JP2018126160A - 筋ジストロフィを処置するためのエキソンスキッピング組成物 - Google Patents

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Abstract

【課題】筋ジストロフィを処置するためのエキソンスキッピング組成物の提供。【解決手段】ヒトジストロフィン遺伝子における選択された標的部位に結合して、エキソン４４スキッピングを誘発することができるアンチセンス分子であって、エキソン４４標的領域に特異的にハイブリダイズする塩基の配列を含み、オリゴマーの塩基は、モルホリノ環構造に連結しており、モルホリノ環構造が、１つの環構造のモルホリノ窒素と隣接する環構造の５’環外炭素とを接合するリン含有サブユニット間連結によって接合されている分子。【選択図】なし

Description

関連出願
この特許出願は、２０１３年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７８４５
４７号の利益を主張する。上記で参照された仮特許出願の全体の内容は、参考として本明
細書に援用される。
発明の分野
本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子におけるエキソンスキッピングを促進するのに適
した新規なアンチセンス化合物および組成物に関する。本発明はまた、本発明の方法にお
ける使用のために適合された新規なアンチセンス組成物を使用したエキソンスキッピング
を誘発するための方法を提供する。
アンチセンス技術は、種々の異なるレベル（転写、スプライシング、安定性、翻訳）で
の遺伝子発現に影響を与える一連の化学を使用して開発されている。その研究の多くは、
広範囲の適応症における異常または疾患に関連する遺伝子を補正または補償するアンチセ
ンス化合物の使用に焦点を当ててきた。アンチセンス分子は特異性を伴って遺伝子発現を
阻害することができ、このために、遺伝子発現のモジュレーターとしてのオリゴヌクレオ
チドに関する多くの研究努力は、標的となる遺伝子の発現、またはシス作用性エレメント
の機能を阻害することに焦点を当ててきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的に
は、センス鎖（例えば、ｍＲＮＡ）、またはあるウイルスＲＮＡ標的の場合はマイナス鎖
のいずれかであるＲＮＡを指向している。特定の遺伝子下方調節の所望の効果を達成する
ために、オリゴヌクレオチドは一般に、標的とされたｍＲＮＡの崩壊を促進するか、ｍＲ
ＮＡの翻訳をブロックするか、またはシス作用性ＲＮＡエレメントの機能をブロックし、
それによって、標的タンパク質の新規合成、またはウイルスＲＮＡの複製を効果的に防止
する。
しかし、このような技術は、目的が未変性タンパク質の産生を上方調節すること、また
は翻訳の未成熟な終結を誘発する変異、例えば、ナンセンス変異もしくはフレームシフト
変異を補償することである場合、有用ではない。これらの場合において、欠陥のある遺伝
子転写物は、標的とされた分解または立体的阻害に供されるべきではなく、したがって、
アンチセンスオリゴヌクレオチド化学は、標的ｍＲＮＡの崩壊を促進するべきではなく、
または翻訳をブロックするべきではない。
種々の遺伝学的疾患において、遺伝子の最終的な発現に対する変異の効果は、スプライ
シングプロセスの間の標的とされたエキソンスキッピングのプロセスによってモジュレー
トすることができる。スプライシングプロセスは、プレｍＲＮＡにおける隣接するエキソ
ン−イントロンジャンクションを近傍に導き、かつイントロンの終わりにおけるホスホジ
エステル結合の切断を行う、複雑な多構成要素の機構によって方向付けられ、これはエキ
ソンの間のホスホジエステル結合のそれに続く再形成を伴い、これは一緒にスプライシン
グされる。この複雑かつ高度に正確なプロセスは、相対的に短い半保存的ＲＮＡセグメン
トであるプレｍＲＮＡにおける配列モチーフによって媒介され、次いでスプライシング反
応に関与する様々な核スプライシング因子が配列モチーフに結合する。スプライシング機
構が、プレｍＲＮＡプロセシングに関与するモチーフを解読または認識する方法を変更す
ることによって、差次的にスプライシングされたｍＲＮＡ分子を生じさせることが可能で
ある。ヒト遺伝子の大部分は、正常な遺伝子発現の間に選択的にスプライシングされるこ
とが今や認識されてきたが、関与する機構は同定されてこなかった。Ｂｅｎｎｅｔｔら（
米国特許第６，２１０，８９２号）は、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ Ｈが媒介する切断を誘
発しないアンチセンスオリゴヌクレオチド類似体を使用した、野性型細胞のｍＲＮＡプロ
セシングのアンチセンスのモジュレーションについて記載している。これによって、膜貫
通ドメインをコードするエキソンを欠いている可溶性ＴＮＦスーパーファミリー受容体の
産生のために、特異的エキソンを欠いている選択的にスプライシングされたｍＲＮＡ（例
えば、Ｓａｚａｎｉ， Ｋｏｌｅら、２００７年によって記載されているような）を産生
することができることにおける有用性が見出される。
正常に機能しているタンパク質が、その中の変異のために未成熟に終結される場合、ア
ンチセンス技術によっていくつかの機能タンパク質の産生を回復させるための手段はスプ
ライシングプロセスの間の介入によって可能であることが示されてきており、疾患をもた
らす変異と関連するエキソンをいくつかの遺伝子から特異的に欠失させることができる場
合、未変性タンパク質の同様の生物学的特性を有するか、またはエキソンと関連する変異
によってもたらされる疾患を改善するのに十分な生物活性を有する、短縮されたタンパク
質産物を産生することができることがある（例えば、Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ， Ｓａｍ
ｂａｄｅら、１９９６年；Ｗｉｌｔｏｎ， Ｌｌｏｙｄら、１９９９年；ｖａｎ Ｄｅｕ
ｔｅｋｏｍ， Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔら、２００１年；Ｌｕ， Ｍａｎｎら、２００
３年；Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ， Ｊａｎｓｏｎら、２００４年を参照されたい）。Ｋｏ
ｌｅら（米国特許第５，６２７，２７４号；同第５，９１６，８０８号；同第５，９７６
，８７９号；および同第５，６６５，５９３号）は、標的とされたプレｍＲＮＡの崩壊を
促進しない修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド類似体を使用した、異常なスプラ
イシングに対抗する方法を開示している。Ｂｅｎｎｅｔｔら（米国特許第６，２１０，８
９２号）は、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ Ｈが媒介する切断を誘発しないアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド類似体をまた使用した、野性型細胞のｍＲＮＡプロセシングのアンチセン
スのモジュレーションを記載している。
標的とされたエキソンスキッピングのプロセスは、多くのエキソンおよびイントロンが
存在するか、エキソンの遺伝子構成において重複性が存在するか、またはタンパク質が１
つもしくは複数の特定のエキソンを伴わずに機能することができる、長い遺伝子において
特に有用である可能性が高い。様々な遺伝子における変異によってもたらされる切断と関
連する遺伝学的疾患の処置のための遺伝子プロセシングを再指向させる努力は、（１）ス
プライシングプロセスに関与するエレメントと完全もしくは部分的にオーバーラップする
か、または（２）そのエレメントにおいて起こる特定のスプライシング反応を正常に媒介
するスプライシング因子の結合および機能を撹乱するためにエレメントに十分に近い位置
においてプレｍＲＮＡに結合する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に焦点を合わ
せてきた。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、タンパク質ジストロフィンの発現の欠
陥によってもたらされる。タンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡの２百万超のヌクレ
オチドに亘って広がる７９のエキソンを含有する。エキソンのリーディングフレームを変
化させるか、もしくは終止コドンを導入するか、または全アウトオブフレームエキソン（
複数可）の除去、または１つもしくは複数のエキソンの重複によって特徴付けられる、任
意のエキソンの変異は、機能的ジストロフィンの産生を撹乱する可能性を有し、ＤＭＤを
もたらす。
変異、典型的には１つまたは複数のエキソンの欠失が、全ジストロフィン転写物に沿っ
た正確なリーディングフレームをもたらし、その結果、タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳が
未成熟で終結しない場合、筋ジストロフィーのより重度でない形態であるベッカー型筋ジ
ストロフィー（ＢＭＤ）が生じることが見出されてきた。変異したジストロフィンプレｍ
ＲＮＡのプロセシングにおける上流および下流のエキソンの接合によって遺伝子の正確な
リーディングフレームが維持される場合、結果は、いくらかの活性を保持する短い内部欠
失を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、ベッカー表現型がもたらされる。
何年にも亘って、ジストロフィンタンパク質のリーディングフレームを変化させないエ
キソン（複数可）の欠失は、ＢＭＤ表現型を生じさせ、一方では、フレームのシフトをも
たらすエキソン欠失は、ＤＭＤを生じさせることが公知であった（Ｍｏｎａｃｏ， Ｂｅ
ｒｔｅｌｓｏｎら、１９８８年）。一般に、リーディングフレームを変化させ、したがっ
て、適切なタンパク質翻訳を中断する点変異およびエキソン欠失を含めたジストロフィン
変異は、ＤＭＤをもたらす。一部のＢＭＤおよびＤＭＤ患者は、複数のエキソンをカバー
するエキソン欠失を有することにも留意すべきである。
アンチセンスオリゴリボヌクレオチドによる変異体ジストロフィンプレｍＲＮＡスプラ
イシングのモジュレーションは、インビトロおよびインビボの両方で報告されてきた（例
えば、Ｍａｔｓｕｏ， Ｍａｓｕｍｕｒａら、１９９１年；Ｔａｋｅｓｈｉｍａ， Ｎｉ
ｓｈｉｏら、１９９５年；Ｐｒａｍｏｎｏ， Ｔａｋｅｓｈｉｍａら、１９９６年；Ｄｕ
ｎｃｋｌｅｙ， Ｅｐｅｒｏｎら、１９９７年；Ｄｕｎｃｋｌｅｙ， Ｍａｎｏｈａｒａ
ｎら、１９９８年；Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍａｎｎら、２００３年を参照されたい）。
ｍｄｘマウスモデルにおける特異的および再現性のあるエキソンスキッピングの最初の
例は、Ｗｉｌｔｏｎらによって報告された（Ｗｉｌｔｏｎ， Ｌｌｏｙｄら、１９９９年
）。アンチセンス分子をドナースプライス部位に向けることによって、培養細胞の処理の
６時間以内に、ジストロフィンｍＲＮＡにおいて一貫した効率的なエキソン２３スキッピ
ングが誘発された。Ｗｉｌｔｏｎらはまた、より長いアンチセンスオリゴヌクレオチドに
よる、マウスジストロフィンのプレｍＲＮＡのアクセプター領域を標的とすることを記載
している。イントロン２３ドナースプライス部位に向けられた最初のアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、初代培養した筋芽細胞において一貫したエキソンスキッピングを誘発し
た一方で、この化合物は、より高いレベルのジストロフィンを発現している不死化された
細胞培養物においてはるかにより効率的ではないことが見出された。しかし、精巧な標的
化およびアンチセンスオリゴヌクレオチド設計によって、特定のエキソン除去の効率は、
ほぼ一桁分増大した（Ｍａｎｎ， Ｈｏｎｅｙｍａｎら、２００２年）。
最近の研究は、ジストロフィンが存在しないことによって影響を受ける組織における最
小の有害効果を伴う、持続性のジストロフィン発現を達成する試みに取り組み始めた。Ｄ
ＭＤを有する４人の患者の前脛骨筋中へのエキソン５１（ＰＲＯ０５１）を標的としたア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの筋肉内注射は、臨床的に明らかな有害効果を伴わずにエ
キソン５１の特異的スキッピングをもたらした（Ｍａｎｎ， Ｈｏｎｅｙｍａｎら、２０
０２年；ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ， Ｊａｎｓｏｎら、２００７年）。ｍｄｘマウスに
おいてエキソン２３を標的とした細胞透過性ペプチドに結合体化されたアンチセンスホス
ホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）の全身送達に注目した研究は、検出
可能な毒性を伴わずに、骨格筋および心筋において高く持続性のジストロフィンタンパク
質産物を産生した（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ， Ｍｏｕｌｔｏｎら、２０
０８年；Ｗｕ， Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００８年；Ｙｉｎ， Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００
８年）。
ＤＭＤの処置のためのスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の安全性
および有効性を試験する最近の臨床治験は、スプライソゾームの立体的遮断によるプレｍ
ＲＮＡの選択的スプライシングを誘発するＳＳＯ技術に基づいている（Ｃｉｒａｋら、２
０１１年；Ｇｏｅｍａｎｓら、２０１１年；Ｋｉｎａｌｉら、２００９年；ｖａｎ Ｄｅ
ｕｔｅｋｏｍら、２００７年）。
米国特許第６，２１０，８９２号明細書 米国特許第５，６２７，２７４号明細書 米国特許第５，９１６，８０８号明細書 米国特許第５，９７６，８７９号明細書 米国特許第５，６６５，５９３号明細書
これらの成功にも関わらず、複数のジストロフィンエキソンを標的とした改善されたア
ンチセンスオリゴマー、および改善された筋肉送達組成物、およびＤＭＤの治療適用のた
めの方法が求められている。
一態様において、本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子において選択された標的に結合
してエキソンスキッピングを誘発することができる、長さが２０〜５０のヌクレオチドの
アンチセンスオリゴマーを提供し、このアンチセンスオリゴマーは、Ｈ４４Ａ（−０７＋
１５）、Ｈ４４Ａ（−０８＋１５）、Ｈ４４Ａ（−０６＋１５）、Ｈ４４Ａ（−０８＋１
７）、Ｈ４４Ａ（−０７＋１７）、およびＨ４４Ａ（−０６＋１７）からなる群より選択
されるエキソン４４標的領域に特異的にハイブリダイズする塩基の配列を含み、オリゴマ
ーの塩基は、モルホリノ環構造に連結しており、モルホリノ環構造が、１つの環構造のモ
ルホリノ窒素と隣接する環構造の５’環外炭素とを接合するリン含有サブユニット間連結
によって接合されている。一実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１
および４〜８からなる群より選択される塩基の配列を含む。別の実施形態において、アン
チセンスオリゴマーは、長さが約２０〜３０のヌクレオチドまたは長さが約２２〜２８の
ヌクレオチドである。さらに別の実施形態において、配列は、配列番号１および４〜８か
ら選択される配列からなる。一実施形態において、本発明は、ＲＮａｓｅ Ｈを活性化し
ないアンチセンスオリゴマーを提供する。
別の態様において、本発明は、例えばポリエチレングリコール分子などのアンチセンス
オリゴマーの活性、細胞分布、または細胞取込みを増強する１つまたは複数の部分または
結合体に化学的に連結しているアンチセンスオリゴマーを提供する。他の実施形態におい
て、アンチセンスオリゴマーは、アルギニンに富んだペプチド、例えば配列番号２４〜３
９から選択される配列に結合体化している。
さらに別の態様において、本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子において選択された標
的に結合してエキソンスキッピングを誘発することができる、長さが２０〜５０のヌクレ
オチドのアンチセンスオリゴマーを提供し、このアンチセンスオリゴマーは、Ｈ４４Ａ（
−０７＋１５）、Ｈ４４Ａ（−０８＋１５）、Ｈ４４Ａ（−０６＋１５）、Ｈ４４Ａ（−
０８＋１７）、Ｈ４４Ａ（−０７＋１７）、およびＨ４４Ａ（−０６＋１７）からなる群
より選択されるエキソン４４標的領域に特異的にハイブリダイズする塩基の配列を含み、
オリゴマーの塩基は、モルホリノ環構造に連結しており、モルホリノ環構造は、１つの環
構造のモルホリノ窒素と隣接する環構造の５’環外炭素とを接合する実質的に荷電してい
ないリン含有サブユニット間連結によって接合されている。一実施形態において、アンチ
センスオリゴマーの連結の５％〜３５％は、正に荷電している。別の実施形態において、
アンチセンスオリゴマーのサブユニット間連結は、荷電しておらず、生理学的ｐＨにて正
に荷電している連結が散在しており、正に荷電している連結の総数は、２および連結の総
数の半分以下の間である。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、モルホ
リノ環構造およびホスホロジアミデートサブユニット間連結を含む。一部の実施形態にお
いて、アンチセンスオリゴマーは、ペンダントカチオン性基で修飾されている。
別の態様において、本発明は、
からなる群より選択されるアンチセンスオリゴマーを提供し、ここで、
そして、＾＝リン中心の立体化学は定義されていない。
一部の実施形態において、ウラシルが、上記構造においてチミンに置き換わり得る。
一態様において、アンチセンス化合物は、１つのサブユニットのモルホリノ窒素と隣接
するサブユニットの５’環外炭素とを接合するリン含有サブユニット間連結から構成され
、連結は、構造：
によるホスホロジアミデート連結であり、
式中、Ｙ１＝Ｏであり、Ｚ＝Ｏであり、Ｐｊは、塩基特異的水素結合によって、ポリヌ
クレオチド中の塩基に結合するのに有効であるプリンまたはピリミジン塩基対合部分であ
り、Ｘは、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、またはアルキルアミノ、例えば、Ｘ
＝ＮＲ２であり、各Ｒは、独立に、水素またはメチルである。荷電していない上記のサブ
ユニット間連結は、生理学的ｐＨにて正に荷電している連結が散在してもよく、正に荷電
している連結の総数は、１およびサブユニット間連結の総数の全てまでの間である。
別の例示的な実施形態において、化合物は、本明細書においてその全体が組み込まれて
いる米国特許出願第１３／１１８，２９８号に記載されているようなサブユニット間連結
および末端修飾からなる。
一態様によれば、本発明は、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡにおける選択された標的
に結合し、エキソンスキッピングを誘発することができるアンチセンス分子を提供する。
別の態様において、本発明は、一緒に使用されて、単一または複数のエキソンスキッピン
グを誘発する、２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。例えば、単一ま
たは複数のエキソンのエキソンスキッピングは、２つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオ
チド分子を一緒に連結することによって達成することができる。
別の態様において、本発明は、Ｈ４４Ａ（−０７＋１７）、Ｈ４４Ａ（−０７＋２０）
、Ｈ４４Ａ（−０７＋２２）、Ｈ４４Ａ（−８＋１５）、Ｈ４４Ａ（−７＋１５）、Ｈ４
４Ａ（−６＋１５）、Ｈ４４Ａ（−８＋１７）、Ｈ４４Ａ（−６＋１７）、Ｈ４４Ａ（＋
７７＋１０１）、Ｈ４４Ａ（＋６４＋９１）、Ｈ４４Ａ（＋６２＋８９）、Ｈ４４Ａ（＋
６２＋８５）、Ｈ４４Ａ（−１３＋１４）、Ｈ４４Ａ（−１４＋１５）からなる群より選
択されるアニーリング部位と指定されるジストロフィン遺伝子のエキソン４４標的領域に
対して相補的である少なくとも１０、１２、１５、１７、２０またはそれより多い連続し
たヌクレオチドを含めた、長さが２０〜５０のヌクレオチドの単離されたアンチセンスオ
リゴヌクレオチドに関し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エキソン４４スキッピン
グを誘発するアニーリング部位に特異的にハイブリダイズする。一実施形態において、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが２５〜２８のヌクレオチドである。
別の態様において、本発明は、配列番号１〜１２、４６および４７からなる群より選択
されるヌクレオチド配列の少なくとも１０、１２、１５、１７、２０またはそれより多い
ヌクレオチドを含めた、長さが２０〜５０のヌクレオチドの単離されたアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドに関し、オリゴヌクレオチドは、ジストロフィン遺伝子のエキソン４４標
的領域に特異的にハイブリダイズし、エキソン４４スキッピングを誘発する。一実施形態
において、配列番号１〜１２、４６および４７におけるチミン塩基は、任意選択でウラシ
ルである。
エキソン４４を標的とした例示的なアンチセンス配列は、下記で同定するものを含む：
一実施形態において、例えば配列番号１のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−０７＋１７）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号２のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−０７＋２０）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号３のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−０７＋２２）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号４のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−８＋１５）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号５のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−７＋１５）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号６のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−６＋１５）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号７のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−８＋１７）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号８のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−６＋１７）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号９のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（＋７７＋１０１）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号１０のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（＋６４＋９１）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号１１のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（＋６２＋８９）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号１２のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（＋６２＋８５）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号４６のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−１３＋１４）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号４７のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−１４＋１５）に特異的にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓ
ｅ Ｈによる切断を最小化または防止する１つまたは複数の修飾を含有する。いくつかの
実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈを活性
化しない。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非天然骨
格を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの骨格の糖部分は、非天然
部分、例えば、モルホリノで置き換えられている。いくつかの実施形態において、アンチ
センスオリゴヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド間連結、例えば、修飾されたホスフェ
ートで置き換えられた、オリゴヌクレオチドの骨格のヌクレオチド間連結を有する。例示
的な修飾されたホスフェートは、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホス
ホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート（ｐｈｏｓｏｐｈｒｏｐｉｐｅｒａｚｉｄ
ａｔｅｓ）、およびホスホロアミデートを含む。いくつかの実施形態において、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル−オリゴリボヌクレオチドまたはペプチド
核酸である。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基の修飾または
置換を含有する。例えば、特定の核酸塩基を選択して、本明細書に記載されているアンチ
センスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大し得る。これらは、５−置換ピリミジン、
６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロ
ピルアデニン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシンならびに２，６−ジア
ミノプリンを含めた）を含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜
１．２℃だけ増大させることが示されてきており、本明細書に記載されているアンチセン
スオリゴヌクレオチド中に組み込み得る。一実施形態において、オリゴヌクレオチドの少
なくとも１つのピリミジン塩基は、５−置換ピリミジン塩基を含み、ピリミジン塩基は、
シトシン、チミンおよびウラシルからなる群より選択される。一実施形態において、５−
置換ピリミジン塩基は、５−メチルシトシンである。別の実施形態において、オリゴヌク
レオチドの少なくとも１つのプリン塩基は、Ｎ−２、Ｎ−６置換プリン塩基を含む。一実
施形態において、Ｎ−２、Ｎ−６置換プリン塩基は、２，６−ジアミノプリンである。
一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単独で、または別の修飾、
例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせて、１つまたは複数の５−メチル
シトシン置換を含む。さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは
、単独で、または別の修飾と組み合わせて、１つまたは複数の２，６−ジアミノプリン置
換を含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の
部分、例えば、ポリエチレングリコール部分、または結合体、例えば、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取込みを増強させるアルギニンに富んだ細
胞透過性ペプチド（例えば、配列番号２４〜３９）に化学的に連結している。例示的な一
実施形態において、アルギニンに富んだポリペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端残基に
おいてアンチセンス化合物の３’端または５’端に共有結合的にカップリングしている。
また例示的な実施形態において、アンチセンス化合物は、モルホリノサブユニット、およ
び１つのサブユニットのモルホリノ窒素と隣接するサブユニットの５’環外炭素とを接合
するリン含有サブユニット間連結から構成される。
別の態様において、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、配列
番号１〜１２、４６および４７のアンチセンスオリゴヌクレオチドを組み込む発現ベクタ
ーを提供する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、修飾されたレトロウイル
スまたは非レトロウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスベクターである。
別の態様において、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびリン酸
緩衝液を含む食塩溶液を含む医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、患者への送達に適した形態の少なくとも１つのアンチセ
ンス分子を含む、遺伝学的障害の予防的または治療的処置において助けるように選択およ
びまたは適合されたアンチセンス分子を提供する。
別の態様において、本発明は、（ａ）本明細書に記載の方法によってアンチセンス分子
を選択するステップと、（ｂ）このような処置を必要としている患者に分子を投与するス
テップとを含む、特定のタンパク質をコードする遺伝子における変異が存在し、かつ変異
の影響をエキソンスキッピングによって抑止することができる、遺伝学的疾患を患ってい
る患者を処置するための方法を提供する。本発明はまた、遺伝学的疾患の処置のための医
薬を製造するための、精製および単離された本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの
使用に取り組む。
別の態様において、本発明は、患者に、有効量の適当に設計された、その患者における
特定の遺伝的病変に関連する本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを
含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィーによって特徴付けられる状態を処置する方法を提
供する。さらに、本発明は、患者に有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはこ
れらの生物学的分子の１つもしくは複数を含む医薬組成物を投与することによって、デュ
シェンヌ型筋ジストロフィーを予防または最小化するための患者を予防的に処置するため
の方法を提供する。
別の態様において、本発明はまた、遺伝学的疾患を処置するためのキットを提供し、キ
ットは、適切な容器中にパッケージされた少なくとも１つの本発明のアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド、およびその使用のための指示書を含む。
これらおよび他の目的および特色は、下記の発明の詳細な説明を図面と併せて読んだときにより完全に理解される。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒトジストロフィン遺伝子において選択された標的に結合してエキソンスキッピングを誘発することができる、長さが２０〜５０のヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーであって、前記アンチセンスオリゴマーは、Ｈ４４Ａ（−０７＋１５）、Ｈ４４Ａ（−０８＋１５）、Ｈ４４Ａ（−０６＋１５）、Ｈ４４Ａ（−０８＋１７）、Ｈ４４Ａ（−０７＋１７）、およびＨ４４Ａ（−０６＋１７）からなる群より選択されるエキソン４４標的領域に特異的にハイブリダイズする塩基の配列を含み、前記オリゴマーの前記塩基は、モルホリノ環構造に連結しており、そして前記モルホリノ環構造は、１つの環構造のモルホリノ窒素と隣接する環構造の５’環外炭素とを接合するリン含有サブユニット間連結によって接合されている、アンチセンスオリゴマー。
（項目２）
前記配列が、配列番号１および４〜８からなる群より選択される、項目１に記載のアンチセンスオリゴマー。
（項目３）
長さが約２０〜３０のヌクレオチドである、項目１または２に記載のアンチセンスオリゴマー。
（項目４）
長さが約２２〜２８のヌクレオチドである、項目１または２に記載のアンチセンスオリゴマー。
（項目５）
前記配列が、配列番号１および４〜８から選択される配列からなる、項目２に記載のアンチセンスオリゴマー。
（項目６）
ＲＮａｓｅ Ｈを活性化しない、項目１〜５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー。
（項目７）
前記アンチセンスオリゴマーの活性、細胞分布、または細胞取込みを増強する１つまたは複数の部分または結合体に化学的に連結している、項目１〜５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー。
（項目８）
ポリエチレングリコール分子に化学的に連結している、項目７に記載のアンチセンスオリゴマー。
（項目９）
アルギニンに富んだペプチドに結合体化している、項目１〜５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー。
（項目１０）
前記アルギニンに富んだペプチドが、配列番号２４〜３９から選択される配列を含む、項目９に記載のアンチセンスオリゴマー。
（項目１１）
１つの環構造のモルホリノ窒素と隣接する環構造の５’環外炭素とを接合する実質的に荷電していないリン含有サブユニット間連結によって接合されているモルホリノ環構造を含む、前記項目のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー。
（項目１２）
前記連結の５％〜３５％が正に荷電している、項目１１に記載のアンチセンスオリゴマー。
（項目１３）
前記サブユニット間連結が、荷電しておらず、そして前記サブユニット間連結に生理学的ｐＨにて正に荷電している連結が散在しており、ここで正に荷電している連結の総数が、２および連結の総数の半分以下の間である、前記項目のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー。
（項目１４）
モルホリノ環構造およびホスホロジアミデートサブユニット間連結を含む、項目１〜１３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー。
（項目１５）
ペンダントカチオン性基で修飾されている、前記アンチセンスオリゴマー。
（項目１６）
以下：
からなる群より選択されるアンチセンスオリゴマーであって、ここで、
であり、＾＝リン中心の立体化学が定義されていない、アンチセンスオリゴマー。
（項目１７）
前記項目のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
（項目１８）
筋ジストロフィーの処置における使用のための、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
前記筋ジストロフィーが、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）である、項目１８に記載の組成物。
図１Ａは、ホスホロジアミデート連結を有する例示的なモルホリノオリゴマー構造を示す。 図１Ｂは、本発明の一実施形態によるアルギニンに富んだペプチドおよびアンチセンスオリゴマーの結合体を示す。 図１Ｃは、図１Ｂにおけるような結合体を示すが、骨格連結は、１つまたは複数の正に荷電している基を含有する。 図１Ｄ〜Ｇは、Ｄ〜Ｇと指定される例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの繰り返しサブユニットセグメントを示す。 図２Ａ〜２Ｂは、固相合成のためのリンカーおよびオリゴマー合成のための固体支持体の調製のための反応スキームを表す。 図２Ａ〜２Ｂは、固相合成のためのリンカーおよびオリゴマー合成のための固体支持体の調製のための反応スキームを表す。 図３は、培養したヒト横紋筋肉腫細胞においてエキソン４４スキッピングを誘発するための例示的なアンチセンスオリゴマーの相対的活性を示す、実験に対応するグラフを表す。示したオリゴマーで処理した横紋筋肉腫細胞から単離されたＲＮＡを、エキソン４４特異的ネステッドＲＴ−ＰＣＲ増幅、それに続いてゲル電気泳動およびバンド強度の定量化に供した。データを、ＰＣＲ、すなわち、完全長ＰＣＲ産物に対するエキソンスキッピング産物のバンド強度によって評価されるエキソンスキッピング％としてプロットする。図３において、Ｈ４４Ａ（−０６＋１４）、Ｈ４４Ａ（−０６＋２０）およびＨ４４Ａ（−０９＋１７）（それぞれ、配列番号１３、１９および２０）は、公開されたオリゴマーである。 図４は、培養したヒト横紋筋肉腫細胞においてエキソン４４スキッピングを誘発するための例示的なアンチセンスオリゴマーの相対的活性を示す、実験に対応するグラフを表す。示したオリゴマーで処理した横紋筋肉腫細胞から単離されたＲＮＡを、エキソン４４特異的ネステッドＲＴ−ＰＣＲ増幅、それに続いてゲル電気泳動およびバンド強度の定量化に供した。データを、ＰＣＲ、すなわち、完全長ＰＣＲ産物に対するエキソンスキッピング産物のバンド強度によって評価されるエキソンスキッピング％としてプロットする。図４において、Ｈ４４Ａ（＋８５＋１０４）、Ｈ４４Ａ（＋５９＋８５）およびＨ４４Ａ（＋６５＋９０）（それぞれ、配列番号１４、２１および２３）は、公開されたオリゴマーである。 図５は、初代ヒト筋芽細胞においてエキソン４４スキッピングを誘発するための例示的なアンチセンスオリゴマーの相対活性を示す実験に対応するグラフを表す。 図６は、初代ヒト筋芽細胞においてエキソン４４スキッピングを誘発するための例示的なアンチセンスオリゴマーの相対活性を示す実験に対応するグラフを表す。
本発明の詳細な説明
本発明の実施形態は一般に、ヒトジストロフィン遺伝子においてエキソンスキッピング
を誘発するように特異的に設計された、改善されたアンチセンス化合物、およびその使用
の方法に関する。ジストロフィンは筋機能において極めて重要な役割を果たし、様々な筋
肉に関連する疾患は、変異した形態のこの遺伝子によって特徴付けられる。したがって、
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている改善されたアンチセンス化合物
は、変異した形態のヒトジストロフィン遺伝子、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィ
ー（ＤＭＤ）およびベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）において見出される変異した
ジストロフィン遺伝子においてエキソンスキッピングを誘発する。
変異によってもたらされる異常なｍＲＮＡスプライシング事象によって、これらの変異
したヒトジストロフィン遺伝子は、欠陥のあるジストロフィンタンパク質を発現するか、
または測定可能なジストロフィンを全く発現せず、これは様々な形態の筋ジストロフィー
をもたらす状態である。この状態を治療するために、本発明のアンチセンス化合物は、変
異したヒトジストロフィン遺伝子のプロセシングを受ける前のＲＮＡの選択された領域に
ハイブリダイズし、さもないと異常にスプライシングされるジストロフィンｍＲＮＡにお
けるエキソンスキッピングおよび差次的なスプライシングを誘発し、それによって筋細胞
が機能的ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物を生じさせることを可能
とする。ある特定の実施形態において、このように得られたジストロフィンタンパク質は
、必ずしもジストロフィンの「野性型」形態ではないが、むしろ切断型であるが依然とし
て機能的または半機能的形態のジストロフィンである。
筋細胞中の機能的ジストロフィンタンパク質のレベルを増大させることによって、これ
らおよび関連する実施形態は、筋ジストロフィー、特に、異常なｍＲＮＡスプライシング
による欠陥のあるジストロフィンタンパク質の発現によって特徴付けられる筋ジストロフ
ィーの形態、例えば、ＤＭＤおよびＢＭＤの予防法および処置において有用であり得る。
本明細書に記載されている特定のオリゴマーは、使用されている他のオリゴマーよりも改
善されたジストロフィン−エキソン−特異的ターゲッティングをさらに提供し、それによ
って関連する形態の筋ジストロフィーを処置する代替方法を超える有意かつ実施上の利点
を提供する。
一態様において、本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子において選択された標的に結合
してエキソンスキッピングを誘発することができる、長さが２０〜５０のヌクレオチドの
アンチセンスオリゴマーを提供し、このアンチセンスオリゴマーは、Ｈ４４Ａ（−０７＋
１５）、Ｈ４４Ａ（−０８＋１５）、Ｈ４４Ａ（−０６＋１５）、Ｈ４４Ａ（−０８＋１
７）、Ｈ４４Ａ（−０７＋１７）、およびＨ４４Ａ（−０６＋１７）からなる群より選択
されるエキソン４４標的領域に特異的にハイブリダイズする塩基の配列を含み、オリゴマ
ーの塩基は、モルホリノ環構造に連結しており、モルホリノ環構造は、１つの環構造のモ
ルホリノ窒素と隣接する環構造の５’環外炭素とを接合するリン含有サブユニット間連結
によって接合されている。一実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１
および４〜８からなる群より選択される塩基の配列を含む。別の実施形態において、アン
チセンスオリゴマーは、長さが約２０〜３０のヌクレオチドまたは長さが約２２〜２８の
ヌクレオチドである。さらに別の実施形態において、配列は、配列番号１および４〜８か
ら選択される配列からなる。一実施形態において、本発明は、ＲＮａｓｅ Ｈを活性化し
ないアンチセンスオリゴマーを提供する。
別の態様において、本発明は、例えばポリエチレングリコール分子などのアンチセンス
オリゴマーの活性、細胞分布、または細胞取込みを増強する１つまたは複数の部分または
結合体に化学的に連結しているアンチセンスオリゴマーを提供する。他の実施形態におい
て、アンチセンスオリゴマーは、アルギニンに富んだペプチド、例えば配列番号２４〜３
９から選択される配列に結合体化している。
さらに別の態様において、本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子において選択された標
的に結合してエキソンスキッピングを誘発することができる、長さが２０〜５０のヌクレ
オチドのアンチセンスオリゴマーを提供し、このアンチセンスオリゴマーは、Ｈ４４Ａ（
−０７＋１５）、Ｈ４４Ａ（−０８＋１５）、Ｈ４４Ａ（−０６＋１５）、Ｈ４４Ａ（−
０８＋１７）、Ｈ４４Ａ（−０７＋１７）、およびＨ４４Ａ（−０６＋１７）からなる群
より選択されるエキソン４４標的領域に特異的にハイブリダイズする塩基の配列を含み、
オリゴマーの塩基は、モルホリノ環構造に連結しており、モルホリノ環構造は、１つの環
構造のモルホリノ窒素と隣接する環構造の５’環外炭素とを接合する実質的に荷電してい
ないリン含有サブユニット間連結によって接合されている。一実施形態において、アンチ
センスオリゴマーの連結の５％〜３５％は、正に荷電している。別の実施形態において、
アンチセンスオリゴマーのサブユニット間連結は、荷電しておらず、生理学的ｐＨにて正
に荷電している連結が散在しており、正に荷電している連結の総数は、２および連結の総
数の半分以下の間である。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、モルホ
リノ環構造およびホスホロジアミデートサブユニット間連結を含む。一部の実施形態にお
いて、アンチセンスオリゴマーは、ペンダントカチオン性基で修飾されている。
別の態様において、本発明は、実施例２〜７に記載されているアンチセンスオリゴマーを提供する。一部の実施形態において、ウラシルが、実施例２〜７に記載されているアンチセンスオリゴマーにおいてチミンに置き換わり得る。
一態様において、本発明は、Ｈ４４Ａ（−０７＋１７）、Ｈ４４Ａ（−０７＋２０）、
Ｈ４４Ａ（−０７＋２２）、Ｈ４４Ａ（−８＋１５）、Ｈ４４Ａ（−７＋１５）、Ｈ４４
Ａ（−６＋１５）、Ｈ４４Ａ（−８＋１７）、Ｈ４４Ａ（−６＋１７）、Ｈ４４Ａ（＋７
７＋１０１）、Ｈ４４Ａ（＋６４＋９１）、Ｈ４４Ａ（＋６２＋８９）、Ｈ４４Ａ（＋６
２＋８５）、Ｈ４４Ａ（−１３＋１４）、Ｈ４４Ａ（−１４＋１５）からなる群より選択
されるアニーリング部位と指定されるジストロフィン遺伝子のエキソン４４標的領域に相
補的な少なくとも１０、１２、１５、１７、２０またはそれより多いヌクレオチドを含め
た、長さが２０〜５０のヌクレオチドの単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関
する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アニーリング部位に特異的にハイブリダイズ
して、エキソン４４スキッピングを誘導する。
本発明の他のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが２０〜５０のヌクレオチドで
あり、配列番号１〜１２、４６、および４７の少なくとも１０、１２、１５、１７、２０
、２２、２５またはそれより多いヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、配列番
号１〜１２、４６、および４７におけるチミン塩基は、任意選択でウラシルである。
本発明の例示的なアンチセンスオリゴマーを以下に示す：
一実施形態において、例えば配列番号１のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−０７＋１７）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号２のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−０７＋２０）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号３のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−０７＋２２）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号４のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−８＋１５）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号５のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−７＋１５）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号６のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−６＋１５）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号７のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−８＋１７）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号８のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−６＋１７）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号９のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（＋７７＋１０１）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号１０のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（＋６４＋９１）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号１１のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（＋６２＋８９）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号１２のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（＋６２＋８５）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号４６のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−１３＋１４）に特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、例えば配列番号４７のようなアンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位Ｈ４４Ａ（−１４＋１５）に特異的にハイブリダイズする。
他に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術および科学用語は、本発明
が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載さ
れているものと同様または同等である任意の方法および材料を、本発明の実施または試験
において使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的の
ために、下記の用語を、下記で定義する。
Ｉ．定義
「約」とは、参照の分量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量ま
たは長さに対して、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％
、５％、４％、３％、２％または１％ほど変動する、分量、レベル、値、数、頻度、百分
率、寸法、サイズ、量、重量または長さを意味する。
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連するポリヌクレオ
チド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列「Ｔ−Ｇ−Ａ（５’−３’
）」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ（５’−３’）」に対して相補的である。相補性は、「部分的
」であり得、ここでは、核酸の塩基のいくつかのみが、塩基対合則によってマッチする。
あるいは、核酸の間に「完全な」または「全体的」相補性が存在し得る。核酸鎖の間の相
補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して有意な効
果を有する。完全な相補性が所望であることが多い一方で、いくつかの実施形態は、標的
ＲＮＡに関して、１つまたは複数ではあるが、好ましくは６つ、５つ、４つ、３つ、２つ
、または１つのミスマッチを含むことができる。オリゴマー内の任意の場所におけるバリ
エーションが含まれる。ある特定の実施形態において、オリゴマーの末端近くの配列にお
けるバリエーションは一般に、内部におけるバリエーションより好ましく、存在する場合
、典型的には、５’端および／または３’端の約６ヌクレオチド、５ヌクレオチド、４ヌ
クレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチドまたは１ヌクレオチド以内である。
「細胞透過性ペプチド」および「ＣＰＰ」という用語は互換的に使用され、輸送ペプチ
ド、担体ペプチド、またはペプチド伝達ドメインとまた称されるカチオン性細胞透過性ペ
プチドを指す。ペプチドは、本明細書に示されているように、所与の細胞培養集団の細胞
の１００％以内の細胞透過を誘発する能力を有し、全身投与によってインビボで複数の組
織内での巨大分子のトランスロケーションを可能とする。好ましいＣＰＰの実施形態は、
下記でさらに記載されているようなアルギニンに富んだペプチドである。
「アンチセンスオリゴマー」および「アンチセンス化合物」および「アンチセンスオリ
ゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、環状サブユニットの配列を指し、これ
はそれぞれが、サブユニット間連結によって連結される塩基対合部分を担持し、サブユニ
ット間連結は、塩基対合部分がワトソン−クリック塩基対合によって核酸（典型的にはＲ
ＮＡ）中の標的配列にハイブリダイズし、標的配列内で核酸：オリゴマーヘテロ二重鎖を
形成することを可能とする。環状サブユニットは、リボースもしくは別のペントース糖、
または好ましい実施形態において、モルホリノ基（下記のモルホリノオリゴマーの記載を
参照されたい）をベースとする。オリゴマーは、標的配列と相補性な正確または近似の配
列を有し得る。オリゴマーの末端近くの配列におけるバリエーションは一般に、内部にお
けるバリエーションより好ましい。
このようなアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳をブロックもしくは阻害するか
、または天然のプレｍＲＮＡスプライスプロセシングを阻害するように設計することがで
き、このようなアンチセンスオリゴマーは、ハイブリダイズする標的配列に「向けられ」
または「標的として」いると言われてもよい。標的配列は典型的には、ｍＲＮＡのＡＵＧ
開始コドン、翻訳抑制オリゴマー、またはプロセシングを受ける前のｍＲＮＡのスプライ
ス部位、スプライシング抑制オリゴマー（ＳＳＯ）を含めた領域である。スプライス部位
のための標的配列は、プロセシングを受ける前のｍＲＮＡ中の通常のスプライスアクセプ
タージャンクションの１〜約２５塩基対下流にその５’端を有するｍＲＮＡ配列を含み得
る。好ましい標的配列は、スプライス部位を含むプロセシングを受ける前のｍＲＮＡの任
意の領域であるか、またはエキソンコード配列内に完全に含有され、またはスプライスア
クセプターもしくはドナー部位にまたがる。オリゴマーが上記の様式で標的の核酸を標的
としているとき、オリゴマーはより一般に、生物学的に関連する標的、例えば、タンパク
質、ウイルス、または細菌を「標的として」いると言われる。
「モルホリノオリゴマー」または「ＰＭＯ」（ホスホロアミデートモルホリノオリゴマ
ーまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー）という用語は、モルホリノサブユ
ニット構造から構成されるオリゴヌクレオチド類似体を指し、（ｉ）構造は、１〜３個の
原子長、好ましくは２個の原子長であり、好ましくは荷電していないか、またはカチオン
性であり、１つのサブユニットのモルホリノ窒素と隣接するサブユニットの５’環外炭素
とを接合する、リン含有連結によって一緒に連結されており、（ｉｉ）各モルホリノ環は
、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリン
またはピリミジン塩基対合部分を担持する。例えば、好ましいホスホロジアミデート連結
タイプを示す図１Ａにおける構造を参照されたい。用語「モルホリノ環構造」は、用語「
モルホリノサブユニット」と交換可能に使用され得る。バリエーションが結合または活性
を妨害しない限り、この連結に対してバリエーションを作製することができる。例えば、
リンに付着している酸素は、硫黄で置換され得る（チオホスホロジアミデート）。５’酸
