BG61524B1

BG61524B1 - Използване на бензотиофени за намаляване на холестерола в кръвта

Info

Publication number: BG61524B1
Application number: BG98317A
Authority: BG
Inventors: Larry Black; Henry Bryant; George Cullinan; Raymond Kauffman
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1993-12-21
Publication date: 1997-11-28
Also published as: HUT69686A; EP1238667A3; BR9305182A; KR940013501A; YU48918B; PL177349B1; US5464845A; MY109345A; NO934740L; JP3197129B2; DK0605193T3; DE69332735T2; YU79893A; SK279271B6; RO113806B1; PL301579A1; EP0605193B1; HU223342B1; RU2123335C1; ATE233559T1

Abstract

1. Използване на бензотиофени с формула, в която n има стойност 0, 1 или 2, R е хидроксил, метокси,С1-С7 алканоилокси, С3-С7 циклоалканоилокси, (С1-С6 алкокси)-С1-С7 алканоилокси, субституирани или несубституирани ароилокси или субституирани или несубституирани арилоксикарбонилокси, R1 е водород, хидроксил, халоген, метокси, С1-С7 алканоилокси, С3-С7 циклоалканоилокси, (С1-С6 алкокси)-С1-С7 алканоилокси, субституирани или несубституирани ароилокси или субституирани или несубституирани арилоксикарбонилокси, R2 е хетероцикличен пръстен, избран от групата, състояща се от пиролидино, пиперидино или хексаметиленимино, или техни фармацевтично приемливи соли, или солвати за намаляване на холестеролните нива в кръвта.

Description

(54) ИЗПОЛЗВАНЕ НА БЕНЗОТИОФЕНИ ЗА НАМАЛЯВАНЕ НА ХОЛЕСТЕРОЛА В КРЪВТА

Област на техниката

Изобретението се отнася до използване на бензотиофени за намаляване на холестерола в кръвта и ще намери приложение при ле- 10 чението на атеросклероза.

Предшестващо състояние на техниката

Клетките на всеки бозайник се нуждаят 15 от холестерол като структурен компонент на техните клетъчни мембрани. Обаче самото свойство, което прави холестерола полезен в клетъчните мембрани, неговата неразтворимост във вода, го прави също и потенциално летален. 20 Когато холестеролът се натрупа на неподходящо място, например върху стената на артерията, той не може да бъде нормално използван и неговото присъствие води до развитието на атеросклерозно петно. Доказано е, че по- 25 вишени концентрации на холестерол в кръвта, свързани с липопротеини с ниска плътност (LDL’S), са основен фактор, водещ до развитието на атеросклероза. Естроген, особено когато е приеман орално, намалява плазмените 30 нива на LDL и увеличава тези на благоприятните липопротеини с висока плътност (HDL’S). Обаче продължителната терапия с естроген се свързва с множество нарушения, включително нарастване риска от рак на стомаха и веро- 35 ятно рак на гърдата и това кара много жени да избягват това лечение. Наскоро предложени терапевтични режими, целта на които е да намалят риска от раково заболяване, такива като комбинирано прилагане на прогестерон и 40 естроген, причиняват нежелани кръвоизливи на пациентите. Освен това комбинирането на прогестерон с естроген изглежда притъпява свойството на естрогена да намалява холестерола в кръвта. Значителните нежелателни 45 ефекти на естрогенната терапия увеличават нуждата от търсенето на алтернативни терапии на хиперхолестеролемия, които дават желания ефект върху серумния LDL, но не водят до нежелани ефекти. 50

Опитите да се изпълнят тези изисквания чрез използването на съединения, позна ти като антиестрогени, които взаимодействат с естрогенния рецептор и/или заемат така нареченото антиестрогенно място (AEBS), имат ограничен успех, вероятно поради факта, че тези съединения най-общо проявяват смесен агонистичен/антагонистичен ефект и са предмет на същите неблагоприятни ефекти, свързани с естрогенната терапия.

Изобретението осигурява методи за намаляване на серумните LDL нива без свързаните с това неблагоприятни ефекти от естрогенната терапия и така осигурява ефективно и приемливо лечение на хиперхолестеролемия.

2-фенил-З-ароилбензотиофеновите съединения с формула I, които са активен компонент в методите на това изобретение, са от група съединения, за първи път изобретени от С.David Jones u Tulio Suares като противозачатъчни средства (1). По-късно Jones открива група от тези съединения, включваща съединенията с формула I от това изобретение, като полезни при антиестрогенна и антиандрогенна терапия, по-специално при лечението на тумори на гърдата и простата (2). Едно от тези съединения, съединението с формула I, в която η е 0, R и R¹ са хидроксилна група, a R²е пиперидинов пръстен, е клинично изпробвано за кратко при лечение на рак на гърдата. Това съединение се нарича ралоксифен (с предишно наименование кеоксифен).

Техническа същност на изобретението

Изобретението осигурява нов метод за намаляване на холестеролните нива в серума, състоящ се в прилагане на съединения с формула I

в която η е 0,1 или 2, R е хидроксилна група, метокси, С^-С, алканоилокси, С₃-С₇циклоалканомлокси, (C^Cj алкокси)-0,-С, алканоилокси, субституирани или несубституирани ароилокси или субституирани или несубституирани арилоксикарбонилокси групи, R¹ е водород, хидроксил, халоген, метокси, С,2

II lllll . I

C₇ алканоилокси, C₃-C₇ циклоалканоилокси, (С,-С₆ алкокси)-С]-С₇ алканоилокси, субституирани или несубституирани ароилокси или субституирани или несубституирани арилоксикарбонилокси групи, R² е хетероцикличен 5 пръстен, избран от групата, състояща се от пиролидинов, пиперидинов или хексаметилениминов пръстен, или фармацевтично приемлива сол или съответния солват, за пациенти, нуждаещи се от по-ниски холестеролни нива 10 в серума.

Изобретението осигурява използването на съединение с формула I или фармацевтично приемливи соли, или съответни солвати за получаване на медикаменти, полезни за на- 15 маляване на холестеролните нива в серума.

Общите химически термини, използвани в описанието на съединението с формула I, имат общоприети значения. Например терминът “алкил” сам по себе си или като част от друг заместител означава алкилов радикал с права или разклонена верига, имащ съответен брой въглеродни атоми, като метил, етил, пропил, и изопропил и по-висши хомолози и изомери, където е отбелязано. Терминът “алкокси” означава алкилова група, имаща съответния брой въглеродни атоми, свързани с кислороден атом като метокси, етокси, пропокси, бутокси, пентилокси и хексилокси група и също включва разклонени верижни структури, като например изопропокси и изобутокси група.

Терминът “Ц-Ц-алканоилокси” означава група -0-C(0)-R, в която R* е водород или С,-С₆ алкил и включва формилокси, ацетокси, пропаноилокси, бутаноилокси, пентаноилокси, хексаноилоксигрупи и подобни, и също включва изомери с разклонена верига, такива като 2,2-диметилпропаноилокси и 3,3диметилбутаноилокси.

Аналогично терминът “С₄-С₇ циклоалканоилокси” означава група -0-С(0)-(С₃-С₆циклоалкил), в която С₃-С₆ алкиловата група включва циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклохексил.

Терминът “ (С₍-С₆-алкокси) -С₁-С₇-алканоилокси” означава група -0-C(0)-R^b-0-(C1-C6 алкил), в която R^b е връзка (С1-С₆ алкоксикарбонилокси) или С,-С₆ алкандиил и включва например метоксикарбонилокси, етоксикарбонилокси, пропоксикарбонилокси, бутоксикарбонилокси, метоксиацетокси, метоксипропаноилокси, метоксибутаноилокси, метоксипен20 таноилокси, метоксихексаноилокси, етоксиацетокси, етоксипропаноилокси, етоксибутаноилокси, етоксипентаноилокси, етоксихексаноилокси, пропоксиацетокси, пропоксипропаноилокси, пропоксибутаноилокси и подобни.

Терминът “несубституиран или субституиран ароилокси” означава група -0-С(0)арил, в която арил е фенилова, нафтилова, тиенилова или фурилова група, така че всяка група е несубституирана или моносубституирана с хидроксил, халоген, С]-С₃ алкил или С₍С₃ алкокси заместител.

Терминът “несубституиран или субституиран арилоксикарбонилокси” означава група -0-С(0)-0-арил, в която арил е фенилова, нафтилова, тиенилова или фурилова група, така че всяка група е несубституирана или моносубституирана с хидроксил, халоген, C^Cj алкил или С₇-С₃ алкокси субституент.

Терминът “хало” означава хлор, флуор, бром или йод.

Изобретението се отнася до откритието, че избрана група 2-фенил-З-ароилбензотиофени от съединенията с формула I са полезни за намаляване холестеролните нива в серума. Методите на лечение, осигурени от изобретението, се състоят в прилагане на съединения с формула I или присъединителна фармацевтично приемлива киселинна сол или солват на пациент, нуждаещ се от по-ниски холестеролни нива в серума. Методът включва медицинска терапия и/или профилактично лечение. Най-общо съединението се комбинира с общи инертни пълнители, разтворители или носители и се пресова във вид на таблетки или се прави като тинктури или разтвори за подходящо орално използване, или се прилага мускулно или венозно. Съединенията могат да бъдат прилагани подкожно и са много подходящи за формулировки с продължително освобождаване на дозата и други подобни. Бензотиофените с формула I намаляват холестеролните нива в серума при животните и би трябвало да се използват със същото предназначение и при хората. Излишък на холестерол в серума може да доведе до множество отклонения, включващи липса на ендогенен естроген, каквато се появява при жени след спиране на менстурацията в резултат на естествени, хирургически или други процеси и при пациенти с гонадална дисгенеза.

Бензотиофените с формула 1№ са серия нестероидни съединения, които проявяват висок афинитет към конвенционални е строгенни рецептори в първични полови тъкани. Обаче те предизвикват минимална естрогенна реакция в тези тъкани и всъщност служат като потенциални антагонисти на естествени естрогени, такива като естрадиол. Обратно на други структурно определени антиестерогенни съединения бензотиофените с формула I са способни да неутрализират класическите естрогенни реакции в първични полови тъкани, докато предизвикват естрогенна реакция на серумните холестеролни нива. Тази дихотомия показва сеелективни агонистични/антагонистични действия спрямо специфични експериментални клетки, които са силно желани при лечението на хиперхолестеролемия. Така изобретението осигурява метод за намаляване холестеролните нива в серума, състоящ се в прилагането спрямо пациент на определено количество съединение с формула I, което намалява серумните LDL нива, но не влияе значително на първичните полови експериментални тъкани. Тази комбинация от свойства позволява продължително лечение на хронични заболявания с малък риск от развитие на нежеланите ефекти при обичайната терапия на естрогенно заместване.

Биологичното действие на бензотиофените с формула I е сложно и може да не е свързано с откриваемото присъствие на основното съединение в кръвта. След орално приложение на предпочитан бензотиофен от това изобретение, ралоксифен (приложен като хидрохлорид) спрямо хора в клиниката, основното съединение не е открито в техния серум. Установено е, че след орално приложение съединението изцяло приема глюкоронидирана форма. Въпреки че не са измерени биологични крайни точки на човешките реципиенти, счита се, че съединението не е биологически достъпно.

За да се разреши въпросът с биологичната достъпност, са осъществени експерименти с лабораторни животни, при които може да се достигне биологична активност. Изследванията с животни показват, че ралоксифенът е максимално активен при инхибиране, както при стомашно поемане на “tritiated’’-естрадиол, така и при нормална утеротропна реакция на естрадиол дори при условия, където ралоксифенът изцяло се свързва с плазмата на животните. Освен това конюгатът, изолиран от урината на хора, третирани с ралоксифен, показва значителна антиестрогенна/антиутеротропна активност при прилагането му венозно върху плъхове и подтиска взаимодействието на “tri5 tiated - естрадиол със стомашните естрогенни рецептори на плъха по начин, подобен на основното съединение при температури, достигащи физиологични условия. Тъй като тези съединения не се свързват при 4°С, от тези изследвания се предполага, че конюгираното съединение може да е било превърнато в основната форма на мястото на действието, вероятно под действието на β-глюкуронидаза. Такова превръщане може да допринесе за активността на съединението, β-глюкуронидазата е повсеместно разпространена и следователно достъпна за превръщане на конюгираното съединение в основната форма, ако е необходима активност. Следователно конюгирането на бензотиофените с формула I не се счита за непременно вредно за тяхната биологична достъпност.

Така методът за лечение съгласно изобретението се провежда чрез прилагане спрямо пациент на такова количество от съединение с формула I или фармацевтично приемлива сол или солват, което е ефективно за намаляване на холестеролните нива в серума. Конкретна полза от този метод е, че се избягват потенциални вредни или неприемливи естрогенни старнични ефекти. Методът включва медицинска терапия и/или профилактично лечение, както е необходимо.

Методът също включва прилагането на съединение с формула I и естроген, както в комбинация, така и поотделно. Терминът естроген, както е използван тук, се отнася до което и да е съединение, приближаващо се по свойства до тези на естествената молекула на 17β-ecτpaдиoл. Примери на такива съединения включват естриол, естроп, етинил естрадиол, Премарин (търговски препарат от конюгирани естрогени изолирани от натурални суровини - Ayerst) и подобни. Поради избирателните агонистични/антагонистични свойства на съединенията с формула I тази комбинация осигурява предимствата на естрогенната терапия без съпътстващите неблагоприятни ефекти на естрогенната терапия, прове50 дена самостоятелно.

Предпочитани методи от това изобретение включват използването на съединения с формула I, в която η с О, a R u R_t са независимо едно от друго хидроксил, Ц-С, алканоилокси, (С,-С₆ алкокси)-С,-С₇ алканоилокси, несубституирани или субституирани бензоилокси или несубституирани или субституирани феноксикарбонилокси. По-нататък предпочитани методи включват използването на съединения с формула I, в която R и R₇ са еднакви. Определени R₂ групи показват предпочитани характеристики, когато се използват в методите от изобретението. Например, предпочитани методи от това изобретение включват използването на съединения с формула I, в която R₂ е пиперидино или пиролидино. По-специално предпочитани са тези съединения, при които R₂ е пиперидино или пиролидиногрупи и R₍ са хидроксилни групи. Най-предпочитано съединение с формула I е ралоксифен.

Съединенията с формула I и техните фармацевтично приемливи соли могат да бъдат получени в съответствие с известни процедури, като тези в (1 и 2).

Съединенията с формула I образуват присъединителни соли с множество органични и неорганични киселини и основи и включват физиологично приемливи соли, които често се използват във фармацевтичната химия. Такива соли са също част от изобретението. Типични неорганични киселини, използвани за образуването на такива соли, са хлороводородна, бромоводородна, йодоводородна, азотна, сярна, фосфорна, хипофосфориста и подобни. Могат също да бъдат използвани соли получени от органични киселини, такива като моноалифатни и дикарбоксилни киселини, фенил-субситиурани алканови киселини, хидроксиалканови и хидроксиалкандио киселини, ароматни киселини, алифатни и ароматни сулфонови киселини. Типични соли са ацетат, фенилацетат, трифлуорацетат, акрилат, аскорбат, бензоат, хлоробензоат, динитробензоат, хидроксибензоат, метоксибензоат, метилбензоат, о-ацетоксибензоат, нафтален-2-бензоат, бромид, изобутират, фенилбутират, β-хидроксибутират, бутин-1,4-диоат, хексин-1,4-диоат, капринат, каприлат, хлорид, цинамат, цитрат, формиат, фумарат, гликолат, хептаноат, хипурат, лактат, малат, малеат, хидроксималеат, малонат, манделат, мезилат, никотинат, изоникотинат, нитрат, оксалат, фталат, терафталат, фосфат, монохидрогенфосфат, дихидрогенфосфат, метафосфат, пирофосфат, пропиолат, пропионат, фенилпропионат, салицилат, себацат, сукцинат, суберат, сулфат, бисулфат, пиросулфат, сулфит, бисулфит, сулфонат, бензол-сулфонат, р-бромофенилсулфонат, хлоробензолсулфонат, етансулфонат, 2-хидроксиетансулфонат, метансулфонат, нафтален-1сулфонат, нафтален-2-сулфонат, р-толуолсулфонат, ксиленсулфонат, тартарат и подобни.

В допълнение, някои от съединенията с формула I могат да образуват солвати с вода или органични разтворители, като етанол. Тези солвати също се предвижда да бъдат използвани в методите от изобретението.

Основи, обикновено използвани за образуване на соли, са амониев хидроокис и алкални и алкалоземни метални хидроокиси, карбонати и бикарбонати, както и алифатни и ароматни амини, алифатни диамини и хидроксиалкиламини. Основи, по-специално използвани при получаването на присъединителни соли ,са амониев хидроокис, калиев карбонат, натриев бикарбонат, калциев хидроокис, метиламин, диетиламин, етилен диамин, циклохексиламин и етаноламин.

Фармацевтично приемливите соли найобщо имат повишена разтворителна способност, сравнена със съединението, от което те произлизат, и затова често са по-податливи към образуване на течни състави или емулсии.

В друг аспект изобретението осигурява метод за получаване на фармацевтичен състав, който се състои в смесване на съединение с формула I или фармацевтично приемлива сол или солват, получени по познат начин, с подходящи инертни носители и довеждане на сместа до фармацевтична рецептура, подходяща за използване при намаляване на холестеролните нива в серума.

Изобретението също предлага фармацевтичен състав, подходящ за намаляване на холестеролните нива, включващ съединение с формула I като активен компонент или фармацевтично приемлива сол или солват.

Фармацевтични състави могат да бъдат получени по известни начини. Например, съединенията, самостоятелно или в комбинация с естроген, могат да бъдат в съставите заедно с инертни пълнители, разтворители или носители и получени под формата на таблетки, капсули, суспензии, прахове и други подобни. Примери за инертни пълнители, разтворители и носители, удобни за такива състави,

включват: пълнители като нишесте, захар, манитол, силициеви деривати, свързващи агенти като карбоксиметил целулоза и други целулозни деривати, алгинати, желатин и поливинилпиролидон, овлажнавящи агенти като глице- 5 рол, разделящи агенти като агарагар, калциев карбонат и натриев бикарбонат, агенти, забавящи разтварянето, като парафин, резорбционни ускорители като кватернерни амониеви съединения, повърхностно активни вещества като цетилов алкохол, глицеролов моностеарат, адсорбционни носители като каолин и бентонит, смазващи вещества като талк, калциев и магнезиев стеарат и твърди полиетилгликоли.

Съединенията, самостоятелно или в комбинация с естроген, също така представляват състави под формата на тинктури и разтвори за удобно орално приложение или разтвори, подходящи за парентерална употреба, например по мускулен, подкожен и венозен път. В допълнение съединенията, самостоятелно или в комбинация с естроген, могат да представляват състави със забавено освобождаване на дозата. Съставите могат да бъдат така направени, че да освобождават активния компонент само или предимно в определен част на червния тракт, по възможност след известно време. Покритията, обвивките и защитните форми могат да бъдат направени от полимерни вещества или восъци.

Конкретната доза от съединението с формула I, необходима за намаляване на холестеролните нива в серума, съгласно изобретението зависи от строгостта на условието, пътя на приложение и свързани с тях фактори. Общоприети и ефективни дневни дози са от около 0,1 до около 1000 mg, по-конкретно от около 50 до около 200 mg. Такива дози се прилагат

Капсули на пациент, нуждаещ се от лечение от един до около три пъти всеки ден или по-често, ако е необходимо по-ефективно намаляване на холестеролните нива в серума. Общоприети и ефективни дневни дози естроген са от около 0.01 до около 4.0 mg, по-специално от около 0.1 до около 2.0 mg. Такива дози се прилагат на пациент, нуждаещ се от лечение от един до около три пъти дневно или по-често, ако е необходимо.

Методът от изобретението е полезен както за мъже, така и за жени. Значителната липса на естрогенна реакция позволява на мъжете да ползват това изобретение, без да се забелязва характерната женска реакция към естроген или естрогенни агонисти като гинекомастия. Методът по-специално е полезен за жени, за предпочитане жени с по-ниско съдържание на естроген. По-ниското съдържание на естроген може да бъде естествен резултат, например след менопаузата или след хирургична намеса. Пациентите, подложени или които са били подложени на продължително лечение с кортикостероиди и тези, имащи гонадална диегеназа, могат също да ползват метода съгласно изобретението.

Обикновено се предпочита да се прилага съединение с формула I под формата на киселинна присъединителна сол, както е прието при използването за лекарства с базова група, такава като пиперидинов пръстен. За предпочитане е такова съединение да се прилага по орален път на възрастни хора (т.е. жени след менопаузата).

По-долу са изложени примери на дози за орално приложение, използвани в изобретението. (“Активен компонент” означава съединение с формула I).

Твърди желатинови капсули се получават по един от съставите 1 до 5.

Състав 1.

Компонент	Количество (mg/капсула)
Активен компонент Нишесте, NF Нишестен прах Силиконова течност, 350 сантистокса	0.1 - 1000 0 - 650 0 - 650 0 - 15

II lllllil . I

Компонентите се смесват, пресяват се през US сито № 45 меша и се напътват в твърди желатинови капсули.

Състав 2.

Компонент	Количество (mg/капсула)
Ралоксифен хидрохлорид	1
Нишесте, NF	112
Нишестен прах	225.3
Силиконова течност, 350
сантистокса	1.7

Състав 3.

Компонент	Количество (mg/капсула)
Ралоксифен хидрохлорид	5
Нишесте, NF	108
Нишестен прах	225.3
Силиконова течност,350
сантистокса	1.7

Компонент	Количество (mg/капсула)
Ралоксифен хидрохлорид	10
Нишесте, NF	103
Нишестен прах	225.3
Силиконова течност, 350
сантистокса	1.7

СъставЛ5.

Компонент	Количество (mg/капсула)
Ралоксифен хидрохлорид	50
Нишесте, NF	150
Нишестен прах	397
Силиконова течност,
350 сантистокса	3.0

_______, , —...... ______ · _______, .... ... · ,.~rf . ... ч.-- ·» >ν - _ίΓ·.

...... ,JUH.r«L·.

Таблетки

Таблетки се получават, като се използват състави 6 или 7.

Съставб.

Компонент	Количество (mg/таблетка)
Активен компонент Целулоза, микрокристална Силициев диоксид, изпарен Киселинен стеарат	0.1 - 1000 0 - 650 0 - 650 0 - 15
Компонентите се смесват и се пресоват, за да се получат таблетки. Таблетките, всяка от които съдържа 0.1	- 1000 mg активен компонент, могат също така да се получат по следния начин.

СъставТ.

Компонент	Количество (mg/таблетка)
Ралоксифен хидрохлорид Нишесте Целулоза, микрокристална Поливинилпиролидон (като 10% воден разтвор) Натриева карбоксиметилцелулоза Магнезиев стеарат Талк	0.1 - 1000 45 35 4 4.5 0.5 1
Активният компонент, нишестето и целулозата се пресяват през U.S. сито № 45 меша и се смесват добре. Разтворът на поливинилпиролидона се смесва с получените прахове, които са пресята през U.S. сито № 14 меша, Така получените гранули се изсушават при 50°	- 60°С и пресяват през U.S. сито № 18 меша. Натриевото карбоксиметилово нишесте, магнезиевият стеарат и талкът, пресята преди това през U.S. сито № 60, се добавят към гранулите, които след смесване се пресоват машинно, за да се получат таблетки.

Суспензии

Суспензии, съдържащи 0.1 - 1000 mg лекарство на 5 ml доза, се получават както следва.

Състав_8.

Компонент	Количество (количество/5гп1)
Активен компонент	0.1 - 1000 mg

II IIJIIII . I

Натриева карбоксиметил-
целулоза	50 mg
Сироп	1.25 mg
Бензоена киселина, разтвор	0.10 ml
Ароматизант	q.v.
Оцветител	q.v.
Пречистена вода	до 5 ml

Лекарството се пресява през U.S. сито № 45 меша и се смесва с натриева карбоксиметилцелулоза и сироп, за да се образува гладко размесена паста (без бучки). Разтворът на бензоена киселина, ароматизанта и оцветителя се разреждат с малко вода и се прибавят при разбъркване. След това се добавя достатъчно вода, за да се получи исканият обем.

Примерни съединения с формула I, използвани в методите на изобретението, са по15 казани в таблицата.

Таблица

1 IptiMep No.	n	R	20 R¹	R2	Сол
1.	0	-OC(O)^L^F	-OC(0)0-F	nuncpuguno
2.	0	-oc(0)Of	-oc(0)Of	nuncpuguno	HC1
3.	0	-OC(O)N	-OC(O)N	nuncpuguno
4.	0	-OC(O)N	-OC(O)N	nunepuguno	HC1
5.	0	-ОС(О)СН₂СН₂СНз	-OQ£))CH₂CH₂CH₃	nuncpuguno
6.	0	-ОС(О)СН₂СН₂СНз	-OC(O)CH₂CH₂CH₃	nunepuguno	HCl
7.	(1	-OC(O)C(CH₃)₃	-ОС(О)С(СН₃)₃	nuncpuguno
8.	0	-OC(O)C(CH₃)₃	-ОС(О)С(СН₃)₃	nunepuguno	HC1
9.	0	-ОС(О)СН₂С(СН₃)₃	-ОС(О)СН₂С(СН₃)3	nunepuguno
10. 11.	0 0	-ОС(О)СН9С(СН₃)₃ -ОС(О)€>СНз	-ОС(О)СНтС(СН₃)₃ -ОС(О)Ш>СНз	nuncpuguno nuncpuguno	HC1
12.	0	-ОС(О)С>СНз	-0С(0)ОсНз	nuncpuguno	HC1
13.	0	-oc(O)4J>	-oc(O)-Q	nunepuguno
14.	0	-ОС(0)ОСН₂СН₂СН₂СН_Я	-OQO)OCH₂CH₂CH₂CHt	nunepuguno
15.	0	-ос(О)оа i₂ch₂ch₂ch_s	-ОС(0)(ХД1₂СН₂СН₂СНз	nunepuguno	HC1
16.	0	-ОС(О)СГ©	-oc(O)o-Q	nunepuguno
17.	0	-ос(о)ож2>	-oc(O)o~G	nunepuguno	HC1
18.	0	-О-С(О)	-О-С(О)	nunepuguno
		to	to
19.	0	-ОС(О)СН₂СН₂ОСН₃	-ОС(О)СН₂СН₂ОСН₃	nunepuguno
20.	0	-ОС(О)СН₂СН₂ОСНз	-ОС(О)СН₂СН₂ОСНз	nunepuguno	HC1
1.	0	-ОН	-ОН	nunepuguno	HC1
22.	0	-ОН	-ОН	nunepuguno
23.	1	-ОН	-ОН	nunepuguno	HC1
24.	0	-ОН	-ОН	nupOAuguiio
25.	0	-ОН	-ОН	пиролидипо	HC1
26.	0	-ОН	-ОН	хексаметиле	HC1
				нимипо
27.	0	-ОСН₃	-осн₃	nunepuguno	HC1
28.	0	-ОС(О)СН₃	-ОС(О)СН₃	nunepuguno	HC1
29.	0	-осн₃	н	пиролидипо	цитрат
30.	0	-ООНз	-ΟΟΗ₃	пиролидипо	цитрат
31.	0	-ос(0)-0	-oc(O)-Q	nunepuguno	HCl
32.	0	-ОН	Cl	nuncpuguno	HC1
33.	0	-ОН	F	nuncpuguno	HCl

Следващите тримерни тестове илюстрират методите на изобретението.

Тестова процедура

В примерите се използва модел след менопаузата, по който се определят ефектите от различни лечения на циркулиращи липиди.

От лабораториите Charles River (Portage, MI) се получават женски плъхове Spraque Dawley на възраст 75 дни (тегло вариращо от 200 до 225 g). Животните се подлагат или на двустранна овариектомия (OVX), или една седмица преди получаването им са били подложени на хирургичната процедура Sham в лабораториите Charles River. След пристигането им те се настаняват в метални закачени клетки в групи от 3 или 4 във всяка клетка и им се дава ad libitum достъп до храна (калциево съдържание приблизително 0.5%) и вода за една седмица. Стайната температура се поддържа 22.2° ± 1.7°С при минимална относителна влажност 40%. В стаите се поддържа 12 h светло и 12 h тъмно.

Дозиране/Тъканна колекция. След една седмица аклимитизационен период (т.е. две седмици след-OVX) започва дневно дозиране с тестваното съединение. Всички съединения се прилагат орално в дози 1 ml/kg телесно тегло, ако не е указано друго. Подкожно се прилага 17 Естрадиол в 20% полиетиленгликолов разтворител: 17 α-етинил естрадиол и изпитваното съединение се дават орално, ако не е указано друго, като суспензия в 1 % карбоксиметилцелулоза или 20% циклодекстрин. На животните се дават дневни дози в продължение на 4 дни. Следвайки режимът на дозиране, животните се претеглят и анестезират със смес кетамин: Ксилазинова смес (2:1, V:V) и чрез сърдечна пункция се взима кръвна проба. Всяко животно се умъртвява чрез задушаване с С0₂; отстранява се матката чрез изрязване и се определя веднага теглото.

Холестеролен анализ. Кръвните проби се оставят да се съсирят при стайна температура за 2 h и след центрофугиране за 10 min при 3000 об./min се получава серум. Серумният холестерол се определя чрез високо надеждния холестеролен анализ на Boehringer Mannheim. Накратко, холестеролът се окислява до холест-

4-ен-З-он и водороден прекис. Водородният прекис взаимодейства с фенол и 4-аминофеназон в присъствието на пероксидаза, за да се получи р-хинон иминово оцветяване, което се ана- лизира спектрофотометрично при 500 nm. Холестеролната концентрация се изчислява по стандартна крива. Цялото изчисляване се автоматизира чрез използването на автоматизирана работна станция Biomek.

Анализ на стомашната еозинофилова пероксидаза (ЕРО).

Стомахът се съхранява при 4°С до настъпване на времето за ензимен анализ. Стомахът се хомогенизира в 50 части от 50 mmol Tris буфер (pH -8.0), съдържащ 0.005% Triton Х-100. След прибавяне на 0.01% водороден прекис и 10 mmol о-фенилендиамин (крайни концентрации) в Tris буфера се наблюдава увеличаване на абсорбцията за 1 min при 450 nm. Присъствието на еозионофили в стомаха е признак за естрогенна активност на съединението. Максималната честота за 15 секунден интервал се определя по началната, линейна част на реакционната крива.

Източници на съединенията: 17 а-естрадиол, 17 β-етинилестрадиол и тамоксифенът се получават от Sigma Chemical Co., St.Louis, МО.

Експериментални групи.

Всички експериментални групи се състоят от 5 или 6 животни.

Влияние на ралоксифена върху серумния холестерол.

Резултатите от контролните експерименти са представени в таблица 1. Най-общо, овариектомията при плъховете причинява увеличаване на серумния холестерол в сравнение с контроли, изцяло третирани с разтворител. Естроген, използван орално под формата на етинил естрадиол (ЕЕ₂), причинява намаляване на серумния холестерол в зависимост от дозата, но той има също стимулираща функция върху стомаха, като неговото тегло достига това на незаразен плъх, на който е приложена доза 100 pg/kg/ден. Отчитат се усреднени резултати от 5 до 6 плъха ± стандартната грешка от усредняването.

При тези изследвания ралоксифенът, приложен като хидрохлоридна сол, също причинява намаляване на серумния холестерол в зависимост от дозата. Наблюдава се само минимално увеличаване на стомашното тегло при тези животни спрямо контролите с овариектомия. Ефектите от ралоксифна са показани в таблица 2. Всяка точка отразява поведението на 5 до 6 плъха съответно и описва ти10

It 1И . I пична крива на техните реакции към дозата отразени усреднено стандартната грешка от на ралоксифена в този модел. Резултатите са усредняването.

Таблица 1

	Серумен холестерол (mg/gl)	Стомашно тегло (mg стомах/g телесно тегло)	ЕРО активност (m OD/min)
Овариеоктомиен контрол (0.3 ml СМС)	81.3 ± 13.4	0.48 ± 0.04	5 + 2
Пълен контрол (0.3 ml СМС)	72.6 ± 14.6	1.70 ±0.12	216 ± 32
EEjO.l mg/kg	46.5 ± 5.8	1.45 ± 0.08	366 ± 17

Таблица 2

	Серумен холестерол (mg/gl)	Стомашно тегло (mg стомах/g телесно тегло)	ЕРО активност (m OD/min)
Овариеоктомиен контрол (0.3 ml СМС)	87.5 ± 8.1	0.45 ± 0.02	4.8 ± 1.6
ЕЕ₂ 0.1 mg/kg	8.1 ± 1.6	1.01 ± 0.03	295.1 ± 32.5
Ралоксифен 0.01 mg/kg	57.5 ± 6.9	0.54 ± 0.04	6.6 ± 1.4
Ралоксифен 0.10 mg/kg	35.3 ± 3.2	0.54 ± 0.04	5.8 ± 0.6
Ралоксифен 1.00 mg/kg	31.6 ±3.4	0.56 ± 0.04	7.2 ± 2.0

Ралоксифенът се прилага като хидрохлоридна сол, сам или в комбинация със 17β-εοтрадиол. Плъховете, третирани само с ралоксифен, имат стомашни тегла, максимално по-големи от овариектомиините контроли и много по-малки от тези на плъховете третирани със 17Р-естрадиол и достигащи тези на целите кон40 тролни плъхове. Обратно, лечението с ралоксифен значително намалява серумния холестерол в овариектомиините плъхове. Когато се дава в комбинