BR112012004316B1 - Composição compreendendo um polímero de impressão molecular, métodos de produção e uso da dita composição - Google Patents

Composição compreendendo um polímero de impressão molecular, métodos de produção e uso da dita composição Download PDF

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Abstract

ABSORVENTES DE MICOTOXINA SINTÉTICOS E MÉTODOS DE PRODUÇÃO E UTILIZAÇÃO DOS MESMOS A presente invenção refere-se de forma geral a polímeros de impressão molecular (MIPs). Em particular, a presente invenção refere-se a MIPs não hostis ao ambiente reutilizáveis que podem ser produzidos em quantidades relativamente altas, a métodos de produção dos mesmos e a métodos de utilização dos mesmos (por exemplo, para sequestrar elou adsorver compostos alvos (por exemplo, micotoxinas)). As composições e os métodos da invenção encontram uso em uma variedade de aplicações incluindo processamento e produção de alimentos e bebidas dietéticos terapêuticos, profiláticos, bem como aplicações de pesquisa, de controle de qualidade e de capacidade de rastreamento.

Description

[001] O presente pedido de patente reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório U.S. Número de Série 61/237.549 depositado em 27 de agosto de 2009, cuja totalidade é incorporada aqui como referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se de forma geral a polímeros de impressão molecular (MIPs). Em particular, a presente invenção refere-se a MIPs não hostis ao ambiente reutilizáveis, a métodos de produção dos mesmos e métodos de utilização dos mesmos (por exemplo, para sequestrar e/ou adsorver alvos (por exemplo, micotoxinas)). As composições e os métodos da invenção encontram uso em uma variedade de aplicações incluindo processamento e produção de alimentos e bebidas dietéticos, terapêuticos, profiláticos, bem como aplicações de pesquisa e de controle de qualidade.
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO
[003] As micotoxinas são metabólitos secundários secretados por uma variedade de fungos, frequentemente produzidas em grãos de cereais bem como forragens antes, durante e depois da colheita. As forragens e os cereais entram naturalmente em contato com os esporos dos fungos. A contaminação por fungos de plantas e a biossíntese de toxinas dependem do estado de saúde da planta antes da colheita, das condições meteorológicas, das técnicas de colheita, nos retardos e nas condições hidrotérmicas antes da estabilização para conservação e para processamento de alimentos. Dependendo do fungo, o crescimento fúngico é controlado através de um número de parâmetros físicoquímicos incluindo a quantidade de água livre (aw), temperatura, presença de oxigênio, natureza do substrato e condições de pH. As micotoxinas se proliferam antes da colheita bem como após a colheita no armazenamento.
[004] Alguns fungos produzem toxinas somente em níveis específicos de umidade, temperatura ou oxigênio. Os efeitos de micotoxinas variam enormemente em relação a sua gravidade. Algumas micotoxinas são letais, algumas causam doenças ou problemas de saúde que podem ser identificados, algumas enfraquecem o sistema imunológico sem produzir sintomas específicos a tal micotoxina, algumas agem como agentes alergênicos ou irritantes e algumas possuem efeito desconhecido sobre animais ou seres humanos. Durante a Segunda Guerra Mundial os soldados russos sofreram necrose dérmica grave, hemorragia e destruição da medula óssea após ingerir grãos mofados que estavam contaminados com Fusarium. Entretanto, somente nos anos de 1960, quando mais de 100.000 perus na Grã Bretanha foram dizimados por uma doença hepática fatal (Doença X do Peru) que a comunidade científica reconheceu os efeitos negativos associados às micotoxinas (Ver, por exemplo, Trenholm H.L., Charmley L.L. e Prelusky D.B., 1996. Mycotoxin binding agents: An update on what we know. Em: Biotechnology in the Feed Industry (Lyons T. P e Jacques K.A eds.) Nottingham University Press, Loughborough, Leics, UK, pp. 327-349.). De acordo com os relatórios da Organização de Alimentos e Agricultura das Nações Unidas (United Nation’s Food and Agriculture Organization (FAO)) recentes, aproximadamente 25% do suprimento de grãos do mundo estão contaminados com micotoxinas. A contaminação com micotoxinas possui um impacto econômico negativo sobre os alimentos e os produtores de alimentos, particularmente produtores de grãos e aves.
[005] As micotoxinas podem aparecer na cadeia alimentar como um resultado de infecção fúngica de produtos vegetais (por exemplo, forragem, grão, proteína vegetal, subprodutos processados de grãos, alimento ricos em fibras e produtos de melaço) e podem ser ingeridas diretamente por seres humanos ou introduzidas através de grãos contaminados, produto(s) alimentício(s) de animais de criação ou de outros animais. As micotoxinas resistem consideravelmente à decomposição durante a digestão de forma que permanecem na cadeia alimentar nos produtos comestíveis (por exemplo, carne, peixe, ovos e produtos laticínios) ou sob a forma de metabólitos da toxina original ingerida. Os tratamentos com temperatura tais como cozimento e congelamento não são métodos adequados de diminuição da prevalência de micotoxinas. Assim, há uma necessidade de composições e/ou métodos para a redução dos efeitos prejudiciais e/ou para a eliminação da ocorrência de micotoxinas nos alimentos e/ou nas cadeias alimentares.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] A presente invenção refere-se a polímeros de impressão molecular (MIPs). Em particular, a presente invenção refere-se a MIPs não hostis ao ambiente reutilizáveis, métodos de produção dos mesmos e métodos de utilização dos mesmos (por exemplo, para sequestrar e/ou adsorver alvos (por exemplo, micotoxinas)). As composições e os métodos da invenção encontram uso em uma variedade de aplicações incluindo processamento e produção de alimentos e bebidas dietéticos, terapêuticos e profiláticos, bem como aplicações de pesquisa e de controle de qualidade.
[007] Consequentemente, em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição que compreende um polímero de impressão molecular sintetizado utilizando um molde de micotoxina. A presente invenção não está limitada ao molde de micotoxina utilizada para produzir um polímero de impressão molecular. Na verdade, uma variedade de moldes de micotoxinas pode ser utilizada incluindo, mas não limitada a, acetoxiscirpenodiol, acetildesoxinivalenol, acetilnivalenol, acetilneosolaniol, acetil T-2 toxina, aflatoxina, aflatoxina B1, B2, G1 e G2, aflatrem, ácido altenúico, alternariol, austdiol, austamida, austocistina, avenaceína +1, beauvericina +2, bentenolida, brevianamida, butenolida, calonectrina, quetoglobosina, quetocina, quetomina, citrinina, citreoviridina, cocliodinol, citocalasinas, ácido ciclopiazônico, desacetilcalonectrina, desactilneosolaniol, diacetato de desoxinivalenol, monoacetato de desoxinivalenol, diacetoxiscirpenol, destruxina B, emestrina, eniatinas, toxinas alcalóides de esporão do centeio e endófitas tais como ergina, ergocornina, ergocristina, ergocriptina, ergometrina, ergonina, ergosina, ergotamina, ergovalina, lisergol, ácido lisérgico e epímeros relacionados, fructigenina +1, fumagilina, fumonisinas, fumonisinas A1, A2, B1 e B2 e B3, fusarenon- X, fusarocromanona, ácido fusárico, fusarina, gliotoxina, HT-2 toxina, hialodendrina, ipomeanina, islanditoxina, isofumigaclavinas A e B, lateritina +1, leptosina, licomarasmina +1, malformina, maltorizina, moniliformina, monoacetoxiscirpenol, ácido micofenólico, neosolaniol, nivalenol, NT-1 toxina, NT-2 toxina, ocratoxina, oosporeína, ácido oxálico, paspalitrem A e B, patulina, ácido penicílico, penitrem, fomopsinas, PR-toxina, roridina E, roquefortina A e B, rubratoxina, rubrosquirina, rubrosulfina, rugulosina, sambucinina +1, satratoxinas, F,G,H, scirpentriol, sirodesmina, slaframina, esporidesmina, sterigmatocistina, swainsonina, T-1 toxina, T-2 toxina, ácido tenuazóico, triacetoxiscirpendiol, tricotecenos, tricodermina, tricotecina, tricoverrinas, tricoverróis, triptoquivaleno, verrucarina, verruculogênio, verticilinas, viopurpurina, viomeleína, viriditoxina, wortmanina, xantocilina, iavanicina+1, zearalenóis, zearalanonas, zearalenona, α, β, zearalanona, α, β, zeranol e subfamílias e/ou derivados dos mesmos e/ou conjugados. Em algumas modalidades preferidas, a micotoxina alvo é OTA. Em outras modalidades preferidas, a micotoxina alvo é esporidesmina ou um alcalóide de esporão do centeio. Em algumas modalidades, o molde de ocratoxina é N-(2- hidroxi-3,5-diclorobenzoil)-L-fenilalanina. Em algumas modalidades, o molde de esporidesmina é 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina. Entretanto, a presente invenção não está limitada a estes moldes de ocratoxina ou de esporidesmina. Na verdade, uma variedade de moldes diferentes pode ser utilizada incluindo N-tert-butoxicarbonil-2,3- dimetoxianilina, 2,3-dimetoxianilina, 3-hidróxi-6,7-dimetóxi-2-indolona- 3-carboxilato de etila, 6,7-dimetoxiisatina ou 6,7-dimetóxi-1- metilisatina.
[008] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de produção de um polímero de impressão molecular que compreende: o fornecimento de: um molde de micotoxina; e um ou mais monômeros e um ou mais agentes de reticulação; e o contato da micotoxina alvo com o um ou mais monômeros e o um ou mais agentes de reticulação sob condições que permitam a polimerização do o um ou mais monômeros e o um ou mais agentes de reticulação na presença da micotoxina alvo. Em algumas modalidades, a micotoxina alvo é N-(2-hidróxi-3,5-diclorobenzoil)-L-fenilalanina. Em algumas modalidades, a micotoxina alvo é 5-cloro-6,7-dimetóxi-1- metilisatina. A presente invenção não está limitada à micotoxina alvo utilizada. Na verdade, uma variedade de moléculas sintéticas pode ser utilizada como moldes de micotoxinas em que as moléculas sintéticas imitam uma ou mais das estruturas, formatos e/ou outras características químicas de micotoxinas naturais. A presente invenção similarmente não está limitada aos tipos de monômeros utilizados. Por exemplo, uma variedade de monômeros é conhecida pelos peritos comuns na arte e inclui, mas não está limitada a, 2-vinilpiridina, 2- hidroxietilmetacrilato e ácido metacrílico. A presente invenção similarmente não está limitada ao tipo de agente de reticulação utilizado. Por exemplo, uma variedade de agentes de reticulação é conhecida pelos peritos comuns na arte e inclui, mas não está limitada a, dimetacrilato de etileno glicol. Em algumas modalidades, a polimerização é iniciada através da formação de radicais livres em um solvente orgânico a uma temperatura entre 55 e 110 graus Celsius, embora menor (por exemplo, 50, 45, 40, 35, 30 graus Celsius ou menor) e maior (por exemplo, 115, 120, 125, 130 graus Celsius ou maior) possa ser utilizada. Em algumas modalidades, os radicais livres são formados através da decomposição iniciada termicamente de azoisobutironitrila (AIBN). A presente invenção não é limitada pelo tipo de solvente orgânico utilizado. Em algumas modalidades, o solvente orgânico é tolueno, ciclohexano, acetonitrila, uma solução de álcool polivinílico (PVA)/ água e uma mistura de dois ou mais de tolueno, ciclohexano, acetonitrila e uma solução de PVA/ água. Em algumas modalidades, a temperatura fica entre 55 e 75 graus Celsius. Em algumas modalidades, a micotoxina alvo é removida do polímero de impressão molecular após a polimerização do um ou mais monômeros e o um ou mais agentes de reticulação. Em algumas modalidades, uma ou mais lavagens com uma solução é utilizada para remover a micotoxina alvo do polímero de impressão molecular. A presente invenção não está limitada ao tipo de solução utilizada para lavagem. Em algumas modalidades, a solução é um solvente orgânico, um tampão, água ou uma combinação dos mesmos. A presente invenção não está limitada ao tipo de solvente orgânico utilizado. Em algumas modalidades, o solvente orgânico é álcool etílico, álcool metílico, acetonitrila, tolueno e/ou uma mistura dos mesmos. Em algumas modalidades, o tampão é um tampão preparado através da reação de hidróxido de sódio, ácido cítrico, ácido succínico e ácido acético. Em algumas modalidades, a água é água deionizada. Em algumas modalidades, o polímero de impressão molecular é seco após a uma ou mais lavagens. Em algumas modalidades, a exposição do polímero de impressão molecular a uma temperatura entre 20 e 90 graus Celsius (por exemplo, entre 60 e 80 graus Celsius; entre 75 e 80 graus Celsius) é utilizada para secar o polímero de impressão molecular, embora temperaturas menores ou maiores possam ser utilizadas.
[009] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de sequestro de uma micotoxina de um material, que compreende: o fornecimento de um material que compreende micotoxinas; e um polímero de impressão molecular gerado através da polimerização de um ou mais monômeros e um ou mais agentes de reticulação na presença de um molde de micotoxina; e o contato do polímero de impressão molecular com o material que compreende micotoxinas sob condições que permitam que o polímero de impressão molecular se ligue à micotoxina. A presente invenção não está limitada ao tipo de micotoxinas sequestradas (por exemplo, de alvo para o sequestro) partindo do material. Na verdade, uma variedade de micotoxinas pode ser sequestrada incluindo, mas não limitada a, acetoxiscirpenodiol, acetildesoxinivalenol, acetilnivalenol, acetilneosolaniol, acetil T-2 toxina, aflatoxina, aflatoxina B1, B2, G1 e G2, aflatrem, ácido altenúico, alternariol, austdiol, austamida, austocistina, avenaceína +1, beauvericina +2, bentenolida, brevianamida, butenolida, calonectrina, quetoglobosina, quetocina, quetomina, citrinina, citreoviridina, cocliodinol, citocalasinas, ácido ciclopiazônico, desacetilcalonectrina, desactilneosolaniol, diacetato de desoxinivalenol, monoacetato de desoxinivalenol, diacetoxiscirpenol, destruxina B, emestrina, eniatinas, toxinas alcalóides de esporão do centeio e endófitas tais como ergina, ergocornina, ergocristina, ergocriptina, ergometrina, ergonina, ergosina, ergotamina, ergovalina, lisergol, ácido lisérgico e epímeros relacionados, fructigenina +1, fumagilina, fumonisinas, fumonisinas A1, A2, B1 e B2 e B3, fusarenon-X, fusarocromanona, ácido fusárico, fusarina, gliotoxina, HT-2 toxina, hialodendrina, ipomeanina, islanditoxina, isofumigaclavinas A e B, lateritina +1, leptosina, licomarasmina +1, malformina, maltorizina, moniliformina, monoacetoxiscirpenol, ácido micofenólico, neosolaniol, nivalenol, NT-1 toxina, NT-2 toxina, ocratoxina, oosporeína, ácido oxálico, paspalitrem A e B, patulina, ácido penicílico, penitrem, fomopsinas, PR-toxina, roridina E, roquefortina A e B, rubratoxina, rubrosquirina, rubrosulfina, rugulosina, sambucinina +1, satratoxinas, F,G,H, scirpentriol, sirodesmina, slaframina, esporidesmina, sterigmatocistina, swainsonina, T-1 toxina, T-2 toxina, ácido tenuazóico, triacetoxiscirpendiol, tricotecenos, tricodermina, tricotecina, tricoverrinas, tricoverróis, triptoquivaleno, verrucarina, verruculogênio, verticilinas, viopurpurina, viomeleína, viriditoxina, wortmanina, xantocilina, iavanicina+1, zearalenóis, zearalanonas, zearalenona, α, β, zearalanona, α, β, zeranol e subfamílias e/ou derivados dos mesmos. Em algumas modalidades preferidas, a micotoxina sequestrada partindo do material é ocratoxina A. Em algumas modalidades preferidas, a micotoxina é esporidesmina. Em algumas modalidades, o material que compreende micotoxinas é uma bebida, uma matéria alimentícia, um alimento para animais, uma composição farmacêutica, uma composição nutracêutica, uma composição cosmética, uma substância necessária para manter a vida ou outro material. Em algumas modalidades, a substância necessária para manter a vida é um meio para uso na aquicultura e uma amostra gasosa que compreende oxigênio. Em algumas modalidades, um polímero de impressão molecular ligado a uma micotoxina não está separado do material que compreende micotoxinas. Em algumas modalidades, o método de sequestro de uma micotoxina partindo de um material, compreende ainda a separação dos polímeros de impressão molecular ligados à micotoxina partindo do material que compreende micotoxinas. Em algumas modalidades, a separação compreende a extração, a concentração e o isolamento dos polímeros de impressão molecular ligados à micotoxina partindo do material que compreende micotoxinas. Em algumas modalidades, a separação ocorre em uma coluna ou um cartucho cromatográfico ou de separação. Em algumas modalidades, após a separação, a micotoxina ligada aos polímeros de impressão molecular são removidas dos polímeros de impressão molecular através de lavagem. Em algumas modalidades, as micotoxinas são analisadas de forma qualitativa e quantitativa após a remoção dos polímeros de impressão molecular. Em algumas modalidades, a análise quantitativa e qualitativa é utilizada para a possibilidade de rastreamento (por exemplo, para identificar e/ou interrelacionar a cronologia, a localização e/ou a aplicação de um item (por exemplo, a localização, o tipo e a quantidade de micotoxinas encontradas) através de identificação registrada documentada). Em algumas modalidades, o polímero de impressão molecular do qual as micotoxinas foram removidas é reutilizado para sequestrar uma micotoxina partindo de um material que compreende micotoxinas. Em algumas modalidades, o polímero de impressão molecular adsorve 1 até 10 vezes mais (por exemplo, 1 até 5 vezes mais, 1 até 2 vezes mais) água que seu peso. Em algumas modalidades, dois ou mais polímeros de impressão molecular diferentes são colocados em contato com o material que compreende micotoxinas com a finalidade de sequestrar duas ou mais micotoxinas específicas partindo do material.
[010] A invenção fornece ainda um método para a síntese de N- (2-hidróxi-3,5-diclorobenzoil)-L-fenilalanina, que compreende: a conversão de ácido 3-5 diclorossalicílico em ácido 2-acetoxiacetóxi- 3,5-diclorobenzóico; a conversão de ácido 2-acetoxiacetóxi-3,5- diclorobenzóico em cloreto de ácido 2-acetoxiacetóxi-3,5- diclorobenzóico; a reação de cloreto de ácido 2-acetoxiacetóxi-3,5- diclorobenzóico com éster etílico de L-fenilalanina para formar N-(2- acetóxi-3,5-diclorobenzoil)-L-fenilalanina; e a conversão de N-(2- acetóxi-3,5-diclorobenzoil)-L-fenilalanina em N-(2-hidróxi-3,5- diclorobenzoil)-L-fenilalanina. Em algumas modalidades, a conversão compreende a hidrólise de funções éster em N-(2-acetóxi-3,5- diclorobenzoil)-L-fenilalanina.
[011] A invenção fornece ainda um método para a síntese de 5- cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina, que compreende: a conversão de ácido 2,3-dimetoxibenzóico em 2,3-dimetóxi-N- tertbutoxicarbonilanilina; a conversão de 2,3-dimetóxi-N- tertbutoxicarbonilanilina em 2,3-dimetoxianilina; a reação de 2,3- dimetoxianilina com dietilcetomalonato para formar 6,7-dimetóxi-3- hidróxi-3-(2-indolona)-carboxilato de etila; a conversão de 6,7- dimetóxi-3-hidróxi-3-(2-indolona)-carboxilato de etila em 6,7- dimetoxiisatina; a conversão de 6,7-dimetoxiisatina em 6,7-dimetóxi-1- metilisatina; e a conversão de 6,7-dimetóxi-1-metilisatina em 5-cloro- 6,7-dimetóxi-1-metilisatina.
[012] A invenção fornece ainda um método de síntese de um polímero de impressão molecular específico para uma micotoxina, que compreende: a produção de um composto molde capaz de facilitar a ligação do MIP a uma micotoxina; a combinação do composto molde em uma reação que compreende um monômero de MIP e um reagente de reticulação em um sistema de solvente que compreende um solvente não prótico apolar; e a promoção da polimerização através de uma ação selecionada do grupo que consiste da exposição do recipiente do reagente a uma temperatura elevada ou da exposição do recipiente do reagente à irradiação de UV. Em algumas modalidades, a micotoxina compreende ocratoxina A, entretanto, a invenção não é limitada a esta. Na verdade, uma variedade de polímeros de impressão molecular específico para uma micotoxina pode ser sintetizada como descrito aqui incluindo, mas não limitada a, MIPs específicos para acetoxiscirpenodiol, acetildesoxinivalenol, acetilnivalenol, acetilneosolaniol, acetil T-2 toxina, aflatoxina, aflatoxina B1, B2, G1 e G2, aflatrem, ácido altenúico, alternariol, austdiol, austamida, austocistina, avenaceína +1, beauvericina +2, bentenolida, brevianamida, butenolida, calonectrina, quetoglobosina, quetocina, quetomina, citrinina, citreoviridina, cocliodinol, citocalasinas, ácido ciclopiazônico, desacetilcalonectrina, desactilneosolaniol, diacetato de desoxinivalenol, monoacetato de desoxinivalenol, diacetoxiscirpenol, destruxina B, emestrina, eniatinas, toxinas alcalóides de esporão do centeio e endófitas tais como ergina, ergocornina, ergocristina, ergocriptina, ergometrina, ergonina, ergosina, ergotamina, ergovalina, lisergol, ácido lisérgico e epímeros relacionados, fructigenina +1, fumagilina, fumonisinas, fumonisinas A1, A2, B1 e B2 e B3, fusarenon- X, fusarocromanona, ácido fusárico, fusarina, gliotoxina, HT-2 toxina, hialodendrina, ipomeanina, islanditoxina, isofumigaclavinas A e B, lateritina +1, leptosina, licomarasmina +1, malformina, maltorizina, moniliformina, monoacetoxiscirpenol, ácido micofenólico, neosolaniol, nivalenol, NT-1 toxina, NT-2 toxina, ocratoxina, oosporeína, ácido oxálico, paspalitrem A e B, patulina, ácido penicílico, penitrem, fomopsinas, PR-toxina, roridina E, roquefortina A e B, rubratoxina, rubrosquirina, rubrosulfina, rugulosina, sambucinina +1, satratoxinas, F,G,H, scirpentriol, sirodesmina, slaframina, esporidesmina, sterigmatocistina, swainsonina, T-1 toxina, T-2 toxina, ácido tenuazóico, triacetoxiscirpendiol, tricotecenos, tricodermina, tricotecina, tricoverrinas, tricoverróis, triptoquivaleno, verrucarina, verruculogênio, verticilinas, viopurpurina, viomeleína, viriditoxina, wortmanina, xantocilina, iavanicina+1, zearalenóis, zearalanonas, zearalenona, α, β, zearalanona, α, β, zeranol e subfamílias e/ou derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, o molde compreende N-(2- hidróxi-3,5-diclorobenzoil)-L-fenilalanina. Em algumas modalidades, o molde compreende 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina. A presente invenção não está limitada a qualquer monômero ou agente de reticulação particular. Na verdade, uma variedade de monômeros e agentes de reticulação pode ser utilizada incluindo os descritos aqui. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a lavagem do polímero de impressão molecular para remover o molde. Em algumas modalidades, a lavagem compreende 1, 2, 3, 4 ou mais lavagens com uma solução (por exemplo, uma solução alcalina diluída, uma solução ácida diluída ou água) para remover o molde.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[013] A Figura 1 mostra ocratoxina A e N-(3,5-dicloro-2- hidroxibenzoil)-L-fenilalanina (molde de OTA).
[014] A Figura 2 mostra a via de síntese de N-(3,5-dicloro-2- hidroxibenzoil)-L-fenilalanina (molde de OTA).
[015] A Figura 3 mostra a eficácia de sequestro de MIP-OTA para OTA em várias taxas de inclusão.
[016] A Figura 4 mostra MIP-OTA observado em um microscópio eletrônico de varredura Hitachi S-4300 no aumento de *15.000 e a 3,0keV.
[017] A Figura 5 mostra a afinidade de sequestro de MIPs (sintetizados em mistura de tolueno-ciclohexano) para 5 níveis diferentes de inclusão em direção a 3 concentrações diferentes de OTA.
[018] A Figura 6 mostra a atividade de sequestro por OTA pelos MIPs feitos de estireno e 2-vinilpiridina como monômeros funcionais e polimerizados com iniciação térmica ou iniciação à baixa temperatura e por UV. Os valores da adsorção inicial e da adsorção restante após lavagem com tampão citrato (pH 4,0) e após lavagem com metanol a 100% são relatados.
[019] A Figura 7 mostra a atividade de sequestro para polifenóis e ácido 3-indol acético por MIPs feitos de estireno e 2-vinilpiridina como monômeros funcionais e polimerizados com temperatura baixa e iniciação por UV. São relatados os valores da adsorção inicial.
[020] A Figura 8 mostra fotos de rede de fibra de vidro revestida com MIP-OTA e utilizada em um tubo falcon de 50 mL para sequestro de OTA no vinho.
[021] A Figura 9 mostra os resultados do teste de sequestro de três níveis de MIP-OTA revestidos sobre a rede de fibra de vidro utilizando quatro condições de polimerização diferentes e testados com vinho branco compreende reforçadas com álcool de 50, 100, 200 ppb de OTA.
[022] A Figura 10 mostra os resultados do teste de sequestro de três níveis de NIP revestidos sobre a rede de fibra de vidro utilizando 3 três condições de polimerização e testados em vinho branco para concentrações reforçadas com álcool de 50, 100, 200 ppb de OTA.
[023] A Figura 11 mostra um perfil cromatográfico de soluções padronizadas de OTA registrado com um detector fluorescente e uma seleção de gradientes utilizada para otimizar o tempo de retenção da micotoxina.
[024] A Figura 12 mostra a esporidesmina e a molecular estrutura do molde de esporidesmina (5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina).
[025] A Figura 13 mostra a via de síntese do molde de esporidesmina.
[026] A Figura 14 mostra a eficácia de sequestro para o molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina através de MIP-esporidesmina e NIP em várias taxas de inclusão.
[027] A Figura 15 mostra a atividade de sequestro para gliotoxina dos MIPs e NIPs sintetizados com polimerização iniciada com calor ou iniciada com temperatura baixa/UV e estabilidade/especificidade da interação após seis lavagens sucessivas realizadas com nível crescente de metanol.
[028] A Figura 16 mostra a atividade de sequestro para o molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina dos MIPs e NIPs sintetizados com polimerização iniciada com calor ou iniciada com temperatura baixa/UV e estabilidade/especificidade da interação após seis lavagens sucessivas realizadas com nível crescente de metanol.