素は、アミノまたは低級アルキル置換アミノで置換されていてもよい。リンに付着してい
るペンダント窒素は、置換されていないか、（任意選択で置換されている）低級アルキル
で一置換、または二置換されていてもよい。下記のカチオン性連結についての考察をまた
参照されたい。プリンまたはピリミジン塩基対合部分は典型的には、アデニン、シトシン
、グアニン、ウラシル、チミンまたはイノシンである。モルホリノオリゴマーの合成、構
造、および結合特徴は、これらの全てが参照により本明細書中に組み込まれている米国特
許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同
第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、同第
５，５０６，３３７号、同第８，０７６，４７６号、同第８，２９９，２０６号および同
第７，９４３，７６２号（カチオン性連結）において詳述されている。修飾されたサブユ
ニット間連結および末端基は、これらの全内容が参照により本明細書中に組み込まれてい
るＰＴＣ出願ＵＳ２０１１／０３８４５９および公報ＷＯ／２０１１／１５０４０８にお
いて詳述されている。
「アミノ酸サブユニット」または「アミノ酸残基」は、α−アミノ酸残基（−ＣＯ−Ｃ
ＨＲ−ＮＨ−）またはβ−アミノ酸残基または他のアミノ酸残基（例えば、−ＣＯ−（Ｃ
Ｈ２）ｎＣＨＲ−ＮＨ−）を指すことができ、Ｒは、側鎖（水素を含み得る）であり、ｎ
は、１〜６、好ましくは１〜４である。
「天然アミノ酸」という用語は、天然に見出されるタンパク質中に存在するアミノ酸を
指す。「非天然アミノ酸」という用語は、天然に見出されるタンパク質において存在しな
いアミノ酸を指し、例には、ベータ−アラニン（β−Ａｌａ）、６−アミノヘキサン酸（
Ａｈｘ）および６−アミノペンタン酸を含む。
「天然核酸」という用語は、天然において見出される核酸を指す。典型的には、天然核
酸は、ホスホジエステル連結によって一緒に接合されたヌクレオチドのポリマー（それぞ
れが、プリンまたはピリミジン核酸塩基およびペントース糖を含有する）である。例示的
な天然核酸分子は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む。「非天然核酸」という用語は、天然に存
在しない核酸を指す。例えば、非天然核酸は、１種または複数の非天然の塩基、糖、およ
び／またはサブユニット間連結、例えば、天然核酸分子において見出されるものに関して
修飾または置換されている糖、塩基、および／または連結を含むことができる。例示的な
修飾は、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、非天然核酸は、複数
のタイプの修飾、例えば、糖および塩基の修飾、糖および連結の修飾、塩基および連結の
修飾、または塩基、糖、および連結の修飾を含む。好ましい実施形態において、本発明の
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非天然核酸分子である。例えば、いくつかの実施形
態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非天然（例えば、修飾または置換され
た）塩基を含有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは
、非天然（例えば、修飾または置換された）糖を含有する。いくつかの実施形態において
、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非天然（例えば、修飾または置換された）サブユ
ニット間連結を含有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは、複数のタイプの修飾または置換、例えば、非天然塩基および／または非天然糖、お
よび／または非天然サブユニット間連結を含有する。他の実施形態において、アンチセン
スオリゴヌクレオチドは、天然核酸分子の化学組成を有し、すなわち、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは、修飾または置換された塩基、糖、またはサブユニット間連結を含まな
い。化学組成に関わらず、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビトロで合
成され、生物由来のアンチセンス組成物を含まない。
「エキソン」は、タンパク質をコードする核酸の規定されたセクション、またはプロセ
シングを受ける前の（または前駆体）ＲＮＡのいずれかの一部がスプライシングによって
除去された後の成熟形態のＲＮＡ分子において示される核酸配列を指す。成熟ＲＮＡ分子
は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または機能的形態の非コードＲＮＡ、例えば、ｒ
ＲＮＡまたはｔＲＮＡでよい。ヒトジストロフィン遺伝子は、約７９のエキソンを有する
。
「イントロン」は、タンパク質に翻訳されない核酸領域（遺伝子内）を指す。イントロ
ンは、ｍＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）に転写され、それに続いて成熟ＲＮＡの形成の間
にスプライシングによって除去される非コードセクションである。
「有効量」または「治療有効量」は、単回用量として、または一連の用量の一部として
、所望の治療効果を生じさせるのに有効な、哺乳動物被験体に投与される治療化合物、例
えば、アンチセンスオリゴマーの量を指す。アンチセンスオリゴマーについて、この効果
は典型的には、選択した標的配列の翻訳または天然のスプライス−プロセシングを阻害す
ることによってもたらされる。
「エキソンスキッピング」は一般に、全エキソン、またはその一部が、所与のプロセシ
ングを受ける前のＲＮＡから除去され、それによって成熟ＲＮＡ、例えば、タンパク質に
翻訳される成熟ｍＲＮＡにおいて存在することから除外されるプロセスを指す。したがっ
て、スキッピングされるエキソンによって別途コードされるタンパク質の一部は、タンパ
ク質の発現した形態において存在せず、典型的には変化してはいるがまだ機能的形態であ
るタンパク質を生じさせる。ある特定の実施形態において、スキッピングされるエキソン
は、異常なスプライシングをさもないともたらすその配列における変異または他の変化を
含有し得る、ヒトジストロフィン遺伝子からの異常なエキソンである。ある特定の実施形
態において、スキッピングされるエキソンは、ジストロフィン遺伝子のエキソン１〜７９
の任意の１つまたは複数であるが、ヒトジストロフィン遺伝子のエキソン４４が好ましい
。
「ジストロフィン」は、ロッド形状の細胞質タンパク質であり、筋線維の細胞骨格と周
囲の細胞外マトリックスとを細胞膜を介して接続するタンパク質複合体の非常に重要な部
分である。ジストロフィンは、複数の機能的ドメインを含有する。例えば、ジストロフィ
ンは、約アミノ酸１４〜２４０においてアクチン結合ドメイン、および約アミノ酸２５３
〜３０４０において中央ロッドドメインを含有する。この大きな中央ドメインは、約１０
９アミノ酸の２４スペクトリン様三重らせんエレメントによって形成され、これはアルフ
ァ−アクチニンおよびスペクトリンとの相同性を有する。リピートは典型的には、またヒ
ンジ領域と称される４つのプロリンに富んだ非リピートセグメントによって中断される。
リピート１５および１６は、ジストロフィンのタンパク質分解性切断のための主要な部位
を提供するように思われる１８アミノ酸のストレッチによって分離されている。大部分の
リピートの間の配列同一性は、１０〜２５％の範囲である。１つのリピートは、３つのア
ルファ−ヘリックス：１、２および３を含有する。アルファ−ヘリックス１および３はそ
れぞれ、７つのヘリックスターンによって形成され、疎水性界面によってコイルドコイル
としておそらく相互作用する。アルファ−ヘリックス２はより複雑な構造を有し、グリシ
ンまたはプロリン残基によって分離される４つおよび３つのヘリックスターンのセグメン
トによって形成される。各リピートは２つのエキソンによってコードされ、アルファ−ヘ
リックス２の最初の部分におけるアミノ酸４７および４８の間のイントロンによって典型
的には中断される。他のイントロンは、リピートにおける異なる位置において見出され、
ヘリックス−３に亘って通常点在している。ジストロフィンはまた、約アミノ酸３０８０
〜３３６０において、システインに富んだセグメント（すなわち、２８０アミノ酸中の１
５システイン）を含めてシステインに富んだドメインを含有し、粘菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔ
ｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）のアルファ−アクチニンのＣ末端ドメインとの相同
性を示す。カルボキシ末端ドメインは、ほぼアミノ酸３３６１〜３６８５において存在す
る。
ジストロフィンのアミノ末端はＦ−アクチンに結合し、カルボキシ末端は筋細胞膜にお
いてジストロフィンが関連するタンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に結合する。ＤＡＰＣは、
ジストログリカン、サルコグリカン、インテグリンおよびカベオリンを含み、これらの構
成要素のいずれかにおける変異は、常染色体性遺伝した筋ジストロフィーをもたらす。ジ
ストロフィンが存在しないときＤＡＰＣは不安定化し、これはメンバータンパク質のレベ
ルの減少をもたらし、進行性の線維損傷および膜漏出に至る。様々な形態の筋ジストロフ
ィー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベッカー型筋ジストロ
フィー（ＢＭＤ）において、筋細胞は、主に遺伝子配列における変異（これは不正確なス
プライシングをもたらす）によって、変化した機能的に欠陥のある形態のジストロフィン
を産生するか、またはジストロフィンを全く産生しない。欠陥のあるジストロフィンタン
パク質の優勢な発現、またはジストロフィンもしくはジストロフィン様タンパク質の完全
な欠乏は、上で述べたように筋変性の急速な進行をもたらす。これに関しては、「欠陥の
ある」ジストロフィンタンパク質は、当技術分野において公知のようにＤＭＤもしくはＢ
ＭＤを有する特定の被験体において産生されるジストロフィンの形態によって、または検
出可能なジストロフィンが存在しないことによって特徴付けられ得る。
本明細書において使用する場合、「機能」および「機能的」などという用語は、生物学
的、酵素的、または治療的機能を指す。
「機能的」ジストロフィンタンパク質は一般に、典型的にはＤＭＤまたはＢＭＤを有す
る特定の被験体において存在するジストロフィンタンパク質の変化した、または「欠陥の
ある」形態と比較して、別途筋ジストロフィーの特徴である筋組織の進行性の分解を低減
させるのに十分な生物活性を有するジストロフィンタンパク質を指す。ある特定の実施形
態において、機能的ジストロフィンタンパク質は、当技術分野で通例の技術によって測定
して、野性型ジストロフィンのインビトロまたはインビボでの生物活性の約１０％、２０
％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％（中間
の全ての整数を含めた）を有し得る。一例として、筋肉培養物におけるインビトロでのジ
ストロフィンに関連する活性は、筋管サイズ、筋原線維の組織化（または解体）、収縮能
、およびアセチルコリン受容体の自発的クラスター形成によって測定することができる（
例えば、Ｂｒｏｗｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１２巻：
２０９〜２１６頁、１９９９年を参照されたい）。動物モデルはまた、疾患の病因を研究
するための貴重なリソースであり、ジストロフィンに関連する活性を試験する手段を提供
する。ＤＭＤ研究のために最も広範に使用される動物モデルの２つは、ｍｄｘマウスおよ
びゴールデンレトリーバ筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）イヌであり、これらの両方は、ジ
ストロフィンネガティブである（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ ＆ Ｍｏｒｇａｎ、Ｉｎｔ
Ｊ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ、８４巻：１６５〜１７２頁、２００３年を参照されたい）。
これらおよび他の動物モデルを使用して、様々なジストロフィンタンパク質の機能的活性
を測定することができる。含まれるのは、ジストロフィンの切断型、例えば、特定の本発
明のエキソンスキッピングアンチセンス化合物によって産生される形態である。
「単離した」とは、その天然の状態において材料に通常伴う構成要素が実質的または本
質的にない材料を意味する。例えば、「単離したポリヌクレオチド」は、本明細書におい
て使用する場合、天然の状態においてポリヌクレオチドに隣接する配列から精製または取
り出されたポリヌクレオチド、例えば、フラグメントに通常隣接する配列から取り出され
たＤＮＡフラグメントを指し得る。
本明細書において使用する場合、「十分な長さ」とは、標的ジストロフィンプレｍＲＮ
Ａにおける少なくとも８、より典型的には８〜３０の連続的な核酸塩基に対して相補的で
あるアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、十分な長さ
のアンチセンスは、標的ジストロフィンプレｍＲＮＡにおいて少なくとも８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０またはそれより多い連続的な核酸塩基を含む
。他の実施形態において、十分な長さのアンチセンスは、標的ジストロフィンプレｍＲＮ
Ａにおいて少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または
２５の連続的な核酸塩基を含む。十分な長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、エキ
ソン４４に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも最小の数のヌクレオチド
を有する。好ましくは、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、１０、１１、１２、１３、
１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２
７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９および
４０またはそれより多いヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含めた、長さが約１０〜約
５０のヌクレオチドである。一実施形態において、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、
長さが１０〜約３０のヌクレオチドである。別の実施形態において、十分な長さのオリゴ
ヌクレオチドは、長さが１５〜約２５のヌクレオチドである。さらに別の実施形態におい
て、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、長さが２０〜３０、または２０〜５０のヌクレ
オチドである。さらに別の実施形態において、十分な長さのオリゴヌクレオチドは、長さ
が２２〜２５、２２〜２８、２４〜２８、２４〜２９、２５〜２８、２０〜３０または２
５〜３０のヌクレオチドである。
「増強する」もしくは「増強すること」または「増大する」もしくは「増大すること」
または「刺激する」もしくは「刺激すること」とは一般に、アンチセンス化合物なしまた
は対照化合物によってもたらされる反応と比較して、細胞または被験体においてより大き
な生理学的反応（すなわち、下流の効果）を生じさせるか、またはもたらす１つまたは複
数のアンチセンス化合物または組成物の能力を指す。測定可能な生理学的反応は、当技術
分野における理解および本明細書における記載から明らかな他の反応の中で、筋組織にお
ける機能的形態のジストロフィンタンパク質の発現の増大、またはジストロフィンに関連
する生物活性の増大を含み得る。約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、
９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１
９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６
５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％だけの筋機能
における増大または改善を含めて、筋機能の増大はまた測定することができる。筋線維の
約１％、２％、％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％
、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％
、８５％、９０％、９５％、または１００％におけるジストロフィン発現の増大を含めて
、機能的ジストロフィンを発現している筋線維の百分率をまた測定することができる。例
えば、線維の２５〜３０％が、ジストロフィンを発現している場合、概ね４０％の筋機能
の改善が起こり得ることが示されてきた（例えば、ＤｅｌｌｏＲｕｓｓｏら、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９巻：１２９７９〜１２９８４頁、２００２年
を参照されたい）。「増大された」または「増強された」量は典型的には、「統計的に有
意な」量であり、アンチセンス化合物なし（薬剤が存在しないこと）または対照化合物に
よってもたらされる量の１．１倍、１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８
倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれを超える（例え
ば、５００倍、１０００倍）（１の間および１を超える全ての整数および小数点を含めた
、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）である増大を含み得る。
「低減する」または「阻害する」という用語は、診断の技術分野における通例の技術に
よって測定して、関連する生理学的反応または細胞反応、例えば、本明細書に記載されて
いる疾患もしくは状態の症状を「減少させる」１種または複数の本発明のアンチセンス化
合物の能力に関し得る。関連する生理学的反応または細胞反応（インビボもしくはインビ
トロ）は、当業者には明らかであり、筋ジストロフィーの症状もしくは病理学における低
減、または欠陥のある形態のジストロフィン、例えば、ＤＭＤもしくはＢＭＤを有する個
体において発現している変化した形態のジストロフィンの発現における低減を含み得る。
反応における「減少」は、非アンチセンス化合物または対照組成物によって生じる反応と
比較して統計的に有意であり得、中間の全ての整数を含めた、１％、２％、３％、４％、
５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１
６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５
０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、ま
たは１００％の減少を含み得る。
また含まれるのは、本発明のオリゴマーのジストロフィン標的化配列を発現することが
できるベクター送達系、例えば、本明細書に記載のような配列番号１〜１２、４６および
４７の任意の１つまたは複数を含むポリヌクレオチド配列を発現するベクターである。「
ベクター」または「核酸構築物」とは、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、酵母
またはウイルスに由来し、ポリヌクレオチドがその中に挿入またはクローニングすること
ができる、ポリヌクレオチド分子、好ましくはＤＮＡ分子を意味する。ベクターは好まし
くは、１つまたは複数の独特な制限部位を含有し、標的細胞もしくは組織または前駆細胞
もしくはその組織を含めた規定された宿主細胞において自律複製することができるか、あ
るいはクローニングされた配列が、再現性があるように確定した宿主のゲノムと組み込み
可能であることができる。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、その
複製が染色体の複製と無関係である染色体外実体として存在するベクター、例えば、直鎖
状もしくは閉環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体でよ
い。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有することができる。代わ
りに、ベクターは、宿主細胞中に導入されたとき、ゲノム中に組み込まれ、かつその中に
ベクターが組み込まれている染色体（複数可）と一緒に複製されるものでよい。
個体（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）または細胞の「処置」は、個体または細胞の
自然の成り行きを変化させる試みにおいて使用される任意のタイプの介入である。処置に
は、これらに限定されないが、医薬組成物の投与が含まれ、予防的に、または病的事象の
開始もしくは病原体との接触に続いて行い得る。処置は、特定の形態の筋ジストロフィー
におけるように、ジストロフィンタンパク質と関連する疾患または状態の症状または病理
学に対して任意の望ましい効果を含み、例えば、処置される疾患または状態の１つまたは
複数の測定可能なマーカーにおける最小の変化または改善を含み得る。また含まれるのは
、処置されている疾患もしくは状態の進行の速度を低減させ、その疾患もしくは状態の発
症を遅延するか、またはその発症の重症度を低減させることに向けることができる「予防
的」処置である。「処置」または「予防法」は、疾患もしくは状態、またはその関連する
症状の完全な根絶、治癒、または予防を必ずしも示さない。
したがって、含まれるのは、任意選択で医薬製剤または剤形の部分として、１つまたは
複数の本発明のアンチセンスオリゴマー（例えば、配列番号１〜１２、４６および４７、
ならびにそのバリアント）を、それを必要とする被験体に投与することによって、筋ジス
トロフィー、例えば、ＤＭＤおよびＢＭＤを処置する方法である。また含まれるのは、１
つまたは複数のアンチセンスオリゴマーを投与することによって、被験体においてエキソ
ンスキッピングを誘発する方法であり、エキソンは、ジストロフィン遺伝子、好ましくは
ヒトジストロフィン遺伝子からのエキソン４４である。「被験体」は、本明細書において
使用する場合、本発明のアンチセンス化合物で処置することができる、症状を示すか、ま
たは症状を示す危険性がある任意の動物を含み、例えば、ＤＭＤもしくはＢＭＤ、または
これらの状態と関連する症状のいずれか（例えば、筋線維の喪失）を有するか、または有
する危険性がある被験体である。適切な被験体（患者）は、実験動物（例えば、マウス、
ラット、ウサギ、もしくはモルモット）、家畜、および家庭の動物またはペット（例えば
、ネコもしくはイヌ）を含む。ヒトではない霊長類、および好ましくは、ヒト患者が含ま
れる。
「アルキル」または「アルキレン」は両方とも、１〜１８個の炭素を含有する飽和直鎖
または分岐鎖の炭化水素ラジカルを指す。例には、これらに限定されないが、メチル、エ
チル、プロピル、イソ−プロピル、ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペン
チルおよびｎ−ヘキシルが含まれる。「低級アルキル」という用語は、１〜８個の炭素を
含有する本明細書に定義されているようなアルキル基を指す。
「アルケニル」は、２〜１８個の炭素を含有し、かつ少なくとも１つの炭素−炭素二重
結合を含む、不飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを指す。例には、これらに限定
されないが、エテニル、プロペニル、イソ−プロペニル、ブテニル、イソ−ブテニル、ｔ
ｅｒｔ−ブテニル、ｎ−ペンテニルおよびｎ−ヘキセニルが含まれる。「低級アルケニル
」という用語は、２〜８個の炭素を含有する本明細書に定義されているようなアルケニル
基を指す。
「アルキニル」は、２〜１８個の炭素を含有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合
を含む、不飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを指す。例には、これらに限定され
ないが、エチニル、プロピニル、イソ−プロピニル、ブチニル、イソ−ブチニル、ｔｅｒ
ｔ−ブチニル、ペンチニルおよびヘキシニルが含まれる。「低級アルキニル」という用語
は、２〜８個の炭素を含有する本明細書に定義されているようなアルキニル基を指す。
「シクロアルキル」は、単環式または多環式アルキルラジカルを指す。例には、これら
に限定されないが、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルお
よびシクロオクチルが含まれる。
「アリール」は、１８個までの炭素を含有し、１つまたは複数の閉環（複数可）を有す
る環状芳香族炭化水素部分を指す。例には、これらに限定されないが、フェニル、ベンジ
ル、ナフチル、アントラセニル、フェナントラセニルおよびビフェニルが含まれる。
「アラルキル」は、式ＲａＲｂのラジカルを指し、Ｒａは、上記に定義されているよう
なアルキレン鎖であり、Ｒｂは、１つまたは複数の上記に定義されているようなアリール
ラジカル、例えば、ベンジル、ジフェニルメチルなどである。
「チオアルコキシ」は、式−ＳＲｃのラジカルを指し、Ｒｃは、本明細書に定義されて
いるようなアルキルラジカルである。「低級チオアルコキシ」という用語は、１〜８個の
炭素を含有する本明細書に定義されているようなアルコキシ基を指す。
「アルコキシ」は、式−ＯＲｄａのラジカルを指し、Ｒｄは、本明細書に定義されてい
るようなアルキルラジカルである。「低級アルコキシ」という用語は、１〜８個の炭素を
含有する本明細書に定義されているようなアルコキシ基を指す。アルコキシ基の例には、
これらに限定されないが、メトキシおよびエトキシが含まれる。
「アルコキシアルキル」は、アルコキシ基で置換されているアルキル基を指す。
「カルボニル」は、Ｃ（＝Ｏ）−ラジカルを指す。
「グアニジニル」は、Ｈ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ２）−ＮＨ−ラジカルを指す。
「アミジニル」は、Ｈ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ２）ＣＨ−ラジカルを指す。
「アミノ」は、ＮＨ２ラジカルを指す。
「アルキルアミノ」は、式−ＮＨＲｄまたは−ＮＲｄＲｄのラジカルを指し、各Ｒｄは
、独立に、本明細書に定義されているようなアルキルラジカルである。「低級アルキルア
ミノ」という用語は、１〜８個の炭素を含有する本明細書に定義されているようなアルキ
ルアミノ基を指す。
「複素環」とは、飽和、不飽和、または芳香族であり、窒素、酸素および硫黄から独立
に選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する、５〜７員単環式、または７〜１０員二環
式の複素環式環を意味し、窒素および硫黄ヘテロ原子は、任意選択で酸化されてもよく、
窒素ヘテロ原子は、任意選択で四級化されてもよく、上記の複素環のいずれかがベンゼン
環に縮合している二環式環を含む。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して
付着し得る。複素環は、下記に定義するようなヘテロアリールを含む。このように、下記
に列挙したヘテロアリールに加えて、複素環はまた、モルホリニル、ピロリジノニル、ピ
ロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシ
ラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピ
リジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミ
ジニル、テトラヒドロチオピラニルなどを含む。
「ヘテロアリール」は、窒素、酸素および硫黄から選択される少なくとも１個のヘテロ
原子を有し、少なくとも１個の炭素原子を含有する５〜１０員の芳香族複素環式環を意味
