JP2004519214A - 促進された２−ケト−ｌ−グロン酸産生 - Google Patents
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Abstract
宿主細胞の２−ＫＬＧ生合成的産生を促進する方法が記述されている。そのような方法は、２−ＫＬＧを産生するために２，５−ＤＫＧを利用する細胞内合成経路を少なくとも部分的には持っている宿主細胞を選択し；宿主細胞の完全性を維持すると同時に該宿主細胞内への該２，５−ＤＫＧの輸送を増加させ；該２，５−ＤＫＧを産生するために宿主細胞を培養し；および２−ＫＬＧを産生することを含んでいる。２，５−ＤＫＧの輸送は、宿主細胞内へ２，５−ＤＫＧを輸送する、一つまたはそれ以上の酵素をコードしているＤＮＡで宿主細胞を形質転換することにより増加する。
Description
【０００１】
技術分野
本発明は一般的に２−ＫＬＧの工業的生産を促進すること、特に、ペリプラスムから細胞の細胞質ゾル領域へ２，５−ジケトグルタル酸を輸送する蛋白質をコードしているゲノムを過剰発現することに関している。本発明は微生物中での、２−ＫＬＧの促進された産生のための発現ベクター、方法およびシステムを提供する。
背景技術
２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＬＧ）は、Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ法（Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，１９３４，１７ ３１１−３２８；Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ，１９３３，Ｈｅｌｖ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，１６，５６１，１０１９）における一工程の化学的手順によりＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）へ容易に変換されることが、一般的によく知られている。出発基質を２−ＫＬＧへ変換するための異種酵素を発現する組換え微生物が存在する。単一発酵工程により、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ中でＤ−グルコースを２−ＫＬＧへ生物変換するために、組換えＤＮＡ技術が使用されてきた（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１４４−１４９（１９８５））。しかしながら、この研究は最終生成物の工業的生産における基質輸送の重要性を認識することなく、２，５−ＤＫＧレダクターゼの発現を増加させること、または他の合成的生産に向けられている。実際に、発明者の研究は、レダクターゼの過剰発現の結果として、２−ＫＬＧ生産における極微の増加を明らかにした。それ故、細胞内で蛋白質を変換する発現レベルを増加させる以外の手段により、組換え微生物を利用する生合成経路を経る、２−ＫＬＧの工業的生産を増加させるための手段が必要とされている。
【０００２】
生体膜の脂質二重層は一般的にイオンおよび極性分子に対して不透過性である。これらの生体膜は細胞を区画化し、細胞の異なった部分をお互いに分離している。それ故、種々の生成物を合成するために細胞により利用される基質、ならびにエネルギー発生または増殖のために細胞により利用される代謝物は、それらを利用する合成および／または分解反応から分離されているであろう。生成物合成に関しては、異なった合成経路またはその一部を、細胞の異なった部分に見ることができる。いくつかの酸化的反応は細胞質ゾルの外側で起こることができる。例えば、炭素源を別の中間体に酸化するため、膜結合蛋白質を利用できる。細胞質ゾル反応または経路（例えば、いくつかの還元または脱水素反応）はまた、基質または中間体を別の生成物へ変換するために利用できる。基質および合成装置が膜の反対側にある場合、所望の最終生成物の産生には、所望の最終生成物への変換を可能にするため、合成反応の原位置への基質移動を必要とする。もしくは、細胞膜の内側で発生した最終生成物は、細胞内からの移動を必要とする。細胞の区画化部分は異なった環境パラメーター（例えば、溶質、イオン、最終生成物、濃度その他）を持っている、または正常では不透過性の障壁を横切った移動を必要とするので、何らかの形の能動輸送が必要とされるであろう。
【０００３】
これらの問題に答えて、膜を横切った物質の輸送を増加させることに関する研究が現れた。溶媒または溶解剤が、膜を破断するために使用され、膜を横切った物質の横断を可能にしてきた。しかしながら、そのような方法は宿主細胞の生存力に有害な効果を示す。もし、合成または代謝経路が、宿主細胞自身の代謝または分解経路によりエネルギーを与えられているまたは依存するとしたら（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのような補因子を必要とするような）、細胞の生存力を破壊することは、宿主細胞によるさらなるまたは連続した合成的産生を停止させる。加えて、細胞増殖を増加させることによるグルコースまたは他のサッカリド輸送の増加が探求されているが（Ｐａｒｋｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５（５）：７９５−８０２（１９９５））、組換え微生物を利用する生合成経路による化学最終生成物または中間体の工業的生産を増加させるために細胞輸送システムを改変することは認識されていない。
【０００４】
Ｃｏｒｎｉｓｈ（Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３４：３１１１−３１２２（１９８８））はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｙｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒによるグルコース輸送とスクシノグルカン エキソポリサッカリド産生の関係を議論している。Ｃｏｒｎｉｓｈは、グルコース取込がスクシノグルカン産生の主たる反応速度制御点であったこと、およびもっと速い速度のスクシノグルカン産生を得るために組換えＤＮＡ法を使用することにより、もっと速い速度でスクシノグルカン産生が得られるはずであることを提案している。しかしながら、Ｃｏｒｎｉｓｈの産生速度は工業的に要求される規模ではなかった。さらに、高いレベルのエネルギーが消費され、およびグルコースの輸送に複雑な調節機構が含まれており、その使用を助長するというよりもむしろ思いとどまらせるものであったであろう。
【０００５】
Ｖｏｌｓｃｈｅｎｋ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１ ５：２５３（１９９７年３月）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内へのリンゴ酸分解経路の導入を記載しており、ワイン中に存在するリンゴ酸レベルを枯渇させる目的で、それをコードしている異種ＤＮＡのクローニングおよび発現を行っている。Ｖｏｌｓｃｈｅｎｋは主として、取り巻いている培地からのリンゴ酸の除去に関心を示し、工業的規模での所望の最終生成物生産には関心を持ってはいない。
【０００６】
さらに、輸送システムが関与するという単なる知見は、所望の最終生成物または中間体の促進された産生をほとんど保証しない。合成装置はすでに飽和されているであろうから、存在する基質が増加しても、所望の最終生成物の産生が必然的に増加するわけではないであろう。加えて、産生基質としてのその使用に加えて代謝産物として直接的にまたは間接的に利用される基質の輸送が増加しても、望まれた産生の増加は生じないであろう。
【０００７】
基質を望まれる最終生成物に変換する酵素の発現レベルを単に増加させても、組換え微生物を使用する化学的化合物の産生を増加させないであろう。細胞中の基質発現レベルを増加させる以外の手段により、組換え微生物を使用する化学的化合物の産生を増加させるための手段が必要とされている。
【０００８】
また、細胞中の細胞質ゾルレダクターゼの発現レベルを増加させる以外の手段により、組換え微生物を利用する、生合成経路を通した２−ＫＬＧの工業的生産を増加させるための手段も必要とされている。
発明の要約
微生物の２，５−ＤＫＧ輸送能力は所望の２−ＫＬＧ生成、特に、２−ＫＬＧ生成は細胞質ゾル内に区画化されており、および２，５−ＤＫＧのその生成原位置からの輸送を必要とするので、の制限因子または障害になるであろう。本発明はその障害を軽減する手段を提供する。
【０００９】
本発明はＰ．ｃｉｔｒｅａ ＰＥ１、ＰＥ６、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＡおよびＰｅｒｍＢの単離された核酸およびアミノ酸配列を提供する。Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ＰＥ１、ＰＥ６、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＡおよびＰｅｒｍＢのアミノ酸配列および核酸配列は図１Ａ−１Ｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１および２に示されている。
【００１０】
本発明はまた、宿主細胞の２，５−ＤＫＧからの２−ＫＬＧの生合成的産生を促進するための改良法も提供する。従って、宿主細胞の２−ＫＬＧ生合成的産生を促進するための方法が提供され、該方法は２，５−ＤＫＧを２−ＫＬＧに変換する合成経路を持っている宿主細胞を選択し；完全性を保持すると同時に該宿主細胞内への該２，５−ＤＫＧの輸送を増加させ；該２−ＫＬＧを産生するように宿主細胞を培養し；および２−ＫＬＧを産生することからなっている。別の態様において、該宿主細胞内への該２，５−ＤＫＧの輸送を増加させる工程は、該宿主細胞細胞質ゾル実質内へ該２，５−ＤＫＧを輸送する一つまたはそれ以上の蛋白質をコードしているＤＮＡでの宿主細胞の形質転換工程を含んでいる。該一つまたはそれ以上の蛋白質はＹｉａＸ２、ＰＥ１、ＰＥ６、ＰｅｒｍＡおよびＰｅｒｍＢから成る群より選択される。コードＤＮＡはまたｙｉａＸ２、ｐｅ１、ｐｅ６、ｐｅｒｍＡおよびｐｅｒｍＢから成る群より選択されるゲノムから発現されてもよい。一つまたはそれ以上の蛋白質はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．＿とハイブリダイズできる。蛋白質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯまたはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．＿と少なくとも５０％、または９０％の同一性を持っている。別の態様において、蛋白質は少なくとも３１残基を含んでいる配列から成り、該残基はＰｅｒｍＡのグリシン１１９に相当するグリシン残基、または任意にＰｅｒｍＡのＷ１３６に相当するトリプトファン残基、または任意に、ＰｅｒｍＡのＧ１３８に相当する位置のフェニルアラニン、ＰｅｒｍＡのＥ１４１に相当する位置のグルタミン酸（Ｅ）およびＰｅｒｍＡのＲ１４２に相当する位置のアルギニン（Ｒ）の群から選択される少なくとも一つの追加の残基を含んでいる。
【００１１】
本発明はまた、内部細胞膜を横切る細胞質ゾル内への２，５−ＤＫＧ輸送を促進する方法も提供し、該方法は宿主細胞を選択し；および該宿主細胞内へ２，５−ＤＫＧを輸送する一つまたはそれ以上の蛋白質をコードしているＤＮＡで該宿主細胞を形質転換することから成っている。一つの態様において、宿主細胞は細菌および酵母から成る群より選択される。好適には、宿主細胞は大腸菌、パントエアおよびクレブシエラから成る群より選択される。
【００１２】
本発明は、宿主細胞を選択しおよび該宿主細胞内へ２，５−ＤＫＧを輸送する一つまたはそれ以上の蛋白質コードＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程による、内部細胞膜を横切る細胞質ゾル内への２，５−ＤＫＧ輸送を促進する方法を提供する。
発明の詳細な説明
定義
輸送体の定義
細菌チャンネル輸送体とは、一般的にＴＣ分類の＃１．Ａにある輸送体を指している（Ｓａｉｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｐｏｏｌｅ，Ｒ．Ｋ．，ｅｄ．）ｐｐ．８１−１３６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）。（“ＴＣ”とは“輸送に関する会議”、輸送体の系統発生的様相を考慮に入れた分類システム、を表している。）これらは一般的に、膜貫通孔を用いるエネルギー非依存性促進拡散機構を経て、基質、イオンまたは他の物質を輸送する。
【００１３】
一次輸送体とは一般的にＴＣ分類の（ＴＣ＃３．Ａ）にある輸送体を指しており（Ｓａｉｅｒ Ｍ．，ｅｔ ａｌ，１９９８）、基質の能動取込および輸送押し出しのために、典型的にはエネルギーカップリングの様式としてＡＴＰ加水分解の形で、化学エネルギーを利用する輸送体である。
【００１４】
グループ輸送システムとはＴＣ分類のＴＣ＃４．Ａにある輸送体を指しており（Ｓａｉｅｒ Ｍ．，ｅｔ ａｌ，１９９８）、輸送の間に輸送およびそれらの基質のリン酸化を同時に行う輸送体である。この範疇のメンバーは細菌特異性ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）の一部であり、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）利用酸化へのカップリングにより特徴付けられる。
【００１５】
二次輸送体とはＴＣ分類のＴＣ＃２．Ａにある輸送体を指しており（Ｓａｉｅｒ Ｍ．，ｅｔ ａｌ，１９９８）、膜を横切って基質、イオンまたは最終生成物を輸送するためのエネルギーを提供するため、化学浸透圧エネルギー（例えば、プロトン勾配の形で）を一般的に使用する輸送体である。
【００１６】
主促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）とはＴＣ分類の＃２にある二次輸送体を指している（Ｓａｉｅｒ Ｍ．，ｅｔ ａｌ，１９９８）。
輸送体とは、細胞膜を横切りおよび細胞または細胞区画内へまたはそれらから、化学化合物を移動することを可能にする任意の巨大分子を指している。輸送体はまた、透過酵素としても知られ、および称されている。特定の理論に限定されているわけではないが、輸送体は膜、膜外表面および膜を通して膜内表面から伸びている蛋白質の一部分と相互作用する蛋白質である。
【００１７】
能動輸送とは、エネルギー消費、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の加水分解、とカップルしている輸送を指している。
【００１８】
アニオン／カチオン共輸送体とは膜を横切って基質を輸送するために化学浸透圧勾配を利用する輸送体である（ＴＣクラス１４）。それらはまた、基質／Ｈ＋共輸送体とも称されている。
【００１９】
ＴＭＳとは膜貫通ドメインを指している。
経路の定義
細胞質の、とは内部細胞膜内に存在することを指している。
【００２０】
外因性基質とは、合成反応を分離する膜の反対側に観察される物質を指している（例えば、基質が所望の最終生成物または中間体へ、細胞内合成経路または合成経路の細胞内部分により変換されるべき場合には内部細胞膜の外側）。
【００２１】
細胞外または内部細胞膜の外側とは、細胞質から膜の反対側の細胞位置を指しており、ペリプラスムが含まれるが、それに限定されるわけではない。
内部細胞膜とはペリプラスムから細胞質を分離している障壁を指している。
【００２２】
膜とは基質に対して本質的に不透過性である脂質二重層を指している。
細胞内とは細胞質ゾルに最も近い膜側または細胞質ゾル側の細胞部分を指している。
【００２３】
細胞内反応とは、細胞質ゾル細胞物質、即ち、内部細胞膜内部に封じ込められている物質内に位置している合成反応または生物変換を指している。
律速段階とは、２−ＫＬＧ生合成経路内の段階を指しており、ここでその段階を通る変換の増加は２−ＫＬＧ産生の増加を生じる。
【００２４】
産生の促進とは、所望の合成反応の中間体、最終生成物または前駆体の力価（全量）が増加したことを指しており、一般的にプロセスを通して得られたｇｍ／ｌ／時間での増加により測定される。それはまた、所望の生成物が作られる速度の増加も指しており、一般的に組換え体産生の単位時間当たりのｇ／ｌで測定され、ここで、産生された中間体、最終生成物または前駆体の量は、過剰発現された輸送体の存在下、膜を横切る基質の輸送を増加させる少なくとも一つの蛋白質をコードしているＤＮＡでの形質転換の結果として増加する。
【００２５】
基質とは合成反応により生物変換される２，５−ＤＫＧを指しており、細胞質ゾル反応原位置は膜により基質と分離されている。
合成反応とは、中間体または最終生成物への基質の組換え体生物変換を指している。
【００２６】
２，５−ＤＫＧレダクターゼとは、２，５−ＤＫＧの２−ＫＬＧへの立体選択的変換を触媒できる蛋白質を指している。
２，５−ＤＫＧ輸送体とは、２，５−ＤＫＧレダクターゼによる２−ＫＬＧへの変換のため、内部細胞膜を横切って２，５−ＤＫＧを輸送できる蛋白質を指している。
発現における定義
プロモーターとは、細胞の翻訳装置により一度翻訳されたら、ポリペプチドを形成できるメッセンジャーＲＮＡを発生するために適した部位で遺伝子の転写を開始するようにＲＮＡポリメラーゼを導くＤＮＡ要素を指している。
【００２７】
“上流活性化配列”は正に作用するＤＮＡ結合レギュレータのための結合位置である。その名前から示されるように、上流活性化配列は転写開始部位の上流であり、核酸である。
【００２８】
調節領域とは、遺伝子の発現を調節するＤＮＡ上の領域を指している。この変更のための一機構は、いくつかの調節領域が蛋白質のための結合部位として働くことである（リプレッサーとしても知られている）。一度結合したら、リプレッサーは遺伝子を転写するためのＲＮＡポリメラーゼの能力を妨害する。
【００２９】
発現系は一つまたはそれ以上の蛋白質および／または核酸を含んでおり、一緒になって作用する場合、宿主細胞中の蛋白質発現を増加できる。発現系は一つまたはそれ以上のプラスミド上にコードでき、問題とする蛋白質をコードしている遺伝子と同じプラスミドでも異なったプラスミドでもよい。
【００３０】
句“機能的に連結された”または“機能的にカップルされた”とは、調節要素（ＤＮＡまたは蛋白質）がそれらの機能を果たすために物理的に相互作用することを意味している。これは蛋白質／蛋白質、ＤＮＡ／蛋白質またはＤＮＡ／ＤＮＡ相互作用であり得る。例えば、ＤＮＡ結合レギュレータはプロモーターと相互作用するが、それらをコードしている遺伝子は染色体の異なった部位に存在してもよい。そのようであるので、要素をコードしている遺伝子はお互いにおよび問題とする蛋白質をコードしている遺伝子と異なったプラスミド上にあることができ、それでも蛋白質の発現を調節するために一緒に働くことができる。
【００３１】
通例、蛋白質およびそれらをコードする遺伝子を説明する場合、遺伝子のための用語は大文字化されず、およびイタリック体である、即ち、ｐｅｒｍＡ。蛋白質のための用語は一般に普通の文字であり、最初の文字は大文字である、即ち、ＰｅｒｍＡ。
生物の定義
“細菌”には分裂菌類の微生物が含まれる。細菌はグラム陰性でもグラム陽性でもよい。グラム陰性菌には、エシェリキア、ヘモフィラス、クレブシエラ、プロテウス、シュードモナス、サルモネラ、グルコノバクター、アセトバクター、エルセニア、シゲラ、ビブリオ、アシネトバクター、パントエアおよびセラチア属の細菌が含まれる。グラム陽性菌には、バチルス、クロストジウム、スタフィロコッカス、ストレプトミセス、ラクトバチルスおよびラクトコッカス属の細菌が含まれる。
【００３２】
グラム陰性菌は、パントエア属の構成細菌株であるパントエアンでありうる。好適な細菌はＰａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａである。Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａはまた、時にはＥｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａまたはＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｅｍｉｕｓとも呼ばれている。
【００３３】
ここで使用される場合、用語“単離された”または“精製された”とは、天然に付随している少なくとも一つの成分が除去された核酸またはアミノ酸を指している。
好適な態様の詳細な説明
本発明の一つの態様は発現系をコードしている核酸を含むプラスミドで宿主細胞を形質転換する方法に関している。本発明の別の態様は、膜を横切った基質の輸送を増加させる一つまたはそれ以上の蛋白質をコードしているＤＮＡを含むプラスミドで宿主細胞を形質転換する方法に関している。宿主細胞は本発明のプラスミドが、例えば、形質転換により挿入できる細胞である。好適には、宿主細胞は細菌であり、より好適にはパントエア、エシェリキア、クレブシエラまたはバチルスの群内のものである。
【００３４】
別の態様において、もし調節要素が取り込まれているとしたら、発現系のそのような要素は大腸菌および枯草菌からのものである。一つの態様において、宿主細胞は、好適には、グラム陰性菌である。別の好適な態様において、宿主細胞はパントエアである。同じ宿主細胞が、一つまたはそれ以上の輸送体をコードする核酸を誘導するさらなるプラスミドで形質転換できる。好適には、輸送体はＭＦＳ輸送体、さらに好適にはアニオン／カチオン共輸送体がコードされている。輸送体の例には、Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａまたはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａおよび異種源からのｙｉａＸ２、ｐｅｒｍＡ、ｐｅｒｍＢ、ｐｅ６、ｐｅ１がコードまたは発現されるものが含まれる。
【００３５】
本発明は、所望の最終生成物の合成および産生経路に対する障害を軽減するため、２，５−ＤＫＧの輸送を増加させることにより、特に輸送体が組換え的に宿主細胞に導入および宿主細胞から過剰発現される場合、宿主細胞の２−ＫＬＧの生合成的産生を促進するための新規方法を提供する。
【００３６】
本発明の一つの態様は、発現系をコードしている核酸を誘導するプラスミドで宿主細胞を形質転換する方法に関している。宿主細胞は本発明のプラスミドが、例えば、形質転換により挿入できる細胞である。好適には、宿主細胞は細菌である。一つの態様において、宿主細胞は、好適には、グラム陰性菌である。別の好適な態様において、宿主細胞はパントエアである。好適には、宿主細胞はＰａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａであり、もし調節要素が取り込まれているなら、そのような発現系の要素はパントエアからである。同じ宿主細胞が、一つまたはそれ以上の輸送体をコードする核酸を誘導するさらなるプラスミドで形質転換できる。好適には、輸送体は、Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａからのｙｉａＸ２、ｐｅｒｍＡ、ｐｅｒｍＢ、ｐｅ６、ｐｅ１でコードまたは発現される。
合成反応
本発明は２−ＫＬＧからの２，５−ＤＫＧの生成を促進するため、膜を横切る２，５−ＤＫＧの増加された輸送を提供する。増加された輸送は、還元反応の細胞位置から２，５−ＤＫＧを分離している膜を横切る２，５−ＤＫＧの転置を提供する（図２および３）。
【００３７】
本発明はアスコルビン酸中間体合成、例えば、２−ＫＬＧへの２，５−ＤＫＧの変換；ソルボソンを経る２−ＫＬＧへのソルボースまたはソルビトールの変換；Ｌ−イドン酸への５−ケト−Ｄ−グルコン酸（５−ＫＤＧ）の還元；およびＬ−グロン酸への５−ケト−Ｄ−グルコン酸の還元、に関連して特に有用である。これらの経路の各々は、細胞質内に存する合成経路、合成反応の部分により特徴付けられる、例えば、２，５−ＤＫＧレダクターゼによる２，５−ＤＫＧの還元；ソルボソン デヒドロゲナーゼによる２−ＫＬＧへのＬ−ソルボソンの還元；５−ＫＤＧデヒドロゲナーゼによるＬ−イドン酸への５−ケト−Ｄ−グルコン酸（５−ＫＤＧ）の還元；および５−ＫＤＧレダクターゼによるＬ−グロン酸への５−ケト−Ｄ−グルコン酸の還元。これらの経路はまた、細胞質中に存している合成反応による生物変換のため、膜を横切って基質（例えば、２，５−ＤＫＧ；Ｌ−ソルボソンなど）を輸送することの必要性によっても特徴付けられる。
【００３８】
