KR101406960B1 - 합성 마이코톡신 흡착제 및 이의 제조 및 활용 방법 - Google Patents

합성 마이코톡신 흡착제 및 이의 제조 및 활용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 분자 각인 고분자들(MIPs)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대량 생산 가능한 재사용가능하며, 생태친화적인 MIPs, 이를 생산하는 방법, 및 이를 활용하는 방법(예를 들면, 표적 화합물(예를 들면, 마이코톡신)을 격리 및/또는 흡착)에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법들은 식이 요법, 예방, 음식 및 음료 가공 및 제조 뿐만 아니라, 연구, 품질 통제 및 이력추적의 다양한 적용 분야에 활용된다.

Description

합성 마이코톡신 흡착제 및 이의 제조 및 활용 방법{SYNTHETIC MYCOTOXIN ADSORBENTS AND METHODS OF MAKING AND UTILIZING THE SAME}
본 발명은 일반적으로 분자 각인 고분자들(molecularly imprinted polymers: MIPs)에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 재활용 가능하며, 생태 친화적인 MIPs, 이를 생산하는 방법 및 이를 활용하는 방법(예를 들면, 표적들(예를 들면, 마이코톡신)을 격리 및/또는 흡착시키는)에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법들은 식이요법, 치료, 예방, 음식 및 음료 가공 및 제조 뿐만 아니라 연구 및 품질 통제 등과 같은 다양한 용도로 활용될 수 있다.
마이코톡신(mycotoxin)은 다양한 균류에 의해 분비되는 2차 대사물질이며, 수확 전, 수확 중 및 수확 후에 곡물 및 사료에서 자주 생산된다. 사료와 곡물들은 자연적으로 균류 포자와 접촉한다. 식물의 균류 오염과 톡신(toxin)의 생합성은 수확 전의 식물의 건강 상태, 대사적 조건, 수확 기술, 지연, 및 보존 및 음식 가공을 위한 안정화 전의 수열 조건 등에 의존한다. 균류에 따라, 균류 성장은 자유수(free water)의 양, 온도, 산소의 존재, 기질의 성질 및 pH 조건을 포함하는 다양한 물리화학적 변수들에 의해 조절된다. 마이코톡신은 수확 전 뿐만 아니라 수확 후 저장 상태에서도 증식한다.
일부 균류들은 특정 레벨의 습도, 온도 또는 산소에서만 톡신을 생산한다. 마이코톡신의 효과는 그 심각성의 정도에서 매우 다양하다. 일부 마이코톡신은 치명적이고, 일부는 식별가능한 질병 혹은 건강 문제를 야기하며, 일부는 그 마이코톡신에 특이적인 증상을 생성함이 없이 면역계를 약화시키며, 일부는 알레르겐(allergen) 혹은 자극성 물질로 작용하며, 일부는 동물 혹은 인간에 공지된 효과를 갖지 않는다. 세계 제2 차 대전 중에, 러시아군은 Fusarium으로 오염된 곰팡이핀 곡물을 섭취한 후 심각한 피부 괴사, 출혈 및 골수 파괴를 겪었다. 그러나, 영국에서 100,000 마리 이상의 칠면조들이 치명적 간 질병(Turkey X 병)에 의해 대량 사망한 1960년대가 되어서야, 과학계에서 마이코톡신과 연관된 부정적 효과가 인식되었다(예를 들면, TrenholmCharmley L.L., and Prelusky D.B., 1996. Mycotoxin binding agents: An update on what we know. In: Biotechnology in the Feed Industry (Lyons T. P and Jacques K.A eds.) Nottingham University Press, Loughborough, Leics, UK, pp. 327-349 참조). 최근의 UN의 식량농업기구(Food and Agriculture Organization: FAO)의 보고에 따르면, 전세계 곡물 공급의 대략 25%가 마이코톡신으로 오염되었다. 마이코톡신 오염은 음식 및 식량 공급자, 특히 곡물 및 가금류 공급자들에 부정적인 경제적 효과를 미친다.
마이코톡신은 식물 생산품(예를 들면, 여물, 곡물, 식물성 단백질, 가공된 곡물 부산물, 조사료 및 당밀 생산품)의 균류 감염의 결과로 식품 체인(food chain)에 등장할 수 있으며 인간에게 직접 섭취되거나 오염된 곡물, 가축 혹은 다른 동물 사료에 의해 도입될 수 있다. 마이코톡신은 소화 중 분해로부터 상당한 저항성을 가지며, 이에 따라 식용가능한 생산품들(예를 들면, 고기, 생선, 계란 및 유제품) 내 또는 소화된 모 톡신의 대사물질의 형태로서 상기 식품 체인 내에 존재한다. 가열 및 냉동과 같은 온도 처리는 마이코톡신의 발현을 감소시키는 적절한 방법이 아니다. 따라서, 사료 및/또는 식품 체인에서 발현하는 마이코톡신을 제거하거나 이의 위해적인 효과를 감소시키기 위한 조성물 및/또는 방법들에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 분자 각인 고분자들(MIPs)에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 본 발명은 재활용 가능하며, 생태 친화적인 MIPs, 이를 생산하는 방법 및 이를 활용하는 방법(예를 들면, 표적들(예를 들면, 마이코톡신)을 격리 및/또는 흡착시키는)에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법들은 식이요법, 치료, 예방, 음식 및 음료 가공 및 제조 뿐만 아니라 연구 및 품질 통제 등과 같은 다양한 용도로 활용될 수 있다.
이에 따라, 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 마이코톡신 템플릿을 사용하여 합성된 분자 각인 고분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 분자 각인 고분자를 생성하는데 활용되는 마이코톡신 템플릿에 제한되지 않는다. 실제로, 비제한적인 예로서, 아세톡시시르펜네디올(acetoxyscirpenediol), 아세틸데옥시니발레놀(acetyldeoxynivalenol), 아세틸니발레놀(acetylnivalenol), 아세틸네오졸라니올(acetylneosolaniol), 아세틸 T-2 톡신(acetyl T-2 toxin), 아플라톡신(aflatoxin), 아플라톡신 B1, B2, G1 및 G2, 아플라트렘(aflatrem), 알테누산(altenuic acid), 알테르나리올(alternariol), 오스트디올(austdiol), 오스트아미드(austamide), 오스토시스틴(austocystin), 아베나세인(avenacein) +1, 부베리신(beauvericin) +2, 벤테놀리드(bentenolide), 브레비안아미드(brevianamide), 부테놀리드(butenolide), 칼로넥트린(calonectrin), 케토글로보신(chaetoglobosin), 케토신(chaetocin), 케토민(chaetomin), 시트리닌(citrinin), 시트레오비리딘(citreoviridin), 코클리오디놀(cochliodinol), 사이토칼라신(cytochalasins), 시클로피아존 산(cyclopiazonic acid), 데아세틸칼로넥트린(deacetylcalonectrin), 데아세틸네오졸라니올(deactylneosolaniol), 데옥시니발레놀 디아세테이트(deoxynivalenol diacetate), 데옥시니발레놀 모노아세테이트(deoxynivalenol monoacetate), 디아세톡시시르페놀(diacetoxyscirpenol), 데스트럭신(destruxin) B, 에메스트린(emestrin), 엔니아틴(enniatins), 에르긴(ergine), 에르고코닌(ergocornine), 에르고크리스틴(ergocristine), 에르고크립틴(ergocryptine), 에르고메트린(ergometrine), 에르고닌(ergonine), 에르고신(ergosine), 에르고타민(ergotamine), 에르고발린(ergovaline), 리세르골(lysergol), 리세르긴 산(lysergic acid) 및 연관 에피머들과 같은 에르고트(ergot) 알칼로이드 톡신들 및 내생균(endophyte), 프럭티게닌(fructigenin) +1, 푸마길린(fumagilin), 푸모니신(fumonisins), 푸모니신 A1, A2, B1 및 B2 및 B3, 푸사레논(fusarenon)-X, 푸사로크로마논(fusarochromanone), 푸사르산(fusaric acid), 푸사린(fusarin), 글리오톡신(gliotoxin), HT-2 톡신, 하이알로덴드린(hyalodendrin), 이포메아닌(ipomeanine), 이슬란디톡신(islanditoxin), 이소푸미각라빈(isofumigaclavines) A 및 B, 라테리틴(lateritin) +1, 렙토신(leptosin), 리코마라스민(lycomarasmin) +1, 말포르민(malformin), 말토리진(maltoryzine), 모닐리포르민(moniliformin), 모노아세톡시시르페놀(monoacetoxyscirpenol), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 네오졸라니올(neosolaniol), 니발레놀(nivalenol), NT-1 톡신, NT-2 톡신, 오크라톡신(ochratoxin), 오오스포레인(oosporein), 옥살산(oxalic acid), 파스팔리트렘(paspalitrem) A 및 B, 파툴린(patulin), 페니실린산(penicillic acid), 페니트렘(penitrem), 포몹신(phomopsins), PR-톡신, 로리딘(roridin) E, 로큐포르틴(roquefortine) A 및 B, 루브라톡신(rubratoxin), 루브로스키린(rubroskyrin), 루브로설핀(rubrosulphin), 루굴로신(rugulosin), 삼부시닌(sambucynin) +1, 사트라톡신(satratoxins) F,G,H, 시르펜트리올(scirpentriol), 시로데스민(sirodesmin), 슬라프라민(slaframine), 스포리데스민(sporidesmin), 스테리그마토시스틴(sterigmatocystin), 스와인소닌(swainsonine), T-1 톡신, T-2 톡신, 테누아조산(tenuazoic acid), 트리아세톡시시르펜디올(triacetoxyscirpendiol), 트리코테센(trichothecenes), 트리코데르민(trichodermin), 트리코테신(trichothecin), 트리코베린(trichoverrins), 트리코베롤(trichoverrols), 트립토퀴발렌(tryptoquivalene), 베루카린(verrucarin), 베루쿨로겐(verruculogen), 버티실린(verticillins), 비오푸르푸린(viopurpurin), 비오멜레인(viomellein), 비리디톡신(viriditoxin), 보르트만닌(wortmannin), 크산토실린(xanthocillin), 야바니신(yavanicin)+1, 제아랄레놀(zearalenols), 제아랄라논(zearalanones), 제아랄레논(zearalenone), α, β, 제아랄라논, α, β, 제라놀(zeranol) 및 이들의 서브패밀리 및/또는 유도체들 및/또는 콘쥬게이트들(conjugates)을 포함하는 다양한 마이코톡신 템플릿들이 활용될 수 있다. 일부 바람직한 실시예들에 있어서, 상기 마이코톡신 템플릿은 OTA 이다. 다른 바람직한 실시예들에 있어서, 상기 마이코톡신 템플릿은 스포리데스민 혹은 에르고트 알칼로이드이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 오크라톡신 템플릿은 N-(2-히드록시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌(N-(2-hydroxy-3,5-dichlorobenzoyl)-L-phenylalanine)이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 스포리데스민 템플릿은 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴(5-chloro-6,7-dimethoxy-1-methylisatine)이다. 그러나, 본 발명은 이러한 오크라톡신 또는 스포리데스민 템플릿들에 제한되는 것은 아니다. 실제로 N-터트-부톡시카르보닐-2,3-디메톡시아닐린(N-tert-butoxycarbonyl-2,3-dimethoxyaniline), 2,3-디메톡시아닐린, 에틸 3-히드록시-6,7-디메톡시-2-인돌론-3-카르복실레이트(ethyl 3-hydroxy-6,7-dimethoxy-2-indolone-3-carboxylate), 6,7-디메톡시이사틴(6,7-dimethoxyisatine) 또는 6,7-디메톡시-1-메틸리사틴을 포함하는 다양한 템플릿들이 활용될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 분자 각인 고분자를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 마이코톡신 템플릿, 일 이상의 모노머들 및 일 이상의 가교제들(crosslinkers)을 제공하는 단계; 및 상기 마이코톡신 템플릿의 존재 하에서 상기 일 이상의 모노머들 및 상기 일 이상의 가교제들의 중합이 가능한 조건에서 상기 마이코톡신 템플릿과 상기 일 이상의 모노머들 및 상기 일 이상의 가교제들을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 마이코톡신 템플릿은 N-(2-히드록시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 마이코톡신 템플릿은 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴이다. 본 발명은 활용되는 마이코톡신 템플릿에 제한되지 않는다. 실제로, 다양한 합성 분자들이 마이코톡신 템플릿으로 활용될 수 있으며, 상기 합성 분자들은 천연 마이코톡신의 일 이상의 구조, 형태 및/또는 다른 화학적 특성들을 모방한 것이다. 또한, 본 발명은 활용되는 모노머들의 종류에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진자들에게 다양한 모노머들이 공지되어 있으며, 이의 비제한적인예들은 2-비닐피리딘, 2-히드록시에틸메타크릴레이트 및 메타크릴산(methacrylic acid)을 포함한다. 또한 본 발명은 활용되는 상기 가교제의 종류에 제한되지 않는다. 예를 들면, 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진자들에게 다양한 가교제들이 공지되어 있으며, 이의 비제한적인 예는 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 중합은 55 내지 110℃ 사이의 온도에서 유기 용매 내에서 자유 라디칼들을 형성함으로써 개시되며, 더 낮은 온도(예를 들면, 50, 45, 40, 35, 30℃ 혹은 그 이하) 및 더 높은 온도(예를 들면, 115, 120, 125, 130℃ 혹은 그 이상)도 가능하다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 자유 라디칼들은 열적으로 개시되는 아조이소부티로니트릴(azoisobutyronitrile: AIBN)의 분해에 의해 형성된다. 본 발명은 활용되는 유기 용매의 종류에 의해 제한되지 않는다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 용매는 톨루엔, 시클로헥산, 아세토니트릴, 폴리비닐 알코올(PVA)/물 용액, 및 톨루엔, 시클로헥산, 아세토니트릴 및 폴리비닐 알코올(PVA)/물 용액 중 2 이상의 혼합물이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 온도는 55 내지 75℃ 이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 마이코톡신 템플릿은 상기 일 이상의 모노머들 및 상기 일 이상의 가교제들의 중합 후에 상기 분자 각인 고분자로부터 제거된다. 일부 실시예들에 있어서, 용액에 의한 일 이상의 세척이 수행되어 상기 분자 각인 고분자로부터 상기 마이코톡신 템플릿을 제거한다. 본 발명은 세척을 위해 활용되는 용액의 종류에 의해 제한되지 않는다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 용액은 유기 용매, 완충액, 물 혹은 이들의 조합이다. 본 발명은 활용되는 유기 용매의 종류에 의해 제한되지 않는다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 용매는 에틸 알코올, 메틸 알코올, 아세토니트릴, 톨루엔 및/또는 이들의 혼합물이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 완충액은 수산화나트륨(sodium hydroxide), 시트르산, 숙신산 및 아세트산을 반응시켜 제조된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 물은 탈이온수이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 분자 각인 고분자는 상기 일 이상의 세척 후에 건조된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 분자 각인 고분자는 20 내지 90℃(예를 들면, 60 내지 80℃, 75 내지 80℃) 범위의 온도에 노출시킴으로써 건조되며, 더 낮거나 높은 온도도 가능하다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 물질로부터 마이코톡신을 격리시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다: 마이코톡신을 포함하는 물질 및 마이코톡신 템플릿의 존재 하에 일 이상의 모노머들과 일 이상의 가교제들의 중합을 통해 생성되는 분자 각인 고분자를 제공하는 단계; 및 상기 분자 각인 고분자가 상기 마이코톡신에 결합이 가능한 조건에서 상기 분자 각인 고분자를 상기 마이코톡신을 포함하는 물질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 상기 물질로부터 격리된(예를 들면, 격리를 위해 표적화되는) 마이코톡신의 종류에 의해 제한되지 않는다. 실제로 다양한 종류의 마이코톡신들이 격리될 수 있다. 이의 비제한적인 예들은 아세톡시시르펜네디올, 아세틸데옥시니발레놀, 아세틸니발레놀, 아세틸네오졸라니올, 아세틸 T-2 톡신, 아플라톡신, 아플라톡신 B1, B2, G1 및 G2, 아플라트렘, 알테누산, 알테르나리올, 오스트디올, 오스트아미드, 오스토시스틴, 아베나세인 +1, 부베리신 +2, 벤티놀리드, 브레비안아미드, 부테놀리드, 칼로넥트린, 케토글로보신, 케토신, 케토민, 시트리닌, 시트레오비리딘, 코클리오디놀, 사이토칼라신, 시클로피아존산, 데아세틸칼로넥트린, 데아세틸네오졸라니올, 데옥시니발레놀 디아세테이트, 데옥시니발레놀 모노아세테이트, 디아세톡시시르페놀, 데스트럭신 B, 에메스트린, 엔니아틴, 에르긴, 에르고코닌, 에르고크리스틴, 에르고크립틴, 에르고메트린, 에르고닌, 에르고신, 에르고타민, 에르고발린, 리세르골, 리세르긴 산 및 연관 에피머들과 같은 에르고트 알칼로이드 톡신들 및 내생균들, 프럭티게닌 +1, 푸마길린, 푸모니신, 푸모니신 A1, A2, B1 및 B2 및 B3, 푸사레논-X, 푸사로크로마논, 푸사르산, 푸사린, 글리오톡신, HT-2 톡신, 하이알로덴드린, 이포메아닌, 이슬란디톡신, 이소푸미각라빈 A 및 B, 라테리틴 +1, 렙토신, 리코마라스민 +1, 말포르민, 말토리진, 모닐리포르민, 모노아세톡시시르페놀, 마이코페놀산, 네오졸라니올, 니발레놀, NT-1 톡신, NT-2 톡신, 오크라톡신, 오오스포레인, 옥살산, 파스팔리트렘 A 및 B, 파툴린, 페니실린산, 페니트렘, 포몹신, PR-톡신, 로리딘 E, 로큐포르틴 A 및 B, 루브라톡신, 루브로스키린, 루브로설핀, 루굴로신, 삼부시닌 +1, 사트라톡신,F,G,H, 시르펜트리올, 시로데스민, 슬라프라민, 스포리데스민, 스테리그마토시스틴, 스와인소닌, T-1 톡신, T-2 톡신, 테누아조산, 트리아세톡시시르펜디올, 트리코테센, 트리코데르민, 트리코테신, 트리코베린, 트리코베롤, 트립토퀴발렌, 베루카린, 베루쿨로겐, 버티실린, 비오푸르푸린, 비오멜레인, 비리디톡신, 보르트만닌, 크산토실린, 야바니신+1, 제아랄레놀, 제아랄라논, 제아랄레논,α,β, 제아랄라논,α,β, 제라놀 및 이들의 서브패밀리 및/또는 유도체들을 포함한다. 일부 바람직한 실시예들에 있어서, 상기 물질로부터 격리된 마이코톡신은 오크라톡신 A이다. 일부 바람직한 실시예들에 있어서, 상기 마이코톡신은 스포리데스민이다. 일부 실시예들에 있어서, 마이코톡신을 포함하는 상기 물질은 음료, 식품, 동물 사료, 약학적 조성물, 기능식품 조성물, 화장료 조성물, 생명 유지에 필요한 물질 또는 다른 물질이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 생명 유지에 필요한 물질은 수경재배(aquaculture) 및 산소를 포함하는 기체 샘플에 사용되는 매체이다. 일부 실시예들에 있어서, 마이코톡신에 결합된 분자 각인 고분자는 마이코톡신을 포함하는 상기 물질로부터 분리되지 않는다. 일부 실시예들에 있어서, 물질로부터 마이코톡신을 격리시키는 상기 방법은 마이코톡신을 포함하는 상기 물질로부터 마이코톡신에 결합된 분자 각인 고분자를 분리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 분리 단계는 마이코톡신을 포함하는 상기 물질로부터 마이코톡신에 결합된 상기 분자 각인 고분자를 추출, 농축 및 분리(isolation) 시키는 단계를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 분리 단계는 크로마토그래피 혹은 분리 컬럼 또는 카트리지 내에서 수행된다. 일부 실시예들에 있어서, 분리 단계 이후에, 상기 분자 각인 고분자에 결합된 마이코톡신은 세척에 의해 상기 분자 각인 고분자로부터 제거된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 마이코톡신은 상기 분자 각인 고분자로부터 제거된 이후에 정성 및 정량 분석된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 정량 및 정성 분석은 이력추적을 위해 활용된다(예를 들면, 문서화된 식별 수단에 의해 대상물의 연대기, 위치 및/또는 적용(예를 들면, 발견된 마이코톡신의 위치, 종류 및 양)을 식별 및/또는 연관시키는). 일부 실시예들에 있어서, 마이코톡신이 제거된 상기 분자 각인 고분자는 마이코톡신을 포함하는 물질로부터 마이코톡신을 격리하기 위해 재사용된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 분자 각인 고분자는 그 중량보다 1 내지 10배 이상(예를 들면, 1 내지 5배 이상, 1 내지 2배 이상)의 물을 흡착시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 2 이상의 다른 분자 각인 고분자들이 2 이상의 특이적 마이코톡신들을 상기 물질로부터 격리시키기 위해 마이코톡신을 포함하는 상기 물질과 접촉된다.
본 발명은 또한 N-(2-히드록시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌을 합성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 3-5 디클로로살리실산(3-5 dichlorosalicylic acid)을 2-아세톡시아세톡시-3,5-디클로로벤조산(2-acetoxyacetoxy-3,5-dichlorobenzoic acid)으로 전환; 2-아세톡시아세톡시-3,5-디클로로벤조산을 2-아세톡시아세톡시-3,5-디클로로벤조산 클로라이드로 전환; 2-아세톡시아세톡시-3,5-디클로로벤조산 클로라이드를 L-페닐알라닌 에틸 에스테르와 반응시켜 N-(2-아세톡시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌 형성; 및 N-(2-아세톡시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌을 N-(2-히드록시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌으로 전환. 일부 실시예들에 있어서, 상기 전환은 N-(2-아세톡시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌의 에스테르 작용기의 가수분해를 포함한다.
본 발명은 또한 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴을 합성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다: 2,3-디메톡시벤조산을 2,3-디메톡시-N-터트부톡시카르보닐아닐린(2,3-dimethoxy-N-tertbutoxycarbonylaniline)으로 전환; 2,3-디메톡시-N-터트부톡시카르보닐아닐린을 2,3-디메톡시아닐린으로 전환; 2,3-디메톡시아닐린을 디에틸케토말로네이트(diethylketomalonate)와 반응시켜 에틸 6,7-디메톡시-3-히드록시-3-(2-인돌론)-카르복실레이트 형성; 에틸 6,7-디메톡시-3-히드록시-3-(2-인돌론)-카르복실레이트를 6,7-디메톡시이사틴(6,7-dimethoxyisatine)으로 전환; 6,7-디메톡시이사틴을 6,7-디메톡시-1-메틸리사틴으로 전환; 및 6,7-디메톡시-1-메틸리사틴을 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴으로 전환.
본 발명은 또한 마이코톡신에 특이적인 분자 각인 고분자를 합성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다: 마이코톡신에 MIP 결합을 촉진할 수 있는 템플릿 화합물을 생성하는 단계; 비극성, 비양자성 용매를 포함하는 용매 시스템 내의 MIP 모노머 및 가교제를 포함하는 반응에 상기 템플릿 화합물을 결합시키는 단계; 및 반응 용기를 상승된 온도에 노출 또는 상기 반응 용기에 UV 조사로 구성된 그룹에서 선택된 행위에 의해 중합을 촉진하는 단계. 일부 실시예들에 있어서, 상기 마이코톡신은 오크라톡신 A를 포함하나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다. 실제로 마이코톡신에 특이적인 다양한 분자 각인 고분자들이 본 출원에 설명되는 바와 같이 합성될 수 있다. 상기 MIP들은 비제한적 예로서, 아세톡시시르펜네디올, 아세틸데옥시니발레놀, 아세틸니발레놀, 아세틸네오졸라니올, 아세틸 T-2 톡신, 아플라톡신, 아플라톡신 B1, B2, G1 및 G2, 아플라트렘, 알테누산, 알테르나리올, 오스트디올, 오스트아미드, 오스토시스틴, 아베나세인 +1, 부베리신 +2, 벤티놀리드, 브레비안아미드, 부테놀리드, 칼로넥트린, 케토글로보신, 케토신, 케토민, 시트리닌, 시트레오비리딘, 코클리오디놀, 사이토칼라신, 시클로피아존산, 데아세틸칼로넥트린, 데아세틸네오졸라니올, 데옥시니발레놀 디아세테이트, 데옥시니발레놀 모노아세테이트, 디아세톡시시르페놀, 데스트럭신 B, 에메스트린, 엔니아틴, 에르긴, 에르고코닌, 에르고크리스틴, 에르고크립틴, 에르고메트린, 에르고닌, 에르고신, 에르고타민, 에르고발린, 리세르골, 리세르긴 산 및 연관 에피머들과 같은 에르고트 알칼로이드 톡신들 및 내생균들, 프럭티게닌 +1, 푸마길린, 푸모니신, 푸모니신 A1, A2, B1 및 B2 및 B3, 푸사레논-X, 푸사로크로마논, 푸사르산, 푸사린, 글리오톡신, HT-2 톡신, 하이알로덴드린, 이포메아닌, 이술란디톡신, 이소푸미각라빈 A 및 B, 라테리틴 +1, 렙토신, 리코마라스민 +1, 말포르민, 말토리진, 모닐리포르민, 모노아세톡시시르페놀, 마이코페놀산, 네오졸라니올, 니발레놀, NT-1 톡신, NT-2 톡신, 오크라톡신, 오오스포레인, 옥살산, 파스팔리트렘 A 및 B, 파툴린, 페니실린산, 페니트렘, 포몹신, PR-톡신, 로리딘 E, 로큐포르틴 A 및 B, 루브라톡신, 루브로스키린, 루브로설핀, 루굴로신, 삼부시닌 +1, 사트라톡신,F,G,H, 시르펜트리올, 시로데스민, 슬라프라민, 스포리데스민, 스테리그마토시스틴, 스와인소닌, T-1 톡신, T-2 톡신, 테누아조산, 트리아세톡시시르펜디올, 트리코테센, 트리코데르민, 트리코테신, 트리코베린, 트리코베롤, 트립토퀴발렌, 베루카린, 베루쿨로겐, 버티실린, 비오푸르푸린, 비오멜레인, 비리디톡신, 보르트만닌, 크산토실린, 야바니신+1, 제아랄레놀, 제아랄라논, 제아랄레논,α,β, 제아랄라논,α,β, 제라놀 및 이들의 서브패밀리 및/또는 유도체들에 특이적인 MIP들을 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 템플릿은 N-(2-히드록시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 템플릿은 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴을 포함한다. 본 발명은 임의의 특정한 모노머 또는 가교제에 제한되지 않는다. 실제로, 본 출원에 설명되는 것들을 포함하는 다양한 모노머들 및 가교제들이 활용될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 분자 각인 고분자를 세척하여 상기 템플릿을 제거하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 세척은 용액(예를 들면, 희석된 염기 용액, 희석된 산 용액 혹은 물)으로 1, 2, 3, 4 혹은 그 이상 횟수의 세척을 포함한다.
도 1은 오크라톡신 A 및 N-(3,5-디클로로-2-히드록시벤조일)-L-페닐알라닌(OTA 템플릿)을 나타낸다.
도 2는 N-(3,5-디클로로-2-히드록시벤조일)-L-페닐알라닌(OTA 템플릿) 합성 경로를 나타낸다.
도 3은 일부 포함 속도에서 OTA에 대한 MIP-OTA 격리 효율을 나타낸다.
도 4는 x15,000 비율 및 3.0keV에서 Hitachi S-4300 주사 전자 현미경 상에서 관찰된 MIP-OTA를 나타낸다.
도 5는 5개의 다른 포함 레벨에서 3개의 다른 OTA 농도들에 대한 MIP들(톨루엔-시클로헥산 혼합물에서 합성된)의 격리 친화도를 나타낸다.
도 6은 기능성 모노머들로서 스티렌 및 2-비닐피리딘으로 생성되고 열-개시 또는 저온 및 UV-개시로 중합된 MIP들에 의한 OTA의 격리 활성을 나타낸다. 시트레이트 완충액 세척(pH 4.0) 이후 및 100% 메탄올 세척 이후의 초기 흡착 및 잔여 흡착의 값들이 표시된다.
도 7은 기능성 모노머들로서 스티렌 및 2-비닐피리딘으로 생성되고 저온 및 UV-개시로 중합된 MIP들에 의한 폴리페놀 및 3-인돌 아세트산의 격리 활성을 나타낸다. 초기 흡착 값들이 표시된다.
도 8은 MIP-OTA로 코팅되고 포도주 내의 OTA 격리를 위한 50mL 팔콘(falcon) 튜브 내에서 사용되는 섬유유리 메쉬(mesh)의 사진들을 나타낸다.
도 9는 4개의 다른 중합 조건들을 사용하고 50, 100, 200ppb OTA의 스파이크드(spiked) 농도를 포함하는 백포도주로 테스트되는 섬유유리 메쉬 상에 코팅된 MIP-OTA의 3개의 레벨들의 격리 테스트 결과를 나타낸다.
도 10은 3개의 다른 중합 조건들을 사용하고 50, 100, 200ppb OTA의 스파이크드(spiked) 농도의 백포도주 내에서 테스트되는 섬유유리 메쉬 상에 코팅된 NIP의 3개의 레벨들의 격리 테스트 결과를 나타낸다.
도 11은 형광 검출기로 기록된 표준 OTA 용액들의 크로마토그래피 프로파일 및 마이코톡신의 유지 시간을 최적화하는데 활용되는 구배 선택을 나타낸다.
도 12는 스포리데스민 및 스포리데스민 템플릿(5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴)의 분자 구조를 나타낸다.
도 13은 스포리데스민 템플릿 합성 경로를 나타낸다.
도 14는 일부 포함 속도에서 MIP-스포리데스민 및 NIP에 의한 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴에 대한 격리 효율을 나타낸다.
