BR112015023001B1 - Oligonucleotídeo antisenso, composição farmacêutica compreendendo o mesmo e uso da dita composição para o tratamento de distrofia muscular de duchenne (dmd) - Google Patents

Oligonucleotídeo antisenso, composição farmacêutica compreendendo o mesmo e uso da dita composição para o tratamento de distrofia muscular de duchenne (dmd) Download PDF

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Diane Elizabeth Frank
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Abstract

COMPOSIÇÕES RESULTANTES DA RETIRADA DE EXONS PARA O TRATAMENTO DE DISTROFIA MUSCULAR. A presente invenção refere-se a moléculas antisense capazes de se ligarem a um sítio alvo selecionado no gene da distrofina humana para induzir a retirada (skipping) do exon 44.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE CORRELATOS
[001]Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade deste ao Pedido de Patente U.S. Provisório No de Série 61/784 547, depositado em 14 de março de 2013, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente.
CAMPO DA TÉCNICA
[002]A presente invenção refere-se a novos compostos e composições anti- senso (antisense) adequados para facilitar a retirada (skipping) de exons no gene da distrofina humana. A invenção também provê métodos para induzir a retirada de exons utilizando as novas composições antisenso adaptadas para o uso nos métodos da invenção.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[003]Tecnologias antisenso estão sendo desenvolvidas utilizando uma gama de reações químicas que afetam a expressão gênica em uma variedade de níveis diferentes (transcrição, splicing (processamento), estabilidade, tradução). Muito dessa pesquisa tem se centrado no uso de compostos antisenso para corrigir ou compensar genes anormais ou associados a doenças em uma grande variedade de indicações. As moléculas antisenso são capazes de inibir a expressão gênica com especificidade e, por esse motivo, muitos esforços de pesquisa que abordam o uso de oligonucleotí- deos como moduladores da expressão gênica têm se concentrado em inibir a expressão de genes alvos ou a na função de elementos que atuam sobre a transcrição (cisacting elements). Os oligonucleotídeos antisenso são tipicamente direcionados contra o RNA, seja fita sense (por exemplo, mRNA) ou na fita filha (minus strand) no caso de alguns RNA alvos virais. Para alcançar um efeito desejado de regulação negativa de um gene específico, os oligonucleotídeos geralmente propiciam o decaimento do mRNA alvo e bloqueiam a tradução do mRNA ou bloqueiam a função de elementos cis-acting do RNA, pelo qual efetivamente impedem a síntese de novo da proteína alvo ou a replicação do RNA viral.
[004]No entanto, tais técnicas não são úteis quando o objeto é regular positi-vamente a produção da proteína nativa ou compensar mutações que induzem o término prematuro da tradução, tais como mutações nonsense (sem sentido) ou que provocam o deslocamento do quadro de leitura (frame shift). Nesses casos, o transcrito gênico defeituoso não deve ser submetido à degradação direcionada ou à inibição estérica, de modo que a química do oligonucleotídeo antisenso não deva promover o decaimento desejado do mRNA ou o bloqueio da tradução.
[005]Em uma variedade de doenças genéticas, os efeitos de mutações sobre a expressão eventual de um gene podem ser modulados por meio de um processo de retirada (skipping) direcionada de exons durante o processo de processamento (splicing). O processo de splicing é direcionado por um mecanismo complexo com múltiplos componentes que aproxima estreitamente junções exon-intron adjacentes no pré- mRNA e que realiza a clivagem de ligações fosfodiéster nas extremidades dos introns com a sua reformação subsequente entre os exons que deverão ser processados em conjunto. Esse processo complexo e altamente preciso é mediado por motivos na sequência do pré-mRNA que são segmentos do RNA relativamente curtos, semiconser- vados, aos quais vários fatores do splicing nuclear que são então envolvidos nas reações de splicing se ligam. Alterar a maneira pela qual o mecanismo do splicing lê ou reconhece os motivos envolvidos no processamento do pré-mRNA torna possível criar moléculas de mRNA processadas de modo diferenciado. Foi atualmente reconhecido que a maioria dos genes humanos sofre processamento alternativo durante a expressão gênica normal, embora os mecanismos envolvidos não tenham sido identificados. Bennett et al. (Patente U.S. No 6 210 892) descrevem a modulação antisenso do processamento celular de mRNA do tipo selvagem utilizando análogos antisenso de oligonucleotídeos que não induzem a clivagem mediada por RNAse H do RNA alvo. Essa modulação encontra utilidade por ser capaz de gerar mRNAs processados de modo alternativo e desprovidos de exons específicos (por exemplo, como descrito por Sazani, Kole, et al. 2007) para a geração de receptores solúveis da superfamília de TNF que carecem de exons codificadores de domínios abrangendo membranas.
[006]Em casos em que uma proteína normalmente funcional é terminada pre-maturamente por causa de mutações presentes, um meio para restaurar a produção da proteína funcional graças à tecnologia antisenso demonstrou que é possível intervir durante os processos de splicing, e que se exons associados com mutações causadoras da doença puderem ser excluídos especificamente de alguns genes, um produto proteico encurtado pode às vezes ser criado, dispondo de propriedades biológicas similares às da proteína nativa ou que tenha atividade biológica suficiente para melhorar a doença causada por mutações associadas com o exon (ver, por exemplo, Sierakowska, Sambade et al. 1996; Wilton, Lloyd et al. 1999; van Deutekom, Brem- mer-Bout et al. 2001; Lu, Mann et al. 2003; Aartsma-Rus, Janson et al. 2004). Kole et al. (Patentes U.S. Nos 5 627 274; 5 916 808; 5 976 879; e 5 665 593) descrevem métodos para combater o splicing anormal utilizando análogos antisenso modificados de oligonucleotídeos que não promovem o decaimento do pré-mRNA visado. Bennett et al. (Patentes U.S. No 6 210 892) descrevem a modulação antisenso do processamento de mRNA celular do tipo selvagem também utilizando análogos antisenso de oligonucleotídeos que não induzem a clivagem mediada por RNAse H do RNA alvo.
[007]Provavelmente, o processo da retirada (skipping) direcionada de exons será especialmente útil em genes longos nos quais há muitos exons e introns, quando há redundância na constituição genética dos exons ou quando uma proteína é capaz de funcionar sem um ou mais exons específicos. Os esforços para redirecionar o processamento de genes para o tratamento de doenças genéticas associadas com truncagens causadas por mutações em vários genes têm se concentrado sobre o uso de oligonucleotídeos antisenso que: (1) se sobrepõem total ou parcialmente aos elementos envolvidos no processo de splicing; ou (2) se ligam ao pré-mRNA em uma posição suficientemente próxima ao elemento para perturbar a ligação e a função dos fatores do splicing que mediariam normalmente uma determinada reação de splicing ocorrida naquele elemento.
[008]A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é causada por um defeito na expressão da proteína distrofina. O gene codificador da proteína contém 79 exons espalhados sobre mais de 2 milhões de nucleotídeos do DNA. Qualquer mutação exô- nica que altere o quadro de leitura do exon, ou que introduza um códon de parada, ou que seja caracterizada pela remoção de um exon ou exons de um quadro inteiro, ou duplicações de um ou mais exons possui o potencial para perturbar a produção de distrofina funcional, resultando em DMD.
[009]Foi constatado que uma forma menos grave da distrofia muscular, a distrofia muscular de Becker (BMD) surge quando uma mutação, tipicamente uma dele- ção de um ou mais exons, e resulta em um quadro de leitura correto ao longo do transcrito inteiro da distrofina, de tal modo que a tradução de mRNA em proteína não terminada prematuramente. Se a união dos exons a montante e a jusante no processamento de um pré-mRNA com mutação para distrofina mantiver o quadro de leitura correto do gene, o resultado é um mRNA codificador de uma proteína com uma dele- ção interna curta ainda retendo alguma atividade e levando a um fenótipo de Becker.
[010]Há muitos anos se sabe que deleções de um exon ou exons que não alteram o quadro de leitura de uma proteína distrofina dariam origem a um fenótipo de distrofia muscular de Becker, ao passo que uma deleção de exons que cause um deslocamento do quadro fará surgir DMD (Monaco, Bertelson et al. 1988). Em geral, mutações na distrofina, incluindo mutações pontuais e deleções de exons que alteram o quadro de leitura e assim interrompem a tradução proteica apropriada, resultam em DMD. Deve ser destacado também que alguns pacientes com BMD e DMD são portadores de deleções de exons abrangendo múltiplos exons.
[011]A modulação do splicing de pré-mRNA de distrofina mutante com oligor- ribonucleotídeos foi relatada in vitro e in vivo (ver, por exemplo, Matsuo, Masumura et al. 1991; Takeshima, Nishio et al. 1995; Pramono, Takeshima et al. 1996; Dunckley, Eperon et al. 1997; Dunckley, Manoharan et al. 1998; Errington, Mann et al. 2003).
[012]O primeiro exemplo de retirada específica e reprodutível de exons no modelo com camundongos mdx foi relatado por Wilton et al. (Wilton, Lloyd et al. 1999). O direcionamento de uma molécula antisenso para o sítio doador de splicing induziu uma retirada consistente e eficiente do exon 23 no mRNA da distrofina dentro de 6 horas de tratamento das células cultivadas. Wilton et al. também descrevem o direcionamento para a região aceitadora do pré-mRNA da distrofina de camundongos com oligonucleotídeos antisenso mais longos. Embora o primeiro oligonucleotídeo antisenso direcionado para o sítio doador de splicing no intron 23 tenha induzido a retirada consistente de exons em mioblastos primários cultivados, esse composto demonstrou ser muito menos eficiente em culturas de células imortalizadas que expressavam níveis mais elevados de distrofina. No entanto, com refinamento do direcionamento e o desenho de oligonucleotídeos antisenso, a eficiência da remoção específica de exons foi aumentada em quase uma ordem de magnitude (Mann, Honeyman et al. 2002).
[013]Estudos recentes começaram a abordar o desafio de se conseguir a expressão sustentada de distrofina acompanhada por efeitos adversos mínimos em tecidos afetados pela ausência de distrofina. A injeção intramuscular de um oligonucleotídeo antisenso direcionado para o exon 51 (PRO051) no músculo tibial anterior em quatro pacientes com DMD resultou na retirada específica do exon 51 sem quaisquer efeitos adversos clinicamente evidentes (Mann, Honeyman et al. 2002; van Deutekom, Janson et al. 2007). Estudos investigando a liberação sistêmica de um oligômero de fosforodiamidato morfolino antisenso conjugado a um peptídeo penetrador de células (PPMO) direcionado para o exon 23 em camundongos mdx produziram produção elevada e sustentada de proteína distrofina em músculos esqueléticos e cardíacos sem toxicidade detectável (Jearawiriyapaisarn, Moulton et al. 2008; Wu, Moulton et al. 2008; Yin, Moulton et al. 2008).
[014]Ensaios clínicos recentes que testaram a segurança e a eficácia de oli-gonucleotídeos que mudam o splicing (SSOs, splice switching oligonucleotides') para o tratamento de DMD baseiam-se na tecnologia SSO para induzir o splicing alternativo de pré-mRNAs por bloqueio estérico do spliceossomo (Cirak etal., 2011; Goemans et al., 2011; Kinali et al., 2009; van Deutekom et al., 2007).
[015]Apesar desses sucessos, há ainda necessidade de oligômeros antisenso melhorados direcionados para múltiplos exons da distrofina e composições melhoradas para liberação em músculos, além de métodos para aplicações terapêuticas destinadas à DMD.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[016]Em um aspecto, a invenção provê um oligômero antisenso com 20-50 nucleotídeos de extensão capaz de se ligar a um alvo selecionado e induzir a retirada de exons no gene da distrofina humana, em que o oligômero antisenso compreende uma sequência de bases que se hibridiza especificamente com uma reação alvo do exon 44 selecionada a partir do grupo constituído por H44A(-07+15), H44A(-08+15), H44A(-06+15), H44A(-08+17), H44A(-07+17) e H44A(-06+17), em que as bases do oligômero são ligadas a estruturas de anel morfolínico e em que as estruturas de anel morfolínico são unidas por ligações entre subunidades contendo fósforo que unem um nitrogênio do morfolino de uma estrutura de anel a um carbono exocíclico 5’ de uma estrutura de anel adjacente. Em uma modalidade, o oligômero antisenso compreende uma sequência de bases selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 1 e 4-8. Em outra modalidade, o oligômero antisenso possui cerca de 20 a 30 nucleo- tídeos de comprimento ou aproximadamente 22 a 28 nucleotídeos de comprimento. Em ainda outra modalidade, a sequência consiste em uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1 e 4-8. Em uma modalidade, a invenção provê um oligômero antisenso não ativa RNase H.
[017]Em outro aspecto, a invenção provê um oligômero antisenso que é ligado quimicamente a uma ou mais porções ou a conjugados para intensificar a atividade, a distribuição celular ou a captação celular do oligômero antisenso, tal como, por exemplo, uma molécula de polietilenoglicol. Em outras modalidades, o oligômero antisenso é conjugado a um peptídeo rico em arginina tal como uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOS: 24-39.
[018]Em ainda outro aspecto, a invenção provê um oligômero antisenso com 20-50 nucleotídeos de comprimento capaz de se ligar a um alvo selecionado para induzir a retirada de exons no gene da distrofina humana, em que o oligômero anti- senso compreende uma sequência de bases que se hibridiza especificamente com uma região alvo do exon 44 selecionada a partir do grupo constituído por H44A(- 07+15), H44A(-08+15), H44A(-06+15), H44A(-08+17), H44A(-07+17) e H44A(- 06+17), em que as bases do oligômero são ligadas a estruturas de anel morfolínico e em que as estruturas de anel morfolínico são unidas por ligações entre subunidades substancialmente sem carga contendo fósforo, unindo um nitrogênio do morfolino de uma estrutura de anel a um carbono exocíclico 5’ de uma estrutura de anel adjacente. Em uma modalidade, 5%-35% das ligações do oligômero antisenso apresentam carga positiva. Em outra modalidade, as ligações entre subunidades do oligômero antisenso não têm carga e são intercaladas com ligações que apresentam carga positiva em pH fisiológico, em que o número total de ligações que apresentam carga positiva é entre 2 e no máximo a metade do número total de ligações. Em algumas modalidades, o oligômero antisenso compreende estruturas de anel morfolínico e ligações fosforodi- amidato entre as subunidades. Em algumas modalidades, o oligômero antisenso é modificado um grupo catiônico pendente.
[019]Em outro aspecto, a invenção provê um oligômero antisenso selecionado a partir do grupo constituído por:
Figure img0001
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em que ^ = a estereoquímica do centro de fósforo não é definida.
[020]Em algumas modalidades, timina pode substituir uracila nas estruturas acima.
[021]Em um aspecto, o composto antisenso é constituído por ligações entre as subunidades contendo fósforo, unindo um nitrogênio do morfolino de uma subuni- dade a um carbono exocíclico 5' de uma subunidade adjacente, em que as ligações são ligações fosforodiamidato, de acordo com a estrutura:
Figure img0007
onde Y1=O, Z=O, Pj é uma porção para pareamento de base purina ou pirimi- dina eficaz para se ligar, por ligação de hidrogênio base-específica, a uma base em um polinucleotídeo, e X é alquila, alcoxi, tioalcoxi ou alquilamino, por exemplo, em que X=NR2, onde todo R é independentemente hidrogênio ou metila. As ligações entre as subunidades acima, que não apresentam carga, podem ser intercaladas com ligações que apresentam carga positiva em pH fisiológico, em que o número total de ligações de carga positiva é entre 1 e até a totalidade do número total de ligações entre subu- nidades.
[022]Em outra modalidade exemplar, o composto é constituído por modificações nas ligações entre subunidades e nos terminais, conforme descrito no Pedido de Patente U.S. No 13/118 298, cujo conteúdo é aqui incorporado em sua totalidade.
[023]De acordo com um aspecto, a invenção provê moléculas antisenso capazes de se ligar a um alvo selecionado no pré-mRNA da distrofina humana para induzir a retirada de exons. Em outro aspecto, a invenção provê dois ou mais oligonu- cleotídeos antisenso que são usados junto para induzir a retirada de um único ou de múltiplos exons. Por exemplo, a retirada de um único ou de múltiplos exons pode ser realizada unindo duas ou mais moléculas de oligonucleotídeos antisenso.
[024]Em outro aspecto, a invenção refere-se a um oligonucleotídeo antisenso isolado com 20 a 50 nucleotídeos de comprimento, incluindo pelo menos 10, 12, 15, 17, 20 ou mais nucleotídeos consecutivos complementares a uma região alvo do exon 44 do gene da distrofina, designada como sítio de anelamento, selecionada a partir do grupo constituído por: H44A(-07+17), H44A(-07+20), H44A(-07+22), H44A(-8+15), H44A(-7+15), H44A(-6+15), H44A(-8+17), H44A(-6+17), H44A(+77+101), H44A(+64+91), H44A(+62+89), H44A(+62+85), H44A(-13+14), H44A(-14+15), em que o oligonucleotídeo antisenso se hibridiza especificamente com o sítio de anela- mento induzindo a retirada do exon 44. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo anti- senso possui 25 a 28 nucleotídeos de comprimento.
[025]Em outro aspecto, a invenção refere-se a um oligonucleotídeo antisenso isolado com 20 a 50 nucleotídeos de comprimento, incluindo pelo menos 10, 12, 15, 17, 20 ou mais nucleotídeos de uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo constituído por: SEQ ID NOs: 1-12, 46 e 47, em que o oligonucleotídeo se hibridiza especificamente com uma região alvo do exon 44 do gene da distrofina e induz a retirada do exon 44. Em uma modalidade, as bases timina, nas SEQ ID NOs: 1-12, 46 e 47, são opcionalmente uracila.
[026]Sequências antisenso exemplares direcionadas para o exon 44 incluem aquelas identificadas abaixo.
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Figure img0009
[027]Em uma modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-07+17), tal como a SEQ ID NO:1. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-07+20), tal como a SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-07+22), tal como a SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-8+15), tal como a SEQ ID NO: 4. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anela- mento H44A(-7+15), tal como a SEQ ID NO: 5. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-6+15), tal como a SEQ ID NO: 6. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-8+17), tal como a SEQ ID NO: 7. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-6+17), tal como a SEQ ID NO: 8. Em outra modalidade, o oligô- mero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(+77+101), tal como a SEQ ID NO: 9. Em outra modalidade, o oligômero anti- senso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(+64+91), tal como a SEQ ID NO: 10. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(+62+89), tal como a SEQ ID NO: 11. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(+62+85), tal como a SEQ ID NO: 12. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(- 13+14), tal como a SEQ ID NO: 46. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-14+15), tal como a SEQ ID NO: 47.
[028]Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso da invenção contêm uma ou mais modificações para modificar ou impedir a clivagem por RNase H. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso da invenção não ativa RNase H. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso compreendem uma cadeia principal não natural. Em algumas modalidades, as porções de açúcar da cadeia principal do oligonucleotídeo são substituídas por porções não naturais, como morfolinos. Em algumas modalidades, nos oligonucleotídeos antisenso, as ligações entre os nucleotídeos da cadeia principal do oligonucleotídeo são substituídas por ligações não naturais entre os nucleotídeos, tais como fosfatos modificados. Os fosfa- tos modificados exemplares incluem metil fosfonatos, metil fosforotioatos, fosforomor- folidatos, fosforopiperazidatos e fosforoamidatos. Em algumas modalidades, o oligo- nucleotídeo antisenso é um 2’-O-metil-oligorribonucleotídeo ou um ácido nucleico pep- tídico.
[029]Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso contém modificações ou substituições de bases. Por exemplo, é possível selecionar certas bases dos nucleotídeos para aumentar a afinidade de ligação dos oligonucleotídeos anti- senso aqui descritos. Essas incluem pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e pu- rinas N-2, N-6 e O-6 substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila, 5- propinilcitosina e 2, 6-diaminopurina. As substituições do tipo 5-metilcitosina demonstraram aumentar a estabilidade do duplex de ácido nucleico em 0,6-1,2 °C, e podem ser incorporadas nos oligonucleotídeos antisenso aqui descritos. Em uma modalidade, pelo menos uma base pirimidina do oligonucleotídeo compreende uma base pirimidina 5-substituída, em que a base pirimidina é selecionada a partir do grupo constituído por citosina, timina e uracila. Em uma modalidade, a base pirimidina 5-substituída é 5- metilcitosina. Em outra modalidade, pelo menos uma base purina do oligonucleotídeo compreende uma base purina N-2, N-6 substituída. Em uma modalidade, a base pu- rina N-2, N-6 substituída é 2, 6-diaminopurina.
[030]Em uma modalidade, o oligonucleotídeo antisenso inclui uma ou mais substituições do tipo 5-metilcitosina isoladamente ou combinadas com outra modificação, como modificações 2'-O-metoxietila em açúcares. Em ainda outra modalidade, o oligonucleotídeo antisenso inclui uma ou mais substituições do tipo 2, 6-diaminopurina isoladamente ou combinadas com outra modificação.
[031]Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antisenso é ligado quimicamente a uma ou mais porções, tais como uma porção polietilenoglicol, ou a conjugados, como um peptídeo penetrador de células rico em arginina (por exemplo, SEQ ID NOs: 24-39), que intensificam a atividade, a distribuição celular ou a captação celular do oligonucleotídeo antisenso. Em uma modalidade exemplar, o polipeptídeo rico em arginina é acoplado covalentemente em seu resíduo N-terminal ou C-terminal à extremidade 3' ou 5’ do composto antisenso. Além disso, em uma modalidade exemplar, o composto antisenso é constituído por subunidades morfolino e ligações entre as subunidades contendo fósforo, unindo um nitrogênio do morfolino a um carbono exocíclico 5' de uma subunidade adjacente.