DEFINIÇÕES
[029] Como utilizado aqui, o termo “polímero de impressão molecular” ou “MIP” refere-se a polímeros sintéticos que se ligam seletivamente a um composto particular. Em uma modalidade preferida, os polímeros de impressão molecular são sintetizados na presença de compostos alvos, também referidos como composto moldes, criando um MIP com um alto grau de afinidade pelo composto alvo específico (por exemplo, micotoxinas). Em geral, os polímeros são construídos com moldes (por exemplo, molécula/ligante/molde construídos sinteticamente (por exemplo, moldes de micotoxinas sintéticos)) que imitam a estrutura, o formato e/ou outras características químicas de um alvo natural (por exemplo, micotoxinas naturais) e outros componentes tais como monômeros e/ou reagentes de reticulação. Por exemplo, os compostos moldes são incorporados em uma mistura pré-polimérica e é permitido que estes se associem com os monômeros. A mistura é então polimerizada com os compostos moldes no local. Uma vez que o polímero foi formado, os compostos moldes são removidos, deixando para trás cavidades complementares com afinidade pelo molde (ou outras composições que se assemelham com o molde (por exemplo, micotoxinas que ocorrem naturalmente). Tais regiões (por exemplo, cavidades ou outras regiões) são feitas sob encomenda para a ligação com futuros compostos alvos dando origem a uma alta afinidade por tais compostos.
[030] É digno de nota que, embora os compostos alvos específicos sejam utilizados para formar polímeros de impressão molecular, os polímeros podem ter uma alta afinidade por uma classe de compostos que é distinta de, mas similar ao composto alvo. Por exemplo, um polímero de impressão molecular pode se ligar a um número de compostos que são similares em formato, densidade de carga, geometria ou outras propriedades físicas ou químicas ao composto molde (por exemplo, micotoxina alvo sintética).
[031] Como utilizado aqui, o termo “polímero”, refere-se a uma molécula (macromolécula) composta de unidades estruturais repetidas tipicamente conectadas através de ligações químicas covalentes que formam uma rede.
[032] Como utilizado aqui, o termo “composto molde” ou “composto alvo” refere-se a um composto que é complexado por ligantes (por exemplo, monômeros) que são subsequentemente polimerizados, formando um polímero de impressão molecular. Os compostos moldes incluem compostos orgânicos (por exemplo, micotoxinas, peptídeos e proteínas) bem como compostos inorgânicos (por exemplo, minerais e metais pesados). Como utilizado aqui, o termo "micotoxina alvo" refere-se a uma molécula construída sinteticamente que imita a estrutura, o formato e/ou outra característica química de uma micotoxina natural (por exemplo, ocrotoxina, esporidesmina etc.). A presente invenção não está limitada ao tipo de micotoxina alvo utilizado. Na verdade uma variedade de micotoxinas pode ser utilizada incluindo, mas não limitada a, Aflatoxinas: aflatoxina B1, B2, G1, G2, M1, P1, Q1, sterigmatocistina e subfamílias, aflatoxicol; Tricotecenos: desoxinivalenol, diacetoxiscirpenol, monoacetoxiscirpenol, scirpenotriol, T-2 toxina, HT- 2 toxinas, T-2 tetraol, fusarenon X, fusarina C, ácido fusárico, fusarocromanona, aurofusarina, fusaproliferina, neosolaniol, nivalenol junto com metabólitos e subfamílias; Fumonisinas: fumonisina A1, A2, B1, B2, B3 e subfamílias; Ocratoxinas: ocratoxina A, B, α, β e metabólitos; Zearalenona, zearalenol α, β, zearalanona, zearalanol α, β, zeranol e metabólitos; Patulina, gliotoxina, ácido micofenólico, ácido moniliformina ciclopiazônico, citrinina, beauvericina, citreoviridina, citocalasina H; Ácido penicílico, PR-toxina, roquefortina A, B, rubratoxina e subfamílias; alcalóides de esporão do centeio: ergotamina, alcalóides de clavina; Isofumigaclavinas A, B; paspalitrem A, B, aflatrem, penitrems e subfamílias; Fomopsinas: Fomopsina A e subfamílias; Verrucarina A, verruculogênio e subfamílias; Esporidesmina e subfamílias; slaframina, swainsonina, ácido tenuazóico, alternariol, wortmanina e outras micotoxinas descritas aqui.
[033] Como utilizado aqui, o termo “monômero”, refere-se a uma molécula que pode ficar quimicamente ligada a outros monômeros para formar um polímero.
[034] Como utilizado aqui, os termos “reticulação” e “agente de reticulação”, referem-se a moléculas que contêm duas, três ou quatro ligações duplas que são capazes de se ligar a dois ou mais monômeros para formar uma rede polimérica.
[035] Como utilizado aqui, o termo “unidade estrutural”, refere-se a um bloco de construção de uma cadeia polimérica e relacionado à unidade repetida.
[036] Como utilizado aqui, o termo “aniônico” ou “ânion” refere-se a um íon que possui uma carga negativa.
[037] Como utilizado aqui, o termo “catiônico” ou “cátion” refere- se a um íon que possui uma carga positiva. Este termo pode-se referir a compostos poliméricos, tais como polímeros de impressão molecular, que contêm uma carga positiva.
[038] Como utilizado aqui, o termo “ácido” como utilizado aqui se refere a qualquer composto químico que pode doar próton(s) e/ou aceitar elétron(s). Como utilizado aqui, o termo “base” refere-se a qualquer composto químico que pode aceitar próton(s) e/ou doar elétron(s) ou íons hidróxidos. Como utilizado aqui, o termo “sal” refere- se a compostos que podem ser derivados de ácidos e bases inorgânicas ou orgânicas.
[039] Como utilizado aqui, o termo “vazamento”, refere-se a uma fração remanescente do molde ainda em associação com o MIP após os vários estágios de lavagem do MIP e que continua a se dissociar do MIP e interfere com sua atividade de adsorção.
[040] Como utilizado aqui, o termo “porogênico/porogênio”, refere-se a uma substância, uma molécula, um tampão, um solvente, (por exemplo, tolueno, xileno, etilbenzeno) utilizado para alterar o tamanho das cavidades em um polímero (por exemplo, cavidades de um MIP), enquanto a proporção de polímero em relação ao porogênio está diretamente correlacionada com a quantidade de porosidade da estrutura final.
[041] Como utilizado aqui, o termo “porosidade”, refere-se a uma medida dos espaços vazios em um material (por exemplo, uma cavidade de MIP) que pode sustentar um gás ou um líquido ou permitir que este passe através.
[042] Como utilizado aqui, o termo “polimerização”, refere-se a um processo de reação de moléculas de monômeros juntas em uma reação química para formar redes tridimensionais ou cadeias poliméricas.
[043] Como utilizado aqui, o termo “precipitação”, refere-se à formação de um sólido em uma solução durante uma reação química. Quando a reação ocorre, o sólido formado é chamado de o precipitado e o líquido remanescente acima do sólido é chamado de sobrenadante.
[044] Como utilizado aqui, o termo “centrifugação” refere-se ao processo de separação de moléculas por tamanho ou densidade utilizando forças centrífugas geradas por um rotor giratório que coloca um objeto em rotação ao redor de um eixo fixo, aplicando uma força perpendicular ao eixo. A centrífuga funciona utilizando o princípio de sedimentação, onde a aceleração centrípeta é utilizada para distribuir igualmente substâncias de densidade maior e menor em camadas de densidade diferentes.
[045] Como utilizado aqui, o termo “concentração” refere-se à quantidade de uma substância por espaço definido. A concentração é geralmente expressa em termos de massa por unidade de volume. Para diluir uma solução, é preciso adicionar mais solvente ou reduzir a quantidade de soluto (por exemplo, através de separação seletiva, evaporação, secagem por spray, secagem por congelamento). Em contraste, para concentrar uma solução, é preciso reduzir a quantidade de solvente.
[046] Como utilizado aqui, o termo “camada” refere-se a um depósito geralmente horizontal organizado no estrato de um material formando uma parte ou um segmento sobrejacente obtido após a separação por centrifugação ou sedimentação em relação às propriedades de densidade do material.
[047] Como utilizado aqui, o termo “purificado” ou “purificar” refere-se à remoção de componentes estranhos de uma amostra. Quando utilizado em um contexto químico “purificado” ou “purificar” refere-se à separação física de uma substância química de interesse de substâncias estranhas, indesejadas ou contaminantes. Os métodos comumente utilizados para purificação de moléculas orgânicas, incluem, mas não estão limitados aos seguintes: purificação por afinidade, filtração mecânica, centrifugação, evaporação, extração de impureza, dissolução em um solvente em que outros componentes são insolúveis, cristalização, adsorção, destilação, fracionamento, sublimação, fundição, refinação, eletrólise e diálise.
[048] Como utilizado aqui, o termo “secagem” refere-se a qualquer tipo de processo que reduz ou elimina líquido em uma substância.
[049] Como utilizado aqui, o termo “secagem por spray” refere-se a um método de secagem de uma substância que contêm líquido utilizando gás quente para evaporar o líquido para reduzir ou para eliminar o líquido na substância. Em outras palavras o material é seco através de aspersão ou de atomização em uma descarga de ar seco aquecido.
[050] Como utilizado aqui, o termo “pó seco de escoamento livre” refere-se a um pó seco de escoamento livre.
[051] Como utilizado aqui, o termo “trituração” refere-se à redução do tamanho de partícula por impacto, cisalhamento ou atrito.
[052] Como utilizado aqui, o termo “lavagem” refere-se à remoção ou à limpeza (por exemplo, utilizando qualquer tipo de soluto (por exemplo, água destilada, tampão ou solvente ou mistura) de impurezas ou componente indesejado solúvel de uma preparação (por exemplo, um MIP pode ser lavagedo para remover os componentes moldes da amostra).
[053] Como utilizado aqui, o termo “analito” refere-se a um átomo, uma molécula, uma substância ou um constituinte químico. Em geral, um analito, dentro e do mesmo não é medido, ao invés disso, aspectoos ou propriedades (físicas, químicas, biológicas etc.) do analito são determinadas utilizando um procedimento analítico, tal como Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (abreviada como HPLC). Por exemplo, em geral não é medida uma “cadeira” (analito- componente) no e do próprio, mas, a altura, a largura etc. de uma cadeira são medidas. Similarmente, em geral não é medida uma micotoxina, mas ao invés disso são medidas uma ou mais propriedades da micotoxina (por exemplo, fluorescência de micotoxinas, relacionada, por exemplo, a sua estabilidade, concentração ou atividade biológica).
[054] Como utilizado aqui, o termo “amostra” é utilizado em um sentido amplo incluindo um espécime de qualquer origem (por exemplo, amostras sintéticas, biológicas e ambientais). As amostras sintéticas incluem qualquer material que é produzido artificialmente (por exemplo, MIP). As amostras biológicas podem ser obtidas de animais (incluindo humanos) e abrangem fluidos, sólidos, tecidos e gases. As amostras biológicas incluem produtos do sangue, tais como plasma, soro e similares. As amostras ambientais incluem material ambiental tal como matéria de superfície, solo, água, cristais e amostras ambientais.
[055] Como utilizado aqui, o termo “cromatografia líquida de alto desempenho” e o termo “HPLC” referem-se a uma forma de cromatografia líquida para separar compostos. Os compostos são dissolvidos em uma solução. Os compostos são separados através da injeção da mistura de amostras em uma coluna, através da qual um solvente ou uma mistura de solventes foi circulada, para eluir componentes da mistura, partindo da coluna. Os instrumentos de HPLC compreendem um reservatório de fase móvel, uma bomba, um injetor, uma coluna de separação e um detector. A presença de analitos no efluente de coluna é registrada através da detecção de forma quantitativa de uma alteração no índice de refração, na absorção em UV-VIS em um comprimento de onda ajustado, na fluorescência após excitação com um comprimento de onda adequado ou uma resposta eletroquímica.
[056] Como utilizado aqui, o termo “sinal” é utilizado geralmente em referência a qualquer processo detectável que indique que uma reação ocorreu (por exemplo, ligação de anticorpo ao antígeno). Os sinais podem ser avaliados de forma qualitativa bem como de forma quantitativa. Os exemplos de tipos de “sinais” incluem, mas não estão limitados a, sinais radioativos, sinais fluormétricos ou sinais de produtos/reagentes colorimétricos.
[057] Como utilizado aqui, o termo “microscopia eletrônica de varredura” e o termo “SEM” referem-se a um tipo de microscopia eletrônica que produz imagens da superfície da amostra através da varredura da mesma com um feixe de eletros de alta energia em um padrão de varredura por rastreio. Os elétrons interagem com os átomos que constituem a amostra, produzindo sinais que contêm informação em relação à topografia de superfície da amostra, à composição e outras propriedades tal como conditividade elétrica.
[058] Como utilizado aqui, o termo “agente de fixação” refere-se a um reagente químico que é capaz de fixar uma substância com outra com a finalidade de “fixar”, estabilizar ou de outra maneira preservar a substância em sua forma atual para prevenir que a substância seja degradada ou de outra maneira se altere. Frequentemente, os agentes de fixação são utilizados na microscopia eletrônica de varredura (SEM) para preparar a amostra.
[059] Como utilizado aqui, o termo “in vivo” refere-se a estudos e/ou experimentos realizados dentro de um organismo vivo, que ocorrem dentro de um organismo biológico.
[060] Como utilizado aqui, o termo “in vitro” refere-se a um ambiente artificial fora do organismo vivo e a processos ou reações biológicas que normalmente ocorreriam dentro de um organismo, mas são produzidas para ocorrer em um ambiente artificial. Os exemplos de ambientes in vitro incluem tubos de ensaio e cultura de células.
[061] Como utilizado aqui, o termo “in situ” significa na condição da mistura de reação.
[062] Como utilizado aqui, o termo “ex vivo” refere-se a estudos e/ou experimentos e/ou aplicação feita dentro ou no tecido vivo em um ambiente artificial fora do organismo com a alteração mínima das condições naturais.
[063] Como utilizado aqui, o termo “absorve” refere-se ao processo através do qual um material “capta” ou “suga” outra substância. Por exemplo, “absorção” pode se referir ao processo de absorção ou de assimilação de substâncias em células ou ao longo dos tecidos e órgãos através de difusão ou osmose (por exemplo, absorção de nutrientes pelo sistema digestivo ou absorção de fármacos no fluxo sanguíneo).
[064] Como utilizado aqui, os termos “adsorver” e “adsorção” referem-se a um processo que ocorre quando um material é sequestrado por e/ou acumulado por (por exemplo, na superfície de) uma composição (sequestrante e/ou adsorvente) ou a um processo em que uma composição (por exemplo, MIP) se liga a uma molécula alvo (por exemplo, micotoxinas) em uma amostra (por exemplo, para a remoção da molécula alvo de uma amostra).
[065] Como utilizado aqui, o termo “absorção” refere-se tanto à adsorção quanto à absorção.
[066] Como utilizado aqui, o termo “sequestrar” e/ou o termo “sequestro” refere-se à associação física (por exemplo, através de ligação (por exemplo, ligação de hidrogênio, ligação iônica, ligação covalente ou outro tipo de ligação) de duas ou mais entidades que entram em contato com outra (por exemplo, através da formação de um complexo). Os exemplos de formas de associação incluem, mas não estão limitados a, ligação de hidrogênio, coordenação e formação de pares iônicos. As interações de sequestro podem envolver um número variável de interações químicas (por exemplo, ligações químicas) dependendo da estereoquímica e da geometria de cada entidade (por exemplo, definindo adicionalmente a especificidade do sequestro). Quando duas ou mais entidades são sequestradas estas podem ser seqüestradas através de ligações químicas, mas também podem ser associadas através de carga, dipolo-dipolo ou outro tipo de interações.
[067] Como utilizado aqui, os termos “agente de sequestro” e/ou “agente sequestrante”, referem-se a uma entidade que é capaz de formar um complexo com uma segunda entidade.
[068] Como utilizado aqui, o termo “complexo” refere-se a uma entidade formada através da associação entre duas ou mais entidades separadas (por exemplo, associação entre duas ou mais entidades em que as entidades são as mesmas ou diferentes (por exemplo, mesmas espécies químicas ou diferentes). A associação pode ser através de uma ligação covalente ou uma ligação não covalente (por exemplo, através de interação de van der Waals, eletrostática, de cargas, interação hidrofóbica, interação de dipolo e/ou forças de ligação de hidrogênio (por exemplo, ligações de uretano, ligações de amida, ligações de éster e combinação das mesmas)).
[069] Como utilizado aqui, o termo “quantidade eficiente” refere- se à quantidade de uma composição (por exemplo, MIP) suficiente para realizar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficiente pode ser administrada e/ou combinada com outro material em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não é pretendido que seja limitada a uma formulação ou rota de administração particular.
[070] Como utilizado aqui, o termo “animal” refere-se aqueles do reino animal. Este inclui, mas não está limitado a animais de criação, animais de fazenda, animais domésticos, animais de empresa, animais marinhos ou de água doce e animais selvagens.
[071] Como utilizado aqui, o termo “matérias alimentícias” refere- se a material(is) que são consumidos por um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano e/ou animal (por exemplo, que contribuem com energia e/ou nutrientes para a dieta do indivíduo)). Os exemplos de matérias alimentícias incluem, mas não estão limitados a, laticínios, suco, grãos, fruta, vegetais, carne, Ração Mista Total (TMR), forragem(ns), pelota(s), concentrado(s), pré-mistura(s) co-produto(s), grão(s), grão(s) destilado(s), melaços, fibra(s), alimento(s) para animais domésticos, gramínea(s), feno, semente(s), folhas, farinha grossa, solúvel(is) e suplemento(s).
[072] Como utilizado aqui, “sistema digestivo” refere-se a um sistema (incluindo sistema gastrointestinal) em que a digestão pode ocorrer ou ocorre.
[073] Como utilizado aqui, o termo “digesto” ou “digestão” refere- se à conversão de alimento, matérias alimentícias ou outros compostos orgânicos na forma que pode ser absorvida; para amolecer, decompor ou quebrar por calor e umidade ou ação química.
[074] Como utilizado aqui, o termo “disponibilidade biológica” refere-se à fração de uma molécula ou componente que está disponível a um organismo ou atinge a circulação sistêmica. Quando uma molécula ou componente é administrado de forma intravenosa, sua disponibilidade biológica é de 100%. Entretanto, quando uma molécula ou componente é administrado através de outras rotas (tal como oral), sua disponibilidade biológica diminui (devido à absorção incompleta e ao metabolismo pré-sistêmico).
[075] Como utilizado aqui, os termos “administração” e o termo “administrar” referem-se ao ato de fornecer uma substância, incluindo um fármaco, um pró-fármaco ou outro agente ou tratamento terapêutico a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo ou células, tecidos e órgãos in vivo, in vitro ou ex vivo). Os exemplos de rotas de administração podem ser através dos olhos (oftálmica), da boca (oral), da pele (tópica ou transdermal), das narinas (nasal), dos pulmões (inalação), mucosa oral (bucal), ouvidos, retal, vaginal, por injeção (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intratumoral, intraperitoneal etc.) e similares.
[076] Como utilizado aqui, o termo “co-administração” e o termo “co-administrar” referem-se à administração de pelo menos dois agentes ou terapias a um indivíduo e/ou material (por exemplo, matéria alimentícia). A co-administração de dois ou mais agentes ou terapias pode ser concorrente ou um primeiro agente/terapia pode ser administrada antes de um segundo agente/terapia.
[077] Como utilizado aqui, o termo “tratamento” refere-se à melhora e/ou à reversão de um sinal ou sintoma de doença (por exemplo, micotoxicose). O termo “tratamento” refere-se tanto ao tratamento terapêutico quanto ao profilático ou a medidas de prevenção. Por exemplo, indivíduos que podem se beneficiar do tratamento com composições e métodos da invenção incluem aqueles já com uma doença e/ou um distúrbio (por exemplo, micotoxicose) bem como aqueles em que uma doença e/ou um distúrbio deve ser prevenido (por exemplo, utilizando um tratamento profilático da presente invenção).
[078] Como utilizado aqui, o termo “micotoxina” refere-se a composto(s) tóxico(s) e/ou carcinogênico(s) produzido(s) por várias espécies de fungos.
[079] Como utilizado aqui, o termo “micotoxicose” refere-se a um estado de saúde em que as micotoxinas ultrapassam as barreiras de resistência de um corpo humano ou de animal. A micotoxicose pode ser considerada uma infecção ou uma doença e pode ter um efeito deletério sobre o afetado.
[080] Como utilizado aqui, os termos “doença”, “infecção” e “condição ou resposta patológica” referem-se a um estado, sinais e/ou sintomas que estão associados a uma deficiência no estado normal de um indivíduo vivo (por exemplo, humano e/ou animal) ou de qualquer um de seus órgãos ou tecidos que interrompe ou modifica o desempenho de funções normais e pode ser uma resposta a fatores ambientais (tais como deficiência de nutrição, riscos industriais ou do clima, incluindo micotoxicose), agentes infecciosos específicos (tais como vermes, ameba, bactérias, vírus, príons etc.), ao defeito inerente do organismo (tais como várias anomalias genéticas) ou combinações destes e outros fatores.
[081] Como utilizado aqui, o termo “em risco de doença” refere-se a um indivíduo que é predisposto a sofrer uma doença particular. Esta predisposição pode ser genética (por exemplo, uma tendência genética particular a sofrer a doença, tal como distúrbios que podem ser herdados) ou devida a outros fatores (por exemplo, idade, peso, condições ambientais, exposições a compostos prejudiciais (por exemplo, presentes no ambiente etc.)).
[082] Como utilizado aqui, o termo “sofrendo de doença” refere- se a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo animal ou humano) que está sofrendo de uma doença particular e não está limitado a quaisquer sinais ou sintomas ou doença particular.
[083] Como utilizado aqui, o termo “tóxico” refere-se a qualquer efeito(s) prejudicial(is), deletério(s), danoso(s) ou de outra maneira negativo(s) em um indivíduo, uma célula ou um tecido quando comparado à mesma célula ou tecido antes do contato ou da administração da toxina/ agente tóxico.
[084] Como utilizado aqui, o termo “composição farmacêutica” refere-se à combinação de um agente ativo (por exemplo, uma composição que compreende um MIP) com um carreador, inerte ou ativo, que torna a composição especialmente adequada para uso diagnóstico ou terapêutico in vitro, in vivo ou ex vivo.
[085] Como utilizado aqui, o termo “farmaceuticamente aceitável” e o termo “farmacologicamente aceitável” referem-se a composições que não produzem substancialmente mais efeitos adversos conhecidos que as reações benéficas conhecidas.
[086] Como utilizado aqui, o termo “capacidade de rastreamento” refere-se à propriedade do resultado de uma meida ou do valor de um padrão através do qual pode ser relacionada com referências citadas, geralmente padrões nacionais ou internacionais, através de uma cadeia intacta de comparações, todas tendo incertezas citadas. É a aplicação prática dos conceitos de metrologia geral às medidas químicas fornece a terminologia, os conceitos e a estratégia de garantir também que as medidas químicas analíticas são comparáveis. Isto mede as entidades que podem ser exclusivamente identificadas de uma maneira que pode ser verificada. As medidas da capacidade de rastreamento são utilizadas, entre outras coisas, para a correlação da cronologia, da localização e/ou da aplicação de um item através da identificação registrada documentada.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[087] Vários grupos de fungos produzem micotoxinas que possuem efeitos prejudiciais sobre a saúde dos animais. Estas toxinas são principalmente produzidas pelos gêneros de fungos Aspergillus, Fusarium e Penicillium quando condições favoráveis para sua formação prevalecem. Nenhuma região do mundo escapa das micotoxinas e seu impacto negativo sobre a saúde dos animais e dos seres humanos. O efeito negativo da contaminação por micotoxinas sobre os suprimentos de grãos e sobre a produtividade animal é enorme e o risco para a saúde humana está sempre presente. Climas mais quentes tendem a sucumbir às aflatoxinas e às fumonisinas enquanto que áreas mais frias com maior umidade estão sujeitas à ocratoxina, à esporidesmina, à zearalenona, ao desoxinivalenol, à T-2 toxina e ao diacetoxiscirpenol.
[088] As micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por bolores e fungos que contaminam os grãos de cereais bem como forragens, frutas, alimentos e produtos alimentícios bem como o ambiente (por exemplo, solo, água e ar através de micotoxicose adquirida por aerossóis etc.). As micotoxinas possuem efeitos perigosos sobre a saúde de seres humanos e animais. Devido ao fato de que as micotoxinas estão presentes ao longo de toda a cadeia alimentar, as micotoxinas estão sujeitas à regulação que limita a contaminação excessiva de alimentos/matéria alimentícia e do ambiente com base nas propriedades toxicológicas dos grupos diferentes de toxinas (Ver, por exemplo, Recomendação de Concessão (Commission Recommendation) de 17 de agosto de 2006 sobre a presença de desoxinivalenol, zearalenona, ocratoxina A, T-2 e HT-2 e fumonisinas em produtos pretendidos para alimentação de animais. Official Journal of the European Union (2006/576/EC)). Sob este aspecto, agências de segurança diferentes ao redor do globo estabeleceram valores limites e procedimentos de controle para testar em relação ao nível de contaminação. Estas regulamentações ainda não estão harmonizadas entre os países e/ou os continentes e também estão sujeitas à condição política e econômica da área geográfica que é considerada. As regulamentações, quando disponíveis, estão fundamentadas em um número não exaustivo de relatórios relacionados aos casos de intoxicação aguda produzidos com formas cristalinas de micotoxinas em situações de modelo. Como um entendimento dos progressos das micotoxinas, o impacto do nível de exposição crônica, a duração da exposição e a co-ocorrência de alimentos/matérias alimentícias contaminadas naturalmente com micotoxinas diferentes e o ambiente que pode exercer efeitos tóxicos sinérgicos, poderiam desempenhar um papel importante na condição de saúde de animais e humanos e sua susceptibilidade a várias outras infecções e assim à condição imunológica. Nesta perspectiva, têm sido consideradas soluções para controlar os compostos com níveis de tóxicos não regulados que entram na cadeia alimentar e que estão presentes no ambiente. Consequentemente, em algumas modalidades da invenção, um método em grande escala econômico para a preparação de agentes absorventes sintéticos de alta afinidade para a remoção de micotoxinas (por exemplo, incluindo, mas não limitadas à família inteira de classes principais ou menos importantes de moléculas de micotoxinas incluindo: Aflatoxinas: aflatoxina B1, B2, G1, G2, M1, P1, Q1, sterigmatocistina e subfamílias, aflatoxicol; Tricotecenos: desoxinivalenol, diacetoxiscirpenol, monoacetoxiscirpenol, scirpenotriol, T-2 toxina, HT-2 toxinas, T-2 tetraol, fusarenon X, fusarina C, ácido fusárico, fusarocromanona, aurofusarina, fusaproliferina, neosolaniol, nivalenol junto com metabólitos e subfamílias; Fumonisinas: fumonisina A1, A2, B1, B2, B3 e subfamílias; Ocratoxinas: ocratoxina A, B, α, β e metabólitos; Zearalenona, zearalenol α, β, zearalanona, zearalanol α, β, zeranol e metabólitos; Patulina, gliotoxina, ácido micofenólico, ácido moniliformina ciclopiazônico, citrinina, beauvericina, citreoviridina, citocalasina H; Ácido penicílico, PR-toxina, roquefortina A, B, rubratoxina e subfamílias; alcalóides de esporão do centeio: ergotamina, alcalóides de clavina; Isofumigaclavinas A, B; paspalitrem A, B, aflatrem, penitrems e subfamílias; Fomopsinas: Fomopsina A e subfamílias; Verrucarina A, verruculogênio e subfamílias; Esporidesmina e subfamílias; slaframina, swainsonina, ácido tenuazóico, alternariol e wortmanina).
