定肉毒桿菌毒素的方法，該液體組合物包含(i)作為活性成分的一肉毒桿菌毒素，(ii)L-丙氨酸(L-alanine)或甲基纖維素(methyl cellulose)，(iii)一非離子表面活性劑，以及(iv)一緩衝劑，以及選用的一等滲劑。
除非另有說明，本文中使用的所有技術和科學術語與本揭露的本領域技術人員通常理解的含義相同。通常，本說明書中使用的術語在技術領域中是公知的，並且為一般用法。
一方面，本揭露涉及一種液體組合物包含(i)作為活性成分的一肉毒桿菌毒素(botulinum toxin)、(ii)L-丙氨酸(L-alanine)或甲基纖維素(methyl cellulose)、(iii)一非離子表面活性劑、以及(iv)一緩衝劑，以及選用的一等滲劑(isotonic agent)。
在本揭露中，該詞「肉毒桿菌毒素」用於包含肉毒桿菌菌株或其突變體產生的神經毒素(NTX)和修飾的、重組的、雜和的和嵌合的肉毒桿菌毒素。
重組肉毒桿菌毒素可以具有由非梭菌屬物種重組產生的一輕鍊和/或一重鏈。此外，本揭露的肉毒桿菌毒素包含A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒桿菌毒素，不僅包含肉毒桿菌毒素複合物(即，300、600和900kDa複合物)，還包含純肉毒桿菌毒素(即約150kDa的神經毒性分子)，這兩者都可實用於本揭露的內容。
優選地，本揭露液體組合物中所含的肉毒桿菌毒素為A型肉毒桿菌毒素。
根據本揭露的液體組合物可含有肉毒桿菌毒素的含量約為10至200 unit/ml或約20至150 unit/ml，較佳約為25至100 unit/ml或25至75 unit/ml，最佳為25至50 unit/ml，但肉毒桿菌毒素的含量不限於此。
根據本揭露的肉毒桿菌毒素的液體組合物使用作為非極性氨基酸的L-丙氨酸(L-alanine)或甲基纖維素(methyl cellulose)賦予疏水性。L-丙氨酸可以通過疏水效應(hydrophobic effect)或鹽效應(salt effect)增加肉毒桿菌毒素的溶解度，並且當與非離子表面活性劑組合使用時，尤其是與聚山梨醇酯(polysorbate)20或聚山梨醇酯(polysorbate)80配合使用時，可調整臨界膠束濃度(critical micelle concentration)。甲基纖維素是與聚山梨醇酯(polysorbate)20或聚山梨醇酯(polysorbate)80具有相似的兩親性的聚合物，但具有不同形式的表面活性劑的溫度敏感性，預期有助於熱穩定性。
根據本揭露的肉毒桿菌毒素的液體組合物，基於組合物的總含量，L-丙氨酸的含量可以為0.01至1%(w/v)，較佳為0.05至0.5%(w/v)，最佳為0.075至0.3%(w/v)。在一個示例性實施例中，基於組合物的總含量，L-丙氨酸的含量可以為0.1%(w/v)。
根據本揭露的肉毒桿菌毒素的液體組合物，基於組合物的總含量，甲基纖維素的含量可以為0.00001至0.1%(w/v)，較佳為0.0001至0.01%(w/v)，最佳為0.0005至0.0015%(w/v)。在一個示例性實施方案中，基於組合物的總含量，甲基纖維素的含量可以為0.00125至0.000625%(w/v)。
在本揭露的肉毒桿菌毒素的液體組合物中，非離子表面活性劑可以是聚山梨醇酯(polysorbate)20或聚山梨醇酯(polysorbate)80，但不限於此。較佳地，可使用聚山梨醇酯(polysorbate)20。發現非離子表面活性劑，特別是聚山梨醇酯(polysorbate)20用於防止肉毒桿菌毒素吸附到容器上，並且大大提升了肉毒桿菌毒素的穩定性，同時改善疏水性和表面相互作用，並防止吸附到容器上。然而，當在液體組合物中包含聚山梨醇酯(polysorbate)20或聚山梨醇酯(polysorbate)80時，可以同時穩定肉毒桿菌毒素，但存在肉毒桿菌毒素的活性高於期望值的問題。