도 15는 열 개시 또는 저온/UV 개시 중합으로 합성된 MIP들 및 NIP들의 글리오톡신에 대한 격리 활성 및 증가하는 메탄올 레벨로 수행되는 6회의 연속적인 세척 후의 상호작용의 안정성/특이성을 나타낸다.
도 16은 열 개시 또는 저온/UV 개시 중합으로 합성된 MIP들 및 NIP들의 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴에 대한 격리 활성 및 증가하는 메탄올 레벨로 수행되는 6회의 연속적인 세척 후의 상호작용의 안정성/특이성을 나타낸다.
용어의 정의
본 출원에 사용되는 용어 "분자 각인 고분자(molecular imprinted polymer)" 또는 "MIP" 는 특정 화합물에 선택적으로 결합하는 합성 고분자들을 지칭한다. 바람직한 실시예들에 있어서, 분자 각인 고분자들은 템플릿 화합물로도 지칭되며 특정 표적 화합물(예를 들면, 마이코톡신)에 고도의 친화도를 갖는 MIP를 생성하는 표적 화합물들의 존재하에 합성된다. 일반적으로 상기 고분자들은 천연 표적(예를 들면 천연 마이코톡신)의 구조, 형상 및/또는 다른 화학적 특성들을 모방하는 템플릿들(예를 들면, 합성적으로 설계된 분자/리간드/템플릿(예를 들면, 합성 마이코톡신 템플릿))과 모노머들 및/또는 가교제와 같은 다른 성분들로 설계된다. 예를 들면, 템플릿 화합물들은 예비-고분자 혼합물과 병합되어 상기 모노머들과 회합물을 형성할 수 있다. 이러한 혼합물은 준비된 상기 템플릿 화합물들과 중합된다. 고분자가 형성되면, 상기 템플릿 화합물들은 제거되면서 상기 템플릿(또는 상기 템플릿과 유사한 조성물들(예를 들면 천연 발생 마이코톡신))에 친화도를 갖는 상보적 캐비티(cavity)들을 남긴다. 이러한 영역들(예를 들면 캐비티들 혹은 다른 영역들)은 미래의 표적 화합물들과 결합을 위해 맞추어지며, 상기 화합물들에 높은 친화도를 유발한다.
특정 표적 화합물들이 분자 각인 고분자들을 형성하는데 사용되고, 상기 고분자들은 상기 표적 화합물과 구별되나 유사한 화합물들의 집단에 높은 친화도를 가질 수 있음을 주목할 필요가 있다. 예를 들면, 분자 각인 고분자는 상기 템플릿 화합물(예를 들면, 합성 마이코톡신 템플릿)과 형상, 전하밀도, 기하학적 구조 또는 기타 물리적 혹은 화학적 특성들과 유사한 수많은 화합물들과 결합한다.
본 출원에 사용되는 용어 "고분자"는 일반적으로 네트워크를 형성하는 공유 화학 결합들에 의해 연결되는 반복 구조 단위들로 구성된 분자(거대분자)를 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "템플릿 화합물" 또는 "표적 화합물"은 후속적으로 중합되는 리간드들(예를 들면, 모노머들)에 의해 복합체화되어 분자 각인 고분자를 형성하는 화합물을 지칭한다. 템플릿 화합물들은 유기 화합물들(예를 들면, 마이코톡신, 펩티드 및 단백질) 뿐만 아니라 무기 화합물들(예를 들면, 미네랄 및 중금속)을 포함한다. 본 출원에 사용되는 용어 "마이코톡신 템플릿(mycotoxin template)"은 천연 마이코톡신(예를 들면, 오크로톡신, 스포리데스민 등)의 구조, 형상 및/또는 기타 화학적 특성을 모방하는 합성적으로 설계된 분자를 지칭한다. 본 발명은 활용되는 마이코톡신 템플릿의 종류에 의해 제한되지 않는다. 실제로, 비제한적인 예로서, 아플라톡신: 아플라톡신 B1, B2, G1, G2, M1, P1, Q1, 스테리그마토시스틴 및 서브패밀리, 아플라톡시콜; 트리코테센: 데옥시니발레놀, 디아세톡시시르페놀, 모노아세톡시시르페놀, 시르페네트리올, T-2 톡신, HT-2 톡신, T-2 테트라올, 푸사레논 X, 푸사린 C, 푸사르산, 푸사로크로마논, 아우로푸사린(aurofusarin), 푸사프롤리페린(fusaproliferin), 네오졸라니올, 니발레놀 및 이의 대사물질 및 서브패밀리; 푸모니신: 푸모니신 A1, A2, B1, B2, B3 및 서브패밀리; 오크라톡신: 오크라톡신 A, B, α, β 및 대사물질; 제아랄레논, 제아랄레놀 α, β, 제아랄라논, 제아랄라놀 α, β, 제라놀 및 대사물질들; 파툴린, 글리오톡신, 마이코페놀산, 모닐리포르민, 시클로피아존산, 시트리닌, 부베리신, 시트레오비리딘, 시토칼라신 H; 페니실린산, PR-톡신, 로큐포르틴 A, B, 루브라톡신 및 서브패밀리; 에르고트 알칼로이드: 에르고타민, 클라빈(clavine) 알칼로이드; 이소푸미각라빈 A, B; 파스팔리트렘 A, B, 아플라트렘, 페니트렘 및 서브패밀리; 포몹신: 포몹신 A 및 서브패밀리; 베루카린 A, 베루쿨로겐 및 서브패밀리; 스포리데스민 및 서브패밀리; 슬라프라민, 스와인소닌, 테누아조산, 알테르나리올, 보르트만닌 및 본 출원에 설명된 기타 마이코톡신들을 포함하는 다양한 마이코톡신들이 활용될 수 있다.
본 출원에 사용되는 용어 "모노머(monomer)"는 다른 모노머들에 화학적으로 결합되어 고분자를 형성하는 분자를 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "가교(crosslink)" 및 "가교제(crooslinker)"는 2 이상의 모노머들에 부착되어 고분자 네트워크를 형성할 수 있는 2, 3 또는 4의 이중 결합들을 함유하는 분자들을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "구조 단위(structural unit)"는 고분자 사슬의 빌딩 블록(building block)을 지칭하며 반복 단위와 연관된다.
본 출원에 사용되는 용어 "음이온성(anionic)" 또는 "음이온(anion)"은 음전하를 갖는 이온을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "양이온성(cationic)" 또는 "양이온(cation)"은 양전하를 갖는 이온을 지칭한다. 본 용어는 양전하를 갖는 분자 각인 고분자들과 같은 고분자 화합물을 지칭할 수도 있다.
본 출원에 사용되는 용어 "산(acid)"은 양성자(proton)를 주거나 전자를 수용할 수 있는 임의의 화학적 화합물을 지칭한다. 본 출원에 사용되는 용어 "염기(base)"는 양성자를 수용 및/또는 전자 또는 수산화이온을 줄 수 있는 임의의 화학적 화합물을 지칭한다. 본 출원에 사용되는 용어 "염(salt)"은 무기 또는 유기 산 및 염기들로부터 생성될 수 있는 화합물들을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "블리딩(bleeding)"은 MIP의 수회의 세척단계 이후에도 MIP와 연관되어 MIP로부터 지속적으로 분리되며 흡착 활성을 방해하는 잔존 템플릿 부분을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "기공 형성제(porogenic/porogen)"는 고분자 상의 캐비티(예를 들면, MIP의 캐비티)의 사이즈를 변화시키는 데 사용되는 물질, 분자, 완충액, 용매(예를 들면, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠)를 지칭하며, 기공 형성제에 대한 고분자의 비율은 최종 구조의 공극률 크기와 직접 연관된다.
본 출원에 사용되는 용어 "공극률(porosity)"은 기체 혹은 액체를 보유하거나 이들이 투과될 수 있도록 하는 물질 내의 보이드(void) 공간(예를 들면, MIP 캐비티)의 측정값을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "중합(polymerization)"은 화학 반응 안에서 모노머 분자들을 함께 반응시켜 3차원 네트워크 또는 고분자 사슬을 형성하는 과정을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "침전(precipitation)"은 화학 반응 중 용액 안에서의 고체 형성을 지칭한다. 반응이 일어날 때, 형성된 고체는 침전물이라 불리며, 상기 고체위에 남은 액체는 상청액이라 불린다.
본 출원에 사용되는 용어 "원심분리(centrifugation)"는 대상체를 고정축 주위로 회전시키며 상기 축에 수직한 힘을 인가하는 회전 로터에 의해 발생하는 원심력을 사용하여 사이즈 또는 밀도에 따라 분자들을 분리하는 과정을 지칭한다. 상기 원심분리는 퇴적 원칙을 사용하여 작동하며, 구심가속도를 사용하여 크고 작은 밀도의 물질들을 서로 다른 밀도의 층들로 균일하게 분산시킨다.
본 출원에 사용되는 용어 "농도"는 한정된 공간 당 물질의 양을 지칭한다. 농도는 일반적으로 단위 부피당 질량으로 표현된다. 용액을 희석시키기 위해, 용매를 첨가하거나 용질의 양을 감소시켜야 한다(예를 들면, 선택적 분리, 증발, 스프레이 건조, 동결 건조에 의해). 이와 반대로, 용액을 농축시키기 위해 용매의 양을 감소시켜야 한다.
본 출원에 사용되는 용어 "층(layer)"은 일반적으로 물질의 밀도 특성들과 연관되어 원심분리 또는 퇴적에 의한 분리 이후 수득되는 상부 혹은 부분을 형성하는 물질의 계층 내에 조직된 수평층을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "정제된(purified)" 또는 "정제"는 샘플로부터 외부 성분들의 제거를 지칭한다. 화학적 의미로 사용되는 경우, "정제된" 또는 "정제"는 외부의, 원하지 않는 또는 오염 물질들로부터 관심대상인 화학 물질을 물리적으로 분리하는 것을 지칭한다. 유기 분자들의 정제를 위해 상용되는 방법은, 이에 제한되는 것은 아니나, 친화도 정제, 기계적 여과, 원심분리, 증발, 불순물 추출, 다른 성분들이 불용성인 용매에의 용해, 결정화, 흡착, 증류, 분별, 승화, 제련, 정련, 전기영동 및 투석을 포함한다.
본 출원에 사용되는 용어 "건조(drying)"는 물질 내의 액체를 감소시키거나 제거하는 임의의 공정을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "스프레이 건조"는 고온 가스를 사용하여 액체를 증발시켜 물질 내의 액체를 감소 또는 제거하는 액체 함유 물질을 건조시키는 방법을 지칭한다. 다르게 표현하면, 상기 물질은 가열된 건조 공기의 드래프트(draft) 내부로 스프레잉 또는 원자화하는 방법에 의해 건조된다.
본 출원에 사용되는 용어 "건조 자유 유동 파우더(dry free flowing powder)"는 자유 유동하는 건조 파우더를 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "그라인딩(grinding)"은 충격, 전단 또는 마모에 의해 입자 사이즈를 감소시키는 것을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "세척(washing)"은 조제물의 불순물 또는 용해성의 원하지 않는 성분의 제거 또는 세정(예를 들면, 임의의 용제(예를 들면, 증류수, 완충액 혹은 용매 또는 이의 혼합물)를 사용하여)을 지칭한다(예를 들면, MIP는 샘플로부터 템플릿 성분들을 제거하기 위해 세척될 수 있다).
본 출원에 사용되는 용어 "분석물(analyte)"은 원자, 분자, 물질 또는 화학 성분을 지칭한다. 일반적으로, 분석물은 그 자체로는 측정되지 않으며, 상기 분석물의 특성들 또는 성질들(물리적, 화학적, 생물학적 등)이 고성능 액상 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography: HPLC)와 같은 분석 공정을 사용하여 결정된다. 예를 들면, 일반적으로 "의자(분석물-성분)" 그 자체는 측정하지 않으며, 의자의 높이, 너비 등이 측정된다. 유사하게, 일반적으로 마이코톡신을 측정하지 않으며, 상기 마이코톡신의 일 이상의 특성들(예를 들면, 안정성, 농도 또는 생물학적 활성과 연관된 마이코톡신 형광)을 측정한다.
본 출원에 사용되는 용어 "샘플"은 임의의 소스(예를 들면, 합성의, 생물학적 및 환경 샘플들)로부터의 시료를 포함하는 광범위한 의미로 사용된다.
합성 샘플들은 인위적으로 생산된 임의의 물질(예를 들면, MIP)을 포함한다. 생물학적 샘플들은 동물들(인간을 포함하는)로부터 수득되며, 유체, 고체, 조직 및 기체를 포괄한다. 생물학적 샘플들은, 혈장, 혈청 등과 같은 혈액 생성물을 포함한다. 환경적 샘플들은 표면 물질, 토양, 물, 결정 및 산업적 샘플과 같은 환경 물질을 포함한다.
본 출원에 사용되는 용어 "고성능 액상 크로마토그래피(HPLC)"는 화합물을 분리하는 액상 크로마토그래피의 일 형태를 지칭한다. 화합물들은 용액 내에 용해된다. 화합물들은 샘플 혼합물을 용매 또는 용매 혼합물이 흐르는 컬럼 상에 주입하여 상기 컬럼으로부터 상기 혼합물의 성분들을 용출시킴으로써 분리된다. HPLC 장치는 이동상 저장소, 펌프, 인젝터, 분리 컬럼 및 검출기를 포함한다, 컬럼 용출액 내의 분석물의 존재는 굴절률, 설정된 파장에서의 UV-VIS 흡수, 적절한 파장에서의 여기 후 형광 또는 전기화학적 반응의 변화를 정량적으로 검출함으로써 기록된다.
본 출원에 사용되는 용어 "신호(signal)"는 일반적으로 반응이 일어났음(예를 들면, 항체의 항원으로의 결합)을 지시하는 임의의 검출가능한 공정과 연관되어 사용된다. 신호는 정성적으로 뿐만 아니라 정량적으로 평가될 수 있다. 신호의 종류의 비제한적인 예들은 방사성 신호, 형광측정 신호 또는 비색측정 산물/시약 신호를 포함한다.
본 출원에 사용되는 용어 "주사 전자 현미경(scanning electron microscopy: SEM)"은 래스터(raster) 스캔 패턴 내에서 고에너지 전자빔으로 샘플 표면을 스캐닝하여 이미지화하는 전자 현미경의 종류를 지칭한다. 전자들은 샘플을 구성하는 원자들과 상호작용하여 샘플 표면의 지형, 조성 및 전기 전도도와 같은 다른 특성들에 관한 정보를 함유하는 신호들을 생성한다.
본 출원에 사용되는 용어 "고정화제(fixation agent)"는 물질을 고정, 안정화 또는 현재 형태로 보존하여 변성되거나 다른 형태로 변형되는 것을 방지하기 위해 한 물질을 다른 물질에 고정시킬 수 있는 화학제제를 지칭한다. 고정화제는 샘플을 제조하기 위해 SEM에서 자주 사용된다.
본 출원에 사용되는 용어 "인 비보(in vivo)"는 생물 기관, 생물학적 기관 내에서 일어나거나 수행되는 연구들 및/또는 실험들을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "인 비트로(in vitro)"는 생물 기관 외부의 인공 환경 및 통상적으로 기관 내에서 일어나나 인공 환경에서 발생하도록 구성되는 생물학적 공정 또는 반응들을 지칭한다. 인 비트로 환경의 예들은 시험관 및 세포 배양물을 포함한다.
본 출원에 사용되는 용어 "인 시투(in situ)"는 반응 혼합물의 조건을 의미한다.
본 출원에 사용되는 용어 "엑스 비보(ex vivo)"는 자연 조건에 최소한의 변경을 가하여 기관 밖 인공 환경의 생물 조직에서 수행되는 연구들 및/또는 실험들 및/또는 적용을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "흡수(absorb)"는 물질이 다른 물질을 수용하거나 빨아들이는 과정을 지칭한다. 예를 들면, "흡수"는 확산 또는 삼투현상을 통해 세포 내부 혹은 조직 및 기관을 가로질러 흡수하거나 동화시키는 과정을 지칭할 수 있다.(예를 들면, 소화계에 의한 영양소 흡수 또는 혈류 내부로의 약물 흡수)
본 출원에 사용되는 용어 "흡착(adsorb)"은 물질이 조성물(격리제 및/또는 흡착제)에 의해 격리 및/또는 축적(예를 들면 표면 상에)될 때 일어나는 과정을 지칭하거나, 조성물(예를 들면, MIP)이 샘플내의 표적 분자(예를 들면, 마이코톡신)에 결합(예를 들면, 샘플로부터 상기 표적 분자를 제거하기 위해)하는 과정을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "수착(sorption)"은 흡착 및 흡수 모두를 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "격리(sequestration)"는 서로 접촉하는 2 이상의 개체(예를 들면, 복합체를 형성하는)들의 물리적 연관(예를 들면, 결합을 통해(예를 들면, 수소 결합, 이온 결합, 공유 결합 또는 다른 종류의 결합)을 지칭한다. 연관의 비제한적인 예시적 형태들은 수소 결합, 배위 및 이온쌍 형성을 포함한다. 격리 상호작용은 각 개체의 입체화학 및 기하형태(예를 들면, 격리의 특이성을 더 정의하는)에 따라 다양한 수의 화학적 상호작용(예를 들면, 화학 결합)을 수반한다. 2 이상의 개체들이 격리되었을 때, 이들은 화학 결합에 의해 격리될 수 있으며, 또한 전하, 쌍극자-쌍극자 또는 다른 종류의 상호작용을 통해서도 연관될 수 있다.
본 출원에 사용되는 용어 "격리제(sequestration agent)"는 제2 개체와 복합체를 형성할 수 있는 개체를 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "복합체(complex)"는 2 이상의 분리된 개체들 사이의 연관(예를 들면, 동일하거나 상이한 2 이상의 개체들(예를 들면, 동일하거나 상이한 화학종들) 사이의 연관)에 의해 형성되는 개체를 지칭한다. 상기 연관은 공유 결합 또는 비공유 결합(예를 들면, 반데르발스힘, 정전기력, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 쌍극자 상호작용 및/또는 수소결합력(예를 들면, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에스테르 결합 및 이들의 조합))을 통해 형성될 수 있다.
본 출원에 사용되는 용어 "유효량(effective amount)"는 이로운 또는 원하는 결과를 얻는데 충분한 조성물(예를 들면, MIP)의 양을 지칭한다. 유효량은 투여 및/또는 일 이상의 다른 투여물, 적용 또는 투약물과 결합될 수 있고, 특정한 제형이나 투약 경로에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에 사용되는 용어 "동물"은 동물계에 속하는 개체들을 지칭한다. 이는 비제한 적인 예로서, 가축, 농장 동물, 가정용 동물, 애완 동물, 해양 및 민물 동물 및 야생 동물을 포함한다.
본 출원에 사용되는 용어 "식품(feedstuff)"은 개체(예를 들면, 인간 및/또는 동물 개체(예를 들면, 음식 섭취에 의해 에너지 및/또는 영양소를 생성하는))에 의해 섭취되는 물질을 지칭한다. 식품의 비제한적인 예로서, 낙농제품, 쥬스, 곡물, 과일, 야채, 고기, Total Mixed Ration(TMR), 사료(forage), 펠렛, 농축물, 프레믹스(premixs) 부산물, 곡물, 양조곡물, 당밀, 섬유, 사료(fodder), 잔디, 건초, 커널, 잎사귀, 밀, 용해물 및 보충제를 들 수 있다.
본 출원에 사용되는 용어 "소화계(digestive system)"은 소화가 발생할 수 있는 계(위장계를 포함)를 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "소화(digestion)"은 음식, 식품 또는 다른 유기 화합물의 흡수가능한 형태로의 전환(열 및 수분 혹은 화학 작용에 의한 연화, 분해 혹은 절단)을 지칭한다
본 출원에 사용되는 용어 "생물학적 이용가능성(bioavailability)"은 기관에 이용가능하거나 순환계에 도달할 수 있는 분자 혹은 성분의 부분을 지칭한다. 분자 혹은 성분이 정맥 안으로 투여되는 경우, 생물학적 이용가능성은 100%이다. 그러나, 분자 혹은 성분이 다른 경로(예를 들면 구강으로) 투여되는 경우, 생물학적 이용기능성은 감소한다(불충분한 흡수 및 1차-통과 대사에 기인하여)
본 출원에 사용되는 용어 "투여(administration)"는 약물, 전구약물 또는 다른 제제 또는 개체(예를 들면, 일 개체 혹은 인 비보, 인 비트로 또는 엑스 비보 세포, 조직 및 기관)에의 치료적 처리를 포함하는 물질을 수여하는 행위를 지칭한다. 예시적인 투여 경로로서 눈(ophthalmic), 입(oral), 피부(topical 또는 transdermal), 코(nasal), 폐(inhalant), 구강 점막(buccal), 귀, 직장, 질(vaginal), 주사(예를 들면, 정맥 주사, 피하, 종양내, 복강내) 등을 들 수 있다.
본 출원에 사용되는 용어 "공동 투여(co-administration)"는 개체에의 적어도 두 제제들 또는 치료들 및/또는 물질(예를 들면, 식품)의 투여를 지칭한다. 2 이상의 제제 혹은 치료의 공동 투여는 동시에 일어날 수 있다. 또는 제1 제제/치료법이 제2 제제/치료법 전에 투여될 수 있다.
본 출원에 사용되는 용어 "치료(treatment)"는 질병(예를 들면, 진균 중독(mycotoxicosis))의 신호 또는 증상의 개선 및/또는 전환을 지칭한다. 상기 용어 "치료"는 실제 치료 뿐만 아니라, 예방적 혹은 방지적 수단들도 지칭한다. 예를 들면, 본 발명의 조성물 및 방법들을 이용한 치료에 의해 이득을 보는 개체들은 이미 질병 및/또는 장애(예를 들면, 진균 중독)를 가진 자들 뿐만 아니라. 질명 및/또는 장애를 예방(예를 들면 본 발명의 예방적 치료를 사용하여)하고자 하는 자들도 포함한다.
본 출원에 사용되는 용어 "마이코톡신"은 다양한 균류 종에 의해 생성되는 독성 및/또는 발암성 화합물을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "진균중독(mycotoxicosis)"은 마이코톡신이 인간 혹은 동물 신체의 저항 장벽을 통과한 상태를 지칭한다. 진균 중독은 감염 또는 질병으로 간주될 수 있으며, 환자에게 유해한 효과를 갖는다.
본 출원에 사용되는 용어 "질병(disease)," "감염(infection)" 및 "병적 상태(pathological condition) 혹은 반응"은 살아있는 개체(예를 들면, 인간 및/또는 동물) 혹은 이의 기관 또는 조직의 정상 기능의 수행을 방해하거나 변형시키는 정상 상태의 손상과 연관된 상태, 신호 및/또는 증상 등을 지칭하며, 이는 환경적 요소들(예를 들면, 영양실조, 산업적 상해 혹은 기후, 진균 중독 포함), 특정한 감염성 제제들(벌레, 박테리아, 바이러스, 프리온 등), 개체의 내재적 결함(예를 들면, 다양한 유전적 비정상) 또는 이러한 요인들의 조합들에 대한 반응일 수 있다.
본 출원에 사용되는 용어 "질병 위험(at risk for disease)"은 특정 질병을 경험할 수 있는 경향이 있는 개체를 지칭한다. 이러한 경향은 유전적(예를 들면, 유전성 장애와 같은 질병을 경험하는 특정한 유전적 경향)이거나, 다른 요인들(예를 들면, 나이, 체중, 환경 조건, 위해적 화합물들(예를 들면 환경 등에 존재하는)에의 노출)에 기인한 것일 수 있다.
본 출원에 사용되는 용어 "질병을 앓는(suffering from disease)"은 특정한 질환을 경험하고 있는 개체(예를 들면, 동물 또는 인간 개체)를 지칭하며, 임의의 특정한 신호, 증상, 질병들에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에 사용되는 용어 "독성(toxic)"은 독성물질 접촉 또는 투여 전의 동일한 세포 혹은 조직과 비교할 때, 개체, 세포 혹은 조직 상의 임의의 해로운 혹은 불리한 효과들을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "약학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 활성 제제(예를 들면 MIP를 포함하는 조성물)와 인 비트로, 인 비보 또는 엑스 비보에서 진단 또는 치료에 특히 적합한 조성물을 만드는 활성 혹은 불활성의 캐리어의 조합을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)" 및 "약물학적으로 허용가능한(pharmacologically acceptable)"은 실질적으로 공지된 이로운 반응보다 공지된 부작용을 더 유발하지 않는 조성물을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "이력추적(traceability)"은 측정 결과 또는 표준값의 특성을 지칭하며, 이는 언급된 불확실성을 갖는 연속적인 사슬의 비교를 통해 통상적으로 국가 혹은 국제 표준에 따라, 언급된 참조와 연관될 수 있다. 이는 화학적 측정에 일반적인 계측 개념의 실용적 적용이며, 분석 화학 측정이 비교가능함을 보장하는 용어, 개념 및 전략을 제공한다. 이는 증명가능한 방법으로 독특하게 식별가능한 개체들을 측정한다. 이력추적 수단들은 문서화된 기록 식별 방식에 의해 개체의 기원, 위치 및/또는 적용을 상호 연관시키는데 활용된다.
다양한 균류 그룹들은 동물 건강에 위해적인 효과를 갖는 마이코톡신을 생성한다. 이들은 이들의 형성에 유리한 조건이 우세한 경우 주로 Aspergillus, Fusarium 및 Penicillium의 균류 속에 의해 생산된다. 전 세계의 어떤 지역도 마이코톡신 및 동물 및 인간 건강에 있어 이의 부정적 영향으로부터 자유롭지 못하다. 곡물 공급 및 동물 생산에 있어 마이코톡신 오염의 부정적 효과는 거대하며, 인간 건강에 대한 위험은 계속 존재한다. 따뜻한 기후는 아플라톡신 및 푸모니신에 쉽게 영향을 받으며, 고습윤의 차가운 기후에서는 오크라톡신, 스포리데스민, 제아랄레논, 데옥시니발레놀, T-2 톡신 및 디아세톡시시르페놀에 쉽게 노출된다.
마이코톡신은 몰드(mold) 및 균류 오염된 곡물 뿐만 아니라 사료, 과일, 식품과 환경(예를 들면, 토양, 물 및 진균 중독에 의해 수득된 에어졸을 통한 공기 등)에 의해 생성된 2차 대사물질이다. 마이코톡신은 인간 및 동물 건강에 위험한 효과를 갖는다. 마이코톡신은 식품 체인에 걸쳐 존재하므로, 마이코톡신은 식품/음식 물질 및 다른 그룹들의 톡신들의 독소적 특성들에 기반한 환경의 과다한 오염을 제한하는 조절의 대상이 된다(예를 들면, Commission Recommendation of 17 August 2006 on the presence of deoxynivalenol, zearalenone, ochratoxin A, T-2 and HT-2 and fumonisins in products intended for animal feeding. Official Journal of the European Union (2006/576/EC) 참조).
이러한 관점에서, 전세계의 여러 안전 기관들은 오염 레벨에 대한 테스트를 위한 한계값 및 통제 과정을 수립하였다. 이러한 통제들은 아직 국가들 및/또는 대륙들 사이에서 조화되지 못하였으며, 또한 고려되는 지리적 영역의 정치적 및 경제적 지위에 영향을 받는다. 이러한 통제들은 모델 상황 상에서 마이코톡신의 결정 형태로 생성된 급성 감염 케이스와 연관된 비망라적인 보고들에서 발견된다. 마이코톡신에 대한 이해가 진행되면서, 만성적 노출 레벨의 영향, 상기 노출의 지속기간 및 자연적으로 마이코톡신 오염된 식품/음식 물질 및 독성에 시너지 작용을 발휘할 수 있는 환경의 동시 발생이 동물 및 인간의 건강 상태 및 이들의 다양한 감염 및 면역 상태의 민감성에 중요한 역할을 할 수 있다. 이러한 관점에서, 식품 체인에 진입하고 환경 내에 존재하는 독성 화합물들의 비-통제 레벨을 처리하는 해법들이 고려되어왔다. 따라서 본 발명의 일부 실시예들에 있어서, 마이코톡신의 제거를 위한 고친화도, 합성 수착제(sorbent)의 제조를 위한 경제적, 대규모 방법이 제공된다(예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니나, 마이코톡신 분자들의 주요 혹은 마이너 클래스의 전체 패밀리는 다음의 예들을 포함한다: 아플라톡신: 아플라톡신 B1, B2, G1, G2, M1, P1, Q1, 스테리그마토시스틴 및 서브패밀리, 아플라톡시콜; 트리코테센: 데옥시니발레놀, 디아세톡시시르페놀, 모노아세톡시시르페놀, 시르페네트리올, T-2 톡신, HT-2 톡신, T-2 테트라올, 푸사레논 X, 푸사린 C, 푸사르산, 푸사로크로마논, 아우로푸사린, 푸사프롤리페린, 네오졸라니올, 니발레놀 및 이의 대사물질 및 서브패밀리; 푸모니신: 푸모니신 A1, A2, B1, B2, B3 및 서브패밀리; 오크라톡신: 오크라톡신 A, B, α, β 및 대사물질; 제아랄레논, 제아랄레놀 α, β, 제아랄라논, 제아랄라놀 α, β, 제라놀 및 대사물질들; 파툴린, 글리오톡신, 마이코페놀산, 모닐리포르민 시클로피아존산, 시트리닌, 부베리신, 시트레오비리딘, 시토칼라신 H; 페니실린산, PR-톡신, 로큐포르틴 A, B, 루브라톡신 및 서브패밀리; 에르고트 알칼로이드: 에르고타민, 클라빈(clavine) 알칼로이드; 이소푸미각라빈 A, B; 파스팔리트렘 A, B, 아플라트렘, 페니트렘 및 서브패밀리; 포몹신: 포몹신 A 및 서브패밀리; 베루카린 A, 베루쿨로겐 및 서브패밀리; 스포리데스민 및 서브패밀리; 슬라프라민, 스와인소닌, 테누아조산, 알테르나리올, 보르트만닌).
오크라톡신 A(OTA)는 부적절하게 저장된 음식 생산품(예를 들면, Pfohl-Leszkowiczand Manderville2007. Molecular Nutrition and Food Research, 51: 61-99 참조), 오염된 곡물, 커피콩(예를 들면, O'Brienand Dietrich 2005. Critical Reviews in Toxicology, 35: 33-60 참조), 와인 포도(예를 들면, BlesaJ., Soriano J.M., Molto J.C., Manes J., 2006. Critical Review in Food Science and Nutrition, 46: 473-478 참조) 상에서 성장하는 다른 몰드 종들 중에서 주로 Aspergillus ochraceus 및 Penicillium verrucosum에 의해 생산되는 마이코톡신 대사물질이며, 인간에 의해 소비되는 액체 및 고체에 전달되어 오염시킬 수 있다(예를 들면, 포도 쥬스, 와인, 맥주, 커피, 코코아 추출물과 오염된 곡물 및 고기와 오염된 곡물 또는 마이코톡신에 다른 방식으로 노출된 동물들로부터의 부산물(예를 들면, 우유, 계란 등)을 활용하는 음식 및 식품들). 이는 인간에게 위해적이며 OTA는 발암성을 가지며(Group 2B; 예를 들면, ClarkH.A., 및 Snedeker S.M, 2006. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B: Critical Reviews, 9: 265-96 참조), 신장 독성형 화합물이고, 면역억제를 유발할 수 있다(예를 들면, Al-Anati L., 및 Petzinger E., 2006. Journal of Veterinary Pharmocology and Therapeutics, 29: 79-90; Pfohl-Leszkowicz 및 Manderville, 2007; O'BrienDietrich, 2005 참조).
OTA는 소변의 변화 및 글루코오스의 소변으로의 분비 증가를 포함하는 돼지의 신장 기능의 변화를 유발하며, 이는 돼지 신증(porcine nephropathy)으로 특징화된다. OTA를 함유하는 닭, 칠면조 및 오리들은 취약한 먹이 전환을 가지며 계란 생산이 감소된다. 인간들에 있어서, OTA 병리학은 발칸 지역 신장병(Balkan endemic nephropathy, 예를 들면 Vrabcheva T., Petkova-Bocharova T., Grosso F., Nikolov I., Chernozemsky I.N., Castegnar M.,and Dragacci S., 2004. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52:2404-2410 참조)으로 임상적으로 기술되었다. 동물 연구들은 이의 페닐알라닌과의 유사성에 기인하여, 위장관 레벨에서의 흡수 후에 OTA는 장간 순환으로 진입할 수 있으며, 혈액 내의 알부민 조각과 결합하여 연장된 시간 동안 동물 조직 내에 존재할 수 있다(예를 들면, Creppy E.E., kane A., Dirheimer G., Lafarge-Frayssinet C., Mousset S., 및 Frayssinet C., 1985. Toxicology Letters, 28: 29-35. 참조).
균류 톡신중의 다른 클래스로서, 글리오톡신, 하이알로덴드린, 시로데스민, 케토민, 케토신, 버티실린, 렙토신, 에메스트린 및 스포리데스민을 포함하는 에피폴리티오디옥소피페라진(epipolythiodioxopiperazine)들이 관심의 대상이다. 이들은 일반적으로 동물 생산에 높은 경제적 효과를 가지며, 주로 뉴질랜드 목축농과 같은 세계의 특정 지역에서 발견되었으나(예를 들면, Hohenboken W.D., Morris C.A.,Munday R., De Nicolo G., Amyes N.C., Towers N.R., 및 Phua S.H., 2004. New Zealand journal of Agricultural Research, 47: 119-127 참조), 포루트갈의 아조어(Azore) 섬에서도 보고되었다. 스포리데스민은 특정 풀들에 다량 존재하는 Pithomyces chartarum에 의해 합성되는 소수성 분자이다. 독성은 디설파이드 브릿지의 존재에 의해 유발되며. 이는 티올 그룹과의 반응 및 반응성 산소종(초과산화물 라디칼, 과산화수소, 히드록실 라디칼)의 생성을 통해 단백질을 불활성화시킬 수 있다. 이러한 병적 현상은 순환 혈류 내에 축적되어 태양광선으로 부터 에너지를 흡수하는 파일로에리틴(phylloerythin, 엽록소의 대사물질)을 야기하는 담관 상피세포들의 파괴로부터 연유하는 안면 습진(facial eczema), 간유발 광민성으로 잘 알려져 있으며, 특히 양, 소, 말 및 사슴에 영향을 미친다. 임상적 증상은 우유 생산 감소, 체중 감소, 광민감성 및 사망을 포함한다(예를 들면, Munday R., 1982. Chemico-Biological Interactions, 41: 361-374 참조). 식품, 음식, 목초 및 액체 내의 마이코톡신 노출외에도, 동물 및 인간은 다른 방식으로 마이코톡신에 접촉하고 영향받을 수 있다. 예를 들면, 동물들은 그들의 잠자리에서 마이코톡신과 접촉할 수 있으며, 물고기는 수중 환경 내의 마이코톡신과 접촉할 수 있으며, 다른 유기 물질들도 마이코톡신에 영향받을 수 있다.
마이코톡신 오염은 피할 수 없으며, 마이코톡신의 부정적 효과를 감소시키기 위해, 흡착 특성을 갖는 것으로 알려진 진흙, 벤토나이트 및 알루미노실리케이트 또는 활성탄 등과 같은 무기물질들이 농업에서 전통적으로 사용되었다(예를 들면, 동물 사료 및/또는 성분들과 혼합되어, 캡슐화되거나 여과 장치로서). 대량으로 사용되는 진흙은 유체 내(예를 들면, 동물 및/또는 인간의 위장관)의 일부 마이코톡신들을 격리시키고, 이들의 독성효과를 최소화한다(예를 들면, Ramos A.J., 및 Hernandez E., 1997. Animal Feed Science and Technology, 65: 197-206; Grant P.G., 및 Phillips T.D., 1998. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46: 599-605 참조). 그러나, 진흙은 비타민, 미네랄 및 아미노산과 같은 동물 및 인간에게 중요한 이로운 영양소들의 흡수를 방해하며, 따라서 섭취물의 영양소 밀도를 감소시킨다. 더욱이, 진흙은 불활성 물질이어서 유익한 효과(예를 들면, 마이코톡신 오염의 감소)를 보기 위해서는 대량으로 사용(예를 들면, 동물 먹이로)되어야 한다. 그러나 대량으로 동물들에게 섭취된 진흙은 진흙이 상기 동물로부터 분비되었을 때 환경에 부정적 효과를 미칠 수 있다. 미국 특허 제6,045,834호 등에 개시된 특정 마이코톡신에 특이성이 부족한 다른 광범위한 마이코톡신 흡착제의 스펙트럼이 사용되어왔다.
일반적으로, 분자 각인 고분자(MIP)는 분자, 후에 추출되어 상보적 캐비티들을 남기는 템플릿의 존재 하에 형성되는 고분자이다. 이러한 고분자는 최초 분자에 대한 특정한 화학적 친화도를 보이며 센서, 촉매 제조 또는 분리 방법을 위해 사용될 수 있다. 최초의 각인 물질은 소듐 실리케이트계 물질이었다. 이러한 물질들의 최초 실험적 용도는 1949년 염료의 분리를 위한 것이었다(예를 들면, Andersson H.S., 및 Nicholls I.A., 2001. In: Molecularly Imprinted Polymers: Man-made mimics of antibodies and their application in analytical chemistry, (Sellergen B ed.), Techniques and Instrumentation in Analytical Chemistry, Vol. 23 Elsevier, Amsterdam, the Netherlands, pp. 1-19 참조).
본 발명은 일반적으로 분자 각인 고분자들(MIPs)에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 재활용 가능하며, 생태친화적인 MIPs, 이의 제조 방법, 이의 활용 방법(예를 들면, 표적 화합물(예를 들면, 마이코톡신)의 격리 및/또는 흡착) 및 다른 방식의 용도에 적용하는 방법(예를 들면, 이력추적 목적으로 마이코톡신의 존재 검출 및 오염된 소스로부터 마이코톡신 제거)에 관한 것이다. 본 발명의 조성물들 및 방법들은 식용, 치료용, 예방용, 음식 및 음료 가공 및 제조, 액체 여과와 연구 및 품질 통제 용도와 같이 다양하게 적용될 수 있다.
따라서, 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 높은 수착 용량 및 표적 분자(예를 들면, 마이코톡신)에 대한 MIP 선택성을 갖는 템플릿 화합물들(예를 들면, 그 위에서 MIP가 합성되는)을 제공한다. 템플릿 화합물들은 MIP 합성 후에 상기 MIP로부터 제거될 수 있다(이에 따라. MIP를 활성화시키고 표적 화합물들(예를 들면, 마이코톡신)에 결합 및 흡착가능하게 한다). 따라서, 본 발명은 경제적일 뿐만 아니라(예를 들면, 경제적으로 실현가능한 대량 생산을 가능케 하는) 종래 사용되었던 MIP 템플릿 보다 용이하게 이용가능한 템플릿 및 MIP의 대량 생산을 가능케 하는 공정(예를 들면, 합성 공정) 및 물질들을 제공한다. 또한, 본 발명은 일부 실시예들에 있어서, 생물학적으로 중성의(예를 들면, 환경적으로 해롭지 않은) 조성물들(예를 들면, 템플릿 화합물, 모노머, 가교제와 MIP)을 제공한다. 예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 본 발명의 모노머들과 가교제들은 템플릿과(예를 들면 템플릿의 작용기들과) 고친화도의 가역 복합체를 형성할 수 있으며, 이에 따라 표적 화합물(예를 들면, 마이코톡신)에 고친화도를 가지며 환경에 긍정적 효과를 제공하는(예를 들면, 물 수착 특성, MIP는 자체 중량보다 10배 까지의 물을 흡착하여 물을 보유함으로써 토양 수화에 이익을 준다) MIP들을 생산한다. 유사하게, 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 재활용가능하며(예를 들면, 표적 화합물들로부터 분리되어 재사용가능한) 표적 화합물들(예를 들면, 마이코톡신)에 대해 고진화도를 갖는 MIP들을 제공한다.
Ⅰ. 분자 각인 고분자(MIP) 합성을 위한 템플릿
MIP 합성을 위한 일반적인 방식은 MIP 네트워크 내의 결합 사이트들의 형성을 유도하는 템플릿 분자들의 존재 하에 모노머들의 중합 및 가교 단계를 포함한다. 기하적 특이성이 로스트-왁스(lost-wax) 캐스팅의 인위적 기술 중에 몰드의 제조를 위한 왁스 구조 카피들의 사용과 동등한 단계들 내에서 MIP 결합 사이트들에 부여된다. MIP 네트워크 형성 후에, 상기 템플릿은 제거되어 템플릿-프리 MIP가 표적 화합물 격리를 위해 이용가능하다. 일부 실시예들에 있어서, 템플릿의 제거는 일련의 세척 단계들(예를 들면, 후술하는 IV 섹션에서 설명되는)을 통해 달성된다.
일부 실시예들에 있어서, 표적 화합물은 템플릿으로 사용된다. 그러나, 이는 템플릿 블리딩(bleeding) 또는 잔여 템플릿의 샘플 내부로의 점진적인 침출과 같은 잠재적 문제점을 발생시킨다. 분석적 적용에 있어서, 템플릿 블리딩은 오류를 유발하는 높은 백그라운드를 야기하며, 비분석적(예를 들면, 격리) 적용에 있어서, 템플릿 블리딩은 실제로 표적 분자들을 샘플 내부에 도입함으로써 격리 시도를 혼동시킬 수 있다. 더욱이, 예들 들어 독성 및/또는 발암성 특성을 갖는 표적들(예를 들면 마이코톡신)을 향해 인도되는 MIP들을 합성할 때, MIP 합성 공정 중에 덜 위해적인 템플릿 분자들을 활용하는 것이 개인 안전과 위해적 폐기물을 최소화 시키는 관점에서 바람직할 수 있다. 바람직한 실시예들에 있어서, 템플릿 분자는 비위해적 및/또는 용이하게 분해되며, 그러므로 건강 혹은 환경 위험을 나타내지 않는다. 보다 바람직한 실시예들에 있어서, 상기 템플릿은 MIP로부터 방출되어 재사용가능하다. 바람직한 실시예들에 있어서. 상기 템플릿은 대량으로 생산될 수 있으며, 마이코톡신보다 안전한 방식으로 생산될 수 있다.
그러므로, 일부 실시예들에 있어서, MIP 합성에 사용되는 템플릿은 원하는 표적 화합물과 동일한 화합물일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, MIP 합성에 사용되는 템플릿은 원하는 표적 화합물과 다른 화합물일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예들에 있어서, 상기 원하는 표적 화합물은 마이코톡신이다. 마이코톡신의 비제한적인 예들은 아플라톡신: 아플라톡신 B1, B2, G1, G2, M1, P1, Q1, 스테리그마토시스틴 및 서브패밀리, 아플라톡시콜; 트리코테센: 데옥시니발레놀, 디아세톡시시르페놀, 모노아세톡시시르페놀, 시르페네트리올, T-2 톡신, HT-2 톡신, T-2 테트라올, 푸사레논 X, 푸사린 C, 푸사르산, 푸사로크로마논, 아우로푸사린, 푸사프롤리페린, 네오졸라니올, 니발레놀 및 이의 대사물질 및 서브패밀리와 콘쥬게이트; 푸모니신: 푸모니신 A1, A2, B1, B2, B3 및 서브패밀리와 콘쥬게이트; 오크라톡신: 오크라톡신 A, B, α, β 및 대사물질; 제아랄레논, 제아랄레놀 α- 및 β-제아랄라논, 제아랄라놀, α- 및 β-제라놀 및 대사물질들과 콘쥬게이트; 파툴린, 마이코페놀산, 모닐리포르민, 시클로피아존산, 시트리닌, 부베리신, 시트레오비리딘, 시토칼라신 H; 글리오톡신, 스포리데스민, 하이알로덴드린, 시로데스민, 케토민, 케토신, 버티실린, 렙토신, 에메스트린 및 서브패밀리들; 페니실린산, PR-톡신, 로큐포르틴 A, B, 루브라톡신 및 서브패밀리; 에르고트 알칼로이드: 에르고타민, 에르고크립틴, 에르고발린, 에르고크리스틴, 에르고메트린, 에르고신, 에르고닌, 에르고코닌, 에르긴, 리세르골, 리세르긴 산 및 에피머 클라빈(clavine) 알칼로이드; 이소푸미각라빈 A, B; 파스팔리트렘 A, B, 아플라트렘, 페니트렘 및 서브패밀리; 포몹신: 포몹신 A 및 서브패밀리; 베루카린 A, 베루쿨로겐 및 서브패밀리; 슬라프라민, 스와인소닌, 테누아조산, 알테르나리올 및 보르트만닌을 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 타겟 화합물은 OTA, 스포리데스민, 에르고트 알칼로이드들이다.
일부 실시예들에 있어서, 비-표적 템플릿 화합물의 설계 및/또는 결정은 표적 분자의 상세한 구조적 분석, 구조적 최소화 및 효율적인 MIP 결합 사이트 형성에 중요한 구조적 특징들 및 작용기들의 결정에 의해 수행된다. 구조적 최소화의 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 본 출원에 참조로서 병합되는 Baggiani C., Giraudi G., 및 Vanni A., 2002. Bioconjugation, 10: 389-394 참조). 본 발명이 임의의 특정한 메커니즘에 제한되는 것은 아니며, 상기 메커니즘의 이해가 본 발명의 수행에 필수적인 것은 아니나, 템플릿 디자인 중에 고려되는 구조적 고려사항들은 비제한적인 예로서, 키랄성, 평면성, 분자의 원하지 않는 특성들을 초래하는 구조의 제거(예를 들면, 분자의 독성 결정기의 제거), 및/또는 용매-접근가능한 적절한 표면의 존재, 정전위 표면 및/또는 템플릿 분자의 친유성-친수성 표면 및 이의 모노머들 및 가교제들과의 잠재적인 상호작용과 템플릿 합성의 단순성 등이 있다. 일부 실시예들에 있어서, 초고속 형상 인식 기술이 적용되어 고성능 2차원 구조 인식 뿐만 아니라 바람직하게는 가장 식별가능한 패턴 중 하나, 즉, 3차원 분자 형상에 의한 분자와 가장 근접하게 유사한 화합물들에 대한 통상적인 검색을 가능케한다(예를 들면, Balletser P., 및 Richards W.G., 2007. Proceedings of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences, 463: 1307-1321 참조)
비제한적인 일 실시예에 있어서, 오크라톡신 A에 대한 템플릿은 도 1에 도시된 바와 같은 N-(2-히드록시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌이다.
N-(2-히드록시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌에 대한 합성 방법의 비제한적인 일 실시예에 있어서, 합성은 3,5-디클로로살리실산과 아세트산 무수물(acetic anhydride)을 반응시켜 2-아세톡시-3,5-디클로로벤조산을 수득하는 것으로 개시되며, 이는 옥살릴 클로라이드(oxalyl chloride)의 작용에 의해 산 염화물로 전환된다. 2-아세톡시-3,5-디클로로벤조산 염화물은 트리에틸아민의 존재하에, 페닐알라닌 에틸 에스테르 하이드로클로라이드와 인 시투로 반응하여 N-(2-아세톡시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌의 에틸 에스테르를 수득한다. 합성 방법의 마지막 단계에서, N-(2-아세톡시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌 에틸 에스테르의 두 에스테르 작용기에 신규하고 특이적인 가수분해를 도입하여 OTA 템플릿인 N-(2-히드록시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌(I)을 98% 수율로 수득한다. 상기의 합성 반응은 도 2에 요약된다.
따라서, 본 발명은 경제적으로 가능한 방식으로 대량 생산 가능한 템플릿(예를 들면, OTA 템플릿)의 합성을 위한 공정 및 물질들을 제공한다.
Ⅱ. MIP 중합에 사용되는 모노머들 및 가교제들
MIP의 합성에 있어 사용되는 모노머들을 선택할 때, 어느 모노머 또는 모노머들의 조합이 템플릿과 가장 상호작용(예를 들면, 공유, 비공유, 이온, 수소 결합, 소수성 상호작용, 반데르발스 상호작용)을 잘 형성하는지 평가하기 위해 템플릿 분자의 구조적 특징들이 고려된다. 비제한적인 일 실시예에 있어서, 본 출원에 개시되는 OTA 템플릿(I)(예를 들면, N-(2-히드록시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌)의 핵심 구조적 특징들은 (i) 두 산성 작용기들(-OH 및 -COOH); (ii) 하나의 강한 극성의 펩티드 그룹(-NHCO-); 및 (iii) 템플릿 구조의 일부 저극성 탄화수소 부분들(예를 들면, 이들 각각은 모노머들 및 가교제 분자들과 복합체를 형성할 수 있다)을 포함한다. 본 출원에 참조로서 병합되는 미국 특허 출원 제 10/181435호는 MIP 기능성 모노머들 밑 컴퓨터 모노머 선택 방법들을 설명하고 있다(예를 들면, 앞서 인용한 Baggiani et al., 2002 참조).
모노머들 및 특이적 모노머들(예를 들면, 본 발명의 MIP 합성 방법에서 활용되는)의 종류들은 이에 제한되는 것은 아니나, 다음의 종류들 및 이의 유도체들을 포함한다: 아크릴산 및 유도체들(예를 들면, 2-브로모아크릴산, 아크릴로일 클로라이드, N-아크릴로일 티로신, N-아크릴로일 피롤리디논, 트랜스-2-(3-피리딜)-아크릴산), 아크릴레이트(예를 들면, 알킬 아크릴레이트, 알릴 아크릴레이트, 히드록시프로필 아크릴레이트), 메타크릴산 및 유도체들(예를 들면, 이타콘산, 2-(트리플루오로메틸) 프로페노산), 메타크릴레이트(예를 들면, 메틸 메타크릴레이트, 히드록시에틸 메타크릴레이트, 2-히드록시에틸 메타크릴레이트, 3-술포프로필 메타크릴레이트 소듐 염, 에틸렌 글리콜 모노메터크릴레이트), 스티렌(예를 들면, (2,3 및 4)-아미노스티렌, 스티렌-4-술폰산, 3-니트로스티렌, 4-에틸스티렌), 비닐(예를 들면, 비닐 클로로포르메이트, 4-비닐벤조산, 4-비닐벤즈알데히드, 비닐 이미다졸, 4-비닐페놀, 4-비닐아민, 아크롤레인), 비닐피리딘(예를 들면, (2, 3, 및/또는 4)-비닐피리딘, 3-부텐 1,2-디올), 보론산(예를 들면, 4-비닐보론산), 술폰산(예를 들면, 4-비닐술폰산, 아크릴아미도-2-메틸-1-프로판-술폰산), 금속 킬레이터(예를 들면, 스티렌 이미노디아세트산), 아크릴아미드 및 유도체들(예를 들면, N-메틸 아크릴아미드), 메타크릴아미드 및 유도체들(예를 들면, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-(3-아미노프로필) 메타크릴아미드), 알켄(예를 들면, 4-펜테노산, 3-클로로-1-페닐-1-프로펜), (meth)아크릴산 무수물 및 유도체들(예를 들면, 메타크릴 무수물), 실리콘-함유 모노머들(예를 들면, (3-메타크릴옥시프로필) 트리메톡시 실란, 테트라메틸디실록산), 폴리렌(예를 들면, 이소프렌, 3-히드록시-3,7,11-트리메틸-1,6,10-도데카트리엔), 아지드(예를 들면, 4-아지도-2,3,5,6-테트라플루오로벤조산), 티올(예를 들면, 알릴 머캅탄). 아크릴레이트 종결 또는 다른 불포화 우레탄들, 카보네이트들 및 에폭사이드들 역시 본 발명의 실시예들에서 사용될 수 있으며, 실리콘계 모노머들도 사용될 수 있다.
바람직한 실시예들에 있어서, OTA에 대한 템플릿(즉, N-(2-히드록시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌)을 향해 인도되는 MIP의 합성에 사용되는 모노머들 및 가교제는 2-비닐피리딘, 2-히드록시에틸 메타크릴레이트 및/또는 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트를 포함한다. 본 발명이 특정한 메커니즘에 제한되지는 않으며, 메커니즘의 이해가 본 발명의 실행에 필수적인 것은 아니나, 2-비닐피리딘은 템플릿의 산성 작용기와 이온 결합을 형성하고 피리딘 고리의 염기성 질소원자에 근접한 비닐 결합을 함유한다. 상기 템플릿과 2-비닐피리딘의 이러한 상호작용은 상기 템플릿 분자의 매우 근접 위치에서 고분자 형성을 촉진하고, MIP 내에서 및 MIP 및 OTA 사이의 강한 결합을 가능케한다(예를 들면, 템플릿 화합물이 제거되고, MIP가 표적 OTA 분자와 상호작용이 가능한 이후). 본 발명이 임의의 특정 메커니즘에 제한되지는 않으며, 본 발명의 수행에 메커니즘의 이해가 필수적인 것은 아니나, 2-히드록시에틸-메타크릴레이트 모노머의 히드록실기는 템플릿의 높은 극성의 펩티드 결합과 함께 추가적인 수소 결합을 형성한다. 추가적인 제제는 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트이다. 본 발명이 임의의 특정 메커니즘에 제한되지는 않으며, 본 발명의 수행에 있어 메커니즘의 이해가 필수적인 것은 아니나, 일부 실시예들에 있어서 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트는 가교제(후술함)로서 사용될 수 있으며, OTA 템플릿 분자에 존재하는 저극성 작용기들과 상호작용하는 불포화 디에스테르를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 모노머들의 개별 종류들은 개별적으로 사용되거나 다른 종류의 모노머들과 조합되어 사용될 수 있다.
가교제들이 사용되는 경우 바람직하게는 하나 혹은 일부의 폴리머 혹은 올리고머 화합물들이거나, 특정 조건들 하에서 분해를 위해 제공되는 화합물일 수 있다. 개체인 폴리머 화합물들에 강성을 부여하는 가교제들은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자들에게 공지되어 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 디-, 트리-, 테트라- 및 펜타-관능성 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 비닐, 알릴 및 스티렌을 포함한다. 가교제의 특정한 예들로서, 이에 제한되는 것은 아니나, p-디비닐벤젠, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(약칭: EGDMA), 테트라메틸렌 디메타크릴레이트(약칭: TDMA), N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드(약칭: MDAA), N,N'-1,3-페닐렌비스(2-메틸-2-프로펜아미드)(PDBMP), 2,6-비스아크릴로일아미도피리딘, 1,4-디아크릴로일 피페라진(약칭: DAP), 1,4-페닐렌 디아크릴아미드 및 N,O-비스아크릴로일-L-페닐알라니놀을 들 수 있다. 가역, 분해가능한 가교제의 예로서, 이에 제한되는 것은 아니나, N,N'-비스-(아크릴로일) 시스타민, N,N-디알릴타르타르디아미드, N,N-(1,2-디히드록시에틸렌) 비스아크릴아미드, N1-((E)-1-(4-비닐페닐)메틸리덴)-4-비닐아닐렌, 알릴 디설파이드 및 비스(2-메타크릴로일옥시에틸)디설파이드를 들 수 있다. 바람직한 실시예들에 있어서, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트는 가교제로 사용된다. 바람직한 가교 모노머는 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트이지만, 본 발명의 실시예들에는 이에 제한되지 않으며, 디비닐벤젠 및 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트(약칭: TRIM)과 같은 다른 가교 모노머들도 사용 가능하다.
가교제에 대한 간단한 모노머의 임의의 비율이 사용되어 최종 적용예(예를 들면, 음식 또는 식품 생산물, 수경농업을 위한 물, 인 비보 등)에 따라 사용되는 MIP 구조적 완전도를 제공할 수 있다.당해 기술 분야의 숙련자라면 모노머의 적절한 비율을 선택하여 원하는 구조적 완전도를 제공할 수 있으며, 이는 표적 분자의 성질 및 구조와 사용되는 템플릿의 성질 및 구조와 밀접하게 연관된다.
인 비보에서 사용되는(예를 들면, 치료적 또는 진단 목적으로, 또는 동물 사료 및 인간 식품의 섭취가능한 격리 성분으로서) 활용되는 폴리머 혹은 올리고머 화합물의 경우, 비독성이며 인 비보 안정성 및 용해성을 보이는 모노머들을 선택하는 것이 중요하다. 비제한적이며 바람직한 예들로서, 아크릴아미드 및 메타크릴레이트를 들 수 있다. 이와는 달리, 상기 폴리머는 후중합(post-polymerization)으로 처리되어 예를 들면, 적절한 유기 또는 무기 제제들과의 반응에 의해 템플릿 용해성을 증진할 수 있다.
자유 라디칼, 양이온성 및 음이온성 중합을 포함하는 서로 다른 중합 방법들이 사용될 수 있다. 중합 조건들은 상보적 고분자 화합물이 생성되는 화합물의 활성 형태에 불리한 영향을 미치지 않도록 선택 및 제공된다. 특히 바람직한 실시예들에 있어서, 자유 라디칼 침전 중합 방법이 사용된다(하기의 섹션 III. 참조).
추가적으로, MIP의 중합은 전형적으로 개시제의 점가에 의해 시작된다. 개시제의 비제한적인 예로서, 아조-비스이소부티로니트릴(약칭: AIBN), 아조-비스디메틸발레론니트릴(약칭: ABDV), 벤질의 디메틸아세탈, 벤조일퍼옥사이드(약칭: BPO) 및 4,4'-아조(4-시아노발레르산)을 들 수 있다. 바람직한 실시예들에 있어서, 상기 개시제는 아조-비스이소부티로니트릴이다.
바람직한 실시예들에 있어서, 모노머, 가교제 및/또는 MIP들은 감소된 또는 무독성 및 높은 물 수착성 및 보유성과 같은 바람직한 안전 및/또는 환경적 특성을 갖는다. 바람직한 실시예들에 있어서, MIP들은 재활용될 수 있으며, 경제적으로 실현가능/생산가능하다.
III. MIP 합성에 사용되는 용매들
중합 반응이 수행되는 용매/용매 혼합물의 선택은 표적 화합물로의 MIP 결합 친화도의 범위, 선택성 및 특이성에 강한 영향을 미친다. 본 발명이 임의의 특정 메커니즘에 제한되지는 않으며, 메커니즘의 이해가 본 발명의 수행에 필수적인 것은 아니나, 다공성은 다공생성성(porogenic) 용매 또는 하기의 특성들을 보유하는 용매 혼합물에 의해 촉진 또는 제공된다: 모노머 혼합물에 용해되고 중합반응에 비활성이며 생성된 고분자(MIP)를 용해시키지 않는다. 적절한 다공 생성성 용매들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 톨루엔, 크실렌, 에틸벤젠 및 디에틸벤젠과 같은 방향족 탄화수소; 시클로헥산과 같은 비극성 용매; 헥산, 헵탄, 옥탄 및 데칸과 같은 포화 탄화수소; 이소프로필 및 이소아밀 알코올과 같은 알코올; 디클로로메탄, 디클로로에탄 및 트리클로로에탄과 같은 지방족 할로겐화 탄화수소; 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 디메틸프탈레이트와 같은 지방족 또는 방향족 에스테르를 포함한다. 바람직한 실시예들에 있어서, 방향족 탄화수소 용매가 사용된다. 특히 바람직한 실시예들에 있어서, 톨루엔이 단독으로 사용된다. 일부 실시예들에 있어서, 톨루엔과 다른 용매의 혼합물이 사용된다. 일부 실시예들에 있어서, 톨루엔은 시클로헥산과 조합되어 사용된다. 상기 다공 생성성 용매들은 개별적으로 또는 2이상의 조합으로 사용될 수 있다. 첨가되는 상기 다공 생성성 용매의 양은 모노머의 총량 대비 약 10% 내지 500% 범위에서 변화될 수 있다. 본 발명이 임의의 특정 메커니즘에 제한되는 것은 아니며, 메커니즘의 이해가 본 발명의 수행에 필수적인 것은 아니나, 극성 용매들(예를 들면, 물, 아세토니트릴)은 모노머들 및 템플릿 사이의 강한 복합체 형성을 방해하여 표적 분자 결합(톨루엔 등에서와 같은)에 대한 MIP의 특이성을 감소시킨다.
