CN111494368A - 水鬼蕉新碱a在制备防治阿尔茨海默病的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从植物水鬼蕉鳞茎分离出的水鬼蕉新碱A在治疗神经退行性疾病中的应用。本发明所涉及水鬼蕉新碱A的结构式如式(Ⅰ)所示。所涉及的用途是关于上述化合物用于制备防治阿尔茨海默病。该水鬼蕉新碱A能明显抑制Aβ含量，能有效防治阿尔茨海默病；且制备水鬼蕉新碱A的原料资源丰富，提取分离技术难度小，溶剂可回收使用，生产成本低。

Description

水鬼蕉新碱A在制备防治阿尔茨海默病的药物中的用途

本申请为申请号201910359771.2、申请日2019年04月30日、发明名称“水鬼蕉新碱A在防治阿尔茨海默病中的应用”的分案申请。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及水鬼蕉新碱A在防治阿尔茨海默病中的应用。

背景技术

水鬼蕉新碱A是从水鬼蕉的鳞茎提取出的新型生物碱，在抗肿瘤和抗炎方面均有突出疗效，如申请号为CN201710354463.1的专利，公开水鬼蕉新碱A在制备抗肿瘤药物中的应用，如申请号为CN20170354440.0的专利，公开水鬼蕉新碱A在制备抗炎药物中的应用。本发明在已知水鬼蕉新碱A的基础上，进一步探索和开发其药用价值，并通过试验证明水鬼蕉新碱A能有效抑制Aβ含量，对于防治阿尔茨海默病或其他神经退行性疾病具有较好效果。

发明内容

本发明的目的在于提供水鬼蕉新碱A在制备防治阿尔茨海默病的药物中的用途。

本发明的技术方案概述如下：

水鬼蕉新碱A在防治阿尔茨海默病中的应用，水鬼新碱A的结构式如式(I)所示：

用于防治阿尔茨海默病的药物水鬼蕉新碱A，由植物水鬼蕉鳞茎分离出。

水鬼蕉新碱A在制备防治阿尔茨海默病的药物中的用途，水鬼蕉新碱A的用量为5mg/kg-20mg/kg；水鬼新碱A的结构式如式(I)所示：

水鬼蕉新碱A在制备防治阿尔茨海默病的药物中的用途，水鬼蕉新碱A的用量为10mg/kg-20mg/kg。

用于在降低脑组织中Aβ淀粉样蛋白含量的药物水鬼蕉新碱A，由植物水鬼蕉鳞茎分离出。

本发明的有益效果：

本研究证明水鬼蕉新碱A对于防治阿尔茨海默病或其他神经退行性疾病具有较好的疗效，水鬼蕉新碱A能有效减少Aβ含量，保护神经细胞，且制备水鬼蕉新碱A的原料资源丰富，提取分离技术难度小，溶剂可回收使用，生产成本低。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1水鬼蕉新碱A对阿尔茨海默症模型小鼠的治疗作用

1.1采用Morris水迷宫法检查学习记忆能力

1.1.1试验动物(购自长春亿斯实验动物技术有限公司，许可证号：2016-0003)分组及模型建立。

将60只雄性ICR小鼠随机分为5组：空白对照组，模型对照组，水鬼蕉新碱A低、中、高剂量组，每组12只。模型对照组和药物治疗各组小鼠侧脑室注射Aβ_1-42溶液(5μg·μL^-1，3μL/只)建立阿尔兹海默症AD模型，连续5天，空白对照组小鼠注射等体积的生理盐水。侧脑室注射时参照小鼠脑立体定位图谱，在两眼连线中点偏右1mm和后眼角连线后2mm处为参考定位侧脑室，颅骨表面皮肤用75％乙醇消毒，使用无菌微量注射器垂直颅骨表面刺入2mm。自模型建立次日起，水鬼蕉新碱A低、中、高剂量组小鼠每天分别给予水鬼蕉新碱A 2.5、5和10mg·kg^-1灌胃，空白组和模型组的小鼠每天给予等体积的生理盐水灌胃，均为每天1次，连续灌胃14d。

1.1.2各组小鼠水迷宫测试方法

Morris水迷宫：圆形水池直径120cm，高70cm，平台直径15cm，高度55cm。以4个等距离点将水池分为4个象限，每个象限贴有不同标志物，在目标象限(设为第三象限)放置逃生平台。定位航行实验统计小鼠的逃避潜伏期；空间探索实验：空间探索实验统计小鼠穿越平台次数。

1.1.3各组小鼠水迷宫测试结果

由表1可知，与空白对照组相比，模型组小鼠的逃避潜伏期明显延长，穿台次数明显减少，差异有统计学意义(P＜0.01)，与模型组相比，水鬼蕉新碱A5mg·kg^-1组、水鬼蕉新碱10mg·kg^-1组、小鼠的逃避潜伏期显著缩短，穿台次数明显延长，差异有统计学意义(P＜0.01)，其中，水鬼蕉新碱A 10mg·kg^-1组小鼠的逃避潜伏期最短，也验证了水鬼蕉新碱A对AD治疗效果与用药浓度有关，随用药浓度的增加，治疗效果越显著，呈现浓度依赖性。

表1水鬼蕉新碱A对阿尔茨海默症模型小鼠逃避潜伏期和穿台次数的影响

与空白组比较，*P<0.05有显著性差异，**P<0.01有非常显著性差异

与模型组比较，^△P<0.05有显著性差异

1.2采用八臂迷宫法检查空间记忆能力：

1.2.1试验动物分组及模型建立

分组及给药同1.1.1

1.2.2小鼠八臂迷宫检测方法

小鼠水迷宫测试结束后，进行八臂迷宫测试。八臂迷宫(放射迷宫)由从1个中央八角平台放射出的8个完全相同的臂组成：中央平台直径30cm，每个臂长45cm，宽11.8cm，高12.5cm，中央平台区通往各臂的入口处有一活动门，用来对小鼠的出入臂进行控制，迷宫与计算机相联，采用摄像跟踪系统记录动物在迷宫内的活动行为。

检测前，各组小鼠空腹禁食12h，置于八臂迷宫中训练5d，每天2次，每次3或4只，每次训练后，并限制性喂食，以使小鼠体重维持在正常进食的80％-85％：训练第1d，在迷宫各臂及中央区分撒着食物颗粒后，将3或4只动物置于迷宫中央，让其自由摄食、探究10min；训练第2d，重复第1d，使小鼠在没有很强的应激条件下熟悉迷宫环境；训练第3d，对每只小鼠进行逐一训练，在每个臂外端边缘处各放一颗食粒，让小鼠动自由摄食、探究10min；训练第4d，在4个臂外端边缘处放一颗食粒(2、4、5、7臂)，各臂门关闭，将小鼠单独放在迷宫中央，20s后，臂门打开，让小鼠在迷宫中小鼠动自由摄食、探究，直至小鼠吃完所有食粒，若经10min，小鼠仍未吃完所有食粒，则终止训练；第5d为测试期，重复第4d，检测各组小鼠的行为学指标，记录小鼠的工作记忆错误次数(即在同一次训练中小鼠再次进入已经吃过食粒的臂的次数)；参考记忆错误次数(即在同一次训练中小鼠进入未放置食粒的臂的次数)；探究时间(在同一次训练中小鼠吃完所有食粒。

1.2.3小鼠八臂迷宫检测结果

研究结果显示：与空白对照组相比，模型组小鼠的工作记忆错误次数、工作记忆错误次数和探究时间明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)，与模型组相比，水鬼蕉新碱A5mg·kg^-1组、水鬼蕉新碱A 10mg·kg^-1组工作记忆错误次数、工作记忆错误次数和探究时间明显减少，差异有统计学意义(P＜0.01；P＜0.05)，其中，水鬼蕉新碱A 10mg·kg^-1组小鼠的工作记忆错误最少，也验证了水鬼蕉新碱A对AD治疗效果与用药浓度有关，随用药浓度的增加，治疗效果越显著，呈现浓度依赖性。

表2水鬼蕉新碱A对阿尔茨海默症模型小鼠八臂迷宫行为学的影响

与空白组比较，*P<0.05有显著性差异，**P<0.01有非常显著性差异

与模型组比较，^△P<0.05有显著性差异，^△△P<0.01有非常显著性差异实施例2测定水鬼蕉新碱A对小鼠脑内Aβ含量的影响

2.1.1实验动物

ICR小鼠60只，8-10周龄，体重20±2g，购自长春亿斯实验动物技术有限公司，许可证号：2016-0003。实验动物采用标准饲料喂养，实验期间可自由摄食、饮水。

2.2实验方法

2.2.1试验动物分组及模型建立

分组及给药同1.11

2.2.2脑匀浆标本制备

末次给药结束后各组小鼠3％戊巴比妥钠将小鼠麻醉后，立即断头处死，分开颅骨，在冰盘上快速取脑，去除脑干及小脑，置0～4℃生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，准确称重，迅速放入预冷的玻璃匀浆器中，加入重量体积比(1:4)的冰冷生理盐水，0～4℃条件下快速匀浆。组织被均匀粉碎后在恒温下进行离心(3000rpm，10min，4℃)，取上清待测。