基質は一般に、ある種の能動輸送機構なしでは効率よく膜を通って通過できないものである。好適には、これらはアスコルビン酸中間体（２，５−ＤＫＧ、ソルボソン）を含むことができるが、これらに限定されるわけではない。加えて、基質は工業的規模での合成的使用のために輸送される物質であり、一般的に宿主細胞による代謝的使用のためではない。工業的使用とは、好適には２ｇ／ｌ／ｈより多く、より好適には３ｇ／ｌ／ｈより多く、およびさらにより好適には５ｇ／ｌ／ｈより多い、力価および容量生産力を指している。別の態様において、生産力力価は、２から１４ｇｍ／ｌ／時間の間、好適には３から１２ｇｍ／ｌ／時間の間、およびさらにより好適には５から１０ｇｍ／ｌ／時間の間であり、経済的に存立できる工業的生産プロセスになる。特に好適な基質には２，５−ＤＫＧおよびソルボソンが含まれる。本発明の発明的様相はこれらの実施態様において特に有用である。
【００３９】
本発明の実施において特に有用な反応は、細胞質ゾル デヒドロゲナーゼ２，５−ＤＫＧレダクターゼによる、２−ＫＬＧへの２，５−ＤＫＧ細胞質ゾル還元のための、内部細胞膜を横切る２，５−ＤＫＧの輸送である（Ｂｏｕｄｒａｎｔ，Ｊ．（１９９０）Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ，Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９０：３２２−３２９）。２，５−ＤＫＧは膜結合２−ケトグルコナート デヒドロゲナーゼにより２−ケト−Ｄ−グルコナート（２−ＫＤＧ）から変換される。本発明は、内部細胞膜を横切る、２−ＫＬＧへの細胞質ゾル還元部位までの２，５−ＤＫＧの輸送が、２，５−ＤＫＧ輸送の増加をコードしているＤＮＡにより達成できることを認めた。
【００４０】
本発明の実施において別の特に有用な反応は、ソルボース、ソルビトールを経る２−ＫＬＧ生成の中間体、ソルボソンの輸送である（Ｓａｉｔｏ，Ｙ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５８（２／３）：３０９−３１５（１９９７）。ソルボソンへのソルビトールおよび／またはソルボースの変換は、ソルビトールまたはソルボースを２−ＫＬＧへ変換する経路の一工程である（Ｂｏｕｄｒａｎｔ Ｊ．，１９９０；Ｓａｉｔｏ（１９９７））。以下は本発明に従ったソルボソン輸送体の工学技術の議論である。
【００４１】
Ｓａｉｔｏが記述しているように、Ｄ−ソルボースから２−ＫＬＧへの経路は、Ｌ−ソルボース デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）によるＬ−ソルボソンへのＬ−ソルボースの酸化、続いてのＬ−ソルボソン デヒドロゲナーゼによる２−ＫＬＧへのＬ−ソルボソンの酸化を含んでいる。膜結合デヒドロゲナーゼによりＤ−ソルビトールをＬ−ソルボソンへ変換する一つの組換え宿主細胞が記述されている（Ｓａｉｔｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（１９９７））。Ｌ−ソルボソンは次に、細胞質中のＬ−ソルボソン−デヒドロゲナーゼによる還元のため、ペリプラスムから輸送される。２−ＫＬＧへの変換のため、経路へのソルボソン中間体の輸送を容易にするソルボソン輸送体の過剰発現は、有益な効果を持っていると理解されている。
【００４２】
Ｄ−グルコースから２−ＫＬＧへの別の経路は、５−ケト−Ｄ−グルコン酸（５−ＫＤＧ）へのＤ−グルコン酸の酸化を含んでおり、それは順に２−ＫＬＧへの酸化のために、Ｌ−イドン酸（ＩＡ）またはＬ−グロン酸へ還元される（Ｂｏｕｄｒａｎｔ，Ｊ．（１９９０））。ケト−レダクターゼによる還元のため、細胞質ゾル内への５−ケト−Ｄ−グルコン酸の輸送もまた５−ＫＤＧ輸送体の過剰発現により容易にすることができる。
【００４３】
別の態様において、合成反応は細胞質ゾル外または基質に関して膜の外側に位置していてもよい。第一の反応の最終生成物は、膜の反対側で行われる第二の反応の中間基質であろう。例えば、日本の柿からのＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ Ｔ−１００（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１８８）中の、Ｄ−ソルビトールからの２−ＫＬＧの合成において、細胞質ゾルＬ−ソルビトール デヒドロゲナーゼによるＬ−ソルボースへのＤ−ソルビトールの変換では、膜結合Ｌ−ソルボース デヒドロゲナーゼによるＬ−ソルボソンへの変換のために細胞膜を横切り、細胞質の外へ輸送される中間体を生じる。それ故、続いての変換のため、膜を横切った内部膜の細胞質ゾル側から膜の外側への細胞質ゾル性中間体（基質）の輸送を増加させることを本発明は企図している。Ｓａｉｔｏ，Ｙ．，（１９９７）。
【００４４】
好適な態様は合成反応またはそれを含んでいる経路が単一の生物体内に存在することを含んでいるが、別の生物体が別の反応を行うことも本発明者により企図されている。例えば、グルコースから２−ＫＬＧ生成のための混合培養系において、中間体２，５−ＤＫＧへのグルコースの変換は一つの生物体内（アセトモナス、アセトバクター、グルコノバクターまたはエルウィニア）で起こるが、一方、その中間体の所望のアスコルビン酸中間体２−ＫＬＧへの変換は第二の生物体内（ブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウム）で起こる、Ｓｏｎｏｙａｍａ（１９７６）による米国特許第３，９６３，５７４号を参照されたい。また、Ｈｏｓｈｉｎｏ、米国特許第５，３１２，７４１号も参照されたい。
【００４５】
従って、合成反応は中間体を発生させてもよく、それ自身は細胞膜により分離された別の細胞位置で変換されてもよい。この態様においての最終生成物は、続いての反応の中間体基質であることができる。
律速段階を決定するための方法
２−ＫＬＧの産生において、内部細胞膜を横切る細胞質ゾル細胞位置への２，５−ＤＫＧ輸送増加の影響をみた一つの理由は、それが２−ＫＬＧへの２，５−ＤＫＧ変換の律速段階であることを発明者が認めたためである。そのような段階が律速段階かどうかの決定は、経路を分析し、各々の段階の産生を評価し、および２，５−ＤＫＧ存在の増加が経路の全産生の増加を生じるかどうかを確かめるため、経路による変換に利用可能な２，５−ＤＫＧ量を変化させることにより行われた。２，５−ＤＫＧの存在を増加させることが２−ＫＬＧの産生を促進することが決定されると、基質の輸送を増加させると２−ＫＬＧの産生が促進されるであろう。
【００４６】
律速段階の決定は、微生物の生産性を比較することにより確かめることができる。経路部分の律速状態を決定するための一つの方法は、特定の化学化合物の存在を増加させる前後に、経路の色々な時点での中間体生産性を比較することである。２，５−ＤＫＧレダクターゼをコードしているＤＮＡの過剰発現によりレダクターゼの存在を増加させても、２−ＫＬＧ産生の増加は生じなかった。図＿。しかしながら、細胞質ゾル中に存在する２，５−ＤＫＧ量の増加は、２−ＫＬＧ産生の増加を生じた。それ故、２，５−ＤＫＧ量の増加が２−ＫＬＧ産生においての律速段階であったことを発明者は認識した。
【００４７】
経路部分の律速状態を決定するための一つの方法は、特定の生物変換器の存在を増加させる前後に、経路の色々な時点での中間体生産性を比較することである。もし、中間体存在の増加または変換経路の過剰発現にもかかわらず、最終生成物産生の増加がなかったら、その工程は律速ではないであろうし、およびそれ故、合成反応に影響する特定酵素の過剰発現は促進された産生を生じないであろう。個々の中間体の量は種々の間接または直接手段により決定できる。間接手段は、ガス分圧のようなインライン測定による呼吸パラメーターの消費または生成（例えば、二酸化炭素生成、酸素消費）を測定することを含んでいる。中間体の直接測定は、Ｌａｚａｒｕｓ，Ａｎａｌｙｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ １５７，３６０−３６６（１９８６）およびそれに引用されている文献（それらは参照文献として本明細書に組み入れられる）に記載されているような、本分野では既知の種々の分析技術により達成でき、ペーパー、ガス、液体および薄層クロマトグラフィーならびに化学的および酵素的アッセイが含まれるが、それらに限定されるわけではない。Ｌａｚａｒｕｓ，１９８６、に特に示されているような高速液体クロマトグラフィー方法論は特に役に立つ。発明者により使用された一つの方法は、存在する化学化合物の分離および定量のため、Ｗａｔｅｒｓ ２６９０ ＨＰＬＣおよびＷａｔｅｒｓ ４１０示差屈折計を使用している（設定、溶離媒質として５０ｍＭ酢酸緩衝液（１ｍｌ／分の流速で）、およびＤｙｏｎｅｘ Ｉｏｎｐａｃ ＡＳ−１０イオン交換カラム（４ｘ２５０ｍｍ）を使用）。
【００４８】
ブロス中に産生された２−ＫＬＧの純度を決定するために発明者により使用された別の方法は全炭素分析によるものである。
従って一つの態様において、細胞外基質存在下で生成物の産生を測定することにより、基質を生成物へ変換できる任意の細胞中で輸送活性が測定できる。例えば、２，５−ＤＫＧレダクターゼを天然に発現している、または組換え的に発現している細胞において、細胞内２，５−ＤＫＧは２−ＫＬＧへ変換される。細胞外２，５−ＤＫＧが提供された場合に２−ＫＬＧを産生する細菌細胞の能力は、２，５−ＤＫＧ透過酵素の発現により細胞内へ２，５−ＤＫＧを輸送する、発現された透過酵素能力の指標であり、および、それ故２，５−ＤＫＧ透過酵素活性の指標である。細胞内２，５−ＤＫＧは、例えば、ＨＰＬＣまたは本分野で既知の他の高感度検出法を使用して検出できる。２，５−ＤＫＧの他の代謝産物もまた同様の方法により検出できる。
２，５−ＤＫＧ輸送体
輸送様式およびエネルギーカップリング機構に基づいて、４つの別個の型の機能的に特徴付けられた輸送システムが存在する。第一は細菌チャンネル蛋白質（ＴＣ＃１．Ａ）であり、それは膜貫通孔を利用するエネルギー非依存性促進拡散機構を経て輸送する。第二の輸送システム、促進体および／または二次輸送体（第二のクラス、ＴＣ＃２．Ａ）は輸送体の最も大きな部門を表している。第三の群、ＡＴＰ駆動一次活性輸送体は、能動取込および／または溶質押し出しのために、エネルギーカップリングの様式としてＡＴＰ加水分解を使用する。最後の群は、輸送の間にそれらの基質をリン酸化する輸送体の群から成っている（ＴＣ＃４．Ａ）。
【００４９】
二次ファミリーの内、クラスＩＩファミリーの最も大きなものは主促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）およびアミノ酸ポリアミンコリン（ＡＰＣ）ファミリー（ｒｅｉｚｅｒ ｅｔ ａｌ．）である。これらの二次輸送体ファミリーは３つの群にさらに分割できる（１）起プロトン形（ｐｍｆ駆動）、（２）起ナトリウム力（ｓｍｆ）−駆動、および（３）他のイオンまたは溶質駆動交換器。これらの輸送システムは溶質の単一、抗および／または共輸送を触媒する。二次活性輸送体は大腸菌、インフルエンザ菌、ピロリ菌、枯草菌、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍ．Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉで同定されている（Ｐａｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ ｌ９９８ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７７：５７３−５９２）。この範疇のすべてのメンバーは細菌特異的ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）の一部である。二次輸送体は典型的には多所性膜蛋白質であり、しばしば、ほとんど一次担体を含む１２のＴＭＳを持ち、エネルギーの化学形が基転置を駆動し、ほとんどのＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）スーパーファミリーメンバーがそうであるようにＡＴＰ−依存性システムであるか、または、糖取り込みおよびリン酸化のためのホスホリル供与体としてＰＥＰを使用するＰＴＳである。一次輸送体がＡＴＰを使用する（細胞からエネルギーを得ている）点で、二次輸送体は一次輸送体（ＡＢＣ輸送体）とは異なっている。加えて、ＡＢＣ輸送体の使用はより複雑な輸送体システムを必要とし、その一つは二つの疎水性の膜内在性ドメイン、および二つのＡＴＰ−結合ドメインから成っている（Ｈｏｓｉｅ，ｅｔ ａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００１）４０（６），１４４９−１４５９）。溶質の取り込みに関連しているＡＢＣ輸送体もまた溶質−結合蛋白質（ＳＢＰ）の存在を必要とする。それ故、改良されたＡＢＣ輸送システムの遺伝子工学は、二次輸送体の一つよりも複雑な性質の発現および形質転換を必要とするであろう。
【００５０】
一つの態様において、内部細胞膜を横切った基質の輸送を増加させるための少なくとも一つの蛋白質をコードしているＤＮＡは、アセトバクター、シュードモナス、バクテリウム、シアノコッカス、ミクロコッカス、ブレビバクテリウム、アルスロバクター、スタフィロコッカス、バチルス、コリネバクテリウム、アセトモナス、グルコノバクターおよびエルウィニアから選択される。好適な生物体は大腸菌、パントエアおよびクレブシエラから成る群より選択される。パントエアが宿主細胞として使用するために最も好適な生物体である。
【００５１】
特に有用な輸送体は、ｙｉａＸ２（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａから）、ｐｅ１およびｐｅ６（環境源から）、およびＰａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａからのｙｉａＸ２、ｐｅｒｍＡおよびｐｅｒｍＢによりコードされているものである。ｙｉａＸ２、ｐｅｒｍＡおよびｐｅｒｍＢ遺伝子は、エルウィニア、アセトバクター、グルコノバクター、大腸菌、アグロバクター、エルセニア、サルモネラ、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、アルスロバクター、ミクロコッカス、スタフィロコッカス、シュードモナス、バチルス、シトロバクターのような種々の細菌に見ることができる。種としてはＹｅｒｓｅｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｙｅｒｓｅｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒが含まれる。
【００５２】
本発明はＹｉａＸ２ポリヌクレオチド、ＰｅｒｍＡポリヌクレオチド、ＰｅｒｍＢポリヌクレオチド、Ｐｅ１ポリヌクレオチドおよびＰｅ６ポリヌクレオチドを提供し、それらは宿主細胞中で膜を横切った基質の輸送を増加させる少なくとも一つの酵素をコードしているＤＮＡとして使用することができる。ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６のポリヌクレオチド配列は、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６とＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ＹｉａＸ２のアミノ酸アラインメントを示している図１３および１４から決定できる。
【００５３】
本発明は、同族体が輸送を調節する（好適には、微生物中の基質の輸送を増加させる）ように機能できる蛋白質をコードしている限り、各々、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６と少なくとも６５％、７０％、８０％または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を持つ一つまたは多ポリヌクレオチドによりコードされていてもいなくても、各々、輸送体ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６をコードしているＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド同族体を包含している。当業者には理解されるであろうが、遺伝子コードの縮重のため、種々のポリヌクレオチド（即ち、ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド変異体）が因子ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６上のＰａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ輸送体をコードできる。本発明はすべてのそのようなポリヌクレオチドを包含している。
【００５４】
Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａおよび環境単離物ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６輸送体の微生物ポリヌクレオチド同族体は、ゲノムかまたはｃＤＮＡ起源の微生物核酸の核酸ハイブリダイゼーションにより同定できる。ポリヌクレオチド同族体配列は、宿主細胞細胞質ゾル物質内へ２，５−ＤＫＧを輸送する少なくとも一つのポリヌクレオチドをコードしているＤＮＡのプローブ、一部または断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出できる。従って、本発明は、ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６からの核酸配列の一部または全部と核酸試料をハイブリダイズさせることから成る、ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド同族体の検出法を提供する。
【００５５】
中間から最大のストリンジェンシー条件下、図１のＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ヌクレオチド配列の一部または全部にハイブリダイズできるＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれている。ハイブリダイゼーション条件はＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １５２，Ａｅａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡＬＩＦ．）（本明細書において参照文献として組み入れられる）に教えられているように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、定義された“ストリンジェンシー”は以下に説明するように与えられる。
【００５６】
“最大ストリンジェンシー”は典型的には約Ｔｍ−５度Ｃ（プローブのＴｍの５度Ｃ下）；“高ストリンジェンシー”はＴｍの約５度Ｃから１０度Ｃ下；“中ストリンジェンシー”はＴｍの約１０度Ｃから２０度Ｃ下；および“低ストリンジェンシー”はＴｍの約２０度Ｃから２５度Ｃ下で生じる。当業者には理解されるであろうが、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用でき、一方、中または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列同族体を同定または検出するために使用できる。
【００５７】
ここで使用される場合、用語“ハイブリダイゼーション”は、“核酸鎖と相補的鎖が塩基対を通して連結される過程”を含んでいる（Ｃｏｏｍｂｓ Ｊ（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．）。
【００５８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実施されるような増幅過程は、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ Ｃ Ｗ ａｎｄ Ｇ Ｓ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ Ｎ．Ｙ．）により説明されている。図１Ａ−１ＥのＰｅｒｍＡヌクレオチド配列からの少なくとも約１０ヌクレオチドおよび多くとも約６０ヌクレオチド、好適には約１２から３０ヌクレオチド、およびより好適には約２０−２５ヌクレオチドの核酸配列がプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用できる。
アミノ酸配列
図１に示したようなＰ．ｃｉｔｒｅａ ＰｅｒｍＡポリヌクレオチドはＰ．ｃｉｔｒｅａ ＰｅｒｍＡをコードしている。Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ｐｅｒｍＡ遺伝子は、４７８０１．９４ダルトンの計算分子量を持つ、４３６残基の一つの蛋白質を特定している。平均疎水性は０．６２であり、等電点は９．２４であった。ｐｅｒｍＡ蛋白質は１１の推定膜貫通へリックスを持つ、膜内在蛋白質である。これらのドメインは他の生物体からの、他の知られている輸送体蛋白質と著しい配列同一性を示しており、最も高い同一性はシュードモナスからのＫＤＧ輸送体蛋白質で観察された。図８Ｂに示したような３１残基の伸長は、ＰｅｒｍＡの１１９のグリシン（Ｇ）、１２２のグルタミン酸（Ｅ）、１２７のフェニルアラニン（Ｐ）、１３６のトリプトファン（Ｗ）、１３８のフェニルアラニン、１４１のグルタミン酸（Ｅ）および１４２のアルギニン（Ｒ）について、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ｐｅｒｍＡ輸送体蛋白質の残基に対応している高度に保存されたセグメントを示している。この高度に保存されたセグメントはアニオン：カチオン共輸送体（ＡＣＳ）ファミリー（Ｐａｏ，Ｓ．Ｓ．，１９９８）の保存残基と一致している、前記表３および４。図８ＢはＰｅｒｍＡの残基１１９から１４１に対応する保存領域を示している。推定膜貫通ドメイン（Ｉ−ＸＩ）は灰色の陰を付けて示されている。図８Ｂの膜貫通ドメインはＳＯＵＣＩプログラムにより決定された。
【００５９】
本発明の範囲内の輸送体には、Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａおよび環境源からのｙｉａＸ２、ｐｅｒｍＡ、ｐｅ１、ｐｅ６およびｐｅｒｍＢによりコードされているものが含まれる。ｙｉａＸ２、ｐｅｒｍＡ、ｐｅ１、ｐｅ６およびｐｅｒｍＢ遺伝子は、エルウィニア、アセトバクター、グルコノバクター、大腸菌、アグロバクター、エルセニア、サルモネラ、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、アルスロバクター、ミクロコッカス、スタフィロコッカス、シュードモナスおよびバチルスのような細菌の種々の種に見ることができる。
【００６０】
本発明はＹｉａＸ２ポリヌクレオチド、ＰｅｒｍＡポリヌクレオチド、Ｐｅ１ポリヌクレオチド、Ｐｅ６ポリヌクレオチドおよびＰｅｒｍＢポリヌクレオチドを提供し、それらは宿主細胞中で膜を横切った２，５−ＤＫＧの輸送を増加させる少なくとも一つの酵素をコードしているＤＮＡとして使用することができる。ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６のポリヌクレオチド配列は、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６とＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ＹｉａＸ２のアミノ酸アラインメントを示している図から決定できる。
【００６１】
本発明は、同族体が輸送を調節するように機能できる蛋白質をコードしている限り、各々、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６と少なくとも６５％、７０％、８０％または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を持つ一つまたは多ポリヌクレオチドによりコードされていてもいなくても、各々、輸送体ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６をコードしているＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド同族体を包含している。当業者には理解されるであろうが、遺伝子コードの縮重のため、種々のポリヌクレオチド（即ち、ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド変異体）が因子ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６上のＰａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ輸送体をコードできる。本発明はすべてのそのようなポリヌクレオチドを包含している。
