BR0113034B1 - Método para aumento da produção biossintética de ácido 2-ceto-L-gulônico (2-KLG) de uma célula hospedeira - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA AUMENTO DA PRODUçãO BIOSSINTÉTICA DE ÁCIDO 2-CETO- L-GULÔNICO (2-KLG) DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA".

Campo da Invenção A presente invenção refere-se em geral ao aumento da produ- ção industrial de 2-KLG e, especificamente, à superexpressâo do genoma codificando a proteína de transporte de 2,5-dicetoglutarato do periplasma para a região cistólica da célula. A presente invenção provê vetores de ex- pressão, métodos e sistemas para a maior produção de um 2-KLG em mi- croorganismos.

Antecedentes da Invenção É geralmente sabido que o ácido 2-ceto-L-gulônico (2-KLG) é imediatamente convertido em ácido L-ascórbico (vitamina c) através de um procedimento químico de uma etapa no método Reichstein (Reicristein T. e outros, Helv. Chim. Ada, 1934, 17 311-328; Reichstein, T. e outros, 1933, Helv. Chim. Ada, 16, 561, 1019). Existem microorganismos recombinantes que expressam enzimas heterólogas para converter um substrato de partida em 2-KLG. Técnicas de DNA recombinante tém sido usadas para bioconverter D-glucose em 2-KLG em Erwinia herbicola em uma etapa de fermentação única (Anderson, S. e outros, Science, 230, 144-149 (1985)). No entanto, este estudo refere-se ao aumento da expressão de ácido 2,5-diceto-D-g!ucônico (2,5-DKG) redutase ou outra produção sintética sem reconhecimento da im- portância de transporte de substrato na produção industrial do produto final.

Na verdade, estudos feitos pelos inventores revelaram um aumento mínimo na produção de 2-KLG como resultado da superexpressâo da redutase. Des- se modo, há a necessidade de um meio para aumentar a produção industrial de 2-KLG através de cursos biossintéticos utilizando microorganismos recom- binantes por meio outros que não o aumento do nível de expressão das prote- ínas de conversão dentro da célula. A bicamada de lipídeo de membranas biológicas é geralmente impermeável a ions e moléculas polares. Essas membranas biológicas com- partimentalizam uma célula, separando seções diferentes da célula uma da outra. Os substratos utilizados pela célula para sinteüzar vários produtos bem como metabólitos utilizados pela célula para geração de energia ou crescimento podem ser separados das reações sintéticas e/ou catabólicas que os utilizam. Com relação à síntese de produto, cursos sintéticos dife- rentes ou suas porções podem ser encontrados em diferentes porções da célula. Algumas reações oxidativas podem acontecer fora do citosol. Por exemplo, as proteínas ligadas à membrana podem ser usadas para oxidar uma fonte de carbono em uma outra imediata.

Reações ou cursos cistólicos, por exemplo, algumas reduções ou desidrogenações, podem ser também utilizados para converter um subs- trato ou intermediário em um outro produto. Quando o substrato e o meca- nismo sintético estão em lados opostos de uma membrana, a produção do produto final desejado pode requerer translocação do substrato para sítios da reação sintética para permitir a sua conversão no produto final desejado.

Alternativamente, os produtos finais gerados dentro da membrana celular podem requerer tanslocação de dentro da célula. Uma vez que as seções divididas da célula podem ter parâmetros ambientais diferentes, por exem- plo, soluto, íon, produto final, etc, concentrações, ou podem requerer trans- locação através de uma barreira normalmente impermeável, alguma forma de transporte ativo pode ser requerida.

Sensível a esses problemas, investigação relacionada ao au- mento do transporte de materiais através da membrana tem acontecido. Sol- ventes ou agentes de lise têm sido usados para romper as membranas, permitindo o cruzamento dos materiais através da membrana. No entanto, tais métodos têm efeitos prejudiciais sobre a viabilidade da célula hospedei- ra. Se os cursos sintéticos ou metabólicos são dependentes ou energizados pelos próprios cursos metabólicos ou catabólicos da célula hospedeira, tal como requerendo co-fatores tal como NADH ou NADPH, destruição da viabi- lidade da célula pára a produção sintética adicional ou continuada pela cé- lula hospedeira. Em adição, embora o aumento no transporte de glicose ou outros sacarídeos tenha sido explorado no aumento de crescimento da cé- lula (Parker, C. e outros, Mol. Microbiol. 15(5):795-802 (1995)), alteração dos sistemas de transporte celular para aumentar a produção industrial de pro- dutos químicos finais ou intermediários através de cursos biossintéticos utili- zando microorganismos recombinantes não foi reconhecida.

Cornish (J. of Gen. Microbiol., 134:3111-3122 (1988)) discute a relação entre transporte de glicose e a produção de exopolissacarídeo succinoglicano por Agrobacteriyum radiobacter. Cornish propôs que a absor- ção de glicose era um ponto de controle cinético principal para produção de succinoglicano, e que seria possível se obter taxas ainda mais altas de pro- dução de succinoglicano usando métodos de DNA recombinante para se obter taxas ainda maiores de produção de succinoglicano. No entanto, as taxas de produção de Cornish não estavam na escala de necessidades in- dustriais. Ainda, os altos níveis de energia gastos e mecanismos de regula- gem complexos envolvidos no transporte de glicose poderíam desencorajar ao invés de encorajar o seu uso.

Volschenk, H. e outros (Nat. Biotechnol. 15:253 (Março 1997) des- creve a introdução de cursos de degradação de malato em Sacchaomyces cerevisiae através da clonagem e expressão de DNA heterólogo codificando a mesma para o propósito de depleção dos níveis de maleato presentes no vinho. Volschenk estava preocupado principalmente com a remoção de ma- lato do meio circundante, não a produção de nenhum produto final desejado em uma escala industrial.

Ainda, o pouco conhecimento de que um sistema de transporte está envolvido na verdade garante muito pouco a produção maior do produto final ou intermediário desejado. O mecanismo sintético pode já estar satura- do e desse modo uma presença maior do substrato não vai resultar neces- sariamente na produção maior do produto final desejado. Em adição, trans- porte maior de um substrato que é utilizado diretamente ou indiretamente como um metabólito em adição ao seu uso como um substrato de produção pode não resultar na produção maior desejada.

Apenas aumentando o nível de expressão da enzima que con- verte o substrato no produto final desejado pode não resultar em uma produ- ção maior de compostos químicos usando microorganismos recombinantes. Há a necessidade de um meio para aumentar a produção de compostos químicos usando microorganismos recombinantes por meios outros que não aumentando o nível de expressão de substratos dentro da célula. Há também a necessidade de um meio para aumentar a produ- ção industrial de 2-KLG através de cursos biossintéticos utilizando microor- ganismos recombinantes por meios outros que não o aumento do nível de expressão das redutases citosólicas na célula.

Sumário da Invenção A capacidade de transporte de 2,5-DKG de um microorganismo pode se tornar um fator limitante ou de obstrução para uma produção de 2- KLG desejada, em particular, uma vez que a produção de 2-KLG é compar- timentalizada no citosol e requer o transporte de 2,5-DKG do seu sítio de produção, cursos ligados à membrana extracelular. A presente invenção provê um meio para aliviar essa obstrução. A presente invenção provê seqüências de ácido nucléico e ami- noácido isoladas para PE1, PE6, YiaX2, PermA e PermB de P. citrea. A se- qüência de aminoácido e a seqüência de ácido nucléico para PE1, PE6, Yi- aX2, PermA e PermB de P. citrea são mostradas nas Figuras 1A-1E SEQ ID NOS: 1 e 2. A presente invenção também provê métodos aperfeiçoados para o aumento da produção biossintética de 2-KLG por uma célula hospedeira a partir de 2,5-DKG. Desse modo, é provido um método para aumento da pro- dução biossintética de 2-KLG por uma célula hospedeira, o método compre- endendo seleção de uma célula hospedeira que tem curso sintético que con- verte 2,5-DKG em 2-KLG; aumento do transporte do dito 2,5-DKG para a dita célula hospedeira enquanto mantendo a integridade da célula hospedei- ra; cultura da célula hospedeira para produzir o dito 2-KLG; e produção de 2- KLG. Em uma outra modalidade, a etapa de aumento do transporte do dito 2,5-DKG para a dita célula hospedeira inclui a etapa de transformar o dito DNA da célula hospedeira codificando uma ou mais proteínas de transporte do dito 2,5-DKG para o dito material citosólico da célula hospedeira. A dita uma ou mais proteínas é selecionada do grupo consistindo em YiaX2, PE1, PE6, PermA e PermB. O DNA codificando pode ser também expresso a par- tir de genomas selecionados do grupo consistindo em yiaX2, pe1, pe6, per- mA e permB. A uma ou mais proteínas é capaz de hibridizar com SEQ ID

NO_____. A proteína tem pelo menos 50 ou 90% de identidade com a SEQ ID NO ou SEQ ID NO______. Em uma outra modalidade, a proteína compreende uma seqüência compreendendo pelo menos 31 resíduos, os ditos resíduos compreendendo um resíduo de glicina, que corresponde à glicina 119 de PermA ou opcionalmente um resíduo triptofano correspondendo a W136 de PermA ou opcionalmente pelo menos um resíduo adicional selecionado do grupo de uma fenilalanina em uma posição que corresponde a G138 de PermA, um ácido glutâmico (E) em uma posição que corresponde a E141 de PermA, e uma arginina (R) em uma posição que corresponde a R142 de PermA. A presente invenção também provê um método para aumento do transporte de 2,5-DKG para o citosol através da membrana celular interna, o método compreendendo selecionar uma célula hospedeira; e transformação do dito DNA da célula hospedeira codificando uma ou mais proteínas de transporte de 2,5-DKG para a dita célula hospedeira. Em uma modalidade, a célula hospedeira é selecionada do grupo consistindo em bactéria e levedu- ra. De preferência, a célula hospedeira é selecionada do grupo consistindo em E. coli, Pantoea e Klebsiella. A presente invenção provê um método para aumento do trans- porte de 2,5-DKG para o citosol através da membrana celular interna através das etapas de selecionar uma célula hospedeira e transformar o DNA da célula hospedeira codificando uma ou mais proteínas de transporte de 2,5- DKG para a dita célula hospedeira.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra o DNA e seqüenciamento de aminoácido de YiaX2 de Klebsiella oxytoca\ PE1 (permease ambiental); PE6 (permease ambiental); PermA de Pantoea citrea', PermB de Pantoea citrea; YiaX2 de Pantoea citrea. A Figura 2 é um diagrama de fluxo mostrando o curso sintético para a produção de precursor de 2-KLG de ácidò ascórbico a partir de glico- se. A Figura 3 é um diagrama mostrando o curso sintético de pre- cursor de ácido 2-ceto-L-gulônico de ácido ascórbico (2-KLG). A Figura 4 é um gráfico mostrando os vários cursos sintéticos que a glicose pode seguir para chegar ao 2-KLG. Boudrant, J. Enzym. Mi- crob. Tech., 1990, 12, 322-329. A Figura 4A é um diagrama mostrando os cursos sintéticos de D-sorbitol em 2-KLG mostrando a localização celular das reações com rela- ção a outras reações dentro do curso e o transporte de substratos através das membranas. Saito, Y. e outros, Biotechnol. Bioeng. 58(2/3):305-315 (1998).

A Figura 5 mostra o curso sintético de D-glicose (G) em 2,5-DKG para 2-KLG, mostrando a localização das reações com relação a outras rea- ções dentro do curso e o transporte dos respectivos substratos através da membrana celular. A Figura 6 é um gráfico linear mostrando a taxa de transporte de DKG com a taxa de produção de KLG mostrando a quantidade de absorção de 2,5-DKG (nmoles/OD 600) v. tempo (-♦- = alimentação de frutose 139-2a, 0,0486x + 0,67; -A- = alimentação de glicose 139-2a, y = 0,0497 + 0,5877; - ·- = frasco de semente 139-2a, y = 0,0075x+0,0569). A Figura 7 é um esquema da operon yia do catabolismo do ácido ascórbico em Klebsiella oxytoca. A Figura 8 é um gráfico mostrando a quantidade de absorção de 2,5 DKG (nmol) pela Klebsiella oxytoca medida através do ensaio de trans- porte de óleo de silício (-♦- = Testador + isopropil β-D-tiogalactopiranosídeo [IPTG]); - A- = AyiaaX2 + IPTG); - - = Testador - IPTG). A Figura 9 é um desenho esquemático mostrando o design de seleção para permeases próximas de P. citrea, K. oxytoca e fontes ambien- tais. A Figura 10 é um gráfico em barra mostrando a atividade de ab- sorção de 2,5-DKG em cepas de K. oxytoca (YiaX2, pcp1, pcp10, pcp32, pK1, Ambiental No.1; e Ambiental No. 6). A Figura 11 é um gráfico em barra mostrando o ensaio de ab- sorção de 2,5-DKG de frasco de agitação tendo várias permeases de DKG (139-2A, 139-2A + PCP32; 139-2A + PCP10; 139-2A + PK1; 139-2A + PCP1) e 139-2A + PE6 no mesmo constructo de plasmídeo (pBCL 1920) medindo a taxa de absorção de DKG (g/l/hr) em 28 9C. 9A-9B. A Figura 12 é um gráfico linear mostrando o aumento de produti- vidade específico com taxa superexpressa de permease de DKG/Produção de Spec (g/L/hr) (-♦- = tipo selvagem; -x- = WT, prmA). A Figura 13 é um desenho esquemático do transportador de PermA em uma superfície da membrana. Os domínios de expansão de membrana putativos numerados l-XI. As posições dos resíduos conservados são indicadas em negrito. N é o terminal amino e C é terminal carboxila.

Domínios de expansão de membrana putativos de Permease A de Pantoea citrea (SEQ ID NO:______) foram deduzidos usando a ferramenta disponível para o http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.iD/sosuiframeO.html A Figura 14 é uma seqüência de aminoácido conservada corres- pondendo ao resíduo G119s até o 142.

Descrição Detalhada Definições Definições de Transportador Transportadores de canal bacteriano referem-se àqueles trans- portadores geralmente na classificação TC de No. 1 .A (Saier, M. e outros, 1998, Advances in Microbiol Physiology (Poole, R.K., ed.) pp. 81-136, Aca- demic Press, São Diego, CA). ("TC" significa "Conselho de Transporte", um sistema de classificação que leva em consideração os aspectos filogenéticos do transportador). Esses geralmente transportam substratos, íons ou outro material através de um mecanismo de difusão facilitado independente de energia empregando um poro de transmembrana.

Transportadores primários referem-se àqueles transportadores geralmente na classificação do TC (TC No.3.A) (Saier. M. e outros, 1998) e são aqueles que utilizam energia química, tipicamente na forma de hidrólise de ATP como um modo de acoplamento de energia para a absorção ativa e extrusão de transporte de substratos.

Sistemas de translocação de grupo referem-se a transportadores na classificação do TC de TC No.4A. (Saier M. e outros, 1998) que são transportadores que concomitantemente transportam e fosforilam seus substratos durante o transporte. Os membros desta categoria geralmente são parte do sistema de fosfotransferase bacteriana específica (PTS) e são caracterizados pelo acoplamento à oxidação de utilização de piruvato de fosfoenol (PEP).

Transportadores secundários referem-se àqueles transportado- res geralmente na classificação do TC de No.2.A, (Saier, M. e outros, 1998) aqueles que geralmente usam energia quimiosmótica, por exemplo, na for- ma de um gradiente de próton, para prover energia para transportar o subs- trato, íons ou produtos finais através da membrana.