し、単環式環および二環式環系の両方を含む。代表的なヘテロアリールは、ピリジル、フ
リル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、キノリニル、ピロリル、イ
ンドリル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、チ
アゾリル、ベンゾチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダ
ジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シンノリニル、フタラジニル、およ
びキナゾリニルである。
「任意選択で置換されているアルキル」、「任意選択で置換されているアルケニル」、
「任意選択で置換されているアルコキシ」、「任意選択で置換されているチオアルコキシ
」、「任意選択で置換されているアルキルアミノ」、「任意選択で置換されている低級ア
ルキル」、「任意選択で置換されている低級アルケニル」、「任意選択で置換されている
低級アルコキシ」、「任意選択で置換されている低級チオアルコキシ」、「任意選択で置
換されている低級アルキルアミノ」および「任意選択で置換されているヘテロシクリル」
という用語は、置換されているとき、少なくとも１個の水素原子が置換基で置き換えられ
ていることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２個の水素原子が置換されている
。これに関しては、置換基は、重水素、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で
置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換され
ているアリール、任意選択で置換されている複素環、任意選択で置換されているシクロア
ルキル、オキソ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲｘ、ＮＲｘＲｙ、ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、Ｎ
ＲｘＳＯ２Ｒｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、
Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｍＲｘおよび−ＳＯｍＮＲｘＲｙを含み、式中、ｍは、０
、１または２であり、ＲｘおよびＲｙは、同じまたは異なり、独立に、水素、任意選択で
置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されて
いるアルキニル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されている複素環
または任意選択で置換されているシクロアルキルであり、前記任意選択で置換されている
アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル
、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されている複素環および任意選択
で置換されているシクロアルキル置換基のそれぞれは、オキソ、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｏ
Ｒｘ、ＮＲｘＲｙ、ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）ＮＲ
ｘＲｙ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｍＲｘおよ
び−ＳＯｍＮＲｘＲｙの１つまたは複数でさらに置換され得る。
アンチセンス分子の命名システムは、異なるアンチセンス分子を区別するために提案お
よび公開された（Ｍａｎｎら（２００２年）、Ｊ Ｇｅｎ Ｍｅｄ、４巻、６４４〜６５
４頁を参照されたい）。下記に示すように、全てが同じ標的領域に向いているいくつかの
僅かに異なるアンチセンス分子を試験するときに、この命名法は特に意味を持った。
Ｈ＃Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）。
最初の文字は、種（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス、Ｃ：イヌ）を指定する。「＃」は
、標的ジストロフィンエキソン数を指定する。「Ａ／Ｄ」は、それぞれ、エキソンの始ま
りおよび終わりにおけるアクセプターまたはドナースプライス部位を示す。（ｘｙ）は、
アニーリング座標を表し、「−」または「＋」は、それぞれ、イントロンまたはエキソン
配列を示す。例えば、Ａ（−６＋１８）は、標的エキソンに先行するイントロンの最後の
６塩基、および標的エキソンの最初の１８塩基を示す。最も近いスプライス部位はアクセ
プターであり、そのためこれらの座標は、「Ａ」が先行する。ドナースプライス部位にお
けるアニーリング座標の記載は、Ｄ（＋２−１８）でよく、最後の２エキソン塩基および
最初の１８イントロン塩基は、アンチセンス分子のアニーリング部位に対応する。完全な
エキソンアニーリング座標は、Ａ（＋６５＋８５）によって表され、すなわち、そのエキ
ソンの開始からの６５番目および８５番目のヌクレオチドの間の部位である。
ＩＩ．アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンス分子（複数可）がプレｍＲＮＡ配列内のエキソンのスプライシングに関与
するヌクレオチド配列を標的とするとき、エキソンの通常のスプライシングは阻害され、
スプライシング機構が成熟ｍＲＮＡからの標的とされた全エキソンを迂回し得る。多くの
遺伝子において、全エキソンの欠失は、重要な機能的ドメインの喪失、またはリーディン
グフレームの撹乱によって非機能タンパク質の産生をもたらす。しかし、いくつかのタン
パク質において、リーディングフレームを撹乱することなく、かつタンパク質の生物活性
を重大に変化させることなく、タンパク質内から１つまたは複数のエキソンを欠失させる
ことによってタンパク質を短くすることが可能である。典型的には、このようなタンパク
質は、構造的役割を有し、かつ／またはこれらの末端において機能的ドメインを持つ。デ
ュシェンヌ型筋ジストロフィーは、典型的にはリーディングフレームを撹乱することによ
って、機能的ジストロフィン遺伝子産物の合成を妨げる変異から生じる。変異を含有する
ジストロフィン遺伝子の領域のエキソンスキッピングを誘発するアンチセンスオリゴヌク
レオチドは、筋細胞が機能的ジストロフィンタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡ転写物
を産生することを可能にすることができる。このように得られたジストロフィンタンパク
質は、必ずしもジストロフィンの「野性型」形態ではないが、むしろ切断されているが機
能的または半機能的形態のジストロフィンである。本発明は、エキソン４４における指定
したジストロフィンプレｍＲＮＡ標的に結合し、かつその遺伝子のプロセシングを再指向
させることができるアンチセンス分子について記載する。
特に、本発明は、下記：Ｈ４４Ａ（−０７＋１７）、Ｈ４４Ａ（−０７＋２０）、Ｈ４
４Ａ（−０７＋２２）、Ｈ４４Ａ（−８＋１５）、Ｈ４４Ａ（−７＋１５）、Ｈ４４Ａ（
−６＋１５）、Ｈ４４Ａ（−８＋１７）、Ｈ４４Ａ（−６＋１７）、Ｈ４４Ａ（＋７７＋
１０１）、Ｈ４４Ａ（＋６４＋９１）、Ｈ４４Ａ（＋６２＋８９）、Ｈ４４Ａ（＋６２＋
８５）、Ｈ４４Ａ（−１３＋１４）、Ｈ４４Ａ（−１４＋１５）から選択されるアニーリ
ング部位と指定されるジストロフィン遺伝子のエキソン４４標的領域に対して相補的であ
る少なくとも１０、１２、１５、１７、２０またはそれより多い連続したヌクレオチドを
含めた、長さが２０〜５０のヌクレオチドの単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド
に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アニーリング部位に特異的にハイブリダ
イズし、エキソン４４スキッピングを誘発する。
安定的および特異的な結合が、オリゴヌクレオチドおよび標的の間に起こるように、各
分子における十分な数の対応する位置が互いに水素結合することができるヌクレオチドに
よって占有されるとき、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび標的ＲＮＡは、互いに相
補的である。このように、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、安定的
および特異的結合が、オリゴヌクレオチドおよび標的の間に起こるように、十分な程度の
相補性または正確な対合を示すために使用される用語である。アンチセンス分子の配列は
、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的配列の配列に対して１００％相補
的である必要はないことは当技術分野で理解される。標的分子へのオリゴヌクレオチドの
結合が標的ＲＮＡの通常の機能を妨げ、かつ特異的結合が望ましい条件下で、すなわち、
インビボアッセイまたは治療的処置の場合は生理学的条件下で、およびインビトロのアッ
セイの場合はアッセイが行われる条件下で、非標的配列へのアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの非特異的結合を回避する十分な程度の相補性が存在するとき、アンチセンス分子は
、特異的にハイブリダイズ可能である。
アンチセンス分子の長さは、プレｍＲＮＡ分子内の意図する場所に選択的に結合するこ
とができる限り変化し得る。このような配列の長さは、本明細書に記載されている選択手
順によって決定することができる。一般に、アンチセンス分子は、長さが約１０のヌクレ
オチドから約５０のヌクレオチドまでである。しかし、この範囲内のヌクレオチドの任意
の長さは、この方法において使用し得ることが認識される。好ましくは、アンチセンス分
子の長さは、長さが１０〜３０のヌクレオチドである。
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、長さが２０〜５０のヌクレオチ
ドであり、配列番号１〜１２、４６および４７のいずれかの少なくとも１０、１２、１５
、１７、２０またはそれより多いヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、配
列番号１〜１２、４６および４７におけるチミン塩基は、任意選択でウラシルである。
エキソン欠失は、短縮された転写ｍＲＮＡにおいてリーディングフレームのシフトをも
たらすべきではない。このように、３つのエキソンの直鎖状配列において、第１のエキソ
ンの終わりがコドンにおける３つのヌクレオチドのうちの２つをコードし、次のエキソン
が欠失している場合、直鎖状配列における第３のエキソンはコドンのためのヌクレオチド
トリプレットを完成させることができる単一のヌクレオチドで始まらなくてはならない。
第３のエキソンが単一のヌクレオチドで始まらない場合、リーディングフレームのシフト
が起こり、これは切断型または非機能タンパク質の生成をもたらす。
構造タンパク質におけるエキソンの終わりにおけるコドン配置は、コドンの終わりにお
いて必ずしも切断し得ず、結果的に、ｍＲＮＡのインフレームのリーディングを確実にす
るためにプレｍＲＮＡから複数種のエキソンを欠失させる必要性があり得ることを認識さ
れたい。このような状況において、複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の
方法によって選択する必要があり得、それぞれは、欠失させるエキソンにおけるスプライ
シングの誘発に関与する異なる領域を対象とする。
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然核酸分子の化
学組成を有し、すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾または置換された塩
基、糖、またはサブユニット間連結を含まない。好ましい実施形態において、本発明のア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、非天然核酸分子である。例えば、非天然核酸は、１つ
または複数の非天然の塩基、糖、および／またはサブユニット間連結、例えば、天然核酸
分子において見出されるものに対して修飾または置換されている塩基、糖、および／また
は連結を含むことができる。例示的な修飾を、下記に記載する。いくつかの実施形態にお
いて、非天然核酸は、複数のタイプの修飾、例えば、糖および塩基の修飾、糖および連結
の修飾、塩基および連結の修飾、または塩基、糖、および連結の修飾を含む。例えば、い
くつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非天然（例えば、修飾
または置換された）塩基を含有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、非天然（例えば、修飾または置換された）糖を含有する。いくつかの実
施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非天然（例えば、修飾または置換
された）サブユニット間連結を含有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドは、複数のタイプの修飾または置換、例えば、非天然塩基および／また
は非天然糖、および／または非天然サブユニット間連結を含有する。
アンチセンス分子との二重鎖形成の間の、プレｍＲＮＡの分解を回避するために、アン
チセンス分子は、内因性ＲＮａｓｅ Ｈによる切断を最小化または防止するように適合し
得る。細胞内での、またはＲＮａｓｅ Ｈを含有する粗抽出物中の非メチル化オリゴヌク
レオチドによるＲＮＡの処理は、プレｍＲＮＡ：アンチセンスオリゴヌクレオチド二重鎖
の分解をもたらすため、この特性は高度に好ましい。迂回することができるか、またはこ
のような分解を誘発しないことができる修飾されたアンチセンス分子の任意の形態を本方
法において使用し得る。ＲＮＡと二重鎖化したとき、細胞のＲＮａｓｅ Ｈによって切断
されないアンチセンス分子の一例は、２’−Ｏ−メチル誘導体である。２’−Ｏ−メチル
−オリゴリボヌクレオチドは、細胞環境および動物組織において非常に安定的であり、Ｒ
ＮＡとのこれらの二重鎖は、これらのリボ−またはデオキシリボ−対応物より高いＴｍ値
を有する。２’ヒドロキシリボース位置のメチル化、およびホスホロチオエート骨格の組
込みは、ＲＮＡに表面上は似ているが、ヌクレアーゼ分解に対して非常により耐性である
分子を生成するための一般のストラテジである。
ＲＮａｓｅ Ｈを活性化しないアンチセンス分子は、公知の技術によって作製すること
ができる（例えば、米国特許第５，１４９，７９７号を参照されたい）。デオキシリボヌ
クレオチドまたはリボヌクレオチド配列であり得るこのようなアンチセンス分子は、その
１メンバーとしてオリゴヌクレオチドを含有する二重鎖分子へのＲＮａｓｅ Ｈの結合を
立体的に妨害または防止する任意の構造的修飾を単純に含有し、この構造的修飾は、二重
鎖形成を実質的に妨害または撹乱しない。二重鎖形成に関与するオリゴヌクレオチドの一
部は、二重鎖へのＲＮａｓｅ Ｈ結合に関与するそれらの一部と実質的に異なるため、Ｒ
Ｎａｓｅ Ｈを活性化しない多数のアンチセンス分子が利用可能である。例えば、このよ
うなアンチセンス分子は、オリゴヌクレオチドでよく、ヌクレオチド間架橋ホスフェート
残基の少なくとも１つ、または全ては、修飾されたホスフェート、例えば、メチルホスホ
ネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート
およびホスホロアミデートである。例えば、ヌクレオチド間架橋ホスフェート残基のどれ
もが、記載されているように修飾され得る。別の非限定的例において、このようなアンチ
センス分子は、ヌクレオチドの少なくとも１つ、または全てが、２’低級アルキル部分を
含有する分子である（例えば、Ｃ１〜Ｃ４直鎖状または分岐状の飽和または不飽和のアル
キル、例えば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１−プロペニル、２−プロペニル
、およびイソプロピル）。例えば、ヌクレオチドのどれもが、記載されているように修飾
され得る。
本発明において有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドの具体例には、修飾された骨格
または非天然サブユニット間連結を含有するオリゴヌクレオチドを含む。修飾された骨格
を有するオリゴヌクレオチドは、骨格においてリン原子を保持するもの、および骨格にお
いてリン原子を有さないものを含む。これらのヌクレオシド間骨格においてリン原子を有
さない修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオシドであると考えることが
できる。
他のアンチセンス分子において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間連結の両
方、すなわち、骨格は、新規な基で置き換えられている。塩基単位は、適当な核酸標的化
合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのこのようなオリゴマー化合
物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されてきたオリゴヌクレオチド
模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオ
チドの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられてい
る。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合
している。
修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、１つまたは複数の置換された糖部分を含有し得
る。
オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（当技術分野で単純に「塩基」と称されることが
多い）の修飾または置換を含み得る。修飾または置換された塩基を含有するオリゴヌクレ
オチドは、核酸において最も一般に見出される１つまたは複数のプリンまたはピリミジン
塩基がより一般でない塩基または非天然の塩基で置き換えられているオリゴヌクレオチド
を含む。
プリン塩基は、一般式：
によって記載されるようなイミダゾール環に縮合したピリミジン環を含む。
アデニンおよびグアニンは、核酸において最も一般に見出される２つのプリン核酸塩基で
ある。これらは、これらに限定されないが、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ２−メチルグアニ
ン、ヒポキサンチン、および７−メチルグアニンを含めた他の天然プリンで置換され得る
。
ピリミジン塩基は、一般式：
によって記載されるような６員ピリミジン環を含む。
シトシン、ウラシル、およびチミンは、核酸において最も一般に見出されるピリミジン塩
基である。これらは、これらに限定されないが、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメ
チルシトシン、プソイドウラシル、および４−チオウラシルを含めた他の天然ピリミジン
で置換され得る。一実施形態において、本明細書に記載されているオリゴヌクレオチドは
、ウラシルの代わりにチミン塩基を含有する。
他の修飾または置換された塩基には、これらに限定されないが、２，６−ジアミノプリ
ン、オロト酸、アグマチジン、リシジン、２−チオピリミジン（例えば、２−チオウラシ
ル、２−チオチミン）、Ｇ−クランプおよびその誘導体、５−置換ピリミジン（例えば、
５−ハロウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチ
ルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキ
シメチルシトシン、Ｓｕｐｅｒ Ｔ）、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、７−
アザ−２，６−ジアミノプリン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザ
アデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、Ｓｕｐｅｒ Ｇ、Ｓｕｐｅ
ｒ Ａ、およびＮ４−エチルシトシン、またはその誘導体；Ｎ２−シクロペンチルグアニ
ン（ｃＰｅｎｔ−Ｇ）、Ｎ２−シクロペンチル−２−アミノプリン（ｃＰｅｎｔ−ＡＰ）
、およびＮ２−プロピル−２−アミノプリン（Ｐｒ−ＡＰ）、プソイドウラシルまたはそ
の誘導体；ならびに縮重塩基もしくはユニバーサル塩基、例えば、２，６−ジフルオロト
ルエン、または非存在塩基、例えば、脱塩基部位（例えば、１−デオキシリボース、１，
２−ジデオキシリボース、１−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボース；またはピロリジン誘
導体（ここで環酸素が窒素で置き換えられている（アザリボース）））が含まれる。Ｓｕ
ｐｅｒ Ａ、Ｓｕｐｅｒ ＧおよびＳｕｐｅｒ Ｔの誘導体の例は、参照により本明細書
において完全に組み込まれている米国特許第６，６８３，１７３号（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において見出すことができる。ｃＰｅｎｔ−Ｇ、ｃＰｅｎｔ−ＡＰお
よびＰｒ−ＡＰは、ｓｉＲＮＡに組み込まれたときに免疫賦活性効果を低減させることが
示された（Ｐｅａｃｏｃｋ Ｈ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、２０１１年
、１３３巻、９２００頁）。プソイドウラシルは、ウリジンにおけるように通常のＮ−グ
リコシドよりむしろＣ−グリコシドを伴うウラシルの天然異性化バージョンである。プソ
イドウリジン含有合成ｍＲＮＡは、ウリジン含有ｍＰｖＮＡと比較して改善された安全性
プロファイルを有し得る（本明細書において参照によりその全体が組み込まれているＷＯ
２００９１２７２３０）。
特定の修飾または置換された核酸塩基は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの
結合親和性を増大させるために特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−ア
ザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルア
デニンを含めた）、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む。５−
メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃だけ増大させることが示さ
れてきており、さらにより特定すると２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と合わせたときに
、現在好ましい塩基置換である。
いくつかの実施形態において、修飾または置換された核酸塩基は、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの精製を促進するために有用である。例えば、ある特定の実施形態において
、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３つまたはそれより多い（例えば、３つ、４つ、
５つ、６つまたはそれより多い）連続したグアニン塩基を含有し得る。特定のアンチセン
スオリゴヌクレオチドにおいて、一続きになった３つまたはそれより多い連続したグアニ
ン塩基は、オリゴヌクレオチドの凝集をもたらし、精製を複雑化し得る。このようなアン
チセンスオリゴヌクレオチドにおいて、連続したグアニンの１つまたは複数は、イノシン
で置換することができる。一続きになった３つまたはそれより多い連続したグアニン塩基
において１つまたは複数のグアニンをイノシンで置換することは、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドの凝集を低減させ、それによって精製を促進することができる。
一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオ
チドに、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを増強させる１つまたは
複数の部分または結合体を化学的に連結することを伴う。このような部分には、これらに
限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例
えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデ
カンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グ
リセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリ
セロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダ
マンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カル
ボニル−オキシコレステロール部分が含まれる。
所与の化合物における全ての位置が均一に修飾されることは必要ではなく、実際、上記
の修飾のうちの１つより多くを、単一の化合物において、またはそれどころかオリゴヌク
レオチド内の単一のヌクレオシドにおいて組み込み得る。本発明はまた、キメラ化合物で
あるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。「キメラ」アンチセンス化合物または「キ
メラ」は、本発明の状況において、アンチセンス分子、特に、オリゴヌクレオチドであり
、これはそれぞれが、少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、オリゴヌクレオチド化
合物の場合はヌクレオチドで構成されている、２つ以上の化学的に別個の領域を含有する
。これらのオリゴヌクレオチドは典型的には、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ分解へ
の耐性の増大、細胞取込みの増大を付与するように修飾されている少なくとも１つの領域
と、標的核酸に対する結合親和性の増大のためのさらなる領域とを含有する。
本発明によって使用されるアンチセンス分子は、固相合成の周知の技術によって好都合
かつ慣例通りに作製され得る。このような合成のための設備は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を含めたいくつかの
供給業者によって販売されている。修飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成
するための１つの方法は、米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。
当技術分野において公知のこのような合成のための任意の他の手段を、加えてまたは代
わりに用い得る。オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートおよびアルキル化さ
れた誘導体を調製するのに同様の技術を使用することは周知である。１つのこのような自
動化された実施形態において、ジエチル−ホスホラミダイトは出発材料として使用され、
Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２巻
：１８５９〜１８６２頁によって記載されているように合成され得る。
本発明のアンチセンス分子はインビトロで合成され、生物由来のアンチセンス組成物を
含まない。本発明の分子はまた、取込み、分布および／または吸収を助けるために、例え
ば、リポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所または他の製剤として、他の分子
、分子構造または化合物の混合物と混合され、カプセル化され、結合体化され、または他
の方法で会合され得る。
Ａ．モルホリノオリゴマー
