BR112014012892B1 - Compostos de reversão anticoagulante e composição farmacêutica compreendendo os referidos compostos - Google Patents

Abstract

COMPOSTOS DE REVERSÃO ANTICOAGULANTE E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO OS REFERIDOS COMPOSTOS. A presente invenção refere-se a novos compostos de reversão anticoagulantes, bem como métodos de fazer os compostos, composições farmacêuticas incluindo os compostos, métodos de usar os compostos para reverter os efeitos anticoagulantes de inibidores de coagulação e ensaios de diagnóstico compreendendo os compostos.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisional US 61/564.559 o qual foi depositado em 29 de novembro de 2011, Pedido de Patente Provisional US 61/614.292 o qual foi depositado em 22 de março de 2012, Pedido de Patente Provisional US 61/641.698 o qual foi depositado em 2 de maio de 2012, e Pedido de Patente Provisional US 61/666.291 o qual foi depositado em 29 de junho de 2012, o conteúdo do qual é aqui incorporado na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção descreve compostos que revertem completamente ou parcialmente efeitos anticoagulantes de inibidores de coagulação, tal como heparina não fracionada ("UFH"), heparina de baixo peso molecular ("LMWH"), fondaparinux e outros anticoagu- lantes de ligação de antitrombina, bem como inibidores de Xa e IIa diretos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A cascata de coagulação é um processo fisiológico normal que visa prevenir perda de sangue significativa ou hemorragia em seguida a lesão vascular. Há vezes, no entanto, que um coágulo de sangue (trombo) se formará quando ele não é necessário. Por exemplo, algumas condições de alto risco, tal como doença médica aguda, imobilização prolongada, cirurgia ou câncer, podem aumentar o risco de desenvolver um coágulo de sangue o qual pode potencialmente levar a consequências significativas, tal como a doença cardiovascular ate- rosclerótica e/ou ritmos cardíacos anormais.

[004] A cascata da coagulação consiste em uma série de etapas nas quais uma protease cliva e, posteriormente, ativa a próxima protease na sequência. Cada protease pode ativar diversas moléculas da próxima protease na série, amplificando esta cascata biológica. O resultado final destas reações é converter fibrinogênio, uma proteína solúvel, para fios insolúveis de fibrina. Juntamente com as plaquetas, os fios de fibrina formam um coágulo no sangue estável.

[005] Antitrombina (AT), um inibidor de serina protease, é o prin cipal inibidor no plasma de proteases de coagulação. AT bloqueia a cascata de coagulação, por exemplo, inibindo trombina (fator IIa) e fator X ativado (fator Xa). Heparina (heparina não fracionada) e hepari- nas de baixo peso molecular (LMWH; heparina fracionada) inibem o processo de coagulação através da ligação a AT via uma sequência de pentassacarídeos. Esta ligação leva a uma mudança conformacio- nal de AT, o que acelera sua inibição de fatores IIa, Xa e outras proteases envolvidas em coagulação de sangue. Uma vez dissociadas, heparina e LMWH são livres para ligar a outra molécula de antitrombi- na e, posteriormente, inibir mais trombina e fator Xa.

[006] Heparina não fracionada é uma mistura de glicosaminogli- canos (GAGs) descobertos no fígado de cães como tendo propriedades anticoagulantes em 1916 por McLean e Howell da Universidade Johns Hopkins. Além de anticoagulação, a heparina não fracionada foi considerada ter outras propriedades, incluindo anti-inflamação e an- giogênese. LMWHs são heparinas que consistem em cadeias curtas de polissacarídeo, geralmente tendo peso molecular menor que 8000 Da. LMWH e heparina são ambas usadas para prevenir a coagulação do sangue dentro do corpo, mas são usadas em diferentes situações na clínica.

[007] A heparina está disponível como uma solução líquida ad ministrada parenteralmente. LMWH, tal como enoxaparina, é uma porção de baixo peso molecular de heparina. Também está disponí- vel como uma solução injetável líquida. As marcas disponíveis atualmente de LMWH aprovadas pela FDA nos Estados Unidos são LO- VENOX® (nome genérico, enoxaparina) e FRAGMIN® (nome genérico, dalteparina).

[008] Heparina de baixo peso molecular ou fracionada tem maior especificidade para atividade de fator Xa sanguíneo e fator IIa do que heparina não fracionada. Além disso, LMWH tem um efeito mais reprodutível no tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), uma medida do tempo de coagulação. LWMH tem uma incidência mais baixa de Trombocitopenia Induzida por Heparina (HIT). Como LMWH tem eficácia mais previsível e uma incidência mais baixa de efeitos adversos, tal como HIT, os pacientes podem se injetar LMWH em casa, embora ela também seja usada muitas vezes no hospital. Por estas razões, LMWHs se tornaram o anticoagulante líder de mercado.

[009] Protamina, uma molécula carregada positivamente, pode ser usada para reverter a anticoagulação resultante de administração de heparina não fracionada altamente carregada negativamente ou heparina de baixo peso molecular (LMWH). Protamina é um produto natural que está associado com problemas de abastecimento, o que ressalta a necessidade de opções adicionais de agentes de reversão idealmente sintéticos. A atividade anticoagulante de LMWH pode ser parcialmente, mas não totalmente, revertida por administração intravenosa de protamina. A razão para a reduzida atividade de reversão de anticoagulação da protamina no caso de LMWH é acreditada ser devida a uma menor afinidade de ligação para a porção de LMWH no san-gue do que a heparina não fracionada. A protamina deve ser administrada lentamente, devido aos efeitos hipotensivos e às preocupações a respeito anafilaxia.

[0010] Recentemente, agentes anticoagulantes adicionais come çaram a ganhar a aprovação reguladora. Exemplos de tais anticoagu- lantes incluem dabigatran ou PRADAXA®, argatroban ou AR- GATROBAN®, rivaroxaban ou XARELTO®, apixaban ou ELIQUIS®, edoxaban ou LIXIANA® e fondaparinux ou ARIXTRA®. Estes anticoa- gulantes inibem cada um de fator IIa ou fator Xa de propagarem coagulação.

[0011] Anticoagulantes tais como dabigatran, fondaparinux, rivaro xaban e apixaban não têm nenhum agente de reversão aprovado. O atual estado da técnica para reversão de dabigatran ou PRADAXA® é empregar carvão ativado para tentar remover dabigatran do sangue e usar transfusões de sangue. Exceto Eerenberg et al. Circulation, 4 de outubro de 2011; 124(14):1573-9. Epub 2011 Set 6., que relata que em um pequeno experimento clínico, concentrado de complexo de pro- trombina foi capaz de reverter dabigatran, mas não rivaroxaban, não há dados ou antídoto clinicamente disponível para reverter qualquer um destes inibidores de Fator IIa ou Xa de coagulação. Portanto, quando pacientes são anticoagulados com estes agentes, os efeitos adversos associados com overdose, particularmente sangramentos importantes ou fatais, são muito mais perigosos do que os efeitos colaterais associados com a administração de heparina não fracionada. A ausência de agente de reversão limita, portanto, a utilização destas fármacos.

[0012] Por estas razões, existe uma necessidade clínica de lon ga data, forte, não satisfeita de novos agentes de reversão anticoa- gulação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0013] Inibidores de heparina, fragmentos de heparina, fondapari- nux e outros inibidores de fator Xa ou fator IIa. A estrutura geral dos agentes de reversão de anticoagulantes de interesse é: R-Z-R’, onde R e R’ são agentes positivamente carregados a pH fisiológico e podem ser as mesmas ou diferentes moléculas e Z é um composto de anel cíclico ou fundido hidrofóbico. Mais especificamente, o inibidor é representado por um composto de fórmula I ou um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo:

em que: A é um anel aromático ou não aromático, carbocíclico ou heterocíclico substituído ou não substituído ou uma porção linear; L e L’ são os mesmos ou diferentes e são ligantes; X e X’ são os mesmos ou diferentes e estão ausentes ou são um grupo funcional que fixa o ligante L a M e o ligante L’ a M’, respectivamente; M e M’ são os mesmos ou diferentes e estão ausentes ou são um ligante que fixa X a Y e X’ a Y’, respectivamente; e Y e Y’ são os mesmos ou diferentes e são uma porção contendo um ou mais átomos ou grupos catiônicos ou um ou mais grupos que se tornam catiônicos em condições fisiológicas.

[0014] Os compostos podem ser simétricos ou assimétricos; isto é, um ou mais de L, L’, X, X’, M, M’, Y ou Y’ podem ser os mesmos ou diferentes. Os compostos podem ser quirais (isto é, contêm um ou mais centros quirais) ou aquirais.

[0015] Em algumas modalidades, A é uma porção heterocíclica. Em outras modalidades, A é uma porção heterocíclica e L e L’ são uma cadeia de alquileno substituído ou não substituído. Em ainda outras modalidades, A é uma porção heterocíclica, L e L’ são uma cadeia de alquileno substituído ou não substituído, e X e X’ são -NH-C(=O)-. Em ainda outras modalidades, A é uma porção heterocíclica, L e L’ são uma cadeia de alquileno substituído ou não substituído, X e X’ são -NH-C(=O)-, e M e M’ são uma cadeia de alquileno substituído. Em ainda outras modalidades, A é uma porção heterocíclica, L e L’ são uma cadeia de alquileno substituído ou não substituído, X é -NH- C(=O)-, M e M' são uma cadeia de alquileno substituído, e Y e Y’ são uma porção de guanidina. Em modalidades particulares, A é um anel de piperazina 1,4 ou 2,5 dissubstituído.

[0016] Em outra modalidade da invenção, o inibidor é um compos to representado pela fórmula II ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

em que cada um de L, L’, M, M’, Y e Y’ é como aqui descrito.

[0017] Em outra modalidade da invenção o inibidor é um composto representado pela fórmula III ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

em que L, L’, M, M’, Y e Y’ são como aqui descritos.

[0018] Em ainda outra modalidade da invenção, o inibidor é um composto representado pela fórmula (IV) ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

em que Y e Y’ são como aqui descritos e n é de 3 a 5, m é de 3 a 6 e G é selecionado de -NH2 e OH. Mais preferencialmente, G é amino.

[0019] Ainda outra modalidade da invenção, o inibidor é um com- posto representado por qualquer uma das fórmulas II, III ou IV, e Y e Y’ são selecionados independentemente do grupo consistindo em

[0020] Mais preferencialmente, G é -NH2 e Y e Y’ são

[0021] Na modalidade preferida, o composto é di-arginina pipera- zina (DAP), representada na fórmula V, ou um composto relacionado, representado na fórmula VI, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos de qualquer composto:

Ácido 2-amino-5-guanidino-pentanoico (3-{4-[3-(2-amino-5-guanidino- pentanoilamino)-propil]-piperazin-1-il}-propil)-amida; ou

Ácido 2-amino-5-guanidino-pentanoico {5-[(2-amino-5-guanidino- pentanoilamino)-metil]-piperazin-2-ilmetil}-amida.

[0022] Em uma modalidade específica, o composto de fórmula V é um estereoisômero como representado na fórmula VII:

[0023] Em outra modalidade específica, o composto de fórmula VI é um estereoisômero como representado na fórmula VIII:

[0024] Os compostos da invenção podem ser administrados em uma composição farmacêutica como uma solução aquosa como um bolus e/ou infusão intravenosa, injeção subcutânea ou oralmente. Na modalidade preferida, os compostos são administrados por injeção (intravenosa, intramuscular ou subcutânea) em um veículo, tal como água estéril destilada, salina, salina tamponada ou outro excipiente farmaceuticamente aceitável para injeção. Em algumas modalidades, o inibidor pode ser administrado oralmente a uma superfície de mucosa (nasal, pulmonar, vaginal, retal ou bucal) ou por depósito.

[0025] Os compostos da invenção podem ser administrados em composição farmacêutica ao paciente em necessidade de reversão de heparina, LMWH ou outra anticoagulação mediada por inibidor de trombina em uma quantidade eficaz para restaurar coagulação normal e hemostasia. As composições farmacêuticas incluindo o composto da invenção são adequadas para uso hospitalar ou em reversão em casa de não emergência. Elas são administradas ao paciente em necessidade de reversão de heparina, LMWH ou outra anticoagulação mediada por inibidor de trombina em uma quantidade eficaz para restaurar coagulação. Os compostos e as composições farmacêuticas aqui descritas podem também ser usadas para reduzir a atividade de fatores de crescimento de ligação de heparina e/ou para reverter completamente ou em parte uma combinação de um ou mais agentes anticoa- gulantes de Fator IIa e/ou Fator Xa.

[0026] Assim, os compostos da invenção podem ser utilizados em um método de reverter completamente ou parcialmente um efeito anti- coagulante de um inibidor de coagulação. Os compostos da invenção também podem ser utilizados como uma parte de um kit de diagnóstico, por exemplo, um kit de diagnóstico para determinar concentração de um anticoagulante no sangue.