為了解決這個問題，在本揭露中，發現基於組合物的總含量，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80的使用量為0.00001至0.1%( w / v)，較佳為0.0001至0.01%(w/v)，最佳為0.0005至0.0015%(w/v)時，可以防止肉毒桿菌毒素的活性高的問題，並且可以有效地防止對容器的吸附，以保持每批或每個液體瓶的肉毒桿菌毒素的活性。在一個示例性實施例中，基於組合物的總含量，聚山梨醇酯20的含量為0.001%(w/v)。
本揭露肉毒桿菌毒素的液體組合物可含有生理上相容的緩衝劑，以將pH維持在等電點(isoelectric point)以下，從而確保長期的穩定性。生理上相容的緩衝劑需要能夠將pH保持在4.5至6.5的範圍內，較佳在5.0至6.0範圍內，最佳約為5.5。作為生理適用的緩衝劑，可以使用檸檬酸鈉(sodium citrate)、琥珀酸(succinic acid)、磷酸(phosphoric acid)、單磷酸鉀(potassium monophosphate)、乙酸鈉(sodium acetate)、氯化鈉(sodium chloride)等。較佳地，根據本揭露的內容，檸檬酸鈉可用作液體組合物中的緩衝劑。檸檬酸鈉緩衝劑能夠控制對蛋白質藥物長期保存時對穩定性有嚴重影響的pH變化，但與特定賦形劑組合使用時，其含量和活性(效力)可能會降低， 因此，需要通過進行相容性試驗來確定使用檸檬酸鈉緩衝劑。
在本揭露的肉毒桿菌毒素的液體組合物中，基於組合物的總含量，生理上相容的緩衝劑的含量可以為5至35mM，較佳為10至30mM，最佳為15至25mM。在一個示例性實施例中，基於組合物的總含量，作為生理學上相容的緩衝劑的檸檬酸鈉的pH值為5.5，而含量為20mM。發現L-丙氨酸和檸檬酸鈉緩衝劑的組合顯著增加了A型肉毒桿菌毒素的穩定性。
此外，本揭露的肉毒桿菌毒素的液體組合物可以任選地進一步包含等滲劑。等滲劑的實例可以包含氯化鈉、甘油、甘露醇、蔗糖、氯化鉀、葡萄糖等。基於組合物的總含量，等滲劑的含量可以為0.7至0.95%(w/v)。較佳地，本揭露的肉毒桿菌毒素的液體組合物包含0.7至0.95%(w/v)，最佳的是以0.9%(w/v)的氯化鈉作為等滲劑。
在一個示例性實施例中，基於組合物的總含量，本揭露肉毒桿菌毒素的液體組合物可含有0.01至1%(w/v)的丙氨酸、0.00001至0.1%(w/v)的聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80、5至35mM的檸檬酸鈉和0.7至0.95%(w/v)的等滲劑。
在另一示例性實施例中，基於組合物的總含量，本揭露的Ａ型肉毒桿菌毒素液體注射液可含有0.00001至0.1%(w/v)的甲基纖維素、0.00001至0.1%(w/v)的聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80、5至35mM的檸檬酸鈉和0.7至0.95%(w/v)的等滲劑。
本揭露的肉毒桿菌毒素的液體組合物可以通過常規的施用途徑施用。在本揭露的一些示例性實施例中，肉毒桿菌毒素的液體組合物通過肌內注射或皮下注射(其是局部給藥的方法)施用於有需要的受試者。由於本揭露的肉毒桿菌毒素的液體組合物處於液態，所以在使用時可以直接施用而不進行重組步驟。另外，根據本揭露的肉毒桿菌毒素的液體組合物，可以在室溫下保持約12週的穩定性，或在壓力條件(stress conditions)下保持最多約5週的穩定性。