[032]Em outro aspecto, a invenção provê vetores de expressão que incorporam os oligonucleotídeos antisenso descritos acima, por exemplo, os oligonucleotí- deos antisenso das SEQ ID NOs: 1-12, 46 e 47. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um retrovírus ou vetor não retroviral modificado, tal como um vetor viral adeno-associado.
[033]Em outro aspecto, a invenção provê composições farmacêuticas que incluem os oligonucleotídeos antisenso descritos acima e uma solução salina que inclui um tampão fosfato.
[034]Em outro aspecto, a invenção provê moléculas antisenso selecionadas e/ou adaptadas para auxiliar o tratamento profilático ou terapêutico de um transtorno genético, compreendendo ao menos uma molécula antisenso em uma forma adequada para liberação a um paciente.
[035]Em outro aspecto, a invenção provê um método para tratar um paciente que sofre de uma doença genética, em que há uma mutação em um gene codificador de uma determinada proteína e o efeito da mutação pode ser anulado pela retirada de exons, compreendendo as etapas de: (a) selecionar uma molécula antisenso de acordo com os métodos aqui descritos; e (b) administrar a molécula a um paciente com necessidade de tal tratamento. A invenção também aborda o uso de oligonucle- otídeos antisenso purificados e isolados da invenção na produção de um medicamento para o tratamento de uma doença genética.
[036] Em outro aspecto, a invenção provê um método para tratar uma condição caracterizada pela distrofia muscular de Duchenne, o qual inclui administrar a um paciente uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo antisenso adequadamente desenhado da invenção, relevante para a lesão genética em particular naquele paciente. Além disso, a invenção provê um método para tratar profilaticamente um paciente e prevenir ou minimizar a distrofia muscular de Duchenne, pela administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo antisenso ou de uma composição farmacêutica compreendendo uma ou mais dessas moléculas biológicas.
[037]Em outro aspecto, a invenção também provê kits para tratar uma doença genética, em que os kits compreendem pelo menos um oligonucleotídeo antisenso da presente invenção, que está acondicionado em um recipiente adequado, e instruções para seu uso.
[038]Esses e outros objetos e características serão entendidos mais completamente quando a descrição detalhada da invenção a seguir for lida em conjunto com as figuras.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS
[039]A Figura 1A mostra uma estrutura exemplar do oligômero de morfolino com uma ligação fosforodiamidato.
[040]A Figura 1B mostra um conjugado de um peptídeo rico em arginina e um oligômero antisenso, de acordo com uma modalidade da invenção.
[041]A Figura 1C mostra um conjugado como na Figura 1B, em que as ligações na cadeia principal contêm um ou mais grupos que apresentam carga positiva.
[042]As Figuras 1D-G mostra um segmento com subunidades repetidas de oligonucleotídeos morfolinos exemplares, designados D a G.
[043]As Figuras 2A-2B retratam um esquema de reação para preparar um elemento de ligação (linker) para síntese em fase sólida e um suporte sólido para síntese de oligômeros.
[044]As Figuras 3 e 4 retratam gráficos correspondentes a experimentos que mostram as atividades relativas de oligômeros antisenso exemplares para indução da retirada do exon 44 em células cultivadas do rabdomiossarcoma humano. O RNA de células do rabdomiossarcoma tratadas com os oligômeros indicados foi submetido à amplificação aninhada por RT-PCR específica para o exon 44, seguida por eletroforese em gel e quantificação da intensidade das bandas. Os dados estão representados por % de retirada de exons, conforme avaliada por PCR, ou seja, a intensidade das bandas do produto resultante da retirada de exons em relação ao produto completo da PCR. Na Figura 3, H44A(-06+14), H44A(-06+20) e H44A(-09+17) (SEQ ID NOs: 13, 19 e 20, respectivamente) são oligômeros publicados. Na Figura 4, H44A(+85+104), H44A(+59+85) e H44A(+65+90) (SEQ ID NOs: 14, 21 e 23, respectivamente) são oli- gômeros publicados.
[045]As Figuras 5 e 6 retratam gráficos correspondentes a experimentos que mostram as atividades relativas de oligômeros antisenso exemplares para induzir a retirada do exon 44 em mioblastos primários humanos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[046]As modalidades da presente invenção referem-se em geral a compostos antisenso melhorados, e a métodos para usá-los, que são especificamente desenhados para induzir a retirada de exons no gene da distrofina humana. A distrofina desempenha uma função vital no funcionamento muscular, e várias doenças relacionadas a músculos são caracterizadas por formas mutantes desse gene. Consequentemente, em certas modalidades, os compostos antisenso melhorados aqui descritos induzem a retirada de exons em formas mutantes do gene da distrofina humana, tal como os genes mutantes da distrofina encontrados na distrofia muscular de Duchenne (DMD) e na distrofia muscular de Becker (BMD).
[047]Em decorrência de eventos anormais no processamento (splicing) do mRNA causados por mutações, esses genes mutantes da distrofina humana expressam proteína distrofina defeituosa ou não expressam qualquer distrofina mensurável, uma condição que leva a várias formas de distrofia muscular. Para sanar essas condições, os compostos antisenso da presente invenção hibridizam-se com regiões selecionadas de um RNA previamente processado de um gene mutante da distrofina humana, induzem a retirada de exons e splicing de modo diferencial naquele mRNA de distrofina caso contrário processado anormalmente, assim permitindo às células musculares produzirem um transcrito de mRNA que codifica uma proteína distrofina funcional. Em certas modalidades, a proteína distrofina resultante não é necessariamente a forma do "tipo selvagem" de distrofina, mas sim uma forma truncada, não obstante funcional ou semifuncional, de distrofina.
[048] Por aumentarem os níveis de proteína distrofina funcional em células musculares, essas modalidades e outras relacionadas podem ser úteis na profilaxia e no tratamento de distrofia muscular, especialmente aquelas formas de distrofia muscular, como DMD e BMD, que são caracterizadas pela expressão proteica defeituosa da distrofina que se deve ao splicing anormal do mRNA. Os oligômeros específicos aqui descritos proporcionam ainda o direcionamento melhorado específico para exons da distrofina acima de outros oligômeros em uso, assim oferecendo vantagens gnificativas e práticas sobre métodos alternativos para tratar formas relevantes de distrofia muscular.
[049]Em um aspecto, a invenção provê um oligômero antisenso com 20-50 nucleotídeos de comprimento capaz de se ligar a um sítio selecionado para induzir a retirada de exons no gene da distrofina humana, em que o oligômero antisenso compreende uma sequência de bases que se hibridiza especificamente com uma região alvo do exon 44 selecionada a partir do grupo constituído por H44A(-07+15), H44A(- 08+15), H44A(-06+15), H44A(-08+17), H44A(-07+17) e H44A(-06+17), em que as bases do oligômero são ligadas a estruturas de anel morfolínico e em que as estruturas de anel morfolínico são unidas por ligações entre subunidades contendo fósforo, unindo um nitrogênio do morfolino de uma estrutura de anel a um carbono exocíclico 5’ de uma estrutura de anel adjacente. Em uma modalidade, o oligômero antisenso compreende uma sequência de bases selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NOs: 1 e 4-8. Em outra modalidade, o oligômero antisenso possui cerca de 20 a 30 nucleotídeos de comprimento ou aproximadamente 22 a 28 nucleotídeos de comprimento. Em ainda outra modalidade, a sequência consiste em uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1 e 4-8. Em uma modalidade, a invenção provê um oligômero antisenso que não ativa RNase H.
[050]Em outro aspecto, a invenção provê um oligômero antisenso que é ligado quimicamente a uma ou mais porções ou conjugados que intensificam a atividade, a distribuição celular ou a captação celular do oligômero antisenso, como, por exemplo, uma molécula de polietilenoglicol. Em outras modalidades, o oligômero antisenso é conjugado a um peptídeo rico em arginina como uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOS: 24-39.
[051]Em ainda outro aspecto, a invenção provê um oligômero antisenso com 20-50 nucleotídeos de comprimento capaz de se ligar a um sítio selecionado para induzir a retirada de exons no gene da distrofina humana, em que o oligômero antisenso compreende uma sequência de bases que se hibridiza especificamente com uma região alvo do exon 44 selecionada a partir do grupo constituído por H44A(- 07+15), H44A(-08+15), H44A(-06+15), H44A(-08+17), H44A(-07+17) e H44A(- 06+17), em que as bases do oligômero são ligadas a estruturas de anel morfolínico e em que as estruturas de anel morfolínico são unidas por ligações entre as subunida- des contendo fósforo substancialmente sem carga, unindo um nitrogênio do morfolino de uma estrutura de anel a um carbono exocíclico 5’ de uma estrutura de anel adjacente. Em uma modalidade, 5%-35% das ligações do oligômero antisenso são carregadas positivamente. Em outra modalidade, as ligações entre as subunidades do oli- gômero antisenso não têm carga e são intercaladas com ligações que apresentam carga positiva em pH fisiológico, em que o número total de ligações de carga positiva é entre 2 e no máximo a metade do número total de ligações. Em algumas modalida-des, o oligômero antisenso compreende estruturas de anel morfolínico e ligações fos- forodiamidato entre as subunidades. Em algumas modalidades, o oligômero antisenso é modificado com um grupo catiônico pendente.
[052]Em outro aspecto, a invenção provê os oligômeros antisenso descritos nos Exemplos 2-7. Em algumas modalidades, timina pode substituir uracila nos oligô- meros antisenso descritos nos Exemplos 2-7.
[053]Em um aspecto, a invenção refere-se a oligonucleotídeos antisenso isolados com 20 a 50 nucleotídeos de comprimento, incluindo pelo menos 10, 12, 15, 17, 20 ou mais nucleotídeos complementares a uma região alvo do exon 44 do gene da distrofina, designada como sítio de anelamento, selecionada a partir do grupo constituído por: H44A(-07+17), H44A(-07+20), H44A(-07+22), H44A(-8+15), H44A(-7+15), H44A(-6+15), H44A(-8+17), H44A(-6+17), H44A(+77+101), H44A(+64+91), H44A(+62+89), H44A(+62+85), H44A(-13+14), H44A(-14+15). Os oligonucleotídeos antisenso hibridizam-se especificamente com o sítio de anelamento, induzindo a retirada do exon 44.
[054]Outros oligonucleotídeos antisenso da invenção possuem de 20 a 50 nu- cleotídeos de comprimento e incluem pelo menos 10, 12, 15, 17, 20, 22, 25 ou mais nucleotídeos das SEQ ID NOs: 1-12, 46 e 47. Em algumas modalidades, bases timina nas SEQ ID NOs: 1-12, 46 e 47 são opcionalmente uracila.
[055]Oligômeros antisenso exemplares da invenção são apresentados abaixo:
Figure img0010
[056]Em uma modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-07+17), tal como a SEQ ID NO:1. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anela- mento H44A(-07+20), tal como a SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-07+22), tal como a SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-8+15), tal como a SEQ ID NO: 4. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-7+15), tal como a SEQ ID NO: 5. Em outra modalidade, o oligô- mero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-6+15), tal como a SEQ ID NO: 6. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-8+17), tal como a SEQ ID NO: 7. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-6+17), tal como a SEQ ID NO: 8. Em outra modalidade, o oli- gômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(+77+101), tal como a SEQ ID NO: 9. Em outra modalidade, o oligômero anti- senso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(+64+91), tal como a SEQ ID NO: 10. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(+62+89), tal como a SEQ ID NO: 11. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(+62+85), tal como a SEQ ID NO: 12. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hibridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(- 13+14), tal como a SEQ ID NO: 46. Em outra modalidade, o oligômero antisenso hi- bridiza-se especificamente com o sítio de anelamento H44A(-14+15), tal como a SEQ ID NO: 47.
[057]A menos que definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos neste relatório descritivo possuem o mesmo significado como comumente entendidos pelos técnicos no assunto ao qual a invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou para testar a presente invenção, métodos e materiais preferidos são descritos. Para fins da presente invenção, os termos a seguir são definidos abaixo.
I. Definições
[058]"Aproximadamente", neste relatório descritivo, significa uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, montante, peso ou comprimento que varia até 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1% em relação a uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, montante, peso ou comprimento de referência.
[059]Os termos "complementar" e "complementaridade" referem-se a polinu- cleotídeos (ou seja, uma sequência de nucleotídeos) relacionados por regras de pa- reamento de bases. Por exemplo, a sequência "T-G-A (5’-3’)" é complementar à sequência "T-C-A (5’-3’)". A complementaridade pode ser "parcial", no sentido de que somente algumas das bases dos ácidos nucleicos se equiparam de acordo com as regras de pareamento de bases. Ou, pode ser complementaridade "completa" ou "total" entre os ácidos nucleicos. O grau de complementaridade entre as fitas dos ácidos nucleicos possui efeitos significativos sobre a eficiência e a força de hibridização entre as fitas dos ácidos nucleicos. Embora a complementaridade perfeita seja frequentemente desejada, algumas modalidades podem incluir um ou mais, mas de preferência 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 erros de pareamento de base no que diz respeito ao RNA alvo. Estão incluídas variações em qualquer local dentro do oligômero. Em certas modalidades, as variações na sequência próximas aos terminais de um oligômero são em geral preferíveis às variações no interior e, se presentes, estão tipicamente dentro de apro-ximadamente 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeo da terminação 5' e/ou 3'.
[060]Os termos “peptídeo penetrador de células” e “CPP” são usados alternadamente e referem-se a peptídeos catiônicos penetradores de células, também denominados peptídeos de transporte, peptídeos carreadores ou domínios peptídicos de transdução. Os peptídeos, como mostrados neste relatório descritivo, possuem a capacidade de induzir a penetração na célula em 100% das células de uma dada população da cultura celular e permitem translocação macromolecular dentro de múltiplos tecidos in vivo quando da administração sistêmica. Uma modalidade preferida de CPP é um peptídeo rico em arginina como descrito mais detalhadamente abaixo.
[061]Os termos “oligômero antisenso”, “composto antisenso” e “oligonucleotí- deo antisenso” são usados alternadamente e referem-se a uma sequência de subuni- dades cíclicas, cada uma carregando uma porção para pareamento de bases, unidos por ligações entre as subunidades que permitem que as porções para pareamento de bases se hibridizem com uma sequência alvo em um ácido nucleico (tipicamente um RNA) por pareamento de bases de Watson-Crick, para formar um heteroduplex ácido nucleico:oligômero dentro da sequência alvo. As subunidades cíclicas têm como base uma ribose ou outro açúcar pentose ou, em uma modalidade preferida, um grupo mor- folino (ver a descrição abaixo de oligômeros morfolinos). O oligômero pode exibir complementaridade de sequência exata ou próxima à sequência alvo; variações na sequência próximas às terminações de um oligômero são em geral preferíveis às variações no interior.
[062]Tal oligômero antisenso pode ser desenhado para bloquear ou inibir a tradução de mRNA ou para inibir o processamento natural por splicing do pré-mRNA, e pode ser dito que é “direcionado para” ou “direcionado contra” uma sequência alvo com a qual se hibridiza. A sequência alvo é tipicamente uma região que inclui um códon AUG de partida de um mRNA, um oligômero supressor da tradução, ou sítio de splicing de um mRNA pré-processado, um oligômero supressor de splicing (SSO). A sequência alva para um sítio de splicing pode incluir uma sequência de mRNA contendo, em sua extremidade 5', 1 a aproximadamente 25 pares de base a jusante de uma junção normal aceitadora de splicing em um mRNA previamente processado. Uma sequência alvo preferida é qualquer região de um mRNA pré-processado que inclua um sítio de splicing ou que esteja inteiramente contida dentro de uma sequência codificadora de exon ou que abranja um sítio aceitador ou doador de splicing. É dito mais geralmente que um oligômero é “direcionado contra” um alvo biologicamente relevante, como uma proteína, vírus ou bactéria, quando este é direcionado contra o ácido nucleico do alvo na maneira descrita acima.
[063]Os termos “oligômero morfolino” ou “PMO” (oligômero fosforamidato ou fosforodiamidato morfolino) refere-se a um análogo de oligonucleotídeo composto por estruturas com subunidades de morfolino, em que (i) as estruturas são unidas por ligações contendo fósforo, com um a três átomos de extensão, de preferência com dois átomos de extensão, e preferivelmente sem carga ou catiônicas, unindo o nitrogênio do morfolino de uma subunidade ao carbono exocíclico 5’ de uma subunidade adjacente, e (ii) cada anel morfolínico carregando uma porção para o pareamento de bases purina ou pirimidina, eficaz para ligação hidrogênio específica, a uma base em um polinucleo- tídeo. Ver, por exemplo, a estrutura na Figura 1A, que mostra um tipo preferido de ligação fosforodiamidato. O termo "estrutura de anel morfolínico" pode ser usado alternadamente com o termo "subunidade de morfolino". Podem ser efetuadas variações a essa ligação, desde que não interfiram com a ligação ou a atividade. Por exemplo, o oxigênio anexado ao fósforo pode ser substituído com enxofre (tiofosforodiamidato). O oxigênio 5’ pode ser substituído com amino ou amino substituído com alquila inferior. O nitrogênio pendente anexado ao fósforo pode ser não substituído, monossubstituídos ou dissubstituído com alquila inferior (opcionalmente substituído). Ver também a discussão sobre ligações catiônicas abaixo. A porção para pareamento de base purina ou pirimidina é tipicamente adenina, citosina, guanina, uracila, timina ou inosina. A síntese, as estruturas e as características de ligação de oligômeros morfolinos são detalhadas nas Patentes U.S. Nos 5 698 685, 5 217 866, 5 142 047, 5 034 506, 5 166 315, 5 521 063, 5 506 337, 8 076 476, 8 299 206 e 7 943 762 (ligações catiônicas), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência neste pedido de patente. Ligações entre subunidades modificadas e grupos terminais são detalhadas no Pedido de Patente PCT US2011/038459 e na Publicação WO/2011/150408, conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente.
[064]Uma “subunidade de aminoácido” ou “resíduo de aminoácido” podem referir-se a um resíduo de a-aminoácido (-CO-CHR-NH-) ou um resíduo de β- ou outro aminoácido (por exemplo, -CO-(CH2)nCHR-NH-), onde R é uma cadeia lateral (que pode incluir hidrogênio) e n é 1 a 6, de preferência 1 a 4.
[065]O termo “aminoácido natural” refere-se a um aminoácido presente em proteínas encontradas na natureza. O termo “aminoácido não natural” refere-se àqueles aminoácidos não presentes em proteínas encontradas na natureza, cujos exemplos incluem beta-alanina (β-Ala), ácido 6-aminohexanoico (Ahx) e ácido 6-aminopentanoico.
[066]O termo “ácido nucleico natural” refere-se a um ácido nucleico encontrado na natureza. Tipicamente, os ácidos nucleicos naturais são polímeros de nucleotídeos (cada um contendo uma nucleobase purina ou pirimidina e um açúcar pentose) unidos por ligações fosfodiéster. As moléculas de ácidos nucleicos naturais exemplares incluem RNA e DNA. O termo “ácido nucleico não natural” refere-se a um ácido nucleico que não está presente na natureza. Por exemplo, os ácidos nucleicos não naturais incluem uma ou mais bases, açúcares e/ou ligações entre subunidades não naturais, por exemplo, um açúcar, base e/ou ligação que foi modificado ou substituído em relação àquele encontrado em uma molécula de ácido nucleico natural. Modificações exemplares são descritas neste pedido de patente. Em algumas modalidades, os ácidos nuclei- cos não naturais incluem mais de um tipo de modificação, por exemplo, modificações em açúcar e base, modificações em açúcar e ligação, modificações em base e ligação ou modificações em base, açúcar e ligação. Em uma modalidade preferida, os oligonu- cleotídeos antisenso da presente invenção são moléculas de ácidos nucleicos não na-turais. Por exemplo, em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso contêm uma base não natural (por exemplo, modificada ou substituída). Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso contêm um açúcar não natural (por exemplo, modificado ou substituído). Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos anti- senso contêm uma ligação não natural entre subunidades (por exemplo, modificada ou substituída). Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso contém mais de um tipo de modificação ou substituição, por exemplo, uma base não natural e/ou um açúcar não natural e/ou uma ligação não natural entre subunidades. Em outras modalidades, os oligonucleotídeos antisenso possuem a composição química de uma molécula de ácido nucleico natural, ou seja, os oligonucleotídeos antisenso não incluem base, açúcar ou ligação entre subunidades que tenham sido modificados ou substituídos. Independentemente da composição química, os oligonucleotídeos antisenso da invenção são sintetizados in vitro e não incluem composições antisenso de origem biológica.
[067]"Exon" refere-se a uma seção definida do ácido nucleico que codifica uma proteína, ou uma sequência de ácido nucleico que é representada na forma madura de uma molécula de RNA após quaisquer porções de um RNA pré-processado (ou precursor) terem sido removidas por splicing. A molécula madura de RNA pode ser de RNA mensageiro (mRNA) ou uma forma funcional de um RNA não codificador, como rRNA ou tRNA. O gene da distrofina humana possui aproximadamente 79 exons.
[068]"Intron" refere-se a uma região do ácido nucleico (dentro de um gene) que não é traduzida em proteína. Um intron é uma seção não codificadora que é transcrita em um mRNA precursor (pré-mRNA) e subsequentemente removida por splicing durante a formação do RNA maduro.
[069]Uma “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” refere- se a uma quantidade de composto terapêutico, como um oligômero antisenso, administrada a um mamífero, seja em dose única ou como parte de uma série de doses, que é eficaz para produzir um efeito terapêutico desejado. Para um oligômero antisenso, esse efeito é tipicamente ocasionado por inibição da tradução ou do processamento natural por splicing de uma sequência alvo selecionada.