또한 MIP 합성을 위한 매체로서 사용되는 용매 혹은 용매 혼합물은 MIP의 팽윤 특성 및 3차원 MIP 네트워크에서의 포어(pore)들의 사이즈에 영향을 미친다. 특정 실시예들에 있어서, 아세토니트릴과 같은 극성 용매들은 MIP 팽윤 및 포어 사이즈의 증가가 바람직할 때 MIP 중합을 위한 용매 혹은 공용매(co-solvent)로 사용된다; 이와는 달리, MIP 팽윤 및 포어 사이즈의 증가가 바람직하지 않은 경우에는(예를 들면, MIP가 팽윤이 유량을 지연시키고, 분석물의 용출 및 HPLC 기기의 성능을 약화시킬 수 있는 크로마토그래피 컬럼에서 사용되는 경우) 이러한 용매들은 바람직하지 않다.
용매 시스템의 신중한 선택이 MIP 포어 사이즈에 직접 영향을 미칠 수 있다. 비제한적인 실시예들에 있어서, OTA 템플릿에 인도되는 MIP의 합성 중, 시클로헥산 및/또는 톨루엔과 같은 저극서 용매들에서 가장 작은 입자(1-20㎛)가 형성되었다. 반면, 아세토니트릴 또는 물과 같은 극성 용매들에서 훨씬 크고 사이즈 균일성이 낮은(10-170㎛) 입자들이 형성되었다. 추가적으로, 높은 모노머 농도에서, 중합 반응은 MIP 모놀리스(monolith)의 그라인딩 중에 일어나는 매우 미세한 입자들의 생성 없이 그라인딩에 의해 용이하게 분산되는 큰 MIP 클러스터를 생성한다(후술하는 섹션 IV. 설명 참조). 매우 미세한 입자들은, 예를 들면, MIP가 컬럼 레진(미세 입자들이 유량을 지연시킬 수 있는)용도로 사용되거나, 미세입자의 존재가 원심분리 혹은 여과중 MIP의 수집을 지연 혹은 교란시키거나, 필터가 도입된 MIP의 양을 보존해야 하는 경우 결과적으로 MIP를 병합하는 특정 메쉬 필터의 포어 사이즈에 의해 통제되는 여과에 있어서 MIP의 적절한 한정을 방해하는 경우 적용하기에 바람직하지 않다. 분산된 MIP 클러스터들은 체로 처리되어 정의된 균일한 사이즈의 생성물을 제공할 수 있다. 그러므로, 중합 용매, 모노머 농도 및 물리적 처리 방법들의 선택은 미세입자들의 형성을 억제하면서, 바람직한 포어 사이즈 및 입자 사이즈를 갖는 MIP의 최적 수율에 영향을 미칠 수 있다.
용매 시스템의 선택은 중합 공정에 의해 형성되는 MIP의 물리적 형태를 결정한다. 예를 들면, 일부 용매 시스템들(비제한적인 예로서 시클로헥산 및/또는 톨루엔과 같은 저극성 용매들을 포함)은 전술한 바와 같이 침전 중합으로 지칭되는 공정 중에 고체 MIP 클러스터들을 생성한다. 다른 용매 시스템들(비제한적인 예로서, 물 내의 폴리비닐 알코올과 같은 극성 용매를 포함하는)은 에멀젼 중합(Vivaldo-Lima E., Wood P.E., Hamielec A.E., 1997. Industrial and Engineering Chemistry Research, 36: 939-965)으로 지칭되는 동적으로 고유한 공정을 촉진한다. 일반적으로, 중합의 성질은 MIP 네트워크의 물리적 형태 및 추가적인 가공의 용이성 양 쪽에 영향을 미친다(예를 들면, 그라인딩의 필요; 입자 사이즈의 균일성; 완충액 혹은 용매 교환의 용이성; 안정성). 중합 공정들은 본 출원에 참조로서 병합되는 Yan H., 및 Ho Row K., 2006. International Journal of Molecular Science, 7: 155-178에서 설명되고 있다. 바람직한 실시예들에 있어서, 침전 중합이 사용된다. 특정 실시예들에 있어서, 침전 중합은 균일하고 용이하게 조절가능한 입자 사이즈의 파우더 형태로 형성되는 MIP 산물을 생성한다. 한편, 비제한적인 예로서 벌크 중합을 포함하는 다른 중합 방법들은 추가 가공 또는 사용 전에 분쇄되는 대형의 MIP 모놀리스를 생성하여 불균일한 입자 사이즈를 야기하고 결과적으로 저성능을 초래할 수 있다.
IV. MIP 합성 및 MIP의 물리적 가공에 이어서 MIP로부터 템플릿을 제거하는 방법
신생 합성된 MIP로부터 템플릿을 분리하는데 사용되는 기술들은 일반적으로 템플릿-MIP 상호작용의 성질에 의해 결정된다. 예를 들면, 공유 결합들이 템플릿 및 MIP 네트워크 사이에서 형성되었을 때, MIP로부터 템플릿의 화학적 분리가 요구된다. 이와 대조적으로, 상기 템플릿 및 MIP 네트워크 사이의 상호작용이 비공유적인 경우, 용매 추출만으로 상기 템플릿을 제거하기에 충분하다(예를 들면, 앞서 인용한 본 출원에 참조로서 병합되는 Yan H., 및 Ho Row K., 2006; Sellergren B., 2001. The non-covalent approach to molecular imprinting. In: Molecularly Imprinted Polymers: Man-made mimics of antibodies and their application in analytical chemistry, (Sellergen B., ed.), Techniques and Instrumentation in Analytical Chemistry, Vol. 23 Elsevier, Amsterdam, the Netherlands, pp. 113-184 참조). 또한, MIP의 합성후 가공은 MIP 활성화로 지칭될 수 있다. 바람직한 실시예들에 있어서, MIP 활성화의 제1 단계는 약하게 감소된 압력에서 MIP 물질로부터 용매를 디캔팅(decanting) 후 증발(회수) 하는 단계를 포함한다(예를 들면, 회전 증발기 시스템을 사용하여). 제2 단계는 MIP 입자들을 그라인딩하여 더 작은 입자를 수득하는 단계를 포함한다(예를 들면, 모르타르 및 막자 혹은 밀링 장치를 이용하여). 제3 단계는 예를 들면, 0.2 w/v% 수산화나트륨으로 상기 MIP 입자들의 복수의 세척을 포함한다. OTA MIP가 합성되는 실시예들에 있어서, 세척의 완결은 템플릿 검출을 위한 FeCl3 용액을 사용하여 음성 테스트가 얻어질 때까지 추적된다(실시예 2 내지 실시예 4 참조). 일부 실시예들에 있어서, 1% 아세트산으로 1회 세척 및 물로 1회 세척이후 용매 잔여물들이 모두 제거될 때까지 최종 MIP 생성물의 건조가 수행된다(예를 들면, 건조 오븐에서 6~8 시간 동안 80℃에서). 최종적으로, MIP 입자들이 체에 걸러져서 확정된 입자 사이즈의 생성물이 제공될 수 있다. 바람직한 실시예들에 있어서, MIP의 물리적 형태는 사용 전에, 예를 들면, MIP가 분산을 위해 분쇄 혹은 그라인딩 등이 요구되는 모놀리스 블록을 형성하지 않으며, 강한 그라인딩을 요구하지 않는다. 바람직한 실시예들에 있어서, MIP의 대부분은 건조시 파우더를 형성하는 스피어(sphere)를 형성한다.
바람직한 실시예들에 있어서, 세척 단계는 MIP 네트워크로부터 템플릿 분자의 적어도 95%를 제거하기에 충분하다. 특히 바람직한 실시예들에 있어서, 세척 단계들은 상기 MIP 네트워크로부터 템플릿 분자의 적어도 99.9%를 제거하기에 충분하다.
V. MIP 조성물의 적용
본 발명의 조성물들 및 방법들은 식용, 치료용, 예방용, 식품 및 음료 가공 및 제조 뿐만 아니라 연구 및 품질 통제 등의 용도에 적용된다. 예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 합성 템플릿들(예를 들면, 본 출원에 개시되는 방법들을 사용하여 생성되는)이 MIP 합성을 위해 활용된다. 본 발명은 임의의 특정한 합성 템플릿 및/또는 합성된 MIP에 제한되지는 않는다. 실제로, 다양한 합성 템플릿들이 생성되고 활용될 수 있으며, 이의 비제한적인 에들은, OTA 템플릿(예를 들면, N-(3,5-디클로로-2-히드록시벤조일)-L-페닐알라닌, 실시예 1 참조), 아플라톡신 템플릿, 트리코테센 템플릿(예를 들면, 세스퀴테르펜 알코올 템플릿(예를 들면, 데옥시니발레놀(DON) 템플릿), 제아랄레논 템플릿, 스포리데스민 템플릿, 스테리그마토시스틴 템플릿, 푸모니신 템플릿, 파툴린 템플릿, 시트리닌 템플릿 및/또는 내생균 연관 에르고트 템플릿을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 마이코톡신과 유사한 외부 작용기들을 포함하는 합성 템플릿(예를 들면, MIP OTA 합성에 사용되는)을 생산하는 조성물 및 방법들을 제공하며(예를 들면, 상기 템플릿은 본 발명의 공정에서 MIP를 생성하는데 활용되며, 이어서 MIP로부터 제거되며, MIP는 외부 작용기들에 의해 유사성을 갖는 마이코톡신에 대해 고친화도를 보인다), 마이코톡신은 아세톡시시르펜네디올, 아세틸데옥시니발레놀, 아세틸니발레놀, 아세틸네오졸라니올, 아세틸 T-2 톡신, 아플라톡신, 아플라톡신 B1, B2, G1 및 G2, 아플라트렘, 알테누산, 알테르나리올, 오스트디올, 오스트아미드, 오스토시스틴, 아베나세인 +1, 부베리신 +2, 벤티놀리드, 브레비안아미드, 부테놀리드, 칼로넥트린, 케토글로보신, 케토신, 케토민, 시트리닌, 시트레오비리딘, 코클리오디놀, 사이토칼라신, 시클로피아존산, 데아세틸칼로넥트린, 데아세틸네오졸라니올, 데옥시니발레놀 디아세테이트, 데옥시니발레놀 모노아세테이트, 디아세톡시시르페놀, 데스트럭신 B, 에메스트린, 엔니아틴, 에르긴, 에르고코닌, 에르고크리스틴, 에르고크립틴, 에르고메트린, 에르고닌, 에르고신, 에르고타민, 에르고발린, 리세르골, 리세르긴 산 및 연관 에피머들과 같은 에르고트 알칼로이드 톡신들 및 내생균들, 프럭티게닌 +1, 푸마길린, 푸모니신, 푸모니신 A1, A2, B1 및 B2 및 B3, 푸사레논-X, 푸사로크로마논, 푸사르산, 푸사린, 글리오톡신, HT-2 톡신, 하이알로덴드린, 이포메아닌, 이술란디톡신, 이소푸미각라빈 A 및 B, 라테리틴 +1, 렙토신, 리코마라스민 +1, 말포르민, 말토리진, 모닐리포르민, 모노아세톡시시르페놀, 마이코페놀산, 네오졸라니올, 니발레놀, NT-1 톡신, NT-2 톡신, 오크라톡신, 오오스포레인, 옥살산, 파스팔리트렘 A 및 B, 파툴린, 페니실린산, 페니트렘, 포몹신, PR-톡신, 로리딘 E, 로큐포르틴 A 및 B, 루브라톡신, 루브로스키린, 루브로설핀, 루굴로신, 삼부시닌 +1, 사트라톡신,F,G,H, 시르펜트리올, 시로데스민, 슬라프라민, 스포리데스민, 스테리그마토시스틴, 스와인소닌, T-1 톡신, T-2 톡신, 테누아조산, 트리아세톡시시르펜디올, 트리코테센, 트리코데르민, 트리코테신, 트리코베린, 트리코베롤, 트립토퀴발렌, 베루카린, 베루쿨로겐, 버티실린, 비오푸르푸린, 비오멜레인, 비리디톡신, 보르트만닌, 크산토실린, 야바니신+1, 제아랄레놀, 제아랄라논, 제아랄레논,α,β, 제아랄라논,α,β, 제라놀 및 이들의 서브패밀리 및/또는 유도체들 및/또는 콘쥬게이트들을 포함하는 그룹에서 선택된다. 특정 실시예들에 있어서, 표적 화합물은 OTA, 스포리데스민 또는 에르고트 알칼로이들이다.
유사하게, 다양한 MIP들이 생성되어 활용될 수 있으며, 이들은 이에 제한되는 것은 아니나, 전술한 합성 템플릿들 또는 템플릿으로서 다른 유기 분자(예를 들면, 비타민, 약물, 항생제, 오염물질, 호르몬, 효소, 단백질 등과 같은 영양소) 중 어느 하나를 사용하여 생성된 MIP를 포함한다.
본 출원에 개시되는 MIP들은 다양한 적용분야에 사용될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, MIP들은 액체의 정제에 활용될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, MIP들은 액체로부터 표적 화합물들(예를 들면, 일 이상의 마이코톡신)을 선택적으로 제거하는데 활용될 수 있다. 본 발명의 액체로부터 제거되는 상기 표적 화합물들(예를 들면, 일 이상의 마이코톡신)에 의해 제한되지 않는다. 실제로 비제한적인 예로서 본 출원에 개시된 마이코톡신들을 포함하는 다양한 표적 화합물들이 제거될 수 있다. 유사하게, 본 발명은 표적 화합물이 제거되는 액체의 종류에 의해 제한되지 않는다. 실제로, 다양한 액체 용액들이 이로부터 제거되는(예를 들면, 상기 용액에 일 이상의 다른 종류의 MIP들을 투여함으로써) 일 이상의 표적 화합물들(예를 들면, 마이코톡신)을 포함할 수 있으며, 상기 용액은 비제한적인 예로서, 음료(예를 들면, 인간에 의해 섭취되는(예를 들면, 쥬스, 포도주(예를 들면, 백포도주, 적포도주 등), 물, 맥주, 차, 커피 등), 물(예를 들면, 수경농업 용, 마시는 물 등), 식품(예를 들면, 인간, 동물 식품), 생물학적 유체(예를 들면, 혈액, 반추위, 위액 등) 생산에 활용되는 액체 등을 포함할 수 있다.
예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 본 발명에 개시되는 조성물들 및 방법들은 액체로부터 표적 화합물들(예를 들면, 마이코톡신)을 선택적으로 제거하는 MIP들을 제공한다. 상기 액체는 음료, 물, 생물학적 샘플, 이동식으로 공급되는 물 , 혈액, 반추위 액 또는 표적 화합물들을 함유하는 다른 종류의 액체일 수 있다. 추가적으로, 표적 화합물들은 다른 종류의 액체로부터 제거될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 본 출원에 개시되는 MIP들은 충분한 시간 동안 액체와 접촉(예를 들면, 혼합)되어 MIP들은 표적 화합물(예를 들면, 마이코톡신)과 상호작용 및 결합할 수 있다. 메커니즘의 이해가 본 발명의 수행에 필수적인 것은 아니며, 본 발명이 임의의 특정 메커니즘에 제한되는 것은 아니나, 일부 실시예들에 있어서, 상기 액체가 MIP와 상호작용 가능해진 후에, MIP에 함유된 복합체화/결합 캐비티들(예를 들면, MIP로부터 템플릿 분자가 제거된 후에 잔존하는 캐비티들)은 접촉에 의해 표적 화합물과 결합하며, 효과적으로 상기 액체로부터 상기 표적 화합물을 제거한다. 상기 액체는 이어서 추가 가공, 패키지 혹은 섭취(예를 들면, 인간 섭취, 동물 섭취 또는 동물 서식을 위해)를 위해 제조된다. 일부 실시예들에 있어서, 본 출원에 의해 생성 및/또는 제공되는 MIP들은 제거/격리 과정에 수반되는 물리적 및 화학적 힘을 견딜 수 있는 강성을 갖는 구조를 보유한다. 예를 들면, 바람직한 일 실시예에 있어서, 본 출원에서 제공되는 MIP는 선택적으로 표적 화합물에 결합하여 물질(예를 들면, 생명 유지에 필수적인(예를 들면, 공기 또는 수경농업 매체) 액체, 고체 표면, 생물학적 유체(예를 들면, 혈액, 반추위 액 등))로부터 상기 표적 화합물을 제거하고, 상기 표적 화합물과의 연관을 유지하여 MIP-표적 화합물 복합체가 상기 물질로부터 수집 및/또는 제거된다(예를 들면, 필터를 통해 액체를 펌핑, 액체를 필터를 통과하도록 주입, 필터를 액체 내부에 디핑(dipping), 용기의 표면 상에 MIP를 코팅, 원심분리, 필터 표면 상에 MIP 코팅, 동물의 배설물 분비 등).
일 실시예에 있어서, 액체로부터 표적 화합물들을 제거하는 방법은 고 선택적이다. 예를 들면, 액체는 복수의 표적 화합물들을 함유할 수 있으며, MIP는 오로지 하나의 특정 표적 화합물(예를 들면, 마이코톡신)만을 선택적으로 제거할 수 있다. 여기서 "하나"란 한 종류의 표적 화합물을 의미하며, 제거되는 표적 화합물들의 수를 의미하는 것은 아니다. 일부 실시예들에 있어서, 복수의 MIP들(예를 들면 복수의 상이한 MIP들의 집단(예를 들면, MIP의 제1 집단은 한 종류의 마이코톡신(예를 들면, 오크라톡신)에 특이적이며, MIP의 제2 집단은 제2 타입의 마이코톡신(예를 들면, 아플라톡신)에 특이적이다) 액체에 투여되어, 충분한 시간동안 상호작용하여 상기 액체로부터 복수의 다른 종류의 표적 화합물들(예를 들면, 마이코톡신)을 제거할 수 있다. 본 발명은 복수의 다른 종류의 표적 화합물들(예를 들면, 마이코톡신)을 포함하는 액체에 투여되는 MIP들의 다른 종류의 수에 의해 제한되지 않는다. 일부 실시예들에 있어서, 액체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 혹은 그 이상의 다른 종류의 표적 화합물들(예를 들면, 마이코톡신)을 포함하며, 상기 복수의 표적 화합물들 중 하나에 특이성을 갖는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 혹은 그 이상의 다른 종류의 MIP들을 포함하는 조성물이 MIP들이 상기 표적 화합물과 상호작용하여 격리시킬 수 있는 조건에서 상기 액체에 투여된다. 일부 실시예들에 있어서, MIP는 단일 표적 분자/화합물에 특이적 친화도를 나타낸다. 일부 실시예들에 있어서, MIP는 공통의 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 일 군의 분자들에 특이적 친화도를 보인다. 일부 실시예들에 있어서, MIP는 다른 표적 화합물들에 대한 복수의 다른 복합체화/결합(complexing/binding) 캐비티들을 보유하여, MIP는 MIP 가공 시, 복수의 표적 분자/화합물 사용에 따라, 복수의 표적 화합물들에 선택적으로 결합할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 복수의 다른 종류의 표적 화합물들(예를 들면, 마이코톡신 혹은 다른 유기 분자 표적 분자/화합물(예를 들면, 비타민, 약물, 항생제, 오염 물질, 호르몬, 효소, 단백질 등))을 포함하는 액체로부터 표적 화합물들을 제거하는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 방법은 다른 표적 화합물들에 결합하도록 디자인된 다른 종류의 MIP들의 군을 포함한다. 예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 액체 샘플이 제공되고, 상기 액체 샘플 내에 일 이상의 표적 화합물들의 존재를 식별하기 위한 분석이 수행된다. 특정 마이코톡신의 존재가 어느 마이코톡신이 존재하는지 결정하기 위해 검출된다. 상기 액체 샘플(예를 들면, 상기 액체 샘플은 그 샘플이 획득된 액체의 성질을 반영한다) 내에 존재하는 일 이상의 종류의 표적 화합물들이 식별되면 일 이상의 MIP들이 생성(예를 들면, 본 출원에 개시된 방법들에 따라) 및/또는 결합되면, 이어서 일 이상의 MIP들이 생기 액체 용액에 투여되어 표적 화합물들을 제거한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 일 이상의 표적 화합물들 종류의 식별은 표적 화합물들에 대해 특이적인 일 이상의 MIP들을 포함하는 컬럼 및/또는 필터의 사용을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 샘플(예를 들면, 액체 샘플)로부터 표적 화합물의 제거를 위해 MIP가 사용되면, 상기 표적 화합물은 MIP로부터 제거되고, MIP는 재사용된다. 일부 실시예들에 있어서, MIP는 적절한 방식으로 처리될 수 있다. 예를 들면, 표적 화합물들은 적절한 용매 및/또는 용액으로 세척을 통해 MIP로부터 제거될 수 있으며(예를 들면, MIP 재사용을 위해), 상기 용매 및/또는 용액은 MIP의 합성 반응 및 물리적 가공 등에 이어서, 템플릿으로부터 MIP를 분리하는 방법들에서 사용되는 용매들로부터 선택될 수 있다(예를 들면, 비제한적인 예로서 아세토니트릴, 톨루엔, 메탄올, 소듐 히드록사이드, 아세트산 등). 재회수된 MIP들은 다시 사용된다.
액체로부터 표적 화합물들을 제거하는 방법들은 MIP의 선택적인 성질 때문에 높은 회수율을 나타낼 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 제거 방법은 액체 내에 존재하는 표적 화합물의 약 25% 내지 약 99%를 회수한다. 일부 실시예들에 있어서, 제거 방법은 액체 내에 존재하는 표적 화합물의 약 35% 내지 약 99%를 회수한다. 일부 실시예들에 있어서, 제거 방법은 액체 내에 존재하는 표적 화합물의 약 50% 내지 약 99%를 회수한다. 일부 실시예들에 있어서, 제거 방법은 액체 내에 존재하는 표적 화합물의 약 75% 내지 약 99%를 회수한다. 다른 실시예들에 있어서, 제거 방법은 액체의 수득되는 표적 화합물 농도를 ppb(parts per billion) 레벨(예를 들면, 인간 및/또는 동물 섭취에 적절한 농도)까지 낮출 수 있다. 제거 방법은 당해 기술분야의 숙련자에 알려진 현재의 제안된 통제 전략에서 발견되는 특정 농도 레벨을 제공하도록 조작될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 제거 방법은 특정한 pH 레벨을 갖는 액체 상에 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 조성물들 및 방법들은 약 1 내지 13의 pH를 갖는 액체에 대해 사용될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, MIP는 표면으로부터 표적 화합물들에 제거하는데 활용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 특정한 실시예들은 표면 상의 표적 화합물들(예를 들면, 마이코톡신)의 존재를 감소시키는 방법들을 제공하며, 이는 상기 표면을 MIP를 포함하는 조성물에 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정한 실시예들에 있어서, 상기 접촉은 MIP가 표적 화합물을 결합 및/또는 격리시키는데 충분한 시간 동안 수행된다. 다른 실시예들에 있어서, 본 발명은 표적 화합물들을 함유하는 환경적 표면의 오염을 제거하는 방법을 제공한다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 표적 화합물은 환경적 표면과 연관되고, 상기 방법은 상기 환경적 표면을 상기 표면으로부터 오염을 제거하는데 충분 양의 조성물(예를 들면, MIP를 포함하는)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 그것이 바람직하기는 하지만, 오염 제거에 의해 상기 표적 화합물이 완전하게 제거되어야 하는 것은 아니다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 조성물들(예를 들면, MIP를 포함하는) 및 방법들은 염료, 페인트 및 다른 표지 및 식별 화합물들을 추가적으로 포함하여, 처리된 표면이 본 발명의 조성물에 의해 충분히 처리되었는지를 확인할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, MIP는 표적 화합물이 표면 혹은 다른 화합물(예를 들면, 토양)에 접촉하는 것을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 특정한 실시예들은 MIP가 다른 물질들(예를 들면, 플라스틱 혹은 녹말 타입의 물질)과 결합되고 식생(vegetation)에 적용되어(예를 들면, 농업적 채소 재배) 성장 동안 표면 화합물들(예를 들면, 마이코톡신)로부터 식생을 보호하고, 추가적으로 상기 화합물이 다른 화합물들(예를 들면, 토양)을 오염시키는 것을 방지할 수 있다.
특정한 실시예들에 있어서, 개체(예를 들면, 인간 또는 동물)의 표면(예를 들면, 외부 혹은 내부 표면)은 본 발명의 조성물로 처리된다(예를 들면, 외부적으로 또는 내부적으로). 다른 실시예들에 있어서, 상기 접촉은 경구, 비강, 구강, 직장, 질 또는 국부 투여를 통할 수 있다. 본 발명의 조성물들이 약학적으로 투여될 때, 상기 조성물들은 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제, 안정화제, 희석제 등을 추가적으로 포함한다. 추가적인 실시예들에 있어서, 본 발명은 추가적인 약학적으로 허용가능한 생활성 분자들(예를 들면, 항체, 항생제, 핵산 주입 수단, 비타민, 미네랄, 보조인자, 마이코톡신을 결합 및/또는 격리시킬 수 있는 인자들(예를 들면, 이스트 세포벽 추출물(예를 들면, 진흙 물질과 결합된 이스트 세포벽 추출물 및/또는 이스트 세포벽과 병합 및/또는 얽힌 진흙 및/또는 진흙 입자들을 함유하는 이스트 세포벽 추출물들)) 등)을 더 포함하는 조성물들을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 개체는 질병 혹은 증상(예를 들면, 운동선수의 발)을 치료목적으로 처리하기 위해 본 발명의 조성물(예를 들면, MIP를 포함하는)이 투여될 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 개체는 질병 혹은 증상(예를 들면, 운동선수의 발)을 예방목적으로 처리(예를 들면, 신호 혹은 증상의 시작을 방지)하기 위해 본 발명의 조성물(예를 들면, MIP를 포함하는)이 투여될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 조성물(예를 들면, MIP를 포함하는) 및 방법들은 임의의 종류의 영역 또는 표면에 적용될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 상기 영역은 고체 표면(예를 들면, 의학 장비), 용액, 기관(예를 들면 인간의 외부 또는 내부)의 표면 또는 식품을 포함한다.
본 발명은 액체 혹은 고체(예를 들면, 표적 화합물들의 제거에 의해)에 투여(예를 들면, 혼합)되는 일 이상의 MIP들의 양에 제한되지 않는다. 일부 실시예들에 있어서, 약 0.10mg, 0.50mg, 1.0mg, 2.0mg, 5.0mg, 10.0mg. 20.0mg, 50.0mg, 100.0mg, 500.0mg 혹은 그 이상의 MIP가 액체 혹은 고체의 리터 당 투여될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명의 MIP는 혈액관류(hemoperfusion)와 같은 독성 제거 방법으로 사용된다. 혈액관류는 혈액으로부터 독성 물질을 제거하기 위해 대용량의 개체의 혈액이 흡착 물질(예를 들면, MIP) 위호 통과하는 치료 기술이다.
통상적으로, 혈액관류에서 가장 흔하게 사용되는 수착제는 레진 및 다양한 형태의 활성탄 또는 석탄이다. 그러나, 이러한 물질들의 결합 특이성은 상대적으로 미약하며, 때로는 표적 화합물 뿐만 아니라 중요한 혈액 인자들도 흡착한다. 이에 따라, 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 표적 화합물들에 대해 보다 특이적이고 고 친화도를 갖는 수착제로서 본 발명의 MIP의 용도를 제공한다.
혈액관류는 동맥 카테터(arterial catheter)를 통해 끌어낸 혈액을 수착 물질(예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 본 출원에 개시된 MIP를 활용하는 수착 물질을 제공한다)을 함유하는 컬럼 또는 카트리지 내부로 펌핑함으로써 작동된다. 혈액이 상기 컬럼 내의 탄소 또는 레진 입자들 위로 통과하면서, 독성 분자들 혹은 입자들은 수착 입자들의 표면에 유도되고 컬럼 내에서 트랩된다. 혈액은 상기 컬럼의 타단부를 통해 흘러나오며, 정맥 카테터에 부착된 튜브를 통해 개체에게 다시 돌아간다. 혈액관류는 혈액 투석 또는 다른 여과 방법들보다 큰 부피의 혈액으로부터 독성을 제거할 수 있다; 예를 들면, 분 당 300mL의 혈액을 처리할 수 있다.
본 발명의 MIP는 혈액관류를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명의 MIP는 혈액관류를 사용하여 개체의 혈액으로부터 일 이상의 마이코톡신을 제거하는데 활용될 수 있다.
투여량 요법은 최적의 원하는 반응(예를 들면, 치료적 혹은 예방적 반응)을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 예를 들면, MIP를 함유하는 단일 볼루스(bolus)가 동물에게 투여될 수 있으며, 일부로 분리된 투여량으로 시간에 걸쳐 투여되거나 상기 투여량은 치료가 필요한 상황의 응급성에 의해 지시되는 대로 비례적으로 감소하거나 증가할 수 있다. 투약의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투약 단위 형태로 비경구 조성물들을 제형하는 것이 유리하다. 본 발명의 MIP의 투여량은 일반적으로 (a) 활성 화합물의 고유한 특성 및 원하는 특정한 치료적 혹은 예방적 효과, 및 (b) 각 개인별로 마이코톡신에 대한 민감성의 처리를 위한 활성 화합물과 같은 화합물의 내재적 특성의 한계에 의존한다. 투여되는 양은 특정 제제의 약물학적 특성과 투여 모드 및 경로와 같은 알려진 인자에 의존하여 변할 것이다: 나이, 건강 및 수여자의 체중; 증상의 성질 및 정도, 동시에 수행되는 치료의 종류, 치료의 빈번도 및 원하는 효과.