Superfamília de facilitador principal (MFS) refere-se a transpor- tadores secundários que estão geralmente na classificação TC de No. 2 (Saier, M. e outros, 1998).

Um transportador refere-se a qualquer macromolécula que per- mita a translocação de um composto químico através de uma membrana celular e para ou fora de uma célula ou compartimento celular. Os transpor- tadores são também conhecidos ou referidos como permeases. Embora não estando limitado a uma teoria específica, é imaginado que o transportador seja uma proteína que interage com uma membrana, com porções da pro- teína se estendendo da superfície exterior da membrana, através da mem- brana, e da superfície interna da membrana.

Transporte ativo refere-se a transporte que é acoplado a um gasto de energia, por exemplo, a hidrólise de tri-fosfato de adenosina (ATP) ou fosfofenolpiruvato (PEP).

Um simportere de ânion/cátion refere-se a um transportador que utiliza um gradiente quimiosomótico para transportar o substrato através da membrana (classe TC 14). Eles são também referidos como simporteres de substrato/H+. TMS refere-se a domínios de expansão de transmembrana Definições de curso Citoplásmico refere-se a estar dentro da membrana celular interna.

Substrato exógeno refere-se a um material encontrado no lado oposto da membrana de separação da reação sintética, por exemplo, fora da membrana celular interna quando o substrato deve ser convertido através de um curso sintético intracelular ou uma porção intracelular de um curso sinté- tico no produto final ou intermediário desejado.

Extracelular ou fora da membrana celular interna refere-se a lo- calizações de célula no lado oposto de uma membrana do citoplasma, in- cluindo, mas não-limitado ao periplasma.

Membrana celular interna refere-se à barreira que separa o cito- plasma do periplasma.

Membrana refere-se a uma bicamada de lipídeo que é intrinse- camente impermeável ao substrato.

Intracelular refere-se à porção da célula no lado da membrana que está mais próxima do ou no citosol. Intracelular também inclui cistólico.

Reação intracelular refere-se a uma reação sintética ou biocon- versão localizada dentro do material celular cistólico, isto é, material preso no interior da membrana celular interna. A etapa de limitação de taxa refere-se à etapa dentro do curso biossintético do 2-KLG, onde um aumento na conversão durante essa etapa resulta em um aumento na produção de 2-KLG.

Aumento da produção refere-se à maior titulação (quantidade total) do intermediário desejado, produto final ou precursor de uma reação sintética, geralmente medida por um aumento no gm/l/hora obtido através do processo. Ele pode também se referir a um aumento na taxa na qual os pro- dutos desejados são produzidos, geralmente medida em g/l por unidade tempo da produção recombinante, onde a quantidade de produto final, in- termediário ou precursor produzida aumenta como resultado da transforma- ção de DNA codificando a pelo menos uma proteína que aumenta o trans- porte do substrato através de uma membrana na presença do transportador superexpresso.

Um substrato refere-se a 2,5-DKG que é bioconvertido através de uma reação sintética, os sítios de reação citosólica sendo separados do substrato por uma membrana.

Reação sintética refere-se à bioconversão recombinante de um substrato em um intermediário ou um produto final. 2,5-DKG redutase refere-se a uma proteína que é capaz de ca- talisar a conversão de 2,5-DKG estereosseletivamente em 2-KLG.

Transportador de 2,5-DKG refere-se a uma proteína que é capaz de transportar o 2,5-DKG através da membrana celular interna para conver- são em 2-KLG através de uma 2,5-KLG redutase.

Definições de expressão Promotores referem-se a elementos de DNA que guiam a poli- merase de DNA para iniciar a transcrição de um gene no sítio apropriado para gerar um RNA mensageiro capaz de formar um polipeptídeo assim que ele é traduzido pelo sistema de tradução da célula.

Uma "seqüência de ativação a montante" é uma posição de liga- ção para um regulador de ligação de DNA de ação positiva. Conforme indi- cado pelo seu nome, a seqüência de ativação a montante é a montante do sítio de início de transcrição e é um ácido nucléico.

Regiões de regulagem referem-se a regiões no DNA que fazem a modulação da expressão dos genes. Um mecanismo para esta modifica- ção é que algumas regiões de regulagem servem como um sítio de ligação para proteínas (também conhecidas como repressores). Uma vez ligado, um repressor interfere com a habilidade da polimerase de RNA em transcrever um gene.

Um sistema de expressão inclui uma ou mais proteínas e/ou áci- dos nucléicos que, quando agindo juntos, podem aumentar a expressão de uma proteína em uma célula hospedeira. O sistema de expressão pode ser codificado em um ou mais plasmídeos e pode ou não estar no mesmo plas- mídeo que o gene codificando a proteína de interesse. A frase, "funcionalmente ligada" ou "funcionalmente acoplada" significa que os elementos de regulagem (DNA ou proteína) interagem fisi- camente a fim de exercer a sua função. Isto pode ser uma interação proteí- na/proteína, DNA/proteína ou DNA/DNA. Por exemplo, o regulador de liga- ção de DNA interage com o promotor, mas os genes que os codificam po- dem estar em sítios diferentes no cromossoma. Dessa maneira, os genes que codificam os elementos podem estar em plasmídeos diferentes um do outro e do gene codificando a proteína de interesse e ainda trabalham juntos para regular a expressão da proteína.

Comumente, quando descrevendo proteínas e os genes que as codificam, o termo para o gene não está em letras maiúsculas e está em itálico, isto é, permA. O termo para a proteína está geralmente em letras normais e a primeira letra é maiúscula, isto é, PermA.

Definições de organismo "Bactérias11 incluem microorganismos da classe Schizomycetes.

As bactérias podem ser ou Gram-negativas ou Gram-positivas. Bactérias gram-negativas incluem membros do gênero Escherichia, Hemophilus, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Gluconobacter, Acetobacter, Yersenia, Shigella, Vibrio, Acinetobacter, Pantoea e Serratia. Bactérias gram-positivas incluem membros dos gêneros Bacillus, Clostrídium, Sta- phylococcus, Streptomyces, Lactobacillus e Lactococcus.

Bactérias gram-negativas podem ser pantoeans que são cepas que são membros do gênero Pantoeas. Uma bactéria preferida é Pantoea citrea. Pantoea citrea é também algumas vezes referida como Erwinia herbi- cola ou Acetobacter ceremius. O termo "isolado" ou "purificado" conforme aqui usado refere-se a um ácido nucléico ou aminoácido que é removido de pelo menos um com- ponente com o qual ele está naturalmente associado.

Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas Uma modalidade da invenção refere-se a um método de trans- formação de uma célula hospedeira com um plasmídeo que inclui o ácido nucléico codificando o sistema de expressão. Uma outra modalidade da in- venção refere-se a um método de transformação de uma célula hospedeira com um plasmídeo que inclui DNA codificando Uma ou mais proteínas que aumentam o transporte do substrato através da membrana. Uma célula hos- pedeira é uma célula na qual um plasmídeo da presente invenção pode ser inserido através, por exemplo, de transformação. A célula hospedeira é de preferência uma bactéria e com mais preferência no grupo de Pantoea, Es- cherichia; Kleibsiella ou Bacillus.

Em uma outra modalidade, se elementos de regulagem forem incorporados, tais elementos do sistema de expressão são de E. coli e B. subtilis. Em uma modalidade, a célula hospedeira é de preferência uma bactéria Gram-negativa. Em uma outra modalidade preferida, a célula hos- pedeira é uma Pantoea. A mesma célula hospedeira pode ser transformada com um plasmídeo adicional que inclui um ácido nucléico que codifica um ou mais transportadores. De preferência, os transportadores são transportado- res MFS codificados, com mais preferência simporteres de ânion/cátion.

Transportadores exemplares incluem aqueles codificados ou expressos por yiaX2, permA, permB, pe6, pe1 de Pantoea citrea ou Klebsiella oxytoca e fontes heterólogas. A presente invenção provê novos métodos para aumento da produção biossintética de um 2-KLG por uma célula hospedeira, através do aumento do transporte de 2,5-DKG para aliviar o bloqueio para a síntese do curso e a produção dos produtos finais desejados, em particular quando os transportadores são recombinantemente introduzidos e superexpressos pela célula hospedeira.

Uma modalidade da invenção refere-se a um método de trans- formação de uma célula hospedeira com um plasmídeo que inclui o ácido nucléico codificando um sistema de expressão. Uma célula hospedeira é uma célula na qual um plasmídeo da presente invenção pode ser inserido através de, por exemplo, transformação. A célula hospedeira é de preferên- cia uma bactéria. Em uma modalidade, a célula hospedeira é de preferência uma bactéria Gram-negativa. Em uma outra modalidade preferida, a célula hospedeira é uma Pantoea. De preferência, a célula hospedeira é Pantoea citrea e, se elementos de regulagem forem incorporados, tais elementos do sistema de superexpressão são de Pantoea. A mesma célula hospedeira pode ser transformada com um plasmídeo adicional, que inclui um ácido nu- cléico que codifica um ou mais transportadores. De preferência, os trans- portadores são codificados ou expressos a partir de yiaX2, permA, permB, pe6, pe1 de Pantoea citrea.

Reação sintética A presente invenção provê transporte maior de 2,5-DKG através de uma membrana para aumentar a produção de 2,5-DKG a partir de 2-KLG. O transporte maior provê translocação do 2,5-DKG através de uma mem- brana que separa o 2,5-DKG da localização celular da reação de redução (Figuras 2 e 3). A presente invenção é particularmente útil em conjunto com síntese intermediária de ácido ascórbico, por exemplo, a conversão de 2,5- DKG em 2-KLG; a conversão de sorbose ou sorbitol em 2-KLG através de sorbosona; a redução do ácido de 5-ceto-D-gulônico (5-KDG) em ácido L- idônico; e a redução de ácido 5-ceto-D-gulônico em ácido L-gulônico. Cada um desses cursos é caracterizado por uma porção do curso sintético, uma reação sintética, que reside dentro do citoplasma, por exemplo, a redução de 2,5-DKG através de 2,5-DKG redutase; a redução de L-sorbosona em 2-KLG através de uma sorbosona desidrogenase; a redução de ácido 5-ceto-D- gulônico (5-KDG) em ácido idônico através de 5-KDG desidrogenase; e a redução de ácido 5-ceto-D-gulônico em ácido L-gulônico através de 5-KDG redutase. Esses cursos são também caracterizados pela necessidade de transporte do substrato, por exemplo, 2,5-DKG; L-sorbosona, etc. através da membrana para bioconversão através da reação sintética que reside no cito- plasma. O substrato é geralmente um que não pode passar pela mem- brana eficientemente sem algum tipo de mecanismo de transporte ativo. De preferência esses podem incluir, mas não estão limitados a, intermediários de ácido ascórbico (2,5-DKG, sorbosona). Em adição, o substrato é um ma- terial que é transportado para uso sintético em uma escala industrial e ge- ralmente não para uso metabólico pela célula hospedeira. Escala industrial refere-se à produtividade do título e volumétrica sendo maior do que 1 gm/litro/hora, de preferência maior do que 2 g/l/h, com mais preferência mai- or do que 3 g/h e com mais preferência ainda maior do que 5 g/l/h. Em uma outra modalidade, a produtividade do título está entre 2 e 14 gm/l/hora, de preferência entre 3 e 12 g/l/h, e com mais preferência ainda entre 5 e 10 g/l/h para ser um processo de produção industrial economicamente viável. Subs- tratos especialmente preferidos incluem 2,5-DKG; e sorbosona. Os aspectos inventivos da presente invenção são especialmente úteis nessas modalida- des.

Uma reação especialmente útil na prática desta invenção é o transporte de 2,5-DKG através da membrana celular interna para a redução cistólica do mesmo em 2-KLG através da desidrogenase cistólica de 2,5- DKG redutase. Boudrant, J. (1990) Enzyme Microb. Technol., 1990:322-329) 2,5-DKG é convertido a partir de 2-ceto-D-gluconato (2-KDG) através de 2- cetogluconato desidrogenase ligado à membrana. 2-KDG é convertido a partir de glicose através de oxidação em D-gluconato (GA). Os inventores reconhecem que o transporte de 2,5-DKG através da membrana celular in- terna para o sítio da redução cistólica para 2-KLG poderia ser conseguido pelo DNA codificando um aumento no transporte de 2,5-DKG.

Uma outra reação especialmente útil na prática desta invenção é o transporte de sorbosona, um intermediário na produção de 2-KLG através de sorbose, sorbitol (Saito, Y. e outros, Biotechnol. Bioeng. 58(2/3):309-315 (1987). A conversão de sorbitol e/ou sorbose em sorbosona é uma etapa no curso de conversão de sorbitol ou sorbose em 2-KLG (Boudrant, J., 1990;

Saito (1997)). O que segue é uma discussão da construção de transportado- res de sorbosona de acordo com a presente invenção.

Conforme descrito em Saito, o curso de D-sorbose em 2-KLG inclui a oxidação de L-sorbose em L-sorbosona através de L-sorbose desi- drogenase (SDH), seguido pela oxidação de L-sorbosona em 2-KLG através de L-sorbosona desidrogenase. Uma célula hospedeira recombinante foi descrita, a qual converte D-sorbitol em L-sorbosona através de desidrogena- ses ligadas à membrana (Saito, Y. e outros (1997)). L-sorbosona é então transportada do periplasma para redução através de L-sorbosona-desidro- genase no citoplasma. A superexpressão do transportador de sorbosona para facilitar o transporte do intermediário de sorbosona para o curso de conversão em 2-KLG é percebida como tendo um efeito benéfico.

Um curso alternativo de D-glicose para 2-KLG inclui a oxidação de ácido D-gulônico em ácido ceto-D-gulônico (5-KDG) que por sua vez é reduzido em ácido L-idônico (IA) ou ácido L-gulônico para oxidação em 2- KLG. (Boudrant, J. (1990)). O transporte de ácido 5-ceto-D-Gulônico para o citosol para redução através de ceto-redutase poderia ser também facilitado pela superexpressão do transportador de 5-KDG.

Em uma outra modalidade, a reação sintética pode ser extracis- tólica ou localizada fora da membrana relativa ao substrato. O produto final da primeira reação pode ser o substrato intermediário para uma segunda reação no lado oposto de uma membrana. Por exemplo, na síntese de 2- KLG a partir de D-sorbitol em Gluconobacter oxydans T-100 de caqui Japo- nês (FERM BP-4188), a conversão de D-sorbitol em L-sorbose através de L- sorbitol desidrogenase citosólica resulta em um intermediário que é trans- portado fora do citoplasma, através da membrana celular para conversão em L-sorbosona através da desidrogenase de L-sorbose ligada à membrana.

Desse modo, os inventores pretendem o aumento no transporte do interme- diário citosólico, um substrato, a partir do lado citosólico da membrana inter- na através da membrana para o exterior da membrana para conversão sub- seqüente. Saito, Y. (1997).

Embora uma modalidade preferida inclua a reação sintética ou os cursos incluindo os mesmos como estando dentro de um único organis- mo, ter reações separadas em organismos separados é também pretendido pelos inventores. Por exemplo, em um sistema de cultura mista para a pro- dução de 2-KLG a partir de glicose, a conversão de glicose em um interme- diário de 2,5-DKG pode acontecer dentro de um organismo (Acetomonas, Acetobacter, Gluconobacteer ou Erwinia) enquanto que a conversão desse intermediário no intermediário de ácido ascórbico 2-KLG desejado acontece dentro do segundo organismo (Brevibacterium ou Corynebacterium) vide Patente U.S. No. 3.963.574 para Sonoyama (1976). Vide também Hoshino, Patente U.S. No. 5.312.741.