[089] A Ocratoxina A (abbreviated as OTA) é o metabólito de micotoxina principalmente produzido por Aspergillus ocraceus e Penicillium verrucosum entre outras espécies de bolores que podem crescer em produtos alimentícios armazenados de forma imprópria (Ver, por exemplo, Pfohl-Leszkowicz A. e Manderville R.A., 2007. Molecular Nutrition and Food Research, 51: 61-99), grão contaminado, grãos de café (Ver, por exemplo, O’Brien E. e Dietrich D.R. 2005. Critical Reviews in Toxicology, 35: 33-60), uvas para vinho (Ver, por exemplo, Blesa J., Soriano J.M., Moltó J.C., Manes J., 2006. Critical Review in Food Science and Nutrition, 46: 473-478) e poderia ser transferido e contaminar líquidos e sólidos consumidos por humanos (por exemplo, suco de uva, vinho, cerveja, café, extratos de cacau, bem como alimentos e produtos alimentícios que utilizam grãos contaminados e carne e outros subprodutos provenientes de animais (por exemplo, leite, ovos etc.) que consomem grãos contaminados ou são de outra maneiras expostos a micotoxinas) que podem ser prejudiciais aos humanos. OTA é um composto carcinogênico (Grupo 2B; Ver, por exemplo, Clark H.A. e Snedeker S.M, 2006. Journal of Toxicology and Enviromental Health, Parte B: Critical Reviews, 9: 26596), nefrotóxico e pode causar imunossupressão (Ver, por exemplo, Al-Anati L. e Petzinger E., 2006. Journal of Veterinary Pharmocology and Therapeutics, 29: 79-90; Pfohl-Leszkowicz e Manderville, 2007 como citado anteriormente; O’Brien e Dietrich, 2005 como citado anteriormente). OTA pode induzir alterações na função renal de porcos incluindo alteração de excreção de urina e aumentos da excreção de glicose na urina, que foi caracterizada como a nefropatia suína. Frangos, perus e patinhos alimentados com grãos contendo OTA possuem fraca conversão de alimentos e produção reduzida de ovos. Em humanos, a patologia de OTA foi descrita clinicamente como a nefropatia endêmica de Balkan (Ver, por exemplo, Vrabcheva T., Petkova-Bocharova T., Grosso F., Nikolov I., Chernozemsky I.N., Castegnaro M. e Dragacci S., 2004. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52:2404-2410). Estudos com animais indicam que devido a sua similaridade com a fenilalanina, após sua absorção no nível do trato gastrointestinal, a OTA pode entrar na circulação enterohepática e se ligar à fração de albumina no sangue e assim persistir nos tecidos dos animais durante períodos de tempo prolongados (Ver, por exemplo, Creppy E.E., Kane A., Dirheimer G., Lafarge-Frayssinet C., Mousset S. e Frayssinet C., 1985. Toxicology Letters, 28: 29-35.).
[090] Outra classe de toxinas fúngicas, as epipolitiodioxopiperazinas incluindo gliotoxina, hialodendrina, sirodesmina, quetomina, quetocina, verticilinas, leptosina, emestrina e esporidesmina são de interesse particular. A última, geralmente de alto impacto econômico sobre a produção animal, foi encontrada em áreas específicas do mundo, primariamente na agricultura pastoril da Nova Zelândia (Ver, por exemplo, Hohenboken W.D., Morris C.A., Munday R., De Nicolo G., Amyes N.C., Towers N.R. e Phua S.H., 2004. New Zealand Journal of Agricultural Research, 47: 119-127), mas também foi relatada nas Ilhas dos Açores de Portugal. A esporidesmina é uma molécula hidrofóbica sintetizada por Pithomyces chartarum que infesta certas gramíneas. A toxicidade é induzida pela presença de uma ponte dissulfeto, que pode inativar proteínas através da reação com grupos tiol e da generação de espécies reativas de oxigênio (radical superóxido, peróxido de hidrogênio, radical hidroxila). Esta patologia é mais bem conhecida como eczema facial, uma fotossensibilização hepatógena resultante da destruição das células epiteliais do duto biliar que faz com que a filoeritina (um metabólito de clorofila) se acumule no sangue circulante e que absorve energia da luz solar e afeta particularmente ovelhas, gado, cavalos e cervos. Os sinais clínicos incluem decréscimos na produção de leite, perda de peso, fotossensibilização e morte (Ver, por exemplo, Munday R., 1982. Chemico-Biological Interactions, 41: 361-374). Em adição à exposição às micotoxinas nos produtos alimentícios, alimentos, pastos e líquidos, animais e humanos entram em contato e são afetados pelas micotoxinas de outras maneiras. Por exemplo, animais podem entrar em contato com micotoxinas em sua forragem de cama, os peixes podem entrar em contato com micotoxinas em seu ambiente aquático e outros materiais orgânicos podem ser afetados por micotoxinas.
[091] A contaminação com micotoxinas é inevitável e para reduzir os efeitos negativos das micotoxinas, materiais inorgânicos tais como argilas, bentonitas e aluminossilicatos ou carvão ativado, conhecidos por suas propriedades de absorção, foram historicamente utilizados na agricultura (por exemplo, misturados com produtos alimentícios para animais e/ou ingredientes, formas encapsuladas ou como dispositivos filtrantes). As argilas utilizadas em grandes quantidades sequestram algumas micotoxinas em fluidos (por exemplo, no trato gastrointestinal do animal e/ou de humanos) e minimizam seus efeitos tóxicos (Ver, por exemplo, Ramos A.J. e Hernandez E., 1997. Animal Feed Science and Technology, 65: 197-206; Grant P.G. e Phillips T.D., 1998. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46: 599-605). Entretanto, as argilas impedem a absorção de muitos nutrientes benéficos que são importantes para animais e humanos tais como vitaminas, minerais e aminoácidos diminuindo assim a densidade de nutrientes da dieta. Além disso, as argilas são um material inerte que tem que ser utilizado (por exemplo, fornecido como alimento para animais) em grandes quantidades para fornecer um efeito benéfico (por exemplo, redução de contaminação com micotoxinas). Entretanto, as argilas fornecidas como alimentos para animais em grandes quantidades podem ter um efeito negativo sobre o ambiente quando as argilas são excretadas pelo animal. Outros agentes de absorção de micotoxinas de espectro amplo, que não têm especificidade por micotoxinas específicas, incluindo a invenção descrita na Patente US número 6.045.834, também foram utilizados.
[092] Em geral, polímeros de impressão molecular (abreviados como MIP’s), são polímeros que são formados na presença de uma molécula, o molde, que é extraída posteriormente, deixando assim cavidades complementares para trás. Estes polímeros exibem certa afinidade química pela molécula original e podem ser utilizados para fabricar sensores, catalisadores ou para métodos de separação. O primeiro material de impressão era à base de silicato de sódio. O primeiro uso experimental destes materiais foi para a separação de corantes em 1949 (Ver, por exemplo, Andersson H.S. e Nicholls I.A., 2001. Em: Molecularly Imprinted Polymers: Man-made mimics of antibodies and their application in analytical chemistry, (Sellergen B., ed.), Techniques and Instrumentation in Analytical Chemistry, Vol. 23 Elsevier, Amsterdam, the Netherlands, pp. 1-19).
[093] A presente invenção refere-se de forma geral a polímeros de impressão molecular (MIPs). Em particular, a presente invenção refere-se a MIPs não hostis ao ambiente reutilizáveis, a métodos de produção dos mesmos, a métodos de utilização dos mesmos (por exemplo, para sequestrar e/ou adsorver compostos alvos (por exemplo, micotoxinas)) e a métodos para a aplicação do uso de maneiras diferentes (por exemplo, para detectar a presença de micotoxinas com a finalidade de possibilidade de rastreamento e para remover micotoxinas de uma fonte contaminada). As composições e os métodos da invenção encontram uso em uma variedade de aplicações incluindo processamento e produção de alimentos e bebidas dietéticos, terapêuticos e profiláticos, filtração de líquidos bem como aplicações de pesquisa e de controle de qualidade.
[094] Consequentemente, em algumas modalidades, a presente invenção fornece compostos moldes (por exemplo, sobre os quais os MIPs são sintetizados) que têm impacto sobre a alta capacidade de absorção e seletividade dos MIPs para os compostos alvos (por exemplo, micotoxinas). Os compostos moldes podem ser removidos do MIP após a síntese de MIP (por exemplo, “ativando” assim o MIP e possibilitando que se ligue e que adsorva compostos alvos (por exemplo, micotoxinas)). Assim, a presente invenção fornece processos (por exemplo, um processo de síntese) e materiais que permitem a produção em grande escala de molde e MIP, que é não é somente econômica (por exemplo, que possibilita a produção em grande escala que pode ser realizada de uma maneira que pode ser conseguida de forma econômica), mas que também utiliza reagentes que são mais facilmente disponíveis que os moldes de MIP utilizados historicamente. A presente invenção fornece ainda, em algumas modalidades, composições (por exemplo, compostos moldes, monômeros, agentes de reticulação bem como MIPs) que são bio-neutros (por exemplo, não são prejudiciais para o ambiente). Por exemplo, em algumas modalidades, os monômeros e os agentes de reticulação da invenção são capazes de formar complexos reversíveis de alta afinidade com molde (por exemplo, com grupos funcionais do molde), produzindo assim MIPs com alta afinidade por compostos alvos (por exemplo, micotoxinas) e que fornecem efeitos positivos para o ambiente (por exemplo, propriedades de alta absorção de água em que os MIP’s adsorvem até 10 vezes mais água que seu peso beneficiando assim a hidratação do solo através da retenção de água). Similarmente, em algumas modalidades, a presente invenção fornece MIPs com alta afinidade por compostos alvos (por exemplo, micotoxinas) que podem ser reutilizados (por exemplo, que podem ser separados dos compostos alvos e reutilizados).
I. Moldes utilizados para a síntese de polímeros de impressão molecular (MIPs)
[095] Os esquemas gerais para a síntese de MIP incluem etapas para a polimerização e a reticulação de monômeros na presença de moléculas moldes que direcionam a formação de sítios de ligação dentro da rede de MIP. A especificidade geométrica é conferida aos sítios de ligação de MIP nas etapas análogas ao uso de cópias de escultura em cera para a preparação de moldes durante a técnica artística de fundição de cera. Após a rede de MIP ser formada, o molde é removido de forma que o MIP livre de molde fica disponível para sequestro do composto alvo. Em algumas modalidades, a remoção do molde é conseguida através de uma série de etapas de lavagem (por exemplo, utilizando as descritas na Seção IV abaixo).
[096] Em algumas modalidades, um composto alvo é utilizado como um molde. Entretanto, isto provoca o problema potencial de vazamento do molde ou de uma lixívia gradual do molde residula em uma amostra. Em aplicações analíticas, o vazamento do molde causa fundo erroneamente alto, enquanto que em aplicações não analíticas (por exemplo, sequestro), o vazamento do molde pode confundir os esforços do sequestro através da introdução na prática de moléculas alvos na amostra. Além disso, por exemplo, quando são sintetizados MIPs que são direcionados para alvos com propriedades tóxicas e/ou carcinogênicas (por exemplo, micotoxinas), pode ser desejada a utilização de moléculas moldes menos prejudiciais durante o processo de síntese de MIP partindo do ponto de vista de segurança pessoal bem como minimizar os resíduos prejudiciais. Em modalidades preferidas, a molécula molde não é prejudicial e/ou é facilmente degradada e, portanto, não represente um risco para saúde ou ambiental. Em modalidades preferidas, o molde pode ser reutilizado após a liberação do MIP. Em modalidades preferidas, o molde pode ser produzido em quantidades maiores e de uma maneira mais segura do que as micotoxinas podem ser produzidas.
[097] Portanto, em algumas modalidades, um molde utilizado para a síntese de MIP pode ser o mesmo composto que o composto alvo desejado. Em algumas modalidades, um molde utilizado para a síntese de MIP pode ser diferente do composto alvo desejado. Em modalidades preferidas da presente invenção, o composto alvo desejado é uma micotoxina. Os exemplos de micotoxinas incluem, mas não estão limitados a Aflatoxinas: aflatoxina B1, B2, G1, G2, M1, P1, Q1, sterigmatocistina e subfamílias, aflatoxicol; Tricotecenos: desoxinivalenol, diacetoxiscirpenol, monoacetoxiscirpenol, scirpenotriol, T-2 toxina, HT-2 toxinas, T-2 tetraol, fusarenon X, fusarina C, ácido fusárico, fusarocromanona, aurofusarina, fusaproliferina, neosoloniol, nivalenol e metabólitos e subfamílias bem como conjugados; Fumonisinas: fumonisina A1, A2, B1, B2, B3 e subfamílias bem como conjugados; Ocratoxinas: ocratoxina A, B, α, β e metabólitos; Zearalenona, zearalenol, α- e β-zearalanona, zearalanol, α- e β-zeranol e metabólitos bem como conjugados; Patulina, ácido micofenólico, moniliformina, ácido ciclopiazônico, citrinina, beauvericina, citreoviridina, citocalasina H; gliotoxina, esporidesmina, hialodendrina, sirodesmina, quetomina, quetocina, verticilinas, leptosina, emestrina e subfamílias; Ácido penicílico, PR- toxina, roquefortina A, B, rubratoxina e subfamílias; alcalóides de esporão do centeio: ergotamina, ergocriptina, ergovalina, ergocristina, ergometrina, ergosina, ergonina, ergocornina, ergina, lisergol, ácido lisérgico e epímeros alcalóides de clavina; Isofumigaclavinas A, B; paspalitrem A, B, aflatrem, penitrems e subfamílias; Fomopsinas: Fomopsina A e subfamílias; Verrucarina A, verruculogênio e subfamílias; slaframina, swainsonina, ácido tenuazóico, alternariol e wortmanina. Em certas modalidades, o composto alvo é OTA, esporidesmina, alcalóides de esporão do centeio.
[098] Em algumas modalidades, o planejamento e/ou a determinação de composto molde que não é alvo é realizada através da análise cuidadosa da molécula alvo, da minimização estrutural e da determinação de características estruturais e grupos funcionais críticos para a formação de sítios de ligação de MIP eficiente. Os métodos para a minimização estrutural são conhecidos na arte (Ver, por exemplo, Baggiani C., Giraudi G. e Vanni A., 2002. Bioconjugation, 10: 389-394; incorporado aqui como referência em sua totalidade). Embora a presente invenção não esteja limitada a qualquer mecanismo particular e um entendimento do mecanismo não é necessário para a prática da presente invenção, considerações estruturais que são levadas em conta durante o planejamento do molde incluem, mas não estão limitadas a quiralidade, planaridade, à eliminação de estruturas responsáveis por propriedades indesejadas da molécula (por exemplo, eliminação de determinantes moleculares de toxicidade) e/ou à existência de uma superfície acessível pelo solvente apropriada, superfície potencial eletrostática e/ou superfície lipofílica-hidrofílica da molécula molde e suas interações potenciais com monômeros e agente de reticulação bem como a simplicidade da síntese do molde. Em algumas modalidades, técnicas de reconhecimento de formato ultra rápidas são aplicadas para possibilitar a verificação de rotina de compostos que se assemelham mais a uma molécula de acordo não somente a um reconhecimento de estrutura bidimensional realizado, mas preferencialmente um dos padrões mais discriminatórios, o que significa dizer, o formato molecular tridimensional (Ver, por exemplo, Balletser P. e Richards W.G., 2007. Proceedings of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences, 463: 1307-1321.
[099] Em um exemplo não limitante, um molde para Ocratoxina A é N-(2-hidróxi-3,5-diclorobenzoil)-L-fenilalanina, como mostrado na A Figura 1.
[0100] Em um exemplo não limitante de um método de síntese para N-(2-hidróxi-3,5-diclorobenzoil)-L-fenilalanina, a síntese começa com a reação de ácido 3,5-diclorossalicílico com anidrido acético para a obtenção de ácido 2-acetóxi-3,5-diclorobenzóico que por sua vez é convertido no cloreto ácido através da ação de cloreto de oxalila. O cloreto do ácido 2-acetóxi-3,5-diclorobenzóico é então reagido in situ com cloridrato do éster etílico de fenilalanina, na presença de trietilamina, para produzir éster etílico de N-(2-acetóxi-3,5- diclorobenzoil)-L-fenilalanina. A última etapa do método de síntese introduz hidrólise nova e altamente específica de ambas as funções de éster etílico do éster de N-(2-acetóxi-3,5-dicloro benzoil)-L-fenilalanina para a obtenção do molde de OTA, N-(2-hidróxi-3,5-diclorobenzoil)-L- fenilalanina (I) com 98% de rendimento. Esta reação de síntese é resumida na A Figura 2.
[0101] Assim, a presente invenção fornece processos e materiais para a síntese de moldes (por exemplo, moldes de OTA) que podem ter a escala aumentada para quantidades grandes de uma maneira que pode ser realizada economicamente.
II. Monômeros e agentes de reticulação utilizados para a polimerização de MIPs
[0102] A seleção de monômeros utilizados na síntese de MIPs leva em consideração características estruturais da molécula molde com a finalidade de avaliar qual monômero ou combinação de monômeros é mais provável que forme interações (por exemplo, covalentes, não covalentes, iônicas, ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas, interações de Van der Waals) com o molde. Em um exemplo não limitante, as características estruturais chaves do molde de OTA (I) descritas aqui (por exemplo, N-(2-hidróxi-3,5- diclorobenzoil)-L-fenilalanina) incluem (i) os dois grupos funcionais ácidos (-OH e -CO2H); (ii) um grupo peptídico fortemente polar (- NHCO-); (iii) e vários fragmentos de hidrocarboneto de polaridade baixa da estrutura molde (por exemplo, dos quais cada um possui o potencial de formar complexos com os monômeros e as moléculas de agente de reticulação). O Pedido de Patente U.S. No. 10/181435, incorporado aqui como referência em sua totalidade, descreve monômeros funcionais de MIP e métodos de seleção computacional de monômeros (Ver, por exemplo, Baggiani e outros, 2002. como citado anteriormente).
[0103] As classes de monômeros e monômeros específicos (por exemplo, utilizadas nos métodos de síntese de MIP da invenção) incluem, mas não estão limitadas às classes a seguir e derivados das mesmas: ácido acrílico e derivados (por exemplo, ácido 2- bromoacrílico, cloreto de acriloíla, N-acriloil tirosina, N-acrioil pirrolidinona, ácido trans-2-(3-piridil)-acrílico), acrilatos (por exemplo, acrilatos de alquila, acrilatos de alila, acrilato de hidroxipropila), ácido metacrílico e derivados (por exemplo, ácido itacônico, ácido 2- (trifluorometil) propenóico), metacrilatos (por exemplo, metacrilato de metila, metacrilato de hidroxietila, metacrilato de 2-hidroxietila, sal de sódio de metacrilato de 3-sulfopropila, monometacrilato de etileno glicol), estirenos (por exemplo, (2, 3 e 4)-aminoestireno, ácido estireno-4-sulfônico, 3-nitroestireno, 4-etiestireno), vinilas (por exemplo, cloroformato de vinila, ácido 4-vinilbenzóico, 4- vinilbenzaldeído, vinil imidazol, 4-vinilfenol, 4-vinilamina, acroleína), vinilpiridinas (por exemplo, (2, 3 e/ou 4)-vinilpiridina, 3-buteno 1,2-diol), ácidos borônicos (por exemplo, ácido 4-vinilborônico), ácidos sulfônicos (por exemplo, ácido 4-vinilsulfônico, ácido acrilamido-2- metil-1-propano-sulfônico), quelantes de metais (por exemplo, ácido estireno iminodiacético), acrilamidas e derivados (por exemplo, N-metil acrilamida), metacrilamidas e derivados (por exemplo, N,N-dimetil acrilamida, N-(3-aminopropil) metacrilamida), alcenos (por exemplo, ácido 4-pentenóico, 3-cloro-1-fenil-1-propeno) anidrido do ácido (met)acrílico e derivados (por exemplo, anidrido metacrílico), monômeros que contêm silício (por exemplo, (3-metacriloxipropil) trimetóxi silano, tetrametildissiloxano), polienos (por exemplo, isopreno, 3-hidróxi-3,7,11-trimetil-1,6,10-dodecatrieno), azidas (por exemplo, ácido4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzóico), tióis (por exemplo, alil mercaptano). Uretanos, carbonatos e epóxis terminados com acrilato ou de outra maneira insaturados também podem ser utilizados em modalidades da presente invenção, assim como podem monômeros à base de silício.
[0104] Em modalidades preferidas, os monômeros e o agente de reticulação utilizados para a síntese de MIPs direcionados para um molde para OTA (isto é, N-(2-hidróxi-3,5-diclorobenzoil)-L-fenilalanina) compreendem 2-vinilpiridina, metacrilato de 2-hidroxietila e/ou dimetacrilato de etileno glicol. Embora a presente invenção não esteja limitada a qualquer mecanismo particular e um entendimento do mecanismo não seja necessário para a prática da presente invenção, 2-vinilpiridina forma ligações iônicas com os grupos ácidos do molde e contém a ligação vinila em grande proximidade ao átomo de nitrogênio básico do anel de piridina. Esta interação entre o molde e a 2- vinilpiridina promove a formação do polímero na vizinhança mais próxima da molécula molde e possibilita uma ligação forte entre o MIP e a OTA no MIP (por exemplo, após o composto molde ser removido e o MIP ser permitido interagir com as moléculas alvos de OTA). Embora a presente invenção não esteja limitada a qualquer mecanismo particular e um entendimento do mecanismo não seja necessário para a prática da presente invenção, o grupo hidroxila do monômero de 2- hidroxietil-metacrilato forma ligações de hidrogênio adicionais com ligações peptídicas altamente polares do molde. Um reagente adicional é dimetacrilato de etileno glicol. Embora a presente invenção não esteja limitada a qualquer mecanismo particular e um entendimento do mecanismo não seja necessário para a prática da presente invenção, o dimetacrilato de etileno glicol encontra uso em algumas modalidades como um agente de reticulação (ver abaixo), como um diéster insaturado que interage com grupos de baixa polaridade que estão presentes na molécula molde de OTA. Em algumas modalidades, tipos individuais de monômeros são utilizados individualmente ou em combinação com outros tipos de monômeros.
[0105] Se utilizado, o agente ou os agentes de reticulação serão preferencialmente um ou vários compostos poliméricos ou oligoméricos ou um composto que é responsável pela clivagem sob condições específicas. Os agentes de reticulação que fornecem rigidez aos compostos poliméricos individuais são conhecidos pelos peritos na arte e incluem, mas não estão limitados a, acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, vinilas, alilas e estirenos di-, tri-, tetra- e penta-funcionais. Os exemplos específicos de agentes de reticulação incluem, mas não estão limitados a p-divinilbenzeno, dimetacrilato de etileno glicol (abreviado como EGDMA), dimetacrilato de tetrametileno (abreviado como TDMA), N,N’-metileno bisacrilamida (abreviado como MDAA), N,N’-1,3-fenilenobis(2-metil-2-propenamida) (PDBMP), 2,6- bisacriloilamidopiridina, 1,4-diacriloil piperazina (abreviado como DAP), 1,4-fenileno diacrilamida e N,O-bisacriloil-L-fenilalaninol. Os exemplos de agentes de reticulação cliváveis reversíveis incluem, mas não estão limitados a, N,N'-bis-(acriloil) cistamina, N,N-dialiltartardiamida, N,N- (1,2-dihidroxietileno) bisacrilamida, N1-((E)-1-(4-vinilfenil) metilideno)- 4-vinilanileno, dissulfeto de alila e bis(2-metacriloiloxietil)) dissulfeto. Em modalidades preferidas, o dimetacrilato de etileno glicol é utilizado como um agente de reticulação. Embora o monômero de reticulação preferido seja dimetacrilato de etileno glicol, modalidades da presente invenção não estão limitadas a este agente e outros monômeros de reticulação podem ser utilizados, tais como, trimetacrilato de divinilbenzeno e trimetilolpropano (abreviados como TRIM).
[0106] Pode ser utilizada qualquer proporção de monômeros simples em relação a agentes de reticulação que forneça uma estrutura de MIP de integridade apropriada, por exemplo, que possa ser utilizada no contexto da aplicação final (por exemplo, em alimento ou produtos alimentícios, em água pretendida para uso na aquicultura, in vivo etc). Os peritos na arte podem selecionar proporções adequadas de monômeros para fornecer a integridade estrutural desejada, que está intimamente relacionada à natureza e à estrutura da molécula alvo e à natureza e à estrutura do molde utilizado.
[0107] No caso de compostos poliméricos ou oligoméricos que devem ser utilizados in vivo (por exemplo, na forma de agentes terapêuticos ou agentes para diagnóstico ou na forma de componentes de sequestro que podem ser consumidos de produto alimentício para animais ou de matérias alimentícias para seres humanos), é importante selecionar monômeros que não são tóxicos e que exibem estabilidade e solubilidade in vivo adequadas. Os exemplos preferidos incluem, mas não estão limitados a, acrilamidas e metacrilatos. Alternativamente, o polímero pode ser tratado pós-polimerização para aumentar a solubilidade do molde, por exemplo, através da reação com reagentes orgânicos ou inorgânicos adequados.
[0108] Métodos de polimerização diferentes podem ser utilizados incluindo polimerização com radicais livres, catiônica e aniônica. São selecionadas e fornecidas aqui condições de polimerização que não afetam de forma adversa a conformação ativa do composto para o qual um composto polimérico complementar deve ser produzido. Em modalidades particularmente preferidas, são utilizados métodos de polimerização com precipitação de radicais livres (ver a Seção III abaixo).
[0109] Adicionalmente, a polimerização de MIPs é tipicamente iniciada através da adição de um agente de iniciação. Os agentes de iniciação incluem, mas não estão limitados a azo-bisisobutironitrila (abreviada como AIBN), azo-bisdimetilvaleronitrila (abreviada como ABDV), dimetilacetal de benzila, benzoilperóxido (abreviado como BPO) e 4,4’-azo(ácido 4-cianovalérico). Em modalidades preferidas, o agente de iniciação é azo-bisisobutironitrila.
[0110] Em modalidades preferidas, monômeros, agentes de reticulação e/ou MIPs possuem propriedades de segurança e/ou ambientais favoráveis tais como toxicidade reduzida ou nenhuma e alta absorção e retenção de água. Em modalidades preferidas, os MIPs podem ser reutilizáveis e economicamente obtidos/produzidos.
III. Solventes utilizados para a síntese de MIPs
[0111] A seleção de solvente/ mistura de solventes em que a reação de polimerização é realizada possui um impacto profundo sobre o âmbito, a seletividade e a especificidade da afinidade de ligação de um MIP em relação ao seu composto alvo. Embora a presente invenção não esteja limitada a qualquer mecanismo particular e um entendimento do mecanismo não seja necessário para a prática da presente invenção, a porosidade é facilitada ou fornecida por um solvente ou uma mistura de solventes porogênicos que exibe as propriedades a seguir: se dissolve na mistura de monômeros, é inativa à reação de polimerização e não dissolve o polímero (MIP) produzido. Os solventes porogênicos adequados incluem, mas não estão limitados a, hidrocarbonetos aromáticos, tais como tolueno, xileno, etilbenzeno e dietilbenzeno; solventes não polares, tal como ciclohexano; hidrocarbonetos saturados, tais como hexano, heptano, octano e decano; alcoóis, tais como álcool isopropílico e isoamílico; hidrocarbonetos halogenados alifáticos, tais como diclorometano, dicloroetano e tricloroetano; ésteres alifáticos ou aromáticos, tais como acetato de etila, acetato de butila, dimetilftalato. Em modalidades preferidas, são utilizados solventes de hidrocarbonetos aromáticos. Em modalidades particularmente preferidas, o tolueno é utilizado sozinho. Em algumas modalidades, é utilizada uma mistura de tolueno com outro solvente. Em algumas modalidades, o tolueno é utilizado em combinação com ciclohexano. Os solventes porogênicos podem ser utilizados individualmente ou em combinações de dois ou mais. A quantidade do solvente porogênico adicionado pode ser variada desde aproximadamente 10% até 500% em massa com base na quantidade total dos monômeros. Embora a presente invenção não esteja limitada a qualquer mecanismo particular e um entendimento do mecanismo não seja necessário para a prática da presente invenção, solventes polares (por exemplo, água, acetonitrila) rompem complexos fortes entre monômeros e o molde, diminuindo assim a especificidade de MIP pela ligação com a molécula alvo (por exemplo, como em tolueno etc.).