本揭露肉毒桿菌毒素的穩定液體組合物可用於治療以一種活動過度的骨骼肌為特徵的神經肌肉疾病。此外，本揭露的肉毒桿菌毒素的液體組合物可用於各種目的，例如治療疾病和加強美容等，如頭痛、偏頭痛、緊張性頭痛、竇性頭痛、頸部頭痛、出汗障礙、腋窩多汗症、手多汗症、足多汗症、弗雷綜合症、肌肉運動過度、面部皺紋、皺眉皺紋、眼部皺紋、嘴巴附近的皺紋、法令紋、皮膚障礙、賁門失弛緩症、斜視、慢性肛裂、眼瞼發作、肌肉骨骼疼痛、纖維肌痛、胰腺炎、心動過速、前列腺肥大、前列腺炎、尿滯留、尿失禁、易怒性膀胱、半側面部驚厥、震顫、肌肉抽筋、胃腸道疾病、糖尿病、唾液酸、逼尿肌括約肌合作症、中風後僵硬、傷口恢復、 兒科腦癱、平滑肌痙攣、再狹窄、局部肌張力障礙、癲癇、子宮頸肌張力障礙、甲狀腺功能障礙、高鈣血症、強迫症、關節炎疼痛、雷諾綜合徵、紋狀體、腹膜粘連、血管痙攣、流鼻涕、肌肉攣縮、喉部肌張力障礙抽筋和腕管綜合症等。
另一方面，本揭露涉及使用一液體組合物穩定一肉毒桿菌毒素的方法，液體組合物包含(i)作為活性成分的一肉毒桿菌毒素、(ii)L-丙氨酸(L-alanine)或甲基纖維素(methyl cellulose)、(iii)一非離子表面活性劑、以及(iv)一緩衝劑，以及選用的一等滲劑。
在一個示例性實施例中，本揭露涉及一種穩定肉毒桿菌毒素製劑的方法，包含藉由將(i)一肉毒桿菌毒素與(ii)L-丙氨酸(iii)聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，(iv)檸檬酸鈉和任選的氯化鈉(其是等滲劑)組合來形成一液體組合物，其中丙氨酸的含量為0.01的含量為1%(w/v)，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80的含量為0.00001至0.1%(w/v)，檸檬酸鈉的濃度為5至35mM，氯化鈉等滲劑的含量基於液體組合物的總含量為0.7至0.95%(w/v)。
在另一個示例性實施例中，本揭露涉及一種穩定肉毒桿菌毒素製劑的方法，包含藉由混合(i)一肉毒桿菌毒素、(ii)甲基纖維素、(iii)聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80、(iv)檸檬酸鈉，以及選用為等滲劑的氯化鈉，其中甲基纖維素含量為0.00001至0.1(w/v)，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80的含量為0.00001至0.1%(w/v)，檸檬酸鈉的濃度為5至35mM，作為等滲劑的氯化鈉基於總液體組合物的含量為0.7至0.95%(w/v)。
由於透過本揭露的方法穩定化的肉毒桿菌毒素製劑(作為一液體製劑)可用作注射劑，因此在使用前不需單獨的重組過程，因而肉毒桿菌毒素製劑可以方便地使用，並且可以被存儲在一個穩定的狀態約6個月或更長時間。
實施例
下文中，將參照以下實施例對本揭露進行更詳細的說明。但是，以下實施例只是為了舉例說明本揭露的內容，對於本領域技術人員顯而易見的是，本揭露的範圍不被解釋為限於這些實施例。
實施例 1：根據兩親性賦形劑的類型和含量評估肉毒桿菌毒素含量
為了找到適合提高肉毒桿菌毒素穩定性的賦形劑，將各種類型的兩性賦形劑加入到梭菌屬(Clostridium)A型肉毒桿菌毒素中，然後通過使用Versamax酶標儀BC-138和BC-378(分子裝置，LLC)的ELISA試驗，評估兩親性賦形劑的類型和含量對肉毒桿菌毒素含量的影響。使用檸檬酸鈉緩衝劑(以下簡稱「SC緩衝劑」或「SC緩衝劑溶液」)以及氯化鈉緩衝劑用作緩衝劑。除非另有說明，否則使用包含0.9%(w/v)的氯化鈉作為等滲劑來製備檸檬酸鈉緩衝劑。
試驗中使用的Ａ型肉毒桿菌毒素是通過韓國專利1,339,349中所述的方法製備的。
對於ELISA試驗，將根據本發明稀釋至各種濃度的Ａ型肉毒桿菌毒素(Daewoong Pharmaceutical)標準品以及液體組合物分佈在塗佈有Ａ型肉毒桿菌毒素抗毒素(NIBSC，59/021)的96孔板中，並使用夾心ELISA技術(Sandwich ELISA technique)進行ELISA測試。
各標準和液體組合物進行一級和二級抗體反應，隨後與受質(substrate)反應。然後，測量450至540nm波長的吸光度(absorbance)下的標準曲線的液體組合物的活性(activity)。以下，本揭露中的其他ELISA方法也通過相同的方法進行測試，並計算其含量。
測試結果用與每種組合物相同的原料濃度(2ng/ml)加入的對照組(0.02%人血清白蛋白，0.9%氯化鈉)的百分比表示。將賦形劑加入到表1所示的各含量中以製備1L液體賦形劑，然後以40U/ml的濃度加入肉毒桿菌毒素，並且確認與40U/ml相比降低的含量。
[表1] 兩親性賦形劑的類型和含量對肉毒桿菌毒素含量的影響
如表1所示，證實了當加入甲基纖維素或聚山梨醇酯20(polysorbate 20)時，Ａ型肉毒桿菌毒素的活性維持在較高水平。相反，當加入PEG 400、羧甲基纖維素鈉(Sod.CMC)或聚維酮K17(PVPK17)時，Ａ型肉毒桿菌毒素的活性降低。因此，在本揭露內容中，甲基纖維素或聚山梨醇酯20用作兩性賦形劑可穩定肉毒桿菌毒素。此外，可以確定的是，當緩衝劑，特別是檸檬酸鈉緩衝劑或氯化鈉緩衝劑一起使用時，維持A型肉毒桿菌毒素活性的性質(即穩定性)不同。
實施例 2：可與聚山梨醇酯20組合使用的其他賦形劑
確定了聚山梨醇酯20的最大可利用濃度，並評估以聚山梨醇酯20作為基礎賦形劑的同時與其他賦形劑組合使用時對肉毒桿菌毒素含量的影響。根據實施例1的結果選擇聚山梨醇酯20作為主要賦形劑，並使用ELISA試驗方法篩選各賦形劑。
考慮到如疏水性、pKa、pKb值和氨基酸的等電點等的物理性質，加入作為候選賦形劑的穩定劑，其預期與所選的聚山梨醇酯20、L-脯氨酸(L-proline)和L-丙氨酸(L-alanine)一起作用。由於需要另外的穩定劑以及聚山梨醇酯20以維持蛋白質的結構穩定性，考慮到A型肉毒桿菌毒素的pKa 6.0，選擇了兩種氨基酸，氨基酸L-脯氨酸和L-丙氨酸。
通過將標準溶液分別給予10隻ICR-小鼠(4週齡，體重18〜22g)(0.1ml /小鼠)的腹膜內進行動物效力試驗(Animal potency Test)，其中標準溶液為將乾粉形式的A型肉毒桿菌毒素稀釋至各種濃度，以及根據本揭露的液體組合物，並且確定3天內死亡的動物數量和存活的動物數量，然後，使用統計程序(StatPlus® 2009 Program (Release 5.9.8, AnalystSoft))計算活性。以下，通過相同的方法進行本揭露的其他動物效力試驗並計算活性。
[表2] 聚山梨醇酯20與氨基酸組合使用的結果
當將濃度為40U/ml的肉毒桿菌毒素的量轉化為100%，並用ELISA法進行分析時，當聚山梨醇酯20的含量為1%以上時，肉毒桿菌毒素的含量降低至80%以下，顯示含量的下降。使用作為唯一保持100%含量的NBT-25I-L169試驗組進行動物效力試驗的結果，與100%含量值相比，活性為143.8%，且得到高的活性評估。此外，當聚山梨醇酯20與L-丙氨酸組合使用時，與聚山梨醇酯20與L-脯氨酸組合使用時相比，ELISA試驗中的A型肉毒桿菌毒素的初始含量高，因此，聚山梨醇酯20和L-丙氨酸在本揭露中一起使用。
實施例3：聚山梨醇酯20和L-丙氨酸的組合對效力的影響
為了證實通過實施例2選擇的聚山梨醇酯20和L-丙氨酸對肉毒桿菌毒素的活性(效力(potency))的影響，將聚山梨醇酯20和L-丙氨酸一起加入以製備所述的A型肉毒桿菌毒素製劑，並確認其對活性(效力)的影響。