[0027] Os exemplos demonstram que DAP liga diretamente rivaro xaban, apixaban, heparina não fracionada, fondaparinux, e LMWH, revertendo a atividade anticoagulante. DAP reverteu anticoagulação de rivaroxaban oral e LMWH subcutânea in vivo, como medida por aPTT e fondaparinux subcutânea como medida por atividade de Xa em ratos. Reversão de DAP, confirmada pela redução estatisticamente significativa na perda de sangue em ensaio de transecção em rato de cauda, foi mostrada para apixaban, dabigatran, edoxaban e rivaroxaban. DAP totalmente reverteu apixaban e rivaroxaban a uma razão em massa de dose de cerca de 10:1 DAP:anticoagulante em sangue humano ex vivo, como medido usando um kit anti-Xa. DAP exibiu reversão dependente de dose de apixaban e rivaroxaban em sangue humano ex vivo. Reversão de rivaroxaban em sangue total humano re- cém-colhido foi confirmada por medições aPTT ex vivo. DAP não ligou em concentrações de argatroban até 1:1000 in vitro. DAP reverteu da- bigatran oral in vivo, em ratos, como medido por aPTT. Ratos dosea- dos com argatroban permaneceram anticoagulados após uma dose IV de 200x de DAP, mostrando que DAP é segura e que a interação de reversão é específica para as heparinas e novos anticoagulantes orais. Em resumo, os exemplos demonstram a complexação de DAP a hepa- rina e LMWH e que DAP serve como um excelente agente de reversão para heparina, compostos do tipo heparina e outros inibidores de trombina, incluindo dabigatran, heparinas de baixo peso molecular aprovadas, bem como rivaroxaban (XARELTO®), fondaparinux (ARIX- TRA®), edoxaban (LIXIANA®) e apixaban (ELIQUIS®), como testado em ensaios in vitro com sangue humano, testes anti-Xa e aPTT e/ou in vivo em um ensaio de transecção de cauda de rato.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] Figura 1 é um gráfico de fluxo de calor versus temperatura como medido por calorimetria de varredura diferencial (DCS) na qual DAP é aquecida de -20°C a 200°C ("1" ou "primeiro calor"), resfriada a -20°C e aquecida de volta a 200°C ("2" ou "segundo calor").

[0029] Figura 2 é um gráfico de DAP sozinha, UFH sozinha e combinação DAP-UFH em função de percentagem em volume em comparação com tamanho (d.nm) conforme medido por Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS).

[0030] Figura 3 é um gráfico de DAP sozinha, rivaroxaban sozinha e DAP-rivaroxaban em razões de 1:1 e 10:1, DAP:rivaroxaban em função do volume (por cento) em comparação com o tamanho (d.nm) como medido por DLS.

[0031] Figura 4 é um gráfico de DAP sozinha, apixaban sozinha e ligação DAP-apixaban em razões de 1:1, 10:1 e 100:1 em função do volume (por cento) em comparação com o tamanho (d.nm) como me- dido por DLS.

[0032] Figura 5 é um gráfico de DAP sozinha, fondaparinux sozi nha e ligação DAP-fondaparinux em razões de 1:1, 10:1 e 100:1 em função do volume (por cento) em comparação com o tamanho (d.nm) como medido por DLS.

[0033] Figura 6 é um gráfico de DAP sozinha, LMWH sozinha e ligação DAP-LMWH em razões de 1:1, 1:10 e 100:1 em função do volume (por cento) em comparação com o tamanho (d.nm) como medido por DLS.

[0034] Figura 7 é um gráfico de DAP sozinha, argatroban sozinha e ligação DAP-argatroban em raxões de 1:1, 10:1, 100:1 e 1000:1, em função do volume (por cento) em comparação com o tamanho (d.nm) como medido por DLS.

[0035] Figura 8 é um gráfico do tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT, segundos) medido ao longo do tempo (horas) durante cinco horas após administração subcutânea de 10 mg de bemiparina (LMWH) a um rato. Quatro horas em tratamento, o rato recebeu uma dose intravenosa de 200 mg/kg (100mg) de DAP.

[0036] Figura 9 é um gráfico de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT, segundos) medido ao longo do tempo (horas) após administração oral de PRADAXA® (dabigatran) a um rato seguida por administração intravenosa de 200 e 100 mg/kg (100mg e 50mg) de DAP.

[0037] Figura 10 é um gráfico de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) medido ao longo do tempo (horas) após administração subcutânea de heparina não fracionada (UFH) a um rato seguida por administração intravenosa de 200 mg/kg (100mg) e 400 mg/kg (200mg) de DAP.

[0038] Figura 11 é um gráfico de um aPTT (segundos) medido ao longo do tempo (horas) após administração oral de 5mg/kg de rivaro xaban a um rato seguida pela administração intravenosa de 5 mg/kg (2 mg) de DAP.

[0039] Figura 12 é um gráfico de concentração de fondaparinux ativa (μg/mL) medida ao longo do tempo (minutos após reversão) depois de uma administração subcutânea de 5 mg/kg de fondaparinux a um rato, seguida pela administração intravenosa de 200 mg/kg de DAP (isto é, "reversão").

[0040] Figura 13 é um gráfico de aPTT (segundos) medido ao lon go do tempo (minutos após reversão) após administração oral de 15,5 mg/kg de PRADAXA® (dabigatran) a um rato, seguida pela administração intravenosa de 100 mg/kg de DAP (isto é, "reversão").

[0041] Figura 14 é um gráfico do tempo aPTT (segundos) durante 0, 2, 10, 25, 50 e 100 mg de DAP administrada intravenosamente.

[0042] Figura 15 é um gráfico de sangue coletado (isto é, perda de sangue cumulativa) ao longo de 30 minutos em um ensaio de sangra- mento de transecção de cauda de rato em ratos que receberam 2 mg de rivaroxaban e 0 mg de DAP, 2 mg de rivaroxaban e 2,5 mg de DAP, 2 mg de rivaroxaban e 12,5 mg de DAP, ou reversão falsa e doses an- ticoagulantes ("simulado"). Com grupos de três ratos da mesma idade, 12,5 mg de DAP reduziram a perda de sangue para níveis de doses simuladas produzindo uma diferença estatisticamente significativa (* p<0,05) de ratos que receberam apenas rivaroxaban.

[0043] Figura 16 é um gráfico de sangue coletado (isto é, perda de sangue cumulativa) durante 30 minutos em um ensaio de sangramento de transecção de cauda de rato em ratos que receberam 1,25 mg de apixaban e 0 mg de DAP, 1,25 mg de apixaban e 5 mg DAP, 1,25 mg de apixaban e 12,5 mg de DAP, ou doses de reversão simulada e de anticoagulante ("simulado"). Com grupos de três ratos da mesma idade, 5 mg e 12,5 mg de DAP reduziram a perda de sangue para níveis de dose simulada produzindo uma diferença estatisticamente significa- tiva (*** p<0,01) de ratos que receberam apenas apixaban.

[0044] Figura 17 é um gráfico de sangue coletado (isto é, perda de sangue cumulativa) ao longo de 30 minutos em um ensaio de sangra- mento de transecção de cauda de rato em ratos que receberam 1,25 mg de edoxaban e 0 mg de DAP, 1,25 mg de edoxaban e 12,5 mg de DAP, ou doses de reversão simulada e anticoagulante ("simulação"). Com grupos de três ratos da mesma idade, 12,5 mg de DAP reduziram perda de sangue para níveis de doses simuladas produzindo uma diferença estatisticamente significativa (* p<0,05) de ratos que receberam apenas edoxaban.

[0045] Figura 18 é um gráfico de sangue coletado (isto é, perda de sangue cumulativa) durante 30 minutos em um ensaio de sangramento de transecção de cauda de rato em ratos que receberam 15 mg de dabigatran etexilato e 0 mg de DAP, 15 mg de dabigatran etexilato e 5 mg de DAP, 15 mg de dabigatran etexilato e 12,5 mg de DAP, ou doses de reversão simulada e anticoagulante ("simulação"). Com grupos de três ratos da mesma idade, 12,5 mg de DAP reduziram a perda de sangue para níveis de doses simulados produzindo uma diferença estatisticamente significativa (*** p<0,01) de ratos que receberam apenas dabigatran etexilato.

[0046] Figura 19 é um gráfico de aPTT (segundos) medido em sangue humano recentemente colhido tratado ex vivo com 50 micro- gramas/ml de DAP, 0,25 micrograma/ml de rivaroxaban, 50 microgra- mas/ml de DAP e 0,25 micrograma/ml de rivaroxaban ou salina.

[0047] Figura 20 é um gráfico que mostra a concentração de anti- coagulante eficaz medida por ensaio de atividade anti-fator Xa em plasma humano tratado ex vivo com 218 μg/L de rivaroxaban sozinha ou em combinação com 1,250 mg/L de DAP, e 459 μg/L de rivaroxaban sozinha ou em combinação com 6,250 μg/L de DAP.

[0048] Figura 21 é um gráfico que mostra a concentração de anti- coagulante eficaz medida por ensaio de atividade anti-fator Xa em plasma humano tratado ex vivo com 156 μg/L de apixaban sozinho ou em combinação com 1,156 μg/L de DAP, e 313 μg/L de apixaban sozinho ou em combinação com 3,125 μg/L de DAP.

[0049] Figura 22 é um gráfico que mostra a concentração de anti- coagulante eficaz medida pelo ensaio de atividade anti-fator Xa em plasma humano tratado ex vivo com 218 μg/L de rivaroxaban, sozinha ou em combinação com quantidades crescentes (1,25, 12,5, 125 e 1250 μg/L) de DAP.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Agentes de Reversão de Anticoagulante

[0050] Novos agentes de reversão de anticoagulante são descrits. Os compostos da invenção incluem compostos aqui descritos, assim como os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[0051] Inibidores de heparina, fragmentos de heparina, fondapari- nux e inibidores de fator Xa ou fator IIa (por exemplo, inibidores de fator oral Xa ou fator IIa) foram desenvolvidos. A estrutura geral dos agentes de reversão de anticoagulante de interesse é: R-Z-R’, onde R e R’ são agentes positivamente carregados a pH fisiológico e podem ser as mesmas ou diferentes moléculas e Z é um composto de anel cíclico ou fundido hidrofóbico.

[0052] Mais especificamente, o inibidor é um composto da fórmula (I) ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

em que: A é um anel aromático ou não aromático, carbocíclico ou heterocíclico substituído ou não substituído ou uma porção linear; L e L’ são os mesmos ou diferentes e são ligantes; X e X’ são os mesmos ou diferentes e estão ausentes ou são um grupo funcional que fixa o ligante L a M e o ligante L’ a M’, respectivamente; M e M’ são os mesmos ou diferentes e estão ausentes ou são um ligante que fixa X a Y e X’ a Y’, respectivamente; e Y e Y’ são os mesmos ou diferentes e são uma porção contendo um ou mais átomos ou grupos catiônicos ou um ou mais grupos que se tornam catiônicos em condições fisiológicas.

[0053] Os compostos podem ser simétricos ou assimétricos; isto é, um ou mais de L, L’, X, X’, M, M’, Y ou Y’ podem ser os mesmos ou diferentes. Os compostos podem ser quirais (isto é, contêm uma ou mais centros quirais) ou aquirais.

[0054] Em algumas modalidades, A é uma porção heterocíclica. Em outras modalidades, A é uma porção heterocíclica e L e L’ são uma cadeia de alquileno substituído ou não substituído. Em ainda outras modalidades, A é uma porção heterocíclica, L e L’ são uma cadeia de alquileno substituído ou não substituído, e X e X’ são -NH-C(=O)-. Em ainda outras modalidades, A é uma porção heterocíclica, L e L’ são uma cadeia de alquileno substituído ou não substituído, X e X’ são -NH-C(=O)-, e M e M’ são uma cadeia de alquileno substituído. Tal como aqui utilizado, cadeia de alquileno é uma porção de alquileno divalente que é C1 a C10, preferivelmente C3 a C6 de comprimento, e que pode ser substituído ou não substituído. Exemplos de substituintes incluem alquila, hidroxila, hidroxil alquila, amino, amino alquila, alcóxi, alquil alcóxi. Tal como aqui utilizado, o termo alquila é C1 a C10, preferivelmente hidrocarboneto C1 a C6 de cadeia linear ou ramificada. Em ainda outras modalidades, A é uma porção heterocíclica, L e L’ são uma cadeia de alquileno substituído ou não substituído, X é -NH- C(=O)-, M e M’ são uma cadeia de alquileno substituído, e Y e Y’ é uma porção de guanidina.

[0055] Em algumas modalidades, A é um anel heterocíclico não aromático, tal como piperazina ou dicetopiperazina. Em outras modali- dades, A é uma porção linear, tal como uma diamina linear ou outra porção linear contendo grupos funcionais reativos que podem formar uma ligação a X e X’, quando presentes, ou Y e Y'. Em algumas modalidades, os ligantes L e L’ são fixados aos heteroátomos no anel A, tal como os dois átomos de nitrogênio na piperazina. Em outras modalidades, os ligantes L e L’ são fixados a átomos que não heteroátomos no anel, tal como carbono. Em modalidades particulares, A é um anel de piperazina, 1,4 ou 2,5 dissubstituído. Em algumas modalidades, L e L’ e/ou M e M’ são cadeias de alquileno substituído ou não substituído, tal como -(CH2)n-, onde n é um número inteiro de 1-10, de preferência 1-6, por exemplo, 1-3. Em modalidades particulares, n é 3. Em algumas modalidades, L e/ou M estão ausentes.