[0112] O solvente ou a mistura de solventes utilizada como um meio para a síntese de MIP também tem impacto sobre as propriedades de intumescimento de MIP e sobre o tamanho dos poros dentro da rede de MIP tridimensional. Em certas modalidades, solventes polares tais como acetonitrila são utilizados como um solvente ou um co-solvente para a polimerização de MIP quando um aumento no intumescimento de MIP e um aumento no tamanho de poro de MIP são desejados; alternativamente, tais solventes são evitados quando um aumento no intumescimento de MIP e do tamanho de poros de MIP não é desejado (por exemplo, quando o MIP for pretendido para uso na forma de uma coluna cromatográfica onde o intumescimento pode impedir a vazão e atrapalhar a eluição dos analitos e a capacidade de desempenho do instrumento de HPLC).
[0113] A escolha criteriosa do sistema de solventes pode afetar diretamente o tamanho de poros de MIP. Em exemplos não limitantes, durante a síntese de um MIP direcionada para um molde de OTA, as partículas menores (1-20 μm) foram formadas em solventes de baixa polaridade como ciclohexano e/ou tolueno, enquanto partículas muito maiores e homogêneas de tamanho menor (10-170 μm) foram formadas em solvente polares como acetonitrila ou água. Além disso, em concentrações altas de monômeros, a reação de polimerização produz aglomerados de MIP grandes que são facilmente dispersos através de trituração, sem a produção de partículas muito finas que ocorrem durante a trituração de monólitos de MIP (ver a discussão detalhada na Seção IV abaixo). As partículas muito finas podem ser indesejáveis nas aplicações em que, por exemplo, um MIP é pretendido para uso como uma resina de coluna (onde partículas finas podem impedir a vazão) ou quando a presença de partículas finas impede ou complica a coleta de MIPs durante a centrifugação ou a filtração ou perturba o confinamento apropriado do MIP no caso de filtração, que é consequentemente controlado pelo tamanho de poro do filtro de trama específica que incorpora o MIP, se o filtro tiver que preservar a quantidade de MIP confinada. Os aglomerados de MIP dispersos podem ser peneirados para fornecer produtos de tamanho homogêneo definido. Portanto, a escolha do solvente de polimerização, da concentração do monômero e os métodos de manipulação física podem ser escolhidos para resultar em um rendimento ótimo dos MIPs com tamanho de poros e tamanho de partículas desejados, enquanto evita a formação de partículas finas.
[0114] A escolha do sistema de solventes determina a forma física do MIP que é formado durante o processo de polimerização. Por exemplo, alguns sistemas de solventes (incluindo, mas não limitados a solventes de baixa polaridade tais como ciclohexano e/ou tolueno) produziram, como descrito anteriormente, aglomerados sólidos de MIP durante um processo referido como polimerização com precipitação. Outros sistemas de solventes (incluindo, mas não limitados a solventes polares tais como álcool polivinílico em água) promovem um processo cineticamente distinto referido como polimerização com emulsão (Vivaldo-Lima E., Wood P.E., Hamielec A.E., 1997. Industrial and Engineering Chemistry Research, 36: 939-965). Em geral, a natureza de polimerização afeta tanto a forma física da rede de MIP quanto a facilidade com a qual esta pode ser processada adicionalmente (por exemplo, a necessidade de trituração; uniformidade de tamanho de partícula; rendimento; facilidade de troca de tampão ou de solvente; estabilidade). Os processos de polimerização são revisados em Yan H. e Ho Row K., 2006. International Journal of Molecular Science, 7: 155-178; incorporado aqui como referência em sua totalidade. Em modalidades preferidas, a polimerização com precipitação é utilizada. Em certas modalidades, a polimerização com precipitação resulta em um produto de MIP que é produzido na forma de um pó de tamanho de partícula uniforme e facilmente manejável. Em comparação, outros métodos de polimerização incluindo, mas não limitados à polimerização em massa podem produzir um grande monólito de MIP que tem que ser triturado antes do processamento ou do uso adicional e que resulta no tamanho de partículas irregular e consequentemente menor desempenho.
IV. Métodos para remover o molde de MIP após a síntese de MIP e o processamento físico de MIPs
[0115] As técnicas utilizadas para a dissociação do molde de MIP recém-sintetizados são geralmente determinadas pela natureza da interação do molde-MIP. Por exemplo, quando ligações covalentes se formaram entre molde e a rede de MIP, é necessária a clivagem química do molde do MIP. Em contraste, quando a interação entre o molde e a rede de MIP é não covalente, a extração do solvente pode ser suficiente para remover o molde (Ver, por exemplo, Yan H. e Ho Row K., 2006 como citado anteriormente e incorporado aqui como referência em sua totalidade; Sellergren B., 2001. The non-covalent approach to molecular imprinting. Em: Molecularly Imprinted Polymers: Man-made mimics of antibodies and their application in analytical chemistry, (Sellergen B., ed.), Techniques and Instrumentation in Analytical Chemistry, Vol. 23 Elsevier, Amsterdam, the Netherlands, pp. 113-184). O processamento pós-síntese dos MIPs também pode ser referido como ativação de MIP. Em modalidades preferidas, uma primeira etapa de ativação de MIP envolve a decantação e então a evaporação (reciclagem) do solvente do material de MIP, sob pressão ligeiramente reduzida (por exemplo, utilizando um sistema evaporador giratório). Uma segunda etapa envolve a trituração das partículas de MIP para produzir um tamanho de partícula menor (por exemplo, utilizando um almofariz e um pilão ou um equipamento de trituração). Uma terceira etapa envolve várias lavagens das partículas de MIP, por exemplo, com 0,2 p/v% de hidróxido de sódio. Em modalidades em que um MIP de OTA é sintetizado, a eficácia de lavagem pode ser rastreada até que um teste negativo seja obtido com solução de FeCl3 para a detecção de molde (ver o Exemplo 2 até o Exemplo 4). Em algumas modalidades, uma única lavagem com 1% de ácido acético e uma única lavagem com água é seguida pela secagem do produto de MIP final (por exemplo, a 80oC em um forno de secagem durante 6-8 h) até que todos os traços de solvente sejam removidos. Finalmente, as partículas de MIP podem ser peneiradas para fornecer um produto de tamanho de partícula definido. Em modalidades preferidas, a forma física do MIP não requer trituração extensiva antes do uso, por exemplo, o MIP não forma blocos monolíticos que requerem moagem ou trituração para dispersão. Em modalidades preferidas, a maioria do MIP forma esferas que formam um pó após a secagem.
[0116] Em modalidades preferidas, as etapas de lavagem são suficientes para remover pelo menos 95% da molécula molde da rede de MIP. Em modalidades particularmente preferidas, as etapas de lavagem são suficientes para remover pelo menos 99% da molécula molde da rede de MIP. Na maioria das modalidades preferidas, as etapas de lavagem são suficientes para remover pelo menos 99,9% da molécula molde da rede de MIP.
V. Aplicação de composições de MIP
[0117] As composições e os métodos da invenção encontram uso em uma variedade de aplicações incluindo processamento e produção de alimentos e bebidas dietéticos, terapêuticos e profiláticos, bem como aplicações de pesquisa e de controle de qualidade. Por exemplo, em algumas modalidades, moldes sintéticos (por exemplo, produzidos utilizando métodos descritos aqui) são utilizados para a síntese de MIP. A presente invenção não está limitada a qualquer molde sintético particular e/ou MIP sintetizados. Na verdade, uma variedade de moldes sintéticos pode ser gerada e utilizada incluindo, mas não limitada a, um molde de OTA (por exemplo, N-(3,5-dicloro-2- hidroxibenzoil)-L-fenilalanina, Ver o Exemplo 1), molde(s) para aflatoxina(s), um molde de tricoteceno (por exemplo, molde de álcool sesquiterpeno (por exemplo, molde de desoxinivalenol (DON))), um molde de zearalenona, um molde de esporidesmina, um molde de sterigmatocistina, um molde de fumonisina, um molde de patulina, um molde de citrinina e/ou um molde de esporão do centeio relacionado à endófita. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece composições e métodos para a produção de um molde sintético (por exemplo, para uso na síntese de OTA de MIP) que compreende grupos funcionais externos que se assemelham a uma micotoxina (por exemplo, em que o molde é utilizado para produzir um MIP em um processo da invenção e subsequentemente removido dali, o MIP exibe alta afinidade pela micotoxina similar através dos grupos funcionais externos), em que a micotoxina é selecionada do grupo que compreende acetoxiscirpenodiol, acetildesoxinivalenol, acetilnivalenol, acetilneosolaniol, acetil T-2 toxina, estendida a todas as aflatoxinas, aflatoxina B1, B2, G1 e G2, aflatrem, ácido altenúico, alternariol, austdiol, austamida, austocistina, avenaceína +1, beauvericina +2, bentenolida, brevianamida, butenolida, calonectrina, quetoglobosina, quetocina, quetomina, citrinina, citreoviridina, cocliodinol, citocalasinas, ácido ciclopiazônico, desacetilcalonectrina, desactilneosolaniol, diacetato de desoxinivalenol, monoacetato de desoxinivalenol, diacetoxiscirpenol, destruxina B, emestrina, eniatinas, estendidas a todas as toxinas alcalóides de esporão do centeio e endófitas tais como ergina, ergocornina, ergocristina, ergocriptina, ergometrina, ergonina, ergosina, ergotamina, ergovalina, lisergol, ácido lisérgico e epímeros relacionados, fructigenina +1, fumagilina, fumonisinas, fumonisinas A1, A2, B1 e B2 e B3, fusarenon-X, fusarocromanona, ácido fusárico, fusarina, gliotoxina, HT-2 toxina, hialodendrina, ipomeanina, islanditoxina, isofumigaclavinas A e B, lateritina +1, leptosina, licomarasmina +1, malformina, maltorizina, moniliformina, monoacetoxiscirpenol, ácido micofenólico, neosolaniol, nivalenol, NT-1 toxina, NT-2 toxina, estendidas a todas as ocratoxinas, oosporeína, ácido oxálico, paspalitrem A e B, patulina, ácido penicílico, penitrem, fomopsinas, PR-toxina, roridina E, roquefortina A e B, rubratoxina, rubrosquirina, rubrosulfina, rugulosina, sambucinina +1, satratoxinas, F,G,H, scirpentriol, sirodesmina, slaframina, esporidesmina, sterigmatocistina, swainsonina, T-1 toxina, T-2 toxina, ácido tenuazóico, triacetoxiscirpendiol estendidas a todas as tricotecenos, tricodermina, tricotecina, tricoverrinas, tricoverróis, triptoquivaleno, verrucarina, verruculogênio, verticilinas, viopurpurina, viomeleína, viriditoxina, wortmanina, xantocilina, iavanicina+1, zearalenóis, zearalanonas, zearalenona, α, β, zearalanona, α, β, zeranol e subfamílias e/ou derivados dos mesmos e/ou conjugados. Em certas modalidades, o composto alvo é OTA, esporidesmina ou alcalóides de esporão do centeio.
[0118] Similarmente, uma variedade de MIPs pode ser produzida e utilizada incluindo, mas não limitada a, um MIP gerado utilizando qualquer um dos moldes sintéticos mencionados anteriormente ou qualquer outra molécula orgânica como um molde (por exemplo, nutriente tais como vitaminas, fármacos, antibióticos, contaminantes, hormônios, enzimas, proteínas etc.).
[0119] Os MIPs descritos aqui encontram uso em uma variedade de aplicações. Por exemplo, em algumas modalidades, os MIPs são utilizados para a purificação de líquidos. Por exemplo, em algumas modalidades, os MIPs são utilizados para remover seletivamente compostos alvos (por exemplo, uma ou mais micotoxinas) de um líquido. A presente invenção não é limitada pelos compostos alvos (por exemplo, uma ou mais micotoxinas) removidos do líquido. Na verdade, uma variedade de compostos alvos pode ser removida incluindo, mas não limitada a, micotoxinas descritas aqui. Similarmente, a presente invenção não está limitada ao tipo de líquido do qual um composto alvo é removido. Na verdade, uma variedade de soluções líquidas diferentes pode ter um ou mais compostos alvos (por exemplo, micotoxinas) removidos das mesmas (por exemplo, através da administração de um ou mais diferentes tipos de MIPs à solução) incluindo, mas não limitadas a, bebidas (por exemplo, consumidas por humanos (por exemplo, suco, vinho (por exemplo, vinho branco, vinho tinto etc.), água, cerveja, chá, café etc.)), água (por exemplo, utilizada na aquicultura, água potável etc.), líquidos utilizados na produção de matérias alimentícias (por exemplo, humano, matérias alimentícias de animais), fluidos biológicos (por exemplo, sangue, fluido do rúmen, fluido do estômago etc.) etc.
[0120] Por exemplo, em algumas modalidades, as composições e os métodos descritos aqui fornecem MIPs que removem seletivamente compostos alvos (por exemplo, micotoxinas) de um líquido. O líquido pode ser uma bebida, água, amostra biológica, suprimento de água potável, sangue, fluido do rúmen ou outro tipo de líquido que contém compostos alvos. Adicionalmente, os compostos alvos podem ser removidos de outros tipos de fluidos. Em algumas modalidades, os MIPs descritos aqui são colocados em contato com (por exemplo, misturados com) um líquido durante quantidade de tempo suficiente que permite que o MIP interaja com e se ligue a um composto alvo (por exemplo, micotoxina). Embora um entendimento do mecanismo não seja necessário para a prática da presente invenção e a presente invenção não esteja limitada a qualquer mecanismo particular, em algumas modalidades, após ser permitido que o líquido interaja com o MIP, as cavidades complexantes/ligantes contidas no MIP (por exemplo, cavidades que permanecem após a molécula molde ser removida do MIP) se ligam com o composto alvo após o contato, removendo eficientemente o composto alvo do líquido. O líquido pode então ser adicionalmente processado, embalado ou feito pronto para consumo (por exemplo, para consumo humano, para consumo animal ou para habitats de animais). Em algumas modalidades, os MIPs gerados e/ou fornecidos aqui possuem uma estrutura rígida que resiste a forças físicas e químicas associadas com o processo de remoção/sequestro. Por exemplo, em uma modalidade preferida, um MIP fornecido aqui se liga seletivamente a um composto alvo, removendo assim o composto alvo de uma substância (por exemplo, líquido, superfície sólida, fluido biológico (por exemplo, sangue, fluido do rúmen etc.), necessária para manter a vida (por exemplo, ar ou meio de aquicultura) etc.) e mantém a associação com o composto alvo à medida que o complexo de MIP-composto alvo é coletado e/ou removido da substância (por exemplo, bombeamento do líquido através de um filtro, verter o líquido através de um filtro, mergulhar um filtro em um líquido, revestimento do MIP sobre a superfície de um recipiente, centrifugações, revestimento do MIP sobre a superfície de um filtro, excreção de fezes de animais etc.).
[0121] Em uma modalidade, um método de remoção de compostos alvos de um líquido é altamente seletivo. Por exemplo, um líquido pode conter uma grande variedade de compostos alvos em que o MIP remove seletivamente apenas um composto alvo específico (por exemplo, micotoxina), onde “um” refere-se ao tipo de composto alvo e não ao número de compostos alvos removidos. Em algumas modalidades, um grande número de MIPs (por exemplo, um grande número de populações diferentes de MIPs (por exemplo, em que uma população de MIPs é específica para um tipo de micotoxina (por exemplo, ocratoxina) e uma segunda população de MIPs é específica para um segundo tipo de micotoxina (por exemplo, aflatoxina) é administrado a um líquido e é permitido que interaja durante uma quantidade de tempo suficiente para remover seletivamente um grande número de tipos diferentes de compostos alvos (por exemplo, micotoxinas) do líquido. A presente invenção não é limitada pelo número de diferentes tipos de MIPs que são administrados a um líquido que compreende um grande número de tipos diferentes de compostos alvos (por exemplo, micotoxinas). Em algumas modalidades, um líquido compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais tipos diferentes de compostos alvos (por exemplo, micotoxinas), aos quais uma composição que compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais tipos diferentes de MIPs com especificidade para um do grande número de compostos alvos é administrada ao líquido sob condições tais que os MIPs interagem com e sequestram os compostos alvos. Em algumas modalidades, um MIP exibe afinidade específica para uma única molécula/composto alvo. Em algumas modalidades, um MIP exibe afinidade específica por um grupo de moléculas que possuem uma propriedade química ou física comum. Em algumas modalidades, um MIP possui um grande número de cavidades complexantes/ligantes diferentes para compostos alvos diferentes de forma que a MIP é capaz de se ligar seletivamente a vários compostos alvos, após o uso de um grande número de molécula/composto alvo quando o MIP é processado.
[0122] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de remoção de compostos alvos de um líquido que compreende um grande número de tipos diferentes de compostos alvos (por exemplo, micotoxinas ou outra molécula/composto alvo orgânico (por exemplo, nutriente tais como vitaminas, fármacos, antibióticos, contaminantes, hormônios, enzimas, proteínas etc.)). Em algumas modalidades, o método inclui um grupo de tipos diferentes de MIPs planejados para se ligarem a compostos alvos diferentes. Por exemplo, em algumas modalidades, é fornecida uma amostra de um líquido em que um ensaio é realizado para identificar a presença de um ou mais compostos alvos na amostra líquida. A presença de micotoxinas específicas pode ser detectada com a finalidade de determinar quais micotoxinas estão presentes. Após a identificação do um ou mais tipos de compostos alvos presentes na amostra líquida (por exemplo, em que a amostra líquida é representativa das características do líquido do qual a amostra foi tirada), um ou mais MIPs são gerados (por exemplo, de acordo com os métodos descritos aqui) e/ou combinados e então o um ou mais MIPs são administrados à solução líquida para remover compostos alvos. Em algumas modalidades, a identificação do um ou mais tipos de compostos alvos compreende o uso de colunas e/ou filtros que compreendem um ou mais MIPs específicos para os compostos alvos. Em algumas modalidades, uma vez que um MIP é utilizado para a remoção de composto alvo de uma amostra (por exemplo, uma amostra líquida), o composto alvo é removido do MIP e o MIP é reutilizado. Em algumas modalidades, o MIP é descartado de uma maneira apropriada. Por exemplo, os compostos alvos podem ser removidos de um MIP (por exemplo, com a finalidade de produzir o MIP reutilizável) através da lavagem com um solvente e/ou solução adequada, que pode ser escolhida dos solventes utilizados nos métodos para dissociar os MIPs do molde após as reações de síntese e o processamento físico de MIPs (por exemplo, incluindo, mas não limitada a, acetonitrila, tolueno, metanol, hidróxido de sódio, ácido acético etc.) ou similar. Os MIPs reciclados são então devolvidos para uso.
[0123] Métodos de remoção de compostos alvos de um líquido podem produzir altos rendimentos de recuperação por causa da natureza seletiva de MIPs. Em algumas modalidades, um método de remoção recupera de aproximadamente 25% até aproximadamente 99% do composto alvo presente em um líquido. Em algumas modalidades, um método de remoção recupera de aproximadamente 35% até aproximadamente 99% do composto alvo presente em um líquido. Em algumas modalidades, um método de remoção recupera de aproximadamente 50% até aproximadamente 99% do composto alvo presente em um líquido. Em algumas modalidades, um método de remoção recupera de aproximadamente 75% até aproximadamente 99% do composto alvo presente em um líquido. Em outras modalidades, um método de remoção diminui a concentração do composto alvo resultante do líquido para um nível nas partes por bilhão (ppb) (por exemplo, até uma concentração que é apropriada para consumo humano e/ou de animais). Os métodos de remoção podem ser feitos sob encomenda para fornecer níveis de concentração específicos que são encontrados nos esquemas reguladores atuais e propostos conhecidos pelos peritos na arte. Em alguma modalidade, os métodos de remoção são utilizados em líquidos com níveis de pH específicos. Por exemplo, as composições e os métodos da invenção podem ser utilizados com líquidos que possuem um pH entre aproximadamente 1 e 13.
[0124] Em algumas modalidades, os MIPs são utilizados para remover compostos alvos de uma superfície. Por exemplo, certas modalidades da presente invenção fornecem métodos para a diminuição da presença de compostos alvos (por exemplo, micotoxinas) sobre uma superfície que compreende o contato da superfície com uma composição que compreende um MIP. Em modalidades específicas, o contato é realizado durante um tempo suficiente para o MIP se ligar a e/ou sequestrar compostos alvos. Em outras modalidades, a presente invenção fornece um método de descontaminação de uma superfície ambiental que carrega compostos alvos. Em tal modalidade, o composto alvo está associado com uma superfície ambiental e o método compreende o contato da superfície ambiental com uma quantidade de uma composição (por exemplo, que compreende um MIP) suficiente para a descontaminação da superfície. Embora possa ser assim desejada, a decontaminação não precisa resultar na eliminação total do composto alvo. Em algumas modalidades, as composições (por exemplo, que compreendem um MIP) e os métodos compreendem ainda corantes, tintas e outros compostos de comercialização e de identificação de forma a garantir que uma superfície tratada tenha sido suficientemente tratada com uma composição da presente invenção.
[0125] Em algumas modalidades, os MIP’s são utilizados para prevenir que um composto alvo entre em contato com uma superfície ou outro composto (por exemplo, solo). Por exemplo, certas modalidades da presente invenção consideram métodos para a produção de composições em que os MIP’s são combinados com outros materiais (por exemplo, produto do tipo plástico ou de amido) e aplicados na vegetação (por exemplo, vegetação agrícola em crescimento) para proteger a vegetação dos compostos da superfície (por exemplo, micotoxina) durante o crescimento e para prevenir adicionalmente os compostos da contaminação de outros compostos (por exemplo, solo).
[0126] Em certas modalidades, uma superfície (por exemplo, superfície externa ou interna) de um indivíduo (por exemplo, humano ou animal) é tratada (por exemplo, externamente ou internamente) com uma composição da presente invenção. Em outras modalidades, o contato ocorre via administração oral, nasal, bucal, retal, vaginal ou tópica. Quando as presentes composições são administradas na forma de agentes farmacêuticos, é considerado que as composições compreendem ainda adjutantes, excipientes, estabilizantes, diluentes farmaceuticamente aceitáveis e similares. Ainda em modalidades adicionais, a presente invenção fornece composições que compreendem ainda moléculas bioativas farmaceuticamente aceitáveis adicionais (por exemplo, anticorpos, antibióticos, meios para transfecção de ácidos nucléicos, vitaminas, minerais, co-fatores, fatores capazes de se ligar a e/ou de sequestrar micotoxinas (por exemplo, extratos de parede celular de leveduras (por exemplo, extratos de parede celular de leveduras combinados com um material argiloso e/ou extrato de parede celular de leveduras que contém argila e/ou partículas de argila integradas e/ou entrelaçadas na parede celular de leveduras) etc.). Em algumas modalidades, um indivíduo recebe a administração de uma composição da invenção (por exemplo, que compreende MIPs) com a finalidade de tratar de forma terapêutica uma doença ou um estado de saúde (por exemplo, pé de atleta). Em outras modalidades, um indivíduo recebe a administração de uma composição da invenção (por exemplo, que compreende MIPs) com a finalidade de tratar de forma profilática (por exemplo, prevenir o início de sinais ou sintomas de) uma doença ou um estado de saúde (por exemplo, pé de atleta). Em algumas modalidades, as composições (por exemplo, que compreendem MIPs) e os métodos são aplicados em qualquer tipo de área ou superfície. Por exemplo, em algumas modalidades, a área compreende uma superfície sólida (por exemplo, um dispositivo médico), uma solução, a superfície de um organismo (por exemplo, uma porção externa ou interna de um ser humano) ou um produto alimentício.
[0127] A presente invenção não é limitada pela quantidade de um ou mais MIPs administrados a (por exemplo, misturados com) um líquido ou um sólido (por exemplo, para a remoção de compostos alvos). Em algumas modalidades, aproximadamente 0,10 mg, 0,50 mg, 1,0 mg, 2,0 mg, 5,0 mg, 10,0 mg, 20,0 mg, 50,0 mg, 100,0 mg, 500,0 mg ou mais de um MIP são administrados por litro de líquido ou sólido.
[0128] Em algumas modalidades, um MIP da presente invenção é utilizado para um método de eliminação de toxinas tal como hemoperfusão. A hemoperfusão é uma técnica de tratamento em que grandes volumes do sangue de um indivíduo são passados ao longo de uma substância adsorvente (por exemplo, MIP) com a finalidade de remover substâncias tóxicas do sangue.
[0129] Normalmente, os materiais absorventes mais comumente utilizados na hemoperfusão são resinas e várias formas de carbono ou carvão ativado. Entretanto, a especificidade de ligação destes materiais é relativamente fraca e algumas vezes adsorvem fatores importantes do sangue bem como moléculas alvos. Consequentemente, em algumas modalidades, a presente invenção fornece o uso de um MIP da invenção como materiais absorventes mais específicos e de afinidade alta para moléculas alvos.
[0130] A hemoperfusão funciona através do bombeamento do sangue retirado através de um cateter arterial em uma coluna ou um cartucho que contém o material absorvente (por exemplo, em algumas modalidades, a presente invenção fornece que o material absorvente utilizado é um MIP descrito aqui). À medida que o sangue passa ao longo das partículas de carbono ou de resina na coluna, as moléculas ou as partículas tóxicas são puxadas para as superfícies das partículas do material absorvente e ficam capturadas dentro da coluna. O sangue escoa para fora da outra extremidade da coluna e é devolvido para o indivíduo através da tubulação ligada ao cateter venoso. A hemoperfusão é capaz de eliminar toxinas de um volume de sangue maior que a hemodiálise ou outros métodos de filtração; por exemplo, pode processar mais de 300 mL de sangue por minuto.
[0131] Um MIP da presente invenção pode ser utilizado para hemoperfusão. Em algumas modalidades, os MIPs da invenção são utilizados para remover uma ou mais micotoxinas do sangue de um indivíduo utilizando hemoperfusão.
[0132] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, um único bolo que contém MIP’s pode ser administrado a um animal, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser reduzida ou aumentada proporcionalmente como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É vantajoso formular composições parenterais na forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e a uniformidade de dosagem. As dosagens dos MIPs da presente invenção são geralmente dependentes (a) das características exclusivas do composto ativo e do efeito terapêutico ou profilático particular que deve ser atingido e (b) das limitações inerentes na arte de produção de tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade a micotoxinas nos indivíduos. A dosagem administrada, evidentemente, variará dependendo dos fatores conhecidos tais como as características farmacodinâmicas do agente particular e seu modo e rota de administração; idade, saúde e peso do receptor; natureza e extensão de sintomas, tipo de tratamento concorrente, frequência de tratamento e o efeito desejado.