Desse modo, a reação sintética pode gerar um intermediário que ele próprio pode ser convertido em um outro local celular separado por uma membrana celular. O produto final, nesta modalidade, pode ser um substrato intermediário para uma reação subseqüente. Métodos para a determinação da etapa de limitação de taxa Uma razão para o efeito do transporte de 2,5-DKG maior através de uma membrana celular interna para o local de célula cistólico na produ- ção de 2-KLG é porque os inventores reconheceram que ele é a etapa de limitação de taxa da conversão de 2,5-DKG em 2-KLG. A determinação de se tal etapa é uma etapa de limitação de taxa foi realizada analisando o cur- so, avaliando a produção de cada etapa e alterando a quantidade de 2,5- DKG disponível para conversão pelo curso para verificar se tal presença maior de 2,5-DKG resulta em um aumento na produção geral do curso.

Quando da determinação de que aumentando a presença de 2,5-DKG au- menta a produção de 2-KLG, aumento no transporte do substrato vai au- mentar a produção de 2-KLG. A determinação da etapa de limitação de taxa pode ser verifica- da comparando a produtividade do microorganismo. Um método para deter- minar o estado de limitação de taxa da porção de curso é comparar a produ- tividade do intermediário em vários pontos do curso, antes e após aumento da presença de um composto químico em particular. Aumento da presença da redutase através de superexpressão do DNA codificando a 2,5-DKG re- dutase não resultou em uma produção maior de 2-KLG. Figura______. No en- tanto, aumento da quantidade de 2,5-DKG presente no citosol resultou em uma produção maior de 2-KLG. Desse modo, os inventores reconheceram que aumento na quantidade de 2,5-DKG era uma etapa limitante de taxa na produção de 2-KLG.

Um método para determinação do estado de limitação de taxa da porção de curso é comparar a produtividade do intermediário em vários pontos do curso, antes e após aumento da presença de um bioconversor em particular. Se não houver nenhum aumento na produção do produto final apesar da maior presença de um intermediário ou a superexpressão do cur- so de conversão, a etapa não pode ser limitante de taxa, e desse modo a superexpressão da enzima em particular que realiza a reação sintética pode não resultar em uma produção maior. As quantidades dos intermediários individuais pode ser determinada através de vários meios indiretos e diretos.

Meios indiretos incluem medição do consumo ou produção de parâmetros respiratórios, por exemplo, produção de dióxido de carbono, consumo de oxigênio, através de medições em linha, tais como pressões parciais do gás.

Medição direta dos intermediários pode ser conseguida através de várias técnicas analíticas conhecidas na técnica descritas por Lazarus, Analyt. Bio- chem. 157, 360-366 (1986) e referências citadas lá, que são aqui incorpora- das a título de referência, incluindo, mas não limitadas a, papel, gás, cro- matografia de camada líquida e fina, bem como ensaios químicos e enzimá- ticos. Metododologias de cromatografia líquida de alto desempenho, especi- almente conforme descrito em Lazarus, 1986, são especialmente úteis. Um método usado pelos inventores inclui a HPLC Waters 2690 e o refractrôme- tro diferencial Waters 410, ajustes, usando um tampão de acetato de 50 mM, taxa de fluxo de 1 ml/minuto, como o meio de eluição e a coluna de troca de íon Dyonex lonpac AS-10 (4x250 mm) para separação e quantificação dos compostos químicos presentes.

Um outro método usado pelos inventores para determinar a pu- reza do 2-KLG produzido no caldo foi através de análise de carbono total.

Desse modo, em uma modalidade, a atividade de transporte pode ser medida em uma célula onde o substrato pode ser convertido em um produto, através da medição da produção do produto na presença de substrato extracelular. Por exemplo, em uma célula expressando natural- mente, ou expressando recombinantemente, uma 2,5-DKG redutase, 2,5- DKG intracelular é convertida em 2-KLG. A habilidade da célula bacteriana em produzir 2-KLG quando provida com 2,5-DKG extracelular, quando da expressão de uma 2,5-DKG permease, é uma medida da habilidade da per- mease expressa em transportar 2,5-DKG para a célula, e é desse modo uma medição da sua atividade de 2,5-DKG permease. 2-KLG intracelular pode ser detectado, por exemplo, usando HPLC ou outros métodos de detecção sensíveis conhecidos na técnica. Outros produtos metabólicos de 2,5-DKG podem ser também detectados, através de métodos similares.

O transportador de 2,5-DKG

Existem quatro tipos diferentes de sistemas de transporte funci- onalmente caracterizados com base no modo de transporte e mecanismos de acoplamento de energia. O primeiro são proteínas de canal bacteriano (TC No. 1.A), que transportam através de um mecanismo de difusão facilita- do independente de energia utilizando um poro de transmembrana. Um se- gundo sistema de transporte, os transportadores facilitadores e/ou secundá- rios (a segunda classe, TC No. 2.A), representa a categoria maior de trans- portadores. Um terceiro grupo de transportadores ativos primários direciona- dos ATP constitui uso de uma hidrólise de ATP como um modo de acopla- mento de energia para a absorção ativa e ou extrusão de solutos. O último grupo consiste em transportadores de grupo que fosforilam o seu substrato durante o transporte (TC No. 4.A).

Das famílias secundárias, as maiores das famílias secundárias II são a superfamília de facilitador principal (MFS) e a família de poliamina co- lina de aminoácido (APC) (Reizer e outros). Essas famílias de transportador secundário podem ser ainda divididas em três grupos (1) forma de motivo de próton (dirigido por pmf), (2) força de motivo de sódio (dirigida por smf) e (3) outros trocadores dirigidos por íon ou soluto. Esses sistemas de transporte catalisam uni, anti e/ou simporte de solutos. Transportadores ativos secun- dários foram identificados em E. coli, H. influenza, H. pylori, B. subtilis, M. genitalium, Synechocystis, M. Jannaschii (Paulsen e outros, 1998, J. Mol.

Biol. 277:573-592). Todos os membros desta categoria são parte do sistema de fosfotransferase específico bacteriano (PTS). Transportadores secundári- os são tipicamente proteínas de membrana politópica, freqüentemente com 12 TMS com a maior parte dos carreadores primários, uma forma química de energia dirige a translocação do grupo, seja ela sistemas dependentes de ATP como são a maior parte dos membros da superfamília de cassete de ligação de ATP (ABC), ou PTS, que usam PEP como o doador de fosforila para absorção de açúcar e fosforilação. Transportadores secundários dife- rem dos primários (transportadores ABC) pelo fato de que os transportado- res primários usam ATP, levando energia para longe da célula. Em adição, o uso de transportadores ABC requer um sistema de transportador mais com- plexo, um que compreenda dois domínios de membrana integrais hidrofóbi- cos, e dois domínios de ligação de ATP (Hosie e outros, Molecul. Microbiol., (2001). 40(6), 1449-1459. Esses transportador ABC responsáveis pela ab- sorção de soluto também requerem a presença de uma proteína de ligação de soluto (SBP). Desse modo, engenharia genética de um sistema trans- portadores ABC requerería a expressão e transformação de uma natureza mais complexa do que uma de um transportador secundário.

Em uma modalidade, o DNA codificando a pelo menos uma proteína para aumento do transporte do substrato através da membrana ce- lular interna é selecionado de Acetobacter, Pseudomonas, Bacterium, Cya- nococcus, Micrococcus, Brevibacterium, Arthrobacter, Staphylococcus, Baci- llus, Corynebacterium, Acetomonas, Gluconobacter e Erwinia. Os organis- mos preferidos são selecionados do grupo consistindo em E. coli, Pantoea e Kleibsiella. Pantoea é o organismo mais preferido para uso como uma célula hospedeira.

Transportadores especialmente úteis incluem aqueles codifica- dos por yiaX2 (de Klebsiella oxytoca), pe1 e pe6 (de fontes ambientais) e yiaX2, permA e permB de Pantoea citrea. Genes de yiaX2, permA e permB podem ser encontrados em uma variedade de bactérias tal como Erwinia, Acetobacter, Gluconobacter, E. coli, Agrobacter, Yersenia, Salmonella, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Micrococcus, Staphylo- coccus, Pseudomona, Bacillus, Citrobacter. Espécies incluem Yersenia pes- tis, Yersenia pseudotuberculosis, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces coelicolor. A presente invenção provê polinucleotídeo de YiaX2, polinucleo- tídeo de PermA, polinucleotídeo de PermB, polinucleotídeo de Pe1 e polinu- cleotídeo de Pe6 que podem ser usados como DNA codificando pelo menos uma enzima que aumenta o transporte do substrato através da membrana na célula hospedeira. As seqüências de polinucleotídeo para YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 podem ser determinadas das Figuras 13 e 14 que mos- tram o alinhamento de aminoácido de YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 de P. citrea com a Yia2 de Klebsiella. A presente invenção compreende homólogos de polinucleotídeo de YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 codificando os YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 de transportadores, respectivamente, sejam eles codificados por um polinucleotídeo ou por polinucleotídeos múltiplos que têm pelo menos 65%, 70%, 80% ou pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 de P citrea, respectivamente, contanto que o homólogo codifique uma proteína que é capaz de funcionar modulan- do o transporte, de preferência transporte maior, de um substrato em um organismo. Como será entendido pelo versado na técnica, devido à degene- ração do código genético, uma variedade de polinucleotídeos, isto é, vari- antes dos polinucleotídeos de YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6, podem codificar os transportadores de Pantoea citrea em fatores YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6. A presente invenção compreende todos tais polinucleo- tídeos.

Homólogos de polinucleotídeo de microorganismo de transpor- tadores YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 de P. citrea, Klebsiella oxytoca e isolatos ambientais podem ser identificados através de hibridização de ácido nucléico de ácido nucléico de microorganismo de qualquer origem genômica ou de cDNA. A seqüência homóloga de polinucleotídeo pode ser detectada através de hibridização de DNA-DNA ou DNA-RNA ou amplificação usando sonda, porções ou fragmentos do DNA codificando o pelo menos um polinu- cleotídeo que transporta o 2,5-DKG para o material citosólico das células hospedeiras. Desse modo, a presente invenção provê um método para a detecção de homólogos de polinucleotídeo YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 que compreende hibridização de uma amostra de ácido nucléico com parte ou toda a seqüência de ácido nucléico de YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6.

Também incluídos no escopo da presente invenção estão as seqüências de polinucleotídeo YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 que são capazes de hibridizar para parte ou toda a seqüência de nucleotídeo YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 da Figura 1 sob condições de estringência inter- mediária a máxima. As condições de hibridização são baseadas na tempe- ratura de fusão (TM) do complexo de ligação de ácido nucléico, conforme ensinado em Berger e Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techni- ques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, São Diego, Cali- fórnia) incorporado aqui a título de referência, e confere uma "estringência" definida conforme explicado abaixo. "Estringência máxima" tipicamente acontece por volta de Tm de 5°C (5°C abaixo da Tm da sonda); "alta estringência" por volta de 5°C a 10°C abaixo da Tm; "estringência intermediária" por volta de 10°C a 20°C abaixo da Tm; e "baixa estringência" por volta de 20°C a 25°C abaixo da Tm.

Como será compreendido por aqueles versados na técnica, uma hibiridiza- ção de estringência máxima pode ser usada para identificar ou detectar se- qüências de polinucleotídeo idênticas enquanto uma hibridização de estrin- gência intermediária ou baixa pode ser usada para identificar ou detectar homólogos de seqüência de polinucleotídeo. O termo "hibridização" conforme aqui usado deve incluir "o pro- cesso através do qual um filamento de ácido nucléico se une a um filamento complementar através de emparelhamento de base" (Coombs J. (1994) Dic- tionary of Biotechnology, Stockton Press, Nova York, N.Y.). O processo de amplificação conforme realizado em tecnologias de reação de cadeia de polimerase (PCR) é descrito em Dieffenbach C.W. e G.S. Dveksler (1995, PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.). Uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos e tanto quanto cerca de 60 nucleotídeos da se- qüência de nucleotídeo PermA das Figuras 1A-1E, de preferência cerca de 12 a 30 nucleotídeos, e com mais preferência cerca de 20-25 nucleotídeos, pode ser usada como uma sonda ou primer de PCR.

Seqüências de aminoácido O polinucleotídeo PermA de P. citrea conforme mostrado na Fi- gura 1 codifica PermA de P. citrea. O gene permA de P. citrea especifica uma proteína de 436 resíduos com uma massa molecular calculada de 47801.94 Dáltons. A hidrofobicidade média era de 0,62 e o ponto isoelétrico era de 9,24. A proteína permA é uma proteína de membrana integral com 11 hélices de transmembrana putativas. Esses domínios mostram similaridade de seqüência significante com outras proteínas de transporte conhecidas de outros organismos, a maior similaridade sendo encontrada com proteínas transportadores de KDG de Pseudomonas. A extensão de 31 resíduos con- forme mostrado na Figura 8B mostra o segmento altamente conservado cor- respondendo aos resíduos da proteína de transporte PermA de P. Citrea para uma glicina (G) em 119 de PermA, um ácido glutâmico (E) em 122, uma fenilalanina (P) em 127, um triptofano (W) em 136, uma fenilalanina em 138, um ácido glutâmico (E) em 141 e uma arginina em (R) em 142. Este segmento altamente conservado está de acordo com os resíduos conserva- dos da família de simporte de âniomcátion (ACS) (Pao, S.S., 1998) Tabelas 3 e 4 supra. A Figura 8B mostra as regiões conservadas correspondendo aos resíduos 119 a 141 de PermA. Domínios de extensão de membrana putativos (l-XI) são indicados em sombreado cinza. Os domínios de exten- são de membrana da Figura 8B foram determinados através do programa SOUCI.

Transportadores dentro do escopo da presente invenção incluem aqueles codificados por yiaX2, permA, pe1 e pe6 e permB de Pantoea citrea, Klebsiella oxytoca e fontes ambientais. Genes de yiaX2, permA, pe1 e pe6 e permB podem ser encontrados em uma variedade de espécies de bactérias tal como Erwinia, Acetobacter, gluconobacter, E. coli, Agrobacter, Yersinia, Samonella, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, micrococcus, staphylococcus, pseudomonas e Bacillus. A presente invenção provê polinucleotídeo de YiaX2, polinucleo- tídeo de PermA, polinucleotídeo de PE1, polinucleotídeo de PE6 e polinucle- otídeo de PermB que podem ser usados como DNA codificando a pelo me- nos uma proteína que aumenta o transporte de 2,5-DKG através da mem- brana na célula hospedeira. As seqüências de polinucleotídeo para YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 podem ser determinadas a partir das figuras que mostram o alinhamento de aminoácido de YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 de P. citrea com o YiaX2 de Kielbsiella. A presente invenção compreende homólogos de polinucleotídeo de YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 codificando os transportadores YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6, respectivamente, sejam eles codificados por um polinucleotídeo ou por polinucleotídeos múltiplos que têm pelo menos 65%, 70%, 80% ou pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com Yi- aX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 de P. citrea, respectivamente, contanto que o homólogo codifique uma proteína que é capaz de funcionar através de transporte modulante de um substrato em um microorganismo. Como será entendido pelo versado na técnica, devido à degeneração do código genéti- co, uma variedade de polinucleotídeos, isto é, variantes dos polinucleotídeos de YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6, podem codificar os transportadores de Pantoea citrea em fatores YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6. A presente invenção compreende todos tais polinucleotídeos.