[070]"Exon skipping" refere-se em geral ao processo pelo qual um exon inteiro, ou parte deste, é removido de um dado RNA pré-processado e, assim, excluído de estar presente no RNA maduro, como o RNA maduro que é traduzido em uma proteína. Consequentemente, a porção da proteína que seria de outra forma codificada pelo exon retirado não está presente na forma expressa, criando tipicamente uma forma alterada, embora ainda funcional da proteína. Em certas modalidades, o exon em retirada é um exon anormal do gene da distrofina humana, que pode conter uma mutação ou outra alteração em sua sequência que do contrário causa o splicing anormal. Em certas modalidades, o exon em retirada é qualquer um ou mais dos exons 1-79 do gene da distrofina, embora o exon 44 do gene da distrofina humana seja preferido.
[071]"Distrofina" é uma proteína citoplasmática em forma de bastonete e uma parte vital do complexo proteico que conecta o citoesqueleto de uma fibra muscular à matriz extracelular circundante através da membrana celular. A distrofina contém múltiplos domínios funcionais. Por exemplo, a distrofina contém um domínio de ligação à actina em aproximadamente os aminoácidos 14-240 e um domínio central em forma de bastonete (rod) em aproximadamente os aminoácidos 253-3040. Esse grande domínio central é formado por 24 elementos triplo helicoidais, semelhante à espectrina de aproximadamente 109 aminoácidos, que possui homologia com a alfa-actinina e a espectrina. As repetições são interrompidas tipicamente por quatro segmentos não repetidos ricos em prolina, também designados como regiões de articulação (hinge). As repetições 15 e 16 são separadas por um trecho com 18 aminoácidos que aparentemente fornecem um sítio importante para clivagem proteolítica da distrofina. A identidade de sequência entre a maioria das repetições varia de 10-25%. Uma repetição contém três alfa-hélices: 1, 2 e 3. As alfa-hélices 1 e 3 são formadas por 7 curvas da hélice, provavelmente interagindo como uma bobina enrolada através de uma interface hidrofóbica. A alfa-hélice 2 possui uma estrutura mais complexa e é formada por segmentos de quatro e três curvas da hélice, separadas por um resíduo de glicina ou de prolina. Cada repetição é codificada por dois exons, tipicamente interrompidos por um intron entre os aminoácidos 47 e 48 na primeira parte da alfa-hélice 2. O outro intron é encontrado em posições diferentes na repetição, normalmente espalhado sobre a hélice-3. A distrofina também contém um domínio rico em cisteína em aproximadamente os aminoácidos 3080-3360, incluindo um segmento rico em cisteína (ou seja, 15 cisteínas em 280 aminoácidos) mostrando homologia ao domínio C-terminal da alfa-actinina do mofo do lodo (Dictyostelium discoideum). O domínio no terminal carboxi está situado aproximadamente nos aminoácidos 3361-3685.
[072]A terminação amino da distrofina liga-se à F-actina e a terminação carboxi liga-se ao complexo distrofina-proteína associada (DAPC) no sarcolema. O DAPC inclui os distroglicanos, sarcoglicanos, integrinas e caveolina, e mutações em qualquer um desses componentes provocam distrofias musculares de herança autos- sômica. O DAPC é desestabilizado quando a distrofina está ausente, resultando em níveis diminuídos das proteínas constituintes, o que, por sua vez, leva a danos progressivos às fibras e à ligação com a membrana. Em várias formas de distrofia muscular, como na distrofia muscular de Duchenne (DMD) e na distrofia muscular de Becker (BMD), as células musculares produzem uma forma alterada e funcionalmente defeituosa de distrofina, ou até nenhuma distrofina, que se deve principalmente a mutações na sequência do gene e levam ao splicing incorreto. A expressão proteica predominante de distrofina defeituosa, ou a falta completa de distrofina ou de uma proteína semelhante à distrofina, leva à rápida progressão de degeneração muscular, como observado acima. A esse respeito, uma proteína distrofina "defeituosa" pode ser caracterizada pelas formas de distrofina que são produzidas em certos indivíduos com DMD ou BMD, como conhecido na técnica, ou pela ausência de distrofina detectável.
[073]Neste relatório descritivo, os termos "função" e "funcional" e os semelhantes referem-se a uma função biológica, enzimática ou terapêutica.
[074]Uma proteína distrofina "funcional" refere-se em geral a uma proteína distrofina com atividade biológica suficiente para reduzir a degradação progressiva de tecido muscular que é de outra forma característica da distrofia muscular, tipicamente quando comparada à forma alterada ou "defeituosa" de proteína distrofina que está presente em certos indivíduos com DMD ou BMD. Em certas modalidades, uma proteína distrofina funcional pode exibir cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% (incluindo todos os números inteiros intermediários) da atividade biológica in vitro ou in vivo da distrofina do tipo selvagem, conforme medida de acordo com técnicas rotineiras no assunto. A título de exemplo, a atividade relacionada à distrofina em culturas de músculo in vitro pode ser medida de acordo com o tamanho de miotubos, a organização (ou desorganização) de miofibrilas, a atividade contrátil e a aglomeração espontânea de receptores de acetilcolina (ver, por exemplo, Brown et al., Journal of Cell Science. 112:209-216, 1999). Modelos animais são também recursos de valor para estudar a patogênese de doença, e oferecem um meio para testar a atividade relacionada à distrofina. Dois dos modelos animais mais difusamente utilizados para a pesquisa de DMD são o camundongo mdx e a distrofia muscular do cão Golden Retriever (GRMD), os quais são ambos negativos para distrofina (ver, por exemplo, Collins & Morgan, Int J Exp Pathol 84: 165-172, 2003). Esses e outros modelos animais podem ser utilizados para aferir a atividade funcional de várias proteínas distrofina. Estão incluídas formas truncadas de distrofina, como aquelas formas que são produzidas por certos compostos antisenso retiradores de exons da presente invenção.
[075]"Isolado", neste relatório descritivo, significa o material que é substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham em seu estado nativo. Por exemplo, um "polinucleotídeo isolado", neste relatório descritivo, pode referir-se a um polinucleotídeo que foi purificado ou separado das sequências que o flanqueiam em um estado natural, por exemplo, um fragmento de DNA que foi separado das sequências que são normalmente adjacentes ao fragmento.
[076]Neste relatório descritivo, “comprimento suficiente” refere-se a um oligo- nucleotídeo antisenso que é complementar a pelo menos 8, mais tipicamente 8-30, nucleobases contíguas em um pré-RNA alvo de distrofina. Em algumas modalidades, um antisenso de comprimento suficiente inclui pelo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20 ou mais nucleobases contíguas no pré-RNA alvo de distrofina. Em outras modalidades, um antisenso de comprimento suficiente inclui pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleobases contíguas no pré-RNA alvo de distrofina. Um oligonucleotídeo antisenso de comprimento suficiente possui pelo menos um número mínimo de nucleotídeos para ser capaz de se hibridizar especificamente com o exon 44. De preferência, um oligonucleotídeo de comprimento suficiente contém cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, incluindo oligonucleotídeos com 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 e 40 ou mais nucleotídeos. Em uma modalidade, um oligonucle- otídeo de comprimento suficiente contém de 10 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento. Em outra modalidade, um oligonucleotídeo de comprimento suficiente contém de 15 a aproximadamente 25 nucleotídeos de comprimento. Em ainda outra modalidade, um oligonucleotídeo de comprimento suficiente contém de 20 a 30 ou de 20 a 50 nucleotídeos de comprimento. Em ainda outra modalidade, um oligonucleotídeo de comprimento suficiente contém de 22 a 25, 22 a 28, 24 a 28, 24 a 29, 25 a 28, 20 a 30 ou 25 a 30 nucleotídeos de comprimento.
[077]"Intensificar" ou "intensificando", "aumentar" ou "aumentando" ou "estimular" ou "estimulando" referem-se em geral à capacidade de um ou mais compostos ou composições antisenso para produzir ou provocar uma resposta fisiológica maior (ou seja, efeitos a jusante) em uma célula ou um indivíduo, quando comparada à resposta provocada por nenhum composto antisenso ou por um composto controle. Uma resposta fisiológica mensurável pode incluir expressão aumentada de uma forma funcional de uma proteína distrofina, ou atividade biológica aumentada relacionada à distrofina no tecido muscular, entre outras respostas evidentes a partir do entendimento sobre o assunto e a presente descrição. A função muscular aumentada também pode ser medida, incluindo aumentos ou melhoras na função muscular em aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%. A porcentagem de fibras musculares que expressa uma distrofina funcional também pode ser medida, incluindo aumento da expressão de distrofina em aproximadamente 1%, 2%, %, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% das fibras musculares. Por exemplo, foi demonstrado que em torno de 40% de melhora na função muscular pode ocorrer se 25-30% das fibras expressarem distrofina (ver, por exemplo, DelloRusso et al, Proc Natl Acad Sci USA 99: 1297912984, 2002). Uma quantidade "aumentada" ou "intensificada" é tipicamente uma quantidade "estatisticamente significante", podendo incluir um aumento que é 1,1; 1,2; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 15; 20; 30; 40; 50 ou mais vezes (por exemplo, 500, 1000 vezes) (incluindo todos os números inteiros e pontos decimais intermediários e acima de 1, por exemplo, 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; etc.) a quantidade produzida por nenhum composto antisenso (a ausência de um agente) ou por um composto controle.
[078]O termo "reduzir" ou "inibir" pode relacionar-se em geral à capacidade de um ou mais compostos antisenso da invenção para "diminuir" uma resposta fisiológica ou resposta celular relevante, tal como um sintoma de uma doença ou condição aqui descrita, conforme medida de acordo com técnicas rotineiras na técnica diagnóstica. As respostas fisiológicas ou celulares relevantes (in vivo ou in vitro) serão evidentes para técnicos no assunto, e podem incluir reduções nos sintomas ou patologia da distrofia muscular, ou reduções na expressão de formas defeituosas de distrofina, tais como as formas alteradas de distrofina que são expressas em indivíduos com DMD ou BMD. Uma "diminuição" em uma resposta pode ser estatisticamente significante quando comparada à resposta produzida por nenhum composto antisenso ou por uma composição controle, e pode incluir uma diminuição de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%, incluindo todos os números inteiros intermediários.
[079]Estão incluídos também sistemas de vetores de liberação que são capazes de expressar as sequências oligoméricas direcionadas à distrofina da presente invenção, tais como vetores que expressam uma sequência de polinucleotídeo compreendendo qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 1-12, 46 e 47, como aqui descritas. "Vetor" ou "construção de ácido nucleico" significa uma molécula de polinucle- otídeo, de preferência uma molécula de DNA derivada, por exemplo, de um plasmí- deo, bacteriófago, levedura ou vírus no qual um polinucleotídeo pode ser inserido ou clonado. Um vetor contém preferivelmente um ou mais sítios de restrição únicos e pode ser capaz de replicação autônoma em uma célula hospedeira definida, incluindo uma célula ou tecido alvo ou uma célula progenitora ou tecido destas, ou que possa ser integrado com o genoma do hospedeiro definido de tal modo que a sequência clonada seja reprodutível. Dessa forma, o vetor pode ser um vetor capaz de replicação autônoma, ou seja, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente de replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo linear ou circular fechado, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio que assegure a autorre- plicação. Alternativamente, o vetor pode ser do tipo que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s) nos quais tenha sido integrado.
[080]“Tratamento” de um indivíduo (por exemplo, um mamífero, como um humano) ou de uma célula é qualquer tipo de intervenção utilizada em uma tentativa para alterar o ciclo natural do indivíduo ou da célula. Tratamento inclui, entre outros, a administração de uma composição farmacêutica, e pode ser realizado profilaticamente ou ser subsequentemente ao início de um evento patológico ou o contato com um agente etiológico. O tratamento inclui qualquer efeito desejável sobre os sintomas ou a patologia de uma doença ou condição associada com a proteína distrofina, como em certas formas de distrofia muscular, e pode incluir, por exemplo, mudanças ou melhoras mínimas em um ou mais marcadores mensuráveis da doença ou condição em tratamento. Estão incluídos também tratamentos "profiláticos" que podem ser direcionados para reduzir a taxa de progressão da doença ou condição em tratamento, retardar o surgimento daquela doença ou condição ou reduzir a gravidade de seu aparecimento. "Tratamento" ou "profilaxia" não indicam necessariamente a erradicação completa, a cura ou a prevenção da doença ou condição ou de seus sintomas associados.
[081]Consequentemente, estão incluídos métodos para tratar distrofia muscular, como DMD e BMD, pela administração de um ou mais oligômeros antisenso da presente invenção (por exemplo, SEQ ID NOs: 1-12, 46 e 47, e suas variantes), opcionalmente como parte de uma formulação farmacêutica ou forma farmacêutica, a um indivíduo com necessidade desse tratamento. Além disso, estão incluídos métodos para induzir a retirada de exons em um indivíduo, administrando um ou mais oligôme- ros antisenso, no quais o exon é o exon 44 do gene da distrofina, de preferência o gene da distrofina humana. Um "sujeito", neste relatório descritivo, inclui qualquer animal que exibe um sintoma ou está em risco de exibir um sintoma, que pode ser tratado com um composto antisenso da invenção, como um indivíduo que é portador ou está em risco de desenvolver DMD ou BMD, ou qualquer um dos sintomas associados com essas condições (por exemplo, perda de fibras musculares). Os sujeitos (pacientes) incluem animais de laboratório (como camundongo, rato, coelho ou cobaia), animais agrícolas e animais domésticos ou de estimação (como um gato ou cão). Primatas não humanos e, de preferência, pacientes humanos estão incluídos.
[082]"Alquila" ou "alquileno" referem-se a um radical hidrocarboneto saturado de cadeia linear ou de ramificada, contendo de 1 a 18 carbonos. Os exemplos incluem, entre outros, metila, etila, propila, iso-propila, butila, iso-butila, terc-butila, n-pentila e n-hexila. O termo "alquila inferior" refere-se a um grupo alquila, como aqui definido, contendo entre 1 e 8 carbonos.
[083]"Alquenila" refere-se a um radical hidrocarboneto insaturado de cadeia linear ou ramificada, contendo de 2 a 18 carbonos e compreendendo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. Os exemplos incluem, entre outros, etenila, propenila, iso-propenila, butenila, iso-butenila, tert-butenila, n-pentenila e n-hexenila. O termo "alquenila inferior" refere-se a um grupo alquenila, como aqui definido, contendo entre 2 e 8 carbonos.
[084]"Alquinila" refere-se a um radical hidrocarboneto insaturado de cadeia linear ou ramificada, contendo de 2 a 18 carbonos e compreendendo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Os exemplos incluem, entre outros, etinila, propinila, iso-propinila, butinila, iso-butinila, terc-butinila, pentinila e hexinila. O termo "alquinila inferior" refere-se a um grupo alquinila, como aqui definido, contendo entre 2 e 8 carbonos.
[085]"Cicloalquila" refere-se a um radical alquila mono ou policíclico. Os exemplos incluem, entre outros, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, cicloheptila e ciclooctila.
[086]"Arila" refere-se a uma porção de hidrocarboneto aromático cíclico contendo a partir de 18 carbonos com um ou mais anéis fechados. Os exemplos incluem, entre outros, fenila, benzila, naftila, antracenila, fenantracenila e bifenila.
[087]"Arilalquila" refere-se a um radical da fórmula RaRb onde Ra é uma cadeia de alquileno, como definido acima, e Rb é um ou mais radicais arila, como definido acima, por exemplo, benzila, difenilmetila e os semelhantes.
[088]"Tioalcoxi" refere-se a um radical da fórmula -SRc onde Rc é um radical alquila como aqui definido. O termo "tioalcoxi inferior" refere-se a um grupo alcoxi, como aqui definido, contendo entre 1 e 8 carbonos.
[089]"Alcoxi" refere-se a um radical da fórmula -ORd onde Rd é um radical alquila como aqui definido. O termo "alcoxi inferior" refere-se a um grupo alcoxi, como aqui definido, contendo entre 1 e 8 carbonos. Os exemplos de grupos alcoxi incluem, entre outros, metoxi e etoxi.
[090]"Alcoxialquila" refere-se a um grupo alquila substituído com um grupo alcoxi.
[091]"Carbonila" refere-se ao radical C(=O) -.
[092]"Guanidinila" refere-se ao radical H2N(C=NH2) -NH-.
[093]"Amidinila" refere-se ao radical H2N(C=NH2)CH-.
[094]"Amino" refere-se ao radical NH2.
[095]"Alquilamino" refere-se a um radical da fórmula -NHRd ou -NRdRd onde todo Rd é, independentemente, um radical alquila como aqui definido. O termo "alqui- lamino inferior" refere-se a um grupo alquilamino, como aqui definido, contendo entre 1 e 8 carbonos.
[096]"Heterociclo" significa um anel heterocíclico monocícliclo de 5 a 7 membros ou bicíclico de 7 a 10 membros, que é saturado, insaturado ou aromático e que contém de 1 a 4 heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio e enxofre, e em que os heteroátomos nitrogênio e enxofre podem ser opcionalmente oxidados, e o heteroátomo nitrogênio pode ser opcionalmente quaternizado, incluindo anéis bicíclicos nos quais qualquer um dos heterociclos acima é fundido a um anel benzeno. O heterociclo pode ser anexado via qualquer heteroátomo ou átomo de carbono. Os heterociclos incluem heteroarilas como definidos abaixo. Assim, além dos heteroarilas listados abaixo, os heterociclos também incluem morfolinila, pirrolidi- nonila, pirrolidinila, piperidinila, piperizinila, hidantoinila, valerolactamila, oxiranila, oxetanila, tetrahidrofuranila, tetrahidropiranila, tetrahidropiridinila, tetrahidrotiofenila, tetrahidrotiopiranila, tetrahidropirimidinila, tetrahidrotiopiranila e os semelhantes.
[097]"Heteroarila" significa um anel heterociclo aromático de 5 a 10 membros e tendo pelo menos um heteroátomo selecionado a partir de nitrogênio, oxigênio e enxofre, além de conter pelo menos um átomo de carbono, incluindo sistemas de anéis mono e bicíclicos. Os heteroarila representativos são piridila, furila, benzofura- nila, tiofenila, benzotiofenila, quinolinila, pirrolila, indolila, oxazolila, benzoxazolila, imi- dazolila, benzimidazolila, tiazolila, benzotiazolila, isoxazolila, pirazolila, isotiazolila, pi- ridazinila, pirimidinila, pirazinila, triazinila, cinnolinila, ftalazinila e quinazolinila.
[098]Os termos "alquila opcionalmente substituído", "alquenila opcionalmente substituído", "alcoxi opcionalmente substituído", "tioalcoxi opcionalmente substituído", "alquilamino opcionalmente substituído", "alquila inferior opcionalmente substituído", "alquenila inferior opcionalmente substituído", "alcoxi inferior opcionalmente substituído", "tioalcoxi inferior opcionalmente substituído", "alquilamino inferior opcionalmente substituído" e "heterociclila opcionalmente substituído" significam que, quando substituídos, pelo menos um átomo de hidrogênio é substituído por um substituinte. No caso de um substituinte oxo (=O), dois átomos de hidrogênio são substituídos. A esse respeito, os substituintes incluem: deutério, alquila opcionalmente substituído, alque- nila opcionalmente substituído, alquinila opcionalmente substituído, arila opcionalmente substituído, heterociclo opcionalmente substituído, cicloalquila opcionalmente substituído, oxo, halogênio, -CN, -ORx, NRxRy, NRxC(=O)Ry, NRxSO2Ry, - NRxC(=O)NRxRy, C(=O)Rx, C(=O)ORx, C(=O)NRxRy, -SOmRx e -SOmNRxRy, em que m é 0, 1 ou 2, Rx e Ry são iguais e diferentes e independentemente hidrogênio, alquila opcionalmente substituído, alquenila opcionalmente substituído, alquinila opcionalmente substituído, arila opcionalmente substituído, heterociclo opcionalmente substituído ou cicloalquila opcionalmente substituído e cada um dos referidos substi- tuintes alquila opcionalmente substituído, alquenila opcionalmente substituído, alquinila opcionalmente substituído, arila opcionalmente substituído, heterociclo opcionalmente substituído e cicloalquila opcionalmente substituído pode ser ainda substituído com um ou mais de oxo, halogênio, -CN, -ORx, NRxRy, NRxC(=O)Ry, NRxSO2Ry, -NRxC(=O)NRxRy, C(=O)Rx, C(=O)ORx, C(=O)NRxRy, -SOmRx e - SOmNRxRy.
[099]Um sistema para nomenclatura de moléculas antisenso foi proposto e publicado para distinguir as diferentes moléculas antisenso (ver Mann et al., (2002) J Gen Med 4, 644-654). Essa nomenclatura tornou-se especialmente relevante quando diversas moléculas antisenso levemente diferentes foram testadas, todas direcionadas à mesma região alvo, como mostrado abaixo: H#A/D(x:y).
[0100]A primeira letra designa a espécie (por exemplo, H: humana, M: murina, C: canina). "#" designa o número do exon alvo da distrofina. "A/D" indica sítio aceitador ou doador de splicing no início ou no final do exon, respectivamente. (x y) representa as coordenadas do anelamento onde "-" ou "+" indicam sequências intrônicas ou exô- nicas respectivamente. Por exemplo, A(-6+18) indicaria as últimas 6 bases do intron precedendo o exon alvo e as primeiras 18 bases do exon alvo. O sítio de splicing mais próximo seria o aceitador de modo que essas coordenadas seriam precedidas por um "A". A descrição das coordenadas de anelamento no sítio doador de splicing poderia ser D(+2-18) onde as últimas 2 bases exônicas e as primeiras 18 bases intrônicas correspondem ao sítio de anelamento da molécula antisenso. Coordenadas do anela- mento inteiramente exônicas seriam representadas por A(+65+85), ou seja, o sítio entre o 65o e o 85o nucleotídeo a partir do início daquele exon.