[0133] Os MIPs da invenção podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para a administração a um indivíduo. Por exemplo, a composição farmacêutica pode compreender MIPs e um carreador farmaceuticamente aceitável. Como utilizado aqui, “carreador farmaceuticamente aceitável” inclui solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis. Os exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como combinações dos mesmos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis tal como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem compreender ainda quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificantes, preservantes ou tampões, que aumentam a vida de prateleira ou a eficácia dos MIPs.
[0134] Em certas modalidades, os MIPs da invenção podem ser administrados de forma oral, por exemplo, com um diluente inerte ou um carreador comestível que pode ser assimilado. O composto (e outros ingredientes, se desejado) também pode estar incluso em uma cápsula de gelatina de exterior duro ou mole, prensado em comprimidos ou incorporado diretamente na dieta do indivíduo. Para a administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados com excipientes e utilizados na forma de comprimidos que podem ser ingeridos, comprimidos bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafers, pelotas e similares. Para administrar um composto da invenção através de outra administração sem ser parenteral, pode ser necessário revestir o composto com ou co- administrar o composto com, um material para prevenir sua inativação.
[0135] Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. Em certas modalidades, os MIPs da invenção são co-formulados com e/ou co-administrados com um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
[0136] As composições farmacêuticas da invenção podem incluir uma “quantidade terapeuticamente eficiente” ou uma “quantidade profilaticamente eficiente” dos MIPs da invenção. A “quantidade terapeuticamente eficiente” refere-se a uma quantidade eficiente, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficiente pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, a idade, o sexo e o peso do indivíduo e a capacidade da nanopartícula de impressão de ativar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficiente é também uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da nanopartícula de impressão são tornados menos importantes pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma “quantidade profilaticamente eficiente” refere-se a uma quantidade eficiente, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para atingir o resultado profilático desejado. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é utilizada nos indivíduos antes de ou em um estágio de doença precoce, a quantidade profilaticamente eficiente será menor que a quantidade terapeuticamente eficiente.
[0137] Em algumas modalidades, quando misturadas com matéria orgânica (por exemplo, matérias alimentícias) e/ou líquido (por exemplo, água, vinho ou outra bebida) e/ou fornecidas diretamente como alimento a um indivíduo, as composições da presente invenção diminuem a absorção ou a ingestão de micotoxinas pelo indivíduo (por exemplo, aliviando assim o desempenho reduzido, aumentando a saúde e/ou reduzindo a incidência de doenças ou respostas patológicas associadas às micotoxinas no indivíduo) e reduzindo e/ou prevenindo a deposição de micotoxinas ou seus metabólitos na carne, peixe, ovos, leite e os outros produtos destinados para entrar na cadeia alimentar de seres humanos.
[0138] Em algumas modalidades, a presente invenção é utilizada para gerar dispositivos de separação (por exemplo, extração em fase sólida (abreviada como SPE)) que são utilizados para remover compostos sólidos ou semi-sólidos de uma mistura de impurezas com base em suas propriedades físicas e químicas que são diferentes dos dispositivos de separação convencionais disponíveis (por exemplo, extração em fase normal, fase inversa ou de troca iônica em fase sólida). Em algumas modalidades, os dispositivos de separação podem ser incorporados em um cartucho que serve para extração e consequentemente para purificação do molde correspondente específico e análogos do molde do MIP produzido.
[0139] Em algumas modalidades, a presente invenção pode servir para o empacotamento da coluna cromatográfica utilizada com cromatografia líquida e que possibilita a eluição específica do molde correspondente e dos análogos do molde do MIP utilizado. As colunas de MIP produzidas possibilitam uma interação mais específica que as outras técnicas e materiais disponíveis conhecidos na arte (por exemplo, colunas em fase normal, de troca iônica, de sílica em fase inversa que compreendem tamanho variado de cadeias de alquila hidrofóbicas (-(CH2)n-CH3 com n igual a 4, 8, 18, mas não limitado a) que interage com peptídeos e moléculas pequenas), mas direcionadas de forma mais específica ao molde correspondente e aos análogos do molde do MIP produzido. Em alguma modalidade, um grande número de tipos diferentes de MIPs cada um dedicado a uma micotoxina específica ou um grupo de micotoxinas pode ser utilizado para o empacotamento da coluna.
[0140] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece materiais para separação e quantificação de micotoxinas. A presente invenção pode então ser utilizada para a medida de possibilidade de rastreamento do produto alimentício/matéria alimentícia ou origem do líquido com a finalidade de medir as micotoxinas presentes na amostra e sua comparação com um composto referido comumente aceito (por exemplo, material padronizado de micotoxina eluído utilizando HPLC unida com um hífen a UV-, detector fluorescente ou detectores de espectrometria de massa etc.)
[0141] Em algumas modalidades, a capacidade de rastreamento do nível de micotoxina pode ser realizada utilizando um único tipo de MIP ou um grande número de tipos diferentes de MIPs, cada um sob encomenda para uma micotoxina específica ou grupo de micotoxinas e aplicado na detecção em materiais de amostra que compreendem de um produto alimentício ou uma amostra de alimento (por exemplo, amostras de grãos (por exemplo, milho, trigo etc.), frutas (por exemplo, maça, peras, uvas etc.), café, chá, cacau etc.).
[0142] Em algumas modalidades, a capacidade de rastreamento do nível de micotoxina utilizando um único MIP ou um grande número de tipos diferentes de MIPs cada um sob encomenda para se direcionar a uma micotoxina específica ou grupo de micotoxinas, é aplicada na investigação analítica (por exemplo, HPLC) para determinar se as micotoxinas estão presentes na amostra e, caso estejam, qual(is) micotoxina(s) está(ão) presente(s) em quais níveis. Em algumas modalidades as ferramentas analíticas utilizadas para a detecção de micotoxinas (por exemplo, HPLC) podem ser utilizadas para prever o perigo de contaminação com micotoxinas no produto alimentício. Em outras modalidades as ferramentas analíticas utilizadas para a detecção de micotoxinas podem ser utilizadas para determinar quais MIP’s ou a combinação de MIP’s que é necessária para a aplicação no material do qual uma amostra foi tirada com a finalidade de reduzir ou de eliminar a(s) micotoxina(s) presente(s).
[0143] Em algumas modalidades, a capacidade de rastreamento do nível de micotoxina utilizando um único MIP ou um grande número de tipos diferentes de MIPs cada um dedicado a uma micotoxina específica ou grupo de micotoxina, é aplicada na detecção do conteúdo de micotoxina de líquidos utilizados nos sistemas de produção animal ou utilizados como bebidas para consumo por animais e humano (por exemplo, água, leite, sucos, vinho, cerveja etc.).
[0144] Em algumas modalidades, a capacidade de rastreamento em termos de conteúdo de micotoxina pode ser aplicada no processamento de produto alimentício/alimento (processamento de carne, processamento de produção fresca) para testar em relação à presença de micotoxinas durante o fluxo de produção inteiro para determinar onde ocorre um problema de contaminação e é necessário o recolhimento dos produtos. Códigos de barra e outros meios de rastreamento, todo o movimento de produto e etapas dentro do processo de produção devem ser referidos consequentemente para permitir a capacidade de rastreamento da amostra analisada.
[0145] Em algumas modalidades, a capacidade de rastreamento do nível de micotoxina utilizando um único MIP ou um grande número de tipos diferentes de MIPs cada um dedicado para uma micotoxina específica ou grupo de micotoxinas, é aplicada na detecção do conteúdo de micotoxina do sangue. Por exemplo, a presente invenção pode ser utilizada na prática de transfusão, para facilitar a validade de verificação contínua responsável pelo paradeiro de um produto sanguíneo e sua condição atual em termos de processamento, teste, armazenamento etc. todos os pontos desde a coleta inicial de um doador direto ao longo da transfusão em um receptor ou do descarte através da capacidade de rastreamento do nível de micotoxina.
[0146] Em algumas modalidades, a presente invenção utiliza os MIPs descritos aqui em combinação com um ou mais métodos e/ou materiais descritos aqui para uso em composições e/ou métodos para a redução, a remoção e/ou a eliminação de micotoxinas (por exemplo, métodos físicos, de mistura, químicos, microbiológicos descritos aqui (por exemplo, para adsorver e/ou sequestrar toxinas)). Por exemplo, em algumas modalidades, um MIP descrito aqui é utilizado com um ou mais métodos físicos, de mistura, químicos ou microbiológicos para sequestrar micotoxinas. Uma variedade de meios físicos pode ser utilizada para reduzir a presença de micotoxinas tais como separação mecânica (Ver, por exemplo, Dickens J.W. e Whitaker T.B., 1975. Peanut Science, 2: 45-50), segregação por densidade (Ver, por exemplo, Huff W.E. e Hagler W.M., 1982. Cereal Chemistry, 59: 152153), limpeza de grãos através de lavagem com água ou carbonato de sódio para reduzir a contaminação de milho (por exemplo, com toxinas de Fusarium), separação dos grãos contaminados (por exemplo, através de separação física ou fluorescência para detectar a presença de micotoxinas), inativação térmica (Ver, por exemplo, Lee L.S., 1989. Journal of American Oil Chemistry Society, 66: 1398-1413), irradiação com UV, raios X ou irradiação com microondas (Ver, por exemplo, CAST, 2003. Mycotoxins: Risk inplant, animal and human systems. Em: Task Force Report 139 (Niyo K. ed.), Council for Agricultural Science and Technology, Ames, Iowa, USA: pp. 1-199), e extração de toxinas com solventes (Ver, por exemplo, Scott P.M., 1998. Review of Veterinary Medicine, 149: 543-548). Uma variedade de agentes químicos tais como ácidos, bases (por exemplo, amônia, soda cáustica), oxidantes (por exemplo, peróxido de hidrogênio, ozônio), agentes redutores (por exemplo, bissulfitos), agentes de cloração e formaldeído, foram utilizados para degradar micotoxinas em produtos alimentícios contaminados, particularmente aflatoxinas (Ver, por exemplo, Hagler W.M, Jr., 1991. Em Mycotoxins, Cancer and Health. (Bray G. e Ryan D. eds.) Lousiana State University Press, Baton Rouge, LN, USA; Phillips T.D., Clement B.A. e Park D.L., 1994. Approaches to reduction of aflatoxin in foods and feeds. Em: The toxicology of aflatoxinas: Humano health, veterinary agriculture sinalificance (Eaton L.D. e Groopman J.D. eds.), Academic Press, New York, NY, USA: pp. 383-406;). Filtros (por exemplo, colunas de filtração) e dispositivos similares podem ser similarmente utilizados para remover micotoxinas.
[0147] A invenção fornece ainda sistemas e métodos de fornecimento de vários aspectos de um produto (por exemplo, produtos e/ou componentes dos mesmos da invenção e/ou serviço utilizando a invenção). A invenção fornece ainda sistemas e métodos de fornecimento de produtos da empresa para um grupo fora da empresa, por exemplo, um sistema e um método para o fornecimento de um cliente ou um distribuidor dos produtos da empresa tal como um ou mais MIPs (por exemplo, MIPs direcionados para micotoxinas específicas). Por exemplo, em algumas modalidades a presente invenção fornece um sistema de controle do produto que pode ser separado ou combinado com um sistema de capacidade de rastreamento. Por exemplo, as amostras de materiais podem ser analisadas para determinar se as micotoxinas estão presentes ou ausentes no material; se as micotoxinas estiverem presentes, as micotoxinas específicas podem ser identificadas. Esta informação pode ser utilizada para a possibilidade de rastreamento (por exemplo, para demonstrar a ausência de todas ou de certas micotoxinas). Esta informação também pode ser utilizada para fornecer um sistema para o controle do produto de MIP em que combinações específicas de MIP’s podem ser criadas e combinadas para se direcionarem especificamente às micotoxinas presentes no material de amostra.
[0148] Em algumas modalidades, a empresa recebe entrada (por exemplo, na forma de um pedido, informação ou materiais (por exemplo, amostra biológica (por exemplo, amostra líquida suspeita de compreender os compostos alvos)) de um grupo fora da empresa (por exemplo, um distribuidor e/ou um cliente) para um departamento de pedidos; e fornece a resposta (por exemplo, na forma de um produto que pode ser fornecido partindo do departamento de envio (por exemplo, para um distribuidor e/ou cliente) ou na forma de relatório de dados (por exemplo, capacidade de rastreamento como serviço de análise de laboratório)). Em algumas modalidades, o sistema de controle de produto é organizado para otimizar o recebimento e o fornecimento de pedidos (por exemplo, de uma maneira eficiente em relação ao custo) de produtos (por exemplo, composições que compreendem um ou mais MIPs (por exemplo, MIPS específicos para micotoxinas)) para um grupo fora da empresa; e para a obtenção de pagamento para tal produto do grupo. Em algumas modalidades, o sistema de controle de produto é organizado para obter código de barra das amostras ou materiais submetidos para análise e fornecimento (por exemplo, de uma maneira eficiente em relação ao custo) de relatórios de folhas de dados (por exemplo, níveis de várias micotoxinas que foram analisadas através do uso de MIP-SPE ou colunas de HPLC feitas de MIPs (por exemplo, MIPS específicos para micotoxinas)) para um grupo fora da empresa; e para a obtenção de pagamento para tal serviço do grupo.
[0149] Em algumas modalidades, a empresa compreende produção e administração. As composições da presente invenção podem ser produzidas na produção e/ou por um terceiro grupo e podem ser armazenadas separadamente ali tal como no armazemaneto de materiais e/ou outro armazenamento de componentes (por exemplo, armazenamento de produtos) e/ou podem ser adicionalmente juntadas (por exemplo, combinadas (por exemplo, um ou mais MIPs podem ser combinados com um ou mais outros tipos de MIPs e/ou com outros componentes (por exemplo, carreadores e/ou outros componentes bioativos descritos aqui))) e armazenadas (por exemplo, em dispositivo e/ou armazenamento de produtos). Em algumas modalidades, a administração inclui o departamento de pedidos (por exemplo, que recebe a entrada na forma de um pedido para um produto do cliente e/ou distribuidor). O departamento de pedidos pode então fornecer o resultado na forma de instruções para o departamento de envio para executar o pedido (isto é, direcionar os produtos como requerido pelo cliente ou distribuidor). Em algumas modalidades, o departamento de envio, em adição à execução de um pedido para o produto ou para o serviço, também pode fornecer informação/dados para o departamento de faturamento. Em algumas modalidades, outro componente da empresa podeincluir departamento de serviço ao cliente (por exemplo, que pode receber a entrada do cliente e/ou fornecer a resposta na forma de retorno ou informação ao cliente e/ou pode receber a entrada ou fornecer a resposta para qualquer outro componente de empresa). Por exemplo, o departamento de serviço ao cliente também pode receber entrada do cliente na forma de informação técnica requerida, por exemplo, para confirmar que os produtos e os métodos da invenção podem ser aplicados para a necessidade particular do cliente e pode fornecer resposta para o cliente na forma de uma response para a informação técnica requerida.
[0150] Assim, em algumas modalidades, os componentes de empresa são configurados de forma adequada para comunicação com cada outro para facilitar a transferência de materiais e peças, dispositivos, outros componentes, produtos, folhas de dados e informação para dentro e para fora da empresa. Por exemplo, um meio físico pode ser utilizado para transferir os produtos do armazenamento do produto para o departamento de envio após o recebimento da entrada adequada do departamento de pedidos ou do armazenamento de amostras para o departamento analítico após o recebimento de requerimento de análise urgente. O departamento de pedidos, em comparação, pode estar ligado de forma eletrônica com outros componentes dentro da empresa, por exemplo, através de uma rede de comunicação (por exemplo, uma rede (por exemplo, internet e/ou intranet)) e pode ser adicionalmente configurado para receber entrada, por exemplo, do cliente por uma rede telefônica, por correspondência ou outro serviço de carga ou através da internet.
[0151] Em algumas modalidades, um sistema de controle de produto compreende ainda um ou mais sistemas de coleta de dados.
[0152] Em algumas modalidades, a empresa pode utilizar um número de aplicações de software para fornecer componentes da empresa com informação e/ou para fornecer a um grupo fora da empresa acesso a um ou mais componentes da empresa (por exemplo, acesso ao departamento de pedidos e/ou ao departamento de serviço ao cliente e/ou coleta/armazenamento de dados). Tais aplicações de software podem compreender uma rede de comunicação tal como a Internet, uma rede de área loca ou uma intranet. Por exemplo, em uma aplicação baseada na internet, o cliente pode acessar um website adequado e/ou um servidor da web que coopera com o departamento de pedidos de forma que o cliente pode fornecer entrada na forma de um pedido para o departamento de pedidos. Em resposta, o departamento de pedidos pode se comunicar com o cliente para confirmar que o pedido foi recebido e pode se comunicar também com o departamento de envio, fornecendo a informação de que os produtos da invenção (por exemplo, composições que compreendem um ou mais tipos diferentes de MIPs (por exemplo, MIPs específicos para micotoxinas)) devem ser enviados para o cliente ou para o departamento analítico, fornecendo a informação de que as análises que utilizam os produtos da invenção (por exemplo, composições que compreendem um ou mais tipos diferentes de MIPs (por exemplo, MIPs específicos para micotoxinas) embaladas na forma de dispositivos separados) devem ser realizadas. Assim, desta maneira, o serviço da empresa pode ser prestado de uma maneira eficiente.
[0153] Assim, em algumas modalidades, em uma disposição em rede, vários subcomponentes de uma empresa (por exemplo, departamento de armazenamento, analítico, de faturamento e departamento de envio) podem se comunicar com os outros através dos respectivos sistemas de computador. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para o fornecimento de vários aspectos de um produto (por exemplo, produtos e/ou componentes dos mesmos da invenção), bem como informação em relação a vários aspectos de um produto da presente invenção (por exemplo, dados de desempenho, estatísticas de uso etc.), para os grupos (por exemplo, clientes/usuários, distribuidores, terceiros (por exemplo, agências do governo (por exemplo, National Institutes of Health e/ou the Centers for Disease Control) etc). Em algumas modalidades, um produto é removido do armazenamento de produtos, por exemplo, pelo departamento de envio e enviado para uma parte requerente tal como cliente ou distribuidor. Tipicamente, tal envio ocorre em resposta ao grupo que fez um pedido, que é então processado (por exemplo, direcionado para o grupo apropriado) dentro da organização e os resultados no produto pedido sendo enviados para o grupo ou o serviço sendo fornecido para o grupo. Os dados em relação ao envio do produto ou as folhas de dados do serviço de análise para o grupo podem ser transmitidos adicionalmente dentro da organização, por exemplo, do departamento de envio ou analítico para o departamento de faturamento, que, por sua vez, pode transmitir uma fatura para o grupo, com o produto ou a folha de dados ou em um momento após o produto ou a folha de dados ter sido enviada. A presente invenção fornece ainda métodos de fornecimento de serviço técnico para os grupos utilizando um produto e/ou componentes do mesmo da invenção. Embora tal função possa ser realizada por indivíduos envolvidos na pesquisa e no desenvolvimento de produtos, geralmente podem ser realizadas, enviadas e/ou direcionadas investigações em relação ao serviço técnico por um departamento administrativo da organização (por exemplo, departamento de serviço ao cliente). As comunicações do serviço técnico (por exemplo, resolução de problemas relacionados ao uso do produto ou componentes individuais do produto) podem requerer troca de informação entre um usuário (por exemplo, cliente) e o departamento de serviço ao cliente.
[0154] Como mencionado anteriormente, qualquer número de variações de um processo do fornecimento de produtos (por exemplo, produtos e/ou componentes dos mesmos descritos aqui) e/ou serviços ao um usuário é possível e está dentro do âmbito da invenção. Consequentemente, a invenção inclui métodos (por exemplo, métodos de comercialização) que envolvem (1) a produção de produtos (por exemplo, um produto e/ou componentes do mesmo descritos aqui); (2) o recebimento de pedidos para estes produtos; (3) o envio dos produtos para as partes que fizeram tais pedidos; (4) o envio de faturas para as partes obrigadas a pagar pelos produtos enviados para as mesmas; e/ou (5) o recebimento de pagamento para os produtos enviados para as partes. Por exemplo, são fornecidos métodos que compreendem duas ou mais das etapas a seguir: (a) obtenção de peças, materiais e/ou componentes de um fornecedor; (b) preparação de um ou mais primeiros produtos (por exemplo, um ou mais componentes descritos aqui (por exemplo, um molde de MIP descrito aqui e/ou um ou mais tipos diferentes de MIPs produzidos utilizando o molde de MIP)); (c) armazenamento do um ou mais primeiros produtos da etapa (b); (d) a combinação do um ou mais primeiros produtos da etapa (b) com um ou mais outros componentes para formar um ou mais segundos produtos (por exemplo, uma composição que compreende dois ou mais tipos diferentes de MIPs); (e) armazenamento do um ou mais primeiros produtos da etapa (b) ou um ou mais segundos produtos da etapa (d); (f) obtenção de um pedido para o primeiro produto da etapa (b) ou um segundo produto da etapa (d); (g) envio do primeiro produto da etapa (b) ou do segundo produto da etapa (d) para o grupo que fez o pedido da etapa (f); (h) rastreamento de dados em relação à quantia de dinheiro devida pelo grupo para o qual o produto é enviado na etapa (g); (i) envio de uma fatura para o grupo para o qual o produto é enviado na etapa (g); (j) obtenção de pagamento para o produto enviado na etapa (g) (geralmente, mas não necessariamente, o pagamento é feito pela parte para a qual o produto foi enviado na etapa (g)); e (k) troca de informação técnica entre a organização e um grupo em posse de um produto enviado na etapa (d) (tipicamente, o grupo para o qual o produto foi enviado na etapa (g)).
[0155] Um comprador pode desejar obter um ou um grande número de tipos diferentes de MIPs. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um grande número de tipos diferentes de MIPs é feita sob encomenda para o comprador (por exemplo, com base na informação em relação à presença de um ou mais tipos de compostos alvos que devem ser eliminados/sequestrados). Uma vantagem disto é que um cliente pode ser capaz de encomendar um produto particular de acordo com suas necessidades (por exemplo, a obtenção de uma composição que compreende um grande número de tipos diferentes de MIPs específicos para cada composto alvo, ao invés de obter separadamente composições que compreendem apenas um único MIP e então utilizar cada composição em combinação com outras).
[0156] A invenção fornece ainda métodos associados com o planejamento de produtos sob encomenda. Estes métodos incluem, por exemplo, (1) obter um pedido de um cliente para o produto com subcomponentes específicos e/ou metodologia para operação do mesmo, (2) preparar o produto com subcomponentes específicos e/ou metodologia para operação do mesmo, (3) e fornecer (por exemplo, enviar) o produto de (b) para o cliente.
EXPERIMENTAL
[0157] Os exemplos a seguir são fornecidos com a finalidade de demonstrar e ilustrar adicionalmente certas modalidades preferidas e aspectos da presente invenção e não devem ser interpretados como limitantes do âmbito da mesma.
Exemplo 1 Síntese do molde de Ocratoxina A
[0158] Preparação de ácido 2-acetóxi-3,5-diclorobenzóico. Um frasco redondo, com três gargalos, de 1 litro equipado com: um agitador mecânico, um termômetro e um funil de gotejamento de 125 mL com equilíbrio de pressão foi colocado em um banho maria mantido a 65oC. Os reagentes a seguir foram subsequentemente carregados no frasco com uma agitação eficiente: 250 mL de tolueno seco, 2,5 mL de ácido sulfúrico concentrado e 207 g de ácido 3,5- diclorossalicílico sólido bem triturado, que forma uma suspensão móvel. Quando a temperatura desta mistura agitada constantemente atingiu 60oC (com a temperatura do banho de água mantida a 65oC) uma adição gota a gota de 108 g (100 mL) de anidrido acético foi iniciada e completada dentro de 30 minutos. Durante a adição de anidrido acético não se deixou que a temperatura da mistura da reação excedesse 75oC. Depois de completada a adição, a mistura foi agitada e aquecida até 70oC durante mais 4 horas. Depois deste período de tempo, a agitação foi interrompida e a mistura resfriada durante toda a noite até a temperatura ambiente. Os cristais brancos que se separaram da mistura foram retirados por filtração, lavados com 2 x 10 mL de tolueno gelado e secos a vácuo a 50oC para produzir 206 g (82,7 % de rendimento) de ácido 2-acetóxi-3,5- diclorobenzóico. Foram recuperados 30,6 g (12,3 % de rendimento) adicionais do produto por: uma concentração do filtrado até ^ do volume original, resfriamento da solução em um banho de gelo e água, separação por filtração do produto cristalino e secagem a vácuo do mesmo a 50oC.
[0159] Preparação in situ de cloreto do ácido 2-acetóxi-3,5- diclorobenzóico e seu uso na preparação do éster etílico de N-(2- acetóxi-3,5-diclorobenzoil)-L-fenilalanina (Por motivo de segurança pessoal o processo foi realizado em uma capela).
[0160] O sistema de produção foi obtido de um reator de 3 L equipado com um agitador mecânico eficiente (Ace Glass Inc, Louisville, KY, cat#13650-12/23) um funil de gotejamento de 250 mL, um condensador com refluxo com um tubo de secagem com CaCl2 com a saída conectada ao absorvente de vapores ácidos, uma entrada de nitrogênio gasoso seco e um termômetro colocado em um banho maria de 22oC. Um litro de tolueno seco, 5 mL de dimetilformamida e 103 g de ácido 2-acetóxi-3,5-diclorobenzóico foram carregados ao reator sob agitação. Foi feita uma adição gota a gota na mistura da reação de 217 mL (1,05 equiv.) de solução 2 M de cloreto de oxalila em dicloreto de metileno foi utilizada sob agitação durante 2,5 horas. Uma corrente de uma mistura de gases tóxicos: HCl, CO e CO2, que foi produzida na reação foi absorvida em 1 L de solução a 10 % de hidróxido de sódio colocado em um coletor resfriado com água da torneira. Depois de completada a adição de cloreto de oxalila acompanhada pela dissolução completa dos sólidos, uma forte corrente de nitrogênio seco foi passada através da solução durante 1 hora para remover a maioria dos gases ácidos (HCl, CO2) que permaneceram dissolvidos na mistura da reação. Depois deste período de tempo o teor do frasco foi resfriado até abaixo de 15 oC em um banho de gelo e água e 95 g (1,0 equiv.) de éster etílico sólido de cloridrato de L-fenilalanina foram adicionados à mistura. Foi instalado um novo funil de gotejamento de 500 mL no local do funil de 250 mL e cheio com uma solução de 145 mL de trietilamina (2,55 equiv.) em 350 mL de tolueno. A solução de trietilamina foi então adicionada durante um período de tempo de 2 horas ao banho de gelo-água e a mistura da reação resfriada e agitada. Durante o período de tempo de adição, a temperatura da mistura foi mantida abaixo de 25oC. Esta temperatura foi mantida durante 4 horas após completada a adição de trietilamina e então o cloridrato de trietilamina foi separado por filtração e a torta branca lavada com duas porções de tolueno de 100 mL. O filtrado foi então transferido para um funil de separação de 3 L e lavado com duas porções de água de 500 mL e uma porção de salmoura de 500 mL. A camada de tolueno foi então concentrada até um volume de 500 mL e deixada durante toda a noite em um refrigerador para cristalização. Os cristais brancos foram coletados no filtro e lavados com 100 mL de tolueno gelado, fornecendo 108,7 g (62 % de rendimento) de éster etílico de N-(2-acetóxi-3,5-diclorobenzoil)-L- fenilalanina.