Homólogos de polinucleotídeo de microorganismo de transpor- tadores YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 de P. citrea, Klebsiella oxytoca e isolatos ambientais podem ser identificados através de hibridização de ácido nucléico de microorganismo de qualquer origem genômica ou de cDNA. A seqüência homóloga de polinucleotídeo pode ser detectada através de hibri- dização de DNA-DNA ou DNA-RNA ou amplificação usando sonda, porções ou fragmentos descritos na Figuras [qual número]. Desse modo, a presente invenção provê um método para a detecção de homólogos de polinucleotí- deo de YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 que compreende hibridização de uma amostra de ácido nucléico com parte ou toda a seqüência de ácido nu- cléico de YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6.

Também incluídos no escopo da presente invenção estão as seqüências de polinucleotídeo de YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 que são capazes de hibridizar para parte ou toda a seqüência de nucleotídeo de YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 da Figura 1 sob condições de estringên- cia intermediária a máxima. As condições de hibridização são baseadas na temperatura de fusão (Tm) do complexo de ligação de ácido nucléico, con- forme ensinado em Berger e Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Te- chniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, São Diego, Califórnia) incorporado aqui a título de referência, e confere uma "estringên- cia" definida conforme explicado abaixo. "Estringência máxima" tipicamente acontece por volta de Tm de 5°C (5°C abaixo da TM da sonda); "alta estringência" por volta de 5°C a 10°C abaixo da Tm; "estringência intermediária" por volta de 10°C a 20°C abaixo da Tm; e "baixa estringência" por volta de 20°C a 25°C abaixo da Tm.

Como será compreendido por aqueles versados na técnica, uma hibridiza- ção de estringência máxima pode ser usada para identificar ou detectar se- qüências de polinucleotídeo idênticas enquanto uma hibridização de estrin- gência intermediária ou baixa pode ser usada para identificar ou detectar homólogos de seqüência de polinucleotídeo. O termo "hibridização" conforme aqui usado deve incluir "o pro- cesso através do qual um filamento de ácido nucléico se une a um filamento complementar através de emparelhamento de base" (Coombs J. (1994) Dic- tionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, N.Y.). O processo de amplificação conforme realizado em tecnologias de reação de cadeia de polimerase (PCR) é descrito em Dieffenbach C.W. e G.S. Dveksler (1995, PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.). Uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos e tanto quanto cerca de 60 nucleotídeos da se- qüência de nucleotídeo de PermA da Figura 1, de preferência cerca de 12 a 30 nucleotídeos, e com mais preferência cerca de 20-25 nucleotídeos, pode ser usada como uma sonda ou primer de PCR. II. Sistemas de Expressão A presente invenção provê sistemas de expressão para a produ- ção maior e transporte das proteínas heterólogas ou homólogas em microor- ganismo, incluindo bactérias e levedura, a. Seqüências de Codificação Na presente invenção, o vetor compreende pelo menos uma có- pia de ácido nucléico codificando um transportador e de preferência compre- ende cópias múltiplas. Em uma modalidade preferida, o microorganismo é Pantoea. Em uma outra modalidade preferida, o microorganismo é Klebsiela.

Em uma modalidade, os polinucleotídeos que compreendem o gene de PermA são utilizados para construir o vetor. Esses segmentos de polinucle- otídeo podem compreender um número de resíduos muito maior do que permA. Por exemplo, pcp 1, pcp10 e pcp32 são fragmentos de nucleotídeo que são operons ou domínios do genoma de Pantoea citrea. Esses seg- mentos de polinucleotídeo são de cerca de 9 kilobases (kb), 13 kb e 67 kb respectivamente. Em uma modalidade preferida, polinucleotídeos que codifi- cam PermA, YiaX2, PermB, PE1 e/ou PE6 de P. citrea, ou seus fragmentos, ou proteínas de fusão ou seqüências homólogas de polinucleotídeo que co- dificam variantes de aminoácido de PermA, YiaX2, PermB, PE1 e/ou PE6 podem ser usados para gerar moléculas de DNA recombinante que direcio- nam a expressão de PermA, YiaX2, PermB, PE1 e/ou PE6, ou suas varian- tes de aminoácido, respectivamente, em células hospedeiras gram-positivas.

Em uma modalidade, a célula hospedeira é selecionada do grupo consistin- do em Acetobacter, Pseudomonas, Bacterium, Cyanococcus, Micrococcus, Brevibacterium, Arthrobacter, Staphylococccus, Bacillus, Corynebacterium, Acetomonas e Gluconobacter. As células hospedeiras preferidas são seleci- onadas do grupo consistindo em Escherichia, Pantoea e Kleibsiella. Pantoea citrea e Kleibsiella são os organismos mais preferidos para uso como uma célula hospedeira. Pantoea é também conhecida como Erwinia.

Como será entendido por aqueles versados na técnica, pode ser vantajoso produzir seqüências de polinucleotídeo possuindo códons de ocor- rência não-natural. Os códons preferidos pela célula hospedeira em particu- lar (Murray e outros (1989) Nuc. Acids. Res. 17:477-508) podem ser selecio- nados, por exemplo, para aumentar a taxa de expressão ou para produzir transcriptos de RNA recombinante tendo propriedades desejadas, tal como meia-vida mais longa, que os transcriptos produzidos a partir de seqüência de ocorrência natural.

Seqüências de polinucleotídeo de PermA, YiaX2, PermB, PE1 e/ou PE6 alteradas que podem ser usadas de acordo com a invenção inclu- em deleções, inserções ou substituições de resíduos de nucleotídeo dife- rentes resultando em um polinucleotídeo que codifica a mesma ou um ho- mólogo de PermA, YiaX2, PermB, PE1 e/ou PE6 funcionalmente equivalen- te, respectivamente. Conforme usado aqui, uma "deleção" é definida como uma mudança ou no nucleotídeo ou na seqüência de aminoácido onde um ou mais resíduos de nucleotídeos ou de aminoácido, respectivamente, estão ausentes.

Conforme aqui usado, uma "inserção" ou "adição" é aquela mu- dança em um nucleotídeo ou seqüência de aminoácido que resultou na adi- ção de um ou mais resíduos de nucleotídeo ou aminoácido, respectivamen- te, conforme comparado com PermA, YiaX2, PermB, PE1 e/ou PE6 gram positiva de ocorrência natural.

Conforme aqui usado, "substituição" resulta da substituição de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos por nucleotídeos ou aminoácidos diferentes, respectivamente. A proteína codificada pode também mostrar deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácido que produzem uma mudança silenciosa e resulta em uma variante de PermA, YiaX2, PermB, PE1 e/ou PE6 gram-positiva funcionalmente equivalente. Substituições de aminoácido deliberadas podem ser feitas com base de similaridade em polaridade, car- ga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou na natureza anfifática dos resíduos contanto que a variante retenha a habilidade em modular transporte, de preferência em aumentar o transporte. Por exemplo, aminoá- cidos negativamente carregados incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos positivamente carregados incluem lisina e arginina; e aminoáci- dos com grupos líder polares não-carregados tendo valores de hidrofilicidade similares incluem leucina, isoleucina, valina; glicina, alanina; asparagina, glutamina; serina, treonina, fenilalanina etirosina.

Os polinucleotídeos de PermA, YiaX2, PermB, PE1 e/ou PE6 da presente invenção podem ser construídos a fim de modificar a clonagem, processamento e/ou expressão do produto de gene. Por exemplo, mutações podem ser introduzidas usando técnicas que são bem conhecidas na técni- ca, por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio para inserir novos sítios de restrição para mudar a preferência do códon, por exemplo.

Em uma modalidade da presente invenção, um polinucleotídeo de PermA, YiaX2, PermB, PE1 e/ou PE6 pode ser ligado a uma seqüência heteróloga para codificar uma proteína de fusão. Uma proteína de fusão pode ser também construída para conter um sítio de divagem localizado en- tre a seqüência de nucleotídeo de PermA, YiaX2, PermB, PE1 e/ou PE6 e a seqüência de proteína heteróloga, de modo que a proteína PermA, YiaX2, PermB, PE1 e/ou PE6 pode ser clivada e purificada longe da porção heteró- loga. b. Seqüência de vetor Vetores de expressão usados na expressão dos transportadores da presente invenção em microorganismos compreendem pelo menos um promotor associado a um fator de transportador selecionado do grupo con- sistindo em PermA, YiaX2, PermB, PE1 e/ou PE6, promotor que é funcional na célula hospedeira. Em uma modalidade da presente invenção, o promotor é o promotor do tipo selvagem para o transportador selecionado e em uma outra modalidade da presente invenção, o promotor é heterólogo para o transportador, mas ainda funcional para a célula hospedeira.

Promotores adicionais associados a ácido nucléico heterólogo codificando proteínas ou polipeptídeos desejados podem ser introduzidos através de técnicas de DNA recombinante. Em uma modalidade da presente invenção, a célula hospedeira capaz de superexpressão de uma proteína ou polipeptídeo heterólogo e ácido nucléico codificando um ou mais transporta- dores) é recombinantemente introduzida. Em uma modalidade preferida da presente invenção, ácidos nucléicos codificando a pelo menos uma proteína ou mais proteínas que aumentam o transporte do substrato podem ser esta- velmente integrados ao genoma do microorganismo. Em uma outra modali- dade, a célula hospedeira é construída para superexpressar o DNA codifi- cando uma ou mais proteínas que aumentam o transporte do dito substrato para a dita célula hospedeira da presente invenção e ácidos nucléicos codifi- cando a proteína heteróloga ou polipeptídeo são introduzidos através de técnicas de DNA recombinante. A presente invenção compreende células hospedeiras que são capazes de superexpressão de outros transportadores conhecidos daqueles versados na técnica, incluindo mas não limitado a, àqueles identificados na Tabela 1,2 ou 3 ou outros transportadores conheci- dos daqueles versados na técnica ou identificados no futuro.

Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão contém um cassete de sítio de clonagem múltiplo que compreende de preferência pelo menos um sítio de endonuclease de restrição único para o vetor, para facili- tar a manipulação de ácido nucléico. Em uma modalidade preferida, o vetor também compreende um ou mais marcadores selecionáveis. Conforme aqui usado, o termo marcador selecionável refere-se a um gene capaz de ex- pressão no hospedeiro gram-positivo que permite facilidade de seleção da- queles hospedeiros contendo o vetor. Exemplos de tais marcadores selecio- náveis incluem mas não estão limitados a antibióticos tal como, eritromicina, aspectinomicina, cloranfenicol e tetraciclina. Também são providas modali- dades onde um transportador codificado por um ácido nucléico tendo pelo menos 90% de homologia com a seqüência de DNA mostrada na SEQ ID NOS: [__________]. De preferência, a homologia é pelo menos 95%, com mais preferência pelo menos 98%. A homologia pode ser determinada alinhando o aminoácido ou a seqüência de DNA reivindicada com uma outra seqüência e determinação de quantos dos aminoácidos ou nucleotídeos combinam como uma porcentagem do total. Homologia pode ser também determinada usando um dos programas de software de análise de seqüência que estão comercialmente disponíveis, por exemplo, o programa TFastA Data Sear- ching disponível no Sequence Analysis Software Package Versão 6,0 (Ge- netic Computer Group, University of Wisconsin, Biotechnology Center, Madi- son, Wis. 53705).

Uma pessoa pode analisar seqüências homólogas usando hibri- dização conforme descrito aqui ou usando PCR com primers degenerados.

Chen e Suttle (1995) Biotechniques 18(4):609-610, 612.

Também, em várias modalidades da invenção, são providos áci- dos nucléicos que podem hibridizar com o DNA ou seus fragmentos, mos- trado nas Figuras e SEQ ID NOS:, respectivamente, sob condições estrin- gentes. Condições de hibridização estringentes incluem hibridização estrin- gente e condições de lavagem como é de conhecimento de uma pessoa versada na técnica. Hibridização e condições estringentes apropriadas são descritas em Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning, 2- ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Métodos para Produção Maior de Peptídeos Recombinantes a partir de Células hospedeiras tendo DNA Transformado Codificando Proteí- nas de Transporte Um método particularmente poderoso de aumento do transporte do substrato de uma localização celular para uma outra envolve a deleção de genomas [afastamento metabólico] da célula hospedeira transformada e a provisão concomitante de DNA codificando que aumenta o transporte do substrato desejado. Isso é vantajosamente conseguido provendo à célula uma quimera de deleção-transportador ou proteína de fusão, onde os afas- tamentos metabólicos da porção deletada são minimizados, e onde a porção de habilidade do transportador é superexpressa. Polipeptídeos quimica- mente fundidos ou seções embaralhadas do genoma são uma possibilidade, mas proteínas recombinantes são naturalmente mais preferidas para uso desta maneira. A identificação de fragmentos de permease apropriados para uso em tal quimera foi descrita aqui acima.

Em termos das porções de transporte dessas proteínas de fu- são, qualquer seqüência derivada de permease que contenha informação de seqüência primária suficiente para conferir atividade de transporte à quimera será útil nesse contexto. No entanto, será muitas vezes preferido usar a en- zima transportadora completa uma vez que isto é mais fácil de compreensão em termos de metodologia. Novamente, uma pessoa pode olhar para a ex- tensa informação disponível em várias referências publicadas a fim de auxi- liar na identificação de transportadores apropriados ou seus fragmentos.

Transformação A presente invenção também compreende acréscimo ou au- mento das capacidades das células em produzir polipeptídeos biologica- mente ativos, tais polipeptídeos aumentando o transporte de um substrato de um primeiro local da célula através de uma membrana para um segundo local da célula. Isto pode ser realizado, em alguns casos, através de super- expressão das proteínas envolvidas no transporte de um substrato para um outro local celular para bioconversão adicional, tal como um transportador secundário do simportere de ânion/cátion (Saier, 1988), em uma modalidade um simportere de ânion/cátion H+. Simporteres exemplares que são com- preendidos pelos inventores incluem permeases de YiaX2, PE1, PE6, Per- mA e PermB de Klebsiella oxytoca e Pantoea citrea. A expressão dos transportadores envolvidos na manutenção das qualidades de viabilidade e produtividade de células hospedeiras, especial- mente a sua capacidade de transporte, é importante. No caso dos cursos serem reações que requerem NADPH ou NADH, a viabilidade continuada das células hospedeiras é uma necessidade para produção contínua bem sucedida através do curso desejado. Certas considerações e fatores podem ser mantidos em mente enquanto determinando o número de cópias múlti- plas ou promotores que podem ser superexpressos enquanto mantendo a viabilidade do organismo. Em geral, expressão excessiva de transportadores pode ser detrimental às células porque o espaço disponível para incorporar o transportador na membrana é limitado. Desse modo, superprodução muito excessiva de um transportador pode diminuir a incorporação na membrana de outros transportadores que possam estar envolvidos no transporte de outros nutrientes do meio. Construção da superexpressão de um fator de transcrição específico do tipo de célula poderia aumentar ou estabilizar as capacidades do transportador de células hospedeiras construídas. A superexpressão estável de simporteres H+ em células hospe- deiras bacterianas vai servir para vários propósitos. Ela vai aumentar a ex- pressão do transgene enquanto mantendo a viabilidade do microorganismo. A superexpressão dos simporteres é mais simples do que a superexpressão de transportadores ABC uma vez que os simporteres não requerem a codifi- cação extensiva para componentes múltiplos do transportador ABC. Tercei- ro, através de superexpressão de um transportador secundário ao invés de transportadores acoplados ATP ou PTS, desvio de necessidades de energia da célula hospedeira é minimizado.