본 발명의 MIP들은 개체에의 투여에 적합한 약학적 조성물 내부로 병합될 수 있다. 예를 들면, 상기 약학적 조성물은 MIP 및 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함할 수 있다. 본 출원에 사용되는 "약학적으로 허용가능한 캐리어"는 생리적으로 양립가능한 용매, 분산매, 코팅, 항박테리아 및 항균류 제제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 캐리어들의 예들은 물, 염분, 인산 완충식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 이들의 조합 중 일 이상을 포함한다. 다수의 경우에 있어서, 조성물 내에 예를 들면, 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올, 염화 나트륨과 같은 등장성 제제를 포함하는 것이 바람직하다. 약학적으로 허용가능한 캐리어들은 웨팅(wetiing) 또는 에멀젼화제, 보존제 또는 완충액과 같은 부수적 물질의 미량을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이는 MIP의 유통 기한 또는 효율성을 증진시킨다.
특정한 실시예들에 있어서, 본 발명의 MIP들은 예를 들면, 비활성 희석제 또는 동화적으로 섭취가능한 캐리어와 함께 경구적으로 투여될 수 있다. 화합물(및 바람직한 경우 다른 성분들)은 또한 태블릿으로 압축된 연성 껍질 젤라틴 캡슐로 밀봉되거나, 개체의 음식에 직접 병합될 수 있다. 경구적 치료 투여를 위해, 화합물들은 부형제와 병합될 수 있으며, 소화가능한 태블릿, 구강 태블릿, 트로키, 캡슐, 엘릭세르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼, 펠렛 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여외의 방식에 의해 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 상기 화합물을 불활성화를 방지할 수 있는 물질로 코팅하거나 공투여(co-administer)될 수 있다.
또한, 보충 활성 화합물들이 조성물과 병합될 수 있다. 특정한 실시예들에 있어서, 본 발명의 MIP는 일 이상의 추가적 치료 제제와 함께 공-제형(co-formulated) 및/또는 공-투여된다.
본 발명의 약학적 조성물들은 본 발명의 MIP의 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 원하는 치료 효과를 얻기 위해 필요한 시간 동안 및 투여되는 유효한 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 각 개인의 질병 상태, 나이, 성, 체중 및 원하는 반응을 나타내는 각인 나노입자의 능력과 같은 인자들에 따라 변화할 수 있다. 치료적 유효량은 치료적으로 이로운 효과가 상기 각인 나노입자의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 우세한 양을 지칭할 수도 있다. "예방적 유효량"은 원하는 예방적 효과를 얻기 위해 필요한 시간동안 투여되는 유효한 양을 지칭한다. 일반적으로, 예방적 투여는 질병 증상 전에 혹은 초기 단계에서 개체에게 사용되므로, 예방적 유효량은 치료적 유효량 보다 작을 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 유기 물질(예를 들면, 식품) 및/또는 액체(예를 들면, 물, 포도주 또는 다른 음료)와 혼합 및/또는 개체에 직접 섭취되었을 때, 본 발명의 조성물은 개체에 의한 마이코톡신의 흡수를 감소시키고(예를 들면, 이에 따라 기능 저하 완화, 건강 증진 및/또는 마이코톡신 연관 질병 또는 병적 반응의 발현을 감소) 마이코톡신 또는 인간 음식 체인에 진입하는 고기, 생선, 달걀, 우유 및 다른 음식물 내의 이들의 대사물의 축적을 감소 및/또는 방지한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 물리적, 화학적 특성에 근거하여 불순물 혼합물로부터 고체 또는 반고체 화합물들을 제거하는 데 사용되며, 종래의 분리 장치와는 상이한 분리 장치들(예를 들면, 고체-상 추출(solid-phase extraction: SPE)을 제조하는데 사용된다. 일부 실시예들에 있어서, 분리 장치들은 추출 및 결과적으로 특정의 대응 템플릿 및 생성된 MIP의 템플릿 유사체들을 정제하는 카트리지 내에 병합될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 액상 크로마토그래피에서 사용되는 크로마토그래피 컬럼의 충진을 위해 사용되어, 활용되는 MIP의 대응 템플릿 및 템플릿 유사체의 특이적 용출을 가능케 할 수 있다. 제조된 MIP 컬럼들은 당해 기술 분야에 알려진 다른 기술들 및 물질들(예를 들면, 일반상, 이온 교환, 다양한 크기의 소수성 알킬 사슬들(비제한적인 예로서, -(CH2)n-CH3, n은 4, 8, 18 등)을 포함하여 펩티드들 및 작은 분자들과 상호작용하는 액상 실리카 컬럼) 보다 특이적인 상호작용을 가능케하며, 생성된 MIP에 대응하는 템플릿 및 템플릿 유사체들에 보다 특이적으로 인도된다. 일부 실시예들에 있어서, 특정 마이코톡신 또는 마이코톡신 군에 특이적인 복수의 서로 다른 MIP들이 상기 컬럼 충진에 사용될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 마이코톡신을 분리 및 정량화하는 물질을 제공한다. 본 발명은 샘플 내에 존재하는 마이코톡신들의 측정을 목적으로 식품/음식물 또는 액체 소스의 추적가능 측정 및 이의 통상적으로 허용되는 참조 화합물(예를 들면, UV-HPLC, 형광 검출기 또는 질량 분광 검출기 등을 사용하여 용출되는 마이코톡신 표준 물질)과의 대비를 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 마이코톡신 레벨의 추적능력은 단일 종류의 MIP 혹은 각각 특정 마이코톡신 또는 마이코톡신들의 군에 맞춰진 복수의 다른 종류의 MIP들을 사용하고 식품 혹은 음식 샘플(예를 들면, 곡물(예를 들면, 옥수수, 밀 등), 과일(예를 들면, 사과, 복숭아, 포도 등), 커피, 차, 코코아 등)을 포함하는 샘플 물질들 내에서 검출에 적용되어 달성될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 단일 종류의 MIP 혹은 각각 특정 마이코톡신 또는 마이코톡신들의 군에 맞춰진 복수의 다른 종류의 MIP들을 사용하는 마이코톡신 레벨의 추적능력은 마이코톡신들이 샘플 내에 존재하는지, 그렇다면 어떤 마이코톡신이 어떤 레벨로 존재하는지 여부를 결정하는 분석적 조사법(예를 들면, HPLC)에 적용된다. 일부 실시예들에 있어서, 마이코톡신을 검출하기 위한 분석적 도구(예를 들면, HPLC)는 음식 내에 마이코톡신 오염의 위험을 예견하는데 사용될 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 마이코톡신을 검출하는데 사용되는 상기 분석적 도구는 존재하는 마이코톡신을 감소 또는 제거하기 위해 어떤 MIP 또는 MIP의 조합이 제조된 샘플로부터의 물질에 적용되는 것이 필요한지를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 단일 종류의 MIP 혹은 각각 특정 마이코톡신 또는 마이코톡신들의 군에 맞춰진 복수의 다른 종류의 MIP들을 사용하는 마이코톡신 레벨의 추적능력은 동물 생산에 사용되거나, 동물 및 인간 섭취를 위해 음료로서 사용되는(예를 들면, 물, 우유, 쥬스, 포도주, 맥주 등) 액체들의 마이코톡신 함량을 검출하는데 적용된다.
일부 실시예들에 있어서, 마이코톡신 함량과 관련된 추적능력은 식품/음식 가공(고기 가공, 신선 생산 가공)에 적용되어 전제 생산 플로우에서 마이코톡신의 존재를 테스트하여 오염 문제가 어디서 발생하여 회수가 요구되는지 여부를 결정할 수 있다. 바코드 및 다른 추적 매체, 생산 공정 내의 모든 생성물의 이동 및 단계들이 분석 샘플의 추적능력이 적용될 수 있도록 참조되어야 한다.
일부 실시예들에 있어서, 단일 종류의 MIP 혹은 각각 특정 마이코톡신 또는 마이코톡신들의 군에 맞춰진 복수의 다른 종류의 MIP들을 사용하는 마이코톡신 레벨의 추적능력은 혈액 내의 마이코톡신 함량을 검출하는데 적용된다. 예를 들면, 본 발명은 수혈 실행에 사용되어, 공여자로부터 초기 수집으로부터 바로 수혈자에의 수혈 또는 마이코톡신 레벨의 추적능력을 통한 처리에 이르는 모든 지점에서 혈액 생성물의 행방 및 이의 가공, 테스팅, 저장 등의 측면에서 현재 상황을 설명하는 지속적 감시 경로를 촉진할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 본 출원에 개시된 MIP들을 마이코톡신의 감소 및/또는 제거를 위한 조성물들 및/또는 방법들(예를 들면, 본 출원에 개시된 물리적, 혼합, 화학적, 미생물학적 방법(예를 들면, 독성을 흡착 및/또는 격리시키는))에 사용되는 본 출원의 일 이상의 방법들 및/또는 물질들에 조합하여 활용할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 본 출원에 개시된 MIP는 마이코톡신을 격리하는 일 이상의 물리적, 혼합, 화학적 또는 미생물학적 방법들과 함께 활용된다. 기계적 분리(예를 들면, Dickens J.W., 및 Whitaker T.B., 1975. Peanut Science, 2: 45-50 참조), 밀도 구분(예를 들면, Huff W.E., 및 Hagler W.M., 1982. Cereal Chemistry, 59: 152-153 참조), 옥수수(예를 들면, Fusarium 톡신을 갖는)의 오염 감소를 위한 물 또는 소듐 카보네이트로 세척에 의한 곡물 세정(예를 들면, 오염된 곡물의 선별(예를 들면, 마이코톡신의 존재를 검출하는 물리적 분리 또는 형광을 통한), 열적 불활성화(예를 들면, Lee L.S., 1989. Journal of American Oil Chemistry Society, 66: 1398-1413 참조), UV 조사, X-레이 또는 마이크로웨이프 조사(예를 들면, CAST, 2003. Mycotoxins: Risk inplant, animal, and human systems. In: Task Force Report 139 (Niyo K. ed.), Council for Agricultural Science and Technology, Ames, Iowa, USA: pp. 1-199 참조) 및 톡신의 용매 추출(예를 들면, Scott P.M., 1998. Review of Veterinary Medicine, 149: 543-548 참조)과 같은 다양한 물리적 수단들이 마이코톡신의 존재를 감소시키는데 사용될 수 있다. 산, 염기(예를 들면, 암모니아, 가성 소다), 산화제(예를 들면, 과산화수소, 오존), 환원제(예를 들면, 비설파이트), 염소화 제제 및 포름알데히드와 같은 다양한 화학적 제제들이 오염된 식품들, 특히 아플라톡신 내의 마이코톡신을 분해하는데 이용되어 왔다(예를 들면, Hagler W.M,Jr., 1991. In Mycotoxins, Cancer and Health. (Bray G. and Ryan D.eds.) Lousiana State University Press, Baton Rouge, LN, USA Phillips T.D., Clement B.A., 및 Park D.L., 1994. Approaches to reduction of aflatoxin in foods and feeds. In: The toxicology of aflatoxins: Human health, veterinary agriculture significance (Eaton L.D. 및 Groopman J.D. eds.), Academic Press, New York, NY, USA: pp. 383-406 참조). 필터들(예를 들면, 여과 컬럼) 및 유사한 장치들이 마이코톡신을 제거하기 위해 활용될 수 있다.
본 발명은 또한 다양한 측면의 생성물(예를 들면, 본 발명 및/또는 본 발명을 활용하는 서비스의 생성물 및/또는 이의 성분들)을 제공하는 시스템 및 방법들을 제공한다. 또한 본 발명은 기업 외부의 집단에게 기업 제품을 제공하는 시스템 및 방법들을 제공한다. 예를 들면, 고객들 혹은 제품 분배자에게 일 이상의 MIP(예를 들면, 특정 마이코톡신 표적 MIP)와 같은 기업의 제품을 공급하는 시스템 및 방법을 제공한다. 예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 이력추적 시스템과 분리 혹은 결합될 수 있는 제품 관리 시스템을 제공한다. 예를 들면, 물질 샘플들은 물질 내에 마이코톡신이 존재 혹은 부존재하는지 여부; 마이코톡신이 존재한다면, 특정 마이코톡신이 식별될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 분석될 수 있다. 이러한 정보는 이력추적(예를 들면 모든 혹은 특정 마이코톡신의 부존재를 나타내는)을 위해 사용될 수 있다. 이러한 정보는 또한 샘플 물질 내에 존재하는 마이코톡신을 특이적으로 표적화하기 위해 특정 MIP의 조합이 생성 및 결합될 있는 MIP 제품 관리 시스템을 제공하는데 사용될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 기업은 기업 외부의 집단(예를 들면, 분배자 및/또는 고객)으로부터 주문 부서로 입력(예를 들면, 주문, 정보 혹은 물질들(예를 들면, 생물학적 샘플(예를 들면, 표적 화합물들을 포함하는 것으로 의심되는 액체 샘플)의 형태로)을 수용하고; 출력(예를 들면, 출하 부서로부터 전달된 제품의 형태로(예를 들면, 분배자 및/또는 고객에게) 또는 데이터 리포트(예를 들면 실험실 분석 서비스로서 이력추적)의 형태로)을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기의 생산 관리 시스템은 제품들(예를 들면, 일 이상의 MIP(예를 들면, 마이코톡신-특이적 MIP)의 기업 외부의 집단으로의 주문 및 전달(예를 들면, 비용 효율적인 방식으로)의 수령을 최적화하고; 상기 집단으로부터 제품에 대한 지불을 수령하기 위해 설계된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 생산 관리 시스템은 데이터시트 리포트(예를 들면, MIP(예를 들면, 마이코톡신-특이적 MIP)로 제조된 MIP-SPE 혹은 HPLC-컬럼의 사용을 통해 분석되는 일부 마이코톡신의 레벨)의 분석 및 전달(예를 들면, 비용 효율적인 방식으로)을 위해 제출되는 샘플들 혹은 물질들을 기업 외부의 집단에게 바코드화하고; 상기 집단으로부터 이러한 서비스에 대한 지불을 수령하기 위해 설계된다.
일부 실시예들에 있어서, 기업은 제조 및 관리를 포함한다. 본 발명의 조성물들은 제조 및/또는 제3 집단에 의해 생산될 수 있으며, 물질 저장 및/또는 다른 구성의 저장(예를 들면, 제품 저장)에서와 같이 개별적으로 저장될 수 있고, 또는 추가적으로 조합되고(예를 들면, 결합(예를 들면, 일 이상의 MIP가 일 이상의 다른 종류의 MIP 및/또는 다른 성분들(예를 들면, 캐리어 및/또는 본 출원에 개시된 다른 생활성 성분들)과 결합될 수 있다) 저장될 수 있다(예를 들면, 장치 및/또는 제품 저장 내에). 일부 실시예들에 있어서, 관리는 주문 부서(예를 들면, 고객 및/또는 분배자로부터 제품의 주문의 형태로 입력을 수용하는)를 포함한다. 주문 부서는 주문을 실행하라는 출하 부서로의 지시의 형태로 출력을 제공할 수 있다(즉, 고객 또는 분배자에게 요청된 대로의 제품을 포워딩 하라는). 일부 실시예들에 있어서, 상기 출하 부서는 제품 또는 서비스에 대한 주문 실행에 추가하여, 청구 부서에게 정보/데이터를 제공할 수도 있다. 일부 실시예들에 있어서, 기업의 다른 구성은 고객 서비스 부서(예를 들면, 고객으로부터 입력을 수용 및/또는 고객에게 피드백 또는 정보의 형태로 출력을 제공 및/또는 기업의 다른 구성에 입력을 수용하거나 출력을 제공할 수 있는)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 고객 서비스 부서는 예를 들면, 본 발명의 제품들 및 방법들이 고객의 특정 요구에 적용될 수 있는지 여부를 확인을 위한 요청 기술 정보의 형태로 고객으로부터 입력을 수용할 수 있으며, 상기 요청 기술 정보에 대한 응신의 형태로 출력을 제공할 수 있다.
따라서, 일부 실시예들에 있어서, 기업의 부분들은 서로 소통하도록 적절히 구성되어 기업 내부 및 외부에서의 물질 및 부품들, 장치들, 다른 성분들, 제품들, 데이터시트 및 정보의 전달을 촉진한다. 예를 들면, 물리적 경로가 활용되어 주문 부서로부터 적절한 입력이 수용되면 제품 저장으로부터 출하 부서로 또는 분석 요청의 쇄도가 수용되면 샘플 저장으로부터 분석 부서로 제품을 전달할 수 있다. 한편, 주문 부서는 기업 내의 다른 부서와 전자적으로, 예를 들면, 통신 네트워크(예를 들면, 네트워크(예를 들면, 인터넷 및/또는 인트라넷)에 의해 연결될 수 있고, 예를 들면 전화 네트워크, 메일 또는 다른 수송 서비스 또는 인터넷을 통해 고객으로부터 입력을 수용하도록 추가적으로 구성될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 생산 관리 시스템은 일 이상의 데이터 수집 시스템을 더 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 기업은 기업의 부서들에게 정보를 제공하거나 기업 외부의 집단에게 일 이상의 기업의 부서들로의 접근(예를 들면, 주문 부서 및/또는 고객 서비스 부서 및/또는 데이터 수집/저장 부서에의 접근)을 제공하는 다수의 소프트웨어 어플리케이션을 활용할 수 있다. 이러한 소프트웨어 어플리케이션은 인터넷, 로컬 영역 네트워크 또는 인트라넷과 같은 통신 네트워크를 포함할 수 있다. 예를 들면, 인터넷 기반 어플리케이션에서, 고객은 주문 부서와 협력하는 적절한 웹사이트 및/또는 웹 서버에 접근하여, 고객은 주문 부소로의 주문의 형태로 입력을 제공할 수 있다. 이에 대응하여, 주문 부서는 고객과 소통하여 주문이 접수되었음을 확인하고, 출하 부서와 추가로 통신하여 본 발명의 제품(예를 들면, 일 이상의 다른 종류의 MIP(예를 들면, 마이코톡신-특이적 MIP)를 포함하는 조성물)들이 고객 또는 분석 부서로 전달되어야 한다는 입력을 제공하고, 본 발명의 제품(예를 들면, 분리된 장치로서 포장된 일 이상의 다른 종류의 MIP(예를 들면, 마이코톡신-특이적 MIP)를 포함하는 조성물)을 사용한 분석이 수행되어야 한다는 입력을 제공한다. 따라서, 이러한 방식에 의해 기업의 비즈니스가 효율적인 방식으로 진행될 수 있다.
따라서, 일부 실시예들에 따른 네트워크 배열에 있어서, 기업의 다양한 서브-부서들(예를 들면, 저장, 분석, 청구 부서 및 출하 부서)이 각각의 컴퓨터 시스템에 의해 서로 통신할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 다양한 측면의 제품들(예를 들면, 본 발명의 제품들 및/또는 성분들)과 본 발명의 제품의 다양한 측면과 관련된 정보(예를 들면, 성능 데이터, 사용 통계 등)를 집단들(예를 들면, 고객/사용자, 분배자, 제3 집단(예를 들면, 정부기관(예를 들면, 국가 건강 기관 및/또는 질병관리센터) 등)에 제공하는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 제품은 예를 들면, 출하 부서에 의해 제품 저장소로부터 제거되고, 고객 또는 분배자와 같은 요청 집단에 전송된다. 이러한 출하는 주문을 요청한 집단에 반응하여 일어나고, 이어서 조작 내에서 처리되고(예를 들면, 적절한 부서에 전달) 상기 집단에게 주문된 제품 혹은 서비스가 전달되도록 한다. 제품의 출하에 대한 데이터 또는 상기 집단으로의 분석 서비스의 데이터시트는 예를 들면, 출하 또는 분석 부서에서 청구 부서로 조직내에서 추가적으로 전송되고, 이어서 상기 제품 또는 데이터시트와 함께 또는 상기 제품 혹은 데이터시트가 전송된 후에 상기 집단에게 청구서가 발행된다. 또한 본 발명은 본 발명의 제품 및/또는 성분들을 사용하여 집단들에게 기술적 서비스를 제공하는 방법을 제공한다. 이러한 기능은 제품 연구 및 개발을 담당하는 개인들에 의해 수행될 수 있으나, 기술 서비스와 관련된 요청들은 일반적으로 조직의 관리 부서(예를 들면, 고객 서비스 부서)에 의해 처리, 이동 및/또는 지시된다. 기술 서비스(예를 들면, 제품 또는 제품의 개별 구성들의 사용과 연관된 문제들을 해결하는) 통신은 사용자(예를 들면, 고객) 및 고객 서비스 부서 사이에서의 정보 교환을 필요로 한다.
전술한 바와 같이, 제품(예를 들면, 본 출원에 개시된 제품 및/또는 성분들) 및/또는 서비스를 사용자에게 공급하는 공정의 임의의 수의 변이들이 가능하며 이는 본 발명의 범위에 속한다. 이에 따라, 본 발명은 (1) 제품(예를 들면, 본 출원에 개시된 제품 및/또는 성분들)의 생산; (2) 이러한 제품들에 대한 주문 접수; (3) 주문을 제출한 집단에 상기 제품을 발송; (4) 발송한 제품에 대한 지불 의무를 지는 집단에 청구서 발송; 및/또는 (5) 집단에 발송된 제품에 대한 지불 접수를 수반하는 방법(예를 들면, 영업 방법)을 포함한다. 예를 들면, 다음의 단계들의 2 이상을 포함하는 방법이 제공된다: (a) 공급자로부터 부분, 물질 및/또는 성분들을 수득하는 단계; (b) 일 이상의 제1 제품(예를 들면, 본 출원에 개시된 일 이상의 성분들(예를 들면, 본 출원에 개시된 MIP 템플릿, 및/또는 상기 MIP 템플릿을 활용하여 생성된 일 이상의 다른 종류의 MIP들))을 제조하는 단계; (c) (b) 단계의 일 이상의 제1 제품을 저장하는 단계; (d) (b) 단계의 상기 일 이상의 제1 제품을 일 이상의 다른 성분과 결합하여 일 이상의 제2 제품(예를 들면, 2 이상의 다른 종류의 MIP들을 포함하는 조성물)을 형성하는 단계; (e) (b) 단계의 상기 일 이상의 제1 제품 또는 (d) 단계의 일 이상의 제2 제품을 저장하는 단계; (f) (b) 단계의 제1 제품 또는 (d) 단계의 제2 제품에 대한 주문을 획득하는 단계; (g) (b) 단계의 상기 제1 제품 또는 (d) 단계의 상기 제2 제품을 (f) 단계에서 주문을 요청한 집단에 출하하는 단계; (h) (g) 단계에서 제품이 출하된 집단이 지불해야 할 금액에 대한 데이터를 추적하는 단계; (i) (g) 단계에서 제품이 출하된 상기 집단에 청구서를 발송하는 단계; (j) (g) 단계에서 출하된 제품에 대한 금액을 수득하는 단계(일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니나, 지불은 (g) 단계에서 제품이 출하된 집단에 의해 이루어진다); 및 (k) 조직 및 (d) 단계에서 출하된 제품을 소유하는 집단(전형적으로, (g) 단계에서 제품이 출하된 집단) 사이에서 기술 정보를 교환하는 단계
구매자는 하나의 혹은 복수의 다른 종류의 MIP들을 구매하기를 희망할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 복수의 다른 종류의 MIP들을 포함하는 조성물은 구매자를 위해 주문 제작된다(예를 들면, 제거/격리되어야할 일 이상의 표적 화합물들의 존재에 관한 정보에 근거하여). 이의 장점은 고객이 그들의 필요에 맞는 특정 제품을 주문할 수 있다는 것이다(예를 들면, 단지 단일 MIP를 포함하는 조성물을 개별적으로 구매하여 이들을 조합한 각 조성물을 활용하기 보다는 각 표적 화합물에 특이적인 복수의 다른 종류의 MIP들을 포함하는 조성물을 구매).
본 발명은 주문 제품들의 디자인을 수반하는 방법들을 제공한다. 이러한 방법들은, 예를 들면, (1) 고객으로부터 특정 서브요소들을 갖는 제품 및/또는 이를 작동시키는 방법론에 대해 고객으로부터 주문을 취하는 단계, (2) 특정 서브요소들 및/또는 이를 작동하는 방법론을 갖는 제품의 제조, (3) (b) 단계의 상기 제품을 상기 고객에게 제공(예를 들면, 출하)하는 단계를 포함한다.
실험예들
후술하는 실시예들은 본 발명의 설명하고 추가적인 특정한 바람직한 실시예들 및 측면들을 나타내기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 오크라톡신 A(Ochratoxin A) 템플릿 합성
2-아세톡시-3,5-디클로로벤조산의 제조. 기계적 교반기, 온도계 및 압력 평형상태의 125mL 적하 펀넬을 구비한 1L의 구형바닥 3-넥(neck) 플라스크를 65℃로 유지된 수조에 배치하였다. 이어서 하기의 시약들을 상기 플라스크에 효율적으로 교반하면서 주입하였다: 250mL의 건조 톨루엔, 2.5mL의 농축 황산 및 이동 서스펜션을 형성하는 207g의 웰 그라운드, 고체 3,5-디클로로살리신산. 지속적으로 교반된 혼합물의 온도가 60℃(수조의 온도는 65℃로 유지됨)에 도달할 때, 108g(100mL)의 아세트산 무수물의 적하가 시작되고 30분 내에 완료되었다. 아세트산 무수물의 첨가 중에, 상기의 반응 혼합물의 온도는 75℃를 넘지 않도록 하였다. 첨가 완료후, 상기 혼합물은 교반되고 추가적인 4시간 동안 70℃로 가열되었다. 이 때, 교반이 정지되고 상기 혼합물을 상온에서 하룻밤동안 식혔다. 상기 혼합물로부터 분리된 흰색 결정들은 여과되고, 2 x 10mL의 냉각 톨루엔으로 세척하고 50℃에서 진공 건조되어 206g(82.7% 수율)의 2-아세톡시-3,5-디클로로벤조산을 수득하였다. 추가적인 30.6g(12.3%% 수율)의 생성물을 하기 단계에 의해 회수하였다: 여과물을 최초 부피의 1/2로 농축, 상기의 용액을 얼음물 수조에서 냉각, 결정화된 생성물을 여과 및 50℃에서 진공 건조.
2-아세톡시-3,5-디클로로벤조산 클로라이드의 인 시투 제조 및 N-(2-아세톡시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌 에틸 에스테르의 제조에 있어서 이의 용도(개인 안전 이유로, 본 공정은 흄 후드(fume hood)에서 수행된다)
생산 시스템은 효율적인 기계적 교반기(Ace Glass Inc, Louisville, KY, cat#13650-12/23), 250mL 적하 펀넬, 출구가 산성 증기 흡수기에 부착된 CaCl2 건조 튜브를 갖는 환류 컨덴서, 건조 질소 가스 입구 및 22℃의 수조에 배치된 온도계를 구비한 3L 반응기로 이루어진다. 1L의 건조 톨루엔, 5mL의 디메틸포름아미드 및 103g의 2-아세톡시-3,5-디클로로벤조산을 교반하면서 상기 반응기에 주입하였다. 메틸렌 디클로라이드 내의 2M 옥살릴 클로라이드 용액 217mL(1.05 당량)을 상기의 반응 혼합물에 2.5 시간 동안 교반하면서 서서히 적하하였다. 반응 중에 생성되는 독성 가스 혼합물(HCl, CO 및 CO2) 증기는 수돗물로 냉각된 트랩 내에 배치된 1L의 10% 수산화나트륨 용액에서 흡수되었다. 고체의 완전한 분해와 함께 옥살릴 클로라이드의 첨가를 완료 후에, 강한 건조 질소 스트림을 1시간 동안 상기 용액으로 통과시켜 상기 반응 혼합물에 용해되어 잔류하는 대부분의 산성 가스들(HCl, CO2)을 제거하였다. 이 때, 플라스크 내의 내용물을 15℃ 아래로 냉각시키고, 상기 혼합물에 고체 L-페닐알라닌 에틸 에스테르 하이드로클로라이드 95g(1.0 당량)을 첨가하였다. 새로운 500mL 적하 펀넬이 250mL을 교체하여 장착되고, 350mL의 톨루엔 내의 145mL의 트리에틸아민(2.55 당량) 용액으로 채웠다. 상기 트리에틸아민 용액은 2시간 동안 얼음물 수조에 첨가되어 반응 혼합물을 냉각 및 교반하였다. 첨가 중에, 상기 혼합물의 온도는 25℃ 아래로 유지되었다. 이러한 온도는 트리에틸아민 첨가 완료 후에 4시간 동안 유지되었고, 이어서 트리에틸아민 하이드로클로라이드는 여과되어 두 100mL 톨루엔으로 세척된 백색 케이크를 얻었다. 얻어진 여과물은 3L의 분리 펀넬로 전달되고 2회의 500mL 물 및 1회의 500mL 염수로 세척하였다. 톨루엔 층은 500mL 부피로 농축되고 결정화를 위해 냉장고 안에서 하룻밤동안 방치되었다. 여과물 상의 백색 결정들을 수집하고 1회의 100mL 냉각 톨루엔으로 세척하여, 108.7g(62%% 수율)의 N-(2-아세톡시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌의 에틸 에스테르를 수득하였다.
1H NMR (중수소화 클로로포름(CDCl3), ppm): 7.78 δ, J 2.8, 1H; 7.55 δ, J 2.4, 1H; 7.30-7.27 m, 3H; 7.11 broad δ, J 8.0, 1H; 7.08 δq, J 8.0 및 1.6, 1H; 4.99 q, J 6.0, 1H; 4.24 q, J 7.0, 2H; 3.29 dd, J 5.6 및 14.4, 1H; 3.21 dd, J 9.2 및 14.0, 1H; 2.11 s, 3H; 1.31 t, J 7.2, 3H.
N-(3,5-디클로로-2-히드록시벤조일)-L-페닐알라닌(OTA 템플릿)의 제조.
108g의 N-(2-아세톡시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌의 에틸 에스테르를 1L의 무수 에틸 알코올에 용해시키고 마그네틱 교반 바를 구비한 2L 구형 바닥 플라스크에 배치시키고, 주변 온도로 유지된 수조에 배치시켰다. 상기 혼합물에 37.2mL의 물 내의 33.33g 수산화나트륨 용액을 한 번에 첨가하고 얻어진 혼합물을 주변 온도에서 17시간(하룻밤) 동안 교반하였다. 68.6mL 부피의 농축 염산을 추가적인 2시간 동안 교반하면서 첨가하였다. 침전된 염화나트륨은 여과되고 여과물은 30T 압력, 60℃ 온도에서 증발 건조되었다. 88.9g(98% 수율)의 잔여물은 냉각 후에 무색 투명 생성물의 형태로 고형화되었고 톨루엔 또는 아세토니트릴에 잘 용해되어 OTA 템플릿(예를 들면, MIP-OTA 생산에 사용되는)을 생성하였다. MS: M+ 354 및 356 1H NMR (CDCl3, ppm): 12.2 very broad s, 1H; 7.49 d, J 2.4, 1H; 7.35-7.28 m, 3H; 7.20 d, J 2.0, 1H; 7.18-7.16 m, 2H; 6.80 br d, J 6.4, 1H; 6.4 very broad s, 1H; 5.07 dd, 5.2 및 5.2, 1H; 3.34 dd, J 14.0 및 5.2, 1H; 3.27 dd, J 13.6 및 5.2, 1H.
실시예 2: 톨루엔-시클로헥산 혼합물에서 MIP-OTA 합성
500mL의 톨루엔, 35.42g(0.1M)의 OTA 템플릿, 16.18mL(0.15M)의 2-비닐피리딘, 12.13mL(0.1M)의 2-히드록시에틸메타크릴레이트, 235.75mL(1.25M)의 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 2.46g(15mM)의 AIBN을 기계적 교반기, 환류 컨덴서, 온도계 및 질소 입구/출구를 구비한 3L의 4-넥 플라스크에 도입하였다. 얻어진 용액을 1 시단 동안 상온에서 교반하고 일정한 질소 스트림을 베셀을 통해 통과시켰다(예를 들면, 중합을 억제하는 산소를 제거하기 위해). 플라스크를 60℃로 가열하고 상기의 혼합물을 격렬하게 교반하였다. 상기 용액의 온도가 55℃ 까지 올라가면서 중합이 일어났다(예를 들면, 용액의 점도 증가에 의해 관찰됨). 중합 개시 후 15 분 시점에서 600mL의 (1:1) 시클로헥산/톨루엔 혼합물을 1회에 첨가하여 상기 용액으로부터 고분자 스피어의 분리를 촉진하였다. 상기 혼합물을 계속 격렬하게 교반하면서, 500mL의 톨루엔을 30분 후에 추가적으로 첨가하여 상대적으로 작은 부피의 용매 내에서 계속 증가하는 고체 MIP 서스펜션의 전체 혼합을 증진시켰다. 60℃ 온도 및 교반을 추가적인 5시간 동안 유지하고, 이후 교반을 중지하고 MIP 스피어들을 침전시켰다. 상청액을 제거하고 펠렛을 2L 회전 증발기 플라스크로 이동시켜 40℃의 온도 및 30T의 감압 조건에서 MIP 스피어로부터 잔여 용매들을 제거하였다. 건조된 스피어들은 대략 140 메쉬로 그라인딩되고 1.5L의 0.2w/v%의 수산화나트륨으로 30분 동안 교반하고 디캔팅하여 5회 세척하였다. 최종 MIP-OTA 스피어들을 디캔팅되는 1.5L의 0.5v/v% 아세트산 및 1.5L의 탈이온수와 혼합되었다. 얻어지는 템플릿-프리 습윤 MIP-OTA 스피어들(~1.0L 부피)을 4개의 유리 트레이들을 사용하여 4시간 동안 80℃의 실험실 오븐에서 건조시켰다. 백색 파우더 유사 형태의 MIP-OTA 248g(93% 수율)을 수득하였다. 하기의 표 1에서 확인되는 다양한 샘플들이 본 방법을 사용하여 합성되었다.
상술한 그리고 후속의 합성 공정을 위해, 중합 억제제는 진공 증류기에 의해 모노머들 및 가교제로부터 중합에 사용되기 전에 제거되었으며, 중합에 사용되는 용매들은 ACS 순도를 가졌다. 후속 세척에서 템플릿의 농도는 10㎍/mL 및 1mg/mL 농도 사이에서 템플릿에 대해 설계된 검정 곡선을 사용하여 λmax 385nm에서 템플릿의 Fe3+ 복합체의 레드-오렌지 색의 강도를 비교하여 수득되었다.
톨루엔-시클로헥산 혼합물에서 합성된 샘플들의 확인
샘플 ID 톨루엔-시클로헥산(mL) 최종 세척 모폴로지
523-29/30 45/15 에탄올 스피어, 백색 파우더
523-31 65/15 에탄올 스피어, 백색 파우더
523-34 65/35 에탄올/NaOH 스피어, 백색 파우더
523-35 55/22 에탄올/NEt3/H2O 백색 파우더, 클러스터
523-36 90/30 NaOH/H2O 백색 클러스터
실시예 3: 아세토니트릴에서 OTA MIP 합성
500mL의 아세토니트릴, 17.71g(50mM)의 OTA 템플릿, 8.1mL(75mM)의 비닐피리딘, 6.1mL(50mM)의 2-히드록시에틸메타크릴레이트, 117.9mL(625mM)의 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 1.23g(15mM)의 AIBN을 기계적 교반기, 압력 평형하의 500mL 적하 펀넬, 온도계 및 질소 입구/출구를 구비한 3L 4-넥 플라스크에 도입하고 전기 가열 난로로 가열하였다. 얻어진 용액을 상온에서 1시간 동안 교반하고 일정한 질소 스트림을 베셀을 통해 통과시켰다(예를 들면, 중합을 억제하는 산소를 제거하기 위해). 이후, 플라스크를 60℃로 가열하고 상기의 혼합물을 격렬하게 교반하였다. 용액의 온도가 55℃까지 증가됨에 따라 중합이 계속되었다(예를 들면, 용액의 점도 증가로 관찰됨). 중합 개시 후 30분 시점에서(예를 들면, 겔 형성이 관찰될 때), 1.5L의 아세토니트릴(55℃로 예비가열되고 산소 제거를 위해 질소로 세척)이 500mL 적하 펀넬으로부터 3부분으로 나누어 빠르게 첨가되어 블록 고분자 형성을 피하고 상기 용액으로부터 고분자 스피어 분리를 촉진하였다. 다음 17시간 동안(하룻밤) 상기 혼합물의 격렬한 교반 및 가열이 유지되었다. 이후, 가열 및 교반이 중지되고 MIP 스피어들이 침전되었다. 상청액은 제거되고 펠렛을 2L 회전 증발기 플라스크 내부로 이동하고 40℃ 온도 및 30T의 감압 조건에서 MIP 스피어들로부터 잔여 용매를 제거하였다. 건조된 스피어들은 대략 140 메쉬로 그라인딩되고 1.5L의 0.2w/v%의 수산화나트륨 용액으로 30분 동안 교반 및 디캔팅하여 5회 세척되었다. 최종 MIP 스피어들은 디캔팅되는 1.5L의 0.5v/v% 아세트산 및 1.5L의 탈이온수와 혼합되었다. 얻어지는 템플릿-프리 습윤 MIP-OTA 스피어들(~1.2L 부피)을 4개의 유리 트레이들을 사용하여 6시간 동안 80℃의 실험실 오븐에서 건조시켰다. 백색 파우더 유사 형태의 MIP-OTA 115g(86.2% 수율)을 수득하였다. 하기의 표 2에서 확인되는 다양한 샘플들이 본 방법을 사용하여 합성되었다.
아세토니트릴에서 합성된 샘플들의 확인
샘플 ID 아세토니트릴(mL) 최종 세척 모폴로지
523-48 100(+ 톨루엔 50mL) NaOH 스피어/클러스터, 노란색
523-49 50(+ 물 150mL) NaOH 스피어, 노란색/오렌지
523-59 225mL NaOH 스피어, 백색
523-60 190mL NaOH 스피어, 백색
4 x 0.2% NaOH 세척후, 1x 1% AcOH 세척에 이어 1x H2O 세척
실시예 4: 톨루엔에서 대량 MIP-OTA 제조
상기 제조는 저부 및 중간부에 2개의 프로펠러가 장착된 기계적 교반기, 전기 가열 난로, 온도계, 공기 평형 상태의 1.5L 적하 펀넬 및 질소 가스 입구 및 질소 유량을 제어하는 버블-미터가 장착된 환류 컨덴서를 구비하는 3L의 4-넥 리드를 갖는 반응기 내에서 수행되었다. 하기의 시약들이 상기 반응기 내에 도입되었다: 54.54g(154mM)의 N-(3,5-디클로로-2-히드록시벤조일)-L-페닐알라닌(OTA 템플릿), 25mL(231mM)의 2-비닐피리딘, 18.7mL(154.0mM)의 에틸렌 글리콜 모노메타크릴레이트, 363g(1.925M)의 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 770mL의 톨루엔 및 5.0g(30.8mM)의 AIBN. 추가적인 1.5L의 톨루엔이 적하 펀넬 내부에 도입되었다. 얻어진 반응 혼합물은 격렬하게 교반되고 45분 동안 주변 온도로 강한 질소 스트림을 처음에는 상기 적하 펀넬에 위치된 톨루엔을 통해, 나중에는 상기 반응기의 보이드(void) 부피로 통과시킴으로써 용해된 가스를 제거하였다. 중합 시간 동안 약한 질소 유량은 유지되었다. 중합은 상기 반응 혼합물을 55℃까지 가열함으로써 개시되었다. 15분 후에, 상기 혼합물의 점도가 증가하였으며 교반이 점차 비효율적이 되었다. 이 때, 추가적인 톨루엔 부피(주변 온도의)가 상기 적하 펀넬로부터 첨가되었다. 상기 첨가는 반응의 발열 특성에 의해 혼합물이 과열되는 것을 막고, 상기 반응 혼합물의 점도가 고분자 스피어들의 형성 및 분리 시간 동안 효율적 교반이 가능하도록 충분히 낮게 유지되기 위해 충분히 빠른 속도로 설정되었다. 다음 5시간 동안 60~70℃의 온도 및 교반이 유지되고, 이어서 상기 혼합물은 교반 없이 다음 날 까지 주변 온도에서 방치되었다. 이어서, 1.75L의 톨루엔 층을 MIP 입자들로부터 디캔팅하고, 톨루엔 습윤 MIP 입자들은 2.0L 회전-증발기 플라스크로 이동되었다. 상기 MIP 입자들 내부에 트랩된 톨루엔(~0.45L)의 대부분은 감압 조건 및 70℃ 아래의 온도에서 MIP 스피어들로부터 증발 제거되었다. 톨루엔 제거 마지막 시점에서, 형성된 파우더 유사 형태의 생성물은 더스트(dust)를 생성하는 경향을 나타냈다. 이 시점에서, 증발이 중단되고 MIP 입자들은 각각 500mL의 에탄올로 2회 세척되었다. 고체들로부터 약 0.75L의 에탄올이 디캔팅되고 증발되어 30g(55%)의 재생성된 OTA 템플릿 및 700mL의 재생성된 에탄올을 수득하였다. 백색 미세 교체들은 이어서 0.5L의 0.2w/v% NaOH로 4회 세척하고 이어서 500mL의 1v/v% 아세트산으로 1회 세척 및 500mL의 탈이온수로 1회 세척하였다. 얻어지는 "습윤" OTA-MIP는 이어서 80℃ 온도의 실험실 오븐에서 24시간 동안 건조되었다. 411.4g 질량(96.6% 수율)의 백색 파우더 유사 형태의 생성물이 수득되고 표준 체를 사용하여 분획하였다. 이러한 방법론은 표 3에서 확인되는 다양한 샘플들을 합성하는데 사용된다. 사이즈 분할의 상세 사항은 표 4에 제공된다.
톨루엔 또는 폴리비닐 알코올(PVA)에서 합성된 샘플들의 확인
샘플 ID 톨루엔 또는 PVA(mL) 최종 세척 모폴로지
514-37/39 150mL 톨루엔 NaOH 스피어/클러스터, 백색
523-40 5mL PVA+100mL 물 NaOH 스피어/클러스터, 백색
514-41 5mL PVA+50mL 물 NaOH 스피어/클러스터, 녹색
514-42/44 388+776mL 톨루엔 NaOH 스피어/클러스터, 백색
4 x 0.2% NaOH 세척후, 1x 1% AcOH 세척에 이어 1x H2O 세척
생성된 MIP-OTA의 사이즈 분할
분할 사이즈 분할 중량(g) MIP-OTA의 w%
> 106㎛ 212.81 51.8
45㎛ - 106㎛ 127.72 31.1
20㎛ - 45㎛ 56.97 13.9
< 20㎛ 13.28 3.2
실시예 5: 저온 및 UV-개시 MIP-OTA 및 NIP 중합/합성
광화학 반응 세트. 석영, 광화학 UV 이머젼 웰(immersion well)(Ace Glass, Catalogue # 7856-10)이 450Watt UV 램프(ACE Glass, Catalogue #7825-34)에 구비되고, 450 Watt Cased Power Supply (ACE Glass, Catalogue #7830-58)가 순환 칠러(chiller) WKL 230 LAUDA(Brinkmann Instuments, Inc.)에 부착되고, 4℃의 냉각수가 UV 램프가 켜지는 시점에 웰 표면을 통해 흐른다.
중합(표 5). 모노머들, 템플릿, 개시제(IABN) 및 가교제가 반투명 폴리에틸엔 병(Nalgenestyle 2105)에 도입되고, 아르곤 스트림을 15분 동안 상기의 혼합물에 통과시켜 자유 라디칼 중합을 억제하는 것으로 알려진 모든 산소를 제거한다. 상기 병을 닫고, 상기 이머젼 웰에 부착시키고, 상기 UV 램프 센터 레벨에서 상기 광화학 반응 세트와 함께 얼음물 수조 내부로 침지된다. 등이 켜질 때 램프 표면을 통해 냉각수가 흐르고 4시간 동안 반응 혼합물 조사(irradiation)가 유지된다(UV 안전 유리가 UV 램프가 켜질 때 필요하다). 추가적인 얼음이 공급되고, 과량의 물이 UV 중합 과정 동안 수조로부터 배수되어 수조의 온도를 4℃로 유지시킨다. 중합 완료 후, 병을 개봉하고, 고분자는 작은 조각들로 분쇄 및 그라인딩되어 다음과 같이 세척된다: 에탄올로 1회, 0.2% 수산화나트륨으로 10회, 1% 아세트산으로 1회 및 에탄올로 3회. 이에 따라 고분자로부터 템플릿을 제거하고 에탄올 잔류물을 제거하기 위해 실험실 오븐에서 최종 건조되는 MIP의 최대 활성을 보장한다. MIP-OTA의 수율은 #555-54A 및 555-54B에서 각각 56.7% 및 49%로 나타났다.
저온 및 UV 조사를 사용하여 합성된 MIP-OTA 샘플들의 확인
MIP-OTA 스티렌
(mM)		 2-비닐-피리딘
(mM)		 에틸렌글리콜 모노메타크릴레이트
(mM)		 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트
(mM)		 IABN
(mM)		 OTA 템플릿
(mM)
555-54A 10.73 - 7.16 89.5 1.07 7.16
555-54B - 10.73 7.16 89.5 1.07 7.16
실시예 6: 마이코톡신에 대한 MIP의 격리 능력-OTA에 적용
톨루엔-시클로헥산, 아세토니트릴 또는 톨루엔에서 생성된 MIP 고분자들이 화학적 상호작용을 통해 액체 또는 반액체 매체로부터 OTA 마이코톡신의 제거를 위해 OTA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 마이코톡신에 대해 테스트되었다. 생성된 MIP는 OTA 마이코톡신 격리의 친화도 측면에서 차이를 나타냈고 상기의 물질에 대해 특이성을 평가하였다. 12.5mg의 MIP가 Amicon 초원심분리기 필터 장치(5,000 Da)에 도입되었다. MIP 물질이 없는 블랭크 샘플 및 오로지 OTA 톡신만을 함유하는 양성 통제군이 함께 제조되어 테스트되었다. 격리 테스트는 pH 4.0으로 조절된 시트레이트 완충액 50mM에서 수행되었다. 모든 샘플들은 오비탈 회전 쉐이커(Brunswick, Champaign, IL, USA) 상에서 150rpm으로 유지되어 37℃에서 90분 동안 배양되었다. 12.5mL의 최종 부피 내의 50, 100, 250 ppb의 3개 최종 농도의 OTA가 테스트되었다. 배양 후에, 마이크로원심분리 튜브가 10분 동안 10,000rpm으로 원심분리되었다. 상청액은 앰버(amber) 및 실란화 HPLC 비알 내부에서 수집되어 비알과 마이코톡신의 상호작용을 방지하고 형광측정 및 다이오드-어레이 검출기 신호와 결합되어 표준 방법(예를 들면, Entwisle A.C., Williams A.C., Mann P.J., Slack P.T., Gilbert J., 1995. Liquid chromatography method with immunoaffinity column cleanup for determination of ochratoxin A in barley: Collaborative study. Journal of AOAC, 83: 1377-1383 참조)에 따라 HPLC(Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA)로부터 계산되었다(예를 들면, 마이코톡신 및 격리된 마이코톡신의 양을 측정).
결과들(표 5 참조)에 따르면, 1.00g/L의 농도에서 OTA-템플릿 및 템플릿 없이(NIP) 제조된 두 MIP 모두 pH 4.0에서 OTA 마이코톡신 분자에 대해 매우 강한 친화도를 나타냈다. 본 제조 방법에 따르면, 침전 중합 후에 생성된 MIP(톨루엔에서 합성된 # 523-31; 톨루엔-시클로헥산 혼합물에서 합성된 #523-34, -35, -36; 및 톨루엔-아세토니트릴 혼합물에서 합성된 #523-48)은 98.8% 이상의 격리 효율을 나타낸 반면, 에멀젼 중합 후에 생성된 MIP는(물 및 폴리비닐 알코올에서 합성된 # 523-40 및 -41; 및 아세토니트릴에서 합성된 49) 63% 아래의 낮은 친화도를 나타냈다. NIP 분자 또한 98.8%의 격리 효율로 상호작용할 수 있다. 이러한 단계에서, 침전 중합 그룹은 NIP 및 MIP들 사이에서 통계적인 차이를 나타내지 않은 반면, 에멀젼 중합 그룹은 MIP 및 NIP 사이 및 MIP들 사이에서도 유의한 차이를 나타냈다.
15% 에탄올/수산화나트륨, 아세트산 1% 용액으로 두 연속적인 세척 단계가 사용되어 두 MIP 그룹들의 상호작용을 보존하는 능력을 평가하고, 격리의 강도를 설명하였다(표 6 참조). 에멀젼 중합 그룹은 MIP로부터 강한 OTA의 방출과 OTA 마이코톡신과 공용출되는 잔여 템플릿의 방출을 나타냈으며 이는 음의 퍼센트의 흡착을 설명한다. 이에 따라, 본 발명은 에멀젼 중합 방법은 OTA 분자들에 효율적인 흡착제를 생성함에 있어 적절치 않았음을 설명한다. 또한, 본 발명은 침전 중합 그룹은 OTA에 강한 친화도를 나타내어 잔여 템플릿에 방해됨이 없이 톨루엔-아세토니트릴 혼합물 내에서 합성된 MIP에 대한 OTA 분자의 단지 최대 26.3% 만이 탈착되었음을 설명한다.
톨루엔, 아세토니트릴 및 톨루엔-아세토니트릴 혼합물에서 합성된 MIP 및 NIP들의 격리 활성 및 15% 에탄올/수산화나트륨으로 2회의 연속적인 세척 후의 상호작용의 안정성(침전 중합)
평균 지속 흡착(%) 평균 탈착(%)
샘플 ID 초기 1회 세척 2회 세척 초기 1회 세척 2회 세척
NIP 523-31# 98.84 92.52 86.66 1.162 7.478 13.342
MIP 523-34# 98.95 93.05 89.50 1.048 6.955 10.500
MIP 523-35# 99.04 90.60 86.09 0.963 9.397 13.915
MIP 523-36# 99.00 86.76 82.83 1.000 13.238 17.175
MIP 523-48# 99.73 85.76 73.71 0.273 14.242 26.293
실시예 7: 오크라톡신 A의 격리를 위한 MIP양의 적정
적정 실험이 수행되어 0.01g/L 에서 1.00g/L의 MIP의 포함률(또는 0.001 에서 0.1%의 포함률)을 조사하였다. MIP 물질을 함유하지 않는 블랭크 샘플 및 OTA 톡신만을 함유하는 양성 통제군이 함께 제조되어 테스트되었다. 격리 테스트는 pH 4.0으로 조절된 시트레이트 완충액 50mM에서 수행되었다. 모든 샘플들은 오비탈 회전 쉐이커(Brunswick, Champaign, IL, USA) 상에서 150rpm으로 유지되어 37℃에서 90분 동안 배양되었다. 12.5mL의 최종 부피 내의 50, 100, 250 ppb의 3개 최종 농도의 OTA가 테스트되었다. 배양 후에, 마이크로원심분리 튜브가 10분 동안 10,000rpm으로 원심분리되었다. 상청액은 앰버 및 실란화 HPLC 비알 내부에서 수집되어 비알과 마이코톡신의 상호작용을 방지하고 형광측정 및 다이오드-어레이 검출기 신호와 결합되어 표준 방법(예를 들면, 앞서 인용한 Entwisle et al., 2000 참조)에 따라 HPLC(Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA)로부터 계산되었다(예를 들면, 마이코톡신 및 격리된 마이코톡신의 양을 측정).
도 3에 도시된 바와 같이, 0.05g/L에서 최적 효율은 80% 이상의 격리값을 나타냈으며, 평균 86.4±1.5%의 격리를 나타냈다. MIP 화합물들의 포함 레벨은 산성 완충액 조건(pH 4.0)의 OTA 50, 100, 200ppb 상에서 MIP #523-34(톨루엔-시클로헥산 혼합물에서 합성) 및 #523-60(아세토니트릴에서 합성)의 0.010, 0.025, 0.050, 0.075, 0.100, 0.50, 및 1.00 g/L의 격리 활성을 측정함으로써 평가되었다. MIP 사이즈는 45 및 106㎛의 입자 직경으로 설정되었으며, 이는 상기의 크기가 최상의 격리 결과를 나타내고 합성된 총 MIP 생산물 내의 가장 높은 비율의 사이즈의 입자로 나타나기 때문이다.
각 MIP(#523-34 및 #523-60)는 각각 91.53±10.86 및 81.75±23.67%의 OTA를 흡착할 수 있었으며, 이는 포함 레벨로부터 총 격리의 평균값이다. #523-34 및 #523-60 샘플들 각각 0.05 및 0.10g/L의 MIP 포함 레벨에 대해서 격리 곡선 내에 굴절 지점이 발견되었다. #523-34에 대한 0.05 내지 1.00 및 0.10 내지 1.00g/L의 포함 레벨에 대해 격리 친화도 평균은 각각 96.31±2.23 및 97.39±0.70% 로 나타났다. #523-60에 대한 0.05 내지 1.00g/L 및 0.10 내지 1.00g/L의 포함 레벨에 대해 격리 친화도 평균은 각각 94.51±6.54 및 97.76±0.91%로 나타났다. 본 발명은 따라서, 톨루엔-시클로헥산 혼합물에서 합성된 MIP가 72.4±22.58% 의 친화도율 수준으로 0.01g/L의 포함 레벨에서 OTA 격리에 대한 보다 높은 친화도율을 갖는 반면, 아세토니트릴에서 생성된 샘플은 각각 0.01 및 0.05g/L의 생성물 포함 레벨에서 47.40±6.08 및 84.77±1.96의 친화도율로 덜 효율적임을 설명한다.
실시예 8: 서로 다른 MIP 및 NIP의 친화도 및 오크라톡신 A에 대한 특이적 특성
중합 용매로서 아세토니트릴 또는 톨루엔에서 합성된 서로 다른 NIP/MIP들의 친화도를 평가하기 위해 본 발명의 실시예 수행 중 실험들을 수행하였다. 샘플 #523-31(톨루엔) 및 #523-59(아세토니트릴)가 OTA 템플릿 없이 합성되었다(비각인 고분자로 정의됨); 샘플 #523-34(톨루엔-시클로헥산 혼합물) 및 #523-60(아세토니트릴)은 OTA 유사체 템플릿 주변에서 중합되었다. 상기 샘플들은 사로 다른 컷-오프 사이즈의 체들을 사용하여 체처리되었다. 테스트되는 입자 사이즈들의 범위는 실시예 4에 설명되었다. MIP 생성물은 지배적으로 45 및 106㎛ 직경(실시예 4에서 설명된 바와 같이)의 입자 사이즈를 생성하였다. MIP 물질을 함유하지 않는 블랭크 샘플 및 OTA 톡신만을 함유하는 양성 통제군이 함께 제조되어 테스트되었다. 격리 테스트는 pH 4.0으로 조절된 시트레이트 완충액 50mM에서 수행되었다. 모든 샘플들은 오비탈 회전 쉐이커(Brunswick, Champaign, IL, USA) 상에서 150rpm으로 유지되어 37℃에서 90분 동안 배양되었다. 12.5mL의 최종 부피 내의 50, 100, 250 ppb의 3개 최종 농도의 OTA가 테스트되었다. 배양 후에, 마이크로원심분리 튜브가 10분 동안 10,000rpm으로 원심분리되었다. 상청액은 앰버 및 실란화 HPLC 비알 내부에서 수집되어 비알과 마이코톡신의 상호작용을 방지하고 형광측정 및 다이오드-어레이 검출기 신호와 결합되어 HPLC(Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA)로부터 계산되었다(예를 들면, 마이코톡신 및 격리된 마이코톡신의 양을 측정).
OTA 친화도 비교 결과 톡신의 3개의 다른 농도(50, 100, 250ppb) 상에서 연속적인 세척 단계 없이 단일 격리 수행에서는 단지 제한된 차이만이 나타났다. 체처리 없이 NIP로 구성된 샘플 #523-59 만이 모든 pH의 OTA 농도에서 낮은 격리 능력을 나타냈다. 낮은 격리값은 특히 20 및 45 사이의 사이즈 및 보다 낮은 정도로 45 내지 106㎛ 직경에서 50ppb 농도의 OTA에 대해 MIP 샘플 #523-34에서도 발견되었다. 따라서, 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 생산된 MIP 입자들의 사이즈는 최악의 경우 78 내지 99%의 격리율 사이의 친화도 변동을 가지며 총 OTA 흡착 친화도에 대해 큰 영향을 미치지 않음을 설명한다. NIP들은 MIP보다 격리 특성에 있어서 덜 효율적이며, 이는 OTA 마이코톡신과 상호작용하는 MIP들의 특이성을 설명한다.
실시예 9: MIP를 사용한 포도주 내에서 스파이크(spiked) OTA의 트래핑 및 MIP 고체상 추출(SPE)-유사 여과 장치를 사용한 포도주 내에서 스파이크 오크라톡신 A의 직접 여과
면역친화 컬럼을 사용하여 백포도주 샘플(Chardonnay 2005 California) 상에서 표준 추출 공정을 테스트하였다. 상기 추출은 순수한 포도주 샘플 및 5, 10, 20ppb의 순수 결정 OTA를 포함하는 스파이크 샘플들 상에서 수행되었다(예를 들면, 표준 추출 공정을 따라 결정되는). 5 ppb의 스파이크 샘플의 회수율은 100% 이었으며, 10ppb에 대해서는 약 77.7%로 나타났다.
MIP 물질을 함유하지 않는 블랭크 샘플 및 OTA 톡신만을 함유하는 양성 통제군이 함께 제조되어 테스트되었다. 격리 테스트는 pH 4.0으로 조절된 시트레이트 완충액 50mM에서 수행되었다. 모든 샘플들은 오비탈 회전 쉐이커(Brunswick, Champaign, IL, USA) 상에서 150rpm으로 유지되어 37℃에서 90분 동안 배양되었다. 12.5mL의 최종 부피 내의 50, 100, 250 ppb의 3개 최종 농도의 OTA가 테스트되었다. 배양 후에, 마이크로원심분리 튜브가 10분 동안 10,000rpm으로 원심분리되었다. 상청액은 앰버 및 실란화 HPLC 비알 내부에서 수집되어 비알과 마이코톡신의 상호작용을 방지하고 형광측정 및 다이오드-어레이 검출기 신호와 결합되어 HPLC(Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA)로부터 계산되었다(예를 들면, 마이코톡신 및 격리된 마이코톡신의 양을 측정).
포도주로부터 OTA의 격리가 마이코톡신의 격리를 위한 표준 공정을 사용하여 최초 가장 우수한 성능의 MIP #523-34(페놀-시클로헥산 혼합물) 상에서 평가되었다. 격리는 평균적으로 0.05, 0.10, 0.50, 및 1.00g/L의 포함 레벨에 대해 각각 43.29±4.08 에서 67.15±4.94, 91.75±1.59, 95.612±1.201% 로 변화되었다. MIP의 적정은 0.5 및 1.0mg/mL의 포함 레벨에서 사용되었을 때 최적의 친화도를 결정하였다(도 5 참조).
따라서, 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 포도주로부터 마이코톡신(예를 들면, OTA)을 트래핑/흡착 하는 조성물 및 이를 이용한 방법을 제공한다(예를 들면, 포도주로부터 마이코톡신을 효과적으로 결합 및 흡착시키는데 활용되는(예를 들면, 흔드는(shaking) 조건에서) MIP 입자들).