[0161] 1H RMN (clorofórmio deuterado (abreviado como CDCl3), ppm): 7,78 δ, J 2,8, 1H; 7,55 δ, J 2,4, 1H; 7,30-7,27 m, 3H; 7,11 δ amplo, J 8,0, 1H; 7,08 δq, J 8,0 e 1,6, 1H; 4,99 q, J 6,0, 1H; 4,24 q, J 7,0, 2H; 3,29 dd, J 5,6 e 14,4, 1H; 3,21 dd, J 9,2 e 14,0, 1H; 2,11 s, 3H; 1,31 t, J 7,2, 3H.
[0162] Preparação de N-(3,5-dicloro-2-hidroxibenzoil)-L- fenilalanina (molde de OTA). Cento e oito gramas de éster etílico de N- (2-acetóxi-3,5-diclorobenzoil)-L-fenilalanina foram dissolvidos em 1 L de álcool etílico anidro e colocados em um frasco de fundo redondo de 2 L equipado com um agitador magnético em barra e colocado em banho maria à temperatura ambiente. A esta mistura foi adicionada uma solução de 33,33 g de hidróxido de sódio em 37,2 mL de água em uma única porção e a mistura agitada à temperatura ambiente durante 17 horas (durante toda a noite). Foi adicionado um volume de 68,6 mL de ácido clorídrico concentrado sob agitação, que foi mantida durante umas 2 horas adicionais. O cloreto de sódio precipitado foi separado por filtração e o filtrado evaporado até secura a 60oC sob 30 T de pressão. O resíduo de 88,9 g (98 % de rendimento) solidificou-se após o resfriamento na forma de um produto vítreo incolor, que era bem solúvel em tolueno ou em acetonitrila, produzindo assim um molde OTA (por exemplo, para uso na produção de MIP-OTA). MS: M+ 354 e 356 1H RMN (CDCl3, ppm): 12,2 muito amplo s, 1H; 7,49 d, J 2,4, 1H; 7,35-7,28 m, 3H; 7,20 d, J 2,0, 1H; 7,18-7,16 m, 2H; 6,80 br d, J 6,4, 1H; 6,4 muito amplo s, 1H; 5,07 dd, 5,2 e 5,2, 1H; 3,34 dd, J 14,0 e 5,2, 1H; 3,27 dd, J 13,6 e 5,2, 1H.
Exemplo 2 Síntese de MIP-OTA em mistura de tolueno-ciclohexano
[0163] Quinhentos mililitros de tolueno, 35,42 g (0,1M) de molde de OTA, 16,18 mL (0,15 M) de 2-vinilpiridina, 12,13 mL (0,1 M) de 2- hidroxietilmetacrilato, 235,75 mL (1,25 M) de dimetacrilato de etileno glicol e 2,46 g (15 mM) de AIBN foram colocados em um frasco com quatro gargalos de 3 L equipado com: um agitador mecânico, um condensador com refluxo, um termômetro e uma entrada / saída de nitrogênio. A solução transparente resultante foi agitada durante 1 hora à temperatura ambiente e uma corrente de nitrogênio constante passada através do vasilhame (por exemplo, para remover oxigênio que possa inibir a polimerização). O frasco foi então aquecido até 60 oC e a mistura agitada vigorosamente. Ocorreu polimerização logo que a temperatura da solução aumentou até ~ 55 oC (por exemplo, observado por um aumento na viscosidade da solução). Quinze minutos depois do início da polimerização, foram adicionados 600 mL da mistura de (1:1) de ciclohexano / tolueno em uma única porção para promover a separação da esfera de polímero da solução. Foi mantida vigorosa agitação da mistura e uns 500 mL de tolueno adicionais foram adicionados 30 minutos depois para melhorar a misturação global da suspensão do volume ainda em aumento da suspensão de MIP sólido em um volume relativamente pequeno de solvente. Foram mantidas uma temperatura de 60 oC e agitação durante umas 5 horas adicionais após o que a agitação foi desligada para deixar que as esferas de MIP se sedimentassem. O sobrenadante foi decantado e a pelota transferida em um frasco giratório para evaporação de 2 L para remover os solventes restantes das esferas de MIP, a 40 oC e sob uma pressão reduzida de 30 T. As esferas secas foram moídas até aproximadamente trama 140 e lavadas 5 vezes, por agitação com 1,5 L de solução 0,2 p/v% de hidróxido de sódio durante 30 minutos e decantação. A porção final das esferas de MIP-OTA foi misturada com 1,5 L de ácido acético a 0,5 v/v%, que também foi decantado e 1,5 L de água deionizada. As esferas de MIP-OTA úmidas livres de molde resultantes (volume de ~ 1,0 L) foram secas em uma estufa de laboratório a 80 oC durante 4 horas, utilizando quatro bandejas de vidro. O MIP-OTA semelhante a um pó branco pesou 248 g (93 % de rendimento). Várias amostras identificadas na Tabela 1 a seguir foram sintetizadas utilizando-se este método.
[0164] Para este e para os procedimentos de síntese subsequentes, os inibidores de polimerização foram removidos dos monômeros e do agente de reticulação por destilação a vácuo, antes de serem usados na polimerização e os solventes usados na polimerização eram de pureza ACS. A concentração do molde em lavagens subsequentes foi obtida por comparação da intensidade da cor vermelha alaranjada do complexo do molde Fe3+ a Àmax 385 nm com a curva de calibração construída para concentrações de molde entre 10 μg/mL e 1 mg/mL. Tabela 1. Identificação das amostras sintetizadas em mistura de tolueno-ciclohexano
Figure img0001
Exemplo 3 Síntese de OTA MIP em acetonitrila
[0165] Quinhentos mililitros de acetonitrila, 17,71 g (50 mM) de molde de OTA, 8,1 mL (75 mM) de 2-vinilpiridina, 6,1 mL (50 mM) de 2-hidroxietilmetacrilato, 117,9 mL (625 mM) de dimetacrilato de etileno glicol e 1,23 g (15 mM) de AIBN foram colocados em um frasco com quatro gargalos de 3 L equipado com: um agitador mecânico, um funil de gotejamento de 500 mL com equilíbrio de pressão, um termômetro e entrada / saída de nitrogênio e uma manta de aquecimento elétrico. A solução transparente resultante foi agitada durante 1 h à temperatura ambiente e uma corrente de nitrogênio constante passada através do vasilhame (por exemplo, para remover oxigênio que possa inibir a polimerização). Depois disso, o frasco foi aquecido até 60 oC e a mistura agitada vigorosamente. Ocorreu polimerização logo que a temperatura da solução aumentou até ~ 55 oC (por exemplo, observado pelo aumento da viscosidade da solução). Trinta minutos depois de iniciada a polimerização (por exemplo, quando se puder observar formação de gel), foi adicionado rapidamente 1,5 L de acetonitrila (pré-aquecida até 55 oC e purgada com nitrogênio para remover oxigênio), em três porções de um funil de gotejamento de 500 mL para evitar a formação de polímero em bloco e para promover a separação das esferas de polímero da solução. Foram mantidos vigorosa agitação e aquecimento da mistura durante as próximas 17 horas (durante toda a noite). Depois disso, foram desligados o aquecimento e a agitação e as esferas de MIP deixadas sedimentar. O sobrenadante foi decantado e a pelota transferida para um frasco giratório de 2 L para evaporação e o resto do solvente removido das esferas de MIP a 40 oC e sob pressão reduzida de 30 T. As esferas secas foram moídas até aproximadamente trama 140 e lavadas 5 vezes, por agitação com 1,5 L de solução a 0,2 p/v% de hidróxido de sódio durante 30 min e decantação. A porção final das esferas de MIP-OTA foi misturada com 1,5 L de ácido acético a 0,5 v/v%, que também foi decantado e 1,5 L de água deionizada. As esferas de MIP-OTA úmidas livres de moldes resultantes (volume de ~ 1,2 L) foram secas em uma estufa de laboratório a 80 oC durante 6 horas, utilizando 4 bandejas de vidro. O MIP-OTA semelhante a um pó branco pesou 115 g (86,2 % de rendimento). Várias amostras identificadas na Tabela 2 abaixo foram sintetizadas utilizando este método. Tabela 2. Identificação das amostras sintetizadas em acetonitrila
Figure img0002
* após lavagem com 4 x NaOH a 0,2 %, lavagem 1 x AcOH a 1% seguida por lavagem 1 x H2O.
Exemplo 4 Preparação de MIP-OTA em tolueno em grande escala
[0166] A preparação foi realizada em um reator de 3 L com uma tampa com quatro gargalos, equipado com um agitador mecânico com dois propulsores instalados no fundo e na metade do caminho ascendente, uma manta de aquecimento elétrico, um termômetro, um funil de gotejamento de 1,5 L com equilíbrio de ar e entrada de nitrogênio gasoso e um condensador com refluxo equipado com um medidor de bolhas para controlar o fluxo de nitrogênio. Os seguintes reagentes foram carregados ao reator: 54,54 g (154 mM) de N-(3,5- dicloro-2-hidroxibenzoil)-L-fenilalanina (molde de OTA), 25 mL (231 mM) de 2-vinilpiridina, 18,7 mL (154,0 mM) de monometacrilato de etileno glicol, 363 g (1,925 M) de dimetacrilato de etileno glicol, 770 mL de tolueno e 5,0 g (30,8 mM) de AIBN. Foi colocado 1,5 L adicional de tolueno em um funil de gotejamento. A mistura da reação foi agitada vigorosamente e o gás dissolvido removido por passagem de uma forte corrente de nitrogênio à temperatura ambiente durante 45 minutos e primeiramente através do tolueno que foi colocado no funil de gotejamento e depois através do volume vazio do reator. Um fluxo fraco de nitrogênio foi mantido durante o período de tempo de polimerização. A polimerização foi iniciada por aquecimento da mistura da reação até 55 oC. Após 15 minutos, aumentou a viscosidade da mistura e a agitação se tornou menos eficiente. Neste ponto, um volume de tolueno adicional (à temperatura ambiente) foi adicionado do funil de gotejamento. A adição foi estabelecida para funcionar suficientemente rapidamente para evitar o superaquecimento da mistura devido às propriedades exotérmicas da reação e para manter a viscosidade da mistura da reação suficientemente baixa para permitir uma agitação eficiente durante o período de tempo de formação e de separação das esferas de polímero. Foram mantidas uma temperatura de 60 - 70 oC e agitação durante as próximas 5 horas e então a mistura foi deixada sem agitação à temperatura ambiente até o dia seguinte. Então, 1,75 L de uma camada de tolueno foi decantado das partículas de MIP e as partículas de MIP úmidas moídas e transferidas para um frasco giratório para evaporação de 2,0 L. A maior parte do tolueno (~ 0,45 L) que foi coletada dentro das partículas de MIP foi separada por destilação das esferas de MIP sob pressão levemente reduzida e a uma temperatura abaixo de 70 oC. No final da remoção de tolueno o produto semelhante a pó que tinha sido formado apresentou uma tendência a produzir pó fino. Depois deste ponto, a evaporação foi interrompida e as partículas de MIP foram lavadas com 2 porções de etanol de 500 mL cada. Aproximadamente 0,75 L de etanol foi então decantado dos sólidos e evaporado para produzir 30 g (55 %) do molde de OTA regenerado e 700 mL de etanol regenerado. Os sólidos finos brancos foram então lavados com 4 vezes porções de 0,5 L de NaOH a 0,2 p/v% seguidas por uma única lavagem com 500 mL de ácido acético a 1 v/v% e uma única porção de 500 mL de água deionizada. As OTA-MIP ‘úmidas’ resultantes foram então secas durante 24 horas em uma estufa de laboratório a 80 oC. Foi obtida uma massa de 411,4 g (96,6 % de rendimento) de produto como pó branco e fracionada utilizando peneiras padronizadas. Esta metodologia foi utilizada para sintetizar as várias amostras identificadas na Tabela 3. Os detalhes da distribuição de tamanho são fornecidos na Tabela 4. Tabela 3. Identificação das amostras sintetizadas em tolueno ou em álcool polivinílico (abreviado como PVA)
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a lavagem 4x com NaOH a 0,2 % foi seguida pela lavagem 1x com AcOH a 1 % e 1x água. Tabela 4. Distribuição de tamanho das MIP-OTA produzidas.
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Exemplo 5
[0167] Polimerização/síntese de MIP-OTA e NIP iniciada por temperatura baixa e por UV.
[0168] Conjunto da reação fotoquímica. Quartzo, poço de imersão fotoquímico UV (Ace Glass, N°. do Catálogo 7856-10) equipado em Lâmpada UV de 450 Watt (ACE Glass, N°. do Catálogo 7825-34) e 450 Watt Cased Power Supply (ACE Glass, N°. do Catálogo 7830-58) está conectado com um refrigerador de circulação WKL 230 LAUDA (fornecido por Brinkmann Instuments, Inc.) e água de resfriamento a 4 °C é circulada através da manta do poço no período de tempo em que a lâmpada UV estiver acesa.
[0169] Polimerização (Tabela 5) Os monômeros, molde, iniciador (IABN) e um agente de reticulação são colocados em um frasco de polietileno translúcido (Nalgene®stile 2105) e uma corrente de argônio é passada através da mistura durante 15 minutos para remover todo o oxigênio, que se sabe inibe a polimerização com radical livre. Então o frasco é fechado e conectado ao poço de imersão, no nível do centro da lâmpada UV e imerso, juntamente com o conjunto para reação fotoquímica, em um banho maria. A água para resfriamento circula através da manta da lâmpada, quando a luz for acesa e a irradiação da mistura da reação é mantida durante quatro horas (são necessários óculos de segurança para UV no período de tempo em que a lâmpada UV estiver acesa). É fornecido gelo adicional e o excesso de água é drenado do banho durante o período de duração da polimerização UV, para manter a temperatura do banho de resfriamento a 4 oC. Depois de completada a polimerização o frasco é aberto, o polímero é triturado e moído em pequenos pedaços que são lavados: uma vez com etanol, dez vezes com hidróxido de sódio a 0,2 %, uma vez com ácido acético a 1 % e três vezes com etanol, para remover o molde do polímero e garantir atividade máxima de MIP que é finalmente seca em uma estufa de laboratório para remover resíduos de etanol. Os rendimentos de MIP-OTA foram de 56,7 % e de 49 %, respectivamente para #555-54A e 555-54B. Tabela 5. Identificação das amostras de MIP-OTA sintetizadas utilizando iniciação com temperatura baixa e UV
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Exemplo 6
[0170] Capacidades de sequestro de MIPs em relação às micotoxinas - aplicadas a OTA
[0171] Os polímeros de MIP produzidos em tolueno-ciclohexano, acetonitrila ou tolueno foram testados em relação à OTA (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) micotoxina para a remoção da micotoxina OTA de meios líquidos ou semi-líquidos por interações químicas. O produto MIP produzido como utilizado aqui para representar as diferenças de afinidade de sequestro da micotoxina OTA e para avaliar a especificidade do material. Uma quantidade de 12,5 mg de MIP foi colocada em um dispositivo para filtração ultracentrífuga de Amicon (5,000 Da). A preparação foi realizada juntamente com uma amostra em branco que não contém material MIP e com um controle positivo que contém apenas a toxina OTA a ser testada. O teste do sequestro foi realizado em tampão citrato 50 mM ajustado até pH 4,0. Todas as amostras foram incubadas durante 90 minutos em um agitador giratório orbital (Brunswick, Champaign, IL, USA) a 150 rpm mantido a uma temperatura de 37 °C. Foram testadas três concentrações finais de OTA com o sistema, 50, 100, 250 partes por bilhão (ppb) em um volume final de 12,5 mL. Após a incubação os tubos para a microcentrífuga foram centrifugados a 10.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi coletado em pequenos frascos para HPLC âmbar e silanizados, evitando qualquer interação da micotoxina com o pequeno frasco e calculado para HPLC (Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA) acoplada ao sinal de detectores fluorométricos e arranjo de diodos (por exemplo, para detectar quantidades de micotoxina e de micotoxina sequestrada) de acordo com métodos padronizados (Ver, por exemplo, Entwisle A.C., Williams A.C., Mann P.J., Slack P.T., Gilbert J., 1995. Chromatografy method with immunoaffinity column cleanup for determination of ochratoxin A in barley: Collaborative study. Journal of AOAC, 83: 1377-1383).
[0172] Os resultados (Ver a Tabela 5) indicaram que tanto o MIP preparado com o molde de OTA e sem o molde (NIP) a uma concentração de 1,00 g/L possuía afinidade muito alta pela molécula de micotoxina OTA a pH de 4,0. De acordo com o processo de preparação, o MIP gerado depois da polimerização por precipitação (identificado como # 523-31 sintetizado em tolueno; # 523-34, -35, -36 sintetizados em mistura de tolueno-ciclohexano e # 523-48 sintetizados em mistura de tolueno-acetonitrila) possuía uma eficiência de sequestro acima de 98,8 % ao passo que o MIP gerado após polimerização em emulsão (identificado como # 523-40 e -41 sintetizado em água e álcool polivinílico e 49 sintetizado em acetonitrila) possui menor afinidade abaixo de 63 %. A molécula de NIP também é capaz de interagir com 98,8 % de eficiência de sequestro. Neste estágio, o grupo de polimerização por precipitação não exibiu diferenças estatísticas entre os NIPs e os MIPs ao passo que o grupo de polimerização em emulsão exibiu diferenças significativas entre MIP e NIP e também entre os MIPs.
[0173] Duas etapas de lavagem sucessivas sob solução a 15 % de etanol/ hidróxido de sódio, ácido acético a 1 % foram usadas para avaliar a capacidade dos dois grupos MIPs preservarem a interação e para levar em conta a força do sequestro (Ver a Tabela 6). O grupo de polimerização em emulsão apresentou uma forte liberação da OTA do MIP bem como uma liberação do molde restante que elui com a micotoxina OTA responsável pela percentagem negativa adsorvida. Consequentemente, a presente invenção mostra que a metodologia da polimerização em emulsão não era adequada para criar um adsorvente eficiente para as moléculas de OTA. A presente invenção mostra ainda que o grupo de polimerização por precipitação possuía uma afinidade significativamente alta em relação a OTA o que permite uma máxima dessorção de apenas 26,3 % da molécula de OTA para os MIP sintetizados em uma mistura de tolueno-acetonitrila sem interferência com qualquer molde restante. Tabela 6. Atividade de sequestro dos MIPs e NIPs sintetizados em tolueno, acetonitrila e em mistura de tolueno- ciclohexano para a ocratoxina A e a estabilidade da interação após duas lavagens sucessivas com 15 % de etanol / hidróxido de sódio.
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# polimerização por precipitação
Exemplo 7 Titulação da quantidade de MIP para o sequestro de ocratoxina A
[0174] Um experimento titulação foi conduzido para investigar as taxas de inclusão de MIP, de 0,01 g/L até 1,00 g/L (ou 0,001 até 0,1 % de taxa de inclusão). A preparação foi feita juntamente com uma amostra em branco que não contém material MIP e um controle positivo contendo apenas a toxina OTA a ser testada. O teste de sequestro foi realizado em tampão citrato 50 mM ajustado ao pH de 4,0. Todas as amostras foram incubadas durante 90 minutos sobre um agitador giratório orbital (Brunswick, Champaign, IL, USA) a 150 rpm mantido a uma temperatura de 37 °C. Foram testadas três concentrações finais de OTA com o sistema, 50, 100, 250 ppb em um volume final de 12,5 mL. Após a incubação os tubos na microcentrífuga foram centrifugados a 10.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi coletado em pequenos frascos para HPLC âmbar e silanizados, evitando qualquer interação da micotoxina com o pequeno frasco e calculado para HPLC (Alliance, Water Corp., Milford, MA, USA) acoplada ao sinal de detectores fluorométricos e arranjo de diodos (por exemplo, para detectar quantidades de micotoxina e micotoxina sequestrada) de acordo com métodos padronizados (Ver, por exemplo, Entwisle e outros, 2000 como citado anteriormente).
[0175] Como mostrado na Figura 3, a 0,05 g/L a eficiência ótima estava acima de 80 % do valor do sequestro e atingia uma média de 86,4 ± 1,5 % de sequestro. A incidência do nível de inclusão dos compostos MIP foi avaliada pelo exame da atividade de sequestro de 0,010, 0,025, 0,050, 0,075, 0,100, 0,50 e 1,00 g/L da MIP #523-34 (sintetizados em mistura de tolueno-ciclohexano) e #523-60 (sintetizados em acetonitrila) em 50, 100, 200 ppb de OTA em condição de tampão ácido (pH 4,0). O tamanho do MIP foi ajustado entre 45 e 106 μm de diâmetro de partículas, pois esta fração forneceu o melhor resultado de sequestro e representou a mais alta proporção de partículas de tamanho nos produtos sintetizados de MIP no total.
[0176] Cada MIP, #523-34 e #523-60, foi capaz de adsorver 91,53 ± 10,86 e 81,75 ± 23,67 % de OTA, respectivamente como uma média do sequestro total independentemente do nível de inclusão. Foi encontrado um ponto de deflexão na curva de sequestro para a inclusão dos níveis de MIP de 0,05 e 0,10 g/L respectivamente para as amostras #523-34 e #523-60. As médias de afinidade de sequestro para a inclusão de 0,05 a 1,00 e 0,10 to 1,00 g/L para #523-34 foram 96,31 ± 2,23 e 97,39 ± 0,70%, respectivamente. As médias de afinidade de sequestro para os níveis de inclusão entre 0,05 e 1,00 g/L e entre 0,10 e 1,00 g/L para #523-60 foram 94,51 ± 6,54 e 97,76 ± 0,91%, respectivamente. A presente invenção assim mostra que os MIP sintetizados em uma mistura de tolueno-ciclohexano eram favoráveis a uma mais alta taxa de afinidade para sequestro de OTA a 0,01 g/L de inclusão com 72,42 ± 2,58% de taxa de afinidade ao passo que a amostra produzida com acetonitrila foi menos eficaz com uma taxa de afinidade de 47,40 ± 6,08 e 84,77 ± 1,96 respectivamente a 0,01 e 0,05 g/L de inclusão de produto.
Exemplo 8 Afinidade de diferentes MIP e NIP e caracterização da especificidade em relação à ocratoxina A
[0177] Foram realizados experimentos durante o desenvolvimento de modalidades da invenção para avaliar a afinidade de diferentes NIPs/MIPs sintetizados em acetonitrila ou em tolueno como o solvente usado para a polimerização. As amostras #523-31 (tolueno) e #523-59 (acetonitrila) foram sintetizadas sem qualquer molde de OTA (definido como Polímero Não Impresso); as amostras #523-34 (mistura de tolueno-ciclohexano) e #523-60 (acetonitrila) foram polimerizados ao redor do molde análogo à OTA. As amostras foram então individualizadas para seleção utilizando diferentes peneiras de faixas de tamanho. Os tamanhos de faixa de partícula foram como descrito no Exemplo 4. A obtenção de MIP produziu predominantemente partículas de tamanho entre aproximadamente 45 e 106 μm de diâmetro (como mostrado na Figura 4). A preparação foi realizada juntamente com uma amostra em branco que não contém material do MIP e um controle positivo que contém apenas a toxina OTA a ser testada. O teste de sequestro foi realizado em tampão citrato a 50 mM ajustado até pH 4,0. Todas as amostras foram incubadas durante 90 minutos em um agitador giratório orbital (Brunswick, Champaign, IL, USA) a 150 rpm mantido a uma temperatura de 37 °C. Três concentrações finais de OTA foram testadas com o sistema, 50, 100, 250 ppb em um volume final de 12,5 mL. Após a incubação os tubos para a microcentrífuga foram centrifugados a 10.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi coletado em pequenos frascos para HPLC âmbar e silanizados, evitando qualquer interação da micotoxina com o pequeno frasco e calculado para a HPLC (Alliance, Water Corp., Milford, MA, USA) acoplada ao sinal de detectores fluorométricos e arranjo de diodos (por exemplo, para detectar quantidades de micotoxina e de micotoxina sequestrada).
[0178] A comparação com a afinidade pela OTA demonstrou diferença apenas limitada avaliada em uma única corrida de sequestro sem etapas de lavagem sucessivas nas 3 concentrações diferentes de toxina (50, 100, 250 ppb). Somente a amostra #523-59 obtida de NIP sem que a seleção exibisse menores capacidades de sequestro de concentração de OTA em cada pH. Também foram encontrados menos valores de sequestro para a amostra de MIP #523-34 para valores de concentração de OTA de 50 ppb especialmente para os tamanhos entre 20 e 45 e em uma menor extensão 45 a 106 μm de diâmetro. Assim, em algumas modalidades, a presente invenção mostra que o tamanho das partículas de MIP produzidas de acordo com os métodos da presente invenção possui um pequeno impacto sobre a afinidade total do adsorvente por OTA, com uma afinidade flutuando nos piores casos entre 78 e 99 % de taxas de sequestro. Os NIPs são menos eficazes em suas propriedades de sequestro do que os MIPs levando em conta a especificidade dos MIPs interagirem com a micotoxina OTA.
Exemplo 9
[0179] Coleta de OTA reforçada com álcool no vinho utilizando MIP e filtração direta de ocratoxina A reforçada com álcool no vinho utilizando dispositivo para filtração de Extração de Fase Sólida de MIP semelhante a (SPE)
[0180] Foi testado um procedimento de extração em uma amostra de vinho branco (Chardonnay 2005 - California) utilizando uma coluna de imunoafinidade. A extração foi feita em uma amostra de vinho puro bem como em amostras de vinho reforçadas com álcool com 5, 10, 20 ppb de OTA pura cristalina. A média da concentração original do vinho era 1,676 ± 0,269 ppb de OTA (por exemplo, como determinado seguindo um procedimento de extração padronizado). A recuperação da amostra de 5 ppb reforçada com álcool foi de 100 % e em torno de 77,7 % para 10 ppb.
[0181] A preparação foi feita juntamente com uma amostra em branco que não contém material MIP e um controle positivo que contenha apenas a toxina OTA a ser testada. O teste de sequestro foi realizado em tampão citrato a 50 mM ajustado para pH 4,0. Todas as amostras foram incubadas durante 90 minutos em um agitador giratório orbital (Brunswick, Champaign, IL, USA) a 150 rpm mantido a uma temperatura de 37 °C. Foram testadas três concentrações finais de OTA com o sistema, 50, 100, 250 ppb em um volume final de 12,5 mL. Após a incubação os tubos na microcentrífuga foram centrifugados a 10.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi coletado em pequenos frascos para HPLC âmbar e silanizados, evitando qualquer interação da micotoxina com o pequeno frasco e calculado para HPLC (Alliance, Water Corp., Milford, MA, USA) acoplada ao sinal de detectores fluorométricos e arranjo de diodos (por exemplo, para detectar quantidades de micotoxina e de micotoxina sequestrada).
[0182] O sequestro de OTA do vinho foi avaliado utilizando um procedimento padronizado para sequestro de micotoxina no MIP #523- 34 original que funciona melhor (mistura de fenol-ciclohexano). O sequestro variou em média de desde 43,29 ± 4,08 a 67,15 ± 4,94 a 91,75 ± 1,59 a 95,612 ± 1,201 % para um nível de inclusão de 0,05, 0,10, 0,50 e 1,00 g/L, respectivamente. A titulação do MIP determinou uma afinidade ótima quando usado a um nível de inclusão de 0,5 e 1,0 mg/mL (Ver a Figura 5).