2.2.3组织蛋白含量的测定

取脑组织匀浆上清液，用紫外分光光度计测定其蛋白含量，具体操作按试剂盒说明书进行。

蛋白测定试剂盒检测原理：蛋白质分子具有-NH3+基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白-NH3+结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度可计算出蛋白含量。

蛋白含量(g/L)＝(测定管OD值-空白管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度(g/L)

2.2.4双抗体夹心酶联免疫吸附法检测各组小鼠脑内Aβ42

Aβ1-42双抗体夹心酶联免疫吸附法测定原理：Aβ42试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELASA)。己知Aβ42浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将Aβ42和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中Aβ1-42的浓度呈比例关系。根据双抗体夹心酶联免疫吸附法测定说明书操作。

小鼠β淀粉样蛋白42ELISA标准曲线制备

根据不同标准品，以吸光度值(Y)对浓度(X)进行线性回归，回归方程：y＝0.0031x+0.3001，R²＝0.9923。表明浓度在0-1000pg·mL-1范围内，浓度与吸光度呈良好的线性关系。

2.3实验结果

2.3.3小鼠脑组织Aβ42的含量测定

由表可知，造模后22d，与空白组比较，模型组小鼠脑中Aβ42显著升高(P<0.01)。与模型组相比，水鬼蕉新碱A 5mg·kg-1组、水鬼蕉新碱A 10mg·kg-1组Aβ42含量显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。说明药物改善老年痴呆小鼠学习记忆能力与其降低脑内Aβ含量有关。

表3小鼠脑组织Aβ42水平(pg/mg prot，

)

与空白组比较，*P<0.05有显著性差异，**P<0.01有非常显著性差异

与模型组比较，^△P<0.05有显著性差异

实施例3水鬼蕉新碱A的毒理学试验

3.1水鬼蕉新碱A的急性毒性试验

3.1.1试验材料

试验动物：6-8周龄的试验动物(购自长春亿斯实验动物技术有限公司，许可证号：2016-0003)60只，分为1组对照组和5组试验组，雌雄各半，雌雄各半，体重20±2g；

试验试剂：水鬼蕉新碱A、生理盐水；

3.1.2试验方法

3.1.2.1 LD50测定:

水鬼蕉新碱A的急性毒性试验取昆明种小鼠60只，随机分为6组，每组10只，分别为水鬼蕉新碱A 645.6、512.9、407.4、323.6、257.0mg·kg^-1剂量组和空白对照组。实验前小鼠禁食16h，给药体积为20mL·kg^-1。给药后，观察各组小鼠的毒性症状及死亡情况，连续观察14d，记录各组小鼠的动物死亡数，并计算半数致死量(LD50)。水鬼蕉新碱A各剂量组给药后小鼠均出现惊厥现象，部分小鼠给药后3h内死亡。此外，各组存活动物连续观察14d，结果表明，一般状态良好，摄食、饮水均未见异常。观察期结束后，对各组存活动物进行尸解，肉眼观察主要脏器均未见异常。水鬼蕉新碱A小鼠急性毒性试验结果见表4。

表4水鬼蕉新碱A小鼠急性毒性试验结果

3.2水鬼蕉新碱A的长期毒性试验

3.2.1试验材料

试验动物：试验动物：6-8周龄的试验动物(购自长春亿斯实验动物技术有限公司，许可证号：2016-0003)120只，分为1组对照组和3组实验组，每组30只，雌雄各半，体重20±2g；

试验试剂：水鬼蕉新碱A、生理盐水；

3.2.2试验方法

将各组小鼠禁食12h后(不禁水)，分别以2.5，5，10mg/kg灌胃给药，每日1次，对照组每日灌胃等量生理盐水，连续灌胃180d，观察各组小鼠死亡情况、饮食情况、体重变化及中毒表现。

试验结果：试验组小鼠无死亡情况，摄食、饮水、活动正常，生理体征、体重、皮毛、行为等指标与对照组小鼠无明显差异，各试验组小鼠的各脏器系数、血液常规指标、生化指标正常，且心、肝、脾、肺、胃、肠、肾、胸腺、子宫、睾丸等重要脏器无异常病理改变，与对照组相同，停药恢复30d后，试验组也未见延迟毒性发生。因此，在本品规定剂量范围内，长期服用水鬼蕉新碱A也是安全可靠的，无任何明显的毒副作用。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (2)

1.水鬼蕉新碱A在制备防治阿尔茨海默病的药物中的用途，所述水鬼蕉新碱A的用量为5mg/kg-20mg/kg；

水鬼新碱A的结构式如式(I)所示：

2.根据权利要求1所述的用途，所述水鬼蕉新碱A的用量为10mg/kg-20mg/kg。