예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 마이코톡신(예를 들면 일 이상의 다른 종류의 마이코톡신(예를 들면, 액상 매체 또는 복합 매트릭스(예를 들면, 음식, 식품, 야채, 동물 등)로부터의 추출 용액에 존재하는)을 트래핑 및/또는 흡착시키는 MIP들(예를 들면, 본 출원에 개시된 방법에 따라 생성되는)을 제공한다.
고체상 추출-유사(SPE-LIKE) 여과 장치는 MIP의 0.1g/L 당량의 포함을 위해 준비되었다. 실란화된 유리 비알들이 수용성 용매 내의 OTA의 안정성을 보장하고 OTA 및 상기 유리 비알 사이의 특이적 상호작용을 방지하기 위해 필요하다. 실란화 방법은 당해 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 방법(예를 들면, 앞서 인용한 Entwisle et al., 2000 참조)에 근거하여 나일론 및 PTFE/PE 필터들 및 튜브들에 적용되었다. 비알들 및 필터들은 실란화 제제(SURFASIL)로 채우거나 침지시켜 제조된다. 1분 후에, 이들을 톨루엔으로 1회, 메탄올로 2회 린스한 후, 물로 3회 린스하고 건조시켰다. 실란화가 수행되어 물질과 OTA 분자의 상호작용의 상당한 감소를 야기하였다. 예를 들면, 5% 미만의 간섭이 관찰되었다(예를 들면, PE/PTFE 필터가 사용되었을 때 물질의 실란화 전의 약 16 내지 26%의 간섭과 비교하여). 나일론은 실란화에 적절하지 않았다. 모든 폴리프로필렌 튜브들은 실란화된 유리 튜브로 교체되었다.
SPE-유사 여과 장치가 컬럼을 통한 샘플의 직접 여과 후에 포도주로부터 OTA를 트랩하기 위해 제조되었다. 5 및 10ppb의 OTA로 스파이크된 포도주(Chardonnay 2005 California)로부터 OTA 제거를 위한 MIP의 효율을 테스트하였다. 그 결과, 5 및 10ppb의 스파이크 OTA에 대해 각각 55.41±5.542 및 56.937±5.739%의 포도주 내의 즉각적인 OTA 함량 감소가 나타났다. 따라서, 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 마이코톡신을 포함하는 액체(예를 들면, 포도주)로부터 마이코톡신을 제거하는 SPE 혹은 SPE-유사 여과 장치를 활용하는 마이코톡신-특이적 MIP들(예를 들면, 본 출원에 개시된 방법들에 따라 생성되는)을 제공한다.
실시예 10: 열 개시 및 저온 UV 개시 MIP 고체상 추출(SPE)-유사 여과 장치를 사용하는 오크라톡신 A의 트래핑 및 포도주의 주요 성분들에 대한 선택성 평가
고체상 추출-유사(SPE-LIKE) 여과 장치가 MIP의 0.1g/L 당량의 포함을 위해 준비되었다. 실란화된 유리 비알들이 수용성 용매 내의 OTA의 안정성을 보장하고 OTA 및 상기 유리 비알 사이의 특이적 상호작용을 방지하기 위해 필요하다. 실란화 방법은 당해 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 방법(예를 들면, 앞서 인용한 Entwisle et al., 2000 참조)에 근거하여 나일론 및 PTFE/PE 필터들 및 튜브들에 적용되었다. 비알들 및 필터들은 실란화 제제(SURFASIL)로 채우거나 침지시켜 제조되었다. 1분 후에, 이들을 톨루엔으로 1회, 메탄올로 2회 린스한 후, 물로 3회 린스하고 건조시켰다. 실란화가 수행되어 물질과 OTA 분자의 상호작용의 상당한 감소를 야기하였다. 예를 들면, 5% 미만의 간섭이 관찰되었다(예를 들면, PE/PTFE 필터가 사용되었을 때 물질의 실란화 전의 약 16 내지 26%의 간섭과 비교하여). 나일론은 실란화에 적절하지 않았다. 모든 폴리프로필렌 튜브들은 실란화된 유리 튜브로 교체되었다.
폴리페놀을 포함하는 12개의 화합물들의 원액(카페산(Caf A), 카테킨 하이드레이트(CH), 에피카테킨(ECH), 페룰산(Fer), 트랜스-3-히드록시신남산(3HCA), 2-히드록시신남산(2-HCA), 말비딘-3-칼락토시드 클로라이드(Mal), 미리세틴(Myr), 퀘세틴 데하이드레이트(QH), 트랜스-레스베라톨(Res), 루틴 트리하이드레이트(Rut) 및 인돌-3-아세트산(IAA)(Sigma, StLouis, MO, USA))이 메탄올(HPLC 등급) 내에 용해시키고 물 및 85% o-인산을 첨가하여 pH를 대략 3.0으로 낮춤으로써 제조되었다. 상청액은 앰버 및 실란화 HPLC 비알 내부에서 수집되어 비알과 분석물의 상호작용을 방지하고 형광측정 및 다이오드-어레이 검출기 신호와 결합되어 HPLC(Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA)로부터 계산되었다(예를 들면, 마이코톡신 및 격리된 마이코톡신의 양을 측정). 30℃로 정온된 C18 역-상 HPLC Spherisorb ODS 컬럼 5㎛, 4.6㎛ x 250mm(Waters Corp., Milford, MA, USA)가 사용되었다. 여기 및 방출 파장은 각각 225nm 및 365nm로 설정되었다. UV-포토 다이오드 어레이 검출기가 210 내지 799nm 파장 범위에서 풀 스캔 모드로 설정되었다. 이동상은 물/인산(99.5%:0.5%; v/v) 및 (B) 아세토니트릴(HPLC 등급)/물/인산(50%/49.5%/0.5%; v/v/v)으로 구성되었다.
모든 MIP들은 모두 80% 흡착 이상의, 완충 용액 내에서 양호한 OTA 흡착을 나타냈다. MIP 555-52는 거의 100%의 최상의 흡착을 나타냈다. 흥미롭게도, 존재하는 OTA는 모든 MIP들의 완충액 세척 중에 흡착되었으나, 특히 열 개시 MIP #555-52 및 #523-34로부터 매우 높은 OTA 농도에서 메탄올 세척 중에 탈착되었다. 존재하는 OTA는 열 개시 MIP들보다 메탄올 세척에 있어서 저온 및 UV-개시 MIP #555-54A 및 #555-54B에 흡착하였으며, 메탄올 세척을 통해 UV-개시 MIP들에 평균적으로 50% 이상의 흡착을 유지하였다(도 6 참조).
포도주 내의 폴리페놀 화합물들의 항산화에 의한 건강 증진은 잘 기록되어 있다. OTA와 같은 액체(예를 들면, 포도주) 내의 마이코톡신을 여과하는 전략에 있어서, 폴리페놀과 같은 일부의 이로운 화합물들 상의 격리제 물질의 효과를 평가하는 것은 또한 중요하다. 일부 실시예들 있어서, 또한 본 출원에 기록된 바에 따르면(예를 들면, 실시예 6 내지 실시예 9 참조), MIP #555-52 및 #523-34를 생성하는 열 개시 중합은 95% 이상의 흡착 레벨로, 액상 매체 내에 존재하는 OTA 마이코톡신과 효과적으로 상호작용할 수 있었다. 반면, MIP #555-54 및 #555-54X를 생성하는 저온 및 UV-개시 중합은 80 및 92% 사이의 값의 격리 효율로 나타나는 흡착 효율을 제공하였다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명의 저온 및 UV-개시 MIP 조성물들은 서로 다른 폴리페놀, 안토시아닌 및 인돌-3-아세트산의 혼합물로 평가되었을 때 OTA에 대한 특이성을 나타냈다. 이 경우, MIP #555-54A 및 #555-54B는 OTA의 높은 흡착(80% 이상의)을 나타냈으며, 동시에 폴리페놀 또는 인돌-3-아세트산(예를 들면, 관능성 및 항산화 특성을 제공하는(예를 들면, 포도주의))의 흡착을 방지하였다. UV-개시 MIP들의 연구에 있어서, 배양 시간은 제거되었으며, 포도주 샘플들과 세척액들은 MIP 또는 필터를 통해 즉시 주입되었다. 흡착은 거의 관찰되지 않았다(도 7). 따라서, 일부 실시예들에 있어서. 본 발명은 마이코톡신(예를 들면, OTA)에 대해 특이성을 나타내며, 동시에 이로운 화합물들(예를 들면, 폴리페놀 및/또는 인돌-3-아세트산)에 대해서는 결합(예를 들면, 흡착)을 나타내지 않는 MIP를 제공한다. 미리세틴, 레스베라트롤 및 루틴의 정량은 HPLC 분석 기기의 정량 한계 및 검출 한계에 근접한 매우 낮은 농도의 존재에 기인하여 불확실성을 가졌다. 따라서 큰 표준 편차 및 음의 값 결과로 주어졌다. 본 실시예에 있어서, 상기 UV-개시 MIP는 따라서, OTA를 트랩하는데 효율적이고, 생성된 MIP 물질의 특이성을 나타내면서 포도주 액체의 폴리페놀 함량을 손상시키지 않았다.
실시예 11: 여과 장치로서 적용하기 위한 섬유유리 상의 MIP 코팅
MIP-OTA로 섬유유리 메쉬의 코팅을 테스트하기 위해 본 발명의 실시예 수행 중에 실험들을 수행하였다(도 8 참조). 복수의 농도의 OTA가 각 제조물의 친화도를 결정하기 위해 사용되었다. 생성된 MIP들은 하기의 표 7에 요약되어 있다. 3개의 메쉬 스크린들이 다른 가교제 농도를 갖는 MIP들로 코팅되었고 이는 취성(brittleness)에 영향을 미친다. (모노머 용액들 1, 2, 3 및 1H). 코팅된 MIP들로부터 제조된 메쉬는 MIP 코팅 전후에 중량에 근거하여 절단되어 차등 가중에 의해 평가되는 MIP 50, 100 및 200mg을 수득하였다. 20mL 팔콘 튜브 내에 침수되어 MIP 코팅된 메쉬를 사용하여 격리 분석을 수행하였으며, 회전 쉐이커를 사용하여 90분 배양 후의 포도주 매체 내의 OTA의 격리 특성을 결정하였다. 3개의 다른 농도의 OTA로 스파이크된 포도주 용액을 함유하는 튜브로부터 1mL를 MIP-OTA 메쉬 필터들로 배양 전 및 배양 후에 측정하였다. 샘플은 앰버 및 실란화 HPLC 비알들 내에서 수집되어, 비알과 마이코톡신의 상호작용을 방지하고, 형광측정 및 다이오드 어레이 검출기 신호와 결합된 HPLC(Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA)로 계산하였다(예를 들면, 마이코톡신 및 격리된 마이코톡신의 양을 검출).
섬유유리 메쉬 상의 MIP코팅을 위한 중합 조건
변수 기능 모노머 용액
1 2 3 1H
오크라톡신 A 유사체(mg) 템플릿 1000 500 250 1000
2-비닐피리딘(㎕) OTA와 염 형성을 위한 염기 1000 500 250 1000
에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(mL) 가교제 5 5 5 5
2-히드록시 에틸 메타크릴레이트(㎕) 결합 분자 800 400 200 800
아조비스이소부티로-니트릴(mg) 중합 개시제 66 55 50 66
경화(오븐) 메쉬 건조 65℃ 65℃ 65℃ 80-90℃
용매 고체 용해 - - - 500㎕
톨루엔
실험 결과에 따르면, OTA에 대한 최대 격리는 MIP의 포함 레벨에 의존하였다. 최대 격리는 포도주 내 100ppb 농도의 OTA의 46.5% 까지 흡착하는 MIP를 생성하는 500mg의 템플릿, 250mg의 비닐-피리딘 및 200mg의 히드록실 에틸 메타크릴레이트에서 얻어졌다. 반대로, 섬유유리 상에 코팅된 동일하게 가공된 NIP 고분자로 동일한 실험을 수행한 결과, 제조 공정에 따라 15% 미만의(1% 까지 떨어짐) 격리 효율을 나타냈으며(도 10 참조), 따라서 OTA에 대한 MIP-OTA 물질의 특이성을 설명하고 있다.
실시예 12: MIP의 크로마토그래피 유지 용량
MIP #523-34(톨루엔-시클로헥산 혼합물로 합성)을 수조 내에서 음파처리하여 상기의 물질을 패킹 후에 4.6 x 150mm의 HPLC 컬럼의 정지상으로 사용하고, 이어서 컬럼을 통해 아세토니트릴을 5.0mL/min 유량으로 하룻밤동안 연속적으로 공급하였다(HPLC Waters Alliance 바이너리 펌프(Waters Corp, Milford, MA, USA)를 사용한 MIP). 컬럼 압력은 약 400psi로 결정되었으며, 다른 문헌들에 개시된 HPLC 조건들(예를 들면, 앞서 인용한 Baggiani et al., 2002; Jodlbauer J., Maier N.M., 및 Lindner W. Journal of ChromatographyA, 945: 45-63; Maier N.M., Buttinger G., Welhartizki S., Gavioli E., Lindner W., 2004. Journal of Chromatography B, 804: 103-11 참조)과 비교되었다. 컬럼은 48시간 동안 1.0mL/min 유량의 아세토니트릴 하에서 안정화되었고, 메탄올 99% 및 테트라에틸아민 1%로 광범위하게 세척되어 상기 컬럼으로부터 잔류하는 OTA 템플릿을 제거하였다. MIP 컬럼을 사용한 OTA의 정면 HPLC-PDA-FID 분석의 특성화를 수행하였다.
상기 컬럼의 생존을 서로 다른 이동상 조건들 및 30℃의 일정 온도로 유지되는 컬럼을 통과하는 서로 다른 구배 세팅 하에서 평가하였다. 100% 물 및 100% 아세토니트릴 또는 100% 메탄올로의 전이 및 그 반대를 포함하며; 또한 60분 동안 메탄올 내의 테트라에틸아민 1% 에서 메탄올 100%를 사용하는 일부 구배들을 테스트하였다. 압력을 1600psi까지 증가시킨 후 컬럼은 정지상에 어떤 변형없이 생존하였으며, 이는 고압에서의 컬럼의 생존을 설명한다. 아세톤 주입이 2분 주기 동안 분석물을 용출하는 컬럼의 보이드 부피를 평가하기 위해 사용되었다. OTA 용출을 일반적인 ODS C18 용출 프로파일(85% 아세토니트릴)을 위해 사용되는 동일한 조건을 사용하여 평가하였다. OTA의 유지(retention)를 등용매(isocratic) 구배 하에서 MIP 컬럼을 사용하여 5분 시점에 평가하였다. OTA의 유지 시간을 증가시키기 위해, OTA의 유지가 19.5분까지 증가되도록 구배를 실행하였다.
선택된 최종 조건들이 도 11에 표시되며, 구배 조건은 수반되는 표에 상세히 표시되었다. 두 개의 피크들이 관찰되었으며, 17 및 22분(63% 아세토니트릴에서) 사이에서 용출하는 OTA의 주요 피크 및 컬럼에 1% 테트라에틸아민 첨가에 의해 방출되는 강하게 결합된 잔여 OTA 부분과 연관된 제2 피크가 관찰된다.
실시예 13: 스포리데스민(sporidesmin) 템플릿 합성
2,3-디메톡시벤조산으로부터 N-터트-부톡시카르보릴-2,3-디메톡시아닐린의 제조.
무수 터트-부틸 알코올 300mL, 50.0g(274mM)의 2,3-디메톡시벤조산 및 28.33g(280mM, 39mL)의 무수 트리에틸아민을 압력 평형의 120mL 적하 펀넬 및 가스 버블-미터, 고중량의 마그네틱 교반 바 및 온도계를 구비한 1L, 구형 바닥 2-넥 플라스크에 주입하였다. 플라스크 내의 내용물을 자기적으로 교반하고 오일 조에서 80℃로 가열하였다. 77.04g(280mM, 60.5mL)의 디페닐 포스포아지데이트(phosphorazidate)를 가스 생성 진행을 제어할 수 있는 충분한 유량으로 상기의 혼합물에 적하하였다. 80℃로 가열하고 마그네틱 교반을 하룻밤동안 유지하였다. 상기 혼합물의 휘발성 성분들은 30T 진공 및 55℃ 아래의 온도에서 회전 증발되었다. 오일성 생성물은 1L의 분리 펀넬로 이동되고 500mL 시클로헥산 및 200mL 에틸 아세테이트의 혼합물 내에 용해되었다. 얻어진 용액을 200mL 탈이온수로 3회 및 200mL 포화 수용성 염화나트륨으로 1회 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 15분 동안 건조시키고, 여과 및 30T 진공, 80℃ 온도에서 회전 증발기 내에서 농축되었다. N-터트-부톡시카르보닐-2,3-디메톡시아닐린 67.88g(98% 수율)을 무색 오일로 수득하였다.
TLC, SiO2, CH2Cl2:시클로헥산(c-Hex) (1:2); Rf=0.66 검출 UV, 고온의 5% KMnO4 밝은 노란색
FT-IR 필름 (cm-1): 3319, 2941, 1669, 1601, 1529, 1477, 1459, 1416, 1369, 1296, 1258, 1090, 998, 978, 780, 737.
1H NMR, (400MHz), CDCl3, (ppm): 1.53 s, 9H; 3.86 s, 3H; 3.862 s, 3H; 6,593 dd, J=8.4 및 1.6Hz, 1H; 7.004 t, J=8.4 및 8.0, 1H; 7.135 br s, 1H; 7.725 d, J=8.0Hz
N-터트-부톡시카르보닐-2,3-디메톡시아닐린으로부터 2,3-디메톡시아닐린의 제조. 580mL의 메탄올, 67.88g(268mM)의 N-터트-부톡시카르보닐-2,3-디메톡시아닐린 및 66.45mL의 12.1M HCl을 마그네틱 교반 바를 구비한 1L 플라스크에 주입하고 50℃의 수조에 위치시켰다. 2시간 동안 가열 및 교반을 유지하고 주변 온도에서 하룻밤동안 교반하며 방치하였다. 이어서, 얼음조 내에서 상기의 용액을 냉각시킨 후, 6.16M 수산화나트륨 130.5mL을 교반과 함께 첨가하였다.
40℃ 아래의 온도 및 30T의 진공 압력 하에서 회전 증발기를 사용하여 상기의 혼합물로부터 메탄올을 증발시켰다. 반 고체 잔여물은 180mL 톨루엔으로 희석시키고 여과되었다. 침전물을 톨루엔 180mL로 2회 이상 세척하고, 여과물을 1L 분리 펀넬로 이동시켰다. 상층을 수집하고 소듐 설페이트로 건조시키고, 농축 및 진공 증류시켰다. 34.6g의 2.3-디메톡시아닐린(94.0% 수율)이 105~107℃, 8T에서 무색, 결정화 오일 형태로 수집되었다.
TLC, SiO2, c-Hex: 테트라히드로퓨란(THF)(6:1); Rf=0.35 검출 UV, 5% KMnO4 가열/갈색-녹색.
FT-IR 필름 (cm-1): 3463, 3368, 2939, 1609, 1497, 1475, 1319, 1262, 1226, 1129, 1085, 1050, 999, 773, 729, 694.
1H NMR, (400MHz), CDCl3,δ(ppm): 3.75br s, 2H; 3.83s, 3H; 3.84 s 3H; 6.34 d, J=8.1 Hz, 1H; 6.38 d, J=8.1Hz, 1H; 6.84 t, J=8.1Hz, 1H.
2,3-디메톡시아닐린 및 디에틸케토말로네이트로부터 에틸 3-히드록시-6,7-디메톡시-2-인돌론-3-카르복실레이트의 합성. 250mL 톨루엔 내의 디에틸게토말로네이트 69.33g(398.1mM) 용액을 공기 평형 상태의 적하 펀넬 및 얼음물 수조안에 배치된 마그네틱 교반 로드를 구비한 1L 구형 바닥 플라스크 내에 위치시켰다. 톨루엔 200mL 내의 2,3-디메톡시아닐린 56.769g(370.6mM) 용액을 상기 적하 펀넬 내부에 주입하였다. 교반이 시작되고 2,3-디메톡시아닐린 용액을 서서히 플라스크 내부에 첨가하면서, 반응 혼합물의 냉각 및 마그네틱 교반을 지속하였다. 상기 첨가는 4시간 후에 완료되었으며, 상기 혼합물은 상온으로 승온시키고 총 22시간의 하룻밤동안 교반하며 방치되었다. 이어서, 상기 혼합물을 2시간 동안 80℃로 가열하고 이어서 상기 혼합물의 온도를 100℃로 증가시켰다. 25mL의 증류액을 수집하였으며, 이는 4mL의 물 및 21mL의 톨루엔을 포함하였다. TLC SiO2(PhMe:THF/6:1,UV, 고온 KMnO4)은 다음 화합물의 존재를 지시하였다: 디에틸케토 말로네이트 Rf 0.86; 모노에틸케토말로네이트의 2,3-디메톡시아닐리드 Rf 0.66; 2,3-디메톡시아닐린 Rf0.43; 디에틸케토말로네이트 모노하이드레이트Rf 0.30 및 원하는 생성물, 에틸 3-히드록시-6,7-디메톡시-2-인돌론-3-카르복실레이트 Rf0.20. 100℃로의 가열을 24시간동안 지속하고, 이후 플라스크 내에 백색 침전이 형성되었다. 플라스크의 내용물은 교반되고 다음 48시간 동안 80-90℃에서 가열되었다. 이후, 상온으로 냉각되고, 침전물을 여과하고 50mL 톨루엔으로 세척하였다. 건조 후에, 16.0g의 에틸-3-히드록시-6,7-디메톡시-2-인돌론-3-카르복실레이트(24.0% 수율)를 수득하였다. 여과물을 회전 증발기 내에서 농축하고 c-Hex를 사용하는 SiO2 LC로 이동시켰다: 7.5 내지 20%의 THF 함량을 갖는 THF 혼합물. 추가적인 12.2g(18.2% 수율)의 매우 순수한 생성물이 수집되었다.
Mp 150-151℃.
TLC, SiO2, Toluene(PhMe): THF(6:1), Rf=0.12 검출 UV, 5% KMnO4 가열/카나리 옐로우
FT-IR 필름(cm-1): 3293, 2937, 1728, 1726, 1636, 1505, 1466, 1336, 1236, 1234, 1164, 1084, 1016, 1192, 729.
1H NMR, (400 MHz), CDCl3, δ(ppm): 1.191 t, J=7.2Hz, 3H; 3.892 s, 3H; 3.898 s, 3H; 4.152-4.319 m, 16 lines, dqx2, 모두 J=7.2 Hz (쿼르텟 중심: 4.179, 4.205, 4.265, 4.292, 2H; 4.346 br s, 1H; 6.575 d, J=8.4 Hz, 1H, 6.961 dd, J=8.4 및 0.4 Hz, 1H; 7.744 br s, 1H.
에틸-3-히드록시-6,7-디메톡시-2-인돌론-3-카르복실레이트로부터 6,7-디메톡시이사틴(6,7-dimethoxyisatine)의 합성. 100mL 에탄올 내의 10.67g(40.2mM)의 에틸-3-히드록시-6,7-디메톡시-2-인돌론-3-카르복실레이트 용액을 주변 온도의 수조에서 교반하였다. 상기의 혼합물에, 25mL의 물 내의 4.828g(120. mM)의 수산화나트륨을 적하하였다. CO2가 없는 공기 스트림을 격렬하게 교반된 상기의 반응 혼합에 통과시켰다. 공기 통과 및 주변 온도에서 상기 혼합물의 교반은 하룻밤동안 유지되었다. 회수된 혼합물은 강한 레드-브라운색이었다. 5mL의 농축 염산을 첨가하여 용액을 중화시켰다. 형성된 무기 염 형태의 백색 침전물을 여과하고, 얻어진 여과물은 20mL의 회전 증발기 내에서 농축되고, 냉장고 안에서 결정화를 위해 방치되었다. 오렌지-옐로우 결정이 수집되고 공기 건조되었다. 순수한 6,7-디메톡시이사틴 2.24 g(26.9% 수율)이 수득되었다. 추가적인 0.54g(6.5% 수율)의 생성물이 SiO2 및PhMe:THF(4:1) 혼합물을 사용하는 액체 크로마토그래피에 의한 여과물로부터 분리되었다.
Mp 209-210℃.
TLC, SiO2, PhMe:THF(6:1), Rf =0.18 옐로우 스팟, 검출 UV, 5% KMnO4 가열/카나리-옐로우
FT-IR 필름(cm-1): 3218, 1747, 1707, 1623, 1507, 1452, 1442, 1337, 1286, 1240, 1184, 1082, 1041, 973, 949, 794, 685, 702, 662.
1H NMR, (400MHz), CDCl3, δ(ppm): 3.91 s 3H; 3.98 s 3H; 6.60 d, J=8.4Hz, 1H; 7.42 d, J=8.4Hz, 1H; 7.74 br s, 1H.
6,7-디메톡시이사틴으로부터 6,7-디메톡시-1-메틸리사틴의 합성. 20mL의 무수 THF 내의 2.255g(20.1mM)의 포타슘 터트-부탄올레이트를 고무 셉텀(septum)에 의한 시린지로부터 마그네틱 교반 및 얼음물 수조에서 냉각하면서 15mL 무수 THF 내의 2.78g(13.4mM)의 6,7-디메톡시이사틴을 함유하는 50mL 구형 바닥 플라스크에 첨가하였다. 상기의 혼합물에, 3.8mL(8.65g, 60mM)의 요오드화 메틸을 시린지를 사용하여 첨가하고, 두꺼운 침전물이 즉시 형성된 상기의 혼합물을 35℃에서 하룻밤동안 교반하였다. TLC(SiO2, PhMe:THF(6:1))에 의해 기질(6,7-디메톡시이사틴) Rf=0.18이 6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 Rf=0.34로 완전히 전환되었음을 확인하였다. 침전물을 여과해 내고, 무수 THF 20mL로 3회 세척하였다. 조합된 여과물을 증발되어 건조되고, 생성물은 플래쉬 크로마토그래피로부터 밝은 붉은색 부분으로 수집되었다. SiO2 및 PhMe:THF (9:1) 혼합물이 사용되었다. 붉은색 용출물의 증발 건조 후에, 2.517g(84.8% 수율)의 밝은 옐로우 색의 결정들이 수집되었다.
Mp 190-191℃.
TLC, SiO2, PhMe:THF (6:1), Rf = 0.34 오렌지-레드 스팟, 검출 UV, 5% KMnO4 가열/카나리-옐로우.
FT-IR 필름(cm-1): 2955, 1724, 1614, 1497, 1450, 1373, 1264, 1205, 1168, 1131, 1086, 1044, 1028, 979, 975, 828, 800, 775, 654.
1H NMR, (400MHz), CDCl3, δ(ppm): 3.490 s, 3H; 3.877 s, 3H; 3.982 s, 3H; 6.575 d, J=8.4Hz, 1H; 7.416 d, J=8.4Hz, 1H.
5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴의 합성. 2.517g(11.38mM)의 6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 및 1.823g(13.65mM)의 N-클로로숙신이미드 및 30mM의 DMF를 마그네틱 교반 바 및 공기 평형 상태의 얼음물 수조 내의 10mL 적하 펀넬을 구비한 100mL 구형 바닥 플라스크에 배치하였다. DMF 내의 1.125mL(13.6mM)의 농축 염산의 10mL 용액을 상기 적하 펀넬에 주입하고 교반 및 냉각된 반응 혼합물에 적하하였다. 첨가 완료 후에, 상기 용액은 추가적인 2시간 동안 주변 온도에서 혼합되었다. 이어서, 상기 용액을 8T 진공, 50℃에서 회전 증발시키고 잔여물을 PhMe:THF (19:1) 혼합물을 사용하는 SiO2 상에서 플래쉬 크로마토그래피 처리하였다. 브릭-레드 밴드의 생성물을 함유하는 용출물이 수집되고 회전 증발 건조되어 1.83g(62.9% 수율)의 브릭-레드 결정의 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴을 수득하였다.
Mp 140-142℃.
TLC, SiO2, PhMe:THF (6:1), Rf = 0.51 레드 스팟, 검출 UV, 5% KMnO4 가열/카나리-옐로우.
UV/VIS(nm) c.-0.143/에탄올: 318, e 2.75, 433, e 0.70.
FT-IR 필름(cm-1): 2951, 1726, 1602, 1457, 1442, 1423, 1404, 1359, 1292, 1263, 1232, 1093, 1046, 1005, 979, 941, 897, 881, 797, 766, 668.
1H NMR, (400MHz), CDCl3, δ(ppm): 3.475 s, 3H; 3.935 s, 3H; 4.027 s, 3H; 7434 s, 1H.
스포리데스민 및 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿의 분자구조는 도 12에 도시되어 있다. 합성 경로는 도 13에 도시된 바와 같이 요약된다.
실시예 14: 스포리데스민 MIP 및 NIP의 합성(메타크릴산 사용)
1.8g(7.04mM)의 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴, 1.194mL(1.212g, 14.08mM)의 메타크릴산, 3.415mL(3.664g, 28.16mM)의 2-히드록시에틸메타크릴레이트, 39.83mL(41.86g, 211.2mM)의 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 1.0g(6.09mM)의 AIBN의 100mL 톨루엔 내의 용액을 가스 평형 상태의 120mL 적하 펀넬, 기계적 교반기, 버블-미터를 구비한 환류 컨덴서 및 온도계를 포함하는 500mL 4-넥 구형 바닥 플라스크에 도입하였다. 120mL의 톨루엔을 상기 적하 펀넬에 도입하고 교반이 개시되며, 질소가 톨루엔(상기 적하 펀넬 내에서) 및 플라스크 내의 혼합물 표면 위로 통과되고, 상기 버블-미터를 통해 외부로 방출되었다. 교반 및 질소 통과 30분 이후에, 가스 유량은 싱글 버블로 제한되고, 플라스크 내의 온도는 상기 플라스크를 70℃의 수조에 침지시킴으로써 65℃로 증가하였다. 15분 내에 중합이 개시되며, 상기 용액의 점도는 계속 증가하였다. 격렬한 교반이 곤란한 경우, 상기 적하 펀넬로부터의 톨루엔은 상기 혼합물을 희석시키기 위해 가능한 한 빨리 첨가되었다. 격렬한 교반 및 가열이 4시간 동안 유지되었다. 상기의 시간 동안, MIP 스피어들이 형성되었다. 얻어지는 혼합물은 교반 및 가열 없이 하룻밤동안 방치되었다. 아침에 MIP 스피어들은 여과되고, 각각 150mL 에탄올로 13회 세척되었다. 오렌지 레드 색의 여과물이 수집되고 회전 농축되었다. 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴(스포리데스민 템플릿)이 PhMe:THF (98:2) 혼합물을 사용하는 플래쉬 크로마토그래피에 의해 수집되어 브릭-레드 밴드의 템플릿을 수집하였다. 회전 증발에 의해 1.572g(87.3% 회수율)의 매우 순수한 결정의 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴을 수득하였다. MIP 스피어들은 하룻밤동안 공기 건조되고 80℃에서 추가적으로 1시간 동안 실험실 오븐에 위치시켰다.
45.362g의 스포리데스민 MIP(메타크릴산)이 작은 달걀껍질 모양의 백색 스피어들로 수득되었고, MIP #519-98로 표시된다.
스노우-화이트 스피어 형태의 스포리데스민 NIP(메타크릴산)가 동일한 공정으로 수득되었으나, 스포리데스민 템플릿은 반응 혼합물에 첨가되지 않았으며 3회의 에탄올 세척(각각 150mL)만을 수행하였다. 고분자는 MIP #555-99로 표시된다.
MIP 및 NIP 모두 용이하게 소결된 유리 필터 상에서 여과 및 세척되었다.
실시예 15: 스포리데스민 MIP 및 NIP 합성(2-비닐피리딘 사용)
1.5g(5.86mM)의 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴, 1.260mL(1.232g, 11.72mL)의 2-비닐피리딘, 2.845mL(3.053g, 23.46mM)의 2-히드록시에틸-메타크릴레이트, 33.191mL(34.833g, 176mM)의 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 0.833g(5.07mM)의 AIBN의 80mL 톨루엔 내의 용액을 가스 평형 상태의 100mL 적하 펀넬, 기계적 교반기, 버블-미터를 구비한 환류 컨덴서 및 온도계를 포함하는 500mL 4-넥 구형 바닥 플라스크에 도입하였다. 120mL의 톨루엔을 상기 적하 펀넬에 도입하고 교반이 개시되며, 질소가 톨루엔(상기 적하 펀넬 내에서) 및 플라스크 내의 혼합물 표면 위로 통과되고, 상기 버블-미터를 통해 외부로 방출되었다. 교반 및 질소 통과 30분 이후에, 가스 유량은 싱글 버블로 제한되고, 플라스크 내의 온도는 상기 플라스크를 70℃의 수조에 침지시킴으로써 65℃로 증가하였다. 15분 내에 중합이 개시되며, 상기 용액의 점도는 계속 증가하였다. 격렬한 교반이 곤란한 경우, 상기 적하 펀넬로부터의 톨루엔은 상기 혼합물을 희석시키기 위해 가능한 한 빨리 첨가되었다. 격렬한 교반 및 가열이 4시간 동안 유지되었다. 상기의 시간 동안, MIP 스피어들이 형성되었다. 얻어지는 혼합물은 교반 및 가열 없이 하룻밤동안 방치되었다. 이어서, MIP 스피어들은 여과되고 각각 150mL의 에탄올로 13회 세척되었다. MIP 세척으로부터의 모든 여과물은 수집 및 회전 증발되어 건조시켰다. 붉은색 잔여물은 20mL의 톨루엔에 용해되고 톨루엔 내의 SiO2(200mL)로 충진된 액체 크로마토그래피 컬럼(24mm x 50cm) 상부에 적용되었다. 붉은색 밴드는 PhMe:THF (5:1)로 세척되었다. 회전 증발을 통해 1.489g(99.2% 회수율)의 결정 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴이 수득되었다. MIP의 스피어들은 주변 온도에서 하룻밤동안 공기 건조되고, 2시간 이상 동안 80℃에서 실험실 오븐에 위치시켰다. 37.936g의 스포리데스민 MIP(2-비닐피리딘)이 작은 달걀껍질 형태의 백색 스피어들로 수득되었으며, MIP #519-101로 표시된다.
스포리데스민 NIP(2-비닐피리딘). 스노우-화이트 스피어 형태의 39.2g이 동일한 공정으로 수득되었으나, 스포리데스민 템플릿은 반응 혼합물에 첨가되지 않았으며, 3회의 에탄올 세척(각각 150mL) 만을 수행하였다. 고분지는 MIP #555-102로 표시된다.
실시예 16: UV 개시, 저온 중합/스포리데스민 MIP의 합성
광화학 반응 세트. 석영, 광화학 UV 이머젼 웰(immersion well)(Ace Glass, Catalogue # 7856-10)이 450Watt UV 램프(ACE Glass, Catalogue #7825-34)에 구비되고, 450 Watt Cased Power Supply (ACE Glass, Catalogue #7830-58)가 순환 칠러(chiller) WKL 230 LAUDA(Brinkmann Instuments, Inc.)에 부착되고, 4℃의 냉각수가 UV 램프가 켜지는 시점에 웰 표면을 통해 흐른다.
중합 공정. 모노머 혼합물: 메타크릴산 1.2g(13.95mM) 및 에틸렌 글리콜 모노메타크릴레이트 3.631g(13.95mM), 스포리데스민 템플릿 1.783g(6.97mM), 개시제(IABN) 0.991g(6.03mM) 및 가교제, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 41.444g(209.1mM)이 반투명의 폴리에틸렌 병(Nalgenestyle 2105)에 도입되고, 아르곤 스트림을 15분 동안 상기의 혼합물에 통과시켜 자유 라디칼 중합을 억제하는 것으로 알려진 모든 산소를 제거한다. 상기 병을 닫고, 상기 이머젼 웰에 부착시키고, 상기 UV 램프 센터 레벨에서 상기 광화학 반응 세트와 함께 얼음물 수조 내부로 침지된다. 등이 켜질 때 램프 표면을 통해 냉각수가 흐르고 3시간 반 동안 반응 혼합물 조사(irradiation)가 유지된다(UV 안전 유리가 UV 램프가 켜질 때 필요하다). 추가적인 얼음이 공급되고, 과량의 물이 UV 중합 과정 동안 수조로부터 배수되어 수조의 온도를 4℃로 유지시킨다. 중합 완료 후, 병을 개봉하고, 고분자는 작은 조각들로 분쇄 및 그라인딩되어 다음과 같이 세척된다: 에탄올로 3회, 1:1 물-에탄올 혼합물로 2회, 3:1 물-에탄올 혼합물로 6회 및 에탄올로 추가 1회를 실시하여 고분자로부터 템플릿을 제거 및 MIP의 최대 활성을 보장하고, 최종적으로 실험실 오븐에서 건조되어 에탄올 잔여물을 제거함으로써 41.1g(89% 수율)의 생성물을 수득하였다.
실시예 17: 마이코톡신에 대한 MIP의 격리 능력-스포리데스민 유사체에 적용
톨루엔 내의 메타크릴산 또는 2-비닐피리딘 모노머들을 사용하여 열 개시 침전 중합에 의해 생성된 MIP 및 NIP 고분자들(예를 들면, 실시예 14 및 실시에 15 참조)을 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿(예를 들면, 실시예 13 참조) 및 유사한 디설파이드-브릿지 피페라지네디온(piperazinedione) 고리 시스템을 함유하는 스포리데스민 분자 유사체, 글리오톡신(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 대해서 화학적 상호작용을 통한 액체 혹은 반-액체 매체로부터 템플릿 및 글리오톡신 마이코톡신을 제거하는 능력을 테스트하였다. 생성된 MIP 및 NIP들은 격리 친화도에 있어 차이를 설명하기 위해 사용되었다. 격리 실험 수행에 있어서, 400mg의 MIP/NIP 물질을 앰버 Schott 병들에 도입하고 조사 대상인 분석물의 작업 용액 100mL을 첨가하여 매체 내에 격리제의 포함율 0.4g/L를 얻었다. MIP 물질이 없는 블랭크 샘플 및 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿 또는 글리오톡신을 함유하는 양성 통제군이 함께 제조되어 테스트되었다. 격리 테스트는 pH 4.0으로 조절된 시트레이트 완충액 50mM에서 수행되었다. 모든 샘플들은 오비탈 회전 쉐이커(Brunswick, Champaign, IL, USA) 상에서 150rpm으로 유지되어 37℃에서 90분 동안 배양되었다. 5개의 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿 또는 글리오톡신의 최종 농도가 테스트되었다- 500; 1000; 1500; 2000; 2500 ppb 또는 1000; 2000; 3000; 4000; 5000. 배양 후에, 상기의 제조물들은 10,000rpm에서 10분 동안 원심분리되었다. 상청액은 앰버 및 실란화 HPLC 비알 내부에서 수집되어 비알과 마이코톡신 또는 템플릿의 상호작용을 방지하고 광 다이오드-어레이 검출기 신호와 결합되어 표준 방법에 따라 HPLC(Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA)로부터 계산되었다(예를 들면, 마이코톡신 및 격리된 마이코톡신의 양을 측정). 글리오톡신에 대한 HPLC 분석은 이동 상으로서 아세토니트릴/아세트산/트리플루오로아세트산(34.9:65:0.1, v/v) 혼합물을 사용하여 수행되었다. 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿의 검출을 위한 HPLC 방법은 아세토니트릴/물/메탄올(45:45:10, v/v) 혼합물로 구성된 스포리데스민 분석을 위한 표준 용출 변수들에 따라 선택되었다. 검출은 전 파장 스캐닝을 수행하는 U.V. 광다이오드 어레이 상에서 수행되었다(268.1nm에서 글리오톡신에 대해 최적 신호가 나타났고, 258.8nm에서 템플릿에 대해 최적 신호가 나타났다).
그 결과, MIP #519-98 및 #519-101 및 NIP #519-99 및 #519-10X는 pH 4.0에서 흡착제의 0.4% 레벨의 포함율에 대해 500 내지 2,500ppb에서 테스트되는 글리오톡신의 90.8% 이상과 상호작용할 수 있었다(표 8 참조). 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿의 흡착 역시 상기 흡착제의 0.4% 레벨의 포함율에 대해 pH 4.0에서 매체 내에 존재하는 1000 내지 5000ppb의 템플릿 분자 농도의 MIP #519-98 및 #519-101 및 NIP #519-99 및 #519-10X에 대해 94.9% 이상의 친화도를 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 일부 실시예들에 있어서, 본 발명에 따르면 톨루엔 내의 합성 MIP들은 모두 pH 4.0에서 포함율 4g/L로 첨가되었을 때, 2-비닐피리딘 모노머들을 사용하여 합성된 MIP #519-101에 대해 약간의 이점을 갖고 스포리데스민 유사체(예를 들면, 글리오톡신 및 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿)에 친화적인 흡착을 가졌다. 이 때 97.82±4.25% 및 95.85±1.25% 까지의 격리 친화도가 각각 글리오톡신 및 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿에 나타났다. MIP 및 NIP 사이의 차이는 상기의 제조물에 있어서 매우 작게 나타났다.
5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿 및 글리오톡신에 대한 2 MIPs 및 2 NIPs에 대해 퍼센트로 표현된 평균 흡착 친화도(pH 4.0 및 0.4% 레벨의 흡착제 포함율로 평가됨)
샘플 ID 평균 흡착
글리오톡신(%) 템플릿(%)
MIP 519-98 90.84±1.47 94.94±2.21
NIP 555-99 91.04±1.51 95.35±0.72
MIP 519-101 97.82±4.25 95.85±1.25
NIP 519-10X 97.14±4.02 95.86±1.02
실시예 18: 스포리데스민 유사체의 격리를 위한 MIP 양의 적정
적정 실험으로 수행하여 0.1g/L 내지 1.00g/L(또는 0.01 내지 0.1%의 포함율) MIP 포함율을 조사하였다. MIP 물질이 없는 블랭크 샘플 및 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿 또는 글리오톡신만을 함유하는 양성 통제군이 함께 제조되어 테스트되었다. 격리 테스트는 pH 4.0으로 조절된 시트레이트 완충액 50mM에서 수행되었다. 모든 샘플들은 오비탈 회전 쉐이커(Brunswick, Champaign, IL, USA) 상에서 150rpm으로 유지되어 37℃에서 90분 동안 배양되었다. 5개의 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿 또는 글리오톡신의 최종 농도가 테스트되었다- 100mL의 최종 부피 내의 1000; 2000; 3000; 4000; 5000ppb. 배양 후에, 마이크로원심분리 튜브들은 10,000rpm에서 10분 동안 원심분리되었다. 상청액은 앰버 및 실란화 HPLC 비알 내부에서 수집되어 비알과 분석물의 상호작용을 방지하고 다이오드-어레이 검출기 신호와 결합되어 표준 방법에 따라 HPLC(Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA)로부터 계산되었다(예를 들면, 실시예 17 참조).
5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿 대한 2 MIPs 및 3 NIPs에 대해 퍼센트로 표현된 평균 흡착 친화도(pH 4.0 및 4 레벨들의 흡착제 포함율로 평가됨)
샘플 ID % 포함율 흡착(%)
템플릿 농도(ppb)
1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 평균
MIP 519-98 0.010 48.90 57.93 48.17 37.86 38.63 46.30
0.025 61.50 69.25 61.98 65.94 50.74 61.88
0.050 80.37 87.95 73.97 76.41 69.28 77.59
0.100 94.10 91.35 89.72 86.74 84.73 89.33
NIP 519-99 0.010 59.83 53.83 41.80 42.17 38.40 47.21
0.025 76.70 67.50 61.71 58.60 57.51 64.40
0.050 89.63 83.18 73.08 75.46 77.25 79.72
0.100 91.50 90.97 87.99 88.86 87.23 89.31
MIP 519-101 0.010 48.60 37.95 39.12 38.29 34.72 39.74
0.025 72.73 62.12 60.53 51.69 54.58 60.33
0.050 76.93 73.40 73.94 70.98 70.17 73.09
0.100 90.83 87.50 87.66 89.16 84.41 87.91
NIP 519-10X 0.010 41.33 42.88 36.18 25.54 26.58 34.70
0.025 58.67 57.45 53.56 47.35 46.85 52.77
0.050 75.20 68.38 68.26 65.43 63.66 68.19
0.100 83.57 84.02 82.04 78.64 75.09 80.67
NIP 519-47X 0.010 16.57 7.48 10.59 17.05 10.39 12.42
0.025 13.20 10.25 7.61 13.26 18.61 12.59
0.050 4.17 12.40 11.92 12.12 13.76 10.87
0.100 10.13 10.52 11.59 17.88 24.72 14.97
도 14, 표 9 및 표 10에 도시된 바와 같이, 일부 실시예들에 있어서, 예를 들면 0.05g/L의 흡착제 포함레벨에서, 본 발명은 70% 이상의 격리 값을 갖는 최적 효율이 나타나며, 0.10g/L에서 거의 90%의 격리까지 도달함을 보여주었다. 따라서, 일부 실시예들에 있어서, 본 발명에 따르면 메타크릴산으로 합성된 MIP/NIP들이 스포리데스민 유사체(예를 들면, 글리오톡신 및 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿(예를 들면, pH 4.0에서 0.01 및 0.1g/L 사이의 포함율로 첨가된))의 흡착을 위한 2-비닐피리딘을 사용하여 합성된 MIP/NIP보다 유리하다. MIP 및 NIP 사이의 차이는 10 내지 15%의 흡착제 포함율로 증가하는 흡착 값을 갖고 저온 및 UV 개시 중합으로 합성되는 NIP를 제외하고는 매우 작게 나타난다.
스포리데스민 템플릿에 대한 4개의 다른 포함율의 NIP 및 MIP의 인 비트로 등온 흡착 특성(pH 4의 시트레이트 완충액 매체)
포함율(%) NIP #519-99 MIP #519-98 NIP #519-10X MIP #519-101 NIP #519-47X
0.010 47.207±9.159 46.302±8.297 34.703±7.837 39.737±5.229 12.416±4.197
0.025 64.404±7.894 61.882±6.983 52.774±5.517 60.331±8.136 12.585±4.101
0.050 79.720±6.683 77.594±7.047 68.186±4.396 73.087±2.671 10.873±3.817
0.100 89.309±1.858 89.329±3.702 80.671±3.767 87.912±2.375 14.967±6.288
실시예 19: 서로 다른 MIP 및 NIP의 친화도 및 스포리데스민 유사체들에 대한 특이성 특성화
열 개시 침전 중합을 위해 사용되는 용매인 톨루엔 내에서 합성된 서로 다른 NIPs/MIPs의 친화도를 평가하기 위해, 본 발명의 실시예들의 수행 중에 실험들을 수행하였다. 생성된 MIP는 스포리데스민 유사체들(예를 들면, 글리오톡신 및 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿)의 격리 친화도의 차이를 나타내고, 상기의 물질에 대한 특이성을 평가하기 위해 사용되었다. 30mg의 MIP가 실란화된 폴리에틸렌 고체상 추출 프릿에 맞춰진 SEP-PAK 컬럼 내부로 주입되었다. 실란화된 유리 비알들이 사용되어 분석물의 수용성 용매 내에서의 안정성을 보장하고, 상기 분석물과 상기 유리 비알과의 특정한 상호작용을 방지하였다. 실란화 방법은 당해 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 방법에 기반하여 나일론 및 PTFE/PE 필터들 및 튜브들에 적용되었다. MIP 물질이 없는 블랭크 샘플 및 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿 또는 글리오톡신을 함유하는 양성 통제군이 함께 제조되어 테스트되었다. 고체상 추출-유사(SPE-like) 여과 장치는 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿 또는 글리오톡신 용액 1mL의 30mg을 통해 여과함으로써 MIP의 포함율 0.1g/L 당량에 대해 제조되었다. 비알들 및 필터들은 실란화 제제(SURFASIL, 예를 들면, 실시예 9 참조)로 충진 또는 침지시켜 제조된다. 상기 SPE-유사 여과 장치는 2000ppb의 단일 농도로 사용되는 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿 또는 글리오톡신 1mL 용액으로 로딩되었다. 샘플들과 함께, 통제군 작업 용액이 유지되었다. 샘플들 및 통제군들은 간헐적으로 흔들면서 2분 동안 37℃에서 배양되었다. 배양 주기 이후에, 샘플들은 시린지를 통해 주입되고, 10분 동안 10,0000g에서 원심분리되어 15mL 원심분리 튜브 내에서 수집되었다. 상청액은 앰버 및 실란화된 HPLC 비알들 내부에서 수집되고 분석되었다. 표적 분자에 대한 탈착의 특이성을 평가하기 위하여, MIP 고분자를 함유하는 물질 상에 6회의 세척 단계들이 수행되었다. 각 세척물들은 HPLC를 통한 분석 전에 10분 동안 10,0000g에서 원심분리되어 15mL 원심분리 튜브 내에서 수집되었다. 6회의 세척 단계들은 유기 용매의 농도를 증가시키면서 수행되었다. 이는 50mM 시트레이트 완충액 세척을 이용한 제1 세척 및 각각 물 내의 메탄올 20, 40, 60, 80, 100%(v/v)의 5회의 연속적인 세척단계들을 포함한다. 본 실험은 전술한 열 개시 침전 중합 MIP #519-98 및 #519-101 및 NIP #519-99 및 #519-10X(파우더 형태)와 저온 및 UV 중합으로 생성되는(예를 들면, 실시예 5 참조) #519-47 및 #519-47X로 표시되는 결정 형태의 MIP 및 NIP를 함께 사용하였다. 상청액은 앰버 및 실란화된 HPLC 비알들 내부에서 수집되어, 마이코톡신 또는 템플릿의 상기 비알과의 상호작용을 방지하고, 표준 방법에 따라 광 다이오드-어레이 검출 신호와 결합되어 HPLC(Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA)로부터 계산되었다(예를 들면, 마이코톡신 및 격리되는 마이코톡신 검출). 글리오톡신에 대한 HPLC 분석은 이동상으로써 아세토니트릴/아세트산/트리플루오로아세트산(34.9:65:0.1, v/v) 혼합물을 사용하여 수행되었다. 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿의 검출을 위한 HPLC 방법은 아세토니트릴/물/메탄올(45:45:10, v/v)로 구성되는 스포리데스민 분석을 위한 표준 용출 변수들에 따라 선택된다. 검출은 전 파장 스캐닝을 수행하는 U.V. 광다이오드 어레이 상에서 수행되었다(268.1nm에서 글리오톡신에 대해 최적 신호가 나타났고, 258.8nm에서 템플릿에 대해 최적 신호가 나타났다).
그 결과(도 15 및 표 11 참조), MIP #519-101 및 #519-98은 글리오톡신 흡착을 위한 대응하는 NIP #519-10X 및 #519-99에 대비하여, 40% 메탄올로 세척되었을 때 보다 낮은 탈착 값을 가졌다. 그러나, 60% 이상의 메탄올을 함유하는 세척들은 격리된 글리오톡신의 거의 전체 양을 제거할 수 있었다. 일부 실시예들에 있어서, 2-비닐피리딘의 모노머들을 사용하여 합성된 MIP #519-101은 대응하는 NIP #519-10X 및 NIP #519-99, MIP #519-98, NIP #519-47X 및 MIP 519-47 보다 20%의 메탄올을 사용하는 세척이 시스템에 적용되었을 때 보다 강한 특이성을 나타냈다. 고분자 519-47X 및 519-47은 25% 이상의 글리오톡신을 흡착할 수 없었다. 완충액 세척의 적용은 임의의 흡착된 글리오톡신을 제거할 수 있었다.
결과들을 참조하면(도 16 및 표 11 참조), MIP #519-101은 대응하는 NIP #519-10X와 비교하여, 20 및 40% 메탄올로 세척되었을 때 낮은 탈착 값을 보였다. 그러나, MIP #519-98 및 NIP #519-99의 특이성은 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿의 흡착을 위한 특이성에 있어서 차이가 없었다. 그러나, 60% 이상의 메탄올을 함유하는 세척들은 격리된 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿의 거의 전체 양을 제거할 수 있었다. 일부 실시예들 및 글리오톡신에서 발견된 바와 같이, 2-비닐피리딘의 모노머들을 사용하여 합성된 MIP #519-101은 대응하는 NIP #519-10X 및 NIP #519-99, MIP #519-98, NIP #519-47X 및 MIP 519-47 보다 20 및 40%의 메탄올을 사용하는 세척이 시스템에 적용되었을 때 보다 강한 특이성을 나타냈다. 고분자 519-47X 및 519-47은 MIP 화합물에 대한 격리의 특이성에 있어 차이를 보였다. 그러나, 50% 보다 낮은 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿의 흡착에도 불구하고, 이는 글리오톡신에서보다 나은 친화도를 나타냈으며, 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴 템플릿에 대한 MIP의 더 양호한 특이성을 보여준다.
Figure 112012011559705-pct00001
실시예 20: 마이코톡신에 대한 MIP 격리 능력- 스포리데스민에 적용
톨루엔 내의 2-비닐피리딘 모노머들을 사용하여 생성된 MIP 고분자(예를 들면, 실시예 15 참조)가 화학적 상호작용을 통해 액상 혹은 반-액상 매체로부터 스포리데스민(A 93%; B, D, E 2 내지 17%) 마이코톡신 제거를 위해 스포리데스민(AgResearch Limited, Ruakura Research Centre, Hamilton, New Zealand)에 대해 테스트되었다. 생성된 MIP는 상기의 물질의 특이성을 평가하고 격리 친화도를 특성화하기 위해 사용되었다. 격리 실험 수행에 있어서, 50 및 400mg의 MIP 물질을 Schott 병들에 도입하고 스포리데스민 혼합물 작업 용액 100mL을 첨가하여 매체 내에 흡착제의 포함율 0.5 및 4.0g/L를 얻었다. MIP 물질이 없는 블랭크 샘플 및 스포리데스민만을 함유하는 양성 통제군이 함께 제조되었다. 격리 테스트는 pH 6.0으로 조절된 50mM 숙시네이트 완충액 내에서 수행되어, 반추위 분의 생리적 조건을 충족시켰다. 모든 샘플들은 90분 동안 37℃에서 오비탈 회전 쉐이커에서 150rpm으로 배양되었다. 3개의 스포리데스민의 최종 농도에 대해 시스템 내에서 테스트하였다: 500; 1,000; 2,000 ppb. 배양 후에, 제조물들은 10,000rpm으로 10분 동안 원심분리되었다. 상청액은 HPLC 비알들 내부에서 수집되고, 표준 방법에 따라 UV 검출기 신호와 결합되어 HPLC로부터 계산되었다(예를 들면, 마이코톡신 및 격리되는 마이코톡신의 양 검출). 스포리데스민 검출을 위한 HPLC 방법은 아세토니트릴/물/메탄올(45:45:10, v/v)의 혼합물을 사용하여 분석물 및 C18 컬럼(4.6mm x 25cm)의 용출을 수행하였다. 검출은 UV 검출기 상에서 수행되었다(280nm에서 스포리데스민에 대한 최적의 신호가 나타났다).
MIP #519-98 생성물은 0.5g/L의 포함율에 대해 80.5 내지 85.7%의 흡착을 나타냈으며, 500; 1000 및 2000ppb로 존재하는 스포리데스민의 4g/L 포함율에서 사용되었을 때 98.5% 이상의 흡착을 나타냈다(예를 들면, 표 12 참조). 반복에 따른 변이는 상기 흡착의 1% 이하를 차지한다. 미소한 포화 효과가 0.5g/L 포함율에서 조사되는 스포리데스민 범위에 걸쳐 수득되는 흡착 값의 감소로 관찰될 수 있었다.
3개의 스포리데스민 농도에 대한 0.5 및 4.0g/L 포함율에서 MIP #519-98의 흡착 효율
포함율(5) 스포리데스민 농도에 대한 평균 흡착 퍼센트(%)
500ppb 1,000ppb 2,000ppb
0.05 85.65±0.87 84.03±0.70 80.51±1.37
0.40 99.13±0.00 98.85±0.00 98.54±0.09
본 명세서에서 언급된 간행물 및 특허들은 본 출원에 참조로서 병합된다. 설명된 본 발명의 조성물들 및 방법들의 다양한 변형 및 변경들은 본 발명의 범위 및 사상을 벗어남이 없이 당해 기술분야에서 통상을 지식을 가진 자들에게 명백히 인지될 수 있을 것이다. 본 발명에 대해 특정의 바람직한 실시예들을 참조로 설명하였으나, 청구되는 본 발명의 범위는 이와 같은 특정 실시예들에 부당히 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 실제로 관련 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 본 발명 수행에 있어 설명된 예들의 다양한 변형들은 명백히 본 발명의 범위 안에 있는 것으로 이해된다.

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  25. a) i) 마이코톡신을 포함하는 물질; 및
    ii) N-(2-히드록시-3,5-디클로로벤조일)-L-페닐알라닌, 5-클로로-6,7-디메톡시-1-메틸리사틴, 에틸 3-히드록시-6,7-디메톡시-2-인돌론-3-카르복실레이트, 6,7-디메톡시이사틴 및 6,7-디메톡시-1-메틸리사틴으로 구성된 그룹에서 선택되는마이코톡신 템플릿의 존재 하에 일 이상의 모노머 및 일 이상의 가교제의 중합을 통해 생성된 분자 각인 고분자를 제공하는 단계; 및
    b) 상기 분자 각인 고분자가 상기 마이코톡신에 결합하도록 하는 조건에서 상기 분자 각인 고분자를 상기 마이코톡신을 포함하는 물질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 물질로부터 마이코톡신을 격리시키는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 방법은 상기 물질로부터 오크라톡신 A를 격리시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 상기 방법은 상기 물질로부터 스포리데스민을 격리시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 상기 마이코톡신을 포함하는 물질은 음료, 식품, 동물 사료, 약학적 조성물, 기능성 조성물, 화장료 조성물, 및 생명 유지에 필요한 물질로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 생명 유지에 필요한 물질은 수경재배에 사용되는 매체 및 산소를 포함하는 가스 샘플로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 25 항에 있어서, 마이코톡신에 결합된 분자 각인 고분자는 마이코톡신을 포함하는 상기 물질로부터 분리되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 25 항에 있어서,
    c) 상기 분자 각인 고분자로부터 결합된 마이코톡신을 분리시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 분리시키는 단계는 상기 분자 각인 고분자 및 상기 물질로부터 상기 마이코톡신을 추출, 농축 및 분리시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 분리시키는 단계는 크로마토그래피 또는 분리 컬럼 또는 카트리지에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 32 항에 있어서, 상기 분리시키는 단계 이후에, 상기 분자 각인 고분자에 결합된 마이코톡신은 세척에 의해 상기 분자 각인 고분자로부터 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 마이코톡신은 상기 분자 각인 고분자로부터 제거된 이후에 정성 및 정량적으로 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 정량 및 정성 분석은 이력추적을 위해 활용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 34 항에 있어서, 마이코톡신이 제거된 상기 분자 각인 고분자는 마이코톡신을 포함하는 물질로부터 마이코톡신을 격리시키기 위해 재사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 25 항에 있어서, 상기 분자 각인 고분자는 그 중량보다 1 내지 10배의 물을 흡착하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 분자 각인 고분자는 그 중량보다 1 내지 5배의 물을 흡착하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 38 항에 있어서, 상기 분자 각인 고분자는 그 중량보다 1 내지 2배의 물을 흡착하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 25 항에 있어서, 상기 물질로부터 2 이상의 특정 마이코톡신들을 격리시키기 위해 2 이상의 다른 분자 각인 고분자들이 마이코톡신을 포함하는 상기 물질과 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
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