[0183] Assim, em algumas modalidades, a presente invenção fornece composições e métodos de utilização da mesma para coletar / adsorver micotoxinas (por exemplo, OTA) de vinho (por exemplo, partículas de MIP que são utilizadas (por exemplo, sob condições de agitação) para se ligar de forma eficaz e adsorver as micotoxinas do vinho).
[0184] Por exemplo, em algumas modalidades, a presente invenção fornece MIPs (por exemplo, gerados de acordo com um método aqui descrito) para coletar e/ou adsorver micotoxinas (por exemplo, um ou um grande número de tipos diferentes de micotoxinas (por exemplo, presentes em meios líquidos ou em solução de extração da matriz do complexo (por exemplo, produto alimentício, alimento, vegetal, animal etc.))).
[0185] Os dispositivos de filtração semelhantes à Extração em Fase Sólida (semelhantes a SPE) foram gerados para um equivalente de 0,1 g/L de inclusão do MIP. Foram necessários pequenos frascos de vidro silanizado para garantir a estabilidade de OTA em solventes aquosos e para evitar qualquer interação específica entre OTA e os pequenos frascos de vidro. O método de silanização foi aplicado a filtros de nylon e de PTFE/PE e a tubos baseados em métodos geralmente usados na técnica (Ver, por exemplo, Entwisle e outros, 2000 como citado anteriormente). Os pequenos frascos e os filtros foram preparados por enchimento dos mesmos ou imersão dos mesmos no reagente silanizando (SURFASIL). Após 1 minuto, eles foram lavados uma vez com tolueno então duas vezes com metanol seguido por três vezes com água e secos. A silanização foi realizada e gerou uma drástica redução da interação do material com a molécula de OTA como realizado no campo. Por exemplo, foi observado menos do que 5 % de interferência (por exemplo, em contraste com aproximadamente 16 a 26 % de interferência sem silanização anterior dos materiais quando forem usados filtros de PE/PTFE). O nylon não era adequado para a silanização. Todos os tubos de polipropileno foram substituídos por tubos de vidro silanizado.
[0186] Os dispositivos de filtração semelhantes à SPE foram produzidos para capturar a OTA do vinho após uma filtração direta da amostra através da coluna. A eficácia do MIP foi testada em relação à eliminação de OTA do vinho (Chardonnay 2005 - California) reforçado com álcool com 5 e 10 ppb de OTA. Os resultados demonstraram para 5 e 10 ppb de OTA reforçada com álcool, uma redução instantânea de 55,41 ± 5,542 e 56,937 ± 5,739% do conteúdo de OTA do vinho, respectivamente. Consequentemente, em algumas modalidades, a presente invenção fornece MIPs específicos às micotoxinas (por exemplo, generados de acordo com os métodos descritos aqui) que são utilizados com dispositivo de filtração SPE ou semelhante à SPE para a remoção de micotoxinas do líquido (por exemplo, vinho) que compreende micotoxinas.
Exemplo 10
[0187] Captura da ocratoxina A utilizando dispositivo de filtração semelhante à Extração em Fase Sólida (SPE) de MIP iniciado por calor e iniciado por temperatura baixa e UV e avaluação de seletividade em relação a constituintes importantes do vinho.
[0188] Os dispositivos de filtração semelhantes à Extração em Fase Sólida (semelhante à SPE) foram gerados para um equivalente de 0,1 g/L de inclusão do MIP. Frascos de vidro silanizados eram necessários para garantir a estabilidade de OTA em solventes aquosos e para prevenir qualquer interação inespecífica entre OTA e os frascos de vidro. O método de silanização foi aplicado em filtros e tubos de nylon e PTFE/PE com base nos métodos geralmente utilizados na arte (Ver, por exemplo, Entwisle e outros, 2000 como citado anteriormente). Os frascos e os filtros foram preparados enchendo os mesmos ou mergulhando os mesmos com reagente de silanização (SURFASIL). Após 1 minuto, foram lavados uma vez com tolueno então duas vezes com metanol seguido por três vezes com água e secos. A silanização foi realizada e gerou uma redução drástica da interação do material com a molécula de OTA como é realizado no campo. Por exemplo, menos de 5% de interferência foi observada (por exemplo, em contraste com aproximadamente 16 até 26% interferência sem a silanização prévia dos materiais quando os filtros de PE/PTFE são utilizados). O nylon não era adequado para a silanização. Todos os tubos de polipropileno foram substituídos por tubos de vidro silanizado.
[0189] As soluções estoques de doze compostos incluindo polifenóis: ácido caféico (Caf A), catequina hidratada (CH), epicatechina (ECH), ácido ferúlico (Fer), ácido trans-3-hidroxicinâmico (3-HCA), ácido 2-hidroxicinâmico (2-HCA), cloreto de malvidin-3- galactosídeo (Mal), miricetina (Myr), quercetina desidratada (QH), trans-resveratrol (Res), rutina trihidratada (Rut) e ácido indol-3-acético (IAA) (Sigma, St Louis, MO, USA) foram preparadas através de dissolução em metanol (grau de HPLC) e adição de água e 85% de ácido o-fosfórico para diminuir o pH em aproximadamente 3,0. O sobrenadante foi coletado em frasco para HPLC âmbar e silanizados, prevenindo qualquer interação do analito com o frasco e calculado partindo da HPLC (Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA) acoplada aos detectores de sinal fluorimétrico e de arranjo de diodos (por exemplo, para detectar quantidades de micotoxina e micotoxina sequestrada). Uma coluna C18 para HPLC em fase inversa Spherisorb ODS de 5 μm, 4,6 μm x 250 mm (Waters Corp., Milford, MA, USA) com termostato a 30°C foi utilizada. Os comprimentos de onda de excitação e de emissão foram ajustados em 225 nm e 365 nm, respectivamente. O detector do arranjo de diodo de foto UV foi ajustado no modo de varredura completa de comprimentos de onda de 210 até 799 nm. As fases móveis consistiam de água/ácido fosfórico (99,5%:0,5%; v/v) e (B) acetonitrila (grau de HPLC)/água/ácido fosfórico (50%/49,5%/0,5%; v/v/v).
[0190] Todos os MIPs exibiam boa adsorção de OTA em tampão solução, todos acima de 80% de adsorção. O MIP 555-52 exibia a melhor adsorção, próxima de 100%. De maneira interessante, a OTA permaneceu adsorvida durante a lavagem com tampão de todos os MIPs, mas foi dessovida durante a lavagem com metanol especificamente partindo dos MIP iniciados com calor MIP #555-52 e #523-34 e significativamente na concentração mais alta de OTA. A OTA permaneceu adsorvida aos MIPs #555-54A e #555-54B iniciados com temperatura baixa e por UV na lavagem com metanol melhor que aos MIPs iniciados com calor, com mais de 50% de adsorção em média aos MIPs iniciados com UV mantidos ao longo da lavagem com metanol (Ver a Figura 6).
[0191] Os benefícios para a saúde de compostos de polifenol antioxidantes no vinho são bem documentados. Na estratégia de filtração da micotoxina em líquido (por exemplo, vinho) tal como OTA, também é primordial para avaliar o impacto dos agentes de sequestro sobre alguns dos compostos benéficos tais como polifenóis. Em algumas modalidades e como documentado aqui (Ver, por exemplo, o Exemplo 6 até o Exemplo 9) a polimerização iniciada com calor produzia MIP #555-52 e #523-34 que eram capazes de interagir de forma eficiente com a micotoxina OTA presente em um meio líquido, com níveis de adsorção acima de 95% enquanto que a polimerização iniciada com temperatura baixa e UV que produzia MIP #555-54 e #555-54X forneceu uma classificação de eficácia de adsorção entre 80 e 92% de eficácia de sequestro (Figura 6).
[0192] Em algumas modalidades, as composições de MIP iniciadas com temperatura baixa e UV da invenção exibem especificidade d pela OTA quando avaliada com uma mistura de diferentes polifenóis, uma antocianina e ácido indol-3-acético. Neste caso, MIP #555-54A e #555-54B exibiam alta adsorção de OTA (above 80%) e preveniam ao mesmo tempo a adsorção dos polifenóis ou do ácido indol-3-acético (por exemplo, fornecendo as características organolépticas e antioxidantes (por exemplo, de vinho)). No estudo dos MIPs iniciados com UV, o tempo de incubação foi eliminado e as amostras de vinho e lavagens foram empurradas ao longo do MIP ou do filtro imediatamente. Muito pouca adsorção foi observada (Figura 7). Assim, em algumas modalidades, a invenção fornece um MIP que exibe especificidade por uma micotoxina (por exemplo, OTA) enquanto exibe de forma concorrente pouca até nenhuma ligação com (por exemplo, adsorção de) compostos benéficos (por exemplo, polifenóis e/ou ácido indol-3-acético). A quantificação da miricetina, do resveratrol e da rutina estava sujeita à incerteza devido a sua presença em concentração muito baixa próxima ao limite de detecção e do limite de quantificação dos instrumento analítico de HPLC fornecendo como uma consequência grandes desvios padrões e valores negativos. Na presente modalidade, os MIPs iniciados com UV eram assim eficientes na captura de OTA e não estavam atrapalhando o conteúdo de polifenóis de um meio líquido de vinho demonstrando a especificidade do material de MIP gerado.
Exemplo 11
[0193] Revestimento de MIP em tela de fibra de vidro para aplicação como um dispositivo filtrante
[0194] Os experimentos foram conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da invenção para testar o revestimento de tela de fibra de vidro com MIP-OTA (Ver a Figura 8). Várias concentrações de OTA foram utilizadas para determinar a afinidade de cada preparação. Os MIPs diferentes gerados são resumidos na Tabela 7 abaixo. Três telas de trama foram revestidas com MIP’s com concentrações variáveis de reagente de reticulação, que afeta a fragilidade. (Soluções de monômeros 1, 2, 3 e 1H). A tela que foi preparada partindo dos MIPs revestidos foi cortada com base no peso antes e depois do revestimento de MIP para fornecer 50, 100 e 200 mg de MIP avaliados por peso diferencial. Os ensaios de sequestro foram conduzidos com tela revestida com MIP submersa em um tubo falcon de 20 mL, com determinação de características de sequestro para OTA no meio de vinho após 90 min de incubação utilizando um agitador giratório. Um mL dos tubos contendo a solução de vinho reforçada com álcool com três concentrações diferentes de OTA foi medido antes e depois da incubação com os filtros de tela de MIP-OTA. A amostra foi coletada em frasco para HPLC âmbar e silanizados, prevenindo qualquer interação da micotoxina com o frasco e calculada com HPLC (Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA) acoplada com detectores de sinal fluorométrico e de arranjo de diodos (por exemplo, para detectar quantidades de micotoxina e micotoxina sequestrada). Tabela 7. Descrição das condições de polimerização para o revestimento de MIP sobre tela de fibra de vidro.
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[0195] Os resultados indicavam que o sequestro máximo contra OTA era dependente do nível de inclusão do MIP. O sequestro máximo foi obtido com 500 mg de molde, 250 mg de vinil-piridina e 200 mg de metacrilato de hidroxil etila que produziu um MIP que adsorveu até 46,5% de OTA da concentração de 100 ppb no vinho (Ver a Figura 9). De maneira inversa, o mesmo experimento realizado com polímero NIP processado de forma idêntica revestido sobre fibra de vidro mostrou menos de 15% (até 1%) de eficácia de sequestro dependendo do procedimento de preparação (Ver a Figura 10) exemplificando assim a especificidade do material de MIP-OTA por OTA.
Exemplo 12 Capacidade de retenção cromatográfica de MIP’s
[0196] O MIP #523-34 (sintetizado com mistura de tolueno- ciclohexano) foi utilizado como fase estática de uma coluna de HPLC de 4,6 x 150 mm após o empacotamento do material utilizando sonicação em um banho maria e então aplicando uma vazão durante a noite contínua de 5,0 mL/min de acetonitrila corrida ao longo da coluna (MIP utilizando uma bomba binária HPLC Waters Alliance (Waters Corp, Milford, MA, USA)). A pressão da coluna foi determinada como sendo de aproximadamente 400 psi e era comparável com outras condições de HPLC descritas em outros lugares (Ver, por exemplo, Baggiani e outros, 2002 como citado anteriormente; Jodlbauer J., Maier N.M. e Lindner W. Journal of Chromatography A, 945: 45-63; Maier N.M., Buttinger G., Welhartizki S., Gavioli E., Lindner W., 2004. Journal of Chromatography B, 804: 103-11). A coluna foi estabilizada sob vazão de acetonitrila a 1,0 mL/min ao longo de 48 h e lavada extensivamente com metanol a 99% e tetraetilamina a 1% para remover molde de OTA restante da coluna. A caracterização da análise de HPLC-PDA-FID frontal de OTA utilizando a coluna de MIP foi realizada.
[0197] A sobrevivência da coluna foi avaliada sob condições de fases móveis diferentes e sob ajustes de gradientes diferentes corridos ao longo da coluna mantida a uma temperatura constante de 30°C. Vários gradientes foram testados incluindo 100% de água e com transição para 100% de acetonitrila ou 100% de metanol e vice versa; e utilizando ainda tetraetilamina a 1% em metanol até metanol a 100% durante 60 min. A coluna sobreviveu sem qualquer modificação na fase estática após um aumento de pressão até 1600 psi responsável pela sobrevivência da coluna em altas pressões. A injeção de acetona foi utilizada para avaliar o volume vazio da coluna com uma eluição do analito ao longo de um período de 2 min. A eluição de OTA foi avaliada utilizando as mesmas condições utilizadas para um perfil de eluição de ODS C18 regular (85% de acetonitrila). A retenção de OTA foi avaliada em 5 min com a coluna de MIP sob gradiente isocrático. Para aumentar o tempo de retenção de OTA, foi implementado um gradiente que permitia que a retenção de OTA aumentasse para 19,5 min.
[0198] As condições finais selecionadas são apresentadas na Figura 11 e a condição de gradiente é detalhada na tabela associada. Dois picos foram observados, o pico principal de OTA sendo eluído entre 17 e 22 min (a 63% de acetonitrila) e um segundo pico associado com uma fração de OTA altamente ligada remanescente liberada através da adição de tetraetilamina a 1% na coluna.
Exemplo 13 Síntese de molde de esporidesmina
[0199] Preparação de N-tert-butoxicarbonil-2,3-dimetoxianilina partindo do ácido 2,3-dimetoxibenzóico. Trezentos mililitros de álcool tert-butílico anidro, 50,0 g (274 mM) de ácido 2,3-dimetoxibenzóico e 28,33 g (280 mM, 39 mL) de trietiletilamina anidra são carregados em um frasco com dois gargalhos de fundo arredondado de 1 L, equipado com um funil de gotejamento de 120 mL com equilíbrio de pressão e medidor de bolhas de gás, barra de agitação magnética pesada e um termômetro. O conteúdo do frasco é agitado magneticamente e aquecido até 80oC em um banho de óleo. Uma quantidade de 77,04 g (280 mM, 60,5 mL) de fosforazidato de difenila é adicionada gota-a- gota na mistura com uma velocidade lenta o suficiente para controlar a evolução de produção de gases. O aquecimento a 80oC e a agitação magnética foram mantidos durante a noite. Os componentes voláteis da mistura foram então evaporados por rotação sob vácuo de 30 T e a uma temperatura abaixo de 55oC. O produto oleoso foi transferido em um funil de separação de 1 L e dissolvido em uma mistura de 500 mL de ciclohexano e 200 mL de acetato de etila. A solução foi lavada três vezes com 200 mL de água DI e uma vez com 200 mL de cloreto de sódio aquoso saturado e seca em sulfato de amônio anidro durante 15 min, filtrada e concentrada no evaporador giratório sob vácuo a 30 T a 80oC. N-tert-butoxicarbonil-2,3-dimetoxianilina 67,88 g (98% de rendimento) foram obtidos na forma de um óleo incolor.
[0200] TLC, SiO2, CH2Cl2:ciclohexano (abreviado como c-Hex) (1:2); Rf =0,66 detecção UV, quente 5% KMnO4 amarelo brilhoso.
[0201] FT-IR filme (cm-1): 3319, 2941, 1669, 1601, 1529, 1477, 1459, 1416, 1369 1296, 1258, 1090, 998, 978, 780, 737.
[0202] 1H RMN, (400MHz), CDCl3, δ (ppm): 1,53 s, 9H; 3.86 s, 3H; 3,862 s, 3H; 6,593 dd, J=8,4&1,6 Hz, 1H; 7,004 t, J=8,4&8,0, 1H; 7,135 br s, 1H; 7,725 d, J=8,0 Hz.
[0203] Preparação de 2,3-dimetoxianilina partindo de N-tert- butoxicarbonil-2,3-dimetoxianilina. Um volume de 580 mL de metanol, 67,88 g (268 mM) de N-tert-butoxicarbonil-2,3-dimetoxianilina e 66,45 mL de 12,1 M de HCl foram carregados em um frasco de 1 L equipado com uma barra de agitação magnética e colocado em banho maria de 50oC. O aquecimento e a agitação foram mantidos durante 2 h e então deixado com agitação durante a noite à temperatura ambiente. Então, após o resfriamento da solução em um banho de gelo, um volume de 130,5 mL de 6,16 M de hidróxido de sódio foi adicionado com agitação.
[0204] O metanol foi evaporado da mistura utilizando um evaporador giratório a uma temperatura abaixo de 40oC e sob pressão a vácuo de 30 T. O resíduo semi-sólido foi diluído com 180 mL de tolueno e filtrado. O precipitado foi lavado mais duas vezes com partes de 180 mL de tolueno e os filtrados foram transferidos em um funil de separação de 1 L. A camada superior foi coletada e seca com sulfato de sódio, concentrada e destilada a vácuo. Uma massa de 34,6 g de 2,3-dimetoxianilina (94,0% de rendimento) foi coletada a 105-107oC a 8 T na forma de óleo de cristalização incolor.
[0205] TLC, SiO2, c-Hex:Tetrahidrofurano (abreviado como THF) (6:1); Rf =0,35 detecção UV, 5% KMnO4 calor/marrom esverdeado.
[0206] FT-IR filme (cm-1): 3463, 3368, 2939, 1609, 1497, 1475, 1319, 1262, 1226, 1129, 1085,_1050, 999, 773, 729, 694.
[0207] 1H RMN, (400MHz), CDCl3, δ (ppm): 3,75 br s, 2H; 3,83 s, 3H; 3,84 s 3H; 6,34 d, J=8,1 Hz, 1H; 6,38 d, J=8,1Hz, 1H; 6,84 t, J=8,1Hz, 1H.
[0208] Síntese de 3-hidróxi-6,7-dimetóxi-2-indolona-3-carboxilato de etila partindo de 2,3-dimetoxianilina e dietilcetomalonato. Uma solução de 69,33 g (398,1 mM) de dietilcetomalonato em 250 mL de tolueno é colocada em um frasco de fundo arredondado de 1 L equipado em um funil de gotejamento com equilíbrio de ar e um bastão de agitação magnética colocado em um banho de gelo-água. Uma solução de 56,769 g (370,6 mM) de 2,3-dimetoxianilina em 200 mL de tolueno é carregada no funil de gotejamento. A agitação é iniciada e a solução de 2,3-dimetoxianilina é lentamente adicionada no frasco, com resfriamento e agitação magnética contínuos da mistura de reação. A adição foi completada no tempo de 4 h e foi permitido que a mistura aquecesse até a temperatura ambiente e deixada com agitação durante a noite durante um total de 22 h. Então, a mistura foi aquecida até 80oC durante 2 h e seguidas por um aumento da temperatura da mistura até 100oC. Um volume de 25 mL do destilado foi coletado. Um volume de 25 mL do destilado foi coletado, incluindo 4 mL de água e 21 mL de tolueno. Uma TLC SiO2 (PhMe:THF/6:1, UV, quente KMnO4 indicava a presença de: dietilcetomalonato Rf 0,86; 2,3-dimetoxianilida de monoetilcetomalonato Rf 0,66; 2,3-dimetoxianilina Rf 0,43; dietilcetomalonato monohidratado Rf 0,30 e o produto desejado, 3- hidróxi-6,7-dimetóxi-2-indolona-3-carboxilato de etila Rf 0,20. O aquecimento a 100oC foi continuado durante 24 h após as quais um precipitado branco foi formado no frasco. O conteúdo do frasco foi então agitado e aquecido a 80-90oC durante as 48 h seguintes. Após este tempo foi resfriado à temperatura ambiente e o precipitado foi extraído por filtração e lavado com 50 mL de tolueno. Após a secagem, 16,1 g de 3-hidróxi-6,7-dimetóxi-2-indolona-3-carboxilato de etila (24,0% de rendimento) foram obtidos. O filtrado foi concentrada em um evaporador giratório e submetido à LC em SiO2 utilizando mistura de c-Hex:THF com conteúdo de THF de 7,5 até 20%. 12,2 g adicionais (18,2% de rendimentos) de produto absolutamente puro foram coletados. Pf 150-151oC.
[0209] TLC, SiO2, Tolueno (abreviado como PhMe):THF (6:1), Rf =0,12 detecção UV, 5% KMnO4 calor/amarelo canário.
[0210] FT-IR filme (cm-1): 3293, 2937, 1728, 1726, 1636, 1505, 1466, 1336, 1236, 1234, 1164, 1084, 1016, 1192, 729.
[0211] 1H RMN, (400 MHz), CDCl3, δ (ppm): 1,191 t, J=7,2Hz, 3H; 3,892 s, 3H; 3,898 s, 3H; 4,152-4,319 m, 16 linhas, dqx2, todos J=7,2 Hz com os centros de quartetos a: 4,179, 4,205, 4,265, 4,292, 2H; 4,346 br s, 1H; 6,575 d, J=8,4 Hz, 1H, 6,961 dd, J=8,4&0,4 Hz, 1H; 7,744 br s, 1H.
[0212] Síntese de 6,7-dimetoxiisatina partindo de 3-hidróxi-6,7- dimetóxi-2-indolona-3-carboxilato de etila. Uma solução de 10,67 g (40,2 mM) de 3-hidróxi-6,7-dimetóxi-2-indolona-3-carboxilato de etila em 100 mL de etanol foi agitada em banho maria à temperatura ambiente. Nesta mistura uma solução de 4,828 g (120,7 mM) de hidróxido de sódio em 25 mL de água foi adicionada gota-a-gota. Uma corrente de ar, livre de CO2, foi passada pela mistura de reação que foi vigorosamente agitada. A passagem de ar e a agitação da mistura à temperatura ambiente foram mantidas durante a noite. A mistura recuperada era marrom avermelhada intensa. A solução foi neutralizada através da adição de 5 mL de hidroclórico ácido concentrado. O precipitado branco de sais inorgânicos que se formou foi extraído por filtração e o filtrado foi concentrado em um evaporador giratório até o volume de 20 mL e deixado para cristalização no refrigerador. Os cristais amarelos alaranjados foram coletados e secos em ar. Uma quantidade de 2,24 g (26,9% de rendimento) de 6,7- dimetoxiisatina pura foi obtida. Um adicional de 0,54 g (6,5% de rendimento) do produto foi separado do filtrado por cromatografia líquida utilizando mistura de SiO2 e PhMe:THF (4:1). Pf 209-210oC.
[0213] TLC, SiO2, PhMe:THF (6:1), Rf =0,18 ponto amarelo, detecção UV, 5% KMnO4 calor/ amarelo canário.
[0214] FT-IR filme (cm-1): 3218, 1747, 1707, 1623, 1507, 1452, 1442, 1337, 1286, 1240, 1184, 1082, 1041, 973, 949, 794, 685, 702, 662.
[0215] 1H RMN, (400 MHz), CDCl3, δ(ppm): 3,91 s 3H; 3,98 s 3H; 6,60 d, J=8,4 Hz, 1H; 7,42 d, J=8,4Hz, 1H; 7,74 br s, 1H.
[0216] Síntese de 6,7-dimetóxi-1-metilisatina partindo de 6,7- dimetoxiisatina. Uma solução de 2,255 g (20,1 mM) de tert-butanolato de potássio em 20 mL de THF anidro foi adicionada partindo de uma seringa através do septo de borracha, com agitação magnética e resfriamento em um banho de gelo-água, em um frasco de fundo arredondado de 50 mL contendo uma solução de 2,78 g (13,4 mM) de 6,7-dimetoxiisatina em 15 mL de THF anidro. Nesta mistura 3,8 mL (8,65 g, 60 mM) de iodeto de metila foram adicionados através de uma seringa e a mistura com precipitado pesado que se formou imediatamente foi agitada durante a noite a 35oC. A TLC (SiO2, PhMe:THF (6:1)) confirmou a conversão total do substrato (6,7- dimetoxiisatina) Rf= 0,18 na 6,7-dimetóxi-1-metilisatina Rf = 0,34. O precipitado foi extraído por filtração e lavado com três partes de 20 mL de THF anidro. Os filtrados combinados foram evaporados até a secura e o produto foi coletado na forma de uma fração corada de vermelho brilhoso da cromatografia instantânea. SiO2 e uma mistura de PhMe:THF (9:1) foram utilizados. Após a evaporação até a secura do eluente corado de vermelho, 2,517 g (84,8% de rendimento) de cristais amarelos brilhosos foram coletados. Pf 190-191oC.
[0217] TLC, SiO2, PhMe:THF (6:1), Rf = 0,34 ponto vermelho alaranjado, detecção UV, 5% KMnO4 calor/ amarelo canário.
[0218] FT-IR filme (cm-1): 2955, 1724, 1614, 1497, 1450, 1373, 1264, 1205, 1168, 1131, 1086, 1044, 1028, 979, 975, 828, 800, 775, 654.
[0219] 1H RMN, (400 MHz), CDCl3, δ (ppm): 3,490 s, 3H; 3,877 s, 3H; 3,982 s, 3H; 6,575 d, J=8,4 Hz, 1H; 7,416 d, J=8,4Hz, 1H.
[0220] Síntese de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina. Uma quantidade de 2,517 g (11,38 mM) de 6,7-dimetóxi-1-metilisatina e 1,823 g (13,65 mM) de N-clorosuccinimida e 30 mL de DMF foram colocados em um frasco de fundo arredondado de 100 mL equipado com uma barra de agitação magnética e um funil de gotejamento de 10 mL com equilíbrio de ar e colocado em um banho de gelo-água. Uma solução em 10 mL de 1,125 mL (13,6 mM) de hidroclórico ácido concentrado em DMF foi carregada no funil de gotejamento e adicionada gota-a-gota na mistura de reação agitada e resfriada. Após adição ter sido completada, a solução foi misturada à temperatura ambiente durante mais 2 h. Então os solventes foram evaporados de forma giratória sob vácuo a 8 T e a 50oC e o resíduo foi submetido à cromatografia instantânea em SiO2 utilizando mistura de PhMe:THF (19:1). Um eluente contendo uma banda vermelho tijolo do produto foi coletado e evaporado de forma giratória até a secura fornecendo 1,83 g (62,9% de rendimento) de cristais vermelho tijolo de 5-cloro-6,7- dimetóxi-1-metilisatina. Pf 140-142oC.
[0221] TLC, SiO2, PhMe:THF (6:1), Rf = 0,51 ponto vermelho, detecção UV, 5% KMnO4 calor/ amarelo canário.
[0222] UV/VIS (nm) c.-0,143 mg/mL em Etanol: 318, e 2,75, 433, e 0,70.
[0223] FT-IR filme (cm-1): 2951, 1726, 1602, 1457, 1442, 1423, 1404, 1359, 1292, 1263, 1232, 1093, 1046, 1005, 979, 941, 897, 881, 797, 766, 668.