【００６２】
Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａおよび環境単離物ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６輸送体の微生物ポリヌクレオチド同族体は、ゲノムかまたはｃＤＮＡ起源の微生物核酸の核酸ハイブリダイゼーションにより同定できる。ポリヌクレオチド同族体配列は、図［番号は？］に開示されているプローブ、一部または断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出できる。従って、本発明は、ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６からの核酸配列の一部または全部と核酸試料をハイブリダイズさせることから成る、ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド同族体の検出法を提供する。
【００６３】
中間から最大のストリンジェンシー条件下、図１のＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ヌクレオチド配列の一部または全部にハイブリダイズできるＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれている。ハイブリダイゼーション条件はＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １５２，Ａｅａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡＬＩＦ．）（本明細書において参照文献として組み入れられる）に教えられているように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、定義された“ストリンジェンシー”は以下に説明するように与えられる。
【００６４】
“最大ストリンジェンシー”は典型的には約Ｔｍ−５度Ｃ（プローブのＴｍの５度Ｃ下）；“高ストリンジェンシー”はＴｍの約５度Ｃから１０度Ｃ下；“中ストリンジェンシー”はＴｍの約１０度Ｃから２０度Ｃ下；および“低ストリンジェンシー”はＴｍの約２０度Ｃから２５度Ｃ下で生じる。当業者には理解されるであろうが、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用でき、一方、中または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列同族体を同定または検出するために使用できる。
【００６５】
ここで使用される場合、用語“ハイブリダイゼーション”は、“核酸鎖と相補的鎖が塩基対を通して連結される過程”を含んでいる（Ｃｏｏｍｂｓ Ｊ（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．）。
【００６６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実施されるような増幅過程は、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ Ｃ Ｗ ａｎｄ Ｇ Ｓ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ Ｎ．Ｙ．）により説明されている。図１のＰｅｒｍＡヌクレオチド配列からの少なくとも約１０ヌクレオチドおよび多くとも約６０ヌクレオチド、好適には約１２から３０ヌクレオチド、およびより好適には約２０−２５ヌクレオチドの核酸配列がプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用できる。
ＩＩ発現系
本発明は、細菌および酵母を含む微生物中での所望の異種または同種蛋白質の促進された産生および輸送のための発現系を提供する。
ａ．コード配列
本発明において、ベクターは輸送体をコードしている少なくとも一つのコピーを含み、好適には多コピーを含んでいる。好適な態様において、微生物はパントエアである。別の好適な態様において、微生物はクレブシエラである。一つの態様において、ｐｅｒｍＡ遺伝子を含むポリヌクレオチドがベクターを構築するために利用される。これらのポリヌクレオチドセグメントはｐｅｒｍＡより多くの数の残基を含むことができる。例えば、ｐｃｐ１、ｐｃｐ１０およびｐｃｐ３２は、Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａゲノムのオペロンまたはドメインであるヌクレオチド断片である。これらのヌクレオチドセグメントは各々、約９キロ塩基（ｋｂ）、１３ｋｂおよび６７ｋｂである。好適な態様において、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６をコードするポリヌクレオチドまたはそれらの断片、または融合蛋白質またはＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６のアミノ酸変異体をコードするポリヌクレオチド同族体配列は、グラム陽性宿主細胞において、各々ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６、またはそれらのアミノ酸変異体の発現を指示する組換えＤＮＡ分子を発生させるために使用することができる。一つの態様において、宿主細胞はアセトバクター、シュードモナス、バクテリウム、シアノコッカス、ミクロコッカス、ブレビバクテリウム、アルスロバクター、スタフィロコッカス、バチルス、コリネバクテリウム、アセトモナスおよびグルコノバクターから成る群より選択される。好適な宿主細胞はエシェリキア、パントエアおよびクレブシエラから成る群より選択される。Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａおよびクレブシエラは、宿主細胞として使用するために最も好適な生物体である。パントエアはまたエルウィニアとしても知られている。
【００６７】
当業者には理解されるであろうように、天然には存在しないコドンを持っているポリヌクレオチド配列を生成させるのが好都合であろう。例えば、発現速度を増加させるため、または、天然に存在する配列から生成される転写体よりも望ましい特性（より長い半減期のような）を持っている組換えＲＮＡ転写体を生成させるため、特定の宿主細胞により好まれるコドン（Ｍｕｒｒａｙ Ｅ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：４７７−５０８）が選択できる。
【００６８】
本発明に従って使用することができる、改変されたＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６ポリヌクレオチド配列には、同一のまたは機能的に等価なＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６同族体をコードするポリヌクレオチドを生じる、欠失、挿入または異なったヌクレオチド残基による置換が含まれている。ここで使用される場合、“欠失”とは、一つまたはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在しない、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列への変化として定義される。
【００６９】
ここで使用される場合、“挿入”または“付加”とは、天然に存在するグラム陽性ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６と比較し、一つまたはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加により生じたヌクレオチドまたはアミノ酸配列への変化である。
【００７０】
コードされた蛋白質もまた、沈黙変化を生み出す、および機能的に等価なグラム陽性ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６変異体を生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を示してもよい。変異体が輸送を調節する（好適には輸送を増加させる）能力を保持している限り、残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質に基づいて、計画的アミノ酸置換を行ってもよい。例えば、陰性に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；陽性に荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ；および類似の親水性値を示す非荷電極性頭部基を持つアミノ酸にはロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。
【００７１】
本発明のＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６ポリヌクレオチドは、遺伝子産物のクローニング、プロセッシングおよび／または発現を改変するために工学的処理することができる。例えば、本分野では既知の技術を使用して突然変異を導入することができる、例えば、コドン嗜好性を変えるために新しい制限部位を挿入する部位特異的突然変異。
【００７２】
本発明の一つの態様において、ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６ポリヌクレオチドを、融合蛋白質をコードしている異種配列と連結することができる。融合蛋白質はまた、ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６蛋白質が異種部分から切断および精製できるように、ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６ヌクレオチド配列および異種蛋白質配列間に位置する切断部位を含むようにも工学的処理することができる。
ｂ．ベクター配列
微生物中で本発明の輸送体の発現に使用される発現ベクターは、ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６から成る群より選択される輸送体因子に関連する少なくとも一つのプロモーターを含んでおり、そのプロモーターは宿主細胞中で機能的である。本発明の一つの態様において、プロモーターは選択された輸送体の野生型プロモーターであり、本発明の別の態様において、プロモーターは輸送体に関しては異種であるが、宿主細胞中でなお機能的である。
【００７３】
所望の蛋白質またはポリペプチドをコードしている異種核酸に関係する追加のプロモーターは、組換えＤＮＡ技術により導入することができる。本発明の一つの態様において、宿主細胞は異種蛋白質またはポリペプチドを過剰発現でき、および、一つまたはそれ以上の輸送体をコードしている核酸は組換え的に導入される。本発明の一つの好適な態様において、基質の輸送を増加する少なくとも一つの蛋白質またはそれ以上の蛋白質をコードしている核酸は微生物ゲノム内へ安定に組み込まれるであろう。別の態様において、本発明の該宿主細胞内への該基質の輸送を増加させる一つまたはそれ以上の蛋白質をコードしているＤＮＡを過剰発現するように宿主細胞が工学処理され、異種蛋白質またはポリペプチドをコードしている核酸は組換えＤＮＡ技術により導入される。本発明は、当業者には既知である他の輸送体を過剰発現できる宿主細胞を包含しており、表１、２または３に同定されているもの、または当業者には既知の、または将来同定されるであろう他の輸送体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００７４】
好適な態様において、核酸操作を容易にするため、好適にはベクターに独特な少なくとも一つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含んだ多クローニング部位カセットを、発現ベクターは含んでいる。好適な態様において、ベクターはまた、一つまたはそれ以上の選択可能マーカーも含んでいる。ここで使用される場合、用語、選択可能マーカーとは、ベクターを含んでいる宿主の選択を容易にすることが可能で、グラム陽性宿主中で発現できる遺伝子を意味している。そのような選択可能マーカーには、エリスロマイシン、アスペクチノマイシン、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリンのような抗生物質が含まれるが、それらに限定されるわけではない。輸送体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：＿に示されたＤＮＡ配列と少なくとも９０％の相同性を持っている核酸によりコードされている態様もまた提供される。好適には、相同性は少なくとも９５％であり、より好適には少なくとも９８％である。相同性は、特許請求されたアミノ酸またはＤＮＡ配列と別の配列を並べ、全体のパーセンテージとしてどのくらい多くのアミノ酸または核酸が一致するかで決定される。相同性はまた、市販品として入手可能な配列分析ソフトウェアープログラムの一つ、例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）で利用可能なＴＦａｓｔＡ Ｄａｔａ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍを使用して決定できる。
【００７５】
ここに説明したようなハイブリダイゼーションを使用して、または縮重プライマーを用いるＰＣＲを使用して、相同性配列をスクリーニングできる。Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｓｕｔｔｌｅ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８（４）：６０９−６１０，６１２。
【００７６】
また、本発明のいくつかの態様において、ストリンジェント条件下、各々図およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：に示したＤＮＡまたはその断片とハイブリダイズできる核酸が提供される。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件には、当業者には知られているようなストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が含まれる。ハイブリダイゼーションおよび適切なストリンジェント条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、に記載されている。
輸送体蛋白質をコードしている形質転換ＤＮＡを持っている宿主細胞からの組換えペプチド産生を増加させる方法
一つの細胞位置から別の位置への基質輸送を増加させる特に強力な方法には、形質転換宿主細胞からの［代謝転換］ゲノムの欠失、および所望の基質の輸送を増加させるＤＮＡコード化の同時供給が含まれる。このことは、欠失される部分の代謝転換が最小化され、および輸送体能力部分が過剰発現される、欠失−輸送体キメラまたは融合蛋白質を細胞に提供することにより都合よく達成される。化学的−融合ポリペプチドまたはゲノムの組み替えた部位が一つの可能性であるが、組換え蛋白質がこの様式での使用に本来最も好適である。そのようなキメラで使用するための適切な透過酵素断片の同定は、上に説明されている。
【００７７】
これらの融合蛋白質の輸送部分に関しては、キメラに輸送能力を与える十分な一次配列情報を含む任意の透過酵素由来配列が、この状況で有用であろう。しかしながら、方法論に関してより直接的であるので、全輸送体酵素を使用するのがしばしば好適であろう。再び、適した輸送体またはその断片の同定を助けるため、種々の公表された文献中の利用可能な情報を広く探すことができる。
形質転換
本発明はまた、生物学的に活性なポリペプチドを産生する細胞の能力を増大または増加させることを企図しており、そのようなポリペプチドは基質を細胞の第一の位置から、膜を横切った細胞の第二の位置への輸送を増加させる。このことは、いくつかの例において、アニオン／カチオン共輸送体の二次輸送体（Ｓａｉｅｒ，１９８８）、一つの態様においてはアニオン／カチオンＨ＋共輸送体のような、追加の生物変換のため、別の細胞位置への基質輸送に関係する蛋白質を過剰発現することにより達成できる。本発明により企図された共輸送体の例には、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａおよびＰａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａからの透過酵素ＹｉａＸ２、ＰＥ１、ＰＥ６、ｐｅｒｍＡおよびｐｅｒｍＢが含まれる。
【００７８】
宿主細胞の生存性および生産の質、特にそれらの輸送能力の維持に関連する輸送体の発現は重要である。経路がＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ要求性反応である場合は、所望の経路による連続的生成を成功させるため、宿主細胞の連続した生存性が必要である。生物体の生存性を維持しながら過剰発現できる、多コピーまたはプロモーターの数を決定する時に、ある種の考慮および因子を心に留めるほうがよい。一般に、膜中に輸送体を取り込むために利用可能な空間が限られているので、輸送体の過大な発現は細胞には有害であろう。従って、一つの輸送体の非常に過大な発現は、培地からの他の栄養素の輸送に関係するであろう他の輸送体の膜中取込を減少させるであろう。細胞型特異的転写因子の過剰発現を工学処理することで、工学処理された宿主細胞の輸送体能力を増加または安定化できた。
【００７９】
細菌宿主細胞中でのＨ＋共輸送体の安定な過剰発現は、いくつかの目的の役に立つことになる。それは微生物の生存性を維持しながら、導入遺伝子発現を増加させる。共輸送体はＡＢＣ輸送体の多成分を大量にコード化する必要がないので、共輸送体の過剰発現はＡＢＣ輸送体の過剰発現よりも簡単である。第三に、ＡＴＰまたはＰＴＳカップル輸送の代わりに二次輸送体を過剰発現させることにより、宿主細胞からのエネルギー転換要求性が最小化される。
【００８０】
本発明の一つの態様において、本発明の一つまたはそれ以上の輸送体をコード化している核酸は、宿主細胞内で複製することができる発現ベクターを経て宿主細胞内へ導入される。パントエアのために適した複製プラスミドはＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（ここに参照文献として特別に組み入れられる）、に記載されており、パントエアが大腸菌と同じプラスミドの複製を維持しているという事実に基づいている。
【００８１】
別の態様において、一つまたはそれ以上の輸送体をコード化している核酸は微生物ゲノム内へ安定して組み入れられる。好適な宿主細胞はパントエア属からのものである。別の好適な宿主細胞はＫ．ｏｘｙｔｏｃａである。染色体内へのＤＮＡ組み込みのためのいくつかの戦略が文献に記載されている（例えば、Ｂａｌｂａｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ １７２：６５−６９；ＬｅＢｏｒｇｅ，ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｇｅｎｅ ２２３：２１３−２１９、を参照されたい）。
【００８２】
Ｐ．ｃｉｔｒｅａの形質転換は、大腸菌のために開発されたプロトコールを使用したエレクトロポレーション法により達成できる（Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．，１ ９８８，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：３６１−３７３）。
ＩＩＩ．形質転換体の同定
宿主内へＤＮＡを導入した後、形質転換体はベクター中にコード化された抗生物質耐性により、または、プラスミド内にコードされた機能で一般的に選択することにより選択される。形質転換体が非形質転換細胞から区別されたら、無傷の構造を持つプラスミドの存在が、標準プロトコールを使用して確認できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ，１９８９）。
【００８３】
ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰｅ６ポリヌクレオチド配列の存在は、図１に開示されたようなポリヌクレオチド配列のプローブ、一部または断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出できる。
ＩＶ．輸送アッセイ
ＨＰＬＣ方法論による、アスコルビン酸中間体レベルを決定するための好適な方法が以前に議論されている。
【００８４】
加えて、当業者には幅広い種類の標識および結合法が知られており、種々の核酸およびアミノ酸アッセイで使用できる。特異的ポリヌクレオチド配列を検出するための、標識ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブには、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識または標識ヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が含まれる。もしくは、ヌクレオチド配列またはその任意の一部は、ｍＲＮＡプローブ生成のためのベクター内へクローン化することができる。そのようなベクターは本分野では既知であり、市販品として利用可能であり、および、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドの添加により、インビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用することができる。
【００８５】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）およびＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｏｈｉｏ）のような多くの会社がこれらの方法のための市販キットおよびプロトコールを供給している。適したレポーター分子または標識には、放射性同位元素、酵素、蛍光、化学発光または色素産生剤、ならびに基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などが含まれる。そのような標識の使用を教えている特許には、米国特許第３，８１７，８３７；３，８５０，７５２；３，９３９，３５０；３，９９６，３４５：４，２７７，４３７；４，２７５，１４９および４，３６６，２４１号が含まれる。また、組換え免疫グロブリンは米国特許第４，８１６，５６７号（本明細書に参照文献として組み入れられる）に示されているように生成することができる。
実施例
実施例１
材料および方法
ａ．プラスミド、細菌株および培地：プラスミドｐＢＣＬ１９２０、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ １３９２Ａ。Ｐ．ｃｉｔｒｅａ １３９２Ａ株は３９１４０であるＰ．ｃｉｔｒｅａ変異体である。ｐＤ９２はＤＫＧレダクターゼ遺伝子を含むベクターの表示に記載されている。米国特許第５，３７６，５４４号。マーフィＩＩＩ培地は、フルクトース０．５％、リン酸１．６％、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ０．２％、Ｓｏｙｔｏｎｅ ０．２％、クエン酸０．０１％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １％、ｐｐｍ範囲のＦｅ、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｚｎのような微量金属塩、およびニコチン酸、葉酸およびＢ１２のようなビタミンを含んでいる；Ｍ９培地、０．９％リン酸、０．１％ＮａＣｌ、０．１％ ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＳＯ４ ０．０００５％、ＣａＣｌ２ ０．０２５％；発酵培地、リン酸カリウム１％、ＭｇＳＯ４ ０．１５％、グルタミン酸１．５％、フルクトース２．５％、硫酸アンモニウム０．１％、およびビオチン、チアミン、ピリドキシン、リボフラビン、ニコチン酸、葉酸およびＢ１２を含むビタミン混合物、鉄、ＺｎおよびＭｎイオンを１０−１００ｐｐｍの範囲で含んでいる微量金属カクテル；輸送アッセイ培地、１００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ６．９；抗生物質、スペクチオマイシン５０μｇ／ｍｌおよびテトラサイクリン２０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ １００μＭ。
ｂ．ＤＮＡ技術
ｃ．細胞の増殖：組換え法および野生型Ｐ．ｃｉｔｒｅａおよびＫ．ｏｘｙｔｏｃａを使用して構築された株は、単一の炭素源としてＤＫＧを含んでいるＭ９培地かまたは単一の炭素源としてフルクトースを含むＭ ＩＩＩ培地、または０．１％から１％の範囲のフルクトース、グルコナートおよびＤＫＧのような混合炭素源を含んでいるＭ ＩＩＩで増殖させた。細胞は２０−３７℃の間で、しかし好適には３０℃以下で増殖させた。細胞は好適には中性ｐＨで、しかしｐＨ５−８を含む範囲で増殖させた。種フラスコから発酵槽で増殖させたＰ．ｃｉｔｒｅａ細胞は、フルクトースかまたはグルコース給餌を使用する発酵培地を使用した。
ｄ．ＤＫＧ取込生化学アッセイ：細胞を含んでいる発酵ブロス試料はそれぞれの増殖装置から引き出し、氷−水浴上で反応停止させた。発酵ブロスを遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットは０．９％氷冷食塩水を使用して洗浄し、続いてＤＫＧ取込アッセイ緩衝液、１００ｍＭ氷冷リン酸カリウム ｐＨ６．９、により２回洗浄した。細胞を同じアッセイ緩衝液に、５５０ｎｍでＯＤが１２になるように再懸濁し、室温で、または好適には２８℃でインキュベートした。ＤＫＧ取込アッセイは、細胞にＣ−１４濃縮放射線同位元素化２，５−ＤＫＧを混合することにより開始させた。ＤＫＧ取込の時間変化が、氷冷アッセイ緩衝液を使用する、真空／フィルターに基づいた反応停止を用いて追跡された。ＤＫＧ取込測定は細胞への放射性同位元素取込により行われ、得られたデータを時間に対してプロットすると、ＤＫＧ取込速度が得られる。
【００８６】
細胞ＤＫＧ取込および代謝研究に、シリコン油を使用する別のアッセイも実施された（Ｊｏｈｎｓｏｎ．Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１９８０，９５：４２９−４３９）。１００μｌのシリコン油をアッセイするばかりになったエピチューブに加えた。細胞および１４（Ｕ）濃縮２，５−ＤＫＧを混合し、規則的な時間間隔で細胞／基質混合物を引き出し、シリコン油を含んでいるエピチューブに加え、１５秒間遠心分離し、続いて直ちにドライアイス／エタノール浴で凍結した。５分後、細胞ペレットを含んでいるエピチューブのチップを直接切断してシンチレーションバイアル内へ落とした。チューブの残りは、凍結部分のすぐ上で再切断し、シンチレーション液を含んでいる別のバイアル内へ落下させた。エピチップから細胞ペレットが放たれるのを容易にするため、一夜たった後にカウントを測定した。上層からのカウント損失およびペレット中のカウント出現間の差は細胞代謝および放出されたＣＯ２によるものである。取込アッセイの終わりに、細胞を透過可能にした場合、低分子量細胞内容物が漏出し、蓄積された移入基質について、および代謝されて細胞成分になった基質についての情報が提供される。
【００８７】
ｅ．ＤＫＧレダクターゼアッセイ：各々の発酵槽から細胞ペレットを集め、−７０℃で約２４時間凍結した。１５および２５時間の時点でのペレットを氷上で融解し、５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５中でフレンチプレスした。抽出物はベンチトップ遠心分離器中、２分ｘ１４Ｋｒｐｍで回転し、続いて全蛋白質濃度およびレダクターゼ活性を測定した。すべての試料は、蛋白質のためのブラッドフォードおよびＢＣＡアッセイで測定し、正確な速度アッセイに必要とされるまで希釈した。アッセイは２，５−ＤＫＧ以外のすべてを含んでいるバックグラウンド速度（総計の速度の１０％未満であった）に対して測定された。緩衝液は：５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．５、１５０μＭ ＮＡＤＰＨおよび５ｍＭ ２，５−ＤＫＧを含んでいた。
【００８８】
細胞ＤＫＧ取込および代謝研究に、シリコン油を使用する別のアッセイも実施された（Ｊｏｈｎｓｏｎ．Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１９８０，９５：４２９−４３９）。１００μｌのシリコン油をアッセイするばかりになったエピチューブに加えた。細胞および１４（Ｕ）濃縮２，５−ＤＫＧを混合し、規則的な時間間隔（例えば、約１０秒毎）で細胞／基質混合物を引き出し、シリコン油を含んでいるエピチューブに加え、１５分間遠心分離し、続いて直ちにドライアイス／エタノール浴で凍結した。５分後、細胞ペレットを含んでいるエピチューブのチップを直接切断してシンチレーションバイアル内へ落とした。チューブの残りは、凍結部分のすぐ上で再切断し、シンチレーション液を含んでいる別のバイアル内へ落下させた。エピチップから細胞ペレットが放たれるのを容易にするため、一夜たった後にカウントを測定した。上層からのカウント損失およびペレット中のカウント出現間の差は細胞代謝および放出されたＣＯ２によるものである。取込アッセイの終わりに、細胞を透過可能にした場合、低分子量細胞内容物が漏出し、蓄積された移入基質について、および代謝されて細胞成分になった基質についての情報が提供される。
実施例ＩＩ
実施例ＩＩは基質の輸送が全細胞生物変換における律速といってもさしつかえない根拠を提供する。
【００８９】
この実施例は、四つの部分に区分化できる、グルコースからの２−ＫＬＧ形成の鍵となる工程を述べている（図５）。Ｐ．ｃｉｔｒｅａ中の三つのペリプラスム酵素を使用する。鍵となる中間体、２，５−ＤＫＧの生成は１４−１５ｇ／ｌ／ｈｒである（Ｓｏｎｏｙａｍａ，ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８２，４３：１０６４−１０６９）。第二の部分はＤＫＧが細胞の細胞質空間へ輸送されるのに必要な速度である。第三は、ＤＫＧレダクターゼを使用する２−ＫＬＧへのＤＫＧの変換速度である（米国特許第５，０３２，５１４号）。２−ＫＬＧへのＤＫＧの変換は、ＤＫＧレダクターゼが過剰発現されている場合は律速ではない。我々の現２−ＫＬＧ産生発酵の場合、ＤＫＧレダクターゼが構成的ｔｒｐプロモーター下にあるｐＤ９２を現在使用している、典型的な発酵と比較し、レダクターゼ特異的活性を増加および減少させることの両方に誘導可能なプラスミドが使用された。誘導可能プラスミド、ｐＤ２３は、ｔａｑプロモーターの下にあり、ＩＰＴＧで誘導できる。三つの発酵槽を、一つはｐＤ９２で、および二つはｐＤ２３（その一つはＩＰＴＧで誘導された）で稼働させた。対照ｐＤ９２および誘導ｐＤ２３はほぼ同一レベルの２−ＫＬＧを産生したが、一方、非誘導ｐＤ２３は著しく少なかった。レダクターゼ特異的活性のアッセイは、対照ｐＤ９２と比較して、非誘導プラスミドは半分以下のレダクターゼしか作っていなかったが、一方、誘導ｐＤ２３は２倍以上を作り出していたことを示した。これらの結果は、我々の２−ＫＬＧ産生Ｐ．ｃｉｔｒｅａ発酵におけるレダクターゼ活性レベルは２−ＫＬＧ産生の障害ではないことを示している。
第四の部分は、細胞内で行われ、移出される必要がある２−ＫＬＧの輸送である。発酵における２−ＫＬＧの産生速度（２．２ｇ／ｌ／ｈｒ−２．７ｇ／ｌ／ｈｒ）は、細胞からの２−ＫＬＧの移出速度と等しいべきと考えられる。もし、２−ＫＬＧの移出速度が制限されていたら、細胞側に２−ＫＬＧが蓄積されるであろうし、細胞はそれらの代謝ポテンシャルで機能することができなくなり、最後には死んでしまうであろう。しかしながら、Ｐ．ｃｉｔｒｅａの２−ＫＬＧ産生細胞はこれらの状態を示さず、２−ＫＬＧの細胞内測定では、産生された２−ＫＬＧ最大濃度の１０−２０分の１が残っていた。２−ＫＬＧ移出も２−ＫＬＧ生成における律速段階ではないことが考えられた。
実施例ＩＩＩ
実施例ＩＩＩは、生物変換のための細胞内への基質輸送速度が本当に律速段階にちがいないという証拠を提出している。
【００９０】
三つの異なった時点の発酵過程からの細胞ペレット、種フラスコ段階、フルクトース給餌段階およびグルコース給餌段階、を集め、実験の部で説明したように処理した。これらの細胞型を使用するＤＫＧ取込アッセイは、ＤＫＧをＫＬＧへ変換することをもたらす、０．５ｇ／ｌ／ｈｒ、２．７ｇ／ｌ／ｈｒおよび２．７５ｇ／ｌ／ｈｒＤＫＧ取込速度を与えた（図９）。ＤＫＧ移入の速度はＫＬＧ移出と同じである。それ故この結果は、ＫＬＧへのＤＫＧの生物変換速度は、細胞内への２，５−ＤＫＧ移入速度に依存していることを示している。それ故、本発明は、過剰発現によりＤＫＧ取込輸送体を増加させることが、２，５−ＤＫＧの移入速度を促進し、従って、２−ＫＬＧ産生速度を促進するであろうことを示すであろう。当業者は、全細胞変換法を使用し、種々の生物形質転換において鍵となる制限因子が、実際に生物形質転換のための、細胞内への基質の移入および移入速度であることを思い浮かべることができる。
実施例ＩＶ
実施例ＩＶはＤＫＧ取込アッセイを使用した、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ中の２，５−ＤＫＧ輸送体の発見を提供する。ＷＯ００２１７０は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａからのオペロンの同定および配列決定を記載しており（ｙｉａオペロンと称される）、それは８つの推定読み取り枠を含んでいる。ｙｉａオペロン中の個々の読み取り枠によりコードされているこれらのポリペプチドの機能は、ＷＯ００２１７０には記載されていない。このオペロンの破壊は、単一炭素源としてアスコルビン酸を使用するＫ．ｏｘｙｔｏｃａの能力を取り除いた。アスコルビン酸は酸化に不安定な物質であり、空気酸化により２，３−ＤＫＧへ分解することが知られている（Ｋｉｍａｙａ，Ｓ．，Ｊ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ，，１９６１，７：１９−２６）。２，３−ＤＫＧが増殖のための実際の基質であることを示唆するのは妥当であった。ｙｉａオペロン中の読み取り枠の一つ（ｙｉａＸ２と称される）は、輸送体型膜貫通蛋白質をコードしており、それ故、２，３−ＤＫＧ透過酵素の候補であると考えられた。２，５−ＤＫＧ透過酵素を発見する平行的研究を照らし合わせると、２，３−ＤＫＧおよび２，５−ＤＫＧは類似の分子であることが理解され、ｙｉａＸ２が２，５−ＤＫＧおよび２−ＫＬＧのような他の糖ケト酸を輸送することは可能であろう。
【００９１】
ｙｉａＸ２が，５−ＤＫＧおよび２−ＫＬＧを輸送できるかどうかを決定するため、この遺伝子をＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株Ｍ５ａ１の染色体から欠失させた（例えば、Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６８：１１７４−１１７７（１９７１）を参照されたい）。ｙｉａＸ２欠失変異体（ＭＧＫ００２と称される）は、本分野では既知の標準分子生物学プロトコールを使用して作り出された（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１７１：４６１７−４６２２（１９８９）を参照されたい）。Ｔｅｓｔｅｒ株と称される別のＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株はＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株ＭＧＫ００２に、プラスミド的にコードされている、およびｌａｃオペロン制御ｙｉａＸ２遺伝子を付加し戻すことにより作り出された。ＭＧＫ００２およびＴｅｓｔｅｒ株を使用する、＋／−ＩＰＴＧ下でのＤＫＧ取込アッセイから、ｙｉａＸ２が２，５−ＤＫＧ輸送活性を持っているポリペプチドをコードしていることが確認された（図９）。
実施例Ｖ
実施例Ｖは、微生物からの２，５−ＤＫＧ透過酵素をスクリーニングするための選択方法論を提供する。
【００９２】
ｙｉａＸ２遺伝子が２，５−ＤＫＧ輸送活性を持っている輸送蛋白質をコードしているという情報により、Ｐ．ｃｉｔｒｅａおよび他の生物源の２，５−ＤＫＧ輸送蛋白質を発見するための選択宿主を設計することが可能になった。ｙｉａＸ２遺伝子欠失および酵素を発現する遺伝子の付加を持つＫ．ｏｘｙｔｏｃａは２，５−ＤＫＧからグルコン酸への異化に関係しており、それは生物体の中枢代謝を評価可能である。２，５−ＤＫＧをグロン酸に異化できる酵素は、いくつかのグラム陰性生物体に存在する、ｔｋｒ ｉｄｎＤ ｉｄｎＯオペロンのｔｋｒおよびｉｄｎｏ遺伝子によりコードされている（Ｂａｕｓｃｈ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９８，１８０：３７０４−３７１０）。
【００９３】
得られたＫ．ｏｘｙｔｏｃａのｔｅｓｔｅｒ株はｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎｏ］であり、単一炭素源として２，５−ＤＫＧ上での増殖に必要とされるすべての成分を持っているが、但し、細胞質内へＤＫＧを移入する能力は持っていない。従って、２，５−ＤＫＧ透過酵素をコードする核酸分子は、ｔｅｓｔｅｒ株中での発現により、２，５−ＤＫＧ上で増殖するｔｅｓｔｅｒ株の能力を与えるべきである。この選択方法論は図９に示されている。
【００９４】
Ｐ．ｃｉｔｒｅａゲノムライブラリーを構築するために使用されたクローニングベクターはプラスミドｐＣｌ１９２０（Ｌｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９４，１８：４６２１）であり、スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性決定基を運んでいる低コピー数発現ベクターである。宿主に提供された場合、ｌａｃｌｑ遺伝子産物により抑制される，ｌａｃＰＯプロモーター／オペレーター領域により駆動される。Ｐ．ｃｉｔｒｅａ（ＡＴＣＣ３９１４０）からのゲノムＤＮＡは標準プロトコールを使用して単離し、ゲノムライブラリーを作製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２））。増幅されたライブラリーは、Ｐ．ｃｉｔｒｅａの２，５−ＤＫＧ透過酵素発見にさらに使用するため、プラスミドＤＮＡの形で保存した。
実施例ＶＩ
実施例ＶＩは宿主細胞中でＤＫＧ輸送体を過剰発現することにより、細胞中のＤＫＧ移入を促進できるという証拠を提供する。
【００９５】
ゲノムライブラリーをｔｅｓｔｅｒ株Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ ｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎｏ］株内へ導入した。２．５％２，５−ＤＫＧおよび０．１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＭ９寒天プレートを使用し、２，５−ＤＫＧ上で成長させたクローンは、放射標識１４Ｃ（Ｕ）ＤＫＧを使用してＤＫＧ取込を試験した。種々のクローンが対照ｔｅｓｔｅｒ株より改良されたＤＫＧ取込を持つことが観察された（図９）。これらの陽性クローンからのゲノムライブラリーＤＮＡでＰ．ｃｉｔｒｅａ（１３９−２Ａ）を形質転換し、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ １３９−２Ａ株よりもＤＫＧ取込が改良されていることを測定するため、ＤＫＧ取込アッセイが実施された。ゲノムライブラリースクリーニングおよび選択方法論を通して発見された、ＤＫＧ透過酵素をコードしているプラスミドの追加のコピーを持っている形質転換体中で、ＤＫＧ取込速度に３から５倍の改良がみられた（図１０）。
実施例ＶＩＩ
実施例ＶＩＩは宿主細胞中でＤＫＧ輸送体を過剰発現させることにより、２−ＫＬＧの産生を改良できることの証拠を提供している。Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ ＤＫＧ透過酵素ＰｅｒｍＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコードしている核酸分子が、グルコースから２−ＫＬＧの生合成に適したＰａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ株１３９−２Ａ内へ低コピーベクターｐＢＣＬ１９２０を使用してサブクローン化された場合（米国特許第５，０３２．５１４号）、２−ＫＬＧ産生の産生速度が２．５ｇ／ｌ／ｈｒから３．２ｇ／ｌ／ｈｒへ改良され、糖に対する収率が４５％から５３％へ改良された（図１１）。
実施例ＶＩＩＩ
実施例ＶＩＩＩはＰ．ｃｉｔｒｅａからのＤＫＧ透過酵素ＰｅｒｍＡの特性を記述している。
【００９６】
この実施例は、Ｐ．ｃｉｔｒｅａのＰｅｒｍＡの膜トポロジーを説明している。ＰＦＡＭ分析（Ｈｉｒｏｋａｗａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１９９８，４（４）：３７８）は、ＰｅｒｍＡは八つの一次ドメインおよび三つの二次貫通ドメインを持つ１１の膜貫通ドメインを持っている（図１２）。アミノ末端はペリプラスムにあり、カルボキシ末端は細胞質中に位置している。二つの主および２つの副ループが存在し、ペリプラスムおよび細胞質の両方が一つの主および一つの副ループを持っている。ＰｅｒｍＡは０．６２の疎水性を持つ膜蛋白質であり、４８ダルトンの分子量を持っている。集積比分析（Ｌｏｌｋｅｍａ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ １１，２２９−２６０）に基づくと、それは２，５−ＤＫＧのＨ＋関連共輸送体の一つである。共通配列分析（Ｐａｏ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９８，６２：１−３４）に基づくと、それはＭＦＳのＡＣＳファミリーに属している（図８ａ）。
【００９７】
本開示を読んだ後に、本発明の精神および範囲から離れることなく、前記の説明および例の種々の別例および変形が、当業者には明らかになるであろうが、そのような例または変形は付随する特許請求の範囲内に含まれているつもりである。本明細書で参照されたすべての報文および特許はその全体がここに組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａのＹｉａＸ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示している。ＰＥ１（環境透過酵素）；ＰＥ６（環境透過酵素）；Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａのＰｅｒｍＡ；Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａのＰｅｒｍＢ；Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａのＹｉａＸ２。
【図２】図２はグルコースからのアスコルビン酸前駆体２−ＫＬＧ生産のための合成経路を示している流れ図である。
【図３】図３はアスコルビン酸前駆体２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＬＧ）の合成経路を示している図である。
【図４】図４は、グルコースが２−ＫＬＧを得るようにたどることができる種々の合成経路を示している流れ図である。Ｂｏｕｄｒａｎｔ，Ｊ．，Ｅｎｚｙｍ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．，１９９０，１２，３２２−３２９。
図４ＡはＤ−ソルビトールから２−ＫＬＧへの合成経路を示している図であり、経路内の他の反応および細胞膜を横切った基質の輸送に関係する反応の細胞位置を示している。Ｓａｉｔｏ，Ｙ，ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．５８（２／３）：３０５−３１５（１９９８）。
【図５】図５はＤ−グルコースから２，５−ＤＫＧ、２−ＫＬＧの合成経路を示しており、経路内の他の反応および細胞膜を横切った各々の基質の輸送に関係する反応の位置を示している。
【図６】図６はＤＫＧ輸送速度とＫＬＧ産生速度を比較している線グラフであり、時間に対する２，５−ＤＫＧ取込量（ナノモル／ＯＤ６００）を示している（−◆−＝フルクトース給餌１３９−２ａ、０．０４８６ｘ＋０．６７；−▲−＝グルコース給餌１３９−２ａ、ｙ＝０．０４９７＋０．５８７７；−●−＝種フラスコ１３９−２ａ、ｙ＝０．００７５ｘ＋０．０５６７）。
【図７】図７はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ中のアスコルビン酸異化作用のｙｉａオペロン概略図である。
【図８】図８はシリコン油輸送アッセイにより測定された、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａによる２，５−ＤＫＧ取込量（ナノモル）を示しているグラフである（−◆−＝Ｔｅｓｔｅｒ＋イソプロピルβ−Ｄ＝チオガラクトピラノシド〔ＩＰＴＧ〕；−▲−＝ΔｙｉａＸ２＋ＩＰＴＧ；−黒四角−＝Ｔｅｓｔｅｒ−ＩＰＴＧ）。
【図９】図９はＰ．ｃｉｔｒｅａ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａおよび環境源から透過酵素を選ぶための選択計画を示している概略図である。
【図１０】図１０はＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株における２，５−ＤＫＧ取込活性を示している棒グラフである（ＹｉａＸ２、ｐｃｐ１、ｐｃｐ１０、ｐｃｐ３２、ｐＫ１、環境＃１および環境＃６）。
【図１１】図１１は２８度ＣでのＤＫＧ取込速度（ｇ／ｌ／ｈｒ）を測定することによる、同一のプラスミド構築物（ｐＢＣＬ１９２０）中に種々のＤＫＧ透過酵素（１３９−２Ａ、１３９−２Ａ＋ＰＣＰ３２；１３９−２Ａ＋ＰＣＰ１０；１３９−２Ａ＋ＰＫ１；１３９−２Ａ＋ＰＣＰ１および１３９−２Ａ＋ＰＥ６）を含んでいる振盪フラスコの２，５−ＤＫＧ取込アッセイを示している棒グラフである。９Ａ−９Ｂ
【図１２】図１２は、特異的生産性が過剰発現されたＤＫＧ透過酵素で増加することを示している線グラフである。特異的産生速度（ｇ／ｌ／ｈｒ）（−◆−＝野生型；−ｘ−＝ＷＴ、ｐｒｍＡ）。
【図１３】図１３は膜表面におけるＰｅｒｍＡ輸送体の概略図である。推定膜貫通ドメインはＩ−ＸＩと番号付けられている。保存残基の位置はボールド体で示されている。Ｎはアミノ末端であり、Ｃはカルボキシル末端である。Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ 透過酵素Ａ（ＳＥＱ ＩＤ：＿）の推定膜貫通ドメインはｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｆｒａｍｅ０．ｈｔｍｌ で利用可能な道具を使用して導き出された。
【図１４】図１４は残基Ｇ１１９から１４２に対応する保存アミノ酸配列である。
技術分野
本発明は一般的に２−ＫＬＧの工業的生産を促進すること、特に、ペリプラスムから細胞の細胞質ゾル領域へ２，５−ジケトグルタル酸を輸送する蛋白質をコードしているゲノムを過剰発現することに関している。本発明は微生物中での、２−ＫＬＧの促進された産生のための発現ベクター、方法およびシステムを提供する。
背景技術
２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＬＧ）は、Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ法（Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，１９３４，１７ ３１１−３２８；Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ，１９３３，Ｈｅｌｖ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，１６，５６１，１０１９）における一工程の化学的手順によりＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）へ容易に変換されることが、一般的によく知られている。出発基質を２−ＫＬＧへ変換するための異種酵素を発現する組換え微生物が存在する。単一発酵工程により、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ中でＤ−グルコースを２−ＫＬＧへ生物変換するために、組換えＤＮＡ技術が使用されてきた（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１４４−１４９（１９８５））。しかしながら、この研究は最終生成物の工業的生産における基質輸送の重要性を認識することなく、２，５−ＤＫＧレダクターゼの発現を増加させること、または他の合成的生産に向けられている。実際に、発明者の研究は、レダクターゼの過剰発現の結果として、２−ＫＬＧ生産における極微の増加を明らかにした。それ故、細胞内で蛋白質を変換する発現レベルを増加させる以外の手段により、組換え微生物を利用する生合成経路を経る、２−ＫＬＧの工業的生産を増加させるための手段が必要とされている。
【０００２】
生体膜の脂質二重層は一般的にイオンおよび極性分子に対して不透過性である。これらの生体膜は細胞を区画化し、細胞の異なった部分をお互いに分離している。それ故、種々の生成物を合成するために細胞により利用される基質、ならびにエネルギー発生または増殖のために細胞により利用される代謝物は、それらを利用する合成および／または分解反応から分離されているであろう。生成物合成に関しては、異なった合成経路またはその一部を、細胞の異なった部分に見ることができる。いくつかの酸化的反応は細胞質ゾルの外側で起こることができる。例えば、炭素源を別の中間体に酸化するため、膜結合蛋白質を利用できる。細胞質ゾル反応または経路（例えば、いくつかの還元または脱水素反応）はまた、基質または中間体を別の生成物へ変換するために利用できる。基質および合成装置が膜の反対側にある場合、所望の最終生成物の産生には、所望の最終生成物への変換を可能にするため、合成反応の原位置への基質移動を必要とする。もしくは、細胞膜の内側で発生した最終生成物は、細胞内からの移動を必要とする。細胞の区画化部分は異なった環境パラメーター（例えば、溶質、イオン、最終生成物、濃度その他）を持っている、または正常では不透過性の障壁を横切った移動を必要とするので、何らかの形の能動輸送が必要とされるであろう。
【０００３】
これらの問題に答えて、膜を横切った物質の輸送を増加させることに関する研究が現れた。溶媒または溶解剤が、膜を破断するために使用され、膜を横切った物質の横断を可能にしてきた。しかしながら、そのような方法は宿主細胞の生存力に有害な効果を示す。もし、合成または代謝経路が、宿主細胞自身の代謝または分解経路によりエネルギーを与えられているまたは依存するとしたら（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのような補因子を必要とするような）、細胞の生存力を破壊することは、宿主細胞によるさらなるまたは連続した合成的産生を停止させる。加えて、細胞増殖を増加させることによるグルコースまたは他のサッカリド輸送の増加が探求されているが（Ｐａｒｋｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５（５）：７９５−８０２（１９９５））、組換え微生物を利用する生合成経路による化学最終生成物または中間体の工業的生産を増加させるために細胞輸送システムを改変することは認識されていない。
【０００４】
Ｃｏｒｎｉｓｈ（Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３４：３１１１−３１２２（１９８８））はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｙｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒによるグルコース輸送とスクシノグルカン エキソポリサッカリド産生の関係を議論している。Ｃｏｒｎｉｓｈは、グルコース取込がスクシノグルカン産生の主たる反応速度制御点であったこと、およびもっと速い速度のスクシノグルカン産生を得るために組換えＤＮＡ法を使用することにより、もっと速い速度でスクシノグルカン産生が得られるはずであることを提案している。しかしながら、Ｃｏｒｎｉｓｈの産生速度は工業的に要求される規模ではなかった。さらに、高いレベルのエネルギーが消費され、およびグルコースの輸送に複雑な調節機構が含まれており、その使用を助長するというよりもむしろ思いとどまらせるものであったであろう。
【０００５】
Ｖｏｌｓｃｈｅｎｋ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１ ５：２５３（１９９７年３月）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内へのリンゴ酸分解経路の導入を記載しており、ワイン中に存在するリンゴ酸レベルを枯渇させる目的で、それをコードしている異種ＤＮＡのクローニングおよび発現を行っている。Ｖｏｌｓｃｈｅｎｋは主として、取り巻いている培地からのリンゴ酸の除去に関心を示し、工業的規模での所望の最終生成物生産には関心を持ってはいない。
【０００６】
さらに、輸送システムが関与するという単なる知見は、所望の最終生成物または中間体の促進された産生をほとんど保証しない。合成装置はすでに飽和されているであろうから、存在する基質が増加しても、所望の最終生成物の産生が必然的に増加するわけではないであろう。加えて、産生基質としてのその使用に加えて代謝産物として直接的にまたは間接的に利用される基質の輸送が増加しても、望まれた産生の増加は生じないであろう。
【０００７】
基質を望まれる最終生成物に変換する酵素の発現レベルを単に増加させても、組換え微生物を使用する化学的化合物の産生を増加させないであろう。細胞中の基質発現レベルを増加させる以外の手段により、組換え微生物を使用する化学的化合物の産生を増加させるための手段が必要とされている。
【０００８】
また、細胞中の細胞質ゾルレダクターゼの発現レベルを増加させる以外の手段により、組換え微生物を利用する、生合成経路を通した２−ＫＬＧの工業的生産を増加させるための手段も必要とされている。
発明の要約
微生物の２，５−ＤＫＧ輸送能力は所望の２−ＫＬＧ生成、特に、２−ＫＬＧ生成は細胞質ゾル内に区画化されており、および２，５−ＤＫＧのその生成原位置からの輸送を必要とするので、の制限因子または障害になるであろう。本発明はその障害を軽減する手段を提供する。
【０００９】
本発明はＰ．ｃｉｔｒｅａ ＰＥ１、ＰＥ６、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＡおよびＰｅｒｍＢの単離された核酸およびアミノ酸配列を提供する。Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ＰＥ１、ＰＥ６、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＡおよびＰｅｒｍＢのアミノ酸配列および核酸配列は図１Ａ−１Ｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１および２に示されている。
【００１０】
本発明はまた、宿主細胞の２，５−ＤＫＧからの２−ＫＬＧの生合成的産生を促進するための改良法も提供する。従って、宿主細胞の２−ＫＬＧ生合成的産生を促進するための方法が提供され、該方法は２，５−ＤＫＧを２−ＫＬＧに変換する合成経路を持っている宿主細胞を選択し；完全性を保持すると同時に該宿主細胞内への該２，５−ＤＫＧの輸送を増加させ；該２−ＫＬＧを産生するように宿主細胞を培養し；および２−ＫＬＧを産生することからなっている。別の態様において、該宿主細胞内への該２，５−ＤＫＧの輸送を増加させる工程は、該宿主細胞細胞質ゾル実質内へ該２，５−ＤＫＧを輸送する一つまたはそれ以上の蛋白質をコードしているＤＮＡでの宿主細胞の形質転換工程を含んでいる。該一つまたはそれ以上の蛋白質はＹｉａＸ２、ＰＥ１、ＰＥ６、ＰｅｒｍＡおよびＰｅｒｍＢから成る群より選択される。コードＤＮＡはまたｙｉａＸ２、ｐｅ１、ｐｅ６、ｐｅｒｍＡおよびｐｅｒｍＢから成る群より選択されるゲノムから発現されてもよい。一つまたはそれ以上の蛋白質はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．＿とハイブリダイズできる。蛋白質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯまたはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．＿と少なくとも５０％、または９０％の同一性を持っている。別の態様において、蛋白質は少なくとも３１残基を含んでいる配列から成り、該残基はＰｅｒｍＡのグリシン１１９に相当するグリシン残基、または任意にＰｅｒｍＡのＷ１３６に相当するトリプトファン残基、または任意に、ＰｅｒｍＡのＧ１３８に相当する位置のフェニルアラニン、ＰｅｒｍＡのＥ１４１に相当する位置のグルタミン酸（Ｅ）およびＰｅｒｍＡのＲ１４２に相当する位置のアルギニン（Ｒ）の群から選択される少なくとも一つの追加の残基を含んでいる。
【００１１】
本発明はまた、内部細胞膜を横切る細胞質ゾル内への２，５−ＤＫＧ輸送を促進する方法も提供し、該方法は宿主細胞を選択し；および該宿主細胞内へ２，５−ＤＫＧを輸送する一つまたはそれ以上の蛋白質をコードしているＤＮＡで該宿主細胞を形質転換することから成っている。一つの態様において、宿主細胞は細菌および酵母から成る群より選択される。好適には、宿主細胞は大腸菌、パントエアおよびクレブシエラから成る群より選択される。
【００１２】
本発明は、宿主細胞を選択しおよび該宿主細胞内へ２，５−ＤＫＧを輸送する一つまたはそれ以上の蛋白質コードＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程による、内部細胞膜を横切る細胞質ゾル内への２，５−ＤＫＧ輸送を促進する方法を提供する。
発明の詳細な説明
定義
輸送体の定義
細菌チャンネル輸送体とは、一般的にＴＣ分類の＃１．Ａにある輸送体を指している（Ｓａｉｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｐｏｏｌｅ，Ｒ．Ｋ．，ｅｄ．）ｐｐ．８１−１３６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）。（“ＴＣ”とは“輸送に関する会議”、輸送体の系統発生的様相を考慮に入れた分類システム、を表している。）これらは一般的に、膜貫通孔を用いるエネルギー非依存性促進拡散機構を経て、基質、イオンまたは他の物質を輸送する。
【００１３】
一次輸送体とは一般的にＴＣ分類の（ＴＣ＃３．Ａ）にある輸送体を指しており（Ｓａｉｅｒ Ｍ．，ｅｔ ａｌ，１９９８）、基質の能動取込および輸送押し出しのために、典型的にはエネルギーカップリングの様式としてＡＴＰ加水分解の形で、化学エネルギーを利用する輸送体である。
【００１４】
グループ輸送システムとはＴＣ分類のＴＣ＃４．Ａにある輸送体を指しており（Ｓａｉｅｒ Ｍ．，ｅｔ ａｌ，１９９８）、輸送の間に輸送およびそれらの基質のリン酸化を同時に行う輸送体である。この範疇のメンバーは細菌特異性ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）の一部であり、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）利用酸化へのカップリングにより特徴付けられる。
【００１５】
二次輸送体とはＴＣ分類のＴＣ＃２．Ａにある輸送体を指しており（Ｓａｉｅｒ Ｍ．，ｅｔ ａｌ，１９９８）、膜を横切って基質、イオンまたは最終生成物を輸送するためのエネルギーを提供するため、化学浸透圧エネルギー（例えば、プロトン勾配の形で）を一般的に使用する輸送体である。
【００１６】
主促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）とはＴＣ分類の＃２にある二次輸送体を指している（Ｓａｉｅｒ Ｍ．，ｅｔ ａｌ，１９９８）。
輸送体とは、細胞膜を横切りおよび細胞または細胞区画内へまたはそれらから、化学化合物を移動することを可能にする任意の巨大分子を指している。輸送体はまた、透過酵素としても知られ、および称されている。特定の理論に限定されているわけではないが、輸送体は膜、膜外表面および膜を通して膜内表面から伸びている蛋白質の一部分と相互作用する蛋白質である。
【００１７】
能動輸送とは、エネルギー消費、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の加水分解、とカップルしている輸送を指している。
【００１８】
アニオン／カチオン共輸送体とは膜を横切って基質を輸送するために化学浸透圧勾配を利用する輸送体である（ＴＣクラス１４）。それらはまた、基質／Ｈ＋共輸送体とも称されている。
【００１９】
ＴＭＳとは膜貫通ドメインを指している。
経路の定義
細胞質の、とは内部細胞膜内に存在することを指している。
【００２０】
外因性基質とは、合成反応を分離する膜の反対側に観察される物質を指している（例えば、基質が所望の最終生成物または中間体へ、細胞内合成経路または合成経路の細胞内部分により変換されるべき場合には内部細胞膜の外側）。
【００２１】
細胞外または内部細胞膜の外側とは、細胞質から膜の反対側の細胞位置を指しており、ペリプラスムが含まれるが、それに限定されるわけではない。
内部細胞膜とはペリプラスムから細胞質を分離している障壁を指している。
【００２２】
膜とは基質に対して本質的に不透過性である脂質二重層を指している。
細胞内とは細胞質ゾルに最も近い膜側または細胞質ゾル側の細胞部分を指している。
【００２３】
細胞内反応とは、細胞質ゾル細胞物質、即ち、内部細胞膜内部に封じ込められている物質内に位置している合成反応または生物変換を指している。
律速段階とは、２−ＫＬＧ生合成経路内の段階を指しており、ここでその段階を通る変換の増加は２−ＫＬＧ産生の増加を生じる。
【００２４】
産生の促進とは、所望の合成反応の中間体、最終生成物または前駆体の力価（全量）が増加したことを指しており、一般的にプロセスを通して得られたｇｍ／ｌ／時間での増加により測定される。それはまた、所望の生成物が作られる速度の増加も指しており、一般的に組換え体産生の単位時間当たりのｇ／ｌで測定され、ここで、産生された中間体、最終生成物または前駆体の量は、過剰発現された輸送体の存在下、膜を横切る基質の輸送を増加させる少なくとも一つの蛋白質をコードしているＤＮＡでの形質転換の結果として増加する。
【００２５】
基質とは合成反応により生物変換される２，５−ＤＫＧを指しており、細胞質ゾル反応原位置は膜により基質と分離されている。
合成反応とは、中間体または最終生成物への基質の組換え体生物変換を指している。
【００２６】
２，５−ＤＫＧレダクターゼとは、２，５−ＤＫＧの２−ＫＬＧへの立体選択的変換を触媒できる蛋白質を指している。
２，５−ＤＫＧ輸送体とは、２，５−ＤＫＧレダクターゼによる２−ＫＬＧへの変換のため、内部細胞膜を横切って２，５−ＤＫＧを輸送できる蛋白質を指している。
発現における定義
プロモーターとは、細胞の翻訳装置により一度翻訳されたら、ポリペプチドを形成できるメッセンジャーＲＮＡを発生するために適した部位で遺伝子の転写を開始するようにＲＮＡポリメラーゼを導くＤＮＡ要素を指している。
【００２７】
“上流活性化配列”は正に作用するＤＮＡ結合レギュレータのための結合位置である。その名前から示されるように、上流活性化配列は転写開始部位の上流であり、核酸である。
【００２８】
調節領域とは、遺伝子の発現を調節するＤＮＡ上の領域を指している。この変更のための一機構は、いくつかの調節領域が蛋白質のための結合部位として働くことである（リプレッサーとしても知られている）。一度結合したら、リプレッサーは遺伝子を転写するためのＲＮＡポリメラーゼの能力を妨害する。
【００２９】
発現系は一つまたはそれ以上の蛋白質および／または核酸を含んでおり、一緒になって作用する場合、宿主細胞中の蛋白質発現を増加できる。発現系は一つまたはそれ以上のプラスミド上にコードでき、問題とする蛋白質をコードしている遺伝子と同じプラスミドでも異なったプラスミドでもよい。
【００３０】
句“機能的に連結された”または“機能的にカップルされた”とは、調節要素（ＤＮＡまたは蛋白質）がそれらの機能を果たすために物理的に相互作用することを意味している。これは蛋白質／蛋白質、ＤＮＡ／蛋白質またはＤＮＡ／ＤＮＡ相互作用であり得る。例えば、ＤＮＡ結合レギュレータはプロモーターと相互作用するが、それらをコードしている遺伝子は染色体の異なった部位に存在してもよい。そのようであるので、要素をコードしている遺伝子はお互いにおよび問題とする蛋白質をコードしている遺伝子と異なったプラスミド上にあることができ、それでも蛋白質の発現を調節するために一緒に働くことができる。
【００３１】
通例、蛋白質およびそれらをコードする遺伝子を説明する場合、遺伝子のための用語は大文字化されず、およびイタリック体である、即ち、ｐｅｒｍＡ。蛋白質のための用語は一般に普通の文字であり、最初の文字は大文字である、即ち、ＰｅｒｍＡ。
生物の定義
“細菌”には分裂菌類の微生物が含まれる。細菌はグラム陰性でもグラム陽性でもよい。グラム陰性菌には、エシェリキア、ヘモフィラス、クレブシエラ、プロテウス、シュードモナス、サルモネラ、グルコノバクター、アセトバクター、エルセニア、シゲラ、ビブリオ、アシネトバクター、パントエアおよびセラチア属の細菌が含まれる。グラム陽性菌には、バチルス、クロストジウム、スタフィロコッカス、ストレプトミセス、ラクトバチルスおよびラクトコッカス属の細菌が含まれる。
【００３２】
グラム陰性菌は、パントエア属の構成細菌株であるパントエアンでありうる。好適な細菌はＰａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａである。Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａはまた、時にはＥｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａまたはＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｅｍｉｕｓとも呼ばれている。
【００３３】
ここで使用される場合、用語“単離された”または“精製された”とは、天然に付随している少なくとも一つの成分が除去された核酸またはアミノ酸を指している。
好適な態様の詳細な説明
本発明の一つの態様は発現系をコードしている核酸を含むプラスミドで宿主細胞を形質転換する方法に関している。本発明の別の態様は、膜を横切った基質の輸送を増加させる一つまたはそれ以上の蛋白質をコードしているＤＮＡを含むプラスミドで宿主細胞を形質転換する方法に関している。宿主細胞は本発明のプラスミドが、例えば、形質転換により挿入できる細胞である。好適には、宿主細胞は細菌であり、より好適にはパントエア、エシェリキア、クレブシエラまたはバチルスの群内のものである。
【００３４】
別の態様において、もし調節要素が取り込まれているとしたら、発現系のそのような要素は大腸菌および枯草菌からのものである。一つの態様において、宿主細胞は、好適には、グラム陰性菌である。別の好適な態様において、宿主細胞はパントエアである。同じ宿主細胞が、一つまたはそれ以上の輸送体をコードする核酸を誘導するさらなるプラスミドで形質転換できる。好適には、輸送体はＭＦＳ輸送体、さらに好適にはアニオン／カチオン共輸送体がコードされている。輸送体の例には、Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａまたはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａおよび異種源からのｙｉａＸ２、ｐｅｒｍＡ、ｐｅｒｍＢ、ｐｅ６、ｐｅ１がコードまたは発現されるものが含まれる。
【００３５】
本発明は、所望の最終生成物の合成および産生経路に対する障害を軽減するため、２，５−ＤＫＧの輸送を増加させることにより、特に輸送体が組換え的に宿主細胞に導入および宿主細胞から過剰発現される場合、宿主細胞の２−ＫＬＧの生合成的産生を促進するための新規方法を提供する。
【００３６】
本発明の一つの態様は、発現系をコードしている核酸を誘導するプラスミドで宿主細胞を形質転換する方法に関している。宿主細胞は本発明のプラスミドが、例えば、形質転換により挿入できる細胞である。好適には、宿主細胞は細菌である。一つの態様において、宿主細胞は、好適には、グラム陰性菌である。別の好適な態様において、宿主細胞はパントエアである。好適には、宿主細胞はＰａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａであり、もし調節要素が取り込まれているなら、そのような発現系の要素はパントエアからである。同じ宿主細胞が、一つまたはそれ以上の輸送体をコードする核酸を誘導するさらなるプラスミドで形質転換できる。好適には、輸送体は、Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａからのｙｉａＸ２、ｐｅｒｍＡ、ｐｅｒｍＢ、ｐｅ６、ｐｅ１でコードまたは発現される。
合成反応
本発明は２−ＫＬＧからの２，５−ＤＫＧの生成を促進するため、膜を横切る２，５−ＤＫＧの増加された輸送を提供する。増加された輸送は、還元反応の細胞位置から２，５−ＤＫＧを分離している膜を横切る２，５−ＤＫＧの転置を提供する（図２および３）。
【００３７】
本発明はアスコルビン酸中間体合成、例えば、２−ＫＬＧへの２，５−ＤＫＧの変換；ソルボソンを経る２−ＫＬＧへのソルボースまたはソルビトールの変換；Ｌ−イドン酸への５−ケト−Ｄ−グルコン酸（５−ＫＤＧ）の還元；およびＬ−グロン酸への５−ケト−Ｄ−グルコン酸の還元、に関連して特に有用である。これらの経路の各々は、細胞質内に存する合成経路、合成反応の部分により特徴付けられる、例えば、２，５−ＤＫＧレダクターゼによる２，５−ＤＫＧの還元；ソルボソン デヒドロゲナーゼによる２−ＫＬＧへのＬ−ソルボソンの還元；５−ＫＤＧデヒドロゲナーゼによるＬ−イドン酸への５−ケト−Ｄ−グルコン酸（５−ＫＤＧ）の還元；および５−ＫＤＧレダクターゼによるＬ−グロン酸への５−ケト−Ｄ−グルコン酸の還元。これらの経路はまた、細胞質中に存している合成反応による生物変換のため、膜を横切って基質（例えば、２，５−ＤＫＧ；Ｌ−ソルボソンなど）を輸送することの必要性によっても特徴付けられる。
【００３８】
基質は一般に、ある種の能動輸送機構なしでは効率よく膜を通って通過できないものである。好適には、これらはアスコルビン酸中間体（２，５−ＤＫＧ、ソルボソン）を含むことができるが、これらに限定されるわけではない。加えて、基質は工業的規模での合成的使用のために輸送される物質であり、一般的に宿主細胞による代謝的使用のためではない。工業的使用とは、好適には２ｇ／ｌ／ｈより多く、より好適には３ｇ／ｌ／ｈより多く、およびさらにより好適には５ｇ／ｌ／ｈより多い、力価および容量生産力を指している。別の態様において、生産力力価は、２から１４ｇｍ／ｌ／時間の間、好適には３から１２ｇｍ／ｌ／時間の間、およびさらにより好適には５から１０ｇｍ／ｌ／時間の間であり、経済的に存立できる工業的生産プロセスになる。特に好適な基質には２，５−ＤＫＧおよびソルボソンが含まれる。本発明の発明的様相はこれらの実施態様において特に有用である。
【００３９】
本発明の実施において特に有用な反応は、細胞質ゾル デヒドロゲナーゼ２，５−ＤＫＧレダクターゼによる、２−ＫＬＧへの２，５−ＤＫＧ細胞質ゾル還元のための、内部細胞膜を横切る２，５−ＤＫＧの輸送である（Ｂｏｕｄｒａｎｔ，Ｊ．（１９９０）Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ，Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９０：３２２−３２９）。２，５−ＤＫＧは膜結合２−ケトグルコナート デヒドロゲナーゼにより２−ケト−Ｄ−グルコナート（２−ＫＤＧ）から変換される。本発明は、内部細胞膜を横切る、２−ＫＬＧへの細胞質ゾル還元部位までの２，５−ＤＫＧの輸送が、２，５−ＤＫＧ輸送の増加をコードしているＤＮＡにより達成できることを認めた。
【００４０】
本発明の実施において別の特に有用な反応は、ソルボース、ソルビトールを経る２−ＫＬＧ生成の中間体、ソルボソンの輸送である（Ｓａｉｔｏ，Ｙ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５８（２／３）：３０９−３１５（１９９７）。ソルボソンへのソルビトールおよび／またはソルボースの変換は、ソルビトールまたはソルボースを２−ＫＬＧへ変換する経路の一工程である（Ｂｏｕｄｒａｎｔ Ｊ．，１９９０；Ｓａｉｔｏ（１９９７））。以下は本発明に従ったソルボソン輸送体の工学技術の議論である。
【００４１】
Ｓａｉｔｏが記述しているように、Ｄ−ソルボースから２−ＫＬＧへの経路は、Ｌ−ソルボース デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）によるＬ−ソルボソンへのＬ−ソルボースの酸化、続いてのＬ−ソルボソン デヒドロゲナーゼによる２−ＫＬＧへのＬ−ソルボソンの酸化を含んでいる。膜結合デヒドロゲナーゼによりＤ−ソルビトールをＬ−ソルボソンへ変換する一つの組換え宿主細胞が記述されている（Ｓａｉｔｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（１９９７））。Ｌ−ソルボソンは次に、細胞質中のＬ−ソルボソン−デヒドロゲナーゼによる還元のため、ペリプラスムから輸送される。２−ＫＬＧへの変換のため、経路へのソルボソン中間体の輸送を容易にするソルボソン輸送体の過剰発現は、有益な効果を持っていると理解されている。
【００４２】
Ｄ−グルコースから２−ＫＬＧへの別の経路は、５−ケト−Ｄ−グルコン酸（５−ＫＤＧ）へのＤ−グルコン酸の酸化を含んでおり、それは順に２−ＫＬＧへの酸化のために、Ｌ−イドン酸（ＩＡ）またはＬ−グロン酸へ還元される（Ｂｏｕｄｒａｎｔ，Ｊ．（１９９０））。ケト−レダクターゼによる還元のため、細胞質ゾル内への５−ケト−Ｄ−グルコン酸の輸送もまた５−ＫＤＧ輸送体の過剰発現により容易にすることができる。
【００４３】
別の態様において、合成反応は細胞質ゾル外または基質に関して膜の外側に位置していてもよい。第一の反応の最終生成物は、膜の反対側で行われる第二の反応の中間基質であろう。例えば、日本の柿からのＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ Ｔ−１００（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１８８）中の、Ｄ−ソルビトールからの２−ＫＬＧの合成において、細胞質ゾルＬ−ソルビトール デヒドロゲナーゼによるＬ−ソルボースへのＤ−ソルビトールの変換では、膜結合Ｌ−ソルボース デヒドロゲナーゼによるＬ−ソルボソンへの変換のために細胞膜を横切り、細胞質の外へ輸送される中間体を生じる。それ故、続いての変換のため、膜を横切った内部膜の細胞質ゾル側から膜の外側への細胞質ゾル性中間体（基質）の輸送を増加させることを本発明は企図している。Ｓａｉｔｏ，Ｙ．，（１９９７）。
【００４４】
好適な態様は合成反応またはそれを含んでいる経路が単一の生物体内に存在することを含んでいるが、別の生物体が別の反応を行うことも本発明者により企図されている。例えば、グルコースから２−ＫＬＧ生成のための混合培養系において、中間体２，５−ＤＫＧへのグルコースの変換は一つの生物体内（アセトモナス、アセトバクター、グルコノバクターまたはエルウィニア）で起こるが、一方、その中間体の所望のアスコルビン酸中間体２−ＫＬＧへの変換は第二の生物体内（ブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウム）で起こる、Ｓｏｎｏｙａｍａ（１９７６）による米国特許第３，９６３，５７４号を参照されたい。また、Ｈｏｓｈｉｎｏ、米国特許第５，３１２，７４１号も参照されたい。
【００４５】
従って、合成反応は中間体を発生させてもよく、それ自身は細胞膜により分離された別の細胞位置で変換されてもよい。この態様においての最終生成物は、続いての反応の中間体基質であることができる。
律速段階を決定するための方法
２−ＫＬＧの産生において、内部細胞膜を横切る細胞質ゾル細胞位置への２，５−ＤＫＧ輸送増加の影響をみた一つの理由は、それが２−ＫＬＧへの２，５−ＤＫＧ変換の律速段階であることを発明者が認めたためである。そのような段階が律速段階かどうかの決定は、経路を分析し、各々の段階の産生を評価し、および２，５−ＤＫＧ存在の増加が経路の全産生の増加を生じるかどうかを確かめるため、経路による変換に利用可能な２，５−ＤＫＧ量を変化させることにより行われた。２，５−ＤＫＧの存在を増加させることが２−ＫＬＧの産生を促進することが決定されると、基質の輸送を増加させると２−ＫＬＧの産生が促進されるであろう。
【００４６】
律速段階の決定は、微生物の生産性を比較することにより確かめることができる。経路部分の律速状態を決定するための一つの方法は、特定の化学化合物の存在を増加させる前後に、経路の色々な時点での中間体生産性を比較することである。２，５−ＤＫＧレダクターゼをコードしているＤＮＡの過剰発現によりレダクターゼの存在を増加させても、２−ＫＬＧ産生の増加は生じなかった。図＿。しかしながら、細胞質ゾル中に存在する２，５−ＤＫＧ量の増加は、２−ＫＬＧ産生の増加を生じた。それ故、２，５−ＤＫＧ量の増加が２−ＫＬＧ産生においての律速段階であったことを発明者は認識した。
【００４７】
経路部分の律速状態を決定するための一つの方法は、特定の生物変換器の存在を増加させる前後に、経路の色々な時点での中間体生産性を比較することである。もし、中間体存在の増加または変換経路の過剰発現にもかかわらず、最終生成物産生の増加がなかったら、その工程は律速ではないであろうし、およびそれ故、合成反応に影響する特定酵素の過剰発現は促進された産生を生じないであろう。個々の中間体の量は種々の間接または直接手段により決定できる。間接手段は、ガス分圧のようなインライン測定による呼吸パラメーターの消費または生成（例えば、二酸化炭素生成、酸素消費）を測定することを含んでいる。中間体の直接測定は、Ｌａｚａｒｕｓ，Ａｎａｌｙｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ １５７，３６０−３６６（１９８６）およびそれに引用されている文献（それらは参照文献として本明細書に組み入れられる）に記載されているような、本分野では既知の種々の分析技術により達成でき、ペーパー、ガス、液体および薄層クロマトグラフィーならびに化学的および酵素的アッセイが含まれるが、それらに限定されるわけではない。Ｌａｚａｒｕｓ，１９８６、に特に示されているような高速液体クロマトグラフィー方法論は特に役に立つ。発明者により使用された一つの方法は、存在する化学化合物の分離および定量のため、Ｗａｔｅｒｓ ２６９０ ＨＰＬＣおよびＷａｔｅｒｓ ４１０示差屈折計を使用している（設定、溶離媒質として５０ｍＭ酢酸緩衝液（１ｍｌ／分の流速で）、およびＤｙｏｎｅｘ Ｉｏｎｐａｃ ＡＳ−１０イオン交換カラム（４ｘ２５０ｍｍ）を使用）。
【００４８】
ブロス中に産生された２−ＫＬＧの純度を決定するために発明者により使用された別の方法は全炭素分析によるものである。
従って一つの態様において、細胞外基質存在下で生成物の産生を測定することにより、基質を生成物へ変換できる任意の細胞中で輸送活性が測定できる。例えば、２，５−ＤＫＧレダクターゼを天然に発現している、または組換え的に発現している細胞において、細胞内２，５−ＤＫＧは２−ＫＬＧへ変換される。細胞外２，５−ＤＫＧが提供された場合に２−ＫＬＧを産生する細菌細胞の能力は、２，５−ＤＫＧ透過酵素の発現により細胞内へ２，５−ＤＫＧを輸送する、発現された透過酵素能力の指標であり、および、それ故２，５−ＤＫＧ透過酵素活性の指標である。細胞内２，５−ＤＫＧは、例えば、ＨＰＬＣまたは本分野で既知の他の高感度検出法を使用して検出できる。２，５−ＤＫＧの他の代謝産物もまた同様の方法により検出できる。
２，５−ＤＫＧ輸送体
輸送様式およびエネルギーカップリング機構に基づいて、４つの別個の型の機能的に特徴付けられた輸送システムが存在する。第一は細菌チャンネル蛋白質（ＴＣ＃１．Ａ）であり、それは膜貫通孔を利用するエネルギー非依存性促進拡散機構を経て輸送する。第二の輸送システム、促進体および／または二次輸送体（第二のクラス、ＴＣ＃２．Ａ）は輸送体の最も大きな部門を表している。第三の群、ＡＴＰ駆動一次活性輸送体は、能動取込および／または溶質押し出しのために、エネルギーカップリングの様式としてＡＴＰ加水分解を使用する。最後の群は、輸送の間にそれらの基質をリン酸化する輸送体の群から成っている（ＴＣ＃４．Ａ）。
【００４９】
二次ファミリーの内、クラスＩＩファミリーの最も大きなものは主促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）およびアミノ酸ポリアミンコリン（ＡＰＣ）ファミリー（ｒｅｉｚｅｒ ｅｔ ａｌ．）である。これらの二次輸送体ファミリーは３つの群にさらに分割できる（１）起プロトン形（ｐｍｆ駆動）、（２）起ナトリウム力（ｓｍｆ）−駆動、および（３）他のイオンまたは溶質駆動交換器。これらの輸送システムは溶質の単一、抗および／または共輸送を触媒する。二次活性輸送体は大腸菌、インフルエンザ菌、ピロリ菌、枯草菌、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍ．Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉで同定されている（Ｐａｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ ｌ９９８ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７７：５７３−５９２）。この範疇のすべてのメンバーは細菌特異的ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）の一部である。二次輸送体は典型的には多所性膜蛋白質であり、しばしば、ほとんど一次担体を含む１２のＴＭＳを持ち、エネルギーの化学形が基転置を駆動し、ほとんどのＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）スーパーファミリーメンバーがそうであるようにＡＴＰ−依存性システムであるか、または、糖取り込みおよびリン酸化のためのホスホリル供与体としてＰＥＰを使用するＰＴＳである。一次輸送体がＡＴＰを使用する（細胞からエネルギーを得ている）点で、二次輸送体は一次輸送体（ＡＢＣ輸送体）とは異なっている。加えて、ＡＢＣ輸送体の使用はより複雑な輸送体システムを必要とし、その一つは二つの疎水性の膜内在性ドメイン、および二つのＡＴＰ−結合ドメインから成っている（Ｈｏｓｉｅ，ｅｔ ａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００１）４０（６），１４４９−１４５９）。溶質の取り込みに関連しているＡＢＣ輸送体もまた溶質−結合蛋白質（ＳＢＰ）の存在を必要とする。それ故、改良されたＡＢＣ輸送システムの遺伝子工学は、二次輸送体の一つよりも複雑な性質の発現および形質転換を必要とするであろう。
【００５０】
一つの態様において、内部細胞膜を横切った基質の輸送を増加させるための少なくとも一つの蛋白質をコードしているＤＮＡは、アセトバクター、シュードモナス、バクテリウム、シアノコッカス、ミクロコッカス、ブレビバクテリウム、アルスロバクター、スタフィロコッカス、バチルス、コリネバクテリウム、アセトモナス、グルコノバクターおよびエルウィニアから選択される。好適な生物体は大腸菌、パントエアおよびクレブシエラから成る群より選択される。パントエアが宿主細胞として使用するために最も好適な生物体である。
【００５１】
特に有用な輸送体は、ｙｉａＸ２（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａから）、ｐｅ１およびｐｅ６（環境源から）、およびＰａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａからのｙｉａＸ２、ｐｅｒｍＡおよびｐｅｒｍＢによりコードされているものである。ｙｉａＸ２、ｐｅｒｍＡおよびｐｅｒｍＢ遺伝子は、エルウィニア、アセトバクター、グルコノバクター、大腸菌、アグロバクター、エルセニア、サルモネラ、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、アルスロバクター、ミクロコッカス、スタフィロコッカス、シュードモナス、バチルス、シトロバクターのような種々の細菌に見ることができる。種としてはＹｅｒｓｅｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｙｅｒｓｅｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒが含まれる。
【００５２】
本発明はＹｉａＸ２ポリヌクレオチド、ＰｅｒｍＡポリヌクレオチド、ＰｅｒｍＢポリヌクレオチド、Ｐｅ１ポリヌクレオチドおよびＰｅ６ポリヌクレオチドを提供し、それらは宿主細胞中で膜を横切った基質の輸送を増加させる少なくとも一つの酵素をコードしているＤＮＡとして使用することができる。ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６のポリヌクレオチド配列は、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６とＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ＹｉａＸ２のアミノ酸アラインメントを示している図１３および１４から決定できる。
【００５３】
本発明は、同族体が輸送を調節する（好適には、微生物中の基質の輸送を増加させる）ように機能できる蛋白質をコードしている限り、各々、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６と少なくとも６５％、７０％、８０％または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を持つ一つまたは多ポリヌクレオチドによりコードされていてもいなくても、各々、輸送体ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６をコードしているＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド同族体を包含している。当業者には理解されるであろうが、遺伝子コードの縮重のため、種々のポリヌクレオチド（即ち、ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド変異体）が因子ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６上のＰａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ輸送体をコードできる。本発明はすべてのそのようなポリヌクレオチドを包含している。
【００５４】
Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａおよび環境単離物ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６輸送体の微生物ポリヌクレオチド同族体は、ゲノムかまたはｃＤＮＡ起源の微生物核酸の核酸ハイブリダイゼーションにより同定できる。ポリヌクレオチド同族体配列は、宿主細胞細胞質ゾル物質内へ２，５−ＤＫＧを輸送する少なくとも一つのポリヌクレオチドをコードしているＤＮＡのプローブ、一部または断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出できる。従って、本発明は、ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６からの核酸配列の一部または全部と核酸試料をハイブリダイズさせることから成る、ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド同族体の検出法を提供する。
【００５５】
中間から最大のストリンジェンシー条件下、図１のＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ヌクレオチド配列の一部または全部にハイブリダイズできるＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれている。ハイブリダイゼーション条件はＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １５２，Ａｅａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡＬＩＦ．）（本明細書において参照文献として組み入れられる）に教えられているように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、定義された“ストリンジェンシー”は以下に説明するように与えられる。
【００５６】
“最大ストリンジェンシー”は典型的には約Ｔｍ−５度Ｃ（プローブのＴｍの５度Ｃ下）；“高ストリンジェンシー”はＴｍの約５度Ｃから１０度Ｃ下；“中ストリンジェンシー”はＴｍの約１０度Ｃから２０度Ｃ下；および“低ストリンジェンシー”はＴｍの約２０度Ｃから２５度Ｃ下で生じる。当業者には理解されるであろうが、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用でき、一方、中または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列同族体を同定または検出するために使用できる。
【００５７】
ここで使用される場合、用語“ハイブリダイゼーション”は、“核酸鎖と相補的鎖が塩基対を通して連結される過程”を含んでいる（Ｃｏｏｍｂｓ Ｊ（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．）。
【００５８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実施されるような増幅過程は、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ Ｃ Ｗ ａｎｄ Ｇ Ｓ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ Ｎ．Ｙ．）により説明されている。図１Ａ−１ＥのＰｅｒｍＡヌクレオチド配列からの少なくとも約１０ヌクレオチドおよび多くとも約６０ヌクレオチド、好適には約１２から３０ヌクレオチド、およびより好適には約２０−２５ヌクレオチドの核酸配列がプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用できる。
アミノ酸配列
図１に示したようなＰ．ｃｉｔｒｅａ ＰｅｒｍＡポリヌクレオチドはＰ．ｃｉｔｒｅａ ＰｅｒｍＡをコードしている。Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ｐｅｒｍＡ遺伝子は、４７８０１．９４ダルトンの計算分子量を持つ、４３６残基の一つの蛋白質を特定している。平均疎水性は０．６２であり、等電点は９．２４であった。ｐｅｒｍＡ蛋白質は１１の推定膜貫通へリックスを持つ、膜内在蛋白質である。これらのドメインは他の生物体からの、他の知られている輸送体蛋白質と著しい配列同一性を示しており、最も高い同一性はシュードモナスからのＫＤＧ輸送体蛋白質で観察された。図８Ｂに示したような３１残基の伸長は、ＰｅｒｍＡの１１９のグリシン（Ｇ）、１２２のグルタミン酸（Ｅ）、１２７のフェニルアラニン（Ｐ）、１３６のトリプトファン（Ｗ）、１３８のフェニルアラニン、１４１のグルタミン酸（Ｅ）および１４２のアルギニン（Ｒ）について、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ｐｅｒｍＡ輸送体蛋白質の残基に対応している高度に保存されたセグメントを示している。この高度に保存されたセグメントはアニオン：カチオン共輸送体（ＡＣＳ）ファミリー（Ｐａｏ，Ｓ．Ｓ．，１９９８）の保存残基と一致している、前記表３および４。図８ＢはＰｅｒｍＡの残基１１９から１４１に対応する保存領域を示している。推定膜貫通ドメイン（Ｉ−ＸＩ）は灰色の陰を付けて示されている。図８Ｂの膜貫通ドメインはＳＯＵＣＩプログラムにより決定された。
【００５９】
本発明の範囲内の輸送体には、Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａおよび環境源からのｙｉａＸ２、ｐｅｒｍＡ、ｐｅ１、ｐｅ６およびｐｅｒｍＢによりコードされているものが含まれる。ｙｉａＸ２、ｐｅｒｍＡ、ｐｅ１、ｐｅ６およびｐｅｒｍＢ遺伝子は、エルウィニア、アセトバクター、グルコノバクター、大腸菌、アグロバクター、エルセニア、サルモネラ、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、アルスロバクター、ミクロコッカス、スタフィロコッカス、シュードモナスおよびバチルスのような細菌の種々の種に見ることができる。
【００６０】
本発明はＹｉａＸ２ポリヌクレオチド、ＰｅｒｍＡポリヌクレオチド、Ｐｅ１ポリヌクレオチド、Ｐｅ６ポリヌクレオチドおよびＰｅｒｍＢポリヌクレオチドを提供し、それらは宿主細胞中で膜を横切った２，５−ＤＫＧの輸送を増加させる少なくとも一つの酵素をコードしているＤＮＡとして使用することができる。ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６のポリヌクレオチド配列は、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６とＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ＹｉａＸ２のアミノ酸アラインメントを示している図から決定できる。
【００６１】
本発明は、同族体が輸送を調節するように機能できる蛋白質をコードしている限り、各々、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６と少なくとも６５％、７０％、８０％または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を持つ一つまたは多ポリヌクレオチドによりコードされていてもいなくても、各々、輸送体ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６をコードしているＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド同族体を包含している。当業者には理解されるであろうが、遺伝子コードの縮重のため、種々のポリヌクレオチド（即ち、ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド変異体）が因子ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６上のＰａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ輸送体をコードできる。本発明はすべてのそのようなポリヌクレオチドを包含している。
【００６２】
Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａおよび環境単離物ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６輸送体の微生物ポリヌクレオチド同族体は、ゲノムかまたはｃＤＮＡ起源の微生物核酸の核酸ハイブリダイゼーションにより同定できる。ポリヌクレオチド同族体配列は、図［番号は？］に開示されているプローブ、一部または断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出できる。従って、本発明は、ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６からの核酸配列の一部または全部と核酸試料をハイブリダイズさせることから成る、ＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド同族体の検出法を提供する。
【００６３】
中間から最大のストリンジェンシー条件下、図１のＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ヌクレオチド配列の一部または全部にハイブリダイズできるＹｉａＸ２、ＰｅｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰＥ６ポリヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれている。ハイブリダイゼーション条件はＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １５２，Ａｅａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡＬＩＦ．）（本明細書において参照文献として組み入れられる）に教えられているように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、定義された“ストリンジェンシー”は以下に説明するように与えられる。
【００６４】
“最大ストリンジェンシー”は典型的には約Ｔｍ−５度Ｃ（プローブのＴｍの５度Ｃ下）；“高ストリンジェンシー”はＴｍの約５度Ｃから１０度Ｃ下；“中ストリンジェンシー”はＴｍの約１０度Ｃから２０度Ｃ下；および“低ストリンジェンシー”はＴｍの約２０度Ｃから２５度Ｃ下で生じる。当業者には理解されるであろうが、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用でき、一方、中または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列同族体を同定または検出するために使用できる。
【００６５】
ここで使用される場合、用語“ハイブリダイゼーション”は、“核酸鎖と相補的鎖が塩基対を通して連結される過程”を含んでいる（Ｃｏｏｍｂｓ Ｊ（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．）。
【００６６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実施されるような増幅過程は、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ Ｃ Ｗ ａｎｄ Ｇ Ｓ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ Ｎ．Ｙ．）により説明されている。図１のＰｅｒｍＡヌクレオチド配列からの少なくとも約１０ヌクレオチドおよび多くとも約６０ヌクレオチド、好適には約１２から３０ヌクレオチド、およびより好適には約２０−２５ヌクレオチドの核酸配列がプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用できる。
ＩＩ発現系
本発明は、細菌および酵母を含む微生物中での所望の異種または同種蛋白質の促進された産生および輸送のための発現系を提供する。
ａ．コード配列
本発明において、ベクターは輸送体をコードしている少なくとも一つのコピーを含み、好適には多コピーを含んでいる。好適な態様において、微生物はパントエアである。別の好適な態様において、微生物はクレブシエラである。一つの態様において、ｐｅｒｍＡ遺伝子を含むポリヌクレオチドがベクターを構築するために利用される。これらのポリヌクレオチドセグメントはｐｅｒｍＡより多くの数の残基を含むことができる。例えば、ｐｃｐ１、ｐｃｐ１０およびｐｃｐ３２は、Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａゲノムのオペロンまたはドメインであるヌクレオチド断片である。これらのヌクレオチドセグメントは各々、約９キロ塩基（ｋｂ）、１３ｋｂおよび６７ｋｂである。好適な態様において、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６をコードするポリヌクレオチドまたはそれらの断片、または融合蛋白質またはＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６のアミノ酸変異体をコードするポリヌクレオチド同族体配列は、グラム陽性宿主細胞において、各々ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６、またはそれらのアミノ酸変異体の発現を指示する組換えＤＮＡ分子を発生させるために使用することができる。一つの態様において、宿主細胞はアセトバクター、シュードモナス、バクテリウム、シアノコッカス、ミクロコッカス、ブレビバクテリウム、アルスロバクター、スタフィロコッカス、バチルス、コリネバクテリウム、アセトモナスおよびグルコノバクターから成る群より選択される。好適な宿主細胞はエシェリキア、パントエアおよびクレブシエラから成る群より選択される。Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａおよびクレブシエラは、宿主細胞として使用するために最も好適な生物体である。パントエアはまたエルウィニアとしても知られている。
【００６７】
当業者には理解されるであろうように、天然には存在しないコドンを持っているポリヌクレオチド配列を生成させるのが好都合であろう。例えば、発現速度を増加させるため、または、天然に存在する配列から生成される転写体よりも望ましい特性（より長い半減期のような）を持っている組換えＲＮＡ転写体を生成させるため、特定の宿主細胞により好まれるコドン（Ｍｕｒｒａｙ Ｅ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：４７７−５０８）が選択できる。
【００６８】
本発明に従って使用することができる、改変されたＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６ポリヌクレオチド配列には、同一のまたは機能的に等価なＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６同族体をコードするポリヌクレオチドを生じる、欠失、挿入または異なったヌクレオチド残基による置換が含まれている。ここで使用される場合、“欠失”とは、一つまたはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在しない、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列への変化として定義される。
【００６９】
ここで使用される場合、“挿入”または“付加”とは、天然に存在するグラム陽性ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６と比較し、一つまたはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加により生じたヌクレオチドまたはアミノ酸配列への変化である。
【００７０】
コードされた蛋白質もまた、沈黙変化を生み出す、および機能的に等価なグラム陽性ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６変異体を生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を示してもよい。変異体が輸送を調節する（好適には輸送を増加させる）能力を保持している限り、残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質に基づいて、計画的アミノ酸置換を行ってもよい。例えば、陰性に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；陽性に荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ；および類似の親水性値を示す非荷電極性頭部基を持つアミノ酸にはロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。
【００７１】
本発明のＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６ポリヌクレオチドは、遺伝子産物のクローニング、プロセッシングおよび／または発現を改変するために工学的処理することができる。例えば、本分野では既知の技術を使用して突然変異を導入することができる、例えば、コドン嗜好性を変えるために新しい制限部位を挿入する部位特異的突然変異。
【００７２】
本発明の一つの態様において、ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６ポリヌクレオチドを、融合蛋白質をコードしている異種配列と連結することができる。融合蛋白質はまた、ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６蛋白質が異種部分から切断および精製できるように、ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６ヌクレオチド配列および異種蛋白質配列間に位置する切断部位を含むようにも工学的処理することができる。
ｂ．ベクター配列
微生物中で本発明の輸送体の発現に使用される発現ベクターは、ＰｅｒｍＡ、ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１および／またはＰＥ６から成る群より選択される輸送体因子に関連する少なくとも一つのプロモーターを含んでおり、そのプロモーターは宿主細胞中で機能的である。本発明の一つの態様において、プロモーターは選択された輸送体の野生型プロモーターであり、本発明の別の態様において、プロモーターは輸送体に関しては異種であるが、宿主細胞中でなお機能的である。
【００７３】
所望の蛋白質またはポリペプチドをコードしている異種核酸に関係する追加のプロモーターは、組換えＤＮＡ技術により導入することができる。本発明の一つの態様において、宿主細胞は異種蛋白質またはポリペプチドを過剰発現でき、および、一つまたはそれ以上の輸送体をコードしている核酸は組換え的に導入される。本発明の一つの好適な態様において、基質の輸送を増加する少なくとも一つの蛋白質またはそれ以上の蛋白質をコードしている核酸は微生物ゲノム内へ安定に組み込まれるであろう。別の態様において、本発明の該宿主細胞内への該基質の輸送を増加させる一つまたはそれ以上の蛋白質をコードしているＤＮＡを過剰発現するように宿主細胞が工学処理され、異種蛋白質またはポリペプチドをコードしている核酸は組換えＤＮＡ技術により導入される。本発明は、当業者には既知である他の輸送体を過剰発現できる宿主細胞を包含しており、表１、２または３に同定されているもの、または当業者には既知の、または将来同定されるであろう他の輸送体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００７４】
好適な態様において、核酸操作を容易にするため、好適にはベクターに独特な少なくとも一つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含んだ多クローニング部位カセットを、発現ベクターは含んでいる。好適な態様において、ベクターはまた、一つまたはそれ以上の選択可能マーカーも含んでいる。ここで使用される場合、用語、選択可能マーカーとは、ベクターを含んでいる宿主の選択を容易にすることが可能で、グラム陽性宿主中で発現できる遺伝子を意味している。そのような選択可能マーカーには、エリスロマイシン、アスペクチノマイシン、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリンのような抗生物質が含まれるが、それらに限定されるわけではない。輸送体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：＿に示されたＤＮＡ配列と少なくとも９０％の相同性を持っている核酸によりコードされている態様もまた提供される。好適には、相同性は少なくとも９５％であり、より好適には少なくとも９８％である。相同性は、特許請求されたアミノ酸またはＤＮＡ配列と別の配列を並べ、全体のパーセンテージとしてどのくらい多くのアミノ酸または核酸が一致するかで決定される。相同性はまた、市販品として入手可能な配列分析ソフトウェアープログラムの一つ、例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）で利用可能なＴＦａｓｔＡ Ｄａｔａ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍを使用して決定できる。
【００７５】
ここに説明したようなハイブリダイゼーションを使用して、または縮重プライマーを用いるＰＣＲを使用して、相同性配列をスクリーニングできる。Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｓｕｔｔｌｅ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８（４）：６０９−６１０，６１２。
【００７６】
また、本発明のいくつかの態様において、ストリンジェント条件下、各々図およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：に示したＤＮＡまたはその断片とハイブリダイズできる核酸が提供される。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件には、当業者には知られているようなストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が含まれる。ハイブリダイゼーションおよび適切なストリンジェント条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、に記載されている。
輸送体蛋白質をコードしている形質転換ＤＮＡを持っている宿主細胞からの組換えペプチド産生を増加させる方法
一つの細胞位置から別の位置への基質輸送を増加させる特に強力な方法には、形質転換宿主細胞からの［代謝転換］ゲノムの欠失、および所望の基質の輸送を増加させるＤＮＡコード化の同時供給が含まれる。このことは、欠失される部分の代謝転換が最小化され、および輸送体能力部分が過剰発現される、欠失−輸送体キメラまたは融合蛋白質を細胞に提供することにより都合よく達成される。化学的−融合ポリペプチドまたはゲノムの組み替えた部位が一つの可能性であるが、組換え蛋白質がこの様式での使用に本来最も好適である。そのようなキメラで使用するための適切な透過酵素断片の同定は、上に説明されている。
【００７７】
これらの融合蛋白質の輸送部分に関しては、キメラに輸送能力を与える十分な一次配列情報を含む任意の透過酵素由来配列が、この状況で有用であろう。しかしながら、方法論に関してより直接的であるので、全輸送体酵素を使用するのがしばしば好適であろう。再び、適した輸送体またはその断片の同定を助けるため、種々の公表された文献中の利用可能な情報を広く探すことができる。
形質転換
本発明はまた、生物学的に活性なポリペプチドを産生する細胞の能力を増大または増加させることを企図しており、そのようなポリペプチドは基質を細胞の第一の位置から、膜を横切った細胞の第二の位置への輸送を増加させる。このことは、いくつかの例において、アニオン／カチオン共輸送体の二次輸送体（Ｓａｉｅｒ，１９８８）、一つの態様においてはアニオン／カチオンＨ＋共輸送体のような、追加の生物変換のため、別の細胞位置への基質輸送に関係する蛋白質を過剰発現することにより達成できる。本発明により企図された共輸送体の例には、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａおよびＰａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａからの透過酵素ＹｉａＸ２、ＰＥ１、ＰＥ６、ｐｅｒｍＡおよびｐｅｒｍＢが含まれる。
【００７８】
宿主細胞の生存性および生産の質、特にそれらの輸送能力の維持に関連する輸送体の発現は重要である。経路がＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ要求性反応である場合は、所望の経路による連続的生成を成功させるため、宿主細胞の連続した生存性が必要である。生物体の生存性を維持しながら過剰発現できる、多コピーまたはプロモーターの数を決定する時に、ある種の考慮および因子を心に留めるほうがよい。一般に、膜中に輸送体を取り込むために利用可能な空間が限られているので、輸送体の過大な発現は細胞には有害であろう。従って、一つの輸送体の非常に過大な発現は、培地からの他の栄養素の輸送に関係するであろう他の輸送体の膜中取込を減少させるであろう。細胞型特異的転写因子の過剰発現を工学処理することで、工学処理された宿主細胞の輸送体能力を増加または安定化できた。
【００７９】
細菌宿主細胞中でのＨ＋共輸送体の安定な過剰発現は、いくつかの目的の役に立つことになる。それは微生物の生存性を維持しながら、導入遺伝子発現を増加させる。共輸送体はＡＢＣ輸送体の多成分を大量にコード化する必要がないので、共輸送体の過剰発現はＡＢＣ輸送体の過剰発現よりも簡単である。第三に、ＡＴＰまたはＰＴＳカップル輸送の代わりに二次輸送体を過剰発現させることにより、宿主細胞からのエネルギー転換要求性が最小化される。
【００８０】
本発明の一つの態様において、本発明の一つまたはそれ以上の輸送体をコード化している核酸は、宿主細胞内で複製することができる発現ベクターを経て宿主細胞内へ導入される。パントエアのために適した複製プラスミドはＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（ここに参照文献として特別に組み入れられる）、に記載されており、パントエアが大腸菌と同じプラスミドの複製を維持しているという事実に基づいている。
【００８１】
別の態様において、一つまたはそれ以上の輸送体をコード化している核酸は微生物ゲノム内へ安定して組み入れられる。好適な宿主細胞はパントエア属からのものである。別の好適な宿主細胞はＫ．ｏｘｙｔｏｃａである。染色体内へのＤＮＡ組み込みのためのいくつかの戦略が文献に記載されている（例えば、Ｂａｌｂａｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ １７２：６５−６９；ＬｅＢｏｒｇｅ，ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｇｅｎｅ ２２３：２１３−２１９、を参照されたい）。
【００８２】
Ｐ．ｃｉｔｒｅａの形質転換は、大腸菌のために開発されたプロトコールを使用したエレクトロポレーション法により達成できる（Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．，１ ９８８，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：３６１−３７３）。
ＩＩＩ．形質転換体の同定
宿主内へＤＮＡを導入した後、形質転換体はベクター中にコード化された抗生物質耐性により、または、プラスミド内にコードされた機能で一般的に選択することにより選択される。形質転換体が非形質転換細胞から区別されたら、無傷の構造を持つプラスミドの存在が、標準プロトコールを使用して確認できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ，１９８９）。
【００８３】
ＹｉａＸ２、ＰｅｒｍＡ、ＰｅｒｍＢ、ＰＥ１およびＰｅ６ポリヌクレオチド配列の存在は、図１に開示されたようなポリヌクレオチド配列のプローブ、一部または断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出できる。
ＩＶ．輸送アッセイ
ＨＰＬＣ方法論による、アスコルビン酸中間体レベルを決定するための好適な方法が以前に議論されている。
【００８４】
加えて、当業者には幅広い種類の標識および結合法が知られており、種々の核酸およびアミノ酸アッセイで使用できる。特異的ポリヌクレオチド配列を検出するための、標識ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブには、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識または標識ヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が含まれる。もしくは、ヌクレオチド配列またはその任意の一部は、ｍＲＮＡプローブ生成のためのベクター内へクローン化することができる。そのようなベクターは本分野では既知であり、市販品として利用可能であり、および、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドの添加により、インビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用することができる。
【００８５】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）およびＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｏｈｉｏ）のような多くの会社がこれらの方法のための市販キットおよびプロトコールを供給している。適したレポーター分子または標識には、放射性同位元素、酵素、蛍光、化学発光または色素産生剤、ならびに基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などが含まれる。そのような標識の使用を教えている特許には、米国特許第３，８１７，８３７；３，８５０，７５２；３，９３９，３５０；３，９９６，３４５：４，２７７，４３７；４，２７５，１４９および４，３６６，２４１号が含まれる。また、組換え免疫グロブリンは米国特許第４，８１６，５６７号（本明細書に参照文献として組み入れられる）に示されているように生成することができる。
実施例
実施例１
材料および方法
ａ．プラスミド、細菌株および培地：プラスミドｐＢＣＬ１９２０、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ １３９２Ａ。Ｐ．ｃｉｔｒｅａ １３９２Ａ株は３９１４０であるＰ．ｃｉｔｒｅａ変異体である。ｐＤ９２はＤＫＧレダクターゼ遺伝子を含むベクターの表示に記載されている。米国特許第５，３７６，５４４号。マーフィＩＩＩ培地は、フルクトース０．５％、リン酸１．６％、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ０．２％、Ｓｏｙｔｏｎｅ ０．２％、クエン酸０．０１％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １％、ｐｐｍ範囲のＦｅ、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｚｎのような微量金属塩、およびニコチン酸、葉酸およびＢ１２のようなビタミンを含んでいる；Ｍ９培地、０．９％リン酸、０．１％ＮａＣｌ、０．１％ ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＳＯ４ ０．０００５％、ＣａＣｌ２ ０．０２５％；発酵培地、リン酸カリウム１％、ＭｇＳＯ４ ０．１５％、グルタミン酸１．５％、フルクトース２．５％、硫酸アンモニウム０．１％、およびビオチン、チアミン、ピリドキシン、リボフラビン、ニコチン酸、葉酸およびＢ１２を含むビタミン混合物、鉄、ＺｎおよびＭｎイオンを１０−１００ｐｐｍの範囲で含んでいる微量金属カクテル；輸送アッセイ培地、１００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ６．９；抗生物質、スペクチオマイシン５０μｇ／ｍｌおよびテトラサイクリン２０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ １００μＭ。
ｂ．ＤＮＡ技術
ｃ．細胞の増殖：組換え法および野生型Ｐ．ｃｉｔｒｅａおよびＫ．ｏｘｙｔｏｃａを使用して構築された株は、単一の炭素源としてＤＫＧを含んでいるＭ９培地かまたは単一の炭素源としてフルクトースを含むＭ ＩＩＩ培地、または０．１％から１％の範囲のフルクトース、グルコナートおよびＤＫＧのような混合炭素源を含んでいるＭ ＩＩＩで増殖させた。細胞は２０−３７℃の間で、しかし好適には３０℃以下で増殖させた。細胞は好適には中性ｐＨで、しかしｐＨ５−８を含む範囲で増殖させた。種フラスコから発酵槽で増殖させたＰ．ｃｉｔｒｅａ細胞は、フルクトースかまたはグルコース給餌を使用する発酵培地を使用した。