Em uma modalidade da presente invenção, ácido nucléico codi- ficando um ou mais transportadores da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira através de um vetor de expressão capaz de replicar dentro da célula hospedeira. Plasmídeos de replicação adequados para Pantoea são descritos em Sambrook, e outros, 1989, Molecular Cloning, 2- ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, aqui expressamente incorporado a título de referência, com base no fato de que Pantoea mantém a replicação dos mesmos plasmídeos que E. coli.

Em uma outra modalidade, ácidos nucléicos codificando um ou mais transportadores são estavelmente integrados no genoma do microor- ganismo. Células hospedeiras preferidas são do gênero Pantoea. Uma outra célula hospedeira preferida é K. oxytoca. Várias estratégias foram descritas na literatura para a integração de DNA ao cromossoma (vide, por exemplo, Balbas e outros, 1996, Gene 172:65-69; LeBorge e outros, 1998, Gene 223:213-219). A transformação de P. citrea pode ser realizada através do mé- todo de eletroforação, usando o protocolo desenvolvido para E. coli (Potter, H., 1988, Anal. Biochem. 174:361-373). III. Identificação de transformantes Após introdução do DNA no hospedeiro, os transformantes são selecionados através de resistência antibiótica codificada no vetor ou em geral através de seleção de uma função codificada dentro do plasmídeo.

Uma vez os transformantes terem sido diferenciados de células não- transformadas, a presença do plasmídeo com uma estrutura intacta pode ser confirmada usando protocolos padrão (Sambrook e outros, 1989). A presença da seqüência de polinucleotídeo de YiaX2, PermA, PermB, PE1 e PE6 pode ser detectada através de hibridização ou amplifica- ção de DNA-DNA ou DNA-RNA usando sondas, porções ou fragmentos da seqüência de polinucleotídeo conforme descrito na Figura 1. IV. Ensaios de transporte Um método preferido para determinação dos níveis dos interme- diários de ácido ascórbico através da metodologia de HPLC foi discutido su- pra.

Em adição, uma ampla variedade de rótulos e técnicas de con- jugação é conhecida por aqueles versados na técnica e pode ser usada em vários ensaios de ácido nucléico e aminoácido. Meios para a produção de sondas de hibridização ou PCR rotuladas para detecção de seqüências de polinucleotídeo específicas incluem oligorrotulagem, translação de entalhe, rotulagem final ou amplificação por PCR usando nucleotídeo rotulado. Alter- nativamente, a seqüência de nucleotídeo, ou qualquer porção dela, pode ser clonada em um vetor para a produção de sonda de mRNA. Tais vetores são conhecidos na técnica, estão comercialmente disponíveis, e podem ser usa- dos para sintetizar sondas de RNA in vitro através da adição de uma polime- rase de RNA comercial mente disponível tal como T7, T3 ou SP6 e nucleotí- deos rotulados. Várias companhias tal como Pharmacia Biotech (Piscataway N.J.), Promega (Madison Wis.) e U.S. Biochemical Corp (Cleveland, Ohio) fornecem kits comerciais e protocolos para esses procedimentos. Moléculas repórter adequadas ou rótulos incluem aqueles radionuclídeos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminescentes ou cromogênicos bem como substratos, co-fatores, inibidores, partículas magnéticas e similar. Patentes ensinando o uso de tais rótulos incluem Patentes U.S. N- 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 e 4.366.241. Tam- bém, imunoglobulinas recombinantes podem ser produzidas conforme mos- trado na Patente U.S. N9 4.816.567 e incorporada aqui a título de referência.

Também, imunoglobulinas recombinantes podem ser produzidas conforme mostrado na Patente U.S. N9 4.816.567 e incorporada aqui a título de refe- rência.

EXEMPLOS

Exemplo 1 Materiais e Métodos a. Plasmídeo, cepa e meio bacteriano: Plasmídeo pBCL 1920, K. oxytoca, P. citrea 1392A, cepa P. citrea 1392A é uma variante que é 39140. pD92 é descrita em representações de um vetor que contém o gene de DKG reduta- se. Patente U.S. NQ 5.376.544. O meio Murphy III contém frutose 0,5%, Fosfato 1,6%, MgS04.7H20 0,2%, Soytone 0,2%, citrato 0,01% (NH4)2S04 1%, traços de sais na faixa de ppm tal como Fe, Co, Mn, Zn e vitaminas tal como ácido nicotínico, folato e B12; meio M9, Fosfato 0,9%, NaCI 0,1%, NH4CI 0,1%, MgS04 0,0005%, CaCI2 0,025%; Potássio de meio de fermen- tação, Fosfato 1%, MgS04 0,15%, glutamato 1,5%, frutose 2,5%, sulfato de amônio 0,1%, e mistura de vitamina tendo biotina, tiamina, piridoxina, ribo- flavina, ácido nicotínico, ácido fólico e Bi2, e solução de coquetel de metais traço tendo íons de ferro, Zn, e Mn em um nível de ppm 10-100; meio de ensaio de transporte 100 mM de Fosfato de Potássio pH 6,9; Antibiótico Es- pectinomicina 50 pLg/ml e Tetraciclina 20 pg/ml, IPTG 100 μΜ.

b. Técnicas de DNA c. Crescimento de células: Cepas construídas usando métodos recombi- nantes e P. citrea e K. oxytoca do tipo selvagem foram cultivadas em ou meio M9 contendo DKG como a fonte de carbono única ou meio MIM como frutose como a única fonte de carbono ou com MIM tendo fonte de carbono mista tal como frutose, Gluconato e DKG na faixa de 0,1% a 1%. As células foram cultivadas entre 20-37°C, mas de preferência abaixo de 30°C. As cé- lulas foram de preferência cultivadas em pH neutro, mas a faixa compreen- dia pH de a partir de 5-8. Células de P. citrea cultivadas em um fermentador de um frasco vedado usaram meio de fermentação usando alimentação ou de frutose ou glicose. d. Ensaio bioquímico de absorção de DKG: Amostras de caldo de fermenta- ção contendo células foram retiradas do respectivo aparelho de crescimento e foram extintas em banho de água gelada. O caldo de fermentação foi cen- trifugado e o sobrenadante foi descartado. O pélete da célula foi lavado usando 0,95 de solução salina fria seguido por 2 lavagens pelo tampão de ensaio de absorção de DKG de 100 mM de fosfato de potássio frio pH 6,9.

As células foram ressuspensas no mesmo tampão de ensaio para um OD de 12 a 550 nm e foram incubadas em temperatura ambiente ou de preferência a 28°C. O ensaio de absorção de DKG foi iniciado misturando as células com 2,5-DKG radio-isotopado enriquecido com C-14. O curso de tempo de absorção de DKG foi realizado usando resfriamento rápido com vácuo/filtro usando tampão de ensaio frio. A medição de absorção de DKG foi feita atra- vés de incorporação de radioisótopo às células e os dados obtidos foram postos em gráfico contra o tempo para dar a taxa de absorção de DKG.

Um outro ensaio usando óleo de silício para absorção de DKG celular e estudo de metabolismo foi também realizado (Johnson, J.D. e ou- tros, J. Lab. Clin. Med., 1980, 95:429-439). 100 pL de óleo de silício foram adicionados a epitubos prontos para o ensaio. Células e o 2,5-DKG enrique- cido com C-14 (U) foram misturados e então em intervalos de tempo regula- res 100 ul da mistura de célula/substrato foram retirados e adicionados aos epitubos contendo óleo de silício, centrifugados por 15 segundos e então imediatamente congelados em banho de gelo seco/etanol. Após cinco mi- nutos, a ponta do epitubo contendo o pélete é cortada diretamente em um frasco de cintilação. O resto do tubo é novamente cortado logo acima da porção congelada e gotejado em um outro frasco contendo fluido de cintila- ção. As contas foram medidas após uma noite para facilitar a palheta de cé- lula de soltar da ponta do epitubo. A diferença entre as contas soltarem do alto e a aparência das contas na palheta é devido ao metabolismo celular e CO2 liberado. No final do ensaio de absorção, quando as células foram per- meabilizadas, os baixos teores de célula molecular se mostraram e prove- ram informação sobre 0 substrato importado acumulado e o resultado de substrato foi adicionalmente metabolizado para se tornar componente celular, e. Ensaio de DKG redutase: Péletes de célula de cada fermentador foram coletadas e congeladas a -70°C por aproximadamente 24 horas. Os péletes nos momentos de tempo de 15 e 25 horas foram derretidos em gelo e prensa- dos em uma prensa French em 50 mM de tampão PIPES, pH 6,5. Os extratos foram girados por 2 min. x 14 K rpm em uma centrífuga de bancada, e subse- qüentemente medidos quanto à concentração de proteína total e atividade de redutase. Todas as amostras foram medidas através dos ensaios Bradford e BCA para proteína, e diluídas conforme necessário para ensaios de taxa preci- sa. Os ensaios foram medidos contra taxas de base que continham todos me- nos 2,5-DKG (e eram todos menos do que 10% das taxas totais). O tampão continha: 50 mM de PIPES pH 6,5,150 uM de NADPH e 5 mM de 2,5-DKG.

Um outro ensaio usando óleo de silício para absorção de DKG celular e estudo de metabolismo foi também realizado (Johnson, J.D. e ou- tros, J. Lab. Clin. Med., 1980, 95:429-439). 100 ul de óleo de silício foram adicionados ao epitubo pronto para o ensaio. Células e 2,5-DKG enriquecido com 14-C (U) foram misturados e então em intervalos de tempo regulares (por exemplo, por volta de a cada 10 segundos) 100 ul da mistura de célu- la/substrato foram retirados e adicionados aos epitubos contendo óleo de silício, centrifugados por 15 minutos e então imediatamente congelados em banho de gelo seco/etanol. Após 5 minutos, a ponto do epitubo contendo o pélete de célula é cortado diretamente no frasco de cintilação. O resto do tubo é novamente cortado um pouco acima da porção congelada e gotejado em um outro frasco contendo fluido de cintilação. As contas foram medidas após uma noite para facilitar a palheta de célula de soltar da ponta do epitu- bo. A diferença entre as contas soltarem do alto e a aparência das contas na palheta é devido ao metabolismo celular e CO2 liberado. No final do ensaio de absorção, quando as células foram permeabilizadas, os baixos teores de célula molecular se mostraram e proveram informação sobre o substrato im- portado acumulado e o resultado de substrato foi adicionalmente metaboli- zado para se tornar componente celular.

Exemplo II O Exemplo II provê a base que de que os transportadores de substrato podem ser de limitação de taxa em bioconversão de célula integral Este exemplo narra as etapas chave de formação de 2-KLG a partir de glicose que pode ser compartimentalizada em quatro partes (Figura 5). A produção do intermediário chave 2,5-DKG usando três enzimas peri- plásmicas em P. citrea em uma taxa de 14-15 g/l/h (Sonoyama e outros, Appl. Environ. Microbio/., 1982, 43:1064-1069). A segunda parte é a taxa através da qual o DKG é necessário ser transportado para o espaço cito- plasmático da célula. A terceira é a taxa de conversão de DKG em 2-KLG usando DKG redutase (Patente U.S. Ns 5.032.514). Conversão de DKG em 2-KLG não é a taxa de limitação quando a DKG redutase é superexpressa.

Quando nas fermentações de produção de 2-KLG atuais da requerente, piasmídeos induzíveis foram usados para ambos aumentar e diminuir as ati- vidades específicas de redutase relativas às fermentações típicas da reque- rente, que atualmente usam pD92, onde a DKG redutase está sob um pro- motor trp constitutivo. O plasmídeo induzível, pD23, está sob um promotor taq, e pode ser induzido com IPTG. Três fermentadores foram utilizados, um com pD92, e dois com pD23, um deles estava induzido com IPTG. O pD92 de controle e o pD23 induzido produziram níveis quase idênticos de 2-KLG, enquanto que o pD23 não-induzido fez significantemente menos. Ensaios de atividades específicas de redutase mostram que com relação ao pD92 de controle, o plasmídeo não-induzido fez menos do que metade dos níveis de redutase, enquanto que o pD23 fez mais de duas vezes mais. Esses resultados indicam que o nível de atividade de redutase na fermentação de P. citrea que produz 2-KLG da requerente não é a obstrução para a produção de 2-KLG.

Cepas Concentração Atividade Atividade de Proteína Redutase Específica pD 92(controle) 3,2 mg/ml 25,0 u/ml 7,8 u/mg pD23 (não-induzida) 3,7 mg/ml 12,0 u/ml 3,2 u/mg pD23 (induzida) 3,9 mg/ml 73 u/ml 19 u/mg A quarta parte é o transporte de 2-KLG que é intracelularmente produzido e necessita ser exportado. A taxa de produção de 2-KLG na fer- mentação (2,2 g/l/h - 2,7 g/l/h) é considerada ser igual à taxa de exportação de 2-KLG da célula. É discutido, se a taxa de exportação de 2-KLG é limi- tante então as células vão acumular 2-KLG dentro da célula e as células não serão capazes de funcionar em seu potencial metabólico e eventualmente morrerão. No entanto, células de P. citrea que produzem 2-KLG não exibem nenhuma dessas condições e medições intracelulares de 2-KLG permane- cem 10-20 vezes abaixo da concentração máxima de 2-KLG produzido. É então imaginado que a exportação de 2-KLG também não seja uma etapa de limitação de taxa na produção de 2-KLG.

Exemplo III O Exemplo III provê a prova de que na verdade da taxa de transporte de substrato para a célula para bioconversão pode ser a etapa de limitação de taxa Péletes de célula de três momentos diferentes do processo de fermentação, estágio de semente de frasco, estágio de alimentação de fruto- se e estágio de alimentação de glicose foram coletados e processados con- forme descrito no experimento. O ensaio de absorção de DKG usando esses tipos de célula deu 0,5 g/l/h, 2,7 g/l/h e 2,75 g/l/h de taxa de absorção de DKG para trazer o DKG para ser convertido em KLG (Figura 9). A taxa de importação de DKG é a mesma que a de exportação de KLG. Esse resultado demonstra então que a taxa de bioconversão de DKG em KLG é dependente da taxa de importação de 2,5-DKG para a célula. Desse modo, a invenção vai mostrar que aumentando os transportadores de absorção de DKG através de superexpressão vai aumentar a taxa de importação de 2,5-DKG e desse modo vai aumentar a taxa de produção de 2-KLG. Aqueles versados na técnica po- dem ver que o fator de limitação chave em várias biotransformações usando métodos de conversão de célula integral pode na verdade ser importação e a taxa de importação de substrato para a célula para a biotransformação.

Exemplo IV

O Exemplo IV provê o encontro de um transportador de 2,5-DKG em K. oxytoca usando ensaio de absorção de DKG. O WO 002170 descreve a identificação e seqüenciamento de um operon de Klebsiella oxytoca, desi- gnado através do operon, que contém oito estruturas de leitura aberta putati- vas. As funções desses polipeptídeos codificados pelas estruturas de leitura aberta individuais no operon yia não são descritas no WO 002170. O rompi- mento deste operon removeu a habilidade da K. oxytoca em usar ácido as- córbico como uma fonte de carbono única. Sabe-se que o ácido ascórbico é uma substância oxidativamente estável e é decomposta em 2,3-DKG através de oxidação do ar (Kimaya, S., J. Vitamino!. 1961, 7:19-26). Foi então sen- sato sugerir que é o 2,3-DKG que é o real substrato para crescimento. Uma das estruturas de leitura aberta no operon yia, designada como yiaX2, codifi- cou uma proteína de transmembrana do tipo de transportador e foi então considerada um candidato para 2,3-DKG permease. À luz da pesquisa pa- ralela para encontrar 2,5-DKG permease, foi então dado conta de que 2,3- DKG e 2,5-DKG sendo moléculas análogas, pode ser possível que yiaX2 possa transportar 2,5-DKG e outros ácidos ceto de açúcar tal como 2-KLG. A fim de determinar se yiaX2 pode transportar 2,5-DKG, e 2- KLG, este gene foi deletado do cromossoma de K. oxytoca cepa M5a1 (vide, por exemplo, Streicher e outros, Proc. Natl. Acad. Sei., 68:1174-1177 (1971)). O mutante de deleção de yiaX2 chamado MGK002 foi criado usando proto- colos de biologia molecular padrão conhecidos na técnica (vide, por exem- plo, Hamilton e outros, J. Bacterial. 171:4617-4622 (1989)). Uma outra cepa de K. oxytoca designada como cepa de Teste foi criada adicionando de volta o plasmídeo codificado e o gene yiaX2 regulado com operon lac à cepa de K. oxytoca MGK002. O ensaio de absorção de DKG sob indução de IPTG +/- usando MGK002 e cepa de Teste confirmou que o yiaX2 codificou um poli- peptídeo tendo atividades de transporte de 2,5-DKG (Figura 9).

Exemplo V O Exemplo V provê a metodologia de seleção para avaliação da 2,5-DKG permease de microorganismos Com a informação de que o gene yiaX2 codificou uma proteína de transportador tendo atividades de transporte de 2,5-DKG, foi possível projetar um hospedeiro de seleção para encontrar a proteína transportadora de 2,5-DKG de P. citrea e outras fontes biológicas. K. oxytoca com deleção do gene yiaX2 e adição de genes para expressar enzimas envolvidas no catabolismo de 2,5-DKG em ácido gulônico, que é acessível ao metabolismo central de um organismo. Enzimas capazes de catabolisar 2,5-DKG em áci- do gulônico são codificadas por tkr e genes idno do operon tkr idnD idnO presente em alguns organismos Gram negativos (Bausch, C. e outros. J.

BacterioL, 1998, 180:3704-3710). A cepa de teste resultante de K. oxytoca era yiaX2[tkr idno] e tinha todos os componentes necessários para crescimento em 2,5-DKG como uma fonte de carbono única, exceto pela sua incapacidade de importar DKG para o citoplasma. Desse modo, a molécula de ácido nucléico que co- difica uma 2,5-DKG permease, quando da expressão na cepa de teste, deve conferir a habilidade da cepa de teste em crescer em 2,5-DKG. Esta meto- dologia de seleção é mostrada na Figura 9. O vetor de clonagem usado para construção de bibliotecas ge- nômicas de P. citrea é o plasmídeo pCI1920 (Lemer e outros, Nucleic. Acid Res., 1994, 18:4621), um vetor de expressão de número de cópia baixo que carrega um determinante de resistência à espectinomicina/estreptomicina. A expressão é dirigida pela região de promotor de lacPO/operador que é re- primida pelo produto do gene laclq quando provido pelo hospedeiro. DNA genômico de P. citrea (ATCC 39140) foi isolado usando protocolo padrão e biblioteca genômica foi criada (Sambrook e outros, Molecular Cloning: A La- boratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1992)). As bibli- otecas amplificadas foram armazenadas na forma de DNA de plasmídeo para uso adicional para encontrar a 2,5-DKG permease de P. citrea.

Exemplo VI O Exemplo VI provê a prova de que a superexpressão do trans- portador de DKG na célula hospedeira pode aumentar a taxa de importação de DKG para a célula.

Biblioteca genômica foi introduzida na cepa de teste de K. oxyto- ca cepa yiaX2[tkr idno]. Clones que cresceram em 2,5-DKG usando placas M9-agar com 2,5-DKG a 2,5% e 0,1 mM de IPTG foram testados quanto à absorção de DKG usando DKG 14-C (U) rotulado. Vários clones foram verifi- cados ter absorção de DKG mais aperfeiçoada do que a cepa de teste de controle (Figura 9). DNA da biblioteca genômica desses clones positivos foi transformado em P. citrea (139-2A) e o ensaio de absorção de DKG foi reali- zado para medir o aperfeiçoamento na absorção de DKG sobre a cepa 139- 2A de P. citrea. Aperfeiçoamento de três a cinco vezes na taxa de absorção de DKG foram vistos nos transformantes tendo cópias adicionais de plasmí- deo codificado por DKG permeases encontrados através de avaliação de biblioteca genômica e metodologia de seleção (Figura 10).

Exemplo VII O Exemplo VII provê a prova de que através de superexpressão do transportador de DKG na célula hospedeira uma pessoa é capaz de aperfeiçoar a produção de 2-KLG.

Molécula de ácido nucléico codificando PermA de DKG permea- se de Pantoea citrea (SEQ ID NO: 2) quando subclonada usando vetor de pouca cópia pBCL 1920 em cepa de Pantoea citrea 139-2A adequada para biossíntese de 2-KLG a partir de glicose (Patente U.S. 5.032.514), a taxa de produção de 2-KLG melhorou de 2,5 g/l/h para 3,2 g/l/h e o rendimento do açúcar melhorou de 45% para 53% (Figura 11).

Exemplo VIII O Exemplo VIII descreve as características de PermA de 2,5- DKG permease de P. citrea.

Este exemplo descreve a topologia da membrana de PermA de P. citrea. Análise PFAM (Hirokawa T. e outros, Bioinformatics, 1998, 4(4):378) prevê que a PermA tem 11 domínios de expansão de transmem- brana, com 8 domínios primários e 3 domínios de expansão secundários (Figura 12). O terminal amino está no periplasma e o terminal carbóxi estan- do localizado no citoplasma. Duas alças maiores e menores existem e am- bos periplasma e citoplasma têm uma alça maior e uma menor. A PermA é uma proteína de membrana com hidrofobicidade de 0,62 e tem um peso molecular de 48 Dáltons. Ela é um simportere associado H+ de 2,5-DKG com base na análise de taxa de acúmulo (Lolkema, J.S. e outros, 1996, Handbook of Biological Physics, Capítulo 11, 229-260). Ela pertence à famí- lia ACS de MFS baseado na análise de seqüência de consenso (Pao, S.S. e outros, Microbiol Molecular Biol. Rev., 1998, 62:1-34) (Figura 8a). Vários outros exemplos e modificações da descrição e exemplos acima ficarão aparentes a uma pessoa versada na técnica após a leitura da descrição sem se afastar do espírito e escopo da invenção, e é pretendido que todos tais exemplos e modificações sejam incluídos no escopo das rei- vindicações apensas. Todas as publicações e patentes aqui referidas são aqui incorporadas em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUCIAS <110> Genencor International, Inc.

Microgenomics, Inc.