[0224] 1H RMN, (400 MHz), CDCl3, δ (ppm): 3,475 s, 3H; 3,935 s, 3H; 4,027 s, 3H; 7434 s, 1H.
[0225] A estrutura molecular de esporidesmina e o molde de 5- cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina podem ser encontrados na Figura 12. A via de síntese é resumida na Figura 13.
Exemplo 14 Síntese de MIP e NIP de esporidesmina (com ácido metacrílico)
[0226] Uma solução de 1,8 g (7,04 mM) de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1- metilisatina, 1,194 mL (1,212 g, 14,08 mM) de ácido metacrílico, 3,415 mL (3,664 g, 28,16 mM) de 2-hidroxietilmetacrilato, 39,83 mL (41,86 g, 211,2 mM) de dimetacrilato de etileno glicol e 1,0 g (6,09 mM) de AIBN em 100 mL de tolueno é colocada em um frasco de fundo arredondado com quatro gargalos de 500 mL equipado com um funil de gotejamento de 120 mL com equilíbrio de gás, um agitador mecânico, um condensador de refluxo com medidor de bolhas e um termômetro. Um volume de 120 mL de tolueno é colocado no funil de gotejamento, o agitador é iniciado e o nitrogênio é passado através do tolueno (no funil de gotejamento) e sobre a superfície da mistura no frasco e liberado para fora através do medidor de bolhas. Após 30 min de agitação e corrente de nitrogênio, a vazão de gás é limitada a bolhas isoladas e a temperatura no frasco é aumentada para 65oC através da imersão do frasco em um banho maria de 70oC. Dentro de 15 min a polimerização começa e a solução se torna mais e mais viscosa. Quando for difícil manter uma agitação vigorosa, o tolueno do funil de gotejamento é adicionado o mais rápido possível, para diluir a amostra. A agitação vigorosa e o aquecimento são mantidos durante 4 h. Durante este tempo esferas pequenas do MIP são formadas. A mistura é deixada sem a agitação ou o aquecimento durante a noite. De manhã as esferas de MIP são extraídas por filtração e lavadas 13 vezes com 150 mL de etanol cada. Os filtrados corados de vermelho alaranjado são coletados, concentrados de forma giratória. A 5-cloro- 6,7-dimetóxi-1-metilisatina (molde de esporidesmina) é recuperada por cromatografia instantânea utilizando PhMe:THF (98:2) e coletando a banda vermelho tijolo do molde. A evaporação giratória forneceu 1,572 g (87,3% de recuperação) de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina cristalina muito pura. As esferas de MIP são secas em ar durante a noite à temperatura ambiente e uma hora adicional a 80oC em uma esfufa de laboratório.
[0227] Uma quantidade de 45,362 g de MIP de esporidesmina (ácido metacrílico) foi obtida na forma de esferas pequenas brancas casca de ovo e identificada como MIP #519-98.
[0228] O NIP de esporidesmina (ácido metacrílico) 45,883 g na forma de esferas branco neve, foi obtido seguindo o mesmo procedimento, entretanto, nenhum molde de esporidesmina foi adicionado na mistura de reação e apenas três lavagens com etanol (150 mL cada) foram realizadas. O polímero foi identificado como MIP #555-99.
[0229] Tanto MIP quanto NIP eram fáceis de filtrar e de lavar no filtro de vidro sinterizado.
Exemplo 15 Síntese de MIP e NIP de esporidesmina (com 2-vinilpiridina)
[0230] Uma solução de 1,5 g (5,86 mM) de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1- metilisatina, 1,260 mL (1,232 g, 11,72 mM) de 2-vinilpiridina, 2,845 mL (3,053 g, 23,46 mM) de 2-hidroxietil-metacrilato, 33,191 mL (34,833 g, 176 mM) de dimetacrilato de etileno glicol e 0,833 g (5,07 mM) de AIBN em 80 mL de tolueno é colocada em um frasco de fundo arredondado com quatro gargalos de 500 mL equipado com um funil de gotejamento de 100 mL com equilíbrio de gás, um agitador mecânico, um condensador de refluxo com medidor de bolhas e um termômetro. Um volume de 120 mL de tolueno é colocado no funil de gotejamento, o agitador é iniciado e o nitrogênio é passado através do tolueno (no funil de gotejamento) e sobre a superfície da mistura no frasco e liberado para fora através do medidor de bolhas. Após 30 min de agitação e corrente de nitrogênio a vazão de gás é limitada a bolhas isoladas e a temperatura no frasco é aumentada para 65oC através da imersão do frasco em um banho maria de 70oC. Dentro de 15 min a polimerização começa e a solução se torna mais e mais viscosa. Quando for difícil manter uma agitação vigorosa, o tolueno do funil de gotejamento é adicionado o mais rápido possível, para diluir a amostra. A agitação vigorosa e o aquecimento são mantidos durante 4 h. Durante este tempo esferas pequenas do MIP são formadas. A mistura é deixada sem a agitação ou o aquecimento durante a noite. Então, as esferas de MIP são extraídas por filtração e lavadas 13 vezes com 150 mL de etanol cada. Todos os filtrados da lavagem dos MIP’s são coletados e evaporados de forma giratória até a secura. O resíduo de coloração vermelha é dissolvido em 20 mL de tolueno e aplicado na parte superior de uma cromatografia líquida coluna (24 mm x 50 cm) preenchida com 200 mL de SiO2 em tolueno. A banda vermelha é lavada com PhMe:THF (5:1). A evaporação giratória forneceu 1,489 g (99,2% de recuperação) de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1- metilisatina cristalina. As esferas de MIP são secas em ar durante a noite à temperatura ambiente e durante mais duas horas a 80oC em uma esfufa de laboratório. Uma quantidade de 37,936 g de MIP de esporidesmina (2-vinilpiridina) foi obtida na forma de esferas pequenas brancas casca de ovo e identificada como MIP #519-101.
[0231] NIP de esporidesmina (2-vinilpiridina). Uma quantidade de 39,2 g na forma de esferas branco neve, foi obtida seguindo o mesmo procedimento, entretanto, nenhum molde de esporidesmina foi adicionado na mistura de reação e apenas três lavagens com etanol (150 mL cada) foram realizadas. O polímero foi identificado como MIP #555-102.
Exemplo 16 Polimerização/síntese de MIP’s de esporidesmina iniciada com UV, temperatura baixa.
[0232] Conjunto da reação fotoquímica. Quartzo, poço de imersão em UV fotoquímico (Ace Glass, Catálogo # 7856-10) equipado em Lâmpada de UV de 450 Watt (ACE Glass, Catálogo# 7825-34) e 450 Watt Cased Power Supply (ACE Glass, Catálogo#7830-58) é ligado a um resfriador de circulação WKL 230 LAUDA (fornecido pela Brinkmann Instuments, Inc.) e o resfriamento água de 4°C é corrido ao longo da manta do poço no momento em que a lâmpada de UV está ligada.
[0233] Processo de polimerização. Uma mistura de monômeros: ácido metacrílico 1,2 g (13,95 mM) e monometacrilato de etileno glicol 3,631 g (13,95 mM), molde de esporidesmina 1,783 g (6,97 mM), iniciador (IABN) 0,991 g (6,03 mM) e um agente de reticulação, dimetacrilato de etileno glicol 41,444 g (209,1 mM) são colocados em uma garrafa de polietileno transparente (Nalgene®stile 2105) e uma corrente de Argônio é passada através da mistura durante 15 min para remover todo o oxigênio, que é conhecido como inibidor da polimerização de radicais livres. A garrafa é então fechada e ligada ao poço de imersão, no nível do centro da lâmpada de UV e imersa, junto com o conjunto da reação fotoquímica, em um banho de gelo-água. A água de resfriamento é corrida ao longo da manta da lâmpada, quando a luz é ligada e a irradiação da mistura de reação é mantida durante três horas e meia (óculos de segurança para UV são necessários no momento em que a lâmpada de UV está ligada). É fornecido gelo adicional e o excesso de água é drenado do banho durante o curso da polimerização com UV, para manter a temperatura do banho de resfriamento a 4°C. Após completar a polimerização a garrafa é aberta, o polímero é triturado e moído em pedaços pequenos que são lavados: três vezes com etanol, duas vezes com mistura 1:1 de água- etanol, seis vezes com mistura 3:1 de água-etanol e mais uma vez com etanol, para remover o molde do polímero e assegurar a atividade máxima do MIP que é finalmente seco em uma esfufa de laboratório, para remover resíduos de etanol fornecendo 41,1 g (89% de rendimento) do produto.
Exemplo 17 Capacidades de sequestro dos MIPs para micotoxinas - aplicados aos análogos de esporidesmina
[0234] Os polímeros de MIP e de NIP produzidos através da polimerização iniciada com calor com precipitação utilizando ácido metacrílico ou monômeros de 2-vinilpiridina em tolueno (Ver, por exemplo, o Exemplo 14 e o Exemplo 15) foram testados para o molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina (Ver, por exemplo, o Exemplo 13) e gliotoxina, um análogo para a molécula de esporidesmina contendo o sistema de anel de piperazinadiona com pontes dissulfeto similares (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) para a remoção do molde e micotoxinas de gliotoxina dos meios líquidos ou semi-líquidos através de interações químicas. Os MIPs e os NIPs produzidos foram utilizados aqui para descrever as diferenças na afinidade de sequestro. Um experimento de sequestro foi conduzido pesando 400 mg de material de MIP/NIP em garrafas Schott âmbar e da adição de 100 mL de uma solução de trabalho do analito investigado para a obtenção de uma taxa de inclusão de 0,4 g/L dos sequestrantes no meio. A preparação foi feita junto com um branco de amostra que não contém material de MIP e um controle positivo que contém o molde de 5-cloro- 6,7-dimetóxi-1-metilisatina ou gliotoxina. O teste de sequestro foi realizado em tampão citrato a 50 mM ajustado em pH 4,0. Todas as amostras foram incubadas durante 90 min em um agitador giratório orbital (Brunswick, Champaign, IL, USA) a 150 rpm mantido a uma temperatura de 37°C. Cinco concentrações finais do molde de 5-cloro- 6,7-dimetóxi-1-metilisatina ou gliotoxina foram testadas com o sistema - 500; 1.000; 1.500; 2.000; 2.500 partes por bilhão (ppb) ou 1.000; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000. Após a incubação as preparações foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi coletado em frascos para HPLC âmbar e silanizados, prevenindo qualquer interação da micotoxina ou do molde com o frasco e calculado partindo da HPLC (Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA) acoplada a detectores de sinal de arranjo de fotodiodos (por exemplo, para detectar quantidades de micotoxina e micotoxina sequestrada) de acordo com métodos padronizados. A análise de HPLC para gliotoxina foi realizada utilizando uma mistura de acetonitrila/ácido acético/ácido trifluoroacético (34,9:65:0,1, v/v) como a fase móvel. O método de HPLC para a detecção do molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina foi selecionado de acordo com os parâmetros de eluição padronizados para análise de esporidesmina consistindo de uma mistura de acetonitrila/água/metanol (45:45:10, v/v). Adetecção foi realizada no arranjo de fotodiodos de U.V. com varredura completa de comprimento de onda (268,1 nm forneceu o sinal ótimo para gliotoxina; 258,8 nm forneceu o sinal ótimo para o molde).
Figure img0009
[0235] Os resultados mostraram que MIP #519-98 e #519-101 e NIP #519-99 e #519-10X eram capazes de interagir com mais de 90,8% da gliotoxina testada entre 500 até 2.500 ppb para um nível de inclusão de 0,4% dos adsorventes em pH 4,0 (Ver a Tabela 8). A adsorção do molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina também foi investigada fornecida uma afinidade de mais de 94,9% para MIP #519- 98 e #519-101 e NIP #519-99 e #519-10X para concentrações do molde entre 1.000 até 5.000 ppb da molécula molde presente no meio em pH 4,0 para um nível de inclusão de 0,4% dos adsorventes (Tabela 8). Assim, em algumas modalidades, a presente invenção mostra que os MIPs sintetizados em tolueno eram favoráveis à adsorção de ambos os análogos de esporidesmina (por exemplo, gliotoxina e molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina) com uma ligeira vantagem para o MIP #519-101 sintetizado utilizando monômeros de 2-vinilpiridina quando adicionados a uma taxa de inclusão de 4 g/L sob pH 4,0 com afinidades de sequestro de até 97,82 ± 4,25% de taxa de afinidade e 95,85 ± 1,25% respectivamente para gliotoxina e molde de 5-cloro-6,7- dimetóxi-1-metilisatina. A diferença entre o MIP e o NIP era mínima para qualquer uma das formulações preparadas. Tabela 8. Afinidade de adsorção média expressa em porcentagem para 2 MIPs e 2NIPs para o molde de 5-cloro-6,7- dimetóxi-1-metilisatina e gliotoxina avaliada em pH 4,0 e 0,4% de nível de inclusão do adsorvente.
Exemplo 18
[0236] Titulação da quantidade de MIP para o sequestro de análogos de esporidesmina
[0237] Um experimento de titulação foi conduzido para investigar as taxas de inclusão de MIP, partindo de 0,1 g/L até 1,00 g/L (ou 0,01 até 0,1% de taxa de inclusão). A preparação foi feita junto com um branco de amostra que não contém material de MIP e um controle positivo que contém apenas o molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina ou gliotoxina que será testada. O teste de sequestro foi realizado em tampão citrato a 50 mM ajustado em pH 4,0. Todas as amostras foram incubadas durante 90 min em um agitador giratório orbital (Brunswick, Champaign, IL, USA) a 150 rpm mantido a uma temperatura de 37°C. Cinco concentrações finais de molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1- metilisatina ou gliotoxina foram testadas com o sistema, 1.000; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000 ppb em um volume final de 100 mL. Após a incubação os tubos de microcentrífuga foram centrifugados a 10.000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi coletado em frascos para HPLC âmbar e silanizados, prevenindo qualquer interação do analito com o frasco e calculado partindo da HPLC (Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA) acoplado com os detectores de sinal de arranjo de diodos de acordo com métodos padronizados (Ver, por exemplo, o Exemplo 17). Tabela 9. Afinidade de adsorção média expressa em porcentagem para 2 MIPs e 3NIPs para o molde de 5-cloro-6,7- dimetóxi-1-metilisatina avaliada em pH 4,0 e 4 níveis de inclusão do adsorvente.
Figure img0010
[0238] Como mostrado na Figura 14, na Tabela 9 e na Tabela 10, em algumas modalidades, por exemplo, a 0,05 g/L de nível de inclusão do adsorvente, a presente invenção mostrou uma eficácia ótima acima de 70% do valor de sequestro e atingiu quase 90% de sequestro a 0,10 g/L. Assim, em algumas modalidades, a presente invenção mostra que os MIPs/NIP sintetizados com ácido metacrílico são mais favoráveis em relação aos MIP/NIP sintetizados utilizando 2- vinilpiridina para a adsorção de um análogo de esporidesmina (por exemplo, gliotoxina e molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina (por exemplo, quando adicionado a uma taxa de inclusão entre 0,01 e 0,1 g/L sob pH 4,0)). As diferenças entre o MIP e o NIP eram, entretanto, mínimas para qualquer uma das formulações preparadas exceto para o NIP sintetizado na polimerização iniciada com temperatura baixa e UV com valores de adsorção crescentes com o nível de inclusão do adsorvente de 10 até 15%. Tabela 10. Características de adsorção isotérmica in vitro de NIP e MIP em quatro taxas de inclusão diferentes ao molde de Esporidesmina em meio de tampão citrato de pH4.
Figure img0011
Exemplo 19 Afinidade de MIP e NIP diferentes e caracterização de especificidade para análogos de esporidesmina
[0239] Os experimentos foram realizados durante o desenvolvimento das modalidades da invenção com a finalidade de avaliar a afinidade de NIPs/MIPs diferentes sintetizados em tolueno como solvente utilizado para a polimerização iniciada com calor com precipitação. O MIP produzido foi utilizado aqui para descrever as diferenças em afinidade de sequestro dos análogos de esporidesmina (por exemplo, gliotoxina e molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina) e para avaliar a especificidade do material. Uma quantidade de 30 mg de MIP foi colocada sobre uma coluna SEP-PAK ajustada com fritas para extração em fase sólida de polietileno silanizadas. Os frascos de vidro silanizados foram utilizados para garantir a estabilidade do analito em solventes aquosos e para prevenir qualquer interação inespecífica entre o analito e os frascos de vidro. O método de silanização foi aplicado em filtros e tubos de nylon e PTFE/PE com base nos métodos geralmente utilizados na arte. A preparação foi feita junto com um branco de amostra que não contém material de MIP e um controle positivo que contém o molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1- metilisatina ou gliotoxina. Os dispositivos de filtração semelhantes à Extração em Fase Sólida (semelhante à SPE) foram gerados para um equivalente de 0,1 g/L de inclusão do MIP através de filtração ao longo de 30 mg de material de 1 mL de uma solução de molde de 5-cloro- 6,7-dimetóxi-1-metilisatina ou gliotoxina. Os frascos e os filtros foram preparados enchendo os mesmos ou mergulhando os mesmos com reagente de silanização (SURFASIL, Ver, por exemplo, o Exemplo 9). Os dispositivos filtrantes semelhantes à SPE foram carregados com uma solução de 1 mL de molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina ou gliotoxina utilizada em uma concentração única de 2.000 ppb. Junto com as amostras, uma solução de trabalho de controle foi mantida. As amostras e os controles foram incubados a 37°C durante 2 min com agitação intermitente. Após o período de incubação, as amostras foram empurradas através da seringa e foram coletadas em tubos de centrífuga de 15 mL e centrifugadas a 10.0000 g durante 10 min. O sobrenadante foi coletado em frascos para HPLC âmbar e silanizados e analisado. Para avaliar a especificidade da dessorção para a molécula alvo, seis etapas de lavagem foram realizadas sobre o material contendo os polímeros de MIP. Cada uma das lavagens foi coletada em tubos de centrífuga de 15 mL e centrifugada a 10.0000 g durante 10 min antes da análise por HPLC. Seis lavagens foram realizadas com concentração crescente de solvente orgânico, que incluíam uma primeira lavagem com 50 mM de tampão de lavagem de citrato e cinco lavagens consecutivas com 20, 40, 60, 80, 100% de metanol em água (v/v), respectivamente. O experimento utilizava os MIP #519-98 e #519-101 e NIP #519-99 e #519-10X (formas de pó) polimerizados precipitados com início com aquecimento previamente junto com formas cristalinas de MIP e NIP identificadas como #519-47 e #519-47X que foram geradas por polimerização sob temperatura baixa e UV (Ver, por exemplo, o Exemplo 5). O sobrenadante foi coletado em frascos para HPLC âmbar e silanizados, prevenindo qualquer interação da micotoxina ou do molde com o frasco e calculado partindo da HPLC (Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA) acoplado a detectores de sinal de arranjo de fotodiodos (por exemplo, para detectar quantidades de micotoxina e micotoxina sequestrada) de acordo com métodos padronizados. A análise de HPLC para gliotoxina foi realizada utilizando uma mistura de acetonitrila/ácido acético/ácido trifluoroacético (34,9:65:0,1, v/v) como a fase móvel. O método de HPLC para a detecção do molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina foi selecionado de acordo com os parâmetros de eluição padronizados para análise de esporidesmina consistindo de uma mistura de acetonitrila/água/metanol (45:45:10, v/v). A detecção foi realizada no arranjo de fotodiodos de U.V. com varredura completa de comprimento de onda (268,1 nm forneceu o sinal ótimo para gliotoxina; 258,8 nm forneceu o sinal ótimo para o molde).
[0240] Os resultados indicavam (Ver a Figura 15 e a Tabela 11) que os MIPs #519-101 e #519-98 tinham valores de dessorção menores quando lavados com 40% de metanol comparados com seus respectivos NIP #519-10X e #519-99 para a adsorção de gliotoxina. As lavagens contendo mais de 60% de metanol eram, entretanto, capazes de remover quase a quantidade toda de gliotoxina sequestrada. Em alguma modalidade, o MIP #519-101 sintetizado utilizando monômeros de 2-vinilpiridina tinha maior especificidade que o NIP #519-10X correspondente e os NIP #519-99, MIP #519-98, NIP #519-47X e MIP 519-47 quando lavagens utilizando 20% de metanol foram aplicadas no sistema. Os polímeros 519-47X e 519-47 não eram capazes de adsorver mais de 25% da gliotoxina. A aplicação de uma lavagem com tampão era capaz de remover qualquer gliotoxina adsorvida.
[0241] Os resultados indicavam (Ver a Figura 16 e a Tabela 11) que o MIPs #519-101 tinha valores de dessorção menores quando lavado com 20 e 40% de metanol comparado com seu respectivo NIP #519-10X. A especificidade de MIP #519-98 e NIP #519-99 era, entretanto, comparável sem diferença na especificidade para a adsorção de molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina. As lavagens contendo mais de 60% de metanol eram, entretanto, capazes de remover quase a quantidade toda de molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1- metilisatina sequestrado. Em alguma modalidade e como observado com gliotoxina, o MIP #519-101 sintetizado utilizando monômeros de 2-vinilpiridina tinha maior especificidade que o correspondente NIP #519-10X e os NIP #519-99, MIP #519-98, NIP #519-47X e MIP 51947 quando lavagens utilizando 20 e 40% de metanol foram aplicadas no sistema. Os polímeros 519-47X e 519-47 exibiam diferença na especificidade de sequestro a favor do composto de MIP. Entretanto, apesar da adsorção do molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina ser inferior a 50 %, este apresentava uma afinidade melhor que a observada com gliotoxina exibindo uma especificidade melhor do MIP para o molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina. Tabela 11. Propriedades de adsorção de 3 MIPs, 3NIPs, para o molde de 5-cloro-6,7-dimetóxi-1-metilisatina e gliotoxina em pH 4,0 em uma configuração de SPE a 0,1% de nível de inclusão do adsorvente e sobrevivência às lavagens tituladas com metanol com uma mistura de tampão citrato (solução A) e metanol (solução B).
Figure img0012
Exemplo 20 Capacidades de sequestro dos MIPs para micotoxinas - aplicadas para esporidesmina
[0242] O polímero de MIP produzido utilizando monômeros de 2- vinilpiridina em tolueno (Ver, por exemplo, o Exemplo 15) foi testado para esporidesmina (AgResearch Limited, Ruakura Research Centre, Hamilton, Nova Zelândia) para a remoção das micotoxinas esporidesmina (A 93%; B, D, E 2 até 17%) dos meios líquidos ou semilíquidos através de interações químicas. O MIP produzido foi utilizado para caracterizar a afinidade de sequestro e para avaliar a especificidade do material. Um experimento de sequestro foi conduzido pesando 50 e 400 mg de material de MIP em garrafas Schott e da adição de 100 mL de uma solução de trabalho de mistura de esporidesmina fornecidos 0,5 e 4,0 g/L de taxa de inclusão do adsorvente no meio. A preparação foi feita junto com um branco de amostra que não contém material de MIP e um controle positivo que contém apenas as esporidesminas. O teste de sequestro foi realizado em tampão succinato a 50 mM ajustado em pH 6,0 para satisfazer as condições fisiológicas do compartimento gástrico do rúmen. Todas as amostras foram incubadas durante 90 min em um agitador giratório orbital a 150 rpm mantido a uma temperatura de 37°C. Três concentrações finais de esporidesminas foram testadas com o sistema, 500; 1.000; 2.000 ppb. Após a incubação as preparações foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi coletado em frascos para HPLC e calculado partindo da HPLC acoplada ao detector de sinal de UV (por exemplo, para detectar quantidades de micotoxina e micotoxina sequestrada) de acordo com métodos padronizados. O método de HPLC para a detecção de esporidesminas utilizava uma mistura de acetonitrila/água/metanol (45:45:10, v/v) para realizar a eluição dos analitos e uma coluna C18 (4,6 mm x 25 cm). A detecção foi realizada no detector de U.V. (280 nm forneceu o sinal ótimo para esporidesminas).
[0243] O produto MIP #519-98 adsorvia 80,5 até 85,7% para uma taxa de inclusão de 0,5 g/L e mais de 98,5% quando utilizado a uma taxa de inclusão de 4 g/L de esporidesmina presente a 500; 1.000 e 2.000 ppb (Ver, por exemplo, a Tabela 12). A variação entre repetições era responsável por menos de 1% da adsorção. Um ligeiro efeito de saturação podia ser observado a 0,5 g/L de taxa de inclusão com um decréscimo do valor de adsorção obtido ao longo de toda a faixa de esporidesmina investigada. Tabela 12. Eficácia de adsorção de MIP #519-98 na taxa de inclusão de 0,5 e 4,0 g/L para 3 concentrações de esporidesmina.
Figure img0013
[0244] Todas as publicações e patentes mencionadas no pedido de patente acima são incorporadas aqui como referência. Várias modificações e variações das composições e dos métodos descritos da invenção serão evidentes para os peritos na arte sem se afastar do âmbito e do espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em associação com modalidades preferidas específicas, deve ser entendido que a invenção como é reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas. Na verdade, é pretendido que várias modificações dos modos descritos para a realização da invenção que são óbvias para os peritos na arte estejam dentro do âmbito da presente invenção.

Claims (10)

1. Composição compreendendo um polímero de impressão molecular CARACTERIZADA pelo fato de que dito polímero de impressão molecular é sintetizado utilizando um molde de micotoxina de N-(2-hidróxi-3,5-diclorobenzoil)-L-fenilalanina.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o polímero de impressão molecular é feito pelo fornecimento de molde de N-(2-hidróxi-3,5- diclorobenzoil)-L-fenilalanina e um ou mais monômeros e um ou mais agentes de reticulação sob condições que permitam a polimerização do dito um ou mais monômeros e um ou mais agentes de reticulação na presença do molde.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais monômeros são selecionados do grupo que consiste de 2-vinilpiridina, 2- hidroxietilmetacrilato e ácido metacrílico.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito um ou mais agentes de reticulação compreendem dimetacrilato de etileno glicol.
5. Método de produção de um polímero de impressão molecular conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) fornecer: i. um molde de micotoxina; e ii. um ou mais monômeros e um ou mais agentes de reticulação; e b) contatar o dito molde de micotoxina com o dito um ou mais monômeros e o dito um ou mais agentes de reticulação sob condições que permitam a polimerização do dito um ou mais monômeros e o dito um ou mais agentes de reticulação na presença do dito molde de micotoxina
6. Método de sequestro de uma micotoxina partindo de um material, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) fornecer: i) um material que compreende micotoxinas; e ii) uma composição compreendendo um polímero de impressão molecular conforme definida nas reivindicações 1 a 4; e b) contatar o dito polímero de impressão molecular com o dito material que compreende micotoxinas sob condições que permitam que o dito polímero de impressão molecular se ligue à dita micotoxina.
7. Método da reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método sequestra ocratoxina A do o dito material.
8. Uso de uma composição compreendendo um polímero de impressão molecular conforme definida nas reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de ser para sequestrar micotoxina de um material.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito material que compreende micotoxinas é selecionado do grupo que consiste de uma bebida, uma matéria alimentícia, um alimento para animais, uma composição farmacêutica, uma composição nutracêutica, uma composição cosmética e uma substância necessária para manter a vida.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de que as micotoxinas são analisadas de forma qualitativa e quantitativa após remoção dos ditos polímeros de impressão molecular e utilizada para a possibilidade de rastreamento.
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