ｄ．ＤＫＧ取込生化学アッセイ：細胞を含んでいる発酵ブロス試料はそれぞれの増殖装置から引き出し、氷−水浴上で反応停止させた。発酵ブロスを遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットは０．９％氷冷食塩水を使用して洗浄し、続いてＤＫＧ取込アッセイ緩衝液、１００ｍＭ氷冷リン酸カリウム ｐＨ６．９、により２回洗浄した。細胞を同じアッセイ緩衝液に、５５０ｎｍでＯＤが１２になるように再懸濁し、室温で、または好適には２８℃でインキュベートした。ＤＫＧ取込アッセイは、細胞にＣ−１４濃縮放射線同位元素化２，５−ＤＫＧを混合することにより開始させた。ＤＫＧ取込の時間変化が、氷冷アッセイ緩衝液を使用する、真空／フィルターに基づいた反応停止を用いて追跡された。ＤＫＧ取込測定は細胞への放射性同位元素取込により行われ、得られたデータを時間に対してプロットすると、ＤＫＧ取込速度が得られる。
【００８６】
細胞ＤＫＧ取込および代謝研究に、シリコン油を使用する別のアッセイも実施された（Ｊｏｈｎｓｏｎ．Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１９８０，９５：４２９−４３９）。１００μｌのシリコン油をアッセイするばかりになったエピチューブに加えた。細胞および１４（Ｕ）濃縮２，５−ＤＫＧを混合し、規則的な時間間隔で細胞／基質混合物を引き出し、シリコン油を含んでいるエピチューブに加え、１５秒間遠心分離し、続いて直ちにドライアイス／エタノール浴で凍結した。５分後、細胞ペレットを含んでいるエピチューブのチップを直接切断してシンチレーションバイアル内へ落とした。チューブの残りは、凍結部分のすぐ上で再切断し、シンチレーション液を含んでいる別のバイアル内へ落下させた。エピチップから細胞ペレットが放たれるのを容易にするため、一夜たった後にカウントを測定した。上層からのカウント損失およびペレット中のカウント出現間の差は細胞代謝および放出されたＣＯ２によるものである。取込アッセイの終わりに、細胞を透過可能にした場合、低分子量細胞内容物が漏出し、蓄積された移入基質について、および代謝されて細胞成分になった基質についての情報が提供される。
【００８７】
ｅ．ＤＫＧレダクターゼアッセイ：各々の発酵槽から細胞ペレットを集め、−７０℃で約２４時間凍結した。１５および２５時間の時点でのペレットを氷上で融解し、５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５中でフレンチプレスした。抽出物はベンチトップ遠心分離器中、２分ｘ１４Ｋｒｐｍで回転し、続いて全蛋白質濃度およびレダクターゼ活性を測定した。すべての試料は、蛋白質のためのブラッドフォードおよびＢＣＡアッセイで測定し、正確な速度アッセイに必要とされるまで希釈した。アッセイは２，５−ＤＫＧ以外のすべてを含んでいるバックグラウンド速度（総計の速度の１０％未満であった）に対して測定された。緩衝液は：５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．５、１５０μＭ ＮＡＤＰＨおよび５ｍＭ ２，５−ＤＫＧを含んでいた。
【００８８】
細胞ＤＫＧ取込および代謝研究に、シリコン油を使用する別のアッセイも実施された（Ｊｏｈｎｓｏｎ．Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１９８０，９５：４２９−４３９）。１００μｌのシリコン油をアッセイするばかりになったエピチューブに加えた。細胞および１４（Ｕ）濃縮２，５−ＤＫＧを混合し、規則的な時間間隔（例えば、約１０秒毎）で細胞／基質混合物を引き出し、シリコン油を含んでいるエピチューブに加え、１５分間遠心分離し、続いて直ちにドライアイス／エタノール浴で凍結した。５分後、細胞ペレットを含んでいるエピチューブのチップを直接切断してシンチレーションバイアル内へ落とした。チューブの残りは、凍結部分のすぐ上で再切断し、シンチレーション液を含んでいる別のバイアル内へ落下させた。エピチップから細胞ペレットが放たれるのを容易にするため、一夜たった後にカウントを測定した。上層からのカウント損失およびペレット中のカウント出現間の差は細胞代謝および放出されたＣＯ２によるものである。取込アッセイの終わりに、細胞を透過可能にした場合、低分子量細胞内容物が漏出し、蓄積された移入基質について、および代謝されて細胞成分になった基質についての情報が提供される。
実施例ＩＩ
実施例ＩＩは基質の輸送が全細胞生物変換における律速といってもさしつかえない根拠を提供する。
【００８９】
この実施例は、四つの部分に区分化できる、グルコースからの２−ＫＬＧ形成の鍵となる工程を述べている（図５）。Ｐ．ｃｉｔｒｅａ中の三つのペリプラスム酵素を使用する。鍵となる中間体、２，５−ＤＫＧの生成は１４−１５ｇ／ｌ／ｈｒである（Ｓｏｎｏｙａｍａ，ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８２，４３：１０６４−１０６９）。第二の部分はＤＫＧが細胞の細胞質空間へ輸送されるのに必要な速度である。第三は、ＤＫＧレダクターゼを使用する２−ＫＬＧへのＤＫＧの変換速度である（米国特許第５，０３２，５１４号）。２−ＫＬＧへのＤＫＧの変換は、ＤＫＧレダクターゼが過剰発現されている場合は律速ではない。我々の現２−ＫＬＧ産生発酵の場合、ＤＫＧレダクターゼが構成的ｔｒｐプロモーター下にあるｐＤ９２を現在使用している、典型的な発酵と比較し、レダクターゼ特異的活性を増加および減少させることの両方に誘導可能なプラスミドが使用された。誘導可能プラスミド、ｐＤ２３は、ｔａｑプロモーターの下にあり、ＩＰＴＧで誘導できる。三つの発酵槽を、一つはｐＤ９２で、および二つはｐＤ２３（その一つはＩＰＴＧで誘導された）で稼働させた。対照ｐＤ９２および誘導ｐＤ２３はほぼ同一レベルの２−ＫＬＧを産生したが、一方、非誘導ｐＤ２３は著しく少なかった。レダクターゼ特異的活性のアッセイは、対照ｐＤ９２と比較して、非誘導プラスミドは半分以下のレダクターゼしか作っていなかったが、一方、誘導ｐＤ２３は２倍以上を作り出していたことを示した。これらの結果は、我々の２−ＫＬＧ産生Ｐ．ｃｉｔｒｅａ発酵におけるレダクターゼ活性レベルは２−ＫＬＧ産生の障害ではないことを示している。
実施例ＩＩＩ
実施例ＩＩＩは、生物変換のための細胞内への基質輸送速度が本当に律速段階にちがいないという証拠を提出している。
【００９０】
三つの異なった時点の発酵過程からの細胞ペレット、種フラスコ段階、フルクトース給餌段階およびグルコース給餌段階、を集め、実験の部で説明したように処理した。これらの細胞型を使用するＤＫＧ取込アッセイは、ＤＫＧをＫＬＧへ変換することをもたらす、０．５ｇ／ｌ／ｈｒ、２．７ｇ／ｌ／ｈｒおよび２．７５ｇ／ｌ／ｈｒＤＫＧ取込速度を与えた（図９）。ＤＫＧ移入の速度はＫＬＧ移出と同じである。それ故この結果は、ＫＬＧへのＤＫＧの生物変換速度は、細胞内への２，５−ＤＫＧ移入速度に依存していることを示している。それ故、本発明は、過剰発現によりＤＫＧ取込輸送体を増加させることが、２，５−ＤＫＧの移入速度を促進し、従って、２−ＫＬＧ産生速度を促進するであろうことを示すであろう。当業者は、全細胞変換法を使用し、種々の生物形質転換において鍵となる制限因子が、実際に生物形質転換のための、細胞内への基質の移入および移入速度であることを思い浮かべることができる。
実施例ＩＶ
実施例ＩＶはＤＫＧ取込アッセイを使用した、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ中の２，５−ＤＫＧ輸送体の発見を提供する。ＷＯ００２１７０は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａからのオペロンの同定および配列決定を記載しており（ｙｉａオペロンと称される）、それは８つの推定読み取り枠を含んでいる。ｙｉａオペロン中の個々の読み取り枠によりコードされているこれらのポリペプチドの機能は、ＷＯ００２１７０には記載されていない。このオペロンの破壊は、単一炭素源としてアスコルビン酸を使用するＫ．ｏｘｙｔｏｃａの能力を取り除いた。アスコルビン酸は酸化に不安定な物質であり、空気酸化により２，３−ＤＫＧへ分解することが知られている（Ｋｉｍａｙａ，Ｓ．，Ｊ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ，，１９６１，７：１９−２６）。２，３−ＤＫＧが増殖のための実際の基質であることを示唆するのは妥当であった。ｙｉａオペロン中の読み取り枠の一つ（ｙｉａＸ２と称される）は、輸送体型膜貫通蛋白質をコードしており、それ故、２，３−ＤＫＧ透過酵素の候補であると考えられた。２，５−ＤＫＧ透過酵素を発見する平行的研究を照らし合わせると、２，３−ＤＫＧおよび２，５−ＤＫＧは類似の分子であることが理解され、ｙｉａＸ２が２，５−ＤＫＧおよび２−ＫＬＧのような他の糖ケト酸を輸送することは可能であろう。
【００９１】
ｙｉａＸ２が，５−ＤＫＧおよび２−ＫＬＧを輸送できるかどうかを決定するため、この遺伝子をＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株Ｍ５ａ１の染色体から欠失させた（例えば、Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６８：１１７４−１１７７（１９７１）を参照されたい）。ｙｉａＸ２欠失変異体（ＭＧＫ００２と称される）は、本分野では既知の標準分子生物学プロトコールを使用して作り出された（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１７１：４６１７−４６２２（１９８９）を参照されたい）。Ｔｅｓｔｅｒ株と称される別のＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株はＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株ＭＧＫ００２に、プラスミド的にコードされている、およびｌａｃオペロン制御ｙｉａＸ２遺伝子を付加し戻すことにより作り出された。ＭＧＫ００２およびＴｅｓｔｅｒ株を使用する、＋／−ＩＰＴＧ下でのＤＫＧ取込アッセイから、ｙｉａＸ２が２，５−ＤＫＧ輸送活性を持っているポリペプチドをコードしていることが確認された（図９）。
実施例Ｖ
実施例Ｖは、微生物からの２，５−ＤＫＧ透過酵素をスクリーニングするための選択方法論を提供する。
【００９２】
ｙｉａＸ２遺伝子が２，５−ＤＫＧ輸送活性を持っている輸送蛋白質をコードしているという情報により、Ｐ．ｃｉｔｒｅａおよび他の生物源の２，５−ＤＫＧ輸送蛋白質を発見するための選択宿主を設計することが可能になった。ｙｉａＸ２遺伝子欠失および酵素を発現する遺伝子の付加を持つＫ．ｏｘｙｔｏｃａは２，５−ＤＫＧからグルコン酸への異化に関係しており、それは生物体の中枢代謝を評価可能である。２，５−ＤＫＧをグロン酸に異化できる酵素は、いくつかのグラム陰性生物体に存在する、ｔｋｒ ｉｄｎＤ ｉｄｎＯオペロンのｔｋｒおよびｉｄｎｏ遺伝子によりコードされている（Ｂａｕｓｃｈ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９８，１８０：３７０４−３７１０）。
【００９３】
得られたＫ．ｏｘｙｔｏｃａのｔｅｓｔｅｒ株はｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎｏ］であり、単一炭素源として２，５−ＤＫＧ上での増殖に必要とされるすべての成分を持っているが、但し、細胞質内へＤＫＧを移入する能力は持っていない。従って、２，５−ＤＫＧ透過酵素をコードする核酸分子は、ｔｅｓｔｅｒ株中での発現により、２，５−ＤＫＧ上で増殖するｔｅｓｔｅｒ株の能力を与えるべきである。この選択方法論は図９に示されている。
【００９４】
Ｐ．ｃｉｔｒｅａゲノムライブラリーを構築するために使用されたクローニングベクターはプラスミドｐＣｌ１９２０（Ｌｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９４，１８：４６２１）であり、スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性決定基を運んでいる低コピー数発現ベクターである。宿主に提供された場合、ｌａｃｌｑ遺伝子産物により抑制される，ｌａｃＰＯプロモーター／オペレーター領域により駆動される。Ｐ．ｃｉｔｒｅａ（ＡＴＣＣ３９１４０）からのゲノムＤＮＡは標準プロトコールを使用して単離し、ゲノムライブラリーを作製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２））。増幅されたライブラリーは、Ｐ．ｃｉｔｒｅａの２，５−ＤＫＧ透過酵素発見にさらに使用するため、プラスミドＤＮＡの形で保存した。
実施例ＶＩ
実施例ＶＩは宿主細胞中でＤＫＧ輸送体を過剰発現することにより、細胞中のＤＫＧ移入を促進できるという証拠を提供する。
【００９５】
ゲノムライブラリーをｔｅｓｔｅｒ株Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ ｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎｏ］株内へ導入した。２．５％２，５−ＤＫＧおよび０．１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＭ９寒天プレートを使用し、２，５−ＤＫＧ上で成長させたクローンは、放射標識１４Ｃ（Ｕ）ＤＫＧを使用してＤＫＧ取込を試験した。種々のクローンが対照ｔｅｓｔｅｒ株より改良されたＤＫＧ取込を持つことが観察された（図９）。これらの陽性クローンからのゲノムライブラリーＤＮＡでＰ．ｃｉｔｒｅａ（１３９−２Ａ）を形質転換し、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ １３９−２Ａ株よりもＤＫＧ取込が改良されていることを測定するため、ＤＫＧ取込アッセイが実施された。ゲノムライブラリースクリーニングおよび選択方法論を通して発見された、ＤＫＧ透過酵素をコードしているプラスミドの追加のコピーを持っている形質転換体中で、ＤＫＧ取込速度に３から５倍の改良がみられた（図１０）。
実施例ＶＩＩ
実施例ＶＩＩは宿主細胞中でＤＫＧ輸送体を過剰発現させることにより、２−ＫＬＧの産生を改良できることの証拠を提供している。Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ ＤＫＧ透過酵素ＰｅｒｍＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコードしている核酸分子が、グルコースから２−ＫＬＧの生合成に適したＰａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ株１３９−２Ａ内へ低コピーベクターｐＢＣＬ１９２０を使用してサブクローン化された場合（米国特許第５，０３２．５１４号）、２−ＫＬＧ産生の産生速度が２．５ｇ／ｌ／ｈｒから３．２ｇ／ｌ／ｈｒへ改良され、糖に対する収率が４５％から５３％へ改良された（図１１）。
実施例ＶＩＩＩ
実施例ＶＩＩＩはＰ．ｃｉｔｒｅａからのＤＫＧ透過酵素ＰｅｒｍＡの特性を記述している。
【００９６】
この実施例は、Ｐ．ｃｉｔｒｅａのＰｅｒｍＡの膜トポロジーを説明している。ＰＦＡＭ分析（Ｈｉｒｏｋａｗａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１９９８，４（４）：３７８）は、ＰｅｒｍＡは八つの一次ドメインおよび三つの二次貫通ドメインを持つ１１の膜貫通ドメインを持っている（図１２）。アミノ末端はペリプラスムにあり、カルボキシ末端は細胞質中に位置している。二つの主および２つの副ループが存在し、ペリプラスムおよび細胞質の両方が一つの主および一つの副ループを持っている。ＰｅｒｍＡは０．６２の疎水性を持つ膜蛋白質であり、４８ダルトンの分子量を持っている。集積比分析（Ｌｏｌｋｅｍａ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ １１，２２９−２６０）に基づくと、それは２，５−ＤＫＧのＨ＋関連共輸送体の一つである。共通配列分析（Ｐａｏ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９８，６２：１−３４）に基づくと、それはＭＦＳのＡＣＳファミリーに属している（図８ａ）。
【００９７】
本開示を読んだ後に、本発明の精神および範囲から離れることなく、前記の説明および例の種々の別例および変形が、当業者には明らかになるであろうが、そのような例または変形は付随する特許請求の範囲内に含まれているつもりである。本明細書で参照されたすべての報文および特許はその全体がここに組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａのＹｉａＸ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示している。ＰＥ１（環境透過酵素）；ＰＥ６（環境透過酵素）；Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａのＰｅｒｍＡ；Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａのＰｅｒｍＢ；Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａのＹｉａＸ２。
【図２】図２はグルコースからのアスコルビン酸前駆体２−ＫＬＧ生産のための合成経路を示している流れ図である。
【図３】図３はアスコルビン酸前駆体２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＬＧ）の合成経路を示している図である。
【図４】図４は、グルコースが２−ＫＬＧを得るようにたどることができる種々の合成経路を示している流れ図である。Ｂｏｕｄｒａｎｔ，Ｊ．，Ｅｎｚｙｍ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．，１９９０，１２，３２２−３２９。
図４ＡはＤ−ソルビトールから２−ＫＬＧへの合成経路を示している図であり、経路内の他の反応および細胞膜を横切った基質の輸送に関係する反応の細胞位置を示している。Ｓａｉｔｏ，Ｙ，ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．５８（２／３）：３０５−３１５（１９９８）。
【図５】図５はＤ−グルコースから２，５−ＤＫＧ、２−ＫＬＧの合成経路を示しており、経路内の他の反応および細胞膜を横切った各々の基質の輸送に関係する反応の位置を示している。
【図６】図６はＤＫＧ輸送速度とＫＬＧ産生速度を比較している線グラフであり、時間に対する２，５−ＤＫＧ取込量（ナノモル／ＯＤ６００）を示している（−◆−＝フルクトース給餌１３９−２ａ、０．０４８６ｘ＋０．６７；−▲−＝グルコース給餌１３９−２ａ、ｙ＝０．０４９７＋０．５８７７；−●−＝種フラスコ１３９−２ａ、ｙ＝０．００７５ｘ＋０．０５６７）。
【図７】図７はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ中のアスコルビン酸異化作用のｙｉａオペロン概略図である。
【図８】図８はシリコン油輸送アッセイにより測定された、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａによる２，５−ＤＫＧ取込量（ナノモル）を示しているグラフである（−◆−＝Ｔｅｓｔｅｒ＋イソプロピルβ−Ｄ＝チオガラクトピラノシド〔ＩＰＴＧ〕；−▲−＝ΔｙｉａＸ２＋ＩＰＴＧ；−黒四角−＝Ｔｅｓｔｅｒ−ＩＰＴＧ）。
【図９】図９はＰ．ｃｉｔｒｅａ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａおよび環境源から透過酵素を選ぶための選択計画を示している概略図である。
【図１０】図１０はＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株における２，５−ＤＫＧ取込活性を示している棒グラフである（ＹｉａＸ２、ｐｃｐ１、ｐｃｐ１０、ｐｃｐ３２、ｐＫ１、環境＃１および環境＃６）。
【図１１】図１１は２８度ＣでのＤＫＧ取込速度（ｇ／ｌ／ｈｒ）を測定することによる、同一のプラスミド構築物（ｐＢＣＬ１９２０）中に種々のＤＫＧ透過酵素（１３９−２Ａ、１３９−２Ａ＋ＰＣＰ３２；１３９−２Ａ＋ＰＣＰ１０；１３９−２Ａ＋ＰＫ１；１３９−２Ａ＋ＰＣＰ１および１３９−２Ａ＋ＰＥ６）を含んでいる振盪フラスコの２，５−ＤＫＧ取込アッセイを示している棒グラフである。９Ａ−９Ｂ
【図１２】図１２は、特異的生産性が過剰発現されたＤＫＧ透過酵素で増加することを示している線グラフである。特異的産生速度（ｇ／ｌ／ｈｒ）（−◆−＝野生型；−ｘ−＝ＷＴ、ｐｒｍＡ）。
【図１３】図１３は膜表面におけるＰｅｒｍＡ輸送体の概略図である。推定膜貫通ドメインはＩ−ＸＩと番号付けられている。保存残基の位置はボールド体で示されている。Ｎはアミノ末端であり、Ｃはカルボキシル末端である。Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ 透過酵素Ａ（ＳＥＱ ＩＤ：＿）の推定膜貫通ドメインはｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｆｒａｍｅ０．ｈｔｍｌ で利用可能な道具を使用して導き出された。
【図１４】図１４は残基Ｇ１１９から１４２に対応する保存アミノ酸配列である。
Claims (17)
- 宿主細胞の２−ＫＬＧ生合成的産生を促進する方法であって：
ａ）細胞質ゾルで２，５−ＤＫＧを２−ＫＬＧに変換する宿主細胞を選択し；
ｂ）宿主細胞の完全性を維持すると同時に該宿主細胞内への該２，５−ＤＫＧの輸送を増加させ；
ｃ）該２，５−ＤＫＧを産生するために宿主細胞を培養し；および
ｄ）２−ＫＬＧを産生することから成る方法。 - 該宿主細胞内へ該２，５−ＤＫＧの輸送を増加させることが、該宿主細胞の細胞質ゾル内へ該２，５−ＤＫＧを輸送する一つまたはそれ以上の蛋白質をコードしているＤＮＡで該宿主細胞を形質転換する工程を含んでいる、請求項１に記載の方法。
- 該一つまたはそれ以上の蛋白質がＹｉａＸ２、ＰＥ１、ＰＥ６、ｐｒｍＡおよびｐｒｍＢから成る群より選択される、請求項２に記載の方法。
- 該一つまたはそれ以上の蛋白質をコードしているＤＮＡが、ＹｉａＸ２、ＰＥ１、ＰＥ６、ｐｒｍＡおよびｐｒｍＢから成る群より選択されるゲノムから発現される、請求項２に記載の方法。
- 該蛋白質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：［共通配列］と［ストリンジェント］ハイブリダイゼーションできる、請求項２に記載の方法。
- 該蛋白質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：［共通透過酵素配列］と少なくとも５０％の相同性を持つ、請求項２に記載の方法。
- 該蛋白質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：［共通透過酵素配列］と少なくとも９０％の相同性を持つ、請求項２に記載の方法。
- 該蛋白質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：［全透過酵素配列］と少なくとも５０％の相同性を持つ、請求項２に記載の方法。
- 該蛋白質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：［全透過酵素配列］と少なくとも９０％の相同性を持つ、請求項２に記載の方法。
- 該蛋白質が３１残基を含む配列を含んでいる、請求項２に記載の方法であって、該残基はＰｅｒｍＡのグリシン１１９に対応するグリシン残基を含んでいる。
- 該蛋白質がさらにＰｅｒｍＡの１３６位に対応するトリプトファン残基（Ｗ）を含む、請求項１１に記載の方法。
- 該蛋白質がさらに、ＰｅｒｍＡのＧ１３８に対応する位置でのフェニルアラニン、ＰｅｒｍＡのＥ１４１に対応する位置でのグルタミン酸（Ｅ）、およびＰｅｒｍＡのＲ１４２に対応する位置でのアルギニン（Ｒ）から成る群より選択される少なくとも一つのアミノ酸残基を含む、請求項１１に記載の方法。
-
- 内部細胞膜を横切った細胞質ゾル内への２，５−ＤＫＧ輸送を促進させるための方法であって：
宿主細胞を選択し；および
該宿主細胞内へ２，５−ＤＫＧを輸送する一つまたはそれ以上の蛋白質をコードしているＤＮＡで該宿主細胞を形質転換することからなる方法。 - 該宿主細胞が細菌および酵母から成る群より選択される、請求項１４に記載の方法。
- 該宿主細胞が大腸菌、パントエアおよびクレブシエラから成る群より選択される、請求項１５に記載の方法。
- ２，５−ＤＫＧ輸送体を過剰発現する方法であって：
宿主細胞を選択し；および
一つまたはそれ以上の２，５−ＤＫＧ輸送体をコードしているＤＮＡで該宿主細胞を形質転換する工程から成る方法。
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