II. Oligonucleotídeos antisenso
[0101]Quando moléculas antisenso são direcionadas para sequências de nu- cleotídeos envolvidas no splicing de exons dentro de sequências do pré-mRNA, o splicing normal do exon pode ser inibido, fazendo com o mecanismo de splicing se desvie do exon alvo inteiro do mRNA maduro. Em muitos genes, a deleção de um exon inteiro levaria à produção de uma proteína não funcional pela perda de domínios funcionais importantes ou a ruptura do quadro de leitura. Em algumas proteínas, contudo, é possível encurtar a proteína excluindo um ou mais exons da proteína, sem perturbar o quadro de leitura e sem alterar seriamente a atividade biológica da proteína. Tipicamente, tais proteínas exercem uma função estrutural e/ou possuem domínios funcionais em suas extremidades. A distrofia muscular de Duchenne muscular tem origem em mutações que impedem a síntese de um produto funcional do gene da distrofina, tipicamente por ruptura do quadro de leitura. Os oligonucleotídeos antisenso que induzem a retirada de exons da região do gene da distrofina contendo a mutação podem permitir às células musculares produzirem um transcrito do mRNA maduro que codifica uma proteína distrofina funcional. A proteína distrofina resultante não é necessariamente a forma de distrofina do "tipo selvagem", mas sim uma forma truncada, não obstante funcional ou semifuncional de distrofina. A presente invenção descreve moléculas antisenso capazes de se ligar a alvos específicos no pré-RNA de distrofina no exon 44 e redirecionar o processamento daquele gene.
[0102]Especificamente, a invenção refere-se a oligonucleotídeos antisenso isolados com 20 a 50 nucleotídeos de comprimento, incluindo pelo menos 10, 12, 15, 17, 20 ou mais nucleotídeos complementares consecutivos à região alvo do exon 44 do gene da distrofina, designada como sítio de anelamento e selecionada a partir das seguintes: H44A(-07+17), H44A(-07+20), H44A(-07+22), H44A(-8+15), H44A(-7+15), H44A(-6+15), H44A(-8+17), H44A(-6+17), H44A(+77+101), H44A(+64+91), H44A(+62+89), H44A(+62+85), H44A(-13+14), H44A(-14+15). Os oligonucleotídeos antisenso hibridizam-se especificamente com o sítio de anelamento, induzindo a retirada do exon 44.
[0103]O oligonucleotídeo antisenso e o RNA alvo são complementares entre si quando um número suficiente de posições correspondentes em cada molécula é ocupado por nucleotídeos que podem se ligar por meio do hidrogênio, de tal modo que ocorra uma ligação estável e específica entre o oligonucleotídeo e o alvo. Assim, "capazes de se hibridizar especificamente" e "complementares" são termos usados para indicar um grau suficiente de complementaridade ou pareamento preciso de tal modo que ocorra uma ligação estável e específica entre o oligonucleotídeo e o alvo. Entende-se na técnica que a sequência de uma molécula antisenso não precisa ser 100% complementar àquela de sua sequência alvo para que possa se hibridizar especificamente com esta sequência alvo. Uma molécula antisenso pode hibridizar-se especificamente quando a ligação do oligonucleotídeo ao alvo molecular interfere com a função normal do RNA alvo, e há um grau de complementaridade suficiente para evitar a ligação não específica do oligonucleotídeo antisenso a sequências que não são alvo em condições nas quais a ligação específica é desejada, ou seja, em condições fisiológicas no caso de ensaios in vivo ou tratamento terapêutico e, no caso de ensaios in vitro, sob as condições nas quais os ensaios são realizados.
[0104]A extensão de uma molécula antisenso pode variar desde que esta seja capaz de se ligar seletivamente no local pretendido dentro da molécula do pré-mRNA. A extensão de tais sequências pode ser determinada de acordo com os procedimentos de seleção aqui descritos. Em geral, a molécula antisenso terá cerca de 10 nucle- otídeos até cerca de 50 nucleotídeos de comprimento. Será reconhecido, no entanto, que qualquer extensão de nucleotídeos dentro dessa faixa pode ser utilizada no método. De preferência, a extensão da molécula antisenso é entre 10-30 nucleotídeos de comprimento.
[0105]Em uma modalidade, os oligonucleotídeos da invenção contêm 20 a 50 nucleotídeos de comprimento e incluem pelo menos 10, 12, 15, 17, 20 ou mais nucle- otídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-12, 46 e 47. Em algumas modalidades, as bases timina nas SEQ ID NOs: 1-12, 46 e 47 são opcionalmente uracila.
[0106]A deleção do exon não deve levar a um deslocamento do quadro de leitura no mRNA transcrito encurtado. Assim, se em uma sequência linear de três exons, o final do primeiro exon codifica dois dos três nucleotídeos em um códon e o exon seguinte for excluído, então, o terceiro exon na sequência linear precisa iniciar com um único nucleotídeo que seja capaz de completar o tripleto de nucleotídeos de um códon. Se o terceiro exon não começa com um único nucleotídeo, haverá um deslocamento do quadro de leitura, o que levaria à geração de uma proteína truncada ou não funcional.
[0107]Será reconhecido que os arranjos de códons no final de exons em proteínas estruturais podem nem sempre quebrar no final de um códon, consequentemente poderá ser necessário excluir mais de um exon do pré-mRNA para assegurar a leitura nas posições corretas (in frame) do mRNA. Em tais circunstâncias, pode haver necessidade de selecionar uma pluralidade de oligonucleotídeos antisenso pelo método da invenção, em que cada um é direcionado para uma região diferente responsável por induzir o splicing nos exons que deverão ser excluídos.
[0108]Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso possuem a composição química de uma molécula de ácido nucleico natural, ou seja, os oligonucle- otídeos antisenso não incluem base, açúcar ou ligação entre as subunidades, modificados ou substituídos. Em uma modalidade preferida, os oligonucleotídeos antisenso da presente invenção são moléculas de ácidos nucleicos não naturais. Por exemplo, os ácidos nucleicos não naturais podem incluir uma ou mais bases, açúcares e/ou ligações entre subunidades não naturais, por exemplo, uma base, açúcar e/ou ligação que foi modificado ou substituído no que diz respeito àquele encontrado em uma molécula de ácido nucleico natural. Modificações exemplares são descritas abaixo. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos não naturais incluem mais de um tipo de modificação, por exemplo, modificações em açúcar e base, modificações em açúcar e ligação, modificações em base e ligação ou modificações em base, açúcar e ligação. Por exemplo, em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso contêm uma base não natural (por exemplo, modificada ou substituída). Em algumas modalidades, os oligonucleotí- deos antisenso contêm um açúcar não natural (por exemplo, modificado ou substituído). Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso contêm uma ligação não natural entre as subunidades (por exemplo, modificada ou substituída). Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso contêm mais de um tipo de modificação ou substituição, por exemplo, uma base não natural e/ou um açúcar não natural e/ou uma ligação não natural entre as subunidades.
[0109]Para evitar a degradação do pré-mRNA durante a formação do duplex com as moléculas antisenso, as moléculas antisenso podem ser adaptadas para minimizar ou evitar a clivagem pela RNase H endógena. Essa propriedade é altamente preferida, pois o tratamento do RNA os oligonucleotídeos não metilados, seja no meio intracelular ou em extratos brutos que contêm RNase H, leva à degradação dos duplexes pré-mRNA:oligonucleotídeo antisenso. Qualquer forma de molécula antisenso modificada que seja capaz de se desviar ou não induzir tal degradação pode ser utilizada no presente método. Um exemplo de moléculas antisenso que, quando presentes em duplex com o RNA, não são clivadas pela RNase H celular são os derivados 2'-O-metila. Os 2'-O-metil-oligoribonucleotídeos são muito estáveis no meio celular e em tecidos animais, e seus duplexes com RNA possuem valores de Tm mais elevados do que seus correspondentes ribo ou desoxirribo. A metilação da posição 2' hidroxir- ribose e a incorporação de uma cadeia principal fosforotioato é uma estratégia comum para produzir moléculas que se assemelham superficialmente com o RNA, mas que são muito mais resistentes à degradação por nucleases.
[0110]Moléculas antisenso que não ativam RNase H podem ser criadas de acordo com técnicas conhecidas (ver, por exemplo, a Patente U.S. No 5 149 797). Tais moléculas antisenso, que podem ser sequências de desoxirribonucleotídeos ou ribo- nucleotídeos, simplesmente contêm qualquer modificação estrutural que prejudique estericamente ou impeça a ligação de RNase H a uma molécula duplex contendo o oligonucleotídeo como um de seus membros, em que essa modificação estrutural não impede consideravelmente ou perturba a formação do duplex. As porções do oligonu- cleotídeo envolvido na formação do duplex são substancialmente diferentes daquelas porções envolvidas em sua ligação à RNase H, portanto, há disponíveis inúmeras moléculas antisenso que não ativam RNase H. Por exemplo, tais moléculas antisenso podem ser oligonucleotídeos nos quais pelo menos um ou todos os resíduos fosfatos que fazem a ligação entre os nucleotídeos são fosfatos modificados, tais como metil fosfonatos, metil fosforotioatos, fosforomorfolidatos, fosforopiperazidatos e fosforami- datos. Por exemplo, resíduos fosfatos intercalados que fazem a ligação entre os nu- cleotídeos podem ser modificados como descrito. Em outro exemplo não limitante, tais moléculas antisenso são moléculas nas quais pelo menos um ou todos os nucleotí- deos contêm uma porção 2' alquila inferior (por exemplo, C1-C4, linear ou ramificado, alquila saturado ou insaturado, como metila, etila, etenila, propila, 1-propenila, 2-pro- penila e isopropila). Por exemplo, nucleotídeos intercalados podem ser modificados conforme descrito.
[0111]Os exemplos específicos de oligonucleotídeos antisenso úteis nesta invenção incluem oligonucleotídeos contendo cadeias principais modificadas ou ligações não naturais entre as subunidades. Os oligonucleotídeos com cadeias principais modificadas incluem aqueles que retêm um átomo de fósforo na cadeia principal e aqueles que não dispõem de um átomo de fósforo na cadeia principal. Os oligonucle- otídeos modificados sem um átomo de fósforo em sua cadeia principal entre os nu- cleosídeos podem também ser considerados como oligonucleosídeos.
[0112]Em outras moléculas antisenso, novos grupos substituem o açúcar e a ligação entre os nucleosídeos, ou seja, a cadeia principal, das unidades nucleotídicas. As unidades das bases são mantidas para hibridização com um composto alvo apropriado ao ácido nucleico. Um de tais compostos oligoméricos que demonstrou excelentes propriedades de hibridização é designado como ácido nucleico peptídico (PNA). Em compostos PNA, a cadeia principal de açúcar é substituída por uma cadeia principal contendo amida, especialmente um cadeia principal de aminoetilglicina. As nu- cleobases são conservadas e ligadas direta ou indiretamente a átomos de aza-nitro- gênio da porção amida da cadeia principal.
[0113]Os oligonucleotídeos modificados podem também conter uma ou mais porções de açúcar modificado.
[0114]Os oligonucleotídeos podem também incluir modificações ou substituições da nucleobase (frequentemente designada na técnica simplesmente como "base"). Os oligonucleotídeos contendo uma base modificada ou substituída incluem aqueles nos quais uma ou mais bases purina ou pirimidina mais comumente encontradas em ácidos nucleicos são substituídas por bases menos comuns ou não naturais.
[0115]As bases purina compreendem um anel pirimidínico fundido a um anel imidazólico, como descrito pela fórmula geral:
Figure img0011
[0116]Adenina e guanina são as duas nucleobases do tipo purina mais comu- mente encontradas em ácidos nucleicos. Essas nucleobases podem ser substituídas por outras purinas não naturais, incluindo, entre outras, N6-metiladenina, N2-metilgua- nina, hipoxantina e 7-metilguanina.
[0117]As bases pirimidina compreendem um anel pirimidínico de seis membros, conforme descrito pela fórmula geral:
Figure img0012
[0118]Citosina, uracila e timina são as bases do tipo pirimidina mais comu- mente encontradas em ácidos nucleicos. Essas bases podem ser substituídas por outras pirimidinas não naturais, incluindo, entre outras, 5-metilcitosina, 5-hidroximetilci- tosina, pseudouracila e 4-tiouracila. Em uma modalidade, os oligonucleotídeos aqui descritos contêm bases timina no lugar de uracila.
[0119]Outras bases modificadas ou substituídas incluem, entre outros, 2,6- diaminopurina, ácido orótico, agmatidina, lisidina, 2-tiopirimidina (por exemplo, 2-tiou- racila, 2-tiotimina), G-clamp e seus derivados, pirimidina 5-substituída (por exemplo, 5-halouracila, 5-propiniluracila, 5-propinilcitosina, 5-aminometiluracila, 5-hidroximetilu- racila, 5-aminometilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, Super T), 7-deazaguanina, 7-de- aza-adenina, 7-aza-2,6-diaminopurina, 8-aza-7-deazaguanina, 8-aza-7-deaza-ade- nina, 8-aza-7-deaza-2,6-diaminopurina, Super G, Super A e N4-etilcitosina, ou seus derivados; N2-ciclopentilguanina (cPent-G), N2-ciclopentil-2-aminopurina (cPent-AP) e N2-propil-2-aminopurina (Pr-AP), pseudouracila ou seus derivados; e bases degeneradas ou universais, como 2,6-difluorotolueno, ou bases ausentes como sítios abási- cos (por exemplo, 1-desoxirribose, 1,2-didesoxirribose, 1-desoxi-2-O-metilribose; ou derivados de pirrolidina nos quais o oxigênio do anel foi substituído por nitrogênio (azarribose)). Os exemplos de derivados de Super A, Super G e Super T podem ser encontrados na Patente U.S. 6 683 173 (Epoch Biosciences), cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente. cPent-G, cPent-AP e Pr-AP demonstraram reduzir efeitos imunoestimuladores quando incorporados em siRNA (Peacock H. et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 9200). Pseudouracila é uma versão natural isomerizada de uracila, com um C-glicosídeo em vez do N-glicosídeo regular como em uridina. O mRNA sintético contendo pseudouri- dina pode exibir um perfil de segurança melhorado quando comparado a mPvRNA contendo uridina (WO 2009127230, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente).
[0120] Certas nucleobases modificadas ou substituídas são especialmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos oligonucleotídeos antisenso da invenção. Essas incluem pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e O-6 substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-propinilcitosina. As substituições com 5-metilcitosina demonstraram aumentar a estabilidade do duplex de ácido nucleico em 0,6-1,2°C e são atualmente as substituições preferidas para bases, ainda mais especialmente quando combinadas com modificações 2'-O-metoxie- tila no açúcar.
[0121]Em algumas modalidades, nucleobases modificadas ou substituídas são úteis para facilitar a purificação de oligonucleotídeos antisenso. Por exemplo, em certas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso podem conter três ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6 ou mais) bases guanina consecutivas. Em certos oligonucleotídeos antisenso, um trecho de três ou mais bases guanina consecutivas podem resultar em agregação dos oligonucleotídeos, complicando a purificação. Em tais oligonucleotí- deos antisenso, uma ou mais das guaninas consecutivas podem ser substituídas por inosina. A substituição por inosina de uma ou mais guaninas em um trecho de três ou mais bases guanina consecutivas pode reduzir a agregação do oligonucleotídeo anti- senso, facilitando assim a purificação.
[0122]Em uma modalidade, outra modificação dos oligonucleotídeos anti- senso envolve ligar quimicamente o oligonucleotídeo a uma ou mais porções ou conjugados que intensificam a atividade, a distribuição celular ou a captação celular do oligonucleotídeo. Tais porções incluem, entre outras, uma porção colesterol, ácido cólico, um tioéter, por exemplo, hexil-5-tritiltiol, um tiocolesterol, uma cadeia alifática, por exemplo, dodecandiol ou resíduos undecila, um fosfolipídio, por exemplo, di-he- xadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamônio, uma poliamina ou uma cadeia de polietilenoglicol ou adamantano, ácido acético, uma porção palmitila ou uma porção octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol.
[0123]Não é necessário que todas as posições em um dado composto sejam modificadas uniformemente e, de fato, mais de uma das modificações citadas acima podem ser incorporadas em um único composto ou mesmo em um único nucleosídeo dentro de um oligonucleotídeo. A presente invenção também inclui oligonucleotídeos antisenso que são compostos quiméricos. Compostos antisenso "quiméricos" ou "quimeras", no contexto desta invenção, são moléculas antisenso, especialmente oligo- nucleotídeos, que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma destas formada por pelo menos uma unidade monomérica, ou seja, um nucleotídeo no caso de um composto oligonucleotídico. Esses oligonucleotídeos tipicamente contêm pelo menos uma região em que o oligonucleotídeo é modificado para que confira resistência aumentada à degradação por nucleases, captação celular aumentada, e uma região adicional para aumentar a afinidade de ligação pelo ácido nucleico alvo.
[0124]As moléculas antisenso utilizadas de acordo com esta invenção podem ser criadas de modo conveniente e rotineiro pela técnica bem conhecida de síntese em fase sólida. O equipamento para tal síntese é vendido por diversos fornecedores incluindo, por exemplo, a Applied Biosystems (Foster City, Califórnia). Um método para sintetizar oligonucleotídeos em um suporte sólido modificado é descrito na Patente U.S. No 4 458 066.
[0125]Qualquer outro meio para tal síntese conhecido na técnica pode ser adicional ou alternativamente empregado. É bem conhecido o uso de técnicas similares para preparar oligonucleotídeos tais como os derivados fosforotioatos e alquilados. Em uma de tais modalidades automáticas, dietil-fosforamiditas são utilizadas como materiais de partida e podem ser sintetizadas como descrito por Beaucage, et al., (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862.
[0126]As moléculas antisenso da invenção são sintetizadas in vitro e não incluem composições antisenso de origem biológica. As moléculas da invenção podem também ser misturadas, encapsuladas, conjugadas ou de outra forma associadas com outras moléculas, estruturas moleculares ou misturas de compostos, como, por exemplo, lipossomos, moléculas direcionadas a receptores, formulações orais, retais, tópicas ou outras, para auxiliar a captação, a distribuição e/ou a absorção.
Oligômeros morfolinos
[0127]Modalidades exemplares da invenção referem-se a oligômeros morfoli- nos com ligações na cadeia principal contendo fósforo, ilustrados nas Figuras 1A-1C. Em uma modalidade, um oligômero morfolino ligado ao fosforodiamidato, como mostrado na Figura 1C, é modificado, de acordo com um aspecto da presente invenção, para conter grupos com carga positiva em preferivelmente 10%-50% de suas ligações na cadeia principal. Os oligômeros morfolinos com ligações sem carga na cadeia principal, incluindo oligômeros antisenso, são detalhados, por exemplo, em (Summerton and Weller 1997) e nas Patentes U.S. Nos 5 698 685, 5 217 866, 5 142 047, 5 034 506, 5 166 315, 5 185 444, 5 521 063, 5 506 337, 8 076 476, 8 299 206 e 7 943 762 de propriedade conjunta, cujos conteúdos são aqui expressamente incorporados por referência neste pedido de patente. Os oligômeros morfolinos com ligações modificadas, incluindo ligações com carga, podem ser encontrados em USSN: 13/118 298 (aqui incorporado por referência neste pedido de patente).
[0128]As propriedades importantes das subunidades à base de morfolino incluem: 1) a capacidade para ser ligada em uma forma oligomérica por ligações estáveis, sem carga ou com carga positiva na cadeia principal; 2) a capacidade para suportar uma base nucleotídica (por exemplo, adenina, citosina, guanina, timidina, ura- cila e inosina) tal que o polímero formado possa se hibridizar com um ácido nucleico alvo com bases complementares, incluindo RNA alvo, valores de Tm acima de apro-ximadamente 45 oC em oligonucleotídeos relativamente curtos (por exemplo, 10-15 bases); 3) a capacidade do oligonucleotídeo para ser transportado de modo ativo ou passivamente em células de mamíferos; e 4) a capacidade do heteroduplex oligonu- cleotídeo antisenso:RNA resistir à degradação por RNAse e RNase H, respectivamente.
[0129]As estruturas exemplares de cadeia principal para os oligonucleotídeos antisenso da matéria reivindicada incluem os tipos de subunidades de morfolino mostrados nas Figuras 1D-G, todos unidos por uma ligação entre as subunidades contendo fósforo, sem carga ou apresentando carga positiva. A Figura 1D mostra uma ligação contendo fósforo que forma a cadeia principal de unidades com cinco átomos, onde os anéis morfolínicos são unidos por uma ligação fosfoamida de 1 átomo. A Figura 1E mostra uma ligação que produz uma cadeia principal de unidades repetidas com 6 átomos. Nessa estrutura, o átomo Y ligando o carbono 5' do morfolino ao grupo fósforo pode ser de enxofre, nitrogênio, carbono ou, preferivelmente, de oxigênio, A porção X pendente do fósforo pode ser flúor, um alquila ou alquila substituído, um alcoxi ou alcoxi substituído, um tioalcoxi ou tioalcoxi substituído ou nitrogênio não substituído, monossubstituídos ou dissubstituído, incluindo estruturas cíclicas, como morfolinas ou piperidinas. O grupo alquila, alcoxi e tioalcoxi de preferência incluem 16 átomos de carbono. As porções Z são enxofre ou oxigênio e, preferivelmente, oxigênio.
[0130]As ligações mostradas nas Figuras 1F e 1G são desenhadas para cadeias principais de unidades com extensão de 7 átomos. Na Estrutura 1F, a porção X é como na Estrutura 1E e a porção Y pode ser metileno, enxofre ou, preferivelmente, oxigênio. Na Estrutura 1G, as porções X e Y são como na Estrutura 1E. Os oligonu- cleotídeos morfolinos especialmente preferidos incluem aqueles compostos por estruturas de subunidades morfolino da forma mostrada na Figura 1E, onde X=NH2, N(CH3)2 ou 1-piperazina ou outro grupo com carga, Y=O e Z=O.
[0131]Um oligonucleotídeo substancialmente sem carga pode ser modificado, de acordo com um aspecto da invenção, para incluir ligações com carga, por exemplo, até aproximadamente 1 para cada 2-5 ligações sem carga, tal como aproximadamente 4-5 para cada 10 ligações sem carga. Em certas modalidades, pode ser vista melhora ótima na atividade antisenso quando aproximadamente 25% das ligações na cadeia principal são catiônicas. Em certas modalidades, pode ser vista intensificação com um número pequeno, por exemplo, 10-20% de ligações catiônicas, ou quando o número de ligações catiônicas situa-se na faixa de 50-80%, tal como próximo a 60%.
[0132]São providos oligômeros com qualquer número de ligações catiônicas, incluindo oligômeros ligados inteiramente catiônicos. De preferência, contudo, os oli- gômeros são parcialmente carregados com, por exemplo, 10%-80%. Em modalidades preferidas, cerca de 10% a 60% e, de preferência, 20% a 50% das ligações são catiô- nicas.
[0133]Em uma modalidade, as ligações catiônicas são intercaladas ao longo da cadeia principal. Os oligômeros parcialmente carregados de preferência contêm pelo menos duas ligações consecutivas sem carga; ou seja, o oligômero preferivelmente não possui um padrão estritamente alternado ao longo de toda a sua extensão.
[0134]São também considerados oligômeros com blocos de ligações catiôni- cas e blocos de ligações sem carga; por exemplo, um bloco central de ligações sem carga pode ser flanqueado por blocos de ligações catiônicas, ou vice-versa. Em uma modalidade, o oligômero possui regiões 5’, 3’ e central com extensão aproximadamente igual, e a porcentagem de ligações catiônicas na região do centro é superior a aproximadamente 50%, de preferência superior a aproximadamente 70%.
[0135]Em certas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso podem ser preparadas por síntese em fase sólida passo a passo, empregando métodos detalhados nas referências citadas acima e abaixo, que dizem respeito à síntese de oligonucleotídeos contendo uma mistura de ligações sem carga e catiônicas na cadeia principal, e nos Exemplos abaixo. Em alguns casos, pode ser desejável acrescentar porções químicas adicionais ao composto antisenso, por exemplo, para reforçar a far- macocinética ou facilitar a captura ou detecção do composto. Tal porção pode ser anexada covalentemente, de acordo com métodos sintéticos padrão. Por exemplo, a adição de uma porção polietilenoglicol ou outro polímero hidrofílico, por exemplo, um contendo 1-100 subunidades monoméricas, pode ser útil para aumentar a solubilidade.
[0136]Uma porção repórter, como fluoresceína ou um grupo radiomarcado, pode ser anexada para fins de detecção. Alternativamente, o marcador repórter anexado ao oligômero pode ser um ligante, como um antígeno ou biotina, capaz de se ligar a um anticorpo marcado ou à estreptavidina. Ao se selecionar uma porção para anexação ou modificação de um oligonucleotídeo antisenso, é, em geral, evidentemente desejável selecionar compostos químicos de grupos que sejam biocompatíveis e provavelmente tolerados por um indivíduo sem efeitos colaterais indesejáveis.
[0137]A extensão dos oligonucleotídeos para uso em aplicações antisenso varia de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 subunidades, mais preferivelmente cerca de 10 a 30 subunidades e tipicamente 15-25 bases. Por exemplo, um oligonucleotídeo da invenção com 19-20 subunidades, uma extensão útil para um oli- gonucleotídeo antisenso, pode de modo ideal conter duas a dez, por exemplo, quatro a oito ligações catiônicas, e o restante das ligações não apresentar carga. Um oligo- nucleotídeo com 14-15 subunidades pode de modo ideal conter duas a sete, por exemplo, 3, 4 ou 5 ligações catiônicas e o restante ser de ligações sem carga. Em uma modalidade preferida, os oligonucleotídeos contêm 25 a 28 subunidades.
[0138]Cada estrutura de anel morfolínico suporta uma porção de pareamento de base, para formar uma sequência de porções de pareamento de base que é tipicamente desenhada para se hibridizar com um alvo antisenso selecionado em uma célula ou em um indivíduo em tratamento. A porção de pareamento de base pode ser uma purina ou pirimidina encontra no DNA ou RNA nativo (por exemplo, A, G, C, T ou U) ou um análogo, como hipoxantina (o componente base do nucleosídeo inosina), 5- metil citosina, 2-6-diaminopurina ou outras bases modificadas conhecidas na técnica e descritas abaixo.
[0139]Tal como observado acima, certas modalidades são direcionadas a oli- gonucleotídeos compreendendo novas ligações entre as subunidades, incluindo oli- gômeros PMO-X e aqueles com grupos terminais modificados. Em algumas modalidades, esses oligômeros apresentam afinidade mais alta por DNA e RNA do que os oligômeros correspondentes não modificados e demonstram propriedades melhoradas de liberação celular, potência e/ou distribuição em tecidos quando comparados a oligômeros contendo outras ligações entre as subunidades. As características estruturais e propriedades dos vários tipos de ligação e de oligômeros são descritas mais detalhadamente na discussão a seguir. A síntese desses oligômeros e de relacionados é descrita no Pedido de Patente U.S. No 13/118 298 de propriedade conjunta, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente.
[0140]Em certas modalidades, a invenção provê um oligonucleotídeo com uma sequência complementar à sequência alvo que é associada com uma doença humana, e compreende uma sequência de nucleotídeos tendo a fórmula:
Figure img0013
em que Nu é uma nucleobase; R1 possui a fórmula:
Figure img0014
q é 0, 1 ou 2; R2 é selecionado a partir do grupo constituído por hidrogênio, C1-C5 alquila, C1-C5 arilalquila e um grupo formamidinila e R3 é selecionado a partir do grupo constituído por hidrogênio, C1-C10 acila, C1C10 aminoacila, porção acila de um alfa ou beta aminoácido natural ou não natural, C1-C10 arilalquila e C1-C10 alquila, ou R2 e R3 são unidos para formar um anel de 5-7 membros, em que o anel pode ser opcionalmente substituído com um substituinte selecionado a partir do grupo constituído por C1-C10 alquila, fenila, halogênio e C1-C10 arilalquila; R4 é selecionado a partir do grupo constituído por um par eletrônico, hidrogênio, um C1-C6 alquila e C1-C6 arilalquila; Rx é selecionado a partir do grupo constituído por sarcosinamida, hidroxila, um nucleotídeo, uma porção peptídica penetradora de célula e piperazinila; Ry é selecionado a partir do grupo constituído por hidrogênio, um C1-C6 alquila, um nucleotídeo, uma porção peptídica penetradora de célula, um aminoácido, um grupo formamidinila e C1-C6 acila; e Rz é selecionado a partir do grupo constituído por um par eletrônico, hidrogênio, um C1-C6 alquila e C1-C6 acila, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
[0141]Nu pode ser selecionado a partir do grupo constituído por adenina, gua- nina, timina, uracila, citosina e hipoxantina. Mais preferivelmente, Nu é timina ou ura- cila.
[0142]Em modalidades preferidas, a invenção provê um oligonucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo a fórmula:
Figure img0015
em que Nu é uma nucleobase; R1 é selecionado a partir do grupo constituído por R1’ e R1’’, em que R1’ é dimetilamino e R1’’ possui a fórmula:
Figure img0016
em que pelo menos um R1 é R1’’; q é 0, 1 ou 2, com a condição de que pelo menos um R1 seja uma porção piperidinila; R2 é selecionado a partir do grupo constituído por hidrogênio, C1-C5 alquila, C1-C5 arilalquila e um grupo formamidinila, e R3 é selecionado a partir do grupo constituído por hidrogênio, C1-C10 acila, C1C10 aminoacila, porção acila de um alfa ou beta aminoácido natural ou não natural, C1-C10 arilalquila e C1-C10 alquila, ou R2 e R3 são unidos para formar um anel de 5-7 membros, em que o anel pode ser opcionalmente substituído com um substituinte selecionado a partir do grupo constituído por C1-C10 alquila, fenila, halogênio e C1-C10 arilalquila; R4 é selecionada a partir do grupo constituído por um par eletrônico, hidrogênio, um C1-C6 alquila e arilalquila; Rx é selecionado a partir do grupo constituído por sarcosinamida, hidroxila, um nucleotídeo, uma porção peptídica penetradora de célula e piperazinila; Ry é selecionado a partir do grupo constituído por hidrogênio, um C1-C6 alquila, um nucleotídeo uma porção peptídica penetradora de célula, um aminoácido, um grupo formamidinila e C1-C6 acila; e Rz é selecionado a partir do grupo constituído por um par eletrônico, hidrogênio, um C1-C6 alquila e C1-C6 acila, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
[0143]Nu pode ser selecionado a partir do grupo constituído por adenina, gua- nina, timina, uracila, citosina e hipoxantina. Mais preferivelmente, Nu é timina ou ura- cila.
[0144]Cerca de 90-50% dos grupos R1 são dimetilamino (ou seja, R1’). Mais preferivelmente, 90-50% dos grupos R1 são dimetilamino. Ainda mais preferivelmente próximo a 66% dos grupos R1 são dimetilamino.
[0145]R1” pode ser selecionado a partir do grupo constituído por:
Figure img0017
[0146]De preferência, pelo menos um nucleotídeo do oligonucleotídeo possui a fórmula:
Figure img0018
em que Rx, Ry, Rz e Nu são como indicados acima. Mais preferivelmente, Nu é timina ou uracila.
[0147]Embora timina (T) seja a porção preferida de pareamento de base (Nu ou Pi), contendo as modificações químicas descritas acima, qualquer subunidade de base conhecida pelo técnico no assunto pode ser utilizada como a porção de parea- mento de base.
B. Transportadores peptídicos
[0148]Os oligonucleotídeos antisenso da invenção podem incluir uma porção do oligonucleotídeo conjugada a um CPP, de preferência uma porção de peptídeo rico em arginina de transporte, eficaz para melhorar o transporte do composto para as células. A porção de transporte é de preferência anexada a uma terminação do oligô- mero, como mostrado, por exemplo, nas Figuras 1B e 1C. Os peptídeos possuem a capacidade para induzir a penetração celular em 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% das células de uma determinada população de cultura celular, incluindo todos os números inteiros intermediários, e permitem a translocação macromolecular dentro de múltiplos tecidos in vivo quando da administração sistêmica. Em uma modalidade, o peptídeo penetrador de células pode ser um transportador peptídico rico em arginina. Em outra modalidade, o peptídeo penetrador de células pode ser Pene- tratina ou o peptídeo Tat. Esses peptídeos são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, na Publicação U.S. No 2010-0016215 A1, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente. Uma abordagem especialmente preferida para a conjugação de peptídeos a oligonucleotídeos an- tisenso pode ser encontrada na Publicação PCT WO2012/150960, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente. Uma modalidade preferida de um peptídeo conjugado ao oligonucleotídeo da presente invenção utiliza glicina como o elemento de ligação entre o CPP e o oligonucleotídeo antisenso. Por exemplo, um peptídeo conjugado a PMO consiste em R6-G-PMO.
[0149]As porções de transporte descritas acima demonstraram intensificar em grande medida a entrada na célula de oligômeros anexados, em relação à captação do oligômero na ausência da porção transportadora anexada. A captação é preferivelmente intensificada pelo menos dez vezes e, mais preferivelmente vinte vezes em relação ao composto não conjugado.
[0150]O uso de transportadores peptídicos ricos em arginina (ou seja, peptí- deos penetradores de células) é especialmente útil na prática da presente invenção. Certos transportadores peptídicos demonstraram ser altamente eficazes na liberação de compostos antisenso em células primárias, incluindo células musculares (Marshall, Oda et al. 2007; Jearawiriyapaisarn, Moulton et al. 2008; Wu, Moulton et al. 2008). Além do mais, quando comparados a outros transportadores peptídicos, como a Pe- netratina e o peptídeo Tat, os transportadores peptídicos aqui descritos, quando conjugados a um PMO antisenso, demonstram capacidade intensificada para alterar o splicing de diversos transcritos gênicos (Marshall, Oda et al. 2007). Modalidades preferidas de conjugados morfolino-transportador peptídico são descritas em WO/2012/150960, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente.
[0151]Transportadores peptídicos exemplares, excluindo os elementos de ligação, são fornecidos na Tabela 1 abaixo 1. Tabela 1. Transportadores peptídicos exemplars
Figure img0019
Figure img0020
aAs sequências atribuídas às SEQ ID NOs não incluem a porção de ligação (por exemplo, C, G, P, Ahx, B, AhxB, onde Ahx e B referem-se ao ácido 6-aminohe- xanoico e beta-alanina, respectivamente).
C. Vetores de expressão
[0152]Em uma modalidade, a invenção inclui vetores de expressão para a expressão em células das sequências direcionadas à distrofina aqui descritas. Os sistemas de vetor de liberação são capazes de expressar as sequências oligoméricas direcionadas à distrofina da presente invenção. Em uma modalidade, tais vetores expressam uma sequência polinucleotídica compreendendo pelo menos 10 nucleotí- deos consecutivos de uma ou mais das SEQ ID NOs: 1-12, 46 e 47. Em outra modalidade, tais vetores expressam uma sequência polinucleotídica compreendendo uma ou mais das SEQ ID NOs: 1-12, 46 e 47. Vetores de expressão adequados para dis- ponibilização de genes são conhecidos na técnica. Tais vetores de expressão podem ser modificados para expressarem as sequências direcionadas à distrofina aqui descritas. Os vetores de expressão exemplares incluem moléculas de polinucleotídeos, de preferência moléculas de DNA, que são derivadas, por exemplo, de um plasmídeo, bacteriófago, levedura ou vírus (por exemplo, adenovírus, vírus adeno-associado, len- tivírus, etc.), nos quais um polinucleotídeo pode ser inserido ou clonado. Um vetor contém preferivelmente um ou mais sítios de restrição únicos e pode ser capaz de replicação autônoma em uma célula hospedeira definida, incluindo uma célula ou tecido alvo ou uma célula progenitora ou tecido destas, ou pode ser integrado com o genoma do hospedeiro definido tal que a sequência clonada seja reprodutível. Dessa forma, o vetor pode ser um vetor capaz de replicação autônoma, ou seja, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação independe de re- plicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo linear ou circular fechado, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser do tipo que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com os cromossomos nos quais foi integrado.
[0153]Em uma modalidade, os vetores de expressão incluem um promotor específico do tecido, por exemplo, um promotor e/ou intensificador específico de músculos, que promove a expressão das sequências oligoméricas direcionadas à distro- fina aqui descritas em células ou tecidos de interesse em particular (por exemplo, em músculo). As sequências promotoras e os vetores de expressão adequados para a expressão em células musculares incluem, por exemplo, aqueles descritos em U.S. 2011/0212529, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente. Os promotores exemplares específicos de músculos incluem um promotor desmina, um promotor de creatina quinase muscular (MCK), um promo-tor Pitx3, um promotor de alfa-actina esquelética ou um promotor de troponina I. O uso de promotores específicos de músculos é descrito mais detalhadamente em, por exemplo, Talbot et al., Molecular Therapy (2010), 18(3): 601-608; Wang et al., Gene Therapy (2008), 15(22): 1489-99; e Coulon et al., Journal of Biological Chemistry (2007), 282(45): 33192-33200.
III. Formulações e modos de administração
[0154]Em certas modalidades, a presente invenção provê formulações ou composições adequadas a liberação terapêutica de oligômeros antisenso, conforme aqui descritos. Consequentemente, em certas modalidades, a presente invenção provê composições farmaceuticamente aceitáveis que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos oligômeros aqui descritos, formulados junto com um ou mais veículos (aditivos) e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Embora seja possível administrar isoladamente um oligômero da presente invenção, é preferível administrar o composto em forma de formulação (composição) farmacêutica.
[0155]Os métodos para a liberação de moléculas de ácidos nucleicos são descritos, por exemplo, em Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2:139; e Delivery Strategies for Antisenso Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar; Sullivan et al., PCT WO 94/02595. Esses e outros protocolos podem ser utilizados para a liberação de virtualmente qualquer molécula de ácido nucleico, incluindo os oligômeros isolados da presente invenção.
[0156]Conforme detalhado abaixo, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas especialmente para a administração em forma sólida ou líquida, incluindo aquelas adaptadas para o seguinte: (1) administração oral, por exemplo, soluções de nutrientes (soluções ou suspensões aquosas ou não aquosas), comprimidos, por exemplo, aqueles destinados à absorção bucal, sublingual e sistêmica, bólus, pós, grânulos, pastas para aplicação à língua; (2) administração parenteral, por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural em forma de, por exemplo, solução ou suspensão estéril ou formulação de liberação prolongada; (3) aplicação tópica, por exemplo, em forma de creme, pomada ou um adesivo de liberação controlada ou spray aplicado à pele; (4) por via intravaginal ou intrarretal, por exemplo, em forma de pessário, creme ou espuma; (5) por via sublingual; (6) via ocular; (7) via transdérmica; ou (8) via nasal.
[0157]A expressão "farmaceuticamente aceitável" é empregada neste relatório descritivo para se referir àqueles compostos, materiais, composições e/ou formas farmacêuticas que são, no âmbito do juízo médico fundamentado, adequadas para o uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, comensuradas com uma relação risco/benefício razoável.
[0158]A expressão "veículo farmaceuticamente aceitável", neste relatório descritivo, significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, como uma carga líquida ou sólida, diluente, excipiente, auxiliar de fabricação (por exemplo, lubrificante, talco, estearato de magnésio, cálcio ou de zinco ou ácido esteárico) ou material solvente encapsulador, envolvidos em carregar ou transportar o composto em questão de um órgão, ou de parte do corpo, para outro órgão, ou parte do corpo. Todo veículo precisa ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não ser nocivo para o paciente.
[0159]Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farma- ceuticamente aceitáveis incluem, entre outros: (1) açúcares, como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, como amido de milho e amido de batata; (3) celulose e seus derivados, como carboximetilcelulose sódica, etilcelulose e acetato de celulose; (4) tragacanta em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, como manteiga de cacau e ceras para supositório; (9) óleos, como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de gergelim, óleo de oliva e óleo de soja; (10) glicóis, como propilenoglicol; (11) polióis, como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; (12) ésteres, como etil oleato e etil laurato; (13) ágar; (14) agentes de tamponamento, como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirógenos; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções tampão do pH; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; e (22) outras substâncias não tóxicas compatíveis empregadas em formulações farmacêuticas.
[0160]Exemplos adicionais não limitantes de agentes adequados para formulação com os oligômeros antisenso da presente invenção incluem: ácidos nucleicos conjugados com PEG, ácidos nucleicos conjugados com fosfolipídios, ácidos nuclei- cos contendo porções lipofílicas, fosforotioatos, inibidores de glicoproteína-P (como Pluronic P85) que podem intensificar a entrada de fármacos em vários tecidos; polímeros biodegradáveis, como microesferas de poli (DL-lactídeo-coglicolídeo) para possibilitar a liberação sustentada após a implantação (Emerich, D F et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.; e nanopartículas carregadas, como aquelas feitas de polibutilcianoacrilato, que podem liberar fármacos através da barreira hematoencefálica e podem alterar mecanismos de captação neuronal (Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999).
[0161]A invenção também inclui o uso da composição compreendendo lipos- somos com a superfície modificada contendo lipídios poli (etilenoglicol) (modificados com PEG, ramificados e não ramificados ou combinações destes, ou lipossomos de longa circulação ou lipossomos stealth (escondidos)). Os oligômeros da invenção podem também compreender moléculas de PEG anexadas covalentemente de vários pesos moleculares. Essas formulações oferecem um método para aumentar o acúmulo de fármacos em tecidos alvo. Essa classe de carreadores de fármacos resiste à opsonização e à eliminação pelo sistema fagocitário mononuclear (MPS ou RES), possibilitando, assim, tempos mais longos de circulação no sangue e exposição intensificada em tecidos do fármaco encapsulado (Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 26012627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). Tais lipossomos demonstraram acumular-se seletivamente em tumores, supostamente por extravasamento e captura nos tecidos alvos neovascularizados (Lasic et al., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Os lipossomos de longa circulação intensificam a farmacocinética do DNA e RNA, especialmente quando comparados aos lipossomos catiônicos convencionais que são conhecidos por se acumularem em tecidos do MPS (Liu et al., J. Biol. Chem. 1995, 42, 2486424870; Choi et al., Publicação Internacional PCT No WO 96/10391; Ansell et al., Publicação Internacional PCT No WO 96/10390; Holland et al., Publicação Internacional PCT No WO 96/10392). Os lipossomos de longa circulação provavelmente também protegem os fármacos da degradação por nucleases em grau maior quando comparados aos lipossomos catiônicos, com base em sua capacidade para evitar o acúmulo em tecidos MPS com metabolismo agressivo tais como o fígado e o baço.
[0162]Em uma modalidade adicional, a presente invenção inclui composições de oligômeros preparadas para a liberação conforme descrito nas Patentes U.S. Nos 6 692 911, 7 163 695 e 7 070 807. A este respeito, em uma modalidade, a presente invenção provê um oligômero da presente invenção em uma composição compreendendo copolímeros de lisina e histidina (HK) (conforme descritos nas Patentes U.S. Nos 7 163 695, 7 070 807 e 6 692 911), seja isoladamente ou combinado com PEG (por exemplo, PEG ramificado ou não ramificado ou uma mistura de ambos), combinado com PEG e uma porção direcionada ou qualquer um dos precedentes combinados com um agente de reticulação. Em certas modalidades, a presente invenção provê oligômeros antisenso em composições compreendendo poli-histidina modificada com ácido glucônico ou poli-histidina gluconilada/transferrina-polilisina. O técnico no assunto também reconhecerá que aminoácidos com propriedades similares a His e Lys podem ser substituídos dentro da composição.
[0163]Certas modalidades dos oligômeros aqui descritos podem conter um grupo funcional básico, como amino ou alquilamino, e são, portanto, capazes de formar sais farmaceuticamente aceitáveis com ácidos farmaceuticamente aceitáveis. O termo "sal farmaceuticamente aceitável", neste aspecto, refere-se aos sais de adição de ácidos inorgânicos e orgânicos relativamente não tóxicos de compostos da presente invenção. Esses sais podem ser preparados in situ no veículo de administração ou na forma farmacêutica durante o processo de fabricação, ou separadamente reagindo um composto purificado da invenção em sua forma de base livre com um ácido orgânico ou inorgânico adequado, e isolando o sal assim formado durante a purificação subsequente. Os sais representativos incluem os sais de bromidrato, clo- ridrato, sulfato, bissulfato, fosfato, nitrato, valerato, oleato, palmitato, estearato, lau- rato, benzoato, lactato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartarato, nafti- lato, mesilato, glicoheptanoato, lactobionato e lauril sulfonato e os semelhantes (Ver, por exemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19).
[0164]Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos oligômeros em questão incluem os sais não tóxicos convencionais ou os sais de amônio quaternário dos compostos, por exemplo, de ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos. Por exemplo, tais sais não tóxicos convencionais incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos como clorídrico, bromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e os semelhantes; e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos como acético, propiônico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico, maleico, hi- droximaleico, fenilacético, glutâmico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxiben- zoico, fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico, etanodissulfônico, oxálico, iso- tiônico e os semelhantes.
[0165]Em certas modalidades, os oligômeros da presente invenção podem conter um ou mais grupos funcionais ácidos e, assim, são capazes de formar sais farmaceuticamente aceitáveis com bases farmaceuticamente aceitáveis. O termo "sal farmaceuticamente aceitável", nesses casos, refere-se aos sais de adição de bases inorgânicas ou orgânicas relativamente não tóxicos de compostos da presente invenção. Esses sais podem da mesma maneira ser preparados in situ no veículo de administração ou na forma farmacêutica durante o processo de fabricação, ou separadamente reagindo o composto purificado em sua forma de ácido livre com uma base adequada, como o hidróxido, carbonato ou bicarbonato de um cátion metálico farma- ceuticamente aceitável, com amônia, ou com uma amina orgânica primária, secundária ou terciária farmaceuticamente aceitável. Os sais representativos de metais alcalinos ou alcalinos terrosos incluem os sais de lítio, sódio, potássio, cálcio, magnésio e de alumínio, e os semelhantes. As aminas orgânicas representativas úteis para a formação de sais de adição de bases incluem etilamina, dietilamina, etilenodiamina, eta- nolamina, dietanolamina, piperazina e os semelhantes (Ver, por exemplo, Berge et al., supra).
[0166]Agentes hidratantes, emulsificantes e lubrificantes, como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, adoçantes, aromatizantes e agentes perfumantes, conservantes e antioxidantes podem também estar presentes nas composições.
[0167]Os exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bis- sulfato de sódio, metabissulfeto de sódio, sulfeto de sódio e os semelhantes; (2) anti- oxidantes solúveis em óleo, como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol, e os semelhantes; e (3) agentes quelantes de metal, como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra- cético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e os semelhantes.
[0168]As formulações da presente invenção incluem aquelas adequadas para administração oral, nasal, tópica (inclusive bucal e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral. As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dose unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos bem conhecidos na técnica da farmácia. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carreador para produzir uma forma de dose única variará dependendo do hospedeiro em tratamento, do modo de administração em particular. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carreador para produzir uma forma de dose única será em geral aquela quantidade do composto que produz um efeito terapêutico. Em geral, considerando cem por cento, essa quantidade variará de aproximadamente 0,1 por cento a aproximadamente noventa e nove por cento de ingrediente ativo, de preferência de aproximadamente 5 por cento a aproximadamente 70 por cento, mais preferivelmente de aproximadamente 10 por cento a aproximadamente 30 por cento.
[0169]Em certas modalidades, uma formulação da presente invenção compreende um excipiente selecionado a partir de ciclodextrinas, celuloses, lipossomos, agentes formadores de micelas, por exemplo, ácidos biliares, e carreadores poliméri- cos, por exemplo, poliésteres e polianidridos; e um oligômero da presente invenção. Em certas modalidades, a formulação citada acima torna um oligômero da presente invenção biodisponível por via oral.
[0170]Os métodos para preparar essas formulações ou composições incluem a etapa de levar de um oligômero da presente invenção a se associar com o carreador e, opcionalmente, um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas levando um composto da presente invenção a se associar uniforme e intimamente com carreadores líquidos ou carreadores sólidos finamente divididos, ou ambos, e então, se necessário, moldar o produto.
[0171]As formulações da invenção adequadas para administração oral podem estar na forma de cápsulas, cachets, pílulas, comprimidos, drágeas (utilizando uma base aromatizada, geralmente sacarose e acácia ou tragacanta), pós, grânulos, ou de solução ou suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso, ou de emulsão líquida óleo em água ou água em óleo, ou de elixir ou xarope, ou de pastilhas, (utilizando uma base inerte, como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia) e/ou de enxaguatórios bucais, e os semelhantes, cada um destes contendo uma quantidade predeterminada de um composto da presente invenção como ingrediente ativo. Um oligômero da presente invenção pode também ser administrado em forma de bólus, eletuário ou pasta;
[0172]Em formas farmacêuticas da invenção para administração oral (cápsulas, comprimidos, pílulas, drágeas, pós, grânulos, trouches e os semelhantes), o ingrediente ativo pode ser mistura com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, como citrato de sódio ou fosfato dicálcico, e/ou qualquer um dos seguintes: (1) cargas ou extensores, como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol e/ou ácido silícico; (2) aglutinantes, como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e/ou acácia; (3) umectantes, como glicerol; (4) agentes desintegrantes, como ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou de tapioca, ácido algínico, certos silicatos e carbonato de sódio; (5) agentes retardadores de solução, como parafina; (6) acelerados da absorção, como compostos de amônio quaternário e surfactantes, como poloxâmero e lauril sulfato de sódio; (7) agentes hidra- tantes, como, por exemplo, álcool cetílico, monoestearato de glicerol e surfactantes não iônicos; (8) absorventes, tais como caulim e argila bentonita; (9) lubrificantes, como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietilenoglicóis sólidos, lauril sulfato de sódio, estearato de zinco, estearato de sódio, ácido esteárico e misturas destes; (10) agentes corantes; e (11) agentes de liberação controlada como crospovi- dona ou etilcelulose. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as composições farmacêuticas podem também compreender agentes de tamponamento. Composições sólidas de um tipo semelhante podem também ser empregadas como cargas em cápsulas gelatinosas de invólucro mole e duro utilizando excipientes como lactose ou açúcares do leite, bem como polietilenoglicóis de elevado peso molecular e os semelhantes.
[0173]Um comprimido pode ser produzido por compressão ou moldagem, op-cionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Comprimidos prensados podem ser preparados utilizando aglutinante (por exemplo, gelatina ou hidroxipropilme- tilcelulose), lubrificante, diluente inerte, conservante, desintegrante (por exemplo, amido glicolato de sódio ou carboximetilcelulose sódica reticulada), agentes tensoativo ou dispersante. Comprimidos moldados podem ser produzidos por moldagem em uma máquina adequada de uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte.
[0174]Os comprimidos e outras formas farmacêuticas sólidas das composições farmacêuticas da presente invenção, como drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos, podem ser opcionalmente marcados ou preparados com revestimentos e invólucros, tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na técnica da formulação farmacêutica. Além disso, as composições farmacêuticas da presente invenção podem também ser formuladas de modo que proporcionem liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo ali contido, utilizando, por exemplo, hidro- xipropilmetilcelulose em proporções variadas para fornecer o perfil de liberação desejado, outras matrizes poliméricas, lipossomos e/ou microesferas. Podem também ser formuladas para liberação rápida, por exemplo, liofilizados. Podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro retentor de bactérias, ou incorporando agentes esterilizantes na forma de composições sólidas que podem ser dissolvidas em água estéril ou em outro meio injetável estéril imediatamente antes do uso. Essas composições podem também conter opcionalmente agentes opacificantes e podem ter uma composição que libere o(s) ingrediente(s) ativo(s) somente ou, preferencialmente, em certa porção do trato gastrointestinal, opcionalmente, de maneira retardada. Os exemplos de composições incorporantes que podem ser utilizadas incluem substâncias poliméricas e ceras. O ingrediente ativo pode também estar em forma microencapsulada, se apropriado, com um ou mais dos excipientes descritos acima.
[0175]As formas farmacêuticas líquidas para administração oral dos compostos da invenção incluem emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além do ingrediente ativo, as formas farmacêuticas líquidas podem conter diluentes inertes comumente usados na técnica, como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes, como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, óleos (especialmente, óleos de semente de algodão, de amendoim, milho, gérmen, oliva, rícino e gergelim), glicerol, álcool tetrahidrofurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácidos graxos de sorbitana, e suas misturas.
[0176]Além de diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes como agentes hidratantes, agentes emulsificantes e de suspensão, adoçantes, agentes aromatizantes, corantes, perfumantes e conservantes.
[0177]As suspensões, além dos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão como, por exemplo, alcoóis isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitana, celulose microcristalina, metahidróxido de alumínio, bento- nita, ágar-ágar e tragacanta, e suas misturas.
[0178]As formulações administração retal ou vaginal podem ser apresentadas como um supositório, o qual pode ser preparado misturado um ou mais compostos da invenção com um ou mais excipientes não irritantes adequados ou carreadores compreendendo, por exemplo, manteiga de cacau, polietilenoglicol, uma cera para supositório ou um salicilato, e que é sólido à temperatura ambiente, mas líquido na temperatura corporal e, portanto, se derreterá no reto ou na cavidade vaginal e liberará o composto ativo.
[0179]As formulações ou formas farmacêuticas para a administração tópica ou transdérmica de um oligômero como aqui provido incluem pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, adesivos e inalantes. Os oligômeros ativos podem ser misturados em condições estéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável e com quaisquer conservantes, tampões ou propelentes que possam ser necessários. As pomadas, pastas, cremes e géis podem conter, além de um composto ativo desta invenção, excipientes, tais como gorduras animais e vegetais, óleos, ceras, parafinas, amido, tragacanta, derivados celulósicos, polietilenoglicóis, silicones, bentonitas, ácido silícico, talco e óxido de zinco, ou misturas destes.
[0180]Os pós e sprays podem conter, além de um oligômero da presente invenção, excipientes tais como lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de alumínio, sili- catos de cálcio e pó de poliamida, ou misturas dessas substâncias. Os sprays podem adicionalmente conter os propelentes costumeiros, como clorofluorohidrocarbonetos e hidrocarbonetos voláteis não substituídos, como butano e propano.
[0181]Os adesivos transdérmicos possuem a vantagem adicional de proporcionar liberação controlada de um oligômero da presente invenção ao corpo. Tais formas farmacêuticas podem ser produzidas dissolvendo ou dispersando o oligômero no meio apropriado. Promotores da absorção podem ser também ser utilizados para aumentar o fluxo do agente através da pele. A taxa de tal fluxo pode ser controlada seja pela presença de uma membrana controladora da taxa ou dispersando o agente em uma matriz polimérica ou gel, entre outros métodos conhecidos na técnica.
[0182]Composições farmacêuticas adequadas para administração parenteral podem compreender um ou mais oligômeros da invenção combinados com uma ou mais soluções aquosas ou não aquosas isotônicas estéreis, dispersões, suspensões ou emulsões farmaceuticamente aceitáveis, ou em forma de pós estéreis que podem ser reconstituídos em soluções injetáveis estéreis ou dispersões imediatamente antes do uso, e podem conter açúcares, alcoóis, antioxidantes, tampões, bacteriostáticos, solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue daquele a quem se destina ou agentes de suspensão ou espessantes. Os exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e os semelhantes), além de suas misturas adequadas, óleos vegetais, como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, como oleato de etila. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, como lecitina, pela manutenção do tamanho necessário de partículas, no caso de dispersões, e pelo uso de surfactantes.
[0183]Essas composições podem também conter adjuvantes como conservantes, agentes hidratantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da ação de microrganismos sobre os oligômeros em questão pode ser assegurada pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico e os semelhantes. Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, como açúcares, cloreto de sódio e os semelhantes nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser ocasionada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
[0184]Em alguns casos, a fim de prolongar o efeito de um fármaco, é desejável desacelerar a absorção do fármaco da injeção subcutânea ou intramuscular. Isso pode ser conseguido pelo uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com baixa solubilidade em água, entre outros métodos conhecidos na técnica. A taxa de absorção do fármaco então depende de sua taxa de dissolução, a qual, por sua vez, pode depender do tamanho dos cristais e da forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada de uma forma do fármaco administrado por via parenteral é alcançada dissolvendo ou suspendendo o fármaco em um veículo oleoso.
[0185]Formas injetáveis de depósito podem ser produzidas formando matrizes para microencapsulamento dos oligômeros em questão em polímeros biodegradáveis tais como polilactídeo-poliglicolídeo. Dependendo da razão de oligômero para polímero e da natureza do polímero especificamente empregado, a taxa de liberação do oligômero pode ser controlada. Os exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). As formulações injetáveis de depósito podem também ser preparadas encapsulando o fármaco em lipossomos ou microemulsões que sejam compatíveis com tecidos do corpo.
[0186]Quando administrados como agentes farmacêuticos a humanos e animais, os oligômeros da presente invenção podem ser fornecidos por si só ou como uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, 0,1 a 99% (mais preferivelmente, 10 a 30%) de ingrediente ativo combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0187]Conforme observado acima, as formulações ou preparados da presente invenção podem ser fornecidos por via oral, parenteral, tópica ou retal. Tipicamente, são fornecidos em formas adequadas para cada via de administração. Por exemplo, estes são administrados em forma de comprimidos ou cápsulas, por injeção, inalação, loção ocular, pomada, supositório, etc., administração por injeção, infusão ou inalação; tópica por loção ou pomada; e retal por supositórios.
[0188]As expressões "administração parenteral" e "administrar por via parenteral", neste relatório descritivo, significam modos de administração diferentes da administração enteral e tópica, habitualmente por injeção, e incluem, entre outros, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal.
[0189]As expressões "administração sistêmica", "administrar sistemica- mente", "administração periférica" e "administrar perifericamente", neste relatório descritivo, significa a administração de um composto, fármaco ou outro material de modo diferente de diretamente no sistema nervoso central, de tal modo que este penetra no sistema do paciente e, assim, é submetido ao metabolismo e outros processos semelhantes, por exemplo, a administração subcutânea.
[0190]Independentemente da via de administração selecionada, os oligôme- ros da presente invenção, que podem ser utilizados em uma forma hidratada adequada, e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formulados em formas farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos pelos técnicos no assunto. Os níveis reais da dose dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas desta invenção podem ser variados de modo que seja obtida uma quantidade do ingrediente ativo eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um determinado paciente, composição e modo de administração, sem que seja inaceitavelmente tóxica ao paciente.
[0191]O nível de dose selecionado dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do oligômero da presente invenção especificamente empregado, ou do seu éster, sal ou amida, a via de administração, a hora da administração, a taxa de excreção ou metabolismo do oligômero especificamente empregado, a taxa e extensão da absorção, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com o oligômero especificamente empregado, a idade, o sexo, o peso, a condição, a saúde geral e o histórico médico prévio do paciente em tratamento e fatores semelhantes bem conhecidos nas áreas técnicas da medicina.
[0192]Um médico ou veterinário com competência comum na técnica pode determinar facilmente e prescrever a quantidade eficaz necessária da composição farmacêutica. Por exemplo, o médico ou veterinário poderia iniciar as doses dos compostos da invenção empregados na composição farmacêutica em níveis inferiores àquele necessário para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dose até que o efeito desejado fosse alcançado. Em geral, uma dose diária adequada de um composto da invenção será aquela quantidade do composto que é a dose eficaz mais baixa para produzir um efeito terapêutico. Tal dose eficaz dependerá geralmente dos fatores descritos acima. Em geral, as doses orais, intravenosas, intracerebroventriculares e subcutâneas dos compostos desta invenção para um paciente, quando utilizados para os efeitos indicados, variarão de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 100 mg por quilograma de peso corporal ao dia.
[0193]Se desejado, a dose diária eficaz do composto ativo pode ser administrada em duas, três, quatro, cinco, seis ou mais subdoses administradas separadamente em intervalos apropriados por todo o dia, opcionalmente, em formas de dose unitária. Em certas situações, a administração é uma vez ao dia. Em certas modalidades, a administração é uma vez ou mais a cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 dias ou a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 semanas ou a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses, conforme necessário, para manter a expressão desejada de uma proteína distrofina funcional.
[0194]As moléculas de ácidos nucleicos podem ser administradas a células por uma variedade de métodos conhecidos por aqueles familiarizados com o assunto, incluindo, entre outros, encapsulamento em lipossomos, por iontoforese ou pela incorporação em outros veículos, tais como hidrogéis, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradáveis e microesferas bioadesivas, conforme aqui descrito e conhecido na técnica. Em certas modalidades, a tecnologia da microemulsificação pode ser utilizada para melhorar a biodisponibilidade de agentes farmacêuticos lipofílicos (insolúveis em água). Os exemplos incluem Trimetrine (Dordunoo, S. K., et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, 17(12), 1685-1713, 1991 e REV 5901 (Sheen, P. C., et al., J Pharm Sci 80(7), 712-714, 1991). Entre outros benefícios, a microemulsificação intensifica a biodisponibilidade ao direcionar a absorção preferencialmente para o sistema linfático em vez para o sistema circulatório, pelo qual se desviando do fígado e impedindo a destruição dos compostos na circulação hepatobiliar.
[0195]Em um aspecto da invenção, as formulações contêm micelas formadas a partir de oligômero como aqui provido e pelo menos um carreador anfifílico, em que as micelas possuem um diâmetro médio inferior a aproximadamente 100 nm. Modalidades mais preferidas provêm micelas com diâmetro médio inferior a aproximadamente 50 nm, e modalidades ainda mais preferidas provêm micelas com diâmetro médio inferior a aproximadamente 30 nm ou mesmo inferior a aproximadamente 20 nm.
[0196]Embora todos os carreadores anfifílicos adequados sejam contemplados, os carreadores presentemente preferidos são em geral aqueles que possuem o status de Em Geral Reconhecidos como Seguros (GRAS, Generally-Re- cognized-as-Safe) e que possam tanto solubilizar como microemulsificar o composto da presente invenção em um estágio mais tardio quando a solução entre em contato com uma fase do complexo em água (como aquela encontrada no trato gastrointestinal humano). Normalmente, os ingredientes anfifílicos que satisfazem esses requisitos possuem valores de HLB (equilíbrio de hidrofílico para lipofílico) de 2-20, e suas estruturas contêm radicais alifáticos de cadeia linear na faixa de C-6 a C-20. Os exemplos são glicerídeos graxos glicolizados com polietileno e polietilenoglicóis.
[0197]Os exemplos de carreadores anfifílicos incluem glicerídeos de ácidos graxos polietilenoglicolisados saturados e monoinsaturados, tais como aqueles obtidos a partir de vários óleos vegetais total ou parcialmente hidrogenados. Tais óleos podem consistir vantajosamente em tri, di e monoglicerídeos de ácidos graxos e ésteres de di e monopolietilenoglicol dos ácidos graxos correspondentes, sendo que uma composição especialmente preferida de ácidos graxos inclui ácido cáprico 4-10, ácido cáprico 3-9, ácido láurico 40-50, ácido mirístico 14-24, ácido palmítico 4-14 e ácido esteárico 5-15%. Outra classe útil de carreadores anfifílicos inclui sorbitana e/ou sorbitol parcialmente esterificado com ácidos graxos saturados ou monoinsaturados (série SPAN) ou análogos etoxilados correspondentes (série TWEEN).
[0198]Os carreadores anfifílicos disponíveis comercialmente podem ser especialmente úteis e incluem a série Gelucire, Labrafil, Labrasol ou Lauroglycol (todos fabricados e distribuídos pela Gattefosse Corporation, Saint Priest, França), PEG- mono-oleato, PEG-di-oleato, PEG-mono-laurato e di-laurato, Lecitina, Polissorbato 80, etc. (produzidos e distribuídos por uma série de empresas nos EUA e no mundo).
[0199]Em certas modalidades, a liberação pode ocorrer pelo uso de liposso- mos, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas, e os semelhantes, para a introdução das composições da presente invenção em células hospedeiras adequadas. Especificamente, as composições da presente invenção podem ser formuladas para liberação seja encapsuladas em uma partícula lipídica, um lipossomo, uma vesícula, uma nanoesfera, uma nanopartícula ou nos semelhantes. A formulação e o uso de tais veículos de liberação podem ser realizados utilizando técnicas conhecidas e convencionais.
[0200]Os polímeros hidrofílicos adequados para o uso na presente invenção são aqueles rapidamente solúveis em água, que podem ser anexados covalentemente a um lipídio formador de vesícula e que são tolerados in vivo sem efeitos tóxicos (ou seja, são biocompatíveis). Os polímeros adequados incluem polietilenoglicol (PEG), ácido poliláctico (também denominado polilactídeo), ácido poliglicólico (também denominado poliglicolídeo), um copolímero de ácido poliláctico-poliglicólico e álcool polivi- nílico. Em certas modalidades, o peso molecular dos polímeros é de aproximadamente 100 ou 120 daltons até aproximadamente 5.000 ou 10.000 daltons, ou de aproximadamente 300 daltons a aproximadamente 5.000 daltons. Em outras modalidades, o polímero é polietilenoglicol com peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 daltons, ou com peso molecular de aproximadamente 300 a aproximadamente 5.000 daltons. Em certas modalidades, o polímero é polietilenoglicol de 750 daltons (PEG(750)). Os polímeros podem também ser definidos pelo número de monômeros contidos; uma modalidade preferida da presente invenção utiliza polímeros de pelo menos aproximadamente três monômeros, tais como polímeros PEG constituídos por três monômeros (aproximadamente 150 daltons).
[0201]Outros polímeros hidrofílicos que podem ser adequados para o uso na presente invenção incluem polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, po- lihidroxipropil metacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida e derivados celulósicos como hidroximetilcelulose ou hidroxietilcelulose.
[0202]Em certas modalidades, uma formulação da presente invenção compreende um polímero biocompatível selecionado a partir do grupo constituído por poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polímeros de ácido acrílico e ésteres me- tacrílicos, polímeros de polivinila, poliglicolídeos, polisiloxanos, poliuretanos e seus copolímeros, celuloses, polipropileno, polietilenos, poliestireno, polímeros de ácido láctico e ácido glicólico, polianidridos, poli(orto)ésteres, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), poli(lactídeo-co-caprolactona), polissacarídeos, proteínas, ácidos poli-hialu- rônicos, policianoacrilatos, além de suas blendas, misturas ou copolímeros.
[0203]Ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos, constituídas por 6, 7 ou 8 unidades de glicose, designadas pela letra grega α, β ou Y, respectivamente. As unidades de glicose são unidas por ligações α-1,4-glicosídicas. Como consequência da conformação em cadeira das unidades de açúcar, todos os grupos hidroxila secundários (em C-2, C-3) estão situados em um lado anel, enquanto todos os grupos hidroxila primários em C-6 estão situados no outro lado. Como resultado, as faces externas são hidrofílicas, tornando as ciclodextrinas solúveis em água. Em contraste, as cavidades das ciclodextrinas são hidrofóbicas, pois são ladeadas pelo hidrogênio dos átomos C3 e C-5 e por oxigênios do tipo éter. Essas matrizes permitem a complexação com uma variedade de compostos relativamente hidrofóbicos, incluindo, por exemplo, compostos esteroides como 17α-estradiol (ver, por exemplo, van Uden et al. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 38:1-3-113 (1994)). A complexação acontece por interações de Van der Waals e pela formação de ligações hidrogênio. Para uma revisão geral da química das ciclodextrinas, ver, Wenz, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:803-822 (1994).
[0204]As propriedades físico-químicas dos derivados de ciclodextrina dependem fortemente do tipo e do grau de substituição. Por exemplo, a sua solubilidade em água varia de insolúvel (por exemplo, triacetil-beta-ciclodextrina) a 147% solúvel (p/v) (G-2-beta-ciclodextrina). Além disso, são solúveis em muitos solventes orgânicos. As propriedades das ciclodextrinas permitem o controle sobre a solubilidade de vários componentes da formulação, aumentando ou diminuindo a sua solubilidade.
[0205]Inúmeras ciclodextrinas e métodos para prepará-las foram descritos. Por exemplo, Parmeter (I), et al. (Patente U.S. No 3 453 259) e Gramera, et al. (Patente U.S. No 3 459 731) descreveram ciclodextrinas eletroneutras. Outros derivados incluem ciclodextrinas com propriedades catiônicas [Parmeter (II), Patente U.S. No 3 453 257], ciclodextrinas reticuladas insolúveis (Solms, Patente U.S. No 3 420 788) e ciclodextrinas com propriedades aniônicas [Parmeter (III), Patente U.S. No 3 426 011 ]. Entre os derivados de ciclodextrina com propriedades aniônicas, ácidos carboxílicos, ácidos fosforosos, ácidos fosfinosos, ácidos fosfônicos, ácidos fosfóricos, ácidos tio- fosfônicos, ácidos tiossulfínicos e ácidos sulfônicos foram anexados à ciclodextrina original [ver, Parmeter (III), supra]. Além do mais, derivados com sulfoalquil éter de ciclodextrina foram descritos por Stella, et al. (Patente U.S. No 5 134 127).
[0206]Os lipossomos consistem em pelo menos uma membrana de bicamada lipídica envolvendo um compartimento interno aquoso. Os lipossomos podem ser caracterizados pelo tipo de membrana e pelo tamanho. Pequenas vesículas unilamela- res (SUVs) possuem uma única membrana e seu diâmetro varia tipicamente entre 0,02 e 0,05 μm; grandes vesículas unilamelares (LUVS) são tipicamente maiores do que 0,05 μm. Vesículas oligolamelares grandes e vesículas multilamelares possuem múltiplas camadas, geralmente concêntricas, de membrana e são tipicamente maiores do que 0,1 μm. Aos lipossomos com diversas membranas não concêntricas, ou seja, diversas vesículas menores que estão contidas dentro de uma vesícula maior, denominam-se vesículas multivesiculares.
[0207]Um aspecto da presente invenção refere-se a formulações compreendendo lipossomos contendo um oligômero da presente invenção, em que a membrana do lipossomo é formulada de modo a prover um lipossomo com capacidade de carre- amento aumentada. Alternativa ou adicionalmente, o composto da presente invenção pode estar contido ou ser absorvido sobre a bicamada lipossômica do lipossomo. Um oligômero da presente invenção pode ser agregado com um surfactante lipídico e carregado dentro do espaço interno do lipossomo; nestes casos, a membrana do lipossomo é formulada para resistir aos efeitos perturbadores do agregado agente ativo-surfactante.
[0208]De acordo com uma modalidade da presente invenção, a bicamada li- pídica de um lipossomo contém lipídios derivatizados com polietilenoglicol (PEG), de tal modo que as cadeias do PEG se estendem da superfície interna da bicamada lipí- dica para o espaço interior encapsulado pelo lipossomo, e se estendem do exterior da bicamada lipídica para o meio circundante.
[0209]Os agentes ativos contidos dentro de lipossomos da presente invenção estão em forma solubilizada. Agregados de surfactante e agente ativo (como emulsões ou micelas contendo o agente ativo de interesse) podem ser encapsulados dentro do espaço interior de lipossomos de acordo com a presente invenção. Um surfac- tante tem como função dispersar e solubilizar o agente ativo, e pode ser selecionado a partir de qualquer surfactante alifático, cicloalifático ou aromático adequado, incluindo, entre outros, lisofosfatidilcolinas biocompatíveis (LPGs) de tamanhos variados de cadeia (por exemplo, de aproximadamente C14 a aproximadamente C20). Lipídios derivatizados com polímeros, como PEG-lipídios, podem também ser utilizados para a formação de micelas, pois atuarão inibindo a fusão de micela/membrana, além de que a adição de um polímero a moléculas do surfactante diminui a CMC do surfactante e auxilia a formação de micelas. São preferidos surfactantes com CMOs na faixa micromolar; surfactantes de CMC mais elevada podem ser utilizados para preparar mi- celas retidas dentro de lipossomos da presente invenção.
[0210]Os lipossomos de acordo com a presente invenção podem ser preparados por uma variedade de técnicas que são conhecidas sobre o assunto. Ver, por exemplo, a Patente U.S. No 4 235 871; Publicações PCT do Pedido de Patente WO 96/14057; New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990), páginas 33-104; Lasic DD, Liposomes from physics to applications, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, 1993. Por exemplo, os lipossomos da presente invenção podem ser preparados pela difusão de um lipídio derivatizado com um polímero hidro- fílico em lipossomos pré-formados, tal como expondo os lipossomos pré-formados a micelas compostas por polímeros com lipídios enxertados, em concentrações de lipídios correspondentes ao percentual molar final do lipídio derivatizado que é desejado no lipossomo. Lipossomos contendo um polímero hidrofílico podem também ser formados por homogeneização, hidratação do campo lipídico ou técnicas de extrusão, conforme são conhecidas sobre o assunto.
[0211]Em outro procedimento exemplar para formulação, o agente ativo é pri-meiramente disperso por sonicação em uma lisofosfatidilcolina ou outro surfactante de baixa CMC (incluindo lipídios enxertados em polímero) que solubiliza rapidamente moléculas hidrofóbicas. A suspensão micelar resultante do agente ativo é então utilizada para reidratar uma amostra de lipídio seco que contém um percentual molar adequado de lipídio enxertado em polímero, ou colesterol. A suspensão do lipídio e agente ativo é então formada em lipossomos utilizando técnicas de extrusão, conhecidas sobre o assunto, sendo os lipossomos resultantes separados da solução não encapsulada por separação padrão em coluna.
[0212]Em um aspecto da presente invenção, os lipossomos são preparados para que tenham tamanhos substancialmente homogêneos em uma faixa selecionada de tamanho. Um método eficaz de dimensionamento envolve a extrusão de uma suspensão aquosa dos lipossomos através de uma série de membranas de policarbonato com um tamanho uniforme selecionado dos poros; o tamanho dos poros da membrana corresponderá grosso modo os tamanhos maiores de lipossomos produzidos por ex- trusão através daquela membrana. Ver, por exemplo, a Patente U.S. No 4 737 323 (12 de abril de 1988). Em certas modalidades, reagentes como DharmaFECT® e Lipofec- tamine® podem ser utilizados para introduzir polinucleotídeos ou proteínas em células.
[0213]As características de liberação de uma formulação da presente invenção dependem do material encapsulante, da concentração de fármaco encapsulado e da presença de modificadores da liberação. Por exemplo, a liberação pode ser manipulada para ser dependente do pH, por exemplo, utilizando um revestimento sensível ao pH que libera somente em pH baixo, como no estômato, ou em pH mais elevado como no intestino. Um revestimento entérico pode ser utilizado para impedir que a liberação ocorra até a passagem através do estômago. Múltiplos revestimentos ou misturas de cianamida encapsulada em materiais diferentes podem ser utilizados para obter uma liberação inicial no estômago, seguida pela liberação posterior no intestino. A liberação pode também ser manipulada pela inclusão de sais ou de agentes formadores de poros, que podem aumentar a captação de água ou a liberação de fármaco por difusão através da cápsula. Excipientes que modificam a solubilidade do fármaco podem também ser utilizados para controlar a taxa de liberação. Agentes que intensificam a degradação da matriz ou a liberação pela matriz podem também ser incorporados. Estes podem ser adicionados ao fármaco, adicionados como uma fase separada (ou seja, como particulados) ou podem ser codissolvidos na fase do polímero, dependendo do composto. Na maioria dos casos, a quantidade deve ser entre 0,1 e trinta por cento (p/p do polímero). Os tipos de promotores da degradação incluem os sais inorgânicos, como sulfato de amônio e cloreto de amônio, ácidos orgânicos como ácido cítrico, ácido benzoico e ácido ascórbico, bases inorgânicas como carbonato de sódio, carbonato de potássio, carbonato de cálcio, carbonato de zinco e hidróxido de zinco, e bases orgânicas como sulfato de protamina, espermina, colina, etanolamina, dietanolamina e trietanolamina e surfactantes como Tween® e Pluronic®. Agentes formadores de poros que adicionam microestrutura às matrizes (ou seja, compostos solúveis em água como sais inorgânicos e açúcares) são acrescentados como parti- culados. A faixa é tipicamente entre um e trinta por cento (p/p de polímero).
[0214]A captação também pode ser manipulada alterando o tempo de permanência das partículas no intestino. Isso pode ser conseguido, por exemplo, revestindo a partícula com, ou o selecionando como o material encapsulante, um polímero adesivo à mucosa. Os exemplos incluem a maioria dos polímeros com grupos carboxila livres, tais como quitosano, celuloses e, especialmente, poliacrilatos (neste relatório descritivo, poliacrilatos referem-se a polímeros incluindo grupos acrilatos e grupos acrilato modificados como os cianoacrilatos e os metacrilatos).
[0215]Um oligômero pode ser formulado para estar contido ou ser adaptado para liberação por um dispositivo cirúrgico ou médico ou por implante. Em certos aspectos, um implante pode ser revestido ou de outra forma tratado com um oligômero. Por exemplo, hidrogéis ou outros polímeros, como polímeros biocompatíveis e/ou biodegradáveis, podem ser utilizados para revestir um implante com as composições da presente invenção (ou seja, a composição pode ser adaptada para o uso com um dispositivo médico utilizando um hidrogel ou outro polímero). Polímeros e copolímeros para revestimento de dispositivos médicos com um agente são bem conhecidos na técnica. Os exemplos de implantes incluem, entre outros, stents, stents que eluem fármacos, suturas, cateteres vasculares, cateteres de diálise, enxertos vasculares, válvulas cardíacas protéticas, marca-passos cardíacos, desfibriladores cardioversores implantáveis, agulhas IV, dispositivos para configuração e formação óssea, como pinos, parafusos, placas e outros dispositivos e matrizes artificiais de tecidos para cica- trização de feridas.
[0216]Além dos métodos aqui providos, os oligômeros para uso de acordo com a invenção podem ser formulados para administração em qualquer maneira conveniente ao uso na medicina humana ou veterinária, por analogia com outros agentes farmacêuticos. Os oligômeros antisenso e suas formulações correspondentes podem ser administrados isoladamente ou combinados com outras estratégias terapêuticas no tratamento de distrofia muscular, tais como o transplante de mioblastos, terapias com células-tronco, administração de antibióticos aminoglicosídeos, inibidores do pro- teassomo e terapias de regulação positiva (por exemplo, regulação positiva de utrofina, um parólogo autossômico da distrofina).
[0217]As vias de administração descritas destinam-se somente como orientação, pois um clínico competente será capaz de determinar facilmente a via de administração ótima e qualquer dose para qualquer animal ou condição em particular. Múltiplas abordagens para introduzir novo material genético funcional em células, tanto in vitro como in vivo, foram tentadas (Friedmann (1989) Science, 244:1275-1280). Essas abordagens incluem a integração do gene a ser expresso em retrovírus modificados (Friedmann (1989) supra; Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S- 5079S); a integração em vetores não retrovirais (por exemplo, vetores virais adeno- associados) (Rosenfeld, et al. (1992) Cell, 68:143-155; Rosenfeld, et al. (1991) Science, 252:431-434); ou a liberação de um transgene ligado a um elemento promotor- intensificador heterólogo via lipossomos (Friedmann (1989), supra; Brigham, et al. (1989) Am. J. Med. Sci., 298:278-281; Nabel, et al. (1990) Science, 249:1285-1288; Hazinski, et al. (1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206-209; e Wang and Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84:7851-7855); sistemas à base de cátions acoplados a ligantes específicos (Wu and Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624) ou o uso de vetores de expressão de DNA naked (Nabel et al. (1990), supra); Wolff et al. (1990) Science, 247:1465-1468). A injeção direta de transgenes em tecido produz somente expressão localizada (Rosenfeld (1992) supra); Rosenfeld et al. (1991) supra; Brigham et al. (1989) supra; Nabel (1990) supra; e Hazinski et al. (1991) supra). O grupo Brigham et al. (Am. J. Med. Sci. (1989) 298:278-281 e Clinical Research (1991) 39 (resumo)) relatou a transfecção in vivo somente de pulmões de camundongos após administração intravenosa ou intratraqueal de um complexo lipossomo-DNA. Um exemplo de artigo de revisão de procedimentos para terapia com genes humanos é: Anderson, Science (1992) 256:808-813.
IV. Kits
[0218]A invenção também provê kits para o tratamento de um paciente com uma doença genética, em que o kit compreende pelo menos uma molécula antisenso (por exemplo, um oligômero antisenso apresentado nas SEQ ID NOs: 1-12, 46 e 47), acondicionada em um recipiente adequado, junto com instruções para seu uso. Os kits podem também conter reagentes periféricos como tampões, estabilizantes, etc. Os técnicos no assunto devem reconhecer que as aplicações do método acima possuem ampla aplicação para identificar moléculas antisenso adequadas para o uso no tratamento de muitas outras doenças.
V. Exemplos
[0219]Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e de exemplo para fins de clareza de entendimento, será facilmente evidente para o técnico no assunto à luz dos ensinamentos desta invenção que certas mudanças e modificações poderão ser-lhe efetuadas sem que, contudo, se desviem do espírito ou âmbito das reivindicações anexadas. Os exemplos a seguir são fornecidos a título de ilustração e não de limitação. Os técnicos no assunto reconhecerão rapidamente uma variedade de parâmetros não críticos que poderiam ser mudados ou modificados para produzir resultados essencialmente similares.
Materiais e métodos Condições para o tratamento de culturas celulares e de tecidos
[0220]Células do rabdomiossarcoma humano (ATCC, CCL-136; células RD) foram semeadas em frascos T75 de cultura de tecido tratado (Nunc) a 1,5 x 106 célu- las/frasco em 24 mL de meio DMEM aquecido com L-Glutamina (HyClone), soro fetal bovino 10% e solução antibiótica com penicilina-estreptomicina 1% (CelGro); depois de 24 horas, o meio foi aspirado, as células foram lavadas uma vez em PBS aquecido e meio fresco foi adicionado. As células foram cultivadas para 80% de confluência em uma incubadora a 37 °C e CO2 5,0% e colhidas utilizando tripsina. Oligômeros mor- folinos fosforodiamidato (PMOs) liofilizados foram ressuspensos de aproximadamente 0,5 a 2,0 mM em água livre de nucleases; para verificar a molaridade, as soluções de PMO foram medidas utilizando um espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Os PMOs foram liberados a células RD por nucleoporação de acordo com as instruções do fabricante e o kit SG (Lonza). Os PMOs foram testados em várias concentrações conforme indicadas (por exemplo, 2,5; 5; 10; 12,5; 20 e 25 micromolar). As células foram incubadas por 24 oras após a nucleoporação a aproximadamente 2 - 3 X 105 células por cavidade de uma placa com 12 ou 24 cavidades (n=2 ou 3) e depois submetidas à extração do RNA conforme descrito abaixo.
[0221]Mioblastos primários humanos foram cultivados em Meio de Crescimento de Células de Músculo Esquelético (PromoCell) utilizando técnicas padrão. Foi realizada nucleoporação dos PMOs em várias concentrações conforme descrito para as células RD acima. As células foram então semeadas em cavidades, com três réplicas, de uma placa de 12 cavidades em meio de crescimento PromoCell e deixadas incubar por 24 horas antes da extração do RNA conforme descrito abaixo.
Extração de RNA e amplificação por PCR
[0222]O RNA foi extraído de células tratadas com PMO (células RD ou mioblastos primários humanos) utilizando o kit de isolamento de RNA RNAspin 96 well da GE Healthcare e submetido a RT-PCR aninhada ou não aninha, utilizando técnicas padrão e os seguintes pares de primers (iniciadores). Primers externos: forward 5’- CAATGCTCCTGACCTCTGTGC-3’ (SEQ ID NO: 40), reverse 5’- GCTCTTTTCCAGGTTCAAGTGG-3’ (SEQ ID NO: 41); primers internos: forward 5’- GTCTACAACAAAGCTCAGGTCG-3’ (SEQ ID NO: 42), reverse 5’- GCAATGTTATCTGCTTCCTCCAACC-3’ (SEQ ID NO: 43). Em alguns casos, foi realizada PCR não aninhada utilizando os primers internos. A retirada de exons foi aferida por eletroforese em gel ou utilizando o bioanalisador Caliper LabChip, e o % de retirada de exons (ou seja, a intensidade de bandas do produto com exons retirados em relação ao produto completo da PCR) foi representado graficamente como mostrado nas Figuras 3 a 6. Preparo de subunidades de morfolino, PMO e PMO com ligações modificadas entre as subunidades
Figure img0021
Esquema 1: Rota sintética geral para subunidades de PMO e de PMO modificadas
[0223]Fazendo referência ao Esquema de Reação 1, em que B representa uma porção de pareamento de base e PG representa um grupo protetor, as subuni- dades de morfolino podem ser preparadas a partir do ribonucleosídeo correspondente (1) como mostrado. A subunidade de morfolino (2) pode ser protegida opcionalmente pela reação com um precursor adequado do grupo protetor, por exemplo, cloreto de tritila. O grupo protetor 3’ é geralmente removido durante a síntese do oligômero em estado sólido conforme descrita mais detalhadamente abaixo. A porção de pareamento de base pode ser adequadamente protegida para a síntese do oligômero em fase sólida. Os grupos protetores adequados incluem benzoíla, para adenina e citosina, fenilacetila, para guanina, e pivaloiloximetila para hipoxantina (I). O grupo pivaloiloximetila pode ser introduzido na posição N1 da base heterocíclica hipoxantina. Embora uma subunidade não protegida de hipoxantina possa ser empregada, os rendimentos em reações de ativação são bem superiores quando a base é protegida. Outros grupos protetores adequados incluem aqueles descritos na Patente U.S. No 8 076 476, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente.
[0224]A reação de 3 com o composto fosforoso ativado 4a ou 4b resulta em subunidades de morfolino com a porção desejada de ligação (5a ou 5b). Deve ser observado que as porções R1 e/ou L1 podem também ser instaladas o anel heterocí- clico Z após a formação da ligação P-O ou mesmo depois que a subunidade tenha sido incorporada em um oligômero.
[0225]Compostos com a estrutura 4a ou 4b podem ser preparados utilizando qualquer número de métodos conhecidos pelos técnicos no assunto, incluindo aqueles descritos nos exemplos. O acoplamento com a porção morfolino então prossegue como descrito acima.
[0226]Compostos com a estrutura 5a ou 5b podem ser utilizados na síntese de oligômeros em fase sólida para preparar oligômeros compreendendo as ligações entre as subunidades. Tais métodos são bem conhecidos na técnica. Resumidamente, um composto com a estrutura 5a ou 5b pode ser modificado na extremidade 5’ para que contenha um elemento de ligação a um suporte sólido. Uma vez suportado, o grupo protetor de 5a ou 5b (por exemplo, tritila na extremidade 3’)) é removido e a amina livre é reagida com uma porção de fósforo ativada de um segundo composto com a estrutura 5a ou 5b (ou seu análogo). Essa sequência é repetida até que a extensão desejada do oligo seja obtida. O grupo protetor na extremidade do terminal 3’ pode ser removido ou deixado se uma modificação 3’ é desejada. O oligo pode ser removido do suporte sólido utilizando qualquer número de métodos, o tratamento de exemplo com uma base para clivar a ligação ao suporte sólido.
[0227]O preparo de oligômeros morfolinos em geral e de oligômeros morfoli- nos específicos da invenção é descrito mais detalhadamente nos Exemplos.
Exemplo 1 Preparo de oligômeros morfolinos
[0228]O preparo dos compostos da invenção é realizado utilizando o protocolo a seguir:
[0229]Preparo de tritil piperazina fenil carbamato 35 (Figura 2A e 2B): A uma suspensão resfriada do composto 11 em diclorometano (6 mL/g de 11), adicionou-se uma solução de carbonato de potássio (3,2 eq) em água (4 mL/g de carbonato de potássio). A essa mistura bifásica, adicionou-se lentamente uma solução de clorofor- mato de fenila (1,03 eq) em diclorometano (2 g/g de cloroformato de fenila). A mistura de reação foi aquecida para 20 °C. Quando a reação foi concluída (1-2 horas), as camadas foram separadas. A camada orgânica foi lavada com água e seca com carbonato de potássio anidro. O produto 35 foi isolado por cristalização com acetonitrila.
[0230]Preparo de álcool carbamato 36: Hidreto de sódio (1,2 eq) foi suspenso em 1-metil-2-pirrolidinona (32 mL/g de hidreto de sódio). A essa suspensão, adicionou-se trietilenoglicol (10,0 eq) e o composto 35 (1,0 eq). A pasta resultante foi aquecida para 95 °C. Quando concluída a reação (1-2 horas), a mistura foi resfriada para 20 °C. A essa mistura, adicionou-se diclorometano 30%/éter metil terc-butílico (v:v) e água. A camada orgânica contendo o produto foi lavada sucessivamente com NaOH aquoso, ácido succínico aquoso e cloreto de sódio aquoso saturado. O produto 36 foi isolado por cristalização em diclorometano/éter metil terc-butílico/heptano.
[0231]Preparo do ácido da Cauda (Tail) 37: A uma solução do composto 36 em tetrahidrofurano (7 mL/g de 36), adicionou-se anidrido succínico (2,0 eq) e DMAP (0,5 eq). A mistura foi aquecida para 50 °C. Quando concluída a reação (5 horas), a mistura foi resfriada para 20 °C e o pH ajustado para 8,5 com NaHCO3 aquoso. Éter metil terc-butílico foi adicionado, e o produto foi extraído na camada aquosa. Dicloro- metano foi adicionado, e o pH da mistura foi ajustado para 3 com ácido cítrico aquoso. A camada orgânica contendo o produto foi lavada com uma mistura de tampão citrato, pH=3, e cloreto de sódio aquoso saturado. Essa solução de 37 em diclorometano foi utilizada sem isolamento para preparar o composto 38.
[0232]Preparo de 38: À solução do composto 37, adicionou-se imida do ácido N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxílico (HONB) (1,02 eq), 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (0,34 eq) e depois cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) (1,1 eq). A mistura foi aquecida para 55 °C. Quando concluída a reação (4-5 horas), a mistura foi resfriada para 20 °C e lavada sucessivamente com ácido cítrico 0,2M/salmoura 1:1 e salmoura. O solvente da solução com diclorometano foi trocado para acetona, depois para N,N-dimetilformamida e o produto foi isolado da acetona/ N,N-dimetilformamida por precipitação em cloreto de sódio aquoso saturado. O produto bruto voltou a ser misturado diversas vezes com água, formando uma pasta, para remover N,N-dimetilformamida residual e sais.
[0233] A introdução da “Cauda” ativada na resina carregada para ancoragem foi realizada em dimetil imidazolidinona (DMI) seguindo o procedimento utilizado para incorporação das subunidades durante a síntese em fase sólida.
[0234]Preparo do suporte sólido para a síntese de oligômeros morfolinos: Esse procedimento foi realizada em um vaso encamisado silanizado para peptídeos (ChemGlass, NJ, EUA) equipado com uma frita de vidro de porosidade grosseira (4060 μm), agitador suspenso e uma torneira de três saída de Teflon para permitir borbu- lhamento de N2 através da frita ou extração a vácuo.
[0235]As etapas de tratamento/lavagem da resina no procedimento a seguir consistem em duas operações básicas: fluidização da resina ou reator com leito agitado e extração do solvente/solução. Para fluidização da resina, a torneira foi posicionada para permitir o fluxo de N2 através da frita, e o tratamento/lavado especificado da resina foi adicionado ao reator e deixado permear e umedecer completamente a resina. A mistura foi então iniciada, e a pasta da resina misturada pelo tempo especificado. Para extração do solvente/solução, a mistura e o fluxo de N2 foram interrompidos e a bomba de vácuo foi iniciada, depois a torneira foi posicionada para permitir a evacuação do tratamento/lavagem da resina para descarte. Todos os volumes de tratamento/lavagem da resina foram 15 mL/g de resina a menos que indicado de outra forma.
[0236]Á resina de aminometilpoliestireno (100-200 mesh; ~1,0 mmol/g de carga com base em substituição de nitrogênio; 75 g, 1 eq, Polymer Labs, Reino Unido, peça no 1464-X799) em vaso encamisado silanizado para peptídeos, adicionou-se 1- metil-2-pirrolidinona (NMP; 20 mL/g de resina) e a resina foi deixada expandir com mistura por 1-2 horas. Após a evacuação do solvente expandido, a resina foi lavada com diclorometano (2 x 1-2 minutos), 5diisopropiletilamina 5% em isopropanol/diclo- rometano 25% (2 x 3-4 minutos) e diclorometano (2 x 1-2 minutos). Após a evacuação da lavagem final, a resina foi tratada com uma solução de âncora dissulfeto 34 em 1- metil-2-pirrolidinona (0,17 M; 15 mL/g de resina, ~2,5 eq) e a mistura resina/reagente foi aquecida a 45 °C por 60 horas. Ao ser concluída a reação, o aquecimento foi interrompido, a solução de âncora foi evacuada e a resina lavada com 1-metil-2-pirrolidi- nona (4 x 3-4 minutos) e diclorometano (6 x 1-2 minutos). A resina foi tratada com uma solução de dicarbonato de dietila 10% (v/v) em diclorometano (16 mL/g; 2 x 5-6 minutos) e então lavada com diclorometano (6 x 1-2 minutos). A resina 39 (ver a Figura 4) foi seca sob uma corrente de N2 por 1-3 horas e então sob vácuo até ser obtido peso constante (± 2%). Rendimento: 110-150% do peso original da resina.
[0237]Determinação do carregamento da resina de aminometilpoliestireno- dissulfeto: O carregamento da resina (número de sítios reativos potencialmente disponíveis) é determinado por um ensaio espectrométrico para o número de grupos trifenilmetila (tritila) por grama de resina.
[0238]Um peso conhecido da resina seca (25 ± 3 mg) é transferido para um balão volumétrico silanizado de 25 mL e se adiciona ~5 mL de ácido trifluoroacético 2% (v/v) em diclorometano. O conteúdo é misturado por rotação suave, então deixado em repouso por 30 minutos. O volume é completado até 25 mL com ácido trifluoroa- cético 2% (v/v) adicional em diclorometano, e o conteúdo é misturado cuidadosamente. Utilizando uma pipeta de deslocamento positivo, uma alíquota da solução contendo tritila (500 μL) é transferida para um balão volumétrico de 10 mL e o volume é completado até 10 mL com ácido metanossulfônico.
[0239]O teor do cátion tritila na solução final é medido por absorbância UV a 431,7 nm e o carregamento da resina calculado em grupos tritila por grama de resina (μmol/g) utilizando os volumes apropriados, diluições, coeficiente de extinção (ε: 41 μmol-1 cm-1) e peso da resina. O ensaio é realizado em triplicata e calculada a média do carregamento.
[0240]O procedimento para o carregamento da resina neste exemplo fornecerá uma resina com carregamento de aproximadamente 500 μmol/g. Quando a etapa de incorporação de âncora dissulfeto foi realizada 24 horas à temperatura ambiente, obteve-se um carregamento de 300-400 em μmol/g.
[0241]Carregamento da cauda: Utilizando a mesma configuração e volumes que os empregados para preparar a resina de aminometilpoliestireno-dissulfeto, a Cauda pode ser introduzida no suporte sólido. A resina carregada de âncora foi primeiramente desprotegida em condições ácidas, e o material resultante neutralizado antes do acoplamento. Para a etapa de acoplamento, uma solução de 38 (0,2 M) em DMI contendo 4-etilmorfolina (NEM, 0,4 M) foi usada em vez da solução de âncora dissulfeto. Depois de 2 horas a 45 °C, a resina 39 foi lavada duas vezes com diisopro- piletilamina 5% em isopropanol/diclorometano 25% e uma vez com DCM. À resina, adicionou-se uma solução de anidrido benzoico (0,4 M) e NEM (0,4 M). Depois de 25 minutos, a camisa do reator foi resfriada para a temperatura ambiente, e a resina lavada duas vezes com diisopropiletilamina 5% em isopropanol/diclorometano 25% e oito vezes com DCM. A resina 40 foi filtrada e seca sob alto vácuo. O carregamento para a resina 40 é definido como o carregamento da resina original de aminometilpo- liestireno-dissulfeto 39 usada para o carregamento da Cauda.
[0242]Síntese em fase sólida: Oligômeros morfolinos foram preparados com um Sintetizador Automático de Peptídeos Gilson AMS-422 em 2 mL de colunas de reação de polipropileno de Gilson (Peça no 3980270). Um bloco de alumínio com canais para o fluxo de água foi colocado em volta das colunas, assim que elas assentaram sobre o sintetizador. O AMS-422 adicionará alternativamente soluções de rea- gente/lavagem, que serão mantidas por um tempo especificado, e evacuará as colunas utilizando vácuo.
[0243]Para oligômeros na faixa até aproximadamente 25 subunidades de extensão, é preferida resina de aminometilpoliestireno-dissulfeto com carregamento próximo a 500 μmol/g de resina. Para oligômeros maiores, é preferida resina de amino- metilpoliestireno-dissulfeto com carregamento de 300-400 μmol/g de resina. Se desejada uma molécula com Cauda em 5’, a resina que foi carregada com Cauda é escolhida seguindo as mesmas diretrizes para o carregamento.
[0244]As seguintes soluções de reagentes foram preparadas:
[0245]Solução de destritilação: Ácido cianoacético 10% (p/v) em diclorome- tano/acetonitrila 4:1; Solução de neutralização: Diisopropiletilamina 5% em diclorome- tano/isopropanol 3:1; Solução de acoplamento: Subunidade de morfolino ativado 0,18 M (ou 0,24 M para oligômeros que aumentaram mais de 20 subunidades) da base e do tipo de ligação desejados e N-etilmorfolina 0,4M em 1,3-dimetilimidazolidinona. Di- clorometano (DCM) foi usado como lavagem de transição, separando as lavagens com as diferentes soluções de reagentes.
[0246]No sintetizador, com o bloco definido para 42 °C, a cada coluna contendo 30 mg de resina de aminometilpoliestireno-dissulfeto (ou resina de Cauda), adicionou-se 2 mL de 1-metil-2-pirrolidinona e deixou-se assentar por 30 minutos. Depois de lavagem duas vezes com 2 mL de diclorometano, foram empregados os seguintes ciclos de síntese:
Figure img0022
[0247]As sequências dos oligômeros individuais foram programadas no sinte- tizador para que cada coluna recebesse a solução de acoplamento apropriada (A, C, G, T, I) na sequência correta. Quando o oligômero em uma coluna completava a incorporação de sua subunidade final, a coluna era removida do bloco e um ciclo final realizado com uma solução de acoplamento constituída por cloreto de 4-metoxitrife- nilmetila (0,32 M em DMI) contendo 4-etilmorfolina 0,89 M.
[0248]Clivagem da resina e remoção de bases e grupos protetores da cadeia principal: Após a metoxitritilação, a resina foi lavada 8 vezes com 2 mL de 1-metil-2- pirrolidinona. Um mL de uma solução de clivagem constituída por 1,4-ditiotreitol 0,1 M (DTT) e trietilamina 0,73 M em 1-metil-2-pirrolidinona foi adicionado, e a coluna fechada e deixada assentar à temperatura ambiente por 30 minutos. Depois desse período, a solução foi escorrida para um frasco Wheaton de 12 mL. A resina encolhida em grande medida foi lavada duas vezes com 300 μL de solução de clivagem. À solução, adicionou-se 4,0 mL de amônia aquosa concentrada (armazenada a -20 °C), o frasco foi tampado firmemente (com tampa rosqueada revestida com Teflon) e a mistura agitada com rotação para misturar a solução. O frasco foi colocado em um forno a 45 °C por 16-24 horas para efetuar a clivagem da base e grupos protetores da cadeia principal.
[0249]Purificação do produto bruto: A solução de amonólise no frasco foi removida do forno e deixada resfriar à temperatura ambiente. A solução foi diluída com 20 mL de amônia aquosa 0,28% e passada através de uma coluna de 2,5 x 10 cm contendo resina Macroprep HQ (BioRad). Usou-se gradiente de sal (A: amônia 0,28% com B: cloreto de sódio 1 M em amônia 0,28%; 0-100% de B em 60 minutos) para eluir o pico contendo metoxitritila. As frações combinadas foram agrupadas e processadas posteriormente dependendo do produto desejado.
[0250]Desmetoxitritilação de oligômeros morfolinos: As frações agrupadas provenientes da purificação com Macroprep foram tratadas com H3PO4 1 M para diminuir o pH para 2,5. Após a mistura inicial, as amostras são deixadas em repouso à temperatura ambiente por 4 minutos, quando então são neutralizadas para pH 10-11 com amônia 2,8%/água. Os produtos foram purificados por extração em fase sólida (SPE).
[0251]Empacotamento e acondicionamento da coluna de SPE: Amberchrome CG-300M (Rohm and Haas; Philadelphia, PA) (3 mL) é empacotado em 20 mL de colunas com frita (BioRad Econo-Pac Chromatography Columns (732-1011)) e a resina enxaguada com 3 mL do seguinte: NH4OH 0,28%/acetonitrila 80%; NaOH 0,5 M/etanol 20%; água; H3PO4 50 mM/acetonitrila 80%; água; NaOH 0,5 M/etanol 20%; água; NH4OH 0,28%.
[0252]Purificação por SPE: A solução resultante da desmetoxitritilação foi carregada na coluna e a resina enxaguada três vezes com 3-6 mL de amônia aquosa 0,28%. Um frasco Wheaton (12 mL) foi colocado abaixo da coluna, e a eluição do produto foi realizada por duas lavagens com 2 mL de acetonitrila 45% em amônia aquosa 0,28%.
[0253]Isolamento do produto: As soluções foram congeladas em gelo seco e os frascos colocados em um liofilizador para produzir um pó branco fofo. As amostras foram dissolvidas em água, passadas através de um filtro de 0,22 micra (Pall Life Sciences, filtro para seringa Acrodisc 25 mm, com membrana HT Tuffryn de 0,2 micra) com uma seringa, e a Densidade Óptica (OD) foi medida em um espectrofotômetro UV para determinar as unidades OD de oligômero presente, bem como dispensar amostra para análise. As soluções então voltaram a ser colocadas em frascos Wheaton para liofilização.
[0254]Análise de oligômeros morfolinos por MALDI: Utilizou-se espectrometria de massa MALDI-TOF para determinar a composição de frações em purificações, bem como para fornecer evidência para a identidade (peso molecular) dos oligômeros. Amostras foram corridas após a diluição com solução de ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxi- cinâmico (ácido sinapínico), 3,4,5-trihidroxiacetofenona (THAP) ou ácido alfa-ciano-4- hidroxicinâmico (HCCA) como matrizes.
Exemplo 2
[0255]Utilizando o protocolo descrito no Exemplo 1, o PMO a seguir foi sintetizado, NG-13-0391 H44A(-8+15), SEQ ID NO: 4 (5’-GAT CTG TCA AAT CGC CTG CAG GT-3’) e utilizado nos Exemplos 8 e 9.
Figure img0023
[0256]AA estereoquímica do centro de fósforo não é definida
Exemplo 3
[0257]Utilizando o protocolo descrito no Exemplo 1, o PMO a seguir foi sintetizado, NG-13-0392 H44A(-7+15), SEQ ID NO: 5 (5’- GAT CTG TCA AAT CGC CTG CAG G-3’) e utilizado como descrito nos Exemplos 8 e 9.
Figure img0024
[0258]AA estereoquímica do centro de fósforo não é definida
Exemplo 4
[0259]Utilizando o protocolo descrito no Exemplo 1, o PMO a seguir foi sintetizado, NG-13-0393 H44A(-6+15), SEQ ID NO: 6 (5’- GAT CTG TCA AAT CGC CTG CAG -3’) e utilizado como descrito nos Exemplos 8 e 9.
Figure img0025
[0260]AA estereoquímica do centro de fósforo não é definida
Exemplo 5
[0261]Utilizando o protocolo descrito no Exemplo 1, o PMO a seguir foi sintetizado, NG-13-0394 H44A(-8+17), SEQ ID NO: 7 (5’- CAG ATC TGT CAA ATC GCC TGC AGG T -3’) e utilizado como descrito nos Exemplos 8 e 9.
Figure img0026
[0262]AA estereoquímica do centro de fósforo não é definida.
Exemplo 6
[0263]Utilizando o protocolo descrito no Exemplo 1, o PMO a seguir foi sintetizado, NG-13-0008 H44A(-7+17), SEQ ID NO: 1 (5’- CAG ATC TGT CAA ATC GCC TGC AGG-3’) e utilizado nos Exemplos 8 e 9.
Figure img0027
[0264]AA estereoquímica do centro de fósforo não é definida.
Exemplo 7
[0265]Utilizando o protocolo descrito no Exemplo 1, o PMO a seguir foi sintetizado, NG-13-0395 H44A(-6+17), SEQ ID NO: 8 (5’-CAG ATC TGT CAA ATC GCC TGC AG-3’) e utilizado como descrito nos Exemplos 8 e 9.
Figure img0028
[0266]AA estereoquimica do centro de fósforo não é definida.
Exemplo 8 Retirada do exon 44
[0267]Uma série de oligômeros antisenso que visam o exon 44 da distrofina humana foi desenhada e sintetizada como segue:
Figure img0029
[0268]Os oligômeros antisenso selecionados mostrados acima foram avalia- dos quanto à eficácia para a retirada de exons, tratando células RD nas várias concentrações indicadas. Nesses experimentos, os oligômeros antisenso publicados, correspondentes a H44A(-06+14) e H44A(+85+104) (US 8 232 384; SEQ ID NOs: 167 e 165, respectivamente) e H44A(-06+20), H44A(-09+17), H44A(+59+85) e H44A(+65+90) (WO2011/057350; SEQ ID NOs: 68, 220, 54 e 10, respectivamente) foram utilizados como oligômeros comparativos. Conforme mostrado na Figura 3, o oligômero H44A(-07+17) (SEQ ID NO: 1) foi altamente eficaz em induzir a retirada do exon 44 em células RD, quando comparado a sequências conhecidas. Conforme mostrado na Figura 4, H44A(+62+89) (SEQ ID NO: 11) foi altamente eficaz em induzir a retirada do exon 44 em células RD cultivadas, quando comparado a outros oligonu- cleotídeos antisenso altamente eficazes conhecidos na técnica.
Exemplo 9 Retirada do exon 44 em mioblastos primários humanos
[0269]Com base nos resultados acima descritos no Exemplo 8, oligômeros adicionais foram desenhados e testados em mioblastos primários humanos. Sequências adicionais conhecidas na técnica foram incluídas na análise (H44A(-10+15) e H44A(-20+5); SEQ ID NOs: 44 e 45, respectivamente) como comparadores para os oligômeros recém-desenhados. Essas sequências são reveladas como as SEQ ID NOs: 4 e 2 na Publicação PCT WO/2010/048586. Conforme mostrado nas Figuras 56, todos de uma série de oligômeros aninhados dentro de uma região alvo definida como H44A(-07+17) têm a capacidade para induzir a retirada do exon 44 em níveis relativamente altos quando comparados a sequências conhecidas na técnica. Oligô- meros preferidos são mostrados acima nos Exemplos 2 - 7 (SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 7, 1 e 8, respectivamente).
[0270]Todas as publicações e os pedidos de patente, citados neste relatório descritivo, são aqui incorporados por referência como se cada publicação ou pedido de patente individual tivesse sido específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência neste pedido de patente. Listagem de sequências
Figure img0030
Figure img0031
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Claims (6)

1. Oligonucleotídeo antisenso CARACTERIZADO pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um oligonucleotídeo antisenso de 22 bases que compreende a sequência de bases GAT CTG TCA AAT CGC CTG CAG G (SEQ ID NO: 5); e (ii) um oligonucleotídeo antisenso de 24 bases que compreende a sequência de bases CAG ATC TGT CAA ATC GCC TGC AGG (SEQ ID NO: 1); em que as porções de açúcar da cadeia principal do oligonucleotídeo são substituídas por morfolinos; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Oligonucleotídeo antisenso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotídeo é quimicamente ligado a uma molécula de polietileno glicol.
3. Oligonucleotídeo antissenso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotídeo antisenso tem a seguinte estrutura:
Figure img0032
em que A = a estereoquímica do fósforo central não é definida.
4. Oligonucleotídeo antisenso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotídeo antisenso tem a seguinte estrutura:
Figure img0033
em que A = a estereoquímica do fósforo central não é definida.
5. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o oligonucleotídeo antisenso, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
6. Uso da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de Distrofia Muscular de Duchenne (DMD).
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