リン含有骨格連結を有するモルホリノオリゴマーに関する本発明の例示的実施形態を、
図１Ａ〜１Ｃにおいて例示する。一実施形態において、図１Ｃに示されているようなホス
ホロジアミデート連結したモルホリノオリゴマーであり、本発明の一態様によると、修飾
されて、好ましくはその骨格連結の１０％〜５０％において正に荷電している基を含有す
る。アンチセンスオリゴマーを含めた、荷電していない骨格連結を有するモルホリノオリ
ゴマーは、例えば、これらの全てが参照により本明細書において明確に組み込まれている
（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、１９９７年）において、ならびに共有の米国
特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、
同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同
第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号、同第８，０７６，４７６号、同第
８，２９９，２０６号および同第７，９４３，７６２号において詳述されている。荷電し
ている連結を含めた修飾されている連結を有するモルホリノオリゴマーは、ＵＳＳＮ：１
３／１１８，２９８（参照により本明細書中に組み込まれている）に見出され得る。
モルホリノをベースとするサブユニットの重要な特性には、１）オリゴマー形態で安定
的な荷電していない、または正に荷電している骨格連結によって連結される能力；２）形
成されたポリマーが、相対的に短いオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜１５の塩基）に
おける約４５℃超のＴｍ値の標的ＲＮＡを含めた相補的塩基標的核酸とハイブリダイズす
ることができるように、ヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チ
ミジン、ウラシルおよびイノシン）を支持する能力；３）オリゴヌクレオチドが哺乳動物
細胞中に能動的または受動的に輸送される能力；ならびに４）それぞれ、リボヌクレアー
ゼおよびリボヌクレアーゼＨ分解に抵抗するアンチセンスオリゴヌクレオチド：ＲＮＡヘ
テロ二重鎖の能力が含まれる。
特許請求した主題のアンチセンスオリゴヌクレオチドについての例示的な骨格構造は、
それぞれ荷電していないまたは正に荷電しているリン含有サブユニット連結によって連結
している図１Ｄ〜Ｇにおいて示すモルホリノサブユニットタイプを含む。図１Ｄは、５原
子繰返し単位骨格を形成するリン含有連結を示し、モルホリノ環は、１原子ホスホアミド
連結によって連結している。図１Ｅは、６原子繰返し単位骨格を生じさせる連結を示す。
この構造において、５’モルホリノ炭素をリン基と連結する原子Ｙは、硫黄、窒素、炭素
、または好ましくは酸素であり得る。リンからペンダントであるＸ部分は、フッ素、アル
キルもしくは置換アルキル、アルコキシもしくは置換アルコキシ、チオアルコキシもしく
は置換チオアルコキシ、または非置換、一置換、もしくは二置換窒素（モルホリンもしく
はピペリジンなどの環状構造を含む）であり得る。アルキル、アルコキシおよびチオアル
コキシは好ましくは、１〜６個の炭素原子を含む。Ｚ部分は硫黄または酸素であり、好ま
しくは酸素である。
図１Ｆおよび１Ｇにおいて示される連結は、７原子単位長さの骨格のために設計される
。構造１Ｆにおいて、Ｘ部分は、構造１Ｅにおける通りであり、Ｙ部分は、メチレン、硫
黄、または好ましくは、酸素であり得る。構造１Ｇにおいて、Ｘ部分およびＹ部分は、構
造１Ｅにおける通りである。特に好ましいモルホリノオリゴヌクレオチドは、図１Ｅにお
いて示される形態のモルホリノサブユニット構造から構成されるものを含み、Ｘ＝ＮＨ２
、Ｎ（ＣＨ３）２、または１−ピペラジンまたは他の荷電している基であり、Ｙ＝Ｏであ
り、Ｚ＝Ｏである。
実質的に荷電していないオリゴヌクレオチドを、本発明の一態様によって修飾し、例え
ば、２〜５の荷電していない連結毎に約１まで、例えば、１０の荷電していない連結毎に
約４〜５の荷電している連結を含み得る。特定の実施形態において、骨格連結の約２５％
がカチオン性であるとき、アンチセンス活性における最適な改善を見ることができる。特
定の実施形態において、増強は、少数、例えば、１０〜２０％のカチオン性連結において
見ることができ、またはカチオン性連結の数は、５０〜８０％の範囲内、例えば、約６０
％である。
完全なカチオン性連結オリゴマーを含めた任意の数のカチオン性連結を有するオリゴマ
ーを提供する。しかし好ましくは、オリゴマーは、部分的に荷電している（例えば、１０
％〜８０％）。好ましい実施形態において、連結の約１０％〜６０％、好ましくは２０％
〜５０％は、カチオン性である。
一実施形態において、カチオン性連結は、骨格に沿って散在している。部分的に荷電し
ているオリゴマーは好ましくは、少なくとも２つの連続的な荷電していない連結を含有す
る。すなわち、オリゴマーは好ましくは、その全体の長さに沿って厳密に交互になってい
るパターンを有さない。
また考慮されるのは、カチオン性連結のブロックおよび荷電していない連結のブロック
を有するオリゴマーである。例えば、荷電していない連結の中央ブロックは、カチオン性
連結のブロックが隣接してもよく、または逆もまた同じである。一実施形態において、オ
リゴマーは、ほぼ等しい長さの５’、３’および中央領域を有し、中央領域におけるカチ
オン性連結の百分率は、約５０％超、好ましくは約７０％超である。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、混合物または荷電
していない骨格連結およびカチオン性骨格連結を有するオリゴヌクレオチドの合成に関し
て上および下で引用した参照文献および本明細書の実施例において詳述した方法を用いて
、段階的固相合成によって調製することができる。場合によっては、さらなる化学部分を
アンチセンス化合物に加えて、例えば、薬物動態を増強し、または化合物の捕捉または検
出を促進することが望ましくあり得る。このような部分は、標準的な合成法によって共有
結合的に付着させ得る。例えば、ポリエチレングリコール部分または他の親水性ポリマー
、例えば、１〜１００のモノマーサブユニットを有するものの付加は、溶解度の増強にお
いて有用であり得る。
レポーター部分、例えば、フルオレセインまたは放射性標識した基を、検出の目的のた
めに付着し得る。代わりに、オリゴマーに付着したレポーター標識は、標識抗体またはス
トレプトアビジンを結合することができるリガンド、例えば、抗原またはビオチンであり
得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの付着または修飾のための部分の選択において、
一般に当然ながら、生体適合性であり、望ましくない副作用を伴わずに被験体において耐
容性を示す可能性が高い基の化合物を選択することが望ましい。
アンチセンス適用における使用のためのオリゴヌクレオチドは一般に、長さが約１０〜
約５０のサブユニット、より好ましくは約１０〜３０のサブユニット、および典型的には
１５〜２５の塩基の範囲である。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドのために有用
な長さである１９〜２０のサブユニットを有する本発明のオリゴヌクレオチドは理想的に
、２〜１０個、例えば、４〜８つのカチオン性連結、および残りの荷電していない連結を
有し得る。１４〜１５のサブユニットを有するオリゴヌクレオチドは理想的には、２〜７
つ、例えば、３つ、４つ、または５つのカチオン性連結、および残りの荷電していない連
結を有し得る。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２５〜２８のサブユ
ニットを有する。
各モルホリノ環構造は、塩基対合部分を支持し、典型的には細胞におけるまたは処置さ
れている被験体における選択したアンチセンス標的にハイブリダイズするように設計され
る塩基対合部分の配列を形成する。塩基対合部分は、天然ＤＮＡまたはＲＮＡにおいて見
出されるプリンまたはピリミジン（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）、あるいは類似体
、例えば、ヒポキサンチン（ヌクレオシドイノシンの塩基構成要素）、５−メチルシトシ
ン、２−６−ジアミノプリンまたは当該分野で公知であり、そして以下に記載された他の
修飾された塩基であり得る。
上で述べたように、特定の実施形態は、ＰＭＯ−Ｘオリゴマーおよび修飾された末端基
を有するものを含めた、新規なサブユニット間連結を含むオリゴヌクレオチドを対象とす
る。いくつかの実施形態において、これらのオリゴマーは、対応する無修飾オリゴマーよ
りＤＮＡおよびＲＮＡに対してより高い親和性を有し、他のサブユニット間連結を有する
オリゴマーと比較して、改善された細胞送達、効力、および／または組織分布特性を示す
。様々な連結タイプおよびオリゴマーの構造的特徴および特性は、下記の考察においてよ
り詳細に記載する。これらおよび関連するオリゴマーの合成は、参照によりその全体が組
み込まれている共有の米国特許出願第１３／１１８，２９８号に記載されている。
ある特定の実施形態において、本発明は、ヒト疾患と関連する標的配列に対して相補的
な配列を有するオリゴヌクレオチド、薬学的に許容されるその塩を提供し、それは、式：
を有するヌクレオチドの配列を含み、式中、
Ｎｕは、核酸塩基であり、
Ｒ１は、式：
を有し、
ｑは、０、１、または２であり、
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アラルキル、およびホルムアミジニル
基からなる群より選択され、
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アシル、Ｃ１〜Ｃ１０アミノアシル、天然または非天然の
アルファまたはベータアミノ酸のアシル部分、Ｃ１〜Ｃ１０アラルキル、およびＣ１〜Ｃ
１０アルキルからなる群より選択され、あるいは
Ｒ２およびＲ３は接合して、５〜７員環を形成し、環は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェ
ニル、ハロゲン、およびＣ１〜Ｃ１０アラルキルからなる群より選択される置換基で任意
選択で置換されていてもよく、
Ｒ４は、電子対、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アラルキルからなる群よ
り選択され、
Ｒｘは、サルコシンアミド、ヒドロキシル、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド部分、
およびピペラジニルからなる群より選択され、
Ｒｙは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド部分、アミノ
酸、ホルムアミジニル基、およびＣ１〜Ｃ６アシルからなる群より選択され、
Ｒｚは、電子対、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アシルからなる群より
選択される。
Ｎｕは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、およびヒポキサンチンか
らなる群より選択され得る。より好ましくは、Ｎｕは、チミンまたはウラシルである。
好ましい実施形態において、本発明は、式：
を有するヌクレオチドの配列を有するオリゴヌクレオチド、薬学的に許容されるその塩を
提供し、
式中、Ｎｕは、核酸塩基であり、
Ｒ１は、Ｒ１’およびＲ１’’からなる群より選択され、ここでＲ１’は、ジメチル−
アミノであり、Ｒ１’’は、式：
を有し、
式中、少なくとも１つのＲ１は、Ｒ１’’であり、
ｑは、０、１、または２であり、ただし、Ｒ１の少なくとも１つは、ピペリジニル部分
であり、
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アラルキル、およびホルムアミジニル
基からなる群より選択され、
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アシル、Ｃ１〜Ｃ１０アミノアシル、天然または非天然の
アルファまたはベータアミノ酸のアシル部分、Ｃ１〜Ｃ１０アラルキル、およびＣ１〜Ｃ
１０アルキルからなる群より選択され、あるいは
Ｒ２およびＲ３は接合して、５〜７員環を形成し、環は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェ
ニル、ハロゲン、およびＣ１〜Ｃ１０アラルキルからなる群より選択される置換基で任意
選択で置換されていてもよく、
Ｒ４は、電子対、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびアラルキルからなる群より選択され
、
Ｒｘは、サルコシンアミド、ヒドロキシル、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド部分、
およびピペラジニルからなる群より選択され、
Ｒｙは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド部分、アミノ
酸、ホルムアミジニル基、およびＣ１〜Ｃ６アシルからなる群より選択され、
Ｒｚは、電子対、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アシルからなる群より
選択される。
Ｎｕは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、およびヒポキサンチンか
らなる群より選択され得る。より好ましくは、Ｎｕは、チミンまたはウラシルである。
Ｒ１基の約９０〜５０％は、ジメチルアミノ（すなわち、Ｒ１’）である。より好まし
くは、Ｒ１基の９０〜５０％は、ジメチルアミノである。最も好ましくは、Ｒ１基の約６
６％は、ジメチルアミノである。
Ｒ１’’は、
からなる群より選択され得る。
好ましくは、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、式：
を有し、
式中、Ｒｘ、Ｒｙ、Ｒｚ、およびＮｕは、上記の通りである。最も好ましくは、Ｎｕは
、チミンまたはウラシルである。
チミン（Ｔ）は、上記の化学修飾を含有する好ましい塩基対合部分（ＮｕまたはＰｉ）
であるが、当業者に公知の任意の塩基サブユニットは、塩基対合部分として使用すること
ができる。
Ｂ．ペプチド輸送体
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＰＰ、好ましくは、細胞中への化合物
の輸送を増強するのに有効なアルギニンに富んだペプチド輸送部分に結合体化されたオリ
ゴヌクレオチド部分を含み得る。輸送部分は、例えば、図１Ｂおよび１Ｃにおいて示すよ
うに、オリゴマーの末端に好ましくは付着している。ペプチドは、中間の全ての整数を含
めて、所与の細胞培養集団の細胞の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、
９０％または１００％内で細胞透過を誘発する能力を有し、全身投与によって、複数の組
織内でインビボでの巨大分子のトランスロケーションを可能とする。一実施形態において
、細胞透過性ペプチドは、アルギニンに富んだペプチド輸送体であり得る。別の実施形態
において、細胞透過性ペプチドは、ペネトラチンまたはＴａｔペプチドであり得る。これ
らのペプチドは当技術分野で周知であり、例えば、参照によりその全体が組み込まれてい
る米国特許出願公開第２０１０−００１６２１５Ａ１号に開示されている。アンチセンス
オリゴヌクレオチドへのペプチドの結合体化への特に好ましいアプローチは、参照により
その全体が組み込まれているＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／１５０９６０において見出すこと
ができる。本発明のペプチド結合体化オリゴヌクレオチドの好ましい一実施形態は、ＣＰ
Ｐおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの間のリンカーとしてグリシンを利用する。例
えば、好ましいペプチド結合体化ＰＭＯは、Ｒ６−Ｇ−ＰＭＯからなる。
上記のような輸送部分は、付着した輸送部分の非存在下でのオリゴマーの取込みと比べ
て、付着したオリゴマーの細胞侵入を大いに増強することが示されてきた。取込みは好ま
しくは、結合体化されていない化合物と比べて、少なくとも１０倍、より好ましくは２０
倍増強される。
アルギニンに富んだペプチド輸送体（すなわち、細胞透過性ペプチド）の使用は、本発
明の実行において特に有用である。特定のペプチド輸送体は、筋細胞を含めた初代細胞中
へのアンチセンス化合物の送達において高度に有効であることが示されてきた（Ｍａｒｓ
ｈａｌｌ， Ｏｄａら、２００７年；Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ， Ｍｏｕ
ｌｔｏｎら、２００８年；Ｗｕ， Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００８年）。さらに、他の公知
のペプチド輸送体、例えば、ペネトラチンおよびＴａｔペプチドと比較して、本明細書に
記載されているペプチド輸送体は、アンチセンスＰＭＯに結合体化したとき、いくつかの
遺伝子転写物のスプライシングを変化させる増強された能力を示す（Ｍａｒｓｈａｌｌ，
Ｏｄａら、２００７年）。モルホリノ−ペプチド輸送体結合体の好ましい実施形態は、
その全体が本明細書に援用されるＷＯ／２０１２／１５０９６０に記載されている。
リンカーを除いた例示的なペプチド輸送体を、下記で表１において示す。
Ｃ．発現ベクター
一実施形態において、本発明は、細胞における本明細書に記載されているジストロフィ
ン標的化配列の発現のための発現ベクターを含む。ベクター送達系は、本発明のオリゴマ
ーのジストロフィン標的化配列を発現することができる。一実施形態において、このよう
なベクターは、配列番号１〜１２、４６および４７の１つまたは複数の少なくとも１０の
連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列を発現している。別の実施形態におい
て、このようなベクターは、配列番号１〜１２、４６および４７の１つまたは複数を含む
ポリヌクレオチド配列を発現している。遺伝子送達に適した発現ベクターは、当技術分野
において公知である。このような発現ベクターを修飾して、本明細書に記載されているジ
ストロフィン標的化配列を発現させることができる。例示的な発現ベクターは、この中に
ポリヌクレオチドを挿入またはクローニングすることができる、例えば、プラスミド、バ
クテリオファージ、酵母またはウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス
、レンチウイルスなど）に由来する、ポリヌクレオチド分子、好ましくはＤＮＡ分子を含
む。ベクターは、１つまたは複数の独特な制限部位を好ましくは含有し、標的細胞もしく
は組織または前駆細胞もしくはその組織を含めた規定の宿主細胞において自律複製するこ
とができ、あるいはクローニングされた配列が再現性があるように規定の宿主のゲノムと
組み込み可能であることができる。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわ
ち、その複製が染色体の複製と無関係である染色体外実体として存在するベクター、例え
ば、直鎖状もしくは閉環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染
色体でよい。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有することができ
る。代わりに、ベクターは、宿主細胞中に導入されたとき、ゲノム中に組み込まれ、かつ
その中にベクターが組み込まれている染色体（複数可）と一緒に複製されるものでよい。
一実施形態において、発現ベクターは、特定の対象とする細胞または組織における（例
えば、筋肉における）本明細書に記載されているオリゴマーのジストロフィン標的化配列
の発現を促進する、組織特異的プロモーター、例えば、筋特異的プロモーターおよび／ま
たはエンハンサーを含む。筋細胞における発現に適したプロモーター配列および発現ベク
ターは、例えば、その全内容が参照により本明細書中に組み込まれているＵＳ２０１１／
０２１２５２９において記載されているものを含む。例示的な筋特異的プロモーターは、
デスミンプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、Ｐｉｔｘ３プ
ロモーター、骨格アルファ−アクチンプロモーター、またはトロポニンＩプロモーターを
含む。筋特異的プロモーターの使用は、例えば、Ｔａｌｂｏｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１０年）、１８巻（３号）：６０１〜６０８頁；Ｗａｎｇら、Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８年）、１５巻（２２号）：１４８９〜９９頁；およびＣ
ｏｕｌｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２
００７年）、２８２巻（４５号）：３３１９２〜３３２００頁においてさらに記載されて
いる。
ＩＩＩ．製剤および投与様式
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のアンチセンスオリゴマーの治療
的送達に適した製剤または組成物を提供する。したがって、特定の実施形態において、本
発明は、１種または複数種の薬学的に許容される担体（添加物）および／または希釈剤と
一緒に製剤した、治療有効量の１つまたは複数の本明細書に記載されているオリゴマーを
含む薬学的に許容される組成物を提供する。本発明のオリゴマーを単独で投与することは
可能である一方、化合物を医薬製剤（組成物）として投与することが好ましい。
核酸分子の送達のための方法は、例えば、Ａｋｈｔａｒら、１９９２年、Ｔｒｅｎｄｓ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．、２巻：１３９頁；およびＤｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅ
ｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃｓ、ｅｄ． Ａｋｈｔａｒ、Ｓｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５
に記載されている。これらおよび他のプロトコルは、本発明の単離したオリゴマーを含め
た実際上任意の核酸分子の送達のために利用することができる。
下記で詳述するように、本発明の医薬組成物は、下記のために適合されたものを含めた
、固体または液体形態での投与のために特別に製剤され得る：（１）経口投与、例えば、
水薬（水性または非水性の液剤または懸濁剤）、錠剤、例えば、口腔、舌下、および全身
的吸収を標的としたもの、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌への適用のためのペースト剤；（
２）非経口投与、例えば、皮下、筋内、静脈内もしくは硬膜外注射による、例えば、無菌
液剤もしくは懸濁剤、または持続放出製剤として；（３）局所適用、例えば、皮膚に適用
するクリーム剤、軟膏剤、または制御放出パッチまたはスプレー剤として；（４）膣内ま
たは直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム剤またはフォーム剤として；（５）舌下；（
６）目；（７）経皮的；あるいは（８）経鼻。
「薬学的に許容される」という語句は、本明細書において、合理的な利益／リスク比と
釣り合った、過剰な毒性も刺激もアレルギー反応も他の問題も合併症も伴わない、妥当な
医学的判断の範囲内で、人間および動物の組織と接触させる使用に適した化合物、材料、
組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
「薬学的に許容される担体」という語句は、本明細書において使用する場合、体の１つ
の器官または一部から、体の別の器官または一部に対象化合物を運搬または輸送すること
に関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体
充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、ステアリン
酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、もしくはステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ ａｃｉ
ｄ））、または溶媒封入材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患
者に対して傷害性でないという意味で「許容され」なくてはならない。
薬学的に許容される担体としての役割を果たすことができる材料のいくつかの例には、
これらに限定されないが、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース
；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン；（３）セ
ルロース、およびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチル
セルロースおよび酢酸セルロース；（４）トラガカント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチ
ン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ろう；（９）油、例
えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およ
びダイズ油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール
、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（
１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（
１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギ
ン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１
９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝化溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネ
ートおよび／またはポリ無水物；ならびに（２２）医薬製剤中で用いられる他の無毒性の
適合性物質が含まれる。
本発明のアンチセンスオリゴマーを有する製剤に適した薬剤のさらなる非限定的例には
、ＰＥＧが結合体化された核酸、リン脂質が結合体化された核酸、親油性部分を含有する
核酸、ホスホロチオエート、様々な組織中への薬物の侵入を増強することができるＰ糖タ
ンパク質阻害剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ８５）；生分解性ポリマー、例えば、埋
込み後の持続放出送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏグリコリド）ミクロスフィア
（Ｅｍｅｒｉｃｈ，Ｄ Ｆら、１９９９年、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、８巻、４
７〜５８頁）Ａｌｋｅｒｍｅｓ、Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．；および負荷
されたナノ粒子、例えば、血液脳関門を越えて薬物を送達することができ、かつニューロ
ン取込み機構を変化させることができる、ポリブチルシアノアクリレートでできたもの（
Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ
ｙ、２３巻、９４１〜９４９頁、１９９９年）が含まれる。
本発明はまた、ポリ（エチレングリコール）脂質を含有する表面修飾されたリポソーム
（ＰＥＧ−修飾された分岐状および非分岐状のもの、もしくはこれらの組合せ、または長
期循環リポソームもしくはステルスリポソーム）を含む組成物の使用を特徴とする。本発
明のオリゴマーはまた、様々な分子量の共有結合的に付着したＰＥＧ分子を含むことがで
きる。これらの製剤は、標的組織における薬物の蓄積を増大させるための方法を提供する
。このクラスの薬物担体は、単核食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン化お
よび排除に抵抗し、それによってカプセル化された薬物についてより長い血液循環時間お
よび組織曝露の増強を可能とする（Ｌａｓｉｃら、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．、１９９５年、
９５巻、２６０１〜２６２７頁；Ｉｓｈｉｗａｔａら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕ
ｌｌ．、１９９５年、４３巻、１００５〜１０１１頁）。このようなリポソームは、おそ
らく血管新生された標的組織における血管外漏出および捕捉によって、腫瘍において選択
的に蓄積することが示されてきた（Ｌａｓｉｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５年、２６７
巻、１２７５〜１２７６頁；Ｏｋｕら、１９９５年、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ
． Ａｃｔａ、１２３８巻、８６〜９０頁）。長期循環リポソームは、特に、ＭＰＳの組
織において蓄積することが公知である従来のカチオン性リポソームと比較して、ＤＮＡお
よびＲＮＡの薬物動態および薬力学を増強する（Ｌｉｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ
．、１９９５年、４２巻、２４８６４〜２４８７０頁；Ｃｈｏｉら、国際ＰＣＴ出願第Ｗ
Ｏ９６／１０３９１号；Ａｎｓｅｌｌら、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９６／１０３９０号；Ｈ
ｏｌｌａｎｄら、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９６／１０３９２号）。長期循環リポソームはま
た、代謝的に活発なＭＰＳ組織、例えば、肝臓および脾臓における蓄積を回避するこれら
の能力に基づいて、カチオン性リポソームと比較してより大きな程度まで薬物をヌクレア
ーゼ分解から保護する可能性が高い。
さらなる実施形態において、本発明は、米国特許第６，６９２，９１１号、同第７，１
６３，６９５号および同第７，０７０，８０７号において記載されるような、送達のため
に調製されるオリゴマー組成物を含む。これに関しては、一実施形態において、本発明は
、（米国特許第７，１６３，６９５号、同第７，０７０，８０７号、および同第６，６９
２，９１１号において記載される）単独での、あるいはＰＥＧ（例えば、分岐状もしくは
非分岐状ＰＥＧ、または両方の混合物）と組み合わせた、ＰＥＧおよび標的化部分と組み
合わせた、あるいは架橋剤と組み合わせた上記のいずれかと組み合わせた、リシンおよび
ヒスチジン（ＨＫ）のコポリマーを含む組成物中の本発明のオリゴマーを提供する。特定
の実施形態において、本発明は、グルコン酸で修飾されたポリヒスチジンまたはグルコニ
ル化（ｇｌｕｃｏｎｙｌａｔｅｄ）−ポリヒスチジン／トランスフェリン−ポリリシンを
含む組成物中のアンチセンスオリゴマーを提供する。当業者はまた、ＨｉｓおよびＬｙｓ
と同様の特性を有するアミノ酸が、組成物内で置換され得ることを認識する。
本明細書に記載されているオリゴマーの特定の実施形態は、塩基性官能基、例えば、ア
ミノまたはアルキルアミノを含有してもよく、このように、薬学的に許容される酸と共に
薬学的に許容される塩を形成することができる。「薬学的に許容される塩」という用語は
、この点において、本発明の化合物の比較的毒性のない無機および有機の酸付加塩を指す
。これらの塩は、投与ビヒクルまたは剤形製造工程においてインサイチュで調製すること
ができ、あるいはその遊離塩基の形態の精製した本発明の化合物と適切な有機酸または無
機酸とを別々に反応させ、それに続く精製の間にこのように形成された塩を単離すること
によって調製することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硫酸
水素塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステア
リン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マ
レイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナプシル酸（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）
、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩な
どが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅら（１９７７年）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓａｌｔｓ」、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．、６６巻：１〜１９頁を参照されたい）。
対象オリゴマーの薬学的に許容される塩には、例えば、無毒性の有機酸または無機酸か
らの、化合物の従来の無毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、このよ
うな従来の無毒性塩には、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、
リン酸、硝酸などに由来するもの；および有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク
酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸
、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安
息香酸、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香
酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸
、イセチオン酸（ｉｓｏｔｈｉｏｎｉｃ）などから調製された塩が含まれる。
特定の実施形態において、本発明のオリゴマーは、１つまたは複数の酸性官能基を含有
してもよく、したがって薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成すること
ができる。「薬学的に許容される塩」という用語は、これらの場合、本発明の化合物の比
較的毒性のない無機および有機の塩基付加塩を指す。これらの塩は同様に、投与ビヒクル
または剤形製造工程においてインサイチュで調製することができ、あるいはその遊離酸の
形態の精製した化合物と、適切な塩基、例えば、薬学的に許容される金属カチオンの水酸
化物、炭酸塩または炭酸水素塩とを、アンモニアとを、または薬学的に許容される有機第
一級、第二級もしくは第三級アミンとを別々に反応させることによって調製することがで
きる。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類塩には、リチウム塩、ナトリウム塩、カリ
ウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびアルミニウム塩などが含まれる。塩基付
加塩の形成のために有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エ
チレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる（
例えば、Ｂｅｒｇｅら、上述を参照されたい）。
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マ
グネシウム、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、矯味矯臭剤および香料
、保存剤および抗酸化剤はまた、組成物中に存在することができる。
薬学的に許容される抗酸化剤の例には、（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン
酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム
など；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシ
アニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プ
ロピル、α−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。
本発明の製剤には、経口、経鼻、局所（口腔および舌下を含めた）、直腸、膣および／
または非経口投与に適したものが含まれる。製剤は、単位剤形で好都合に提示し得、製剤
分野で周知の任意の方法によって調製し得る。単一の剤形を生成するために担体材料と合
わせることができる活性成分の量は、処置されている宿主、特定の投与モードによって変
化する。単一の剤形を生成するために担体材料と合わせることができる活性成分の量は一
般に、治療効果を生じさせる化合物の量である。一般に、１００パーセントの内、この量
は、約０．１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは、約５パーセント〜
約７０パーセント、最も好ましくは、約１０パーセント〜約３０パーセントの範囲である
。
特定の実施形態において、本発明の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソ
ーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、およびポリマー担体、例えば、ポリエステルおよ
びポリ無水物から選択される賦形剤；ならびに本発明のオリゴマーを含む。特定の実施形
態において、上記の製剤は、本発明の経口的に生物が利用可能なオリゴマーを与える。
これらの製剤または組成物を調製する方法は、本発明のオリゴマーを、担体、および任
意選択で、１種または複数種の補助成分と合わせるステップを含む。一般に、製剤は、本
発明の化合物と、液体担体、または微粉化した固体担体、または両方とを、均質および密
接に合わせ、次いで必要に応じて、生成物を成形することによって調製される。
経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれが、活性成分として所定の量の本発明の化
合物を含有する、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤（香味を付けた基剤、
通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを使用した）、散剤、顆粒剤の形態
、あるいは水性もしくは非水性液体中の液剤または懸濁剤として、あるいは水中油型もし
くは油中水型液体乳剤として、あるいはエリキシル剤またはシロップ剤として、あるいは
香錠（不活性な基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカ
シアを使用した）として、ならびに／あるいは口内洗浄剤などとしてでよい。本発明のオ
リゴマーはまた、ボーラス、舐剤またはペースト剤として投与され得る。
経口投与のために本発明の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤
、トローチ剤（ｔｒｏｕｃｈｅｓ）など）において、活性成分は、１種または複数種の薬
学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、ならび
に／あるいは下記のいずれか：（１）充填剤または増量剤（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）、例えば
、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ
酸；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポ
リビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア；（３）保湿剤（ｈｕｍｅｃｔ
ａｎｔ）、例えば、グリセロール；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャ
ガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケート、および炭酸ナトリウム
；（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン；（６）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニ
ウム化合物および界面活性剤、例えば、ポロキサマーおよびラウリル硫酸ナトリウム；（
７）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール、および非イオ
ン性界面活性剤；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ；（９）滑
沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリ
エチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸ナトリ
ウム、ステアリン酸、およびこれらの混合物；（１０）着色剤；ならびに（１１）制御放
出剤、例えば、クロスポビドンまたはエチルセルロースと混合され得る。カプセル剤、錠
剤および丸剤の場合、医薬組成物はまた、緩衝剤を含み得る。同様のタイプの固体組成物
はまた、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤、および高分子量ポリエチレングリコールな
どを使用して、ソフトおよびハードシェルのゼラチンカプセル中の充填剤として用い得る
。
錠剤は、任意選択で１種または複数種の補助成分と共に、圧縮または成形によって作製
し得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース）、滑沢剤、不活性な希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナト
リウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散化剤
を使用して調製し得る。成形錠剤は、適切な機械において不活性な液体希釈剤で湿らせた
粉末化した化合物の混合物を成形することによって作製し得る。
本発明の医薬組成物の錠剤、および他の固体剤形、例えば、糖衣錠、カプセル剤、丸剤
および顆粒剤は、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶性コーティング、および医薬
製剤の技術分野において周知の他のコーティングと共に任意選択で刻み目を付け、または
調製し得る。これらはまた、例えば、所望の放出プロファイルを提供するために変化する
割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームお
よび／またはミクロスフィアを使用して、その中の活性成分の緩徐な放出または制御放出
を提供するために製剤され得る。これらは、急速放出のために製剤され得る（例えば、凍
結乾燥）。これらは、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、または滅菌水
もしくはいくつかの他の無菌の注射用媒体に使用の直前に溶解させることができる無菌の
固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって無菌化し得る。これらの組成物はまた
、乳白剤を任意選択で含有してもよく、これらが、任意選択で遅延された様式で、胃腸管
の特定の部分において活性成分（複数可）のみまたはそれを優先的に放出する組成であり
得る。使用することができる包埋組成物の例には、ポリマー物質およびろうが含まれる。
活性成分はまた、適切な場合、上記の賦形剤の１つまたは複数を有するマイクロカプセル
化された形態でよい。
本発明の化合物の経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、マイクロ
乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。活性成分に加えて、液
体剤形は、当技術分野で通常使用される不活性な希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可
溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル
、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３
−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オ
リーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポ
リエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を
含有し得る。
不活性な希釈剤に加えて、経口組成物はまた、佐剤、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸
濁化剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、香料および保存剤を含むことができる。
懸濁剤は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリ
オキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸
化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにこれらの混合物とし
て、懸濁化剤を含有し得る。
直腸または膣投与のための製剤は、１種または複数種の本発明の化合物と、例えば、カ
カオバター、ポリエチレングリコール、坐剤ろうまたはサリチレートを含む１種または複
数種の適切な非刺激性の賦形剤または担体とを混合することによって調製してもよく、か
つ室温で固体であるが体温で液体であり、したがって、直腸または膣腔内で融解して活性
化合物を放出する、坐剤として提示し得る。
本明細書において提供するようなオリゴマーの局所または経皮的投与のための製剤また
は剤形には、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル
剤、液剤、パッチおよび吸入剤が含まれる。活性オリゴマーは、無菌条件下にて、薬学的
に許容される担体と、および必要とし得る任意の保存剤、緩衝液、または噴霧体と混合し
得る。軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、本発明の活性化合物に加えて、
賦形剤、例えば、動物性および植物性脂肪、油、ろう、パラフィン、デンプン、トラガカ
ント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸
、タルクならびに酸化亜鉛、またはこれらの混合物を含有し得る。
散剤およびスプレー剤は、本発明のオリゴマーに加えて、賦形剤、例えば、ラクトース
、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、また
はこれらの物質の混合物を含有することができる。スプレー剤は、通例の噴霧体、例えば
、クロロフルオロ炭化水素および揮発性非置換炭化水素、例えば、ブタンおよびプロパン
をさらに含有することができる。
経皮パッチは、体への本発明のオリゴマーの制御された送達を提供するさらなる利点を
有する。このような剤形は、オリゴマーを適当な媒体に溶解または分散させることによっ
て作製することができる。吸収増強剤をまた使用して、皮膚を横切る薬剤のフラックスを
増大させることができる。このようなフラックスの速度は、当技術分野において公知の他
の方法の中で、速度制御膜を提供することによって、または薬剤をポリマーマトリックス
もしくはゲルに分散させることによって制御することができる。
非経口投与に適した医薬組成物は、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、製剤
を意図するレシピエントの血液と等張とする溶質、または懸濁化剤もしくは増粘剤（ｔｈ
ｉｃｋｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含有し得る、１種または複数種の薬学的に許容される
無菌等張性の水性液剤もしくは非水性液剤、分散剤、懸濁剤または乳剤、あるいは使用の
直前に無菌の注射用溶液または分散剤に再構成し得る無菌の粉末と組み合わせて、１種ま
たは複数種の本発明のオリゴマーを含有し得る。本発明の医薬組成物において用い得る適
切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロー
ル、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、および適切なこれらの混合
物、植物性油、例えば、オリーブ油、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エ
チルが含まれる。例えば、コーティング材料、例えば、レシチンの使用によって、分散剤
の場合は必要とされる粒径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって、
適当な流動性を維持することができる。
これらの組成物はまた、佐剤、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散化剤を含有
し得る。対象オリゴマーに対する微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、
例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含むことによって確
実にし得る。組成物中に等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことがまた望ま
しくあり得る。さらに、注射用医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例
えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによってもたらし得る。
場合によっては、薬物の効果を延長させるために、皮下注射または筋肉内注射からの薬
物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、当技術分野において公知の他の方法の中で
も、水溶性が乏しい結晶性またはアモルファス材料の液体懸濁物を使用することによって
達成し得る。そして薬物の吸収の速度は溶解のその速度によって決まり、これはまた、結
晶サイズおよび結晶形態によって決まり得る。代わりに、非経口的に投与された薬物形態
の吸収の遅延は、油性ビヒクルに薬物を溶解または懸濁させることによって達成される。
注射用デポー形態は、生分解性ポリマー、例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド中で
対象オリゴマーのマイクロカプセル化マトリックスを形成させることによって作製し得る
。オリゴマーとポリマーの比、および用いる特定のポリマーの性質によって、オリゴマー
放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエス
テル）およびポリ（無水物）が含まれる。デポー注射用製剤はまた、身体組織と適合性で
あるリポソームまたはマイクロ乳剤中に薬物を捕捉することによって調製し得る。
本発明のオリゴマーが医薬としてヒトおよび動物に投与されるとき、これらはそれ自体
で、または薬学的に許容される担体と組み合わせて、例えば、０．１〜９９％（より好ま
しくは、１０〜３０％）の活性成分を含有する医薬組成物として与えることができる。
上で述べたように、本発明の製剤または調製物は、経口的、非経口的、局所的、または
直腸に与え得る。これらは典型的には、それぞれの投与経路に適した形態で与えられる。
例えば、これらは、錠剤またはカプセル剤形態で、注射、吸入、眼用ローション剤（ｅｙ
ｅ ｌｏｔｉｏｎ）、軟膏剤、坐剤などによる、注射、注入または吸入による投与；ロー
ション剤または軟膏剤による局所；および坐剤による直腸で投与される。
「非経口投与」および「非経口的に投与された」という語句は、本明細書において使用
する場合、通常、注射による、経腸および局所投与以外の投与モードを意味し、これらに
限定されないが、静脈内、筋内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、
腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内注射お
よび注入が含まれる。
「全身投与」、「全身的に投与された」、「末梢投与」および「末梢的に投与された」
という語句は、本明細書において使用する場合、中枢神経系中への直接の投与以外の、化
合物、薬物または他の材料が患者の系に入り、したがって代謝および他の同様のプロセス
に供されるような、化合物、薬物または他の材料の投与、例えば、皮下投与を意味する。
選択した投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用し得る本発明のオリゴマー、およ
び／または本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容され
る剤形に製剤され得る。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者
に対して受容できないほど毒性であることを伴わずに、特定の患者、組成物、および投与
モードについて所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変化し得
る。
選択した投与量レベルは、用いられる本発明の特定のオリゴマー、またはそのエステル
、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、用いられる特定のオリゴマーの排泄
または代謝の速度、吸収の速度および程度、処置の持続期間、用いられる特定のオリゴマ
ーと組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年
齢、性別、体重、状態、身体全体の健康および従前の病歴、ならびに医学の技術分野にお
いて周知の同様の要因を含めた種々の要因によって決まる。
当技術分野で通常の技量を有する医師または獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効
量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医師は、所望の治療
効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで医薬組成物中に用いられる本発明
の化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増大させることが
できる。一般に、本発明の化合物の適切な１日用量は、治療効果を生じさせるのに有効な
最も低い用量である化合物の量である。このような有効用量は一般に、上記の要因によっ
て決まる。一般に、患者のための本発明の化合物の経口、静脈内、脳室内（ｉｎｔｒａｃ
ｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）および皮下用量は、示される効果のために使用さ
れるとき、１日当たり体重１キログラム毎に約０．０００１〜約１００ｍｇの範囲である
。
所望される場合、活性化合物の有効な１日用量は、任意選択で単位剤形にて、１日を通
して適当な間隔で別々に投与される、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを超える
部分用量として投与され得る。特定の状況において、投薬は、１日毎に１回の投与である
。特定の実施形態において、投薬は、必要に応じ、機能的なジストロフィンタンパク質の
所望される発現を維持するための、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、
８日毎、９日毎、１０日毎、１１日毎、１２日毎、１３日毎、１４日毎、または１週間毎
、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎
、１０週間毎、１１週間毎、１２週間毎、または１カ月毎、２カ月毎、３カ月毎、４カ月
毎、５カ月毎、６カ月毎、７カ月毎、８カ月毎、９カ月毎、１０カ月毎、１１カ月毎、１
２カ月毎に１回または複数回の投与である。
核酸分子は、これらに制限されないが、本明細書に記載され、当技術分野において公知
のような、リポソーム中へのカプセル化、イオン導入による、または他のビヒクル、例え
ば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体付着性ミクロ
スフィア中への組込みによるものを含めて、当業者には公知の種々の方法によって細胞に
投与することができる。特定の実施形態において、マイクロ乳化技術を利用して、親油性
（水不溶性）医薬品のバイオアベイラビリティーを改善し得る。例には、トリメトリン（
Ｔｒｉｍｅｔｒｉｎｅ）（Ｄｏｒｄｕｎｏｏ， Ｓ． Ｋ．ら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ、１７頁（１２号）、１
６８５〜１７１３頁、１９９１年およびＲＥＶ５９０１（Ｓｈｅｅｎ， Ｐ． Ｃ．ら、
Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ、８０巻（７号）、７１２〜７１４頁、１９９１年）が含まれる
。様々な利益のなかでもとりわけ、マイクロ乳化は、吸収を循環器系の代わりにリンパ系
に優先的に向けることによって増強されたバイオアベイラビリティーを実現し、これによ
って肝臓を迂回し、肝胆道循環における化合物の破壊を防止する。
本発明の一態様において、製剤は、本明細書において提供するようなオリゴマーおよび
少なくとも１種の両親媒性担体から形成されるミセルを含有し、ミセルは、約１００ｎｍ
未満の平均直径を有する。より好ましい実施形態は、約５０ｎｍ未満の平均直径を有する
ミセルを提供し、さらにより好ましい実施形態は、約３０ｎｍ未満、またはさらに約２０
ｎｍ未満の平均直径を有するミセルを提供する。
全ての適切な両親媒性担体が意図される一方、現在好ましい担体は一般に、一般に安全
と認められる（ＧＲＡＳ）ステータスを有し、かつ本発明の化合物を可溶化することがで
き、溶液が複雑な水相（例えば、ヒト消化管において見出されるもの）と接触するとき、
より後の段階でマイクロ乳化することができることの両方であるものである。通常、これ
らの要件を満足させる両親媒性成分は、２〜２０のＨＬＢ（親水親油バランス）値を有し
、これらの構造は、Ｃ−６〜Ｃ−２０の範囲の直鎖脂肪族ラジカルを含有する。例は、ポ
リエチレングリコール化（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）脂肪酸グ
リセリドおよびポリエチレングリコールである。
両親媒性担体の例には、飽和および一不飽和ポリエチレングリコール化（ｐｏｌｙｅｔ
ｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｙｚｅｄ）脂肪酸グリセリド、例えば、完全または部分的に水
素付加した様々な植物性油から得られるものが含まれる。このような油は有利には、トリ
−、ジ−、およびモノ−脂肪酸グリセリド、ならびに対応する脂肪酸のジ−およびモノ−
ポリエチレングリコールエステルからなり、特に好ましい脂肪酸組成物は、カプリン酸４
〜１０％、カプリン酸３〜９％、ラウリン酸４０〜５０％、ミリスチン酸１４〜２４％、
パルミチン酸４〜１４％およびステアリン酸５〜１５％を含む。別の有用なクラスの両親
媒性担体には、飽和もしくは一不飽和脂肪酸（ＳＰＡＮ−シリーズ）または対応するエト
キシ化類似体（ＴＷＥＥＮ−シリーズ）を伴う部分的にエステル化されたソルビタンおよ
び／またはソルビトールが含まれる。
Ｇｅｌｕｃｉｒｅ−シリーズ、Ｌａｂｒａｆｉｌ、Ｌａｂｒａｓｏｌ、またはＬａｕｒ
ｏｇｌｙｃｏｌ（全てＧａｔｔｅｆｏｓｓｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｉｎｔ Ｐ
ｒｉｅｓｔ、Ｆｒａｎｃｅによって製造および配布されている）、ＰＥＧ−モノ−オレエ
ート、ＰＥＧ−ジ−オレエート、ＰＥＧ−モノ−ラウレートおよびジ−ラウレート、レシ
チン、ポリソルベート８０など（米国および世界中のいくつかの会社によって生産および
配布されている）を含めて、市販の両親媒性担体は特に有用であり得る。
特定の実施形態において、送達は、適切な宿主細胞中への本発明の組成物の導入のため
の、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフィア、脂質粒子、小胞などの使用に
よって起こり得る。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィ
ア、ナノ粒子などのいずれか中にカプセル化されて、送達のために製剤され得る。このよ
うな送達ビヒクルの製剤および使用は、公知および従来の技術を使用して行うことができ
る。
本発明における使用に適した親水性ポリマーは、容易に水溶性であり、小胞形成脂質に
共有結合的に付着させることができ、毒性効果を伴わずにインビボで耐容性を示す（すな
わち、生体適合性である）ものである。適切なポリマーには、ポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ポリラクチドとまた称される）、ポリグリコール酸（ポリグリコリ
ドとまた称される）、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマー、およびポリビニルアルコ
ールが含まれる。特定の実施形態において、ポリマーは、約１００ダルトンもしくは１２
０ダルトンから、約５，０００ダルトンもしくは１０，０００ダルトンまで、または約３
００ダルトン〜約５，０００ダルトンの分子量を有する。他の実施形態において、ポリマ
ーは、約１００〜約５，０００ダルトンの分子量を有し、または約３００〜約５，０００
ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。特定の実施形態において、ポ
リマーは、７５０ダルトンのポリエチレングリコール（ＰＥＧ（７５０））である。ポリ
マーはまた、その中のモノマーの数によって定義し得る。本発明の好ましい実施形態は、
少なくとも約３種のモノマーのポリマーを利用し、このようなＰＥＧポリマーは、３種の
モノマーからなる（ほぼ１５０ダルトン）。
本発明における使用に適し得る他の親水性ポリマーには、ポリビニルピロリドン、ポリ
メトキサゾリン（ｐｏｌｙｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｉｎｅ）、ポリエチルオキサゾリン、ポ
リヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリル
アミド、および誘導体化セルロース、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロ
キシエチルセルロースが含まれる。
特定の実施形態において、本発明の製剤は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアル
キレン、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルポリマ
ー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、セルロース
、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸およびグリコール酸のポリマー、
ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）（ｐｏｌｙ（ｂｕｔｉｃ ａｃｉｄ
））、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、多糖類、タンパク質
、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリレート、ならびにそのブレンド、混合物、または
コポリマーからなる群より選択される生体適合性ポリマーを含む。
シクロデキストリンは、それぞれ、ギリシャ文字α、βまたはγと指定される、６つ、
７つまたは８つのグルコース単位からなる環状オリゴ糖である。グルコース単位は、α−
１，４−グルコシド結合によって連結している。糖単位のいす形配座の結果として、全て
の第二級ヒドロキシル基（Ｃ−２、Ｃ−３における）は、環の１つの側面上に位置してお
り、一方、Ｃ−６における全ての第一級ヒドロキシル基は、他の側面上に配置されている
。その結果、外側の面は親水性であり、シクロデキストリンを水溶性とする。対照的に、
シクロデキストリンの空洞は、原子Ｃ−３およびＣ−５の水素によって、ならびにエーテ
ル様酸素で裏打ちされているため疎水性である。これらのマトリックスは、例えば、ステ
ロイド化合物、例えば、１７α−エストラジオールを含めた種々の比較的疎水性の化合物
と共に複合体を形成することが可能となる（例えば、ｖａｎ Ｕｄｅｎら、Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ． Ｏｒｇ． Ｃｕｌｔ．、３８巻：１−３−１１３（１９９４年）
を参照されたい）。複合体形成は、ファンデルワールス相互作用によって、および水素結
合形成によって起こる。シクロデキストリンの化学的性質の一般的概説について、Ｗｅｎ
ｚ、Ａｇｎｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、３３巻：８０３〜８２
２頁（１９９４年）を参照されたい。
シクロデキストリン誘導体の物理化学的特性は、種類および置換度によって強力に決ま
る。例えば、水中のこれらの溶解度は、不溶性（例えば、トリアセチル−β−シクロデキ
ストリン）から１４７％可溶性（ｗ／ｖ）（Ｇ−２−β−シクロデキストリン）までの範
囲である。さらに、これらは、多くの有機溶媒中で可溶性である。シクロデキストリンの
特性により、様々な製剤構成要素の溶解度を増大または減少させることによって、これら
の溶解度の制御をすることができる。
多数のシクロデキストリンおよびこれらの調製のための方法が記載されてきた。例えば
、Ｐａｒｍｅｔｅｒ（Ｉ）ら（米国特許第３，４５３，２５９号）およびＧｒａｍｅｒａ
ら（米国特許第３，４５９，７３１号）は、電気的中性のシクロデキストリンを記載した
。他の誘導体には、カチオン性特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（Ｉ
Ｉ）、米国特許第３，４５３，２５７号］、不溶性架橋シクロデキストリン（Ｓｏｌｍｓ
、米国特許第３，４２０，７８８号）、およびアニオン性特性を有するシクロデキストリ
ン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ）、米国特許第３，４２６，０１１号］が含まれる。アニ
オン性特性を有するシクロデキストリン誘導体の中で、カルボン酸、亜リン酸、亜ホスフ
ィン酸（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｕｓ ａｃｉｄ）、ホスホン酸、リン酸、チオホスホン酸（
ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、チオスルフィン酸（ｔｈｉｏｓｕｌｐｈｉ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）、およびスルホン酸が、親シクロデキストリンに付加されてきた［Ｐ
ａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ）、上述を参照されたい］。さらに、スルホアルキルエーテルシ
クロデキストリン誘導体は、Ｓｔｅｌｌａらによって記載されてきた（米国特許第５，１
３４，１２７号）。
リポソームは、水性の内部コンパートメントを封入する少なくとも１つの脂質二重層膜
からなる。リポソームは、膜タイプにより、およびサイズにより特性決定し得る。小型単
層小胞（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＳＵＶ）は単一の膜
を有し、典型的には直径が０．０２〜０．０５μｍの範囲であり、大型単層小胞（ｌａｒ
ｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＬＵＶＳ）は典型的には、０．０５
μｍより大きい。少層大型小胞（ｏｌｉｇｏｌａｍｅｌｌａｒ ｌａｒｇｅ ｖｅｓｉｃ
ｌｅ）および多層小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）は、複数の通常
同心円状膜の層を有し、典型的には０．１μｍより大きい。いくつかの非同心円状膜を有
するリポソーム、すなわち、より大型小胞内に含有されるいくつかのより小型小胞は、多
胞体小胞（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）と称される。
本発明の一態様は、本発明のオリゴマーを含有するリポソームを含む製剤に関し、リポ
ソーム膜は、増大した運搬能力を有するリポソームを提供するように製剤される。代わり
にまたはさらに、本発明の化合物は、リポソームのリポソーム二重層中に含有し得、また
はリポソームのリポソーム二重層上に吸着し得る。本発明のオリゴマーは、脂質界面活性
剤（ｌｉｐｉｄ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）と共に凝集させ、リポソームの内側空間内に運
んでもよい。これらの場合、リポソーム膜は、活性剤−界面活性剤凝集物の破壊効果に抵
抗するように製剤される。
本発明の一実施形態によると、ＰＥＧ鎖が、脂質二重層の内面からリポソームによって
カプセル化された内部空間中に伸長し、脂質二重層の外部から周囲の環境中に伸長するよ
うに、リポソームの脂質二重層は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化された
脂質を含有する。
本発明のリポソーム内に含有される活性剤は、可溶化形態である。界面活性剤および活
性剤の凝集物（例えば、目的とする活性剤を含有する乳剤またはミセル）は、本発明によ
るリポソームの内部空間内に捕捉し得る。界面活性剤は、活性剤を分散および可溶化する
ように作用し、これらに限定されないが、変化する鎖長（例えば、約Ｃ１４〜約Ｃ２０）
の生体適合性リゾホスファチジルコリン（ＬＰＧ）を含めた任意の適切な脂肪族、脂環式
または芳香族の界面活性剤から選択され得る。ポリマー誘導体化脂質は、ミセル／膜融合
を阻害するように作用し、界面活性剤分子へポリマーを加えることによって界面活性剤の
ＣＭＣを減少させ、ミセル形成を助長するため、ポリマー誘導体化脂質、例えば、ＰＥＧ
−脂質をまた、ミセル形成のために利用し得る。好ましいのは、マイクロモル濃度範囲の
ＣＭＯを有する界面活性剤である。より高いＣＭＣの界面活性剤を利用して、本発明のリ
ポソーム内に捕捉されたミセルを調製し得る。
本発明にしたがうリポソームは、当技術分野において公知の種々の技術のいずれかによ
って調製し得る。例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；公開されたＰＣＴ出願ＷＯ
９６／１４０５７；Ｎｅｗ ＲＲＣ， Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ
ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９０年）、３３〜１０４頁
；Ｌａｓｉｃ ＤＤ， Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＢＶ
、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９３年を参照されたい。例えば、リポソーム中で望ましい誘
導体化された脂質の最終モルパーセントに相当する脂質濃度で、予め形成されたリポソー
ムを脂質グラフトポリマーから構成されるミセルに曝露させることになどによって、親水
性ポリマーで誘導体化した脂質を予め形成されたリポソーム中に拡散させることによって
、本発明のリポソームは調製し得る。親水性ポリマーを含有するリポソームはまた、当技
術分野において公知のように、均質化、脂質領域水和（ｌｉｐｉｄ−ｆｉｅｌｄ ｈｙｄ
ｒａｔｉｏｎ）、または押出技術によって形成することができる。
別の例示的な製剤手順において、活性剤は、リゾホスファチジルコリン、または疎水性
分子を容易に可溶化する他の低ＣＭＣの界面活性剤（ポリマーグラフト脂質を含めた）中
で超音波処理によって最初に分散させる。次いで、このように得られた活性剤のミセル懸
濁物を使用して、適切なモルパーセントのポリマーグラフト脂質、またはコレステロール
を含有する乾燥した脂質試料を再水和させる。次いで、脂質および活性剤懸濁物を、当技
術分野において公知のような押出技術を使用してリポソームに形成し、このように得られ
たリポソームを、標準的なカラム分離によってカプセル化されていない溶液から分離する
。
本発明の一態様において、リポソームは、選択したサイズ範囲の実質的に均一なサイズ
を有するように調製される。１つの有効なサイジング方法は、選択した均質な孔径を有す
る一連のポリカーボネート膜を通してリポソームの水性懸濁物を押し出すことを伴い、膜
の孔径は、その膜を通す押出によって生成したリポソームの最も大きなサイズにおおよそ
相当する。例えば、米国特許第４，７３７，３２３号（１９８８年４月１２日）を参照さ
れたい。特定の実施形態において、試薬、例えば、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）お
よびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）を利用して、細胞中にポリヌクレオチドま
たはタンパク質を導入し得る。
本発明の製剤の放出の特徴は、封入材料、カプセル化された薬物の濃度、および放出調
節剤の存在によって決まる。例えば、胃におけるように低ｐＨにおいてのみ、または腸に
おけるようにより高いｐＨで放出するｐＨ感受性コーティングを使用して、例えば、放出
をｐＨ依存性であるように操作することができる。腸溶性コーティングを使用して、胃を
通過する後まで放出が起こることを防止することができる。複数のコーティング、または
異なる材料中にカプセル化されたシアナミドの混合物を使用して、胃における最初の放出
、それに続く腸におけるその後の放出を得ることができる。放出はまた、水の取込みまた
はカプセルからの拡散による薬物の放出を増大させることができる、塩またはポア形成剤
を含むことによって操作することができる。薬物の溶解度を改変させる賦形剤をまた使用
して、放出速度を制御することができる。マトリックスの分解またはマトリックスからの
放出を増強する薬剤をまた組み込むことができる。これらは、化合物によって、薬物に加
え、別々の相として加えることができ（すなわち、微粒子として）、またはポリマー相に
同時溶解することができる。殆どの場合、量は、０．１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマ
ー）であるべきである。分解増強剤のタイプには、無機塩、例えば、硫酸アンモニウムお
よび塩化アンモニウム、有機酸、例えば、クエン酸、安息香酸、およびアスコルビン酸、
無機塩基、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛、および
水酸化亜鉛、ならびに有機塩基、例えば、硫酸プロタミン、スペルミン、コリン、エタノ
ールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミン、ならびに界面活性剤、
例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）が含まれる。マト
リックスに微小構造を加えるポア形成剤（すなわち、水溶性化合物、例えば、無機塩およ
び糖）を、微粒子として加える。範囲は典型的には、１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマ
ー）である。
腸における粒子の滞留時間を変化させることによって、取込みをまた操作することがで
きる。例えば、粒子を粘膜の接着性ポリマーでコーティングすることによって、または封
入材料として粘膜の接着性ポリマーを選択することによって、これは達成することができ
る。例には、遊離カルボキシル基を有する大部分のポリマー、例えば、キトサン、セルロ
ース、特に、ポリアクリレートが含まれる（本明細書において使用する場合、ポリアクリ
レートは、アクリレート基および修飾されたアクリレート基、例えば、シアノアクリレー
トおよびメタアクリレートを含むポリマーを指す）。
オリゴマーは、手術デバイスもしくは医療デバイスまたはインプラント内に含有される
ように製剤され得るか、あるいはこれらによって放出されるように適合され得る。特定の
態様において、インプラントは、オリゴマーでコーティングまたは別の方法で処理し得る
。例えば、ヒドロゲル、または他のポリマー、例えば、生体適合性および／または生分解
性ポリマーを使用して、インプラントを本発明の組成物でコーティングし得る（すなわち
、組成物は、ヒドロゲルまたは他のポリマーを使用することによって医療デバイスと共の
使用のために適合し得る）。医療デバイスを薬剤でコーティングするためのポリマーおよ
びコポリマーは、当技術分野において周知である。インプラントの例には、これらに限定
されないが、ステント、薬物溶出ステント、縫合糸、プロテーゼ、血管カテーテル、透析
カテーテル、血管移植片、人工心臓弁、心臓ペースメーカー、埋め込み式電気除細動器、
ＩＶ針、接骨（ｂｏｎｅ ｓｅｔｔｉｎｇ）および骨形成のためのデバイス、例えば、ピ
ン、ネジ、プレート、および他のデバイス、ならびに創傷治癒のための人工組織マトリッ
クスが含まれる。
本明細書において提供する方法に加えて、本発明によって使用するためのオリゴマーは
、ヒトまたは動物用の薬における使用のために、他の医薬から類推して任意の好都合な方
法における投与のために製剤され得る。アンチセンスオリゴマーおよびこれらの対応する
製剤は、筋ジストロフィーの処置において、単独で、または他の治療ストラテジ、例えば
、筋芽細胞移植、幹細胞治療、アミノグリコシド抗生物質、プロテアソーム阻害剤の投与
、および上方調節治療（例えば、ユートロフィン（ジストロフィン常染色体パラログ）の
上方調節）と組み合わせて投与され得る。
当業者は任意の特定の動物および状態のための最適な投与経路および任意の投与量を容
易に決定することができるため、記載される投与経路はガイドとしてのみ意図される。イ
ンビトロおよびインビボの両方での細胞中への新規な機能的遺伝物質を導入するための複
数のアプローチが試みられてきた（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ
、２４４巻：１２７５〜１２８０頁）。これらのアプローチは、修飾されたレトロウイル
ス中に発現する遺伝子の組み込み（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９年）同上；Ｒｏｓｅｎ
ｂｅｒｇ（１９９１年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５１巻（１８号）、ｓｕｐｐ
ｌ．：５０７４Ｓ〜５０７９Ｓ頁）；非レトロウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウ
イルスベクター）中への組み込み（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２年）、Ｃｅｌｌ、６
８巻：１４３〜１５５頁；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５
２巻：４３１〜４３４頁）；またはリポソームを介した異種性プロモーター−エンハンサ
ーエレメントに連結している導入遺伝子の送達（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９年）、同
上；Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９年）、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ．、２９８巻：
２７８〜２８１頁；Ｎａｂｅｌら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：１２８５
〜１２８８頁；Ｈａｚｉｎｓｋｉら（１９９１年）、Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐ． Ｃｅｌ
ｌ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．、４巻：２０６〜２０９頁；およびＷａｎｇおよびＨｕａ
ｎｇ（１９８７年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８４
巻：７８５１〜７８５５頁）；リガンド特異的なカチオンベースの輸送系へのカップリン
グ（ＷｕおよびＷｕ（１９８８年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６３巻：１４６
２１〜１４６２４頁）、またはネイキッドＤＮＡ発現ベクターの使用（Ｎａｂｅｌら（１
９９０年）、同上）；Ｗｏｌｆｆら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻：１４６
５〜１４６８頁）を含む。組織中への導入遺伝子の直接注射は、局在化された発現のみを
生じさせる（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２年）、同上）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９
９１年）、同上；Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９年）、同上；Ｎａｂｅｌ（１９９０年）、
同上；およびＨａｚｉｎｓｋｉら（１９９１年）、同上）。Ｂｒｉｇｈａｍらのグループ
（Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ．（１９８９年）、２９８巻：２７８〜２８１頁およ
びＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１年）、３９頁（アブストラクト））は
、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内または気管内投与に続く、マウスの肺のインビボでの
トランスフェクションのみを報告している。ヒト遺伝子治療手順の総論の一例は、Ａｎｄ
ｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２年）２５６巻：８０８〜８１３頁である。
ＩＶ．キット
本発明はまた、遺伝学的疾患を有する患者の処置のためのキットを提供し、キットは、
その使用のための指示書と一緒に、適切な容器中にパッケージされた、少なくとも１つの
アンチセンス分子（例えば、配列番号１〜１２、４６および４７に示されたアンチセンス
オリゴマー）を含む。キットはまた、周辺的試薬、例えば、緩衝液、安定剤などを含有し
得る。当技術分野の当業者は、上記の方法の適用は、多くの他の疾患の処置における使用
に適したアンチセンス分子を同定するために広範な適用を有することを認識すべきである
。
理解を明確にするために上記の発明を例示および例として少し詳しく記載してきたが、
添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、特定の変更および修正をそ
れに行い得ることは、本発明の教示に鑑みて当業者には容易に明らかであろう。下記の実
施例は、限定のためではなく例示としてのみ提供する。当業者は、本質的に同様の結果を
得るために変更または修正することができる種々の重大でないパラメーターを容易に認識
する。
材料および方法
細胞および組織培養処理の条件
ヒト横紋筋肉腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１３６；ＲＤ細胞）を、組織培養処理したＴ
７５フラスコ（Ｎｕｎｃ）中に、Ｌ−グルタミン（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１０％ウシ胎仔血
清、および１％ペニシリン−ストレプトマイシン抗生剤溶液（ＣｅｌＧｒｏ）を有する２
４ｍＬの温めたＤＭＥＭ内に１．５×１０６個の細胞／フラスコで播種した。２４時間後
、培地を吸引し、細胞を温めたＰＢＳ中で一回洗浄し、新鮮な培地を加えた。細胞を５．
０％ＣＯ２にて３７℃のインキュベーター中で８０％コンフルエンスまで増殖させ、トリ
プシンを使用して収集した。凍結乾燥したホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（
ＰＭＯ）を、ヌクレアーゼ非含有水に概ね０．５ｍＭ〜２．０ｍＭで再懸濁した。モル濃
度を確認するために、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ）を使用して、ＰＭＯ溶液を測定した。ＰＭＯを、製造者の指示書によってヌ
クレオポレーション、およびＳＧキット（Ｌｏｎｚａ）を使用してＲＤ細胞に送達した。
ＰＭＯを、示されるような様々な濃度（例えば、２．５マイクロモル濃度、５マイクロモ
ル濃度、１０マイクロモル濃度、１２．５マイクロモル濃度、２０マイクロモル濃度およ
び２５マイクロモル濃度）で試験した。細胞を、１２または２４ウェルプレートのウェル
（ｎ＝２または３）毎に約２〜３×１０５個の細胞でヌクレオポレーション後に２４時間
インキュベートし、次いで、下記のようなＲＮＡ抽出に供した。
初代ヒト筋芽細胞を、標準的な技術を使用して骨格筋細胞増殖培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌ
ｌ）中で培養した。様々な濃度でのＰＭＯのヌクレオポレーションを、上記のＲＤ細胞に
ついて記載されている通りに行なった。次いで、細胞を、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ増殖培地中
で１２ウェルプレートの３連ウェルに蒔き、下記のようなＲＮＡ抽出の前に２４時間イン
キュベートした。
ＲＮＡ抽出およびＰＣＲ増幅
ＲＮＡは、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＲＮＡｓｐｉｎ９６ウェルＲＮＡ単離キ
ットを使用してＰＭＯ処理した細胞（ＲＤ細胞または初代ヒト筋芽細胞）から抽出し、標
準的な技術および下記のプライマー対を使用してネステッドまたは非ネステッドのいずれ
かのＲＴ−ＰＣＲに供した。外側プライマー：フォワード５’−ＣＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧ
ＡＣＣＴＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号４０）、リバース５’−ＧＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡ
ＧＧＴＴＣＡＡＧＴＧＧ−３’（配列番号４１）；内側プライマー：フォワード５’−Ｇ
ＴＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＡＧＧＴＣＧ−３’（配列番号４２）、リバース５’−
ＧＣＡＡＴＧＴＴＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＣＣ−３’（配列番号４３）。一部の
場合において、内側プライマーを使用して非ネステッドＰＣＲを実施した。エキソンスキ
ッピングをゲル電気泳動によって、またはＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐバイオアナラ
イザーを使用して測定し、エキソンスキッピング％（すなわち、完全長ＰＣＲ産物に対す
るエキソンスキッピングされた生成物のバンド強度）を、図３〜６において示すようにグ
ラフ化した。
モルホリノサブユニット、ＰＭＯおよび修飾されたサブユニット間連結を含むＰＭＯの
調製
反応スキーム１を参照すると、Ｂは、塩基対合部分を表し、ＰＧは、保護基を表し、モ
ルホリノサブユニットは、示されているように対応するリボヌクレオシド（ｒｉｂｉｎｕ
ｃｌｅｏｓｉｄｅ）（１）から調製されてもよい。モルホリノサブユニット（２）は、適
切な保護基前駆体、例えば塩化トリチルとの反応によって任意選択で保護されてよい。３
’保護基は、より詳細に以下に記載する固体オリゴマー合成の間に一般に除去される。塩
基対合部分は、固相オリゴマー合成のために適切に保護されてよい。適切な保護基として
、アデニンおよびシトシンのためのベンゾイル、グアニンのためのフェニルアセチル、な
らびにヒポキサンチン（Ｉ）のためのピバロイルオキシメチルが挙げられる。ピバロイル
オキシメチル基は、ヒポキサンチン複素環式塩基のＮ１位に導入され得る。保護されてい
ないヒポキサンチンサブユニットが使用されてもよいが、活性化反応における収率は、塩
基が保護されているとき、はるかに優れている。他の適切な保護基として、参照により本
明細書においてその全体が組み込まれている米国特許第８，０７６，４７６号に開示され
ているものが挙げられる。
３と活性化されたリン化合物４ａまたは４ｂとの反応は、所望の連結部分（５ａまたは
５ｂ）を有するモルホリノサブユニットを結果として生じる。Ｒ１および／またはＬ１部
分は、Ｐ−Ｏ結合の形成後に、またはサブユニットがオリゴマーに組み込まれた後にも、
複素環式環Ｚに設けられてもよいことに留意すべきである。
構造４ａまたは４ｂの化合物は、実施例に記載されているものを含め、当業者に公知の
多くの方法を使用して調製され得る。モルホリノ部分とのカップリングが次いで先に概説
したように進行する。
構造５ａまたは５ｂの化合物は、サブユニット間連結を含むオリゴマーの調製のための
固相オリゴマー合成に使用され得る。かかる方法は、当技術分野において周知である。簡
潔には、構造５ａまたは５ｂの化合物は、５’端で修飾されて、固体支持体へのリンカー
を含有していてよい。一旦支持されたら、５ａまたは５ｂの保護基（例えば、３’端にお
けるトリチル））は除去されて、遊離アミンが構造５ａまたは５ｂの第２の化合物（また
はその類似体）の活性化されたリン部分と反応する。この順序は、所望の長さのオリゴが
得られるまで繰り返される。末端の３’端における保護基は、除去されても、３’修飾が
望まれる場合には残されても、いずれであってもよい。オリゴは、多くの方法、例えば固
体支持体との連結を切断する塩基での処理を使用して固体支持体から除去され得る。
一般のモルホリノオリゴマーおよび本発明の特定のモルホリノオリゴマーの調製は、実
施例において、より詳細に記載されている。
（実施例１）
モルホリノオリゴマーの調製
本発明の化合物の調製を、以下のプロトコールを使用して実施する：
トリチルピペラジンフェニルカルバメート３５の調製（図２Ａおよび２Ｂ）：化合物１
１のジクロロメタン冷却懸濁物（６ｍＬ／ｇ １１）に、炭酸カリウム（３．２当量）の
水溶液（４ｍＬ／ｇ炭酸カリウム）を添加した。この２相混合物に、クロロギ酸フェニル
（１．０３当量）のジクロロメタン溶液（２ｇ／ｇクロロギ酸フェニル）をゆっくり添加
した。反応混合物を２０℃に加温した。反応が完了したら（１〜２時間）、層を分離した
。有機層を水で洗浄し、無水炭酸カリウムで乾燥させた。生成物３５をアセトニトリルか
ら結晶化によって単離した。
カルバメートアルコール３６の調製：水素化ナトリウム（１．２当量）を１−メチル−
２−ピロリジノン（３２ｍＬ／ｇ水素化ナトリウム）に懸濁した。この懸濁物にトリエチ
レングリコール（１０．０当量）および化合物３５（１．０当量）を添加した。得られた
スラリーを９５℃に加熱した。反応が完了したら（１〜２時間）、混合物を２０℃に冷却
した。この混合物に、３０％ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ｖ：ｖ
）および水を添加した。生成物を含有する有機層を、水性ＮａＯＨ、水性コハク酸、およ
び飽和水性塩化ナトリウムで連続して洗浄した。生成物３６をジクロロメタン／メチルｔ
ｅｒｔ−ブチルエーテル／ヘプタンから結晶化によって単離した。
Ｔａｉｌ酸３７の調製：化合物３６のテトラヒドロフラン（７ｍＬ／ｇ ３６）溶液に
無水コハク酸（２．０当量）およびＤＭＡＰ（０．５当量）を添加した。混合物を５０℃
に加熱した。反応が完了したら（５時間）、混合物を２０℃に冷却し、水性ＮａＨＣＯ３
でｐＨ８．５に調整した。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加し、生成物を水性層に
抽出した。ジクロロメタンを添加し、混合物を水性クエン酸でｐＨ３に調整した。生成物
を含有する有機層をｐＨ＝３のクエン酸塩緩衝液と飽和水性塩化ナトリウムとの混合物で
洗浄した。この３７のジクロロメタン溶液を、単離せずに化合物３８の調製に使用した。
３８の調製：化合物３７の溶液に、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカ
ルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（１．０２当量）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ
）（０．３４当量）、次いで１−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボ
ジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１．１当量）を添加した。混合物を５５℃に加熱した。反応
が完了したら（４〜５時間）、混合物を２０℃に冷却し、１：１の０．２Ｍクエン酸／ブ
ラインおよびブラインで連続して洗浄した。ジクロロメタン溶液を、アセトン、次いでＮ
，Ｎ−ジメチルホルムアミドへの溶媒交換に供し、生成物をアセトン／Ｎ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミドから飽和水性塩化ナトリウムへの沈殿によって単離した。粗生成物を水中で
数回再スラリー化し、残存するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび塩を除去した。
活性化された「Ｔａｉｌ」のアンカーローディング樹脂上への導入を、固相合成の間の
サブユニットの組み込みに使用した手順によって、ジメチルイミダゾリジノン（ＤＭＩ）
中で実施した。
モルホリノオリゴマーの合成用の固体支持体の調製：この手順を、粗い多孔度（４０〜
６０μｍ）のガラスフリット、オーバーヘッドスターラ、およびＴｅｆｌｏｎ三方栓を備
えて、フリットを通してのＮ２のバブリングまたは真空抽出を可能にする、シラン処理さ
れたジャケット付きペプチド容器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）で実施した。
以下の手順における樹脂の処理／洗浄ステップは、樹脂流動化または撹拌床反応器と溶
媒／溶液抽出との２つの基本操作からなる。樹脂流動化では、フリットを通してのＮ２の
上方への流れが可能になるように栓を位置付けし、特定の樹脂処理／洗浄液を反応器に添
加して、浸透させて、樹脂を完全に湿潤させた。次いで、混合を開始し、樹脂スラリーを
、特定の時間混合した。溶媒／溶液抽出では、混合およびＮ２流を停止し、真空ポンプを
始動させ、次いで廃棄物への樹脂処理／洗浄液の排出を可能にするように栓を位置付けた
。樹脂処理／洗浄液の全容量は、別途記述のない限り、１５ｍＬ／ｇ樹脂であった。
シラン処理されたジャケット付きペプチド容器中のアミノメチルポリスチレン樹脂（１
００〜２００メッシュ、約１．０ｍｍｏｌ／ｇ（窒素置換を基準にしたローディング量）
；７５ｇ、１当量、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ、ＵＫ、部品＃１４６４−Ｘ７９９）に、
１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ；２０ｍｌ／ｇ樹脂）を添加し、１〜２時間混合
しながら樹脂を膨潤させた。膨潤溶媒の排出後、樹脂をジクロロメタン（２×１〜２分）
、２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミン（２×
３〜４分）およびジクロロメタン（２×１〜２分）で洗浄した。最終洗浄液の排出後、樹
脂を、ジスルフィドアンカー３４の１−メチル−２−ピロリジノン溶液（０．１７Ｍ；１
５ｍＬ／ｇ樹脂、約２．５当量）で処理し、この樹脂／試薬混合物を４５℃で６０時間加
熱した。反応が完了したら、加熱を止め、アンカー溶液を排出し、樹脂を１−メチル−２
−ピロリジノン（４×３〜４分）およびジクロロメタン（６×１〜２分）で洗浄した。樹
脂を１０％（ｖ／ｖ）ジエチルジカルボネートのジクロロメタン溶液（１６ｍＬ／ｇ；２
×５〜６分）で処理し、次いでジクロロメタン（６×１〜２分）で洗浄した。樹脂３９（
図４を参照されたい）をＮ２流下で１〜３時間乾燥し、次いで真空下で一定重量（±２％
）まで乾燥した。収率：元の樹脂重量の１１０〜１５０％。
アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂のローディングの決定：樹脂のローディ
ング（潜在的に利用可能な反応性部位の数）を、樹脂１ｇあたりのトリフェニルメチル（
トリチル）基の数に関する分光アッセイにより決定する。
既知の重量の乾燥樹脂（２５±３ｍｇ）を、シラン処理した２５ｍｌメスフラスコに移
し、約５ｍＬのジクロロメタン中２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を添加する。内容物を
穏やかな旋回により混合し、次いで３０分間静置させる。容量をさらなるジクロロメタン
中２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で２５ｍＬに増やし、内容物を十分に混合する。容積
式ピペットを使用して、トリチル含有溶液（５００μＬ）のアリコートを１０ｍＬメスフ
ラスコに移し、容量をメタンスルホン酸で１０ｍＬに増やす。
最終溶液におけるトリチルカチオン含量を、４３１．７ｎｍにおけるＵＶ吸光度により
測定し、樹脂のローディングを、適切な容量、希釈、吸光率（ε：４１μｍｏｌ−１ｃｍ
−１）および樹脂重量を使用して、樹脂１ｇ当たりのトリチル基（μｍｏｌ／ｇ）で算出
する。このアッセイを三連で実施し、平均のローディングを算出する。
この実施例における樹脂のローディング手順は、概ね５００μｍｏｌ／ｇのローディン
グを有する樹脂を提供する。ジスルフィドアンカー組み込みステップを室温で２４時間実
施すると、３００〜４００μｍｏｌ／ｇのローディングが得られた。
Ｔａｉｌのローディング：アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の調製に関す
るものと同じ設定および容量を使用して、Ｔａｉｌを固体支持体に導入することができる
。アンカーローディング樹脂を酸性条件下でまず脱保護し、得られた材料を中和した後カ
ップリングした。カップリングステップでは、ジスルフィドアンカー溶液の代わりに、３
８（０．２Ｍ）の、４−エチルモルホリン（ＮＥＭ、０．４Ｍ）を含有するＤＭＩ溶液を
使用した。４５℃で２時間の後、樹脂３９を２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中
の５％ジイソプロピルエチルアミンで２回、ＤＣＭで１回洗浄した。この樹脂に、無水安
息香酸（０．４Ｍ）およびＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液を添加した。２５分後、反応器のジ
ャケットを室温まで冷却し、樹脂を、２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％
ジイソプロピルエチルアミンで２回、そしてＤＣＭで８回洗浄した。樹脂４０を濾過し、
高真空下で乾燥した。樹脂４０のローディングを、Ｔａｉｌのローディングにおいて使用
した、元のアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂３９のローディングであると定
義する。
固相合成：モルホリノオリゴマーを、２ｍＬのＧｉｌｓｏｎポリプロピレン反応カラム
（部品＃３９８０２７０）において、Ｇｉｌｓｏｎ ＡＭＳ−４２２自動ペプチド合成装
置にて調製した。水流のためのチャネルを備えたアルミニウムブロックを、合成装置に据
えたカラムの周りに設置した。ＡＭＳ−４２２は、代替的には、試薬／洗浄溶液を添加し
、特定の時間保持し、真空を使用してカラムを排出させる。
長さが最大約２５サブユニットの範囲のオリゴマーには、５００μｍｏｌ／ｇ樹脂に近
いローディングのアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。より長いオ
リゴマーには、３００〜４００μｍｏｌ／ｇ樹脂のローディングのアミノメチルポリスチ
レン−ジスルフィド樹脂が好ましい。５’−Ｔａｉｌを含む分子が望ましい場合、Ｔａｉ
ｌでローディングされた樹脂を、同じローディングガイドラインで選択する。
以下の試薬溶液を調製した：
脱トリチル化溶液：４：１ジクロロメタン／アセトニトリル中の１０％のシアノ酢酸（
ｗ／ｖ）；中和溶液：３：１ジクロロメタン／イソプロパノール中の５％のジイソプロピ
ルエチルアミン；カップリング溶液：０．１８Ｍ（または２０サブユニットより長く成長
したオリゴマーについては０．２４Ｍ）の所望の塩基および連結型の活性化されたモルホ
リノサブユニット、ならびに１，３−ジメチルイミダゾリジノン中の０．４ＭのＮ−エチ
ルモルホリン。異なる試薬溶液洗浄液を分離する移行洗浄液として、ジクロロメタン（Ｄ
ＣＭ）を使用した。
ブロックを４２℃に設定した合成装置において、３０ｍｇのアミノメチルポリスチレン
−ジスルフィド樹脂（またはＴａｉｌ樹脂）を含有する各カラムに、２ｍＬの１−メチル
−２−ピロリジノンを添加し、室温で３０分間置いた。２ｍＬのジクロロメタンで２回洗
浄した後、以下の合成サイクルを使用した：
各カラムが、適当なカップリング溶液（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｉ）を適当な順序で受容する
ように、個々のオリゴマーの順序を合成装置にプログラムした。カラム内のオリゴマーが
その最後のサブユニットの組み込みを完了したら、カラムをブロックから除去し、０．８
９Ｍの４−エチルモルホリンを含有する４−メトキシトリフェニルメチルクロリド（ＤＭ
Ｉ中０．３２Ｍ）から構成されるカップリング溶液によって手動で最後のサイクルを実施
した。
樹脂からの切断ならびに塩基および骨格保護基の除去：メトキシトリチル化後、樹脂を
、２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンで８回洗浄した。１−メチル−２−ピロリジノ
ン中、０．１Ｍの１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および０．７３Ｍのトリエチル
アミンからなる切断溶液を１ｍＬ添加し、カラムに蓋をして、室温で３０分間置いた。そ
の後、この溶液を、１２ｍＬのＷｈｅａｔｏｎバイアル中にドレインした。大幅に収縮し
た樹脂を、３００μＬの切断溶液で２回洗浄した。この溶液に、４．０ｍＬの濃水性アン
モニア（−２０℃で保存）を添加し、（Ｔｅｆｌｏｎで裏打ちしたスクリューキャップで
）バイアルにしっかりと蓋をし、混合物を旋回させて溶液を混合した。バイアルを４５℃
のオーブンに１６〜２４時間設置し、塩基および骨格保護基の切断を行った。
粗生成物の精製：バイアルに入ったアンモノリシス溶液をオーブンから取り出し、室温
まで冷却させた。この溶液を、２０ｍＬの０．２８％水性アンモニアで希釈し、Ｍａｃｒ
ｏｐｒｅｐ ＨＱ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を含有する２．５×１０ｃｍのカラムに通した。
塩勾配（Ａ：０．２８％アンモニアおよびＢ：０．２８％アンモニア中の１Ｍ塩化ナトリ
ウム；６０分で０〜１００％のＢ）を使用して、メトキシトリチル含有ピークを溶離した
。合わせた画分をプールし、所望の生成物に応じてさらに加工した。
モルホリノオリゴマーの脱メトキシトリチル化：Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ精製からのプール
した画分を１ＭのＨ３ＰＯ４で処理してｐＨを２．５まで下げた。最初の混合の後、試料
を室温で４分間置き、このとき、２．８％アンモニア／水でｐＨ１０〜１１に中和する。
生成物を、固相抽出（ＳＰＥ）により精製した。
ＳＰＥカラム充填およびコンディショニング：Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ ＣＧ−３００
Ｍ（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）（３ｍＬ）を２０
ｍＬのフリット状カラム（ＢｉｏＲａｄ Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃクロマトグラフィカラム（
７３２−１０１１））に充填し、樹脂を３ｍＬの以下：０．２８％ＮＨ４ＯＨ／８０％ア
セトニトリル；０．５Ｍ ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；５０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４／８
０％アセトニトリル；水；０．５ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；０．２８％ＮＨ４Ｏ
Ｈ；ですすぐ。
ＳＰＥ精製：脱メトキシトリチル化からの溶液をカラム上にローディングし、樹脂を、
３〜６ｍＬの０．２８％水性アンモニアで３回すすいだ。Ｗｈｅａｔｏｎバイアル（１２
ｍＬ）をカラムの下に設置し、２ｍＬの０．２８％水性アンモニア中４５％アセトニトリ
ルで２回洗浄することによって、生成物を溶離した。
生成物単離：溶液をドライアイス中で凍結させ、バイアルを凍結乾燥器に設置して、綿
毛状の白色粉末を生成させた。試料を水に溶解し、シリンジを使用して０．２２μフィル
タ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｃｒｏｄｉｓｃ ２５ｍｍシリンジフィ
ルタおよび０．２マイクロメートルのＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎメンブラン）を通して濾過し
、ＵＶ分光光度計にて光学密度（ＯＤ）を測定して、存在するオリゴマーのＯＤ単位を決
定し、分析用の試料を分配した。次いで、溶液をＷｈｅａｔｏｎバイアルに戻して設置し
、凍結乾燥した。
ＭＡＬＤＩによるモルホリノオリゴマーの分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用し
て、精製物における画分の組成を決定し、オリゴマーの正体のための証拠（分子量）を提
供した。試料をマトリクスとしての３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（シナピ
ン酸）、３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）またはアルファ−シア
ノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ）の溶液で希釈した後、試行した。
（実施例２）
実施例１に記載されているプロトコールを使用して、以下のＰＭＯを合成し：ＮＧ−１
３−０３９１ Ｈ４４Ａ（−８＋１５）、配列番号４（５’−ＧＡＴＣＴＧＴＣＡＡＡＴ
ＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴ−３’）；実施例８および９において使用した。
（実施例３）
実施例１に記載されているプロトコールを使用して、以下のＰＭＯを合成し：ＮＧ−１
３−０３９２ Ｈ４４Ａ（−７＋１５）、配列番号５（５’−ＧＡＴＣＴＧＴＣＡＡＡＴ
ＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧ−３’）；実施例８および９に記載されているように使用した。
（実施例４）
実施例１に記載されているプロトコールを使用して、以下のＰＭＯを合成し：ＮＧ−１
３−０３９３ Ｈ４４Ａ（−６＋１５）、配列番号６（５’−ＧＡＴＣＴＧＴＣＡＡＡＴ
ＣＧＣＣＴＧＣＡＧ−３’）；実施例８および９に記載されているように使用した。
（実施例５）
実施例１に記載されているプロトコールを使用して、以下のＰＭＯを合成し：ＮＧ−１
３−０３９４ Ｈ４４Ａ（−８＋１７）、配列番号７（５’−ＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＡ
ＡＴＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴ−３’）；実施例８および９に記載されているように使用し
た。
（実施例６）
実施例１に記載されているプロトコールを使用して、以下のＰＭＯを合成し：ＮＧ−１
３−０００８ Ｈ４４Ａ（−７＋１７）、配列番号１（５’−ＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＡ
ＡＴＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧ−３’）；実施例８および９に記載されているように使用した
。
（実施例７）
実施例１に記載されているプロトコールを使用して、以下のＰＭＯを合成し：ＮＧ−１
３−０３９５ Ｈ４４Ａ（−６＋１７）、配列番号８（５’−ＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＡ
ＡＴＣＧＣＣＴＧＣＡＧ−３’）；実施例８および９に記載されているように使用した。
（実施例８）
エキソン４４スキッピング
ヒトジストロフィンエキソン４４を標的とする一連のアンチセンスオリゴマーを設計し
、以下のように合成した：
先に示した選択されたアンチセンスオリゴマーを、様々な示した濃度でＲＤ細胞を処理
することによって、エキソンスキッピングの有効性について評価した。これらの実験にお
いて、Ｈ４４Ａ（−０６＋１４）およびＨ４４Ａ（＋８５＋１０４）（ＵＳ８，２３２，
３８４；それぞれ配列番号１６７および１６５）、ならびにＨ４４Ａ（−０６＋２０）、
Ｈ４４Ａ（−０９＋１７）、Ｈ４４Ａ（＋５９＋８５）およびＨ４４Ａ（＋６５＋９０）
（ＷＯ２０１１／０５７３５０；それぞれ配列番号６８、２２０、５４および１０）に対
応する公開されたアンチセンスオリゴマーを比較オリゴマーとして使用した。図３に示す
ように、オリゴマーＨ４４Ａ（−０７＋１７）（配列番号１）は、公知の配列と比較して
、ＲＤ細胞においてエキソン４４スキッピングを誘発するのに高度に有効であった。図４
に示すように、Ｈ４４Ａ（＋６２＋８９）（配列番号１１）は、当技術分野において公知
の他の高度に活性なアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、培養したＲＤ細胞にお
いてエキソン４４スキッピングを誘発するのに高度に有効であった。
（実施例９）
初代ヒト筋芽細胞におけるエキソン４４スキッピング
実施例８に記載されている上記結果に基づいて、さらなるオリゴマーを設計し、初代ヒ
ト筋芽細胞において試験した。当技術分野において公知の追加の配列を、新たに設計した
オリゴマーとの比較対象として分析に含めた（Ｈ４４Ａ（−１０＋１５）およびＨ４４Ａ
（−２０＋５）；それぞれ配列番号４４および４５）。これらの配列は、ＰＣＴ公開ＷＯ
／２０１０／０４８５８６において配列番号４および２として開示されている。図５〜６
に示すように、Ｈ４４Ａ（−０７＋１７）として定義された標的領域内で入れ子になって
いる一連のオリゴマーは、全て、当技術分野において公知の配列と比較して比較的高いレ
ベルでエキソン４４スキッピングを誘発する能力を有する。好ましいオリゴマーは、実施
例２〜７において先に示されている（それぞれ配列番号４、５、６、７、１および８）。
本明細書において引用される全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物
または特許出願が特におよび個々に参照により組み込まれていることが示されるかのよう
に参照により本明細書に組み込まれている。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の発明。
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