[表3] 測定組合聚山梨醇酯20和L-丙氨酸的效力的結果
表3顯示，在相同的實驗條件下，即使使用相同含量的聚山梨醇酯20和L-丙氨酸，每批的A型肉毒桿菌毒素的活性(效力)不同，評估活性過高。總體而言，評估聚山梨醇酯20的肉毒桿菌毒素的活性高持續到聚山梨醇酯20的濃度達到0.015%為止，這表示每批產生的值的流動不是恆定的以及是不穩定的。由於這種現象被認為是由具有兩親性的聚山梨醇酯20所引起的，因此確認必須將含有聚山梨醇酯(polysorbate)20的物質以能夠持續維持肉毒桿菌毒素的活性(效力)的含量包含在液體組合物中。
實施例4：根據聚山梨醇酯20的含量來評估動物效力
為了研究聚山梨醇酯20含量對肉毒桿菌毒素的動物效力的影響，通過改變含量進行了具有以下組成的液體製劑的動物效力篩選。聚山梨醇酯20在各種濃度下的動物效力試驗如下所述進行，根據聚山梨醇酯20的濃度，以評估確定是否為活性高。使用5mM檸檬酸鈉來補償由於降低聚山梨醇酯20含量而降低蛋白質穩定性的現象。
[表4]根據聚山梨醇酯20含量測定動物效力的結果
在通過動物效力試驗對肉毒桿菌毒素進行活性評價試驗中，可將80至125%作為適當範圍。這是由動物效力試驗的變化引起的現象，因此與一般試驗方法相比，其程度明顯較大。如上表4所示，肉毒桿菌毒素的滴定度(titer)為114.4%，即使是非常少量的聚山梨醇酯20，例如使用微量的0.00075%(w/v)。
實施例5：根據L-丙氨酸的濃度評估滴定度和穩定性
為了研究L-丙氨酸含量對肉毒桿菌毒素效力的影響，通過改變L-丙氨酸的含量進行動物效力篩選。為了證實L-丙氨酸對聚山梨醇酯20的效力協同作用的影響，和L-丙氨酸與檸檬酸鈉緩衝劑相互作用的影響，用含有5mM檸檬酸鈉緩衝劑和0.001%聚山梨醇酯20製備穩定性液體注射液。使用L-丙氨酸的濃度為0.1%、0.02%和0.05%，在0.1%至0.02%的壓力條件(stress conditions)下進行了穩定性的比較和評估。
考慮到A型肉毒桿菌毒素的熱穩定性和動物效力試驗時間表，在壓力條件下的穩定性評估中，根據KFDA的通知，將壓力條件確定為40℃和75%RH，或者在37℃下進行效能降低方面的比較和評估。以下，使用相同的方法對多個壓力條件下的穩定性進行全部評估。
[表5] 根據L-丙氨酸的濃度測量動物效力和穩定性的結果
可以確認，L-丙氨酸含量越高，在壓力條件下的穩定性越高，聚山梨醇酯20的滴度的協同作用也被部分抑制。預計L-丙氨酸會影響聚山梨醇酯20的臨界膠束濃度(critical micelle concentration)，並證實在壓力條件下，與0.1%L-丙氨酸的組合在3週內只有14%的活性降低。 鑑於上述結果，當L-丙氨酸的濃度為0.1%時，穩定性特別優異。
實施例 6：通過緩衝劑評估A型肉毒桿菌毒素的活性和穩定性
考慮到A型肉毒桿菌毒素的等電點，選擇了液體組合物的緩衝劑。被確定為製劑的主緩衝劑的檸檬酸鈉緩衝劑和氯化鈉，具有緩衝能力低於pH 6.0和A型肉毒桿菌毒素(為肌肉給藥產品中最常用的並藉此確認安全性的)的等電點。在本實驗的所有實驗中，除非另有說明，否則通過包含0.9%(w/v)氯化鈉作為等滲劑來製備檸檬酸鈉緩衝劑。
通過組合(i)L-丙氨酸或甲基纖維素和(ii)聚山梨醇酯20與(iii)兩種緩衝劑，檸檬酸鈉緩衝劑(pH5.5)和0.9%(w/v)氯化鈉中的任一者，來製備A型肉毒桿菌毒素製劑。添加到A型肉毒桿菌毒素中的賦形劑的類型和濃度總結在下表6中。
製備緩衝劑後，對應於每個濃度，加入L-丙氨酸、甲基纖維素和聚山梨醇酯(polysorbate)20，從而製備賦形劑溶液。然後，加入肉毒桿菌毒素使其濃度為40U/ml。
[表6] 根據緩衝劑類型，測定A型肉毒桿菌毒素穩定性的結果