<120> MODO PARA AUMENTO DA PRODUO BIOSSINTICA DE IDO

2-CET0-L-GULIC0 (2-KLG) DE UMA CULA HOSPEDEIRA

<130> GC687-PCTA <140> PI0113034-0 <141> 03/08/2001 <150> US 09/633,294 <151> 04/08/2000 <150> US 09/677,032 <151> 29/09/2000 <160> 12 <170> FastSEQ para Windows Vers 4.0 <210> 1 <211> 1317 <212> DNA <213> Klebsiella oxytoca <400> 1 atgaatataa cctctaactc tacaaccaaa gatataccgc gccagcgctg gttaagaatc 60 attccgccta tactgatcac ttgtattatt tcttatatgg accgggtcaa tattgccttt 120 gcgatgcccg gaggtatgga tgccgactta ggtatttccg ccaccatggc ggggctggcg 180 ggcggtattt tctttatcgg ttatctattt ttacaggttc ccggcgggaa aattgccgtt 240 cacggtagcg gtaagaaatt tatcggctgg tcgctggtcg cctgggcggt catctccgtg 300 ctgacggggt taattaccaa tcagtaccag ctgctggccc tgcgcttctt actgggcgtg 360 gcggaaggcg gtatgctgcc ggtcgttctc acgatgatca gtaactggtt ccccgacgct 420 gaacgcggtc gcgccaacgc gattgtcatt atgtttgtgc cgattgccgg gattatcacc 480 gccccactct caggctggat tatcacggtt ctcgactggc gctggctgtt tattatcgaa 540 ggtttgctct cgctggttgt tctggttctg tgggcataca ccatctatga ccgtccgcag 600 gaagcgcgct ggatttccga agcagagaag cgctatctgg tcgagacgct ggccgcggag 660 caaaaagcca ttgccggcac cgaggtgaaa aacgcctctc tgagcgccgt tctctccgac 720 aaaaccatgt ggcagcttat cgccctgaac ttcttctacc agaccggcat ttacggctac 780 accctgtggc tacccaccat tctgaaagaa ttgacccata gcagcatggg gcaggtcggc 840 atgcttgcca ttctgccgta cgtcggcgcc attgctggga tgttcctgtt ttcctccctt 900 tcagaccgaa ccggtaaacg caagctgttc gtctgcctgc cgctgattgg cttcgctctg 960 tgcatgttcc tgtcggtggc gctgaaaaac caaatttggc tctcctatgc cgcgctggtc 1020 ggctgcggat tcttcctgca atcggcggct ggcgtgttct ggaccatccc ggcacgtctg 1080 ttcagcgcgg aaatggcggg cggcgcgcgc ggggttatca acgcgcttgg caacctcggc 1140 ggattttgtg gcccttatgc ggtcggggtg ctgatcacgt tgtacagcaa agacgctggc 1200 gtctattgcc tggcgatctc cctggcgctg gccgcgctga tggcgctgct gctgccggcg 1260 aaatgcgatg ccggtgctgc gccggtaaag acgataaatc cacataaacg cactgcg 1317 <210> 2 <211> 1281 <212> DNA <213> Desconhecido <220> <223> Permease ambiental PE1 <400> 2 atgaacagct ctaccaatgc aacgaaacgc tggtggtaca tcatgcctat cgtgtttatc 60 acgtatagcc tggcgtatct cgaccgcgca aacttcagct ttgcttcggc agcgggcatt 120 acggaagatt taggcattac caaaggcatc tcgtcgcttc ttggcgcact tttcttcctc 180 ggctatttct tcttccagat cccgggggcg atttacgcgg aacgccgtag cgtacggaag 240 ctgattttca tctgtctgat cctgtggggc gcctgcgcct cgcttgaccg ggatggtgca 300 caatattcca gcgctggctg gcgatccgtt ttattctcgg ctgtcgtgga agcggcggtc 360 atgccggcga tgctgattta catcagtaac tggtttacca aatcagaacg ttcacgcgcc 420 aacaccttct taatcctcgg caacccggtc acggtactgt ggatgtcggt ggtctccggc 480 tacctgattc agtccttcgg ctggcgtgaa atgtttatta ttgaaggcgt tccggccgtc 540 ctctgggcct tctgctggtg ggtgctggtc aaagttaaac cgtcgcaggt gaactggttg 600 tcggaaaacg agaaagccgc gctgcaggcg cagctggaga gcgagcagca gggtattaaa 660 gccgtgcgta actacggcga agccttccgc tcacgcaacg tcattctact gtgcatgcag 720 tattttgcct ggagtatcgg cgtgtacggt tttgtgctgt ggttgccgtc aattattcgc 780 agcggcggcg tcaatatggg gatggtggaa gtcggctggc tctcttcggt gccttatctg 840 gccgcgacta ttgcgatgat cgtcgtctcc tgggcttccg ataaaatgca gaaccgtaaa 900 ctgttcgtct ggccgctgct gctgattggc ggactggctt ttattggctc atgggccgtc 960 ggcgctaacc atttctgggc ctcttatacc ctgctggtga ttgccaatgc ggcaatgtac 1020 gccccttacg gtccgttttt cgccatcatt ccggaaatgc tgccgcgtaa cgtcgccggt 1080 ggcgcaatgg cgctcatcaa cagcatgggg gccttaggtt cattctttgg ttcgtggttc 1140 gtgggctacc tgaacggcac caccggcagt ccatcagcct catacatttt catgggagtg 1200 gcgcttttcg cctcggtatg gcttacttta attgttaagc ctgctaacaa tcaaaagctc 1260 cccatcggcg ctcgtcacgc c 1281 <210> 3 <211> 1278 <212> DNA <213> Desconhecido <220> <223> Permease ambiental PE6 <400> 3 atgaatacag cctctgtttc tgtcacccaa agccaggcga tccccaaatt acgctggttg 60 agaatagtgc cgcctattct tattacctgc attatttcct atatggaccg ggtgaacatc 120 gccttcgcca tgcccggcgg catggacgat gaactgggca tcaccgcctc gatggccggg 180 ttggccggcg gtattttctt tatcggttat ctgttcttgc aggtacccgg cggcaagctg 240 gcggtgtacg gcaacggcaa gaaattcatc ggttggtcgt tgttggcctg ggcggtgatt 300 tccgtgctga ccgggctggt cacgaatcag tatcaattgc tgttcctgcg cttcgccctc 360 ggccgtttcc gaagcggcat gctgcggtgg gtgctgacca tgatcagcaa ctggttcccg 420 gacaaggaac gcgggcgcgc caacgccatc gtcatcatgt tcgtgccgat cgccggcatc 480 cttaccgcac cgctgtccgg ctggatcatc accgcctggg actggcgcat gctgttcctg 540 gtcgagggcg cgctgtcgct ggtcgtgatg gtgctgtggt atttcaccat cagcaaccgt 600 ccacaagagg ccaaaaggat ttcgcaggcg gaaaaagatt atctgatcaa aacgctgcac 660 gacgaacagt tgctgatcaa aggcaaaacg gtgcgcaacg cctcgctgcg tcgggtgctg 720 ggcgacaaaa tcatgtggaa gttcttctac cagaccggga tatacggcta caccctgtgg 780 ctgccgacca ttctcaaggg gctcaccaac ggcaatatgg agcaggtcgg gatgctggct 840 atcctgccct atatcggcgc catcttcggc atgctgatca tttccaccct ctccgatcgc 900 accggcaagc gcaaagtgtt cgtcgcactg ccgctggcct gctttgccat ctgcatggcg 960 ctgtcggtgc tgctgaagga tcacatctgg tggtcgtacg cggcgctggt gggctgtggc 1020 gtctttaccc aggccgccgc cggggtgttc tggaccattc cgcccaagct gtttaacgcc 1080 gaaatggccg gcggcgcgcg cggcgtgatc aatgcactgg gcaacctcgg cggtttctgc 1140 ggcccctata tggtcggcgt gttgatcacc ttgttcagca aagacgtcgg cgtttacagc 1200 ctcgcggtgt cgctggcctc cgcctcggtg ctggcgttga tgctgccgaa cagatgcgac 1260 caaaaagcgg gggccgaa 1278 <210> 4 <211> 1308 <212> DNA <213> Pantoea citrea <400> 4 atgcaaaaat cacagccggg aacccgctgg tttcggatta ttgtgccgat cctgatagcc 60 tgcatcatgt cgtttatgga tcgggtaaat atcagtttcg cattgccggg cggtatggag 120 caggatctgc tgatgtccag ccagatggcc ggggtagtta gcggtatttt ctttattggt 180 tatctgtttt tgcaggttcc tggtgggcat atcgcagtac gtggcagtgg taaacgtttt 240 attgcctggt cgcttgttgc ctgggccgtt gtttctgtcg ctaccgggtt tgtgactcat 300 cagtaccagc tgttgatttt acgttttgca ctgggggtct ctgaaggtgg gatgttgccg 360 gtagttctga caatggtcag caactggttt cctgaaaaag agctggggcg tgctaatgca 420 tttgtcatga tgttcgcccc gcttggcgga atgattaccg cccctgtctc cggatggatt 480 attgcactgc tagactggcg ctggttattt attatcgaag gattactgtc ggtagtggtt 540 ctggcagtct ggtggctgat ggtcagtgac cgccctgaag atgcccgttg gctgccggca 600 gcagaacggg aatatctgct gcgcgaaatg gcccgtgaca aggccgagcg gagcaaactc 660 cctccgatca gtcatgctcc cctgcaagag gttttccata acccgggcct gatgaagtta 720 gtgattctga actttttcta tcagacaggt gattacggat acactctgtg gctgccgact 780 attatcaaaa acctgaccgg agctagtatt ggtaacgtcg gtttgctgac agtgctacct 840 tttatcgcga cgttatcagg gatttatgtc gtctcttacc tgagcgataa aaccggcaaa 900 cgtcggcaat gggtgatgat ttctctgttc tgttttgcgg cctgcctgtt ggcctcagtc 960 ctgttacgtg aatttgtgct ggctgcttat ctggctctgg tggcttgcgg ctttttcctg 1020 aaagcagcca ccagcccgtt ctggagtatt ccgggacgta ttgcaccgcc ggaagcagcc 1080 ggtagtgccc gtggtgtaat taacggactg gggaatctgg gcggtttctg cggcccctgg 1140 ctggtcggat taatgatcta cctgtacgga cagaatgcag ccgttgttac tctggcaggc 1200 tctctgatca ttgccgggat tattgcggca ttactgccaa cgcagtgtga tctgcgcccg 1260 gcagaggcac ggcagcagaa tttcacccca cgtattcatg atgccaaa 1308 <210> 5 <211> 1242 <212> DNA <213> Pantoea citrea <400> 5 atgccggtga tttttattac ttacagcctg gcatatctgg atcgggccaa ctacggcttt 60 gctgctgcct ctgggattga agcagatctt ggaattagcc gtggcacctc ctctctgatt 120 ggagcactgt tctttctcgg ctacttcatt tttcaggtgc ccggggcaat ttatgcagtg 180 aaacgcagtg tccgtaaact ggtgtttacc agcctgctgt tgtggggatt ttgtgccgct 240 gcgaccggac ttatcagcaa tattccggct ctgatggtga tccgctttgt tctgggtgtt 300 gttgaagccg cagtgatgcc agcgatgctg atttacatca gcaactggtt cacccgtcag 360 gaacgttcac gggctaatac ctttctggta ttaggtaacc cggtcacggt gttatggatg 420 tctattgttt ccggatatct gatcaatgct tttggctggc gggaaatgtt tattttcgag 480 ggtgtgcctg ccttaatctg ggccatcttc tggtggttta ttgtccggga caaaccggag 540 caggtgagct ggctgacaga aacagaaaag cagcaactgg ccagtgcaat ggctgaagag 600 cagcaggcaa taccaccgat gcgcaatgtg ccgcaggccc tgcgttcccg caatgtggtg 660 gtactgtgcc tgttacacgc tctgtggagc atcggagtgt atggttttat gatgtggatg 720 ccatcgatac tgcgtagcgc tgcatcaatg gacattgtcc gggtaggctg gctggccgca 780 gttccgtatc tggccgcgat tattactatg ctggtgattt catggctgtc agataaaacc 840 gggctgcgtc ggctttttat ctggccatta ttgctgattg cgtcagttac tttttttggg 900 tcctggttac ttgggagcta ctcattctgg ttttcctatg gcttgctggt actggctgct 960 gcttgtatgt atgccccgta tggaccgttt tttgcgttga ttcctgaatt gctgccaaaa 1020 aatgtggcgg ggatttctat cgggttaatt aactgttgcg gggcgctggg agcttttgcc 1080 ggagcctggc tggtgggcta tcttaatggt ctgaccggtg gtccgggggc ttcttacact 1140 tttatggcca ttgcattgct ggtttctgta gggttggtgt ttttcctgaa agtcccttca 1200 gggaatttgg tcactcgtcg gttgctgaaa ggtgatgcaa ag 1242 <210> 6 <211> 1338 <212> DNA <213> Pantoea citrea <400> 6 atgaatactc atcaggcagc caaaggtatt gctataccta aacaacggtg gctgagaatt 60 atctcgccaa taattatcac ctgcattatt tcttatatgg accgggtcaa tattgctttt 120 gccatgcctg gaggaatgga taaagattta tccgtctctg ccagtatggc cggattggcc 180 ggcggaatat tttttatagg ttatctgttc ttacaggttc ccggtggaaa aatagccgta 240 cacggtagtg gtaagaaatt tattggctgg tcactggtgg cctgggcagt aatttcagtt 300 ctgaccggca tggttactaa ccagtatcag ttgctgtttt tacgctttct tctgggggta 360 tcagaagggg gtatgttgcc tgttgttctc actatcatca gtaactggtt tccagatcgt 420 gaacgcggca gagccaactc aatcgtgatt atgtttgtac ccatcgccgg aataatctcc 480 gccccgctgg caggctggtt aatctcttct ctggactggc gctggctgtt ttatattgaa 540 ggtttacttt ctctggcggt actgctgctg tgggcactga ctatttctga ccgccccgcc 600 gaagcacgct ggatctcccg ggccgaaaaa gattatctgc tcaaaacctt gcgggaagag 660 cagatagctc accaaccccc tttgcgtaaa gtcactctgt cgtcagtgct ggaaaacaga 720 actttatggc tgctgattgc acttaatttt ttctatcagg ccggaatcta tggctacaca 780 ttgtggctgc cgaccatttt aaaagatatg gcgcatagca gcatgtccct ggtcggttta 840 ctggcaattc tgccttatgt cgccgccatg gccggtatgt tcctgttttc ccggttatcg 900 gataagagtg gcaaacggcg ccgttatgtc attctgccct tgttcggatt cgcgttatgc 960 atggcattgt cagtaatcag ccagggccat ttatggattt cttacagcgc actgattggc 1020 tgtggttttt tcctgcagtc agctgctggg gtgttttggg caattccggc ccggttgttt 1080 agtgccgagg tcgcaggcag tgcccgtggg gtaattaatg ccttaggtaa tcttggcggt 1140 ttttgtggcc cctatctggt cggcatcttt attacttttt atagccaggc ggccggtgtc 1200 tatttcctgg caatttcgct ggcgattgcc ggagctctgg cattttgcct gccacgccgc 1260 tgcgatatgt cagccagcga aatcgccgct gaagatgcaa agattgaacc gctgcccgga 1320 catgccggga gggtatta 1338 <210> 7 <211> 439 <212> PRT <213> Klebsiella oxytoca <400> 7 Met Asn Ile Thr Ser Asn Ser Thr Thr Lys Asp Ile Pro Arg Gin Arg 15 10 15 Trp Leu Arg Ile Ile Pro Pro Ile Leu Ile Thr Cys Ile Ile Ser Tyr 20 25 30 Met Asp Arg Vai Asn Ile Ala Phe Ala Met Pro Gly Gly Met Asp Ala 35 40 45 Asp Leu Gly Ile Ser Ala Thr Met Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ile Phe 50 55 60 Phe Ile Gly Tyr Leu Phe Leu Gin Vai Pro Gly Gly Lys Ile Ala Vai 65 70 75 80 His Gly Ser Gly Lys Lys Phe Ile Gly Trp Ser Leu Vai Ala Trp Ala 85 90 95 Vai Ile Ser Vai Leu Thr Gly Leu Ile Thr Asn Gin Tyr Gin Leu Leu 100 105 110 Ala Leu Arg Phe Leu Leu Gly Vai Ala Glu Gly Gly Met Leu Pro Vai 115 120 125 Vai Leu Thr Met Ile Ser Asn Trp Phe Pro Asp Ala Glu Arg Gly Arg 130 135 140 Ala Asn Ala Ile Vai Ile Met Phe Vai Pro Ile Ala Gly Ile Ile Thr 145 150 155 160 Ala Pro Leu Ser Gly Trp Ile Ile Thr Vai Leu Asp Trp Arg Trp Leu 165 170 175 Phe Ile Ile Glu Gly Leu Leu Ser Leu Vai Vai Leu Vai Leu Trp Ala 180 185 190 Tyr Thr Ile Tyr Asp Arg Pro Gin Glu Ala Arg Trp Ile Ser Glu Ala 195 200 205 Glu Lys Arg Tyr Leu Vai Glu Thr Leu Ala Ala Glu Gin Lys Ala Ile 210 215 220 Ala Gly Thr Glu Vai Lys Asn Ala Ser Leu Ser Ala Vai Leu Ser Asp 225 230 235 240 Lys Thr Met Trp Gin Leu Ile Ala Leu Asn Phe Phe Tyr Gin Thr Gly 245 250 255 Ile Tyr Gly Tyr Thr Leu Trp Leu Pro Thr Ile Leu Lys Glu Leu Thr 260 265 270 His Ser Ser Met Gly Gin Vai Gly Met Leu Ala Ile Leu Pro Tyr Vai 275 280 285 Gly Ala Ile Ala Gly Met Phe Leu Phe Ser Ser Leu Ser Asp Arg Thr 290 295 300 Gly Lys Arg Lys Leu Phe Vai Cys Leu Pro Leu Ile Gly Phe Ala Leu 305 310 315 320 Cys Met Phe Leu Ser Vai Ala Leu Lys Asn Gin Ile Trp Leu Ser Tyr 325 330 335 Ala Ala Leu Vai Gly Cys Gly Phe Phe Leu Gin Ser Ala Ala Gly Vai 340 345 350 Phe Trp Thr Ile Pro Ala Arg Leu Phe Ser Ala Glu Met Ala Gly Gly 355 360 365 Ala Arg Gly Vai Ile Asn Ala Leu Gly Asn Leu Gly Gly Phe Cys Gly 370 375 380 Pro Tyr Ala Vai Gly Vai Leu Ile Thr Leu Tyr Ser Lys Asp Ala Gly 385 390 395 400 Vai Tyr Cys Leu Ala Ile Ser Leu Ala Leu Ala Ala Leu Met Ala Leu 405 410 415 Leu Leu Pro Ala Lys Cys Asp Ala Gly Ala Ala Pro Vai Lys Thr Ile 420 425 430 Asn Pro His Lys Arg Thr Ala 435 <210> 8 <211> 427 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Permease ambiental PE1 <400> 8 Met Asn Ser Ser Thr Asn Ala Thr Lys Arg Trp Trp Tyr Ile Met Pro 15 10 15 Ile Vai Phe Ile Thr Tyr Ser Leu Ala Tyr Leu Asp Arg Ala Asn Phe 20 25 30 Ser Phe Ala Ser Ala Ala Gly Ile Thr Glu Asp Leu Gly Ile Thr Lys 35 40 45 Gly Ile Ser Ser Leu Leu Gly Ala Leu Phe Phe Leu Gly Tyr Phe Phe 50 55 60 Phe Gin Ile Pro Gly Ala Ile Tyr Ala Glu Arg Arg Ser Vai Arg Lys 65 70 75 80 Leu Ile Phe Ile Cys Leu Ile Leu Trp Gly Ala Cys Ala Ser Leu Asp 85 90 95 Arg Asp Gly Ala Gin Tyr Ser Ser Ala Gly Trp Arg Ser Vai Leu Phe 100 105 110 Ser Ala Vai Vai Glu Ala Ala Vai Met Pro Ala Met Leu Ile Tyr Ile 115 120 125 Ser Asn Trp Phe Thr Lys Ser Glu Arg Ser Arg Ala Asn Thr Phe Leu 130 135 140 Ile Leu Gly Asn Pro Vai Thr Vai Leu Trp Met Ser Vai Vai Ser Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Gin Ser Phe Gly Trp Arg Glu Met Phe Ile Ile Glu Gly 165 170 175 Vai Pro Ala Vai Leu Trp Ala Phe Cys Trp Trp Vai Leu Vai Lys Vai 180 185 190 Lys Pro Ser Gin Vai Asn Trp Leu Ser Glu Asn Glu Lys Ala Ala Leu 195 200 205 Gin Ala Gin Leu Glu Ser Glu Gin Gin Gly Ile Lys Ala Vai Arg Asn 210 215 220 Tyr Gly Glu Ala Phe Arg Ser Arg Asn Vai Ile Leu Leu Cys Met Gin 225 230 235 240 Tyr Phe Ala Trp Ser Ile Gly Vai Tyr Gly Phe Vai Leu Trp Leu Pro 245 250 255 Ser Ile Ile Arg Ser Gly Gly Vai Asn Met Gly Met Vai Glu Vai Gly 260 265 270 Trp Leu Ser Ser Vai Pro Tyr Leu Ala Ala Thr Ile Ala Met Ile Vai 275 280 285 Vai Ser Trp Ala Ser Asp Lys Met Gin Asn Arg Lys Leu Phe Vai Trp 290 295 300 Pro Leu Leu Leu Ile Gly Gly Leu Ala Phe Ile Gly Ser Trp Ala Vai 305 310 315 320 Gly Ala Asn His Phe Trp Ala Ser Tyr Thr Leu Leu Vai Ile Ala Asn 325 330 335 Ala Ala Met Tyr Ala Pro Tyr Gly Pro Phe Phe Ala Ile Ile Pro Glu 340 345 350 Met Leu Pro Arg Asn Vai Ala Gly Gly Ala Met Ala Leu Ile Asn Ser 355 360 365 Met Gly Ala Leu Gly Ser Phe Phe Gly Ser Trp Phe Vai Gly Tyr Leu 370 375 380 Asn Gly Thr Thr Gly Ser Pro Ser Ala Ser Tyr Ile Phe Met Gly Vai 385 390 395 400 Ala Leu Phe Ala Ser Vai Trp Leu Thr Leu Ile Vai Lys Pro Ala Asn 405 410 415 Asn Gin Lys Leu Pro Ile Gly Ala Arg His Ala 420 425 <210> 9 <211> 426 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Permease ambiental ΡΕ6 <400> 9 Met Asn Thr Ala Ser Vai Ser Vai Thr Gin Ser Gin Ala Ile Pro Lys 15 10 15 Leu Arg Trp Leu Arg Ile Vai Pro Pro Ile Leu Ile Thr Cys Ile Ile 20 25 30 Ser Tyr Met Asp Arg Vai Asn Ile Ala Phe Ala Met Pro Gly Gly Met 35 40 45 Asp Asp Glu Leu Gly Ile Thr Ala Ser Met Ala Gly Leu Ala Gly Gly 50 55 60 Ile Phe Phe Ile Gly Tyr Leu Phe Leu Gin Vai Pro Gly Gly Lys Leu 65 70 75 80 Ala Vai Tyr Gly Asn Gly Lys Lys Phe Ile Gly Trp Ser Leu Leu Ala 85 90 95 Trp Ala Vai Ile Ser Vai Leu Thr Gly Leu Vai Thr Asn Gin Tyr Gin 100 105 110 Leu Leu Phe Leu Arg Phe Ala Leu Gly Arg Phe Arg Ser Gly Met Leu 115 120 125 Arg Trp Vai Leu Thr Met Ile Ser Asn Trp Phe Pro Asp Lys Glu Arg 130 135 140 Gly Arg Ala Asn Ala Ile Vai Ile Met Phe Vai Pro Ile Ala Gly Ile 145 150 155 160 Leu Thr Ala Pro Leu Ser Gly Trp Ile Ile Thr Ala Trp Asp Trp Arg 165 170 175 Met Leu Phe Leu Vai Glu Gly Ala Leu Ser Leu Vai Vai Met Vai Leu 180 185 190 Trp Tyr Phe Thr Ile Ser Asn Arg Pro Gin Glu Ala Lys Arg Ile Ser 195 200 205 Gin Ala Glu Lys Asp Tyr Leu Ile Lys Thr Leu His Asp Glu Gin Leu 210 215 220 Leu Ile Lys Gly Lys Thr Vai Arg Asn Ala Ser Leu Arg Arg Vai Leu 225 230 235 240 Gly Asp Lys Ile Met Trp Lys Phe Phe Tyr Gin Thr Gly Ile Tyr Gly 245 250 255 Tyr Thr Leu Trp Leu Pro Thr Ile Leu Lys Gly Leu Thr Asn Gly Asn 260 265 270 Met Glu Gin Vai Gly Met Leu Ala Ile Leu Pro Tyr Ile Gly Ala Ile 275 280 285 Phe Gly Met Leu Ile Ile Ser Thr Leu Ser Asp Arg Thr Gly Lys Arg 290 295 300 Lys Vai Phe Vai Ala Leu Pro Leu Ala Cys Phe Ala Ile Cys Met Ala 305 310 315 320 Leu Ser Vai Leu Leu Lys Asp His Ile Trp Trp Ser Tyr Ala Ala Leu 325 330 335 Vai Gly Cys Gly Vai Phe Thr Gin Ala Ala Ala Gly Vai Phe Trp Thr 340 345 350 Ile Pro Pro Lys Leu Phe Asn Ala Glu Met Ala Gly Gly Ala Arg Gly 355 360 365 Vai Ile Asn Ala Leu Gly Asn Leu Gly Gly Phe Cys Gly Pro Tyr Met 370 375 380 Vai Gly Vai Leu Ile Thr Leu Phe Ser Lys Asp Vai Gly Vai Tyr Ser 385 390 395 400 Leu Ala Vai Ser Leu Ala Ser Ala Ser Vai Leu Ala Leu Met Leu Pro 405 410 415 Asn Arg Cys Asp Gin Lys Ala Gly Ala Glu 420 425 <210> 10 <211> 436 <212> PRT <213> Pantoea citrea <400> 10 Met Gin Lys Ser Gin Pro Gly Thr Arg Trp Phe Arg Ile Ile Vai Pro 15 10 15 Ile Leu Ile Ala Cys Ile Met Ser Phe Met Asp Arg Vai Asn Ile Ser 20 25 30 Phe Ala Leu Pro Gly Gly Met Glu Gin Asp Leu Leu Met Ser Ser Gin 35 40 45 Met Ala Gly Vai Vai Ser Gly Ile Phe Phe Ile Gly Tyr Leu Phe Leu 50 55 60 Gin Vai Pro Gly Gly His Ile Ala Vai Arg Gly Ser Gly Lys Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ala Trp Ser Leu Vai Ala Trp Ala Vai Vai Ser Vai Ala Thr Gly 85 90 95 Phe Vai Thr His Gin Tyr Gin Leu Leu Ile Leu Arg Phe Ala Leu Gly 100 105 110 Vai Ser Glu Gly Gly Met Leu Pro Vai Vai Leu Thr Met Vai Ser Asn 115 120 125 Trp Phe Pro Glu Lys Glu Leu Gly Arg Ala Asn Ala Phe Vai Met Met 130 135 140 Phe Ala Pro Leu Gly Gly Met Ile Thr Ala Pro Vai Ser Gly Trp Ile 145 150 155 160 Ile Ala Leu Leu Asp Trp Arg Trp Leu Phe Ile Ile Glu Gly Leu Leu 165 170 175 Ser Vai Vai Vai Leu Ala Vai Trp Trp Leu Met Vai Ser Asp Arg Pro 180 185 190 Glu Asp Ala Arg Trp Leu Pro Ala Ala Glu Arg Glu Tyr Leu Leu Arg 195 200 205 Glu Met Ala Arg Asp Lys Ala Glu Arg Ser Lys Leu Pro Pro Ile Ser 210 215 220 His Ala Pro Leu Gin Glu Vai Phe His Asn Pro Gly Leu Met Lys Leu 225 230 235 240 Vai Ile Leu Asn Phe Phe Tyr Gin Thr Gly Asp Tyr Gly Tyr Thr Leu 245 250 255 Trp Leu Pro Thr Ile Ile Lys Asn Leu Thr Gly Ala Ser Ile Gly Asn 260 265 270 Vai Gly Leu Leu Thr Vai Leu Pro Phe Ile Ala Thr Leu Ser Gly Ile 275 280 285 Tyr Vai Vai Ser Tyr Leu Ser Asp Lys Thr Gly Lys Arg Arg Gin Trp 290 295 300 Vai Met Ile Ser Leu Phe Cys Phe Ala Ala Cys Leu Leu Ala Ser Vai 305 310 315 320 Leu Leu Arg Glu Phe Vai Leu Ala Ala Tyr Leu Ala Leu Vai Ala Cys 325 330 335 Gly Phe Phe Leu Lys Ala Ala Thr Ser Pro Phe Trp Ser Ile Pro Gly 340 345 350 Arg Ile Ala Pro Pro Glu Ala Ala Gly Ser Ala Arg Gly Vai Ile Asn 355 360 365 Gly Leu Gly Asn Leu Gly Gly Phe Cys Gly Pro Trp Leu Vai Gly Leu 370 375 380 Met Ile Tyr Leu Tyr Gly Gin Asn Ala Ala Vai Vai Thr Leu Ala Gly 385 390 395 400 Ser Leu Ile Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Leu Leu Pro Thr Gin Cys 405 410 415 Asp Leu Arg Pro Ala Glu Ala Arg Gin Gin Asn Phe Thr Pro Arg Ile 420 425 430 His Asp Ala Lys 435 <210> 11 <211> 414 <212> PRT <213> Pantoea citrea <400> 11 Met Pro Vai Ile Phe Ile Thr Tyr Ser Leu Ala Tyr Leu Asp Arg Ala 15 10 15 Asn Tyr Gly Phe Ala Ala Ala Ser Gly Ile Glu Ala Asp Leu Gly Ile 20 25 30 Ser Arg Gly Thr Ser Ser Leu Ile Gly Ala Leu Phe Phe Leu Gly Tyr 35 40 45 Phe Ile Phe Gin Vai Pro Gly Ala Ile Tyr Ala Vai Lys Arg Ser Vai 50 55 60 Arg Lys Leu Vai Phe Thr Ser Leu Leu Leu Trp Gly Phe Cys Ala Ala 65 70 75 80 Ala Thr Gly Leu Ile Ser Asn Ile Pro Ala Leu Met Vai Ile Arg Phe 85 90 95 Vai Leu Gly Vai Vai Glu Ala Ala Vai Met Pro Ala Met Leu Ile Tyr 100 105 110 Ile Ser Asn Trp Phe Thr Arg Gin Glu Arg Ser Arg Ala Asn Thr Phe 115 120 125 Leu Vai Leu Gly Asn Pro Vai Thr Vai Leu Trp Met Ser Ile Vai Ser 130 135 140 Gly Tyr Leu Ile Asn Ala Phe Gly Trp Arg Glu Met Phe Ile Phe Glu 145 150 155 160 Gly Vai Pro Ala Leu Ile Trp Ala Ile Phe Trp Trp Phe Ile Vai Arg 165 170 175 Asp Lys Pro Glu Gin Vai Ser Trp Leu Thr Glu Thr Glu Lys Gin Gin 180 185 190 Leu Ala Ser Ala Met Ala Glu Glu Gin Gin Ala Ile Pro Pro Met Arg 195 200 205 Asn Vai Pro Gin Ala Leu Arg Ser Arg Asn Vai Vai Vai Leu Cys Leu 210 215 220 Leu His Ala Leu Trp Ser Ile Gly Vai Tyr Gly Phe Met Met Trp Met 225 230 235 240 Pro Ser Ile Leu Arg Ser Ala Ala Ser Met Asp Ile Vai Arg Vai Gly 245 250 255 Trp Leu Ala Ala Vai Pro Tyr Leu Ala Ala Ile Ile Thr Met Leu Vai 260 265 270 Ile Ser Trp Leu Ser Asp Lys Thr Gly Leu Arg Arg Leu Phe Ile Trp 275 280 285 Pro Leu Leu Leu Ile Ala Ser Vai Thr Phe Phe Gly Ser Trp Leu Leu 290 295 300 Gly Ser Tyr Ser Phe Trp Phe Ser Tyr Gly Leu Leu Vai Leu Ala Ala 305 310 315 320 Ala Cys Met Tyr Ala Pro Tyr Gly Pro Phe Phe Ala Leu Ile Pro Glu 325 330 335 Leu Leu Pro Lys Asn Vai Ala Gly Ile Ser Ile Gly Leu Ile Asn Cys 340 345 350 Cys Gly Ala Leu Gly Ala Phe Ala Gly Ala Trp Leu Vai Gly Tyr Leu 355 360 365 Asn Gly Leu Thr Gly Gly Pro Gly Ala Ser Tyr Thr Phe Met Ala Ile 370 375 380 Ala Leu Leu Vai Ser Vai Gly Leu Vai Phe Phe Leu Lys Vai Pro Ser 385 390 395 400 Gly Asn Leu Vai Thr Arg Arg Leu Leu Lys Gly Asp Ala Lys 405 410 <210> 12 <211> 446 <212> PRT <213> Pantoea citrea <400> 12 Met Asn Thr His Gin Ala Ala Lys Gly Ile Ala Ile Pro Lys Gin Arg 15 10 15 Trp Leu Arg Ile Ile Ser Pro Ile Ile Ile Thr Cys Ile Ile Ser Tyr 20 25 30 Met Asp Arg Vai Asn Ile Ala Phe Ala Met Pro Gly Gly Met Asp Lys 35 40 45 Asp Leu Ser Vai Ser Ala Ser Met Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ile Phe 50 55 60 Phe Ile Gly Tyr Leu Phe Leu Gin Vai Pro Gly Gly Lys Ile Ala Vai 65 70 75 80 His Gly Ser Gly Lys Lys Phe Ile Gly Trp Ser Leu Vai Ala Trp Ala 85 90 95 Vai Ile Ser Vai Leu Thr Gly Met Vai Thr Asn Gin Tyr Gin Leu Leu 100 105 110 Phe Leu Arg Phe Leu Leu Gly Vai Ser Glu Gly Gly Met Leu Pro Vai 115 120 125 Vai Leu Thr Ile Ile Ser Asn Trp Phe Pro Asp Arg Glu Arg Gly Arg 130 135 140 Ala Asn Ser Ile Vai Ile Met Phe Vai Pro Ile Ala Gly Ile Ile Ser 145 150 155 160 Ala Pro Leu Ala Gly Trp Leu Ile Ser Ser Leu Asp Trp Arg Trp Leu 165 170 175 Phe Tyr Ile Glu Gly Leu Leu Ser Leu Ala Vai Leu Leu Leu Trp Ala 180 185 190 Leu Thr Ile Ser Asp Arg Pro Ala Glu Ala Arg Trp Ile Ser Arg Ala 195 200 205 Glu Lys Asp Tyr Leu Leu Lys Thr Leu Arg Glu Glu Gin Ile Ala His 210 215 220 Gin Pro Pro Leu Arg Lys Vai Thr Leu Ser Ser Vai Leu Glu Asn Arg 225 230 235 240 Thr Leu Trp Leu Leu Ile Ala Leu Asn Phe Phe Tyr Gin Ala Gly Ile 245 250 255 Tyr Gly Tyr Thr Leu Trp Leu Pro Thr Ile Leu Lys Asp Met Ala His 260 265 270 Ser Ser Met Ser Leu Vai Gly Leu Leu Ala Ile Leu Pro Tyr Vai Ala 275 280 285 Ala Met Ala Gly Met Phe Leu Phe Ser Arg Leu Ser Asp Lys Ser Gly 290 295 300 Lys Arg Arg Arg Tyr Vai Ile Leu Pro Leu Phe Gly Phe Ala Leu Cys 305 310 315 320 Met Ala Leu Ser Vai Ile Ser Gin Gly His Leu Trp Ile Ser Tyr Ser 325 330 335 Ala Leu Ile Gly Cys Gly Phe Phe Leu Gin Ser Ala Ala Gly Vai Phe 340 345 350 Trp Ala Ile Pro Ala Arg Leu Phe Ser Ala Glu Vai Ala Gly Ser Ala 355 360 365 Arg Gly Vai Ile Asn Ala Leu Gly Asn Leu Gly Gly Phe Cys Gly Pro 370 375 380 Tyr Leu Vai Gly Ile Phe Ile Thr Phe Tyr Ser Gin Ala Ala Gly Vai 385 390 395 400 Tyr Phe Leu Ala Ile Ser Leu Ala Ile Ala Gly Ala Leu Ala Phe Cys 405 410 415 Leu Pro Arg Arg Cys Asp Met Ser Ala Ser Glu Ile Ala Ala Glu Asp 420 425 430 Ala Lys Ile Glu Pro Leu Pro Gly His Ala Gly Arg Vai Leu 435 440 445 Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas de que trata a Resolução INPI 228 de 11/11/2009: Código de Controle Campo 1 Campo 2 Outras Informações: - Nome do Arquivo: LISTAGEM DE SEQUÊNCIA P120093.txt - Data de Geração do Código: 27-01-2014 - Hora de Geração do Código: 13:02:17 - Código de Controle: - Campo 1: B0B615871034CB4F

- Campo 2: 5D64A55262B833ED

Claims (7)

1. Método para aumento da produção biossintética de ácido 2- ceto-L-gulônico (2-KLG) de uma célula hospedeira, o método sendo caracte- rizado pelo fato de que compreende: a) selecionar uma célula hospedeira que converta cistolicamente ácido 2,5-diceto-D-glucônico (2,5-DKG) em ácido 2-ceto-L-gulônico ; b) aumentar o transporte do dito ácido 2,5-diceto-D-glucônico na dita célula hospedeira através da introdução na referida célula de DNA com- preendendo a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:4 enquanto a integridade da célula hospedeira é mantida; e c) cultivar a célula hospedeira sob condições de cultura apropri- adas para produzir o dito ácido 2-ceto-L-gulônico em que a produção de áci- do 2-ceto-L-gulônico é aumentada em comparação com uma célula hospe- deira que não compreende o DNA introduzido codificando a proteína trans- portadora.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula bacteriana ou de levedura.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é obtida de um microorganismo selecionado do grupo consistindo em uma Escherichia, uma Pantoea e uma Klesiella.

4. Método de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma Pantoea citrea.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira de Escherichia é uma Escherichia coli.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira de Klebsiella é uma Klebsiella oxytoca.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de DNA codifica uma proteína de SEQ ID NO:10.