[0056] X e X’ são um grupo funcional que fixa os ligantes L e L’ a Y e Y’. Exemplos de grupos funcionais incluem, mas não estão limitados a, ésteres, amidas, carbonatos e cetonas. Em modalidades particulares, X e X’ são um grupo funcional que é resistente a hidrólise simples, tal como um grupo amida.

[0057] Y e Y’ são uma porção que contém um ou mais átomos ou grupos que são catiônicos ou serão catiônicos em condições fisiológicas. Exemplos incluem porções de amina e guanidina, bem como porções contendo fósforo, tal como porções de alquiltrifenilfosfônio, tetra- fenilfosfônio, tetrafenilarsônio, tribenzil amônio e fosfônio. Porções ca- tiônicas adicionais incluem oligômeros e polímeros catiônicos, tal como oligo ou polilisina, oligo ou poliarginina, polietileno imina N-alquilado e semelhantes. Outras porções catiônicas incluem cátions lipofílicos des- localizados contendo uma a três unidades carbimino, sulfimino ou fos- finimino como descrito em Kolomeitsev et al., Tet. Let., Vol. 44, N.° 33, 5795-5798 (2003).

[0058] Em algumas modalidades, o composto é um derivado de piperazina, em que as cadeias laterais de aminoácidos contêm um ou mais átomos carregados positivamente ou átomos que serão carregados positivamente em condições fisiológicas. Exemplos incluem diar- ginina piperazina. Outros aminoácidos que são carregados positivamente ou serão carregados positivamente em condições fisiológicas pode ser usados em lugar de arginina.

[0059] "Aromático", tal como aqui utilizado, se refere a sistemas de anel de 5 a 12 membros, de preferência 5, 6 e 7 membros, aromático, heterocíclico, aromático fundido, heterocíclico fundido, diaromático ou di-heterocíclico, opcionalmente substituídos. De um modo amplamente definido, "Ar", conforme aqui usado, inclui grupos aromáticos de anel único de 5, 6 e 7 membros que podem incluir de zero a quatro heteroá- tomos, por exemplo, benzeno, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, triazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina e pirimidina, e outros semelhantes. Aqueles grupos aril tendo heteroátomos na estrutura de anel podem também ser referidos como "heterociclos arial" ou "hetero- aromáticos". O anel aromático pode ser substituído em uma ou mais posições do anel por tais substituintes como descritos acima, por exemplo, halogênio, azida, alquila, aralquila, alquenila, alquinila, ciclo- alquial, hidroxila, alcoxila, amino, nitro, sulfidrila, imino, amido, fosfona- to, fosfinato, carbonila, carboxila, silila, éter, alquiltio, sulfonila, sulfo- namido, cetona, aldeído, éster, heterociclila, porções aromáticas ou heteroaromáticas, --CF3, --CN, ou outros semelhantes. O termo "Ar" inclui também sistemas de anéis policíclicos tendo dois ou mais anéis cíclicos nos quais dois ou mais carbonos são comuns a dois anéis adjacentes (isto é, "anéis fundidos") em que pelo menos um dos anéis é aromático, por exemplo, o outro anel cíclico, ou anéis, podem ser ci- cloalquilas, cicloalquenilas, cicloalquinilas, arilas e/ou heterociclos. Exemplos de anel heterocíclico incluem, mas não estão limitados a, benzimidazolila, benzofuranila, benzotiofuranila, benzotiofenila, ben- zoxazolila, benzoxazolinila, benzotiazolila, benzotriazolila, benzotetra- zolila, benzisoxazolila, benzisotiazolila, benzimidazolinila, carbazolila, 4aH carbazolila, carbolinila, cromanila, cromenila, cinolinila, deca- hidroquinolinila, 2H,6H-1,5,2-ditiazinila, di-hidrofuro [2,3-b]tetra- hidrofurano, furanila, furazanila, imidazolidinila, imidazolinila, imidazoli- la, lH-indazolila, indolenila, indolinila, indolizinila, indolila, 3H-indolila, isatinoil, isobenzofuranila, isocromanila, isoindazolila, isoindolinil, isoindolila, isoquinolinila, isotiazolila, isoxazolila, metilenodioxifenila, morfolinila, naftiridinila, octa-hidroisoquinolinila, oxadiazolila, 1,2,3- oxadiazolila, 1,2,4-oxadiazolila, 1,2,5-oxadiazolila, 1,3,4-oxadiazolila, oxazolidinila, oxazolil, oxindolil, pirimidinila, fenantridinila, fenantrolinila, fenazinila, fenotiazinila, fenoxatinila, fenoxazinila, ftalazinila, piperazini- la, piperidinila, piperidonila, 4-piperidonila, piperonila, pteridinila, purini- la, piranila, pirazinila, pirazolidinila, pirazolinila, pirazolila, piridazinila, piridoxazol, piridoimidazol, piridotiazol, piridinila, piridila, pirimidinila, pirrolidinila, pirrolinila, 2H-pirrolila, pirrolila, quinazolinila, quinolinila, 4H-quinolizinila, quinoxalinila, quinuclidinila, tetra-hidrofuranial, tetra- hidroisoquinolinila, tetra-hidroquinolinila, tetrazolila, 6H-1,2,5- tiadiazinila, 1,2,3-tiadiazolila, 1,2,4-tiadiazolila, 1,2,5-tiadiazolila, 1,3,4- tiadiazolila, tiantrenila, tiazolila, tienila, tienotiazolila, tienoxazolila, tie- noimidazolila, tiofenila e xantenila.

[0060] "Heterociclo" ou "heterocíclico", tal como aqui utilizado, re fere-se a um radical cíclico fixado por meio de um carbono ou nitrogênio de anel de um anel monocíclico ou dicíclico contendo de 3 a 10 átomos de anel e, preferivelmente, de 5 a 6 átomos de anel consistindo em carbono e um a quatro heteroátomos cada um selecionado do grupo que consiste em oxigênio não peróxido, enxofre e N(R) em que R está ausente ou é H, O, (C1-4) alquila, fenila ou benzila e, opcionalmente, contendo 1-3 ligações duplas e, opcionalmente, substituído por um ou mais substituintes. Exemplos de anel heterocíclico incluem, mas não estão limitados a, benzimidazolila, benzofuranila, benzotiofuranila, benzotiofenila, benzoxazolila, benzoxazolinila, benzotiazolila, benzotriazolila, benzotetrazolila, benzisoxazolila, benzisotiazolila, benzimi- dazolinila, carbazolila, 4aH-carbazolila, carbolinila, cromanila, cromeni- la, cinolinila, deca-hidroquinolinila, 2H,6H-1,5,2-ditiazinila, di- hidrofuro[2,3-b]tetra-hidrofurano, furanila, furazanila, imidazolidinila, imidazolinila, imidazolila, 1H-indazolila, indolenila, indolinila, indolizini- la, indolila, 3H-indolila, isatinoila, isobenzofuranila, isocromanila, isoin- dazolila, isoindolinila, isoindolila, isoquinolinila, isotiazolila, isoxazolila, metilenodioxifenila, morfolinila, naftiridinila, octa-hidroisoquinolinila, oxadiazolila, 1,2,3-oxadiazolila, 1,2,4-oxadiazolila, 1,2,5- oxadiazolila, 1,3,4-oxadiazolila, oxazolidinila, oxazolila, oxindolila, pirimidinila, fe- nantridinila, fenantrolinila, fenazinila, fenotiazinila, fenoxatinila, fenoxa- zinila, ftalazinila, piperazinila, piperidinila, piperidonila, 4-piperidonila, piperonila, pteridinila, purinila, piranila, pirazinila, pirazolidinila, pirazoli- nila, pirazolila, piridazinila, piridoxazol, piridoimidazol, piridotiazol, piri- dinila, piridila, pirimidinila, pirrolidinila, pirrolinila, 2H-pirrolila, pirrolila, quinazolinila, quinolinila, 4H-quinolizinila, quinoxalinila, quinuclidinila, tetra-hidrofuranila, tetra-hidroisoquinolinila, tetra-hidroquinolinila, tetrazolila, 6H-1,2,5-tiadiazinila, 1,2,3-tiadiazolila, 1,2,4-tiadiazolila, 1,2,5- tiadiazolila, 1,3,4-tiadiazolila, tiantrenila, tiazolila, tienila, tienotiazolila, tienoxazolila, tienoimidazolila, tiofenila e xantenila.

[0061] Em outra modalidade da invenção, o inibidor é um compos to representado pela fórmula II, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

em que cada um de L, L’, M, M’, Y e Y’ é tal como anteriormente descrito.

[0062] Em outra modalidade da invenção, o inibidor é um compos to representado pela fórmula III ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: em que L, L’, M, M’, Y e Y’ são tal como anteriormente descritos.

[0063] Em ainda outra modalidade da invenção, o inibidor é um composto representado pela fórmula (IV) ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

em que Y e Y’ são como descritos anteriormente e n é de 3 a 5, m é de 3 a 6 e G é selecionado de -NH2 e OH. Mais preferencialmente, G é amino.

[0064] Ainda uma outra modalidade da invenção, o inibidor é um composto representado por qualquer uma das fórmulas II, III ou IV, e Y e Y’ são selecionados independentemente do grupo que consiste em

[0065] Mais preferencialmente, G é -NH2 e Y e Y’ são

[0066] Assim, em uma modalidade, o composto da invenção é di- arginina piperazina ("DAP"), tal como o composto de fórmula V, ou um composto relacionado de fórmula VI, ou sais farmaceuticamente acei-táveis de cada composto:

Ácido 2-amino-5-guanidino-pentanoico (3-{4-[3-(2-amino-5-guanidino- pentanoilamino)-propil]-piperazin-1-il}-propil)-amida; ou

Ácido 2-amino-5-guanidino-pentanoico {5-[(2-amino-5-guanidino- pentanoilamino)-metil]-piperazin-2-ilmetil}-amida.

[0067] Em uma modalidade específica, o composto de fórmula V é um estereoisômero como representado na fórmula VII:

[0068] Em outra modalidade específica, o composto de fórmula VI é um estereoisômero como representado na fórmula VIII:

[0069] A frase "sal farmaceuticamente aceitável" de um composto como aqui utilizado significa um sal que é farmaceuticamente aceitável e que possui a atividade farmacológica desejada do composto parenal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de grupos acídicos ou básicos presentes em compostos da invenção. Sais de adição ácidos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, sais cloridrato, bromidrato, iodidrato, nitrato, sulfato, bissulfato, fosfato, ácido fosfato, isonicotinato, acetato, lactato, salicilato, citrato, tartarato, panto- tenato, bitartarato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, meta- nossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato e pamoato (isto é, 1,1’-metileno-bis-(2-hidróxi-3-naftoato)). Sais de base adequados incluem, mas não estão limitados a, alumínio, cálcio, lítio, magnésio, potássio, sódio, zinco e sais de dietanolamina.

[0070] O composto da invenção inibe a atividade de inibidores de coagulação. Um mecanismo proposto de ação do composto da invenção é por meio de moléculas carregadas negativamente de ligação (por exemplo, fondaparinux, heparina não fraccionada, LMWH, aqui descritos). Outros inibidores de coagulação (por exemplo, inibidores de fator IIa e fator Xa, tal como dabigatran, apixaban, edoxaban, e rivaroxaban, aqui descritos) também possuem cargas negativas; assim, o composto da invenção pode inibir estes inibidores de coagulação através de neutralização de suas porções carregadas negativamente.

[0071] Outro mecanismo proposto de ação do composto da inven ção é por meio de interações físicas fracas, tal como ligação de hidro-gênio, e interações hidrofóbicas com os inibidores de coagulação. Os inibidores de Fator IIa e Xa orais possuem porções hidrofóbicas que podem causar associação hidrofóbica com o composto da invenção, por exemplo, DAP.

[0072] Assim, em algumas modalidades, os compostos da inven ção contêm pelo menos uma porção cíclica hidrofóbica, por exemplo, um ou uma combinação de anéis alifáticos ou aromáticos, incluindo anéis fundidos. Em outras modalidades, os compostos da invenção contêm pelo menos uma porção hidrofóbica cíclica e pelo menos duas porções carregadas positivamente ou parcialmente carregadas a pH fisiológico.

[0073] Em algumas modalidades da invenção, uma ou ambas as argininas dos compostos de Fórmulas V e VI (ou dos compostos de Fórmulas VII e VIII) são substituídas por um ou mais aminoácidos car-regados positivamente, seus derivados, ou compostos similarmente carregados, por exemplo, lisina, histidina, ornitina. As argininas nos compostos de Fórmulas V e VI, ou aminoácidos carregados positivamente usados em lugar de tais argininas podem ser aminoácidos de ocorrência natural (isto é, L-aminoácidos), os seus enantiômeros (isto é, D-aminoácidos), ou misturas racêmicas ou outras. "Enantiômeros" referem-se a dois estereoisômeros de um composto que são imagens de espelho não sobrepostas entre si.

[0074] Definições estereoquímicas e convenções usadas aqui geralmente seguem S.P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York.; e Eliel, E. e Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Muitos compostos orgânicos existem em formas opticamente ativas, isto é, eles têm a capacidade de girar o plano de luz polarizada em plano. Ao descrever um composto opticamente ativo, os prefixos D e L ou R e S são usados para denotar a configuração absoluta da molécula em torno de seu(s) centro(s) quiral(is). Os prefixos D e L ou (+) e (-) são empregados para designar o sinal de rotação de luz polarizada em plano pelo composto, com (-) ou L significando que o composto é levorrotatório. Um composto com o prefixo (+) ou D é dextrorrotatório. Para uma determinada estrutura química, estes estereoisômeros são idênticos exceto que eles são imagens de espelho um do outro. Um estereoisômero específico pode também ser denominado como um enantiômero e uma mistura desses isômeros é muitas vezes chamada de uma mistura enantiomérica. Uma mistura 50:50 de enantiômeros é denominada como uma mistura racêmica ou um racemato o qual pode ocorrer quando não houve nenhuma estere- osseleção ou estereoespecificidade em uma reação ou um processo químico. Os termos "mistura racêmica" e "racemato" referem-se a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, desprovidas de atividade óptica.

[0075] Em outras modalidades da invenção, o composto da inven ção contém pelo menos uma porção cíclica hidrofóbica, por exemplo, um ou uma combinação de anéis alifáticos e aromáticos, incluindo anéis fundidos. Os compostos de interesse contêm pelo menos uma porção hidrofóbica cíclica e pelo menos duas porções carregadas positivamente ou parcialmente carregadas a pH fisiológico.

[0076] Atenção especial deve ser dada para o projeto de agentes terapêuticos à base de peptídeos, uma vez que tais agentes podem provocar reações imunológicas indesejáveis e muitas vezes graves, uma vez administrados a um sujeito. O composto da invenção é concebido para ser de peso molecular suficientemente baixo, para minimizar problemas de imunogenicidade. Em uma modalidade, a fim de evitar a ativação da resposta imune, o composto é concebido de tal forma que seu peso molecular seja menor do que cerca de 5000 dáltons, tal como menos do que ou de cerca de 1000 dáltons, por exemplo, cerca de 500 dáltons. Em uma modalidade, o peso molecular do composto é de cerca de 512 dáltons.

[0077] É preferível que os compostos da invenção não liguem, ou de outro modo interfiram com a função de ERG, a um canal de íon de potássio que contribui para a condutividade elétrica do coração. A inibição deste canal de potássio pode levar a síndrome QT longa potencialmente fatal, e algumas fármacos candidatas de outra forma bem- sucedidas exibiram ligação ERG humana.

[0078] Além disso, é preferível que o composto da invenção não iniba ou sirva como substratos para citocromo p450 ligado à membrana (CYP). CYPs são enzimas principais envolvidas no metabolismo de fármaco e a modulação de atividade CYP pode interferir com depuração e metabolismo de outras fármacos administradas a um sujeito, causando interações de fármaco indesejáveis.

[0079] Além disso, de preferência, os compostos da invenção não exibem ligação a proteína de plasma significativa in vitro (por exemplo, ligação de albumina). Uma vez que os compostos da invenção são em grande parte não ligados a proteínas plasmáticas, eles exibem meias vidas de atividade curtas minimizando o risco de overdose com base em acumulação.

II. Síntese de Agentes de Reversão de Anticoagulantes

[0080] Os compostos e seus sais farmaceuticamente aceitáveis aqui descritos são preparados utilizando uma variedade de métodos partindo de compostos disponíveis comercialmente, compostos co-nhecidos ou compostos preparados por métodos conhecidos. Exemplos de rotas sintéticas para um dos compostos aqui descritos (Composto de Fórmula V, di-arginina piperazina, "DAP") estão incluídos nos esquemas abaixo. Os esquemas abaixo são também aplicáveis ao composto estereoisômero de DAP de Fórmula VII selecionando os compostos de partida estereoisoméricos adequados. Outros compostos da invenção podem ser sintetizados seguindo um esquema sintético semelhante. É compreendido pelos versados na técnica que a ordem de etapas aqui mostrada pode ser alterada para acomodar funcionalidades na molécula-alvo. É também entendido pelos versados na técnica que podem ser necessárias várias etapas de proteção e desproteção para síntese. A necessidade de proteção e desproteção, e a seleção de grupos de proteção adequados, encontram-se, por exemplo, em Greene and Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, John Wiley & Sons (1991) o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[0081] Em algumas modalidades da presente invenção, o grupo de proteção é um grupo butiloxicarbonila terciário (Boc). Em outras moda-lidades da presente invenção, o grupo de proteção é grupo 2,2,4,6,7- Pentametildi-hidrobenzofuran-5-sulfonila (Pbf). Em outra modalidade, o grupo de proteção de aminoácido pode ser, mas não está limitado a, 2,2,5,7,8-pentametil-croman-6-sulfonila (PMC).

[0082] Os grupos de proteção podem ser removidos por uma vari edade de rotas. A remoção de grupo de proteção compreende, por exemplo, tratar composto protegido com ácido trifluoracético (TFA), HCl aquoso, ou aquecimento em ácido acético. Como a remoção de grupos de proteção, por exemplo, remoção de grupos de proteção em condições acídicas, pode resultar na produção de espécies catiônicas que podem alquilar os grupos funcionais na cadeia peptídica, expur- gadores podem ser adicionados durante o a etapa de desproteção para reagir com qualquer uma das espécies reativas livres. Exemplos de expurgadores incluem, mas não estão limitados a, água, derivados de anisol e derivados de tiol. Assim, em uma modalidade, a remoção de grupos de proteção compreende tratar composto protegido com TFA e um expurgador (por exemplo, TFA e água).

[0083] Vários solventes, por exemplo, solventes orgânicos, podem ser usados nas etapas da síntese. Solventes apropriados incluem, mas não estão limitados a, sulfóxido de dimetila, dimetilformamida (DMF), tetra-hidrofurano, metanol, etanol, cloreto de metileno, tolueno e acetona. Em algumas modalidades, o solvente é DMF.

[0084] Agentes de ligação de ácidos adequados podem ser usa dos nas etapas da síntese. Estes incluem, mas não estão limitados a, bases orgânicas, tal como, por exemplo, piridina, trietilamina, trietano- lamina, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), e di- isopropiletilamina (DIEA); e bases inorgânicas, tal como, por exemplo, hidreto de sódio, carbonato de potássio e carbonatos de sódio. Em al-gumas modalidades, o agente de ligação de ácido é DIEA.

[0085] A síntese pode incluir reagentes de acoplamento de peptí- deo. Os reagentes de acoplamento de peptídeo podem incluir, mas não estão limitados a, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDC), N-Hidroxibenzotriazol (HOBt), carbonildi-imidazol (CDI), diciclo- hexilcarbodi-imida (DCC), éster de N-hidroxisuccinamida ativo (OSu), O-Benzotriazol-N,N ,N’,N’-tetrametil-urônio-hexafluor-fosfato (HBTU) e combinações dos mesmos. Em uma modalidade, o reagente de aco-plamento peptídico é HBTU. Em outra modalidade, o reagente de aco-plamento peptídico é EDC/HOBt. Em ainda outra modalidade, o reagente de acoplamento peptídico é um éster OSu ativo.

[0086] Além disso, a síntese pode incluir uma etapa na qual um produto em bruto é purificado, por exemplo, por cromatografia em coluna. Os produtos desejados de cada etapa ou série de etapas podem ser separados e/ou purificados até o grau desejado de homogeneidade pelas técnicas comuns na técnica. Tipicamente, tais separações envolvem extração de múltiplas fases, cristalização a partir de um solvente ou mistura de solvente, destilação, sublimação ou cromatografia. A cromatografia pode envolver qualquer número de métodos incluindo, por exemplo: fase reversa e fase normal; exclusão de tamanho; troca iônica; métodos e aparelhos de cromatografia líquida de alta, média e baixa pressão; analítica de pequena escala; leito móvel simulado (SMB) e cromatografia em camada fina ou espessa preparativa, bem como técnicas de camada fina em pequena escala e de cromatografia flash.

[0087] Em um esquema, o composto de Fórmula V (DAP)

é sintetizado por reação de equivalentes em excesso (por exemplo, pelo menos cerca de dois equivalentes) de composto 1

com um equivalente de composto 2

na presença de um reagente de acoplamento peptídico, para obter um composto 3

em que P1 é um grupo de proteção e P2 é um grupo de proteção ou é um hidrogênio.

[0088] Em uma modalidade, o reagente de acoplamento peptídico é HBTU, EDC/HOBt, ou um éster OSu ativo. Em uma modalidade, o grupo de proteção P1 é Boc. Em outra modalidade, o grupo de proteção P2 é Pbf. Em uma modalidade diferente, o grupo de proteção P1 é Boc e P2 é um hidrogênio.

[0089] Subsequentemente, 3 pode ser purificado. Esta purificação pode envolver vários métodos de cromatografia de coluna conhecidos na técnica.

[0090] Grupos de proteção 3 podem ser removidos por uma varie dade de métodos conhecidos na técnica, a fim de obter o composto de Fórmula V. A desproteção pode ser conseguida por, por exemplo, re-moção de grupos de proteção utilizando ácido trifluoracético (TFA) e água, TFA e água ou outro expurgador incluindo, mas não limitado a, HCl aquoso, ou aquecimento em ácido acético.

[0091] O composto pode ainda ser purificado usando um método de cromatografia de coluna, tal como cromatografia de troca iônica com tampões de sal ou HPLC preparativa com ácido trifluoracético ou ácido acético, como um tampão.

[0092] Em um esquema mais específico, o acoplamento envolveu reagir composto 1, em que P1 era Boc e P2 era um hidrogênio (repre- sentado como Boc-Arg-OH'HCl abaixo), com composto 2, tal como representado abaixo:

[0093] O produto bruto resultante foi mais do que 95% puro por cromatografia de camada fina (TLC).

[0094] Subsequentemente, a etapa de desprotecção foi realizada como representado a seguir:

[0095] O produto desprotegido foi purificado por HPLC preparativa utilizando 1% de tampão de ácido acético. Observou-se pureza do produto >98%. TFA residual foi removido por baixa quantidade de resina DOWEX. O peso molecular de DAP (o composto de Fórmula V) é de 512,4, e o composto sintetizado de acordo com o esquema acima exibiu o seguinte pico principal por espectroscopia de massa: [M+H]+= 513,4.

III. Composições Farmacêuticas

[0096] As composições farmacêuticas compreendendo os com postos aqui descritos são fornecidas. Tal composição pode conter, em adição ao composto da invenção, um veículo ou excipiente farmaceu- ticamente aceitável. O termo "farmaceuticamente aceitável" significa um material não tóxico que é compatível com as características físicas e químicas do ingrediente ativo e que não interfere com a eficácia da atividade biológica do ingrediente ativo. As composições podem conter vários diluentes, cargas, sais, tampões, estabilizadores, solubilizado- res e outros materiais bem conhecidos na técnica. As características do veículo dependerão da rota de administração e são geralmente bem conhecidas na técnica.

[0097] A composição farmacêutica da invenção pode ser adaptada para administração entérica - administração da composição, em que a composição é absorvida através do trato digestivo, por exemplo, ingestão oral, administração retal. Em outras modalidades, a composição farmacêutica da invenção pode ser adaptada para administração pa-renteral - administração da composição, em que a composição é intro-duzida via uma rota diferente do trato digestivo, por exemplo, rota in-travenosa, subcutânea, cutânea, nasal, pulmonar, vaginal, bucal.

[0098] As composições farmacêuticas adequadas, por exemplo, composições para administração oral, podem ser preparadas como descrito em referências tais como "Pharmaceutical dosage form tablets", eds. Liberman et. al. (Nova York, Marcel Dekker, Inc., 1989), "Remington - The Science and practice of pharmacy", 20th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000 e "Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems", 6th Edition, Ansel et. al., (Media, PA: Williams and Wilkins, 1995), aqui incorporadas por referência que fornecem informação sobre veículos, materiais (por exemplo, materiais de revestimento), equipamento e processo para preparar comprimidos e cápsulas e formas de dosagem de libertação retardada de comprimi- dos, cápsulas e grânulos.

[0099] Os exemplos de materiais de revestimento adequados in cluem, mas não estão limitados a, polímeros de celulose, tal como fta- lato de acetato de celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilce- lulose, ftalato de hidroxipropil metilcelulose e succinato de acetato de hidroxipropil metilcelulose; ftalato de acetato de polivinila, polímeros e copolímeros de ácido acrílico e resinas metacrílicas que são comerci-almente disponíveis sob o nome comercial de Eudragit® (Roth Pharma, Westerstadt, Alemanha), Zein, goma-laca e polissacarídeos. Além disso, o material de revestimento pode conter veículos convencionais, tal como plastificantes, pigmentos, corantes, deslizantes, agentes de estabilização, formadores de poros e tensoativos.

[00100] Excipientes farmaceuticamente aceitáveis opcionais presentes nos comprimidos, contas, grânulos ou partículas contendo fár- maco incluem, mas não estão limitados a, diluentes, ligantes, lubrificantes, desintegrantes, corantes, estabilizantes e tensoativos.

[00101] Diluentes, também designados por "enchimentos", são tipi-camente necessários para aumentar a massa de uma forma de dosagem sólida, de modo que um tamanho prático seja fornecido para compressão de comprimidos ou formação de contas e grânulos. Dilu- entes adequados incluem, mas não estão limitados a, fosfato dicálcico di-hidrato, sulfato de cálcio, lactose, sacarose, manitol, sorbitol, celulose, celulose microcristalina, caulim, cloreto de sódio, amido seco, amidos hidrolisados, amido pré-gelatinizado, dióxido de silicone, óxido de titânio, silicato de alumínio magnésio e açúcar em pó.

[00102] Ligantes são utilizados para conferir qualidades coesivas a uma formulação de dosagem sólida, e, assim, asseguram que um comprimido ou uma conta ou um grânulo permaneça intacto após a formação das formas de dosagem. Materiais ligantes apropriados incluem, mas não estão limitados a, amido, amido pré-gelatinizado, gela- tina, açúcares (incluindo sacarose, glicose, dextrose, lactose e sorbitol), polietileno glicol, ceras, gomas naturais e sintéticas, tal como acácia, tragacanto, alginato de sódio, celulose, incluindo hidroxipropilme- tilcelulose, hidroxipropilcelulose, etilcelulose, e veegum, e polímeros sintéticos, tal como copolímeros de ácido acrílico e ácido metacrílico, copolímeros de ácido metacrílico, copolímeros de metil metacrilato, copolímeros de aminoalquil metacrilato, ácido poliacríli- co/polimetacrílico e polivinilpirrolidona.

[00103] Lubrificantes são usados para facilitar a fabricação de com-primido. Exemplos de lubrificantes adequados incluem, mas não estão limitados a, estearato de magnésio, estearato de cálcio, ácido esteárico, beenato de glicerol, polietileno glicol, talco e óleo mineral.

[00104] Desintegrantes são utilizados para facilitar a desintegração ou o "rompimento" da forma de dosagem após administração, e geralmente incluem, mas não estão limitados a, amido, glicolato de amido de sódio, sódio carboximetil amido, sódio carboximetilcelulose, hidro- xipropil celulose, amido pré-gelatinizado, argilas, celulose, alginina, gomas ou polímeros reticulados, tal como PVP reticulado (Polyplasdo- ne XL da GAF Chemical Corp).

[00105] Estabilizadores são utilizados para inibir ou retardar reações de decomposição de fármaco as quais incluem, a título de exemplo, reações oxidativas.

[00106] Tensoativos podem ser agentes ativos de superfície aniôni- cos, catiônicos, anfóteros ou não iônicos. Tensoativos aniônicos apropriados incluem, mas não estão limitados a, aqueles que contêm íons carboxilato, sulfonato e sulfato. Exemplos de tensoativos aniônicos incluem sódio, potássio, amônio de sulfonatos de alquil de cadeia longa e alquil aril sulfonatos, tal como sódio dodecilbenzeno sulfonato; dial- quil sódio sulfossuccinatos, tal como sódio dodecilbenzeno sulfonato; dialquil sódio sulfosuccinatos, tal como sódio bis-(2-etiltioxil)- sulfosuccinato; e sulfatos de alquil, tal como sódio lauril sulfato. Ten- soativos catiônicos incluem, mas não estão limitados a, compostos de amônio quaternário, tal como cloreto de benzalcônio, cloreto de benze- tônio, brometo de cetrimônio, cloreto de estearil dimetilbenzil amônio, polioxietileno e de amina de coco. Exemplos de tensoativos não ióni- cos incluem monoestearato de etileno glicol, miristato de propileno gli- col, monoestearato de gliceril, estearato de gliceril, poligliceril-4-oleato, acilato de sorbitano, acilato de sacarose, laurato de PEG-150, mono- laurato de PEG-400, polioxietileno monolaurato, polissorbatos, polioxi- etileno octilfenileter, éter cetílico de PEG-1000, éter tridecil de polioxie- tileno, éter butílico de polipropileno glicol, Poloxamer® 401, estearoil monoisopropanolamida e amida de sebo hidrogenada de polioxietile- no. Exemplos de tensoativos anfóteros incluem sódio N-dodecil-.beta.- alanina, sódio N-lauril-.beta.-iminodipropionato, miristoanfoacetato, lauril betaína e lauril sulfobetaína.

[00107] Composições farmacêuticas da invenção podem ser concebidas para fornecer liberação retardada, sustentada, pulsátil ou outra liberação modificada.

[00108] Se desejado, os comprimidos, as contas, grânulos ou partículas podem também conter uma quantidade menor de substâncias auxiliares não tóxicas, tal como agentes umectantes ou emulsionantes, corantes, agentes de tamponamento de pH e conservantes.

[00109] Formulações bioadesivas também podem ser utilizadas para intensificar a absorção ou modificar a liberação. Tais formulações são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Pedido de Patente US 20060045865 por Jacob, aqui incorporado por referência.

[00110] As composições farmacêuticas adaptadas para distribuição via administração nasal ou pulmonar também podem ser úteis. Aerossóis para a distribuição de agentes terapêuticos para o trato respiratório foram descritos, por exemplo, Adjei, A. and Garren, J. Pharm. Res., 7: 565-569 (1990); e Zanen, P. and Lamm, J.-W.J. Int. J. Pharm, 114: 111-115 (1995). O trato respiratório compreende as vias respiratórias superiores, incluindo a orofaringe e laringe, seguidas pelas vias respi-ratórias inferiores as quais incluem a traqueia seguida por bifurcações para os brônquios e bronquíolos. As vias aéreas superiores e inferiores são chamadas as vias aéreas de condução. Os bronquíolos terminais, em seguida, dividem-se em bronquíolos respiratórios que, então, levam para a zona respiratória final, os alvéolos, ou o pulmão profundo. Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapuetic and diagnostic agents to the respiratory tract", em Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313 (1990). O pulmão profundo, ou alvéolos, é o alvo principal de aerossóis terapêuticos inalados para distribuição de fármaco sistêmica.

[00111] As fármacos administradas por inalação podem vir como formulações de aerossol líquidas.

[00112] Para composições injetáveis (por exemplo, composições intravenosas), o veículo é água estéril destilada, salina, salina tampo- nada ou outro excipiente farmaceuticamente aceitável para injeção. Aditivos podem também incluir conservantes e ácidos ou base para ajustar o pH, para alterar a solubilidade ou a absorção.

[00113] Em uma modalidade, em que a composição farmacêutica compreende o composto de DAP de fórmula V (ou seu estereoisômero de fórmula VII) e a composição é adaptada para administração parenteral em uma injeção, o composto é dissolvido em água com modificadores de tonicidade e molalidade adequados (tal como salina tampo- nada com fosfato). DAP é solúvel em água a mais de 100 mg/ml. Em uma modalidade, DAP é adaptado como uma solução estéril para ad-ministração IV. Em um aspecto, a molalidade da composição farma-cêutica na qual DAP é adaptado para administração IV é ajustada para 290 mOsm/L com cloreto de sódio, e o pH é ajustado para 7,4 com hidróxido de sódio. De preferência, a composição farmacêutica é ad-ministrada como um bolus intravenoso por movimento lento.

IV. Métodos de Uso

[00114] A presente invenção proporciona um método de completamente ou parcialmente reverter um efeito anticoagulante de um inibidor de coagulação, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção (por exemplo, um composto de fórmula I, II, III, IV, V, VI, VII ou VIII) ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção também proporciona um método para promover coagulação em um sujeito em necessidade do mesmo, em que o sujeito está recebendo um inibidor de coagulação compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Além disso, a presente invenção proporciona um método para neutralizar ou inibir um inibidor de coagulação compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00115] Na presente invenção, o inibidor de coagulação (também denominado aqui como anticoagulante) é uma molécula que inibe o processo de coagulação. Exemplos de inibidores de coagulação incluem, mas não estão limitados a, ativadores de antitrombina (por exemplo, heparina não fracionada e LMWH), inibidores de fator de IIa e inibidores de fator Xa.

[00116] Heparina: heparina é um mucopolissacarídeo ocorrendo naturalmente que age no corpo como um cofator antitrombina para prevenir coagulação intravascular. A substância é produzida por basó- filos e mastócitos os quais são encontrados em grandes números nos tecidos conjuntivos circundando capilares, particularmente nos pul- mões e no fígado. Na forma de sal de sódio, heparina é utilizada tera- peuticamente como um anticoagulante.

[00117] Heparina de Baixo Peso Molecular: Heparina de Baixo Peso Molecular (LMWH) é feita de heparina utilizando vários métodos de despolimerização, incluindo despolimerização oxidativa com peróxido de hidrogênio, utilizados na fabricação de ardeparin (NORMIFLO®); clivagem deaminativa com nitrito de isoamil usada na fabricação de certoparin (SANDOPARIN®); clivagem eliminativa beta alcalina do éster benzílico de heparina usada na fabricação de enoxaparin (LOVE- NOX® e CLEXANE®); despolimerização oxidativa com Cu2+ e peróxido de hidrogênio utilizada na fabricação de parnaparin (FLUXUM®); clivagem beta-eliminativa pela enzima heparinase usada na fabricação de tinzaparin (INNOHEP® e LOGIPARIN®); clivagem deaminativa com ácido nitroso usada na fabricação de dalteparin (FRAGMIN®), reviparin (CLIVARIN®) e nadroparin (FRAXIPARIN®), o que resulta na formação de um resíduo anidromanose não natural no terminal de redução dos oligossacarídeos produzidos. Este pode ser subsequentemente convertido em anidromanitol usando um agente redutor adequado. Tanto a beta-eliminação química quanto a enzimática resultam na formação de um resíduo uronato insaturado não natural (UA) no terminal não redutor.

[00118] O sumário de atividades anticoagulantes de várias LMWHs é apresentado na Tabela 1. Tabela 1: Dados de peso molecular (MW) e atividades anticoagulantes de produtos LMWH atualmente disponíveis.

Adaptado de Gray E. et al., Thromb Haemost, 99: 807-818 (2008).

[00119] Clinicamente, LMWH (peso molecular médio de cerca de 4,5 kDa) difere da heparina (isto é, "heparina não fracionada", peso molecular médio de cerca de 15 kDa) em uma variedade de formas: (a) LMWH requer dosagem subcutânea menos frequente para profilaxia de tromboembolismo venoso pós-operatório; (2) LMWH requer injeção subcutânea uma ou duas vezes ao dia em pacientes tratados para tromboembolismo venoso e angina instável em vez de infusão intravenosa necessária com heparina; (3) LMWH não requer monitoramento do parâmetro de coagulação aPTT; (4) LMWH coloca um risco mais baixo de hemorragia; (5) a utilização de longo prazo de LMWH coloca um risco mais baixo de osteoporose; e (6) LMWH coloca um risco mais baixo de trombocitopenia induzida por heparina (um efeito colateral potencial da administração de heparina). No entanto, os efeitos anticoagulantes de heparina são tipicamente reversíveis com sulfato de protamina, enquanto o efeito da protamina em LMWH é limitado. Além disso, LMWH tem menos efeito em atividade de trombina (Fator IIa) em comparação com heparina, embora tanto LMWH quanto hepa- rina tenham um efeito similar na atividade de Fator Xa.

[00120] Inibidores de Trombina e Outro Fator IIa ou Xa: Exemplos de inibidores de trombina (Fator IIa) e Fator Xa incluem anticoagulan- tes tais como dabigatran (PRADAXA®), rivaroxaban (XARELTO®), api- xaban (ELIQUIS®), edoxaban (LIXIANA®), fondaparinux (ARIXTRA®) e argatroban (ARGATROBAN®).

[00121] O nome químico para anticoagulante oral PRADAXA®, da- bigatran etexilato mesilato, um inibidor direto de trombina, é β-Alanina, N-[[2-[[[4=[[[(hexiloxi)carbonil]amino]iminometil]fenil]amino]metil]-1- metil-1H-benzimidazol-5-il]carbonil]-N-2-piridinil-, etil éster, metanos- sulfonato. Dabigatran e seus glucoronídeos acil são inibidores diretos de trombina competitivos. Como trombina (Fator IIa, serina protease) permite a conversão de fibrinogênio em fibrina durante a cascata de coagulação, a sua inibição previne o desenvolvimento de um trombo.

[00122] Rivaroxaban, um inibidor de fator Xa, é o ingrediente ativo em XARELTO®, e tem o nome químico 5-Cloro-N-({(5S)-2-oxo-3-[4-(3- oxo-4-morfolinil)fenil]-1,3-oxazolidin-5-il}metil)-2-tiofenocarboxamida. Rivaroxaban é um enantiômero (S) puro. XARELTO® é um inibidor de fator Xa oralmente biodisponível que bloqueia seletivamente o sítio ativo de fator Xa e não requer um cofator (tal como Antitrombina III), para a atividade.

[00123] Apixaban ou ELIQUIS® é 1-(4-metoxifenil)-7-oxo-6-[4-(2- oxopiperidin-1-il)fenil]-4,5-di-hidropirazolo[5,4-c]piridina-3-carboxamida. Ele é um inibidor de fator Xa direto administrado oralmente aprovado na Europa e atualmente sendo submetido a experimentos de fase III nos EUA para a prevenção de tromboembolismo venoso.

[00124] Edoxaban ou LIXIANA® é N’-(5-cloropiridin-2-il)-N- [(1S,2R,4S)-4-(dimetilcarbamoil)-2-[(5-metil-6,7-di-hidro-4H- [1,3]tiazolo[5,4-c]piridina-2-carbonil)amino]ciclo-hexil]oxamida. Edoxa- ban é um inibidor de fator Xa direto e foi aprovado no Japão para uso na prevenção de tromboembolismo venoso.

[00125] ARIXTRA® é fondaparinux sódico. Ele é um inibidor sintéti co e específico de Fator X(Xa) ativado. Fondaparinux sódico é sal me- til O-2-deoxi-6-O-sulfo-2-(sulfoamino)-α-D-glicopiranosil-(1^4)-O-β-D- glicopiranosil-(1 ^4)-O-2-deoxi-3,6-di-O-sulfo-2-(sulfoamino)-α-D- flicopiranosil-(1^4)-O-2-O-sulfo-α-L-idopiranuronosil-(1^4)-2-deoxi-6- O-sulfo-2-(sulfoamino)-α-D-glicopiranosida, decassódio. A fórmula mo-lecular de fondaparinux sódica é C31H43N3Na10O49S8 e o seu peso mo- lecular é de 1728. A fórmula estrutural é fornecida abaixo:

[00126] A atividade antitrombótica de fondaparinux sódica é o resultado de inibição seletiva mediada por antitrombina III (ATIII) de Fator Xa. Ao ligar seletivamente a ATIII, fondaparinux sódica potencializa (cerca de 300 vezes) a neutralização inata de Fator Xa por ATIII. Neutralização de Fator Xa interrompe a cascata de coagulação do sangue e, assim, inibe a formação de trombina e o desenvolvimento de trom- bos. Fondaparinux sódica não inativa trombina (Fator II ativado) e não tem efeito conhecido em função plaquetária. Na dose recomendada, fondaparinux sódica não afeta a atividade fibrinolítica ou o tempo de sangramento. A farmacodinâmica/farmacocinética de fondaparinux só- dica são derivadas de concentrações plasmáticas de fondaparinux quantificadas via atividade anti-fator Xa. Apenas fondaparinux pode ser usada para calibrar o ensaio anti-Xa. (Os padrões internacionais de he- parina ou LMWH não são adequados para esta utilização.) Como resultado, a atividade de fondaparinux sódica é expressa em miligramas (mg) do calibrador de fondaparinux. A atividade anti-Xa da fármaco aumenta com concentração de fármaco crescente, atingindo valores máximos em aproximadamente três horas. Fondaparinux sódica administrada por injeção subcutânea é rapidamente e completamente absorvida (biodisponibilidade absoluta é de 100%). Em doentes submetidos a tratamento com injeção de fondaparinux sódica de 2,5 mg, uma vez por dia, a concentração plasmática em estado constante de pico é, em média, de 0,39 a 0,50 mg/L e é atingida aproximadamente 3 horas após a dose. Nestes pacientes, a concentração plasmática mínima no estado constante é de 0,14 a 0,19 mg/L. Em pacientes com trombose venosa profunda sintomática e embolia pulmonar submetidos a tratamento com injeção de fondaparinux sódica de 5 mg (peso corporal <50 kg), 7,5 mg (peso corporal de 50 a 100 kg) e 10 mg (peso corporal >100 kg) uma vez por dia, as doses ajustadas ao peso corporal fornecem picos de estado constante médios e concentrações plasmáticas mínimas semelhantes em todas as categorias de peso corporal. As concentrações plasmáticas de estado constante de pico médias estão na faixa de 1,20 a 1,26 mg/L. Nestes pacientes, a concentração plasmática de estado constante mínima está na faixa de 0,46 a 0,62 mg/L.

[00127] ARGATROBAN® é um inibidor de trombina (Fator IIa) sintético direto derivado de L-arginina. O nome químico para AR- GATROBAN® é ácido 1-[5-[(aminoiminometil)amino]-l-oxo-2-[[(1,2,3,4- tetra-hidro-3-metil-8-quinolinil)sulfonil]amino]pentil]-4-metil-2- piperidinacarboxílico, mono-hidrato. A fórmula molecular de AR- GATROBAN® é C23H36N6O5S •H2O. O seu peso molecular é de 526,66. ARGATROBAN® é um inibidor direto de trombina que liga re- versivelmente ao sítio ativo de trombina. ARGATROBAN® não requer o cofator antitrombina III para atividade antitrombótica. ARGATROBAN® é administrado por injeção e ele que exerce seus efeitos anticoagulan- tes inibindo reações catalisadas por trombina ou induzidas por trombi- na, incluindo formação de fibrina; ativação de fatores de coagulação V, VIII e XIII; ativação de proteína C; e agregação de plaquetas.

[00128] Um efeito anticoagulante é qualquer efeito de um inibidor de coagulação (por exemplo, heparina, LMWH, inibidor de Fator Xa, inibidor de Fator IIa) que resulta de seu bloqueio da propagação das cascatas de coagulação. Exemplos não limitantes de efeitos de anti- coagulação incluem suprarregulação de atividade de antitrombina, atividade de Fator Xa diminuída, atividade de Fator IIa diminuída, perda de sangue elevada e quaisquer outras condições em que a atividade ou as concentrações de fatores de coagulação são alteradas de tal maneira a inibir a formação de coágulos de sangue.

[00129] A atividade de um inibidor de coagulação (isto é, seus efeitos anticoagulantes) pode ser medida por uma variedade de métodos incluindo, mas não se limitando a, um ensaio de atividade anti-fator Xa cromogênico, ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada, tempo de protrombina, ensaio de sangramento (por exemplo, ensaio san- gramento de cauda de rato), tromboelastografia, ensaio de geração de trombina, tempo pra diluir veneno de víbora de Russel, tempo de coa-gulação de ecarina, tempo de coagulação de caulim, Razão Normalizada Internacional (INR), teste de fibrinogênio (Clauss), tempo de trombina (TCT), tempo de mistura e tempo de lise de euglobulina. Estes métodos auxiliam na determinação de vários parâmetros de anti- coagulação e são conhecidos dos versados na técnica. Assim, em algumas modalidades, a anticoagulação pode ser monitorada por um ou uma combinação dos ensaios acima referidos.

[00130] O ensaio anti-fator Xa mede diretamente atividade anti-fator Xa. A metodologia atrás de um ensaio anti-fator Xa é que plasma do paciente é adicionado a uma quantidade conhecida de excesso de fator Xa e excesso de antitrombina. Se um inibidor de fator Xa está presente no plasma do paciente ele reduzirá a atividade enzimática do fator Xa. A quantidade de fator Xa residual é inversamente proporcional à quantidade de agente anti-Xa no plasma. A quantidade de fator Xa residual é detectada pela adição de um substrato cromogênico que imita o substrato natural do fator Xa, fazendo o fator residual Xa clivá- lo, liberando um composto colorido que pode ser detectado por um es- pectrofotômetro. Deficiencias de antitrombina no paciente não afetam o ensaio, porque quantidades excessivas de antitrombina são fornecidas na reação. Os resultados são dados em concentração de anticoa- gulante em unidades/mL de anti-fator Xa, de modo que valores elevados indicam níveis elevados de anticoagulação e valores baixos indicam níveis baixos de anticoagulação.

[00131] O ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) é um ensaio que mede quanto tempo leva para o sangue coagular. Amostras de sangue são coletadas para medição direta ou em tubos com oxalato e citrato para prender a coagulação por cálcio até que o ensaio possa ser realizado. No ensaio, um fosfolipídeo, um ati- vador (sílica, celite, caulim, ácido elágico, etc.) e cálcio são misturados no plasma para induzir coagulação. O ensaio mede o tempo até um trombo (coágulo) se formar.

[00132] Ensaio de sangramento de cauda de rato ou ensaio de transecção de cauda de rato é um ensaio que mede perda de sangue, por exemplo, perda de sangue após administração de fármaco. Em uma modalidade, em que o efeito do composto da invenção (por exemplo, DAP) está sendo testado, no Tmax do anticoagulante, DAP é administrado intravenosamente. Após 20 minutos, caudas de rato são seccionadas aproximadamente 1 mm da ponta, colocadas em salina à temperatura ambiente e sangue é coletado durante 30 minutos e pesado.

[00133] Os ensaios usados para medir atividade de inibidores de coagulação podem ser utilizados no laboratório ou na clínica para medir reversão do efeito anticoagulante de um inibidor de coagulação, por exemplo, reversão de um efeito anticoagulante de um inibidor de coa-gulação devido à administração de uma composição farmacêutica compreendendo um composto da invenção. Assim, em uma modalidade, os ensaios são utilizados para medir a reversão completa ou parcial de um efeito anticoagulante de um inibidor de coagulação (tal como heparina, LMWH, inibidor de Fator IIa e inibidor de Fator Xa).

[00134] Uma reversão completa de um efeito anticoagulante de um inibidor de coagulação ocorre mediante neutralização da atividade an- ticoagulante. Em uma modalidade, uma reversão completa de um efeito anticoagulante de um inibidor de coagulação, como medida pelo en- saio de atividade anti-Xa, ocorre quando a concentração de anticoagu- lante é trazida abaixo da concentração mínima eficaz (MEC) para anti- coagulação. MEC, tal como aqui utilizada, é uma menor quantidade da fármaco (por exemplo, inibidor de coagulação) necessária para o efeito terapêutico. Em outra modalidade, uma reversão completa de um efeito anticoagulante de um inibidor de coagulação, como medida pelo ensaio aPTT, ocorre quando o aPTT retorna dentro de cerca de 10% da linha de base. Uma linha de base, tal como é aqui utilizada, refere-se a aPTT na ausência de inibidores de coagulação.

[00135] Em muitos casos, a anticoagulação ainda será desejada, mas em menor grau. Assim, será indicada uma reversão parcial de um efeito anticoagulante de um inibidor de coagulação. Reversão parcial de um efeito anticoagulante de um inibidor de coagulação, como medida pelo ensaio de atividade anti-Xa, ocorre quando a concentração de anti- coagulante é trazida abaixo da concentração de anticoagulante na au-sência de um agente de reversão de anticoagulação (por exemplo, um composto da invenção), mas permanece acima da MEC para anticoa- gulação. Assim, em algumas modalidades, a reversão parcial de um efeito anticoagulante de inibidores de coagulação ocorre quando a con-centração de anticoagulante é mais baixa do que cerca de quatro vezes a MEC, de preferência cerca de duas vezes a MEC, mais preferivelmente menos do que cerca de duas vezes a MEC (por exemplo, cerca da MEC). Reversão parcial de um efeito anticoagulante de inibidor de coagulação, como medida por ensaio aPTT, ocorre quando aPPT é reduzida abaixo da medição na ausência de um agente de reversão da anti- coagulação (por exemplo, um composto da invenção), mas acima da linha de base. Assim, em outras modalidades, a reversão parcial de um efeito de anticoagulação de inibidores de coagulação ocorre quando a medição de aPTT é reduzida abaixo de cerca de quatro vezes a linha de base, de preferência cerca de duas vezes a linha de base, mais pre- ferencialmente menos do que cerca de duas vezes a linha de base. Ge-ralmente, a extensão e duração de reversão de anticoagulação são de-terminadas pelo médico ou veterinário.

[00136] Tal como aqui utilizado, "sujeito em necessidade do mesmo" é um sujeito em necessidade de reversão de anticoagulação ou aguda ou planejada, por exemplo, um sujeito que sofre de overdose de anticoagulante, um sujeito que sofre de hemorragia (por exemplo, he-morragia induzida por trauma ou hemorragia espontânea no trato GI ou em outro local), um paciente que necessite de intervenção cirúrgica planejada, um sujeito que sofre um procedimento invasivo ou não in- vasivo que requer uma biópsia, um sujeito sofrendo um procedimento em que um erro de procedimento pode ter risco de hemorragia se o sujeito permanecer anticoagulado, um sujeito que necessita de anestesia espinhal ou epidural. "Sujeito em necessidade do mesmo" pode ser um paciente em quem a presença de um inibidor de fator direto (Fator Xa, Fator IIa e/ou antitrombina) está produzindo ou é provável de produzir efeitos de sangramento. Assim, "sujeito em necessidade do mesmo" pode ser um sujeito que recebe terapia anticoagulação (por exemplo, sujeito recebendo heparina, LMWH, inibidor de Fator IIa, ou inibidor de Fator Xa), para, por exemplo, prevenção de acidente vascular cerebral, procedimentos cirúrgicos e de diagnóstico cardíacos, arritmias cardíacas, prevenção de trombose venosa profunda (DVT), embolia pulmonar, prevenção geral da formação de coágulos de sangue patológicos.

[00137] "Sujeito em necessidade do mesmo", como aqui utilizado, é um animal. "Sujeito em necessidade do mesmo" inclui, sem limitação, um ser humano, camundongo, rato, cobaia, cão, gato, cavalo, vaca, porco, macaco, chimpanzé, babuíno ou macaco rhesus. Em uma modalidade, "sujeito em necessidade do mesmo" é um mamífero. Em outra modalidade, "sujeito em necessidade do mesmo" é ser um humano.

[00138] Como aqui utilizado, "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um agente de reversão de anticoagula- ção (por exemplo, um composto da invenção aqui descrita) o qual é eficaz mediante administração de doses únicas ou múltiplas (por exemplo, doses de bolus e/ou de manutenção) a um sujeito, para neutralizar ou inibir (reverter completamente ou parcialmente) um efeito anticoagulante de um inibidor de coagulação, ou na promoção de coagulação.

[00139] Em um aspecto, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma dose de um agente de reversão de anticoagulação que está entre 0,01 e 10.000 vezes a dose de anticoagulante em peso. Em outro aspecto, o agente de reversão de anticoagulação é administrado a uma razão em massa de dose entre cerca de 1:1 e 1000:1 do agente de reversão de anticoagulação para anticoagulante, por exemplo, 100:1 do agente de reversão de anticoagulação para anticoagulante, tal como 10:1 de agente de reversão de anticoagulação para anticoagulan- te. Em uma modalidade do presente método, uma quantidade terapeu- ticamente eficaz do agente de reversão de anticoagulação pode ser administrada por rota de administração subcutânea, intramuscular ou intravenosa. Por exemplo, ela pode ser administrada intravenosamente como uma solução estéril. Em outra modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de reversão de anticoagulação é administrada por rota oral, nasal ou pulmonar, ou a uma região de mucosa (boca, reto ou vagina).

[00140] A quantidade terapeuticamente eficaz do agente de reversão da anticoagulação (por exemplo, o composto da invenção) tipicamente variará de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 1 g/kg de peso corporal por dia; em outra modalidade, de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 600 mg/kg de peso corporal por dia; em outra modalidade de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 250 mg/kg de peso corporal por dia; em outra modalidade de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 400 mg/kg de peso corporal por dia; em outra modalidade de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 200 mg/kg de peso corporal por dia; em outra modalidade de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dia; em outra modalidade de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 25 mg/kg de peso corporal por dia; em outra modalidade de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dia; em outra modalidade de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dia; em outra modalidade de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dia; em outra modalidade de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal por dia. Os ensaios de coagulação padrão (como aqueles descritos aqui) e outros ensaios in vitro podem ser utilizados para determinar a quantidade terapeuticamente eficaz.

[00141] Em alguns aspectos da invenção, o composto da invenção pode ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional. Em uma modalidade, o pelo menos um agente terapêutico adicional pode ser vitamina K a qual é tipicamente utilizada para corrigir deficiências de coagulação induzidas pelos compostos de varfarina.

[00142] A presente invenção também proporciona um ensaio de diagnóstico para determinar a concentração de anticoagulante no sangue. Como se mostra no Exemplo 13 abaixo, DAP demonstra uma tendência dose responsiva em reverter rivaroxaban ex vivo em plasma humano usando um ensaio cromogênico anti-fator Xa depurado de 510k. Assim, o composto da invenção, por exemplo, DAP, pode ser utilizado em um ensaio de diagnóstico para determinar a concentração de um anticoagulante, por exemplo, um inibidor de Fator Xa no sangue. Num tal ensaio, o composto da invenção, por exemplo, DAP, pode ser utilizado quer em conjunto com os reagentes de kit atualmente disponíveis ou como um substrato de ligação direta substituindo fatores sintéticos presentes em kits disponíveis atualmente. Em uma mo- dalidade, o ensaio de diagnóstico pode compreender o composto da invenção (por exemplo, DAP) como um substrato de ligação, em que o composto da invenção liga um anticoagulante em uma amostra de sangue, e a atividade residual do fator de coagulação (por exemplo, Fator Xa) é quantificada para determinar a concentração do anticoagu- lante na amostra. Em outra modalidade, o ensaio de diagnóstico pode compreender o composto da invenção (por exemplo, DAP) conjugado com micropartículas magnéticas, em que o composto da invenção pode ligar um anticoagulante em uma amostra de sangue, a fim de ou remover o anticoagulante da amostra ou concentrá-lo. O ensaio cro- mogênico ou de ponto de cuidado baseado em DAP da invenção pode ajudar na determinação de níveis de anticoagulante em sujeitos, o que é atualmente uma necessidade não atendida clínica significativa, uma vez que diagnósticos atuais não podem determinar concentrações sanguíneas de inibidores diretos com alta precisão.

[00143] Além disso, a presente invenção proporciona um ensaio, por exemplo, um ensaio cromogênico, para determinar a concentração do composto da invenção, por exemplo, DAP, necessária para reverter o anticoagulante presente no sangue. Em uma modalidade, o ensaio utiliza DAP como um agente de ligação direta para vários anticoagulantes.

[00144] A invenção também proporciona um ensaio, por exemplo, um ensaio cromogênico, para determinar a quantidade do composto da invenção, por exemplo, DAP, no sangue. Tal ensaio pode utilizar concentrações predeterminadas de um anticoagulante.

[00145] A presente invenção também fornece um kit de diagnóstico que incorpora um ensaio de diagnóstico aqui descrito acima. Assim, em uma modalidade, o kit é utilizado para determinar a concentração de anticoagulante no sangue. O kit pode conter outros componentes, em-balagem, instruções, reagentes e/ou outro material para auxiliar na de-terminação de anticoagulante (por exemplo, inibidor de Fator Xa) ou concentração de DAP e para auxiliar na utilização do kit. Além disso, o kit pode ser utilizado para determinar se existe uma combinação de var- farina e outro anticoagulante, pois varfarina não será afetada pelo com-posto da invenção, enquanto outros anticoagulantes serão revertidos.

[00146] Como demonstrado nos exemplos seguintes, um composto da invenção (por exemplo, DAP) é capaz de ligar heparina, inativando- a in vivo. Assim, em adição aos seus efeitos na coagulação, um composto da invenção pode também ser utilizado para privar os tecidos das atividades bioquímicas da heparina. Por exemplo, outras moléculas de ligação à heparina demonstraram a capacidade de reduzir o fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e outros fatores de crescimento de ligação a heparina. A privação de VEGF e FGF foi mostrada útil em terapia anticâncer, tornando os compostos da invenção possíveis candidatos para o tratamento de câncer. Portanto, em um aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar, prevenir ou melhorar um câncer em um sujeito, compreendendo a administração a um sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00147] Como demonstrado nos exemplos, um composto da invenção, DAP, ligou XARELTO®, ELIQUIS®, ARIXTRA® e LMWH in vitro, conforme medido por espalhamento de luz dinâmico (DLS). DAP reverteu ARIXTRA® e LMWH administradas subcutaneamente in vivo. DAP reverteu XARELTO®, ELIQUIS®, PRADAXA®, LIXIANA®, heparina não fracionada e bemiparin in vivo. DAP administrada intravenosamente em doses de 100mg/kg, 250mg/kg e 400mg/kg em ratos não mostrou nenhum efeito adverso. DAP foi biodisponível oralmente em ratos. DAP não exibiu nenhuma ligação de ERG humano, não inibiu ou serviu como um substrato de enzimas CYP, e não ligou apreciavelmente quaisquer proteínas de plasma (dados não mostrados). Além disso, parece que DAP tem uma meia-vida de eliminação curta, porque anti- coagulação induzida por PRADAXA® retornou em 20-30 minutos em seguida a uma dose de bolus intravenosa de DAP em ratos. Além disso, DAP era estável a esterilização (sobreviveu a aquecimento a 200°C) e a armazenamento como um pó liofilizado a 4°C por mais de um ano. O resumo de reversão de anticoagulante por DAP é apresentado na Tabela 2. Tabela 2: Reversão de anticoagulante

* Protamina reverte parcialmente heparinas de baixo peso molecular. Tabela 3: Correlação in vitro in vivo

[00148] Assume biodisponibilidades orais de 60% para rivaroxaban, 50% para apixaban e 5% para dabigatran; assume 100% de biodispo- nibilidade para anticoagulantes injetáveis.

[00149] O sumário de correlação in vitro-in vivo de tratamento com DAP é apresentado na Tabela 3. Razão molar de ligação de DLS é calculada dividindo a razão em massa mais baixa de DAP para antico- agulante que mostra ligação significativa, definida como uma associação em salina tamponada com fosfato acima de 50nm de diâmetro aparente, pela razão de peso molecular de DAP e do anticoagulante. Os pesos moleculares utilizados nos cálculos foram de 512Da (DAP), 436Da (rivaroxabana), 460Da (apixaban), 1,7kDa (fondaparinux), 3,6kDa (bemiparin), 628Da (dabigatran) e 509Da (ARGATROBAN®). A razão molar de reversão foi calculada de forma semelhante usando a dose de reversão in vivo mínima de DAP necessária para atingir reversão como medida pelo ensaio de sangramento de transecção de cauda de rato, kit anti-Xa cromogênico ou tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT). Para o ensaio de sangramento, o anticoagulante foi considerado revertido se a perda de sangue durante um período de 30 minutos após transecção de cauda, com a cauda cortada imersa em salina à temperatura ambiente, estivesse dentro de 25% do controle (sem anticoagulante administrado). Como medida pelo kit Xa, a reversão foi alcançada quando a concentração de anticoagulante eficaz foi trazida abaixo da concentração eficaz mínima (MEC) para anticoagu- lação. Como medida por aPTT, a reversão foi considerada alcançada quando um rato aPTT de um rato anticoagulado retornou para dentro de 10% da linha de base. No caso de fondaparinux, embora 200mg/kg de DAP fosse a dose mais baixa administrada in vivo, os dados in vitro indicam que doses de reversão significativamente mais baixas são possíveis.

[00150] O conteúdo completo de todas as referências, pedidos de patente e patentes citadas ao longo deste pedido é por meio deste in-corporado por referência aqui.

EXEMPLOS

[00151] A invenção será ainda ilustrada nos seguintes Exemplos não limitativos. Estes exemplos são apresentados para auxiliar na compreensão da invenção, mas não se destinam, e não devem ser interpretados, a limitar seu escopo de qualquer maneira. Os exemplos não incluem descrições detalhadas de métodos convencionais que são bem conhecidos dos versados na técnica.

Exemplo 1: Testes de Estabilidade In Vitro de Diarginina piperazi- na ("DAP") Materiais e Métodos

[00152] Um sal de acetato de DAP foi preparado como aqui descrito. Como descrito nestes exemplos, DAP sólido ou em pó refere-se ao sal de acetato, enquanto DAP em solução refere-se à base livre quando o sal ioniza em solução aquosa. Como descrito nestes exemplos, o composto de DAP utilizado foi o composto de Fórmula VII.

[00153] O pó de DAP foi testado para estabilidade térmica de duas maneiras. DAP foi armazenada a 4°C durante sete meses antes da utilização. Além disso, a DAP sólida foi testada por calorimetria de var-rimento diferencial (DSC) aquecendo de -20°C a 200°C, de volta a - 20°C e, novamente, a 200°C.

Resultados

[00154] Pó de DAP era estável a 4°C durante mais de 12 meses. Os resultados de DSC são mostrados na Figura 1. O segundo aquecimento ("2") mostrou comportamento térmico semelhante ao primeiro aquecimento ("1"), indicando que DAP sobreviveu a aquecimento repetido a 200°C. Esta constatação indica que DAP é capaz de sobreviver a aquecimento a temperaturas acima daquelas para esterilização.

Exemplo 2: A ligação do DAP para Heparina e LMWH Materiais e Métodos

[00155] Espalhamento de luz dinâmico (DLS) foi utilizado para avaliar a associação de 1 mg/ml de heparina não fracionada e 1 mg/ml de bemiparin (LMWH; HIBOR®), quer isoladamente ou em combinação com 100 mg/ml de DAP em água (razões em massa de 100:1 de DAP para heparina ou LMWH).

Resultados

[00156] DAP fisicamente associada em água tanto com heparina não fracionada (Figura 2) quanto LMWH (não mostrada) para formar as associações físicas que aumentam o diâmetro aparente. Quando soluções de DAP foram misturadas com soluções de LMWH ou hepa- rina não fracionada, elas formaram partículas devido às suas interações físicas, o que suporta a teoria de que DAP pode reverter anticoa- gulação de heparina e LMWH associando fisicamente com estas moléculas.

Exemplo 3: Ligação para DAP Anticoagulantes medida pelo DLS. Materiais e Métodos

[00157] Rivaroxaban (XARELTO®) sozinha, DAP sozinha e combinações DAP:rivaroxaban em razões em massa de 1:1 e 10:1 foram adicionados a uma solução aquosa e analisados por espalhamento de luz dinâmico (DLS) para avaliar a associação da DAP e rivaroxaban. Um experimento semelhante foi realizado em apixaban (ELIQUIS®) sozinha, DAP sozinha e combinações DAP:apixaban em razões em massa de 1:1, 10:1 e 100:1. Fondaparinux (ARIXTRA®) sozinha, DAP sozinha, e combinações fondaparinux:DAP em razões em massa de 1:1, 10:1 e 100:1, foram testadas de forma semelhante. LMWH (bemi- parin; HIBOR®) sozinha, DAP sozinha e combinações LMWH:DAP em razões em massa de 1:1, 10:1 e 100:1 também foram testadas. A concentração de LMWH testada foi de 0,1 mg/ml. Portanto, em 1:1, 0,1 mg/ml de DAP foi testado, em 10:1, 1 mg/ml foi testado, e em 100:1, 10 mg/ml de DAP foram testados.

[00158] Além disso, dabigatran sozinha, DAP sozinha e combinação dabigatran:DAP em razões em massa de 1:1, 10:1, 100:1, 1000:1 e 10.000:1 de DAP foram testadas. Por fim, ARGATROBAN® sozinha, DAP sozinha ou combinações de argatroban:DAP em razões em massa de 1:1, 10:1, 100:1 e 1.000:1 foram testadas.

Resultados

[00159] Os resultados são mostrados na Figura 3 para rivaroxaban; Figura 4 para apixaban; Figura 5 para fondaparinux (ARIXTRA®), Figura 6 para LMWH; e Figura 7 para argatroban. Cada figura mostra picos individuais representando DAP e o anticoagulante sozinho em solução aquosa. Quando o anticoagulante foi misturado com DAP em razões em massa suficientemente altas, uma mudança no tamanho foi observada. Neste ensaio, mesmo um ligeiro aumento do tamanho indica interação física entre os dois; no entanto, apenas mudanças significativas no diâmetro aparente são usadas na avaliação da correlação in vitro in vivo. Diâmetro aparente é uma medida do grau de interação.

Exemplo 4: Reversão de DAP de Anticoagulação de LMWH In Vivo Materiais e Métodos

[00160] Um rato albino macho, pesando 470 g, foi administrado com 10 mg de bemiparin (uma overdose de LMWH) por injeção subcutânea. O tempo de aPTT foi medido ao longo de cinco horas. Quatro horas após a administração de LMWH, o rato recebeu uma dose intravenosa de 200 mg/kg de DAP (100mg de DAP).

Resultados

[00161] Mediante administração de LMWH, o aPTT aumentou de 53 para 246 segundos durante o decurso de quatro horas. A administração intravenosa de 200 mg/kg de DAP (100 mg de DAP) trouxe o tempo de aPTT abaixo da linha de base dentro de 60 minutos (Figura 8).

Exemplo 5: Reversão de DAP de Anticoagulação de Dabigatran (PRADAXA®) In Vivo; um Estudo de Overdose Materiais e Métodos

[00162] Um rato albino macho, pesando 430 g, foi administrado com 40 mg/kg de PRADAXA® (20mg de PRADAXA®; overdose de PRADAXA®) por gavagem oral.

[00163] Aproximadamente 2 horas em tratamento de PRADAXA®, 200 mg/kg de DAP (100 mg de DAP) foram administradas como uma injeção de bolus intravenosa. Aproximadamente 2 horas mais tarde, o rato foi administrado com uma dose de 100 mg/kg de DAP (50mg DAP). Em outra hora, o rato foi administrado com outra dose de 100 mg/kg de DAP (50 mg de DAP). aPTT foi medida ao longo de todo o tratamento.

Resultados

[00164] Os resultados são mostrados nas Figuras 9 e 13. 2 horas em seguida à administração de PRADAXA®, aPTT subiu de 43 para 81 segundos, mostrando anticoagulação significativa. 100 mg de DAP foram administrados como uma injeção de bolus intravenosa que trouxe aPTT abaixo da linha de base dentro de 25 minutos. 2 horas mais tarde, o aPTT tinha subido de volta a 79 segundos e o rato foi administrado com uma dose de 50 mg de DAP. Dentro de 30 minutos, o aPTT foi trazido abaixo da linha de base. Ambas as vezes, dentro de 60 minutos após a administração de DAP, os níveis de aPTT haviam retornado acima da linha de base. Após a segunda dose de DAP, o aPTT subiu para 53 segundos. Uma terceira dose de DAP, 100 mg/kg de DAP (50 mg de DAP), foi administrada intravenosamente e o aPTT caiu até a linha de base dentro de 20 minutos. A Figura 13 demonstra um experimento semelhante em que, depois da administração de 15,5 mg/kg de PRADAXA®, o aPTT voltou ao normal dentro de cerca de 30 minutos do início do tratamento com 100 mg/kg de DAP.

Exemplo 6: Reversão de DAP de Anticoagulação de Heparina não Fracionada ("UHF") In Vivo. Materiais e Métodos

[00165] Um rato albino macho, pesando 515 g, foi administrado com 10 mg/kg de heparina não fracionada (5mg de UFH) por injeção subcutânea.

[00166] 200 mg/kg de DAP (100 mg de DAP) foram administrados como duas injeções de bolus intravenosas após administração de UFH. Subsequentemente, o rato foi administrado com uma dose de 400mg/kg de DAP (200 mg de DAP). aPTT foi medido ao longo de todo o tratamento.

Resultados

[00167] Como demonstrado na Figura 10, o tempo de aPTT subiu significativamente de 28 para 102 segundos ao longo do curso de uma hora após administração de heparina. 100 mg de DAP foram adminis-trados intravenosamente e ela trouxe o tempo de aPTT para 48 segundos em 20 minutos. Dentro de 1 hora, aPTT subiu para 120 segundos, em seguida, outros 100mg de DAP foram administrados intravenosamente. Em 15 minutos, aPTT foi abaixado para 47 segundos. Dentro de 1 hora, o aPTT aumentou para 96 segundos, depois, uma dose de 200 mg de DAP foi administrada intravenosamente. 10 minutos depois, aPTT caiu para 33 segundos.

Exemplo 7: Reversão de DAP de Anticoagulação de Rivaroxaban (XARELTO®) In Vivo Materiais e Métodos

[00168] 5 mg/kg de rivaroxaban (XARELTO®) foram administrados oralmente a ratos. Depois de quatro horas, 5 mg/kg de DAP (2 mg de DAP) foram administrados intravenosamente. aPTT foi medido em zero, 15, 30, 45, 60 e 240 minutos, antes da administração de DAP. aPTT foi medido de novo a cerca de 5, 10, 25, 35, 45, 60, 120 e 240 minutos após administração de DAP.

Resultados

[00169] Os resultados são mostrados na Figura 11. DAP eficazmente reverteu a anticoagulação de rivaroxaban (XARELTO®) in vivo em ratos.

Exemplo 8: Reversão de DAP de Fondaparinux (ARIXTRA®) In Vivo. Materiais e Métodos

[00170] 5 mg/kg de fondaparinux foram administrados subcutanea- mente a ratos. 200 mg/kg de DAP foram administrados intravenosamente após 2 horas. A atividade foi medida por Ensaio de Fator Xa depurado 510k cromogênico (Biophen) aos 10, 20, 30 e 60 minutos após administração de DAP.

Resultados

[00171] Figura 12 demonstra reversão mediada por DAP de antico- agulação de fondaparinux dentro de 10 minutos da administração.

Exemplo 9: DAP intravenosa não influencia aPTT Materiais e Métodos

[00172] 0, 2, 10, 25, 50 ou 100 mg de DAP foram administrados in travenosamente a ratos CD de peso combinado machos e um aPTT foi medido.

Resultados

[00173] Os resultados mostrados na Figura 16 demonstram que DAP administrada intravenosamente não influenciou aPTT em uma forma dependente da dose na ausência de anticoagulantes. As barras de erro representam erro padrão de sete medições de aPTT mediadas por mais de 90 minutos.

Exemplo 10: Reversão de DAP de Anticoagulação em um Modelo de Transecção de Cauda de Rato. Materiais e Métodos

[00174] Cada um de três ratos foram administrados com 2 mg de rivaroxaban. Um rato recebeu uma reversão simulada não contendo DAP, o segundo recebeu 2,5 mg de DAP e o terceiro recebeu 12,5 mg de DAP. Um quarto rato recebeu anticoagulante simulado e doses de reversão ("simulado"). 20 minutos após a dose de reversão, as caudas foram seccionadas a 1 mm da ponta, colocadas em salina a temperatura ambiente e a perda de sangue foi coletado durante 30 minutos e em seguida foi pesada.

[00175] Os mesmos procedimentos foram utilizados com 1,25 mg de apixaban (ELIQUIS®) sozinha ou em combinação com 5 ou 12,5 mg de DAP; com 15,5 mg de dabigatran etexilato (PRADAXA®) sozinho ou em combinação com 5 ou 12,5 mg de DAP; e com 5 mg de edoxaban (LIXIANA®) sozinha ou em combinação com 12,5 mg de DAP.

Resultados

[00176] Os resultados são mostrados na Figura 15 para rivaroxaban, na Figura 16 para apixaban, na Figura 17 para edoxaban, e na Figura 18 para dabigatran etexilato. O ensaio de sangramento de tran- secção de cauda de rato é análogo à situação clínica na qual é necessária reversão de anticoagulante aguda. Os resultados mostram que DAP efetivamente reverteu a atividade anticoagulante levando à redução estatisticamente significativa na perda de sangue em comparação com ratos recebendo apenas anticoagulante.

Exemplo 11: Reversão de DAP de Anticoagulação de Rivaroxaban (XARELTO®) em Sangue Humano Recém-colhido Ex Vivo. Materiais e Métodos

[00177] Sangue humano foi colhido de um voluntário. Rivaroxaban a 0,25 μg/ml foi adicionada sozinha ou em combinação com 50 μg/ml de DAP. Os controles continham 50 μg/ml de DAP ou salina. aPTT foi medido dentro de 2 minutos da coleta de sangue.

Resultados

[00178] A Figura 19 demonstra que a administração de DAP levou a uma reversão de anticoagulação induzida por rivaroxaban no sangue humano recentemente coletado, como medida por aPTT. As barras de erro representam erro padrão de três experimentos independentes.

Exemplo 12: Reversão de DAP de Antocoagulação de Rivaroxaban e Apixaban em Plasma Humano Ex Vivo Materiais e Métodos

[00179] 218 μg/L ou 459 μg/L de rivaroxaban foram adicionados ao plasma humano, com ou sem 1.250 μg/L ou 6.250 μg/L de DAP, res-pectivamente. Da mesma forma, 156 μg/L ou 313 μg/L de apixaban foram adicionados ao plasma humano com ou sem 1.156 μg/L ou 3,125 μg/L de DAP, respectivamente. Efeito de DAP em anticoagula- ção foi medido por ensaio cromogênico anti-Fator Xa Biophen depurado 510k. Concentraçoes de rivaroxaban foram determinadas por comparação com padrões de calibração de plasma, enquanto as concentrações de apixaban foram inferidas de diluições de solução de estoque, pois padrões de calibração não estão ainda disponíveis.

Resultados

[00180] Para ambas as concentrações de rivaroxaban e apixaban, DAP retornou a concentração de anticoagulante eficaz para abaixo da concentração eficaz mínima. A Figura 20 mostra os resultados para rivaroxaban e a Figura 21 mostra os resultados para apixaban.

Exemplo 13: Reversão de DAP Dose-dependente de Anticoagula- ção de Rivaroxaban em Plasma Humano Ex Vivo Materiais e Métodos

[00181] 218 μg/L de rivaroxaban foram adicionados ao plasma hu mano, quer sozinha ou em combinação com 1,25, 12,5, 125 ou 1.250 μg/L de DAP. A atividade de Fator Xa foi medida por kit de ensaio cromogênico anti-Xa Biophen depurado 510k. Concentrações de rivaroxaban foram determinadas por comparação com padrões de calibra- ção de plasma.

Resultados

[00182] A Figura 22 demonstra que DAP foi eficaz na reversão dose dependente de anticoagulante de rivaroxaban em plasma humano, como demonstrado pelo seu efeito na concentração de rivaroxaban (medida por ensaio de atividade de Fator Xa).

Claims (16)

1. Composto representado pela fórmula II:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracte-rizado pelo fato de que: L e L’ são cada um uma cadeia alquileno C1 a C10 que é substituída ou não-substituída com pelo menos um de alquila C1 a C10, hidroxila, hidroxil alquila C1 a C10, amino, amino alquila C1 a C10, alcóxi C1 a C10, alquil C1 a C10 alcóxi C1 a C10; M e M’ são cada um uma cadeia alquileno C1 a C10 que é substituída com pelo menos um de alquila C1 a C10, hidroxila, hidroxil alquila C1 a C10, amino, amino alquila C1 a C10, alcóxi C1 a C10, alquil C1 a C10 alcóxi C1 a C10; e Y e Y’ são cada um

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que L e/ou L’ são uma cadeia alquileno substituído ou não substituído que é C1 a C6.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula III:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

4. Composto de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula IV:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que n é 3 a 5, m é 3 a 6 e G é selecionado de -NH2 e OH.

5. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que G é amina.

6. Composto, caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula V

7. Composto, caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula VI

8. Composto, caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula VII

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

9. Composto, caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula VIII

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto como definido em qualquer uma das rei-vindicações 1 a 9, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a composição é adaptada para administração enteral.

12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição é adaptada para administração oral.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a composição é adaptada para administração parenteral.

14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a composição é adaptada para administração intravenosa ou subcutânea.

15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a composição está na forma de uma cápsula ou comprimido.

16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a composição está em uma solução aquosa.

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