作為實驗結果，如表6所示，當使用0.9%(w/v)氯化鈉緩衝劑時，甲基纖維素和聚山梨醇酯20的組合在應力條件下顯示出非常低的穩定性。另一方面，在1週在壓力條件下的L-丙氨酸和聚山梨醇酯20的組合，顯示其活性的下降低於0週的甲基纖維素與聚山梨醇酯20的組合的活性的下降。
同時，使用檸檬酸鈉緩衝劑時，甲基纖維素與聚山梨醇酯20組合的穩定性得到充分提高，並且在壓力條件下穩定性維持在1週至2週之間。
也就是說，可以確認使用檸檬酸鈉緩衝劑時，改善穩定性的維持性。這是因為肉毒桿菌毒素的穩定性可以維持在pH6.0以下，並且通過檸檬酸鈉緩衝劑的功能可減輕如在壓力條件等環境中發生的氧化現象。
[表7]根據檸檬酸鈉緩衝劑的濃度(pH5.5)，通過動物效力(第二次測試)測量動物效力和穩定性的結果
另外，在二次試驗結果中，證實10mM或以上的檸檬酸鈉緩衝劑的部分有助於維持在壓力條件下的穩定性。特別是當使用20mM檸檬酸鈉緩衝劑時，穩定性最高。
[產業利用性]
根據本揭露的A型肉毒桿菌毒素的液體組合物，其是即用型(ready-to-use)而不需要一重組過程(reconstitution process)，因此可以提高使用者的便利性，並減少由於重組過程等中的稀釋過程的錯誤造成肉毒桿菌毒素活性的偏差。此外，根據本揭露的液體組合物有效地防止肉毒桿菌毒素在低肉毒桿菌毒素濃度下聚集，從而具有非常優異的儲存穩定性，並且有效地防止肉毒桿菌毒素吸附到容器，從而不斷維持每批或各液體瓶的肉毒桿菌毒素的活性。
雖然針對本揭露的具體實施方式進行了詳細說明，但是對於本領域技術人員將顯而易見的是，上述具體描述僅僅是示例性實施例，並不應被解釋為限制本揭露的範圍。因此，本揭露的實質範圍由申請專利範圍及其均等物定義。
無
無

Claims (9)

  1. 一種液體組合物，包含一L-丙氨酸(L-alanine)與一甲基纖維素(methyl cellulose)其中一者、一肉毒桿菌毒素、一非離子表面活性劑以及一緩衝劑，該非離子表面活性劑為聚山梨醇酯20(polysorbate 20)或聚山梨醇酯80(polysorbate 80)，該聚山梨醇酯20或該聚山梨醇酯80基於該液體組合物的總含量為0.00001至0.1%(w/v)。
  2. 如請求項1所述之液體組合物，其中該肉毒桿菌毒素是一A型肉毒桿菌毒素。
  3. 如請求項1所述之液體組合物，其中該L-丙氨酸基於該液體組合物的總含量為0.01至1%(w/v)。
  4. 如請求項1所述之液體組合物，其中該甲基纖維素基於該液體組合物的總含量為0.00001至0.1%(w/v)。
  5. 如請求項1所述之液體組合物，包含基於該液體組合物的總含量為5至35mM的檸檬酸鈉(sodium citrate)作為該緩衝劑的。
  6. 如請求項1所述之液體組合物，更包含基於該液體組合物的總含量為0.7至0.95%(w/v)的一等滲劑(isotonic agent)。
  7. 如請求項1至6任一項所述之液體組合物，其中該液體組合物為即用型(ready-to-use)注射劑。
  8. 一種使用液體組合物以穩定肉毒桿菌毒素的方法，包含以下步驟：使用一液體組合物，該液體組合物包含L-丙氨酸(L-alanine)與一甲基纖維素(methyl cellulose)其中一者、一肉毒桿菌毒素、一非離子表面活性劑以及一緩衝劑，該非離子表面活性劑為聚山梨醇酯20(polysorbate 20)或聚山梨醇酯80(polysorbate 80)，該聚山梨醇酯20或該聚山梨醇酯80基於該液體組合物的總含量為0.00001至0.1%(w/v)。
  9. 如請求項8所述的方法，其中該液體組合物更包含一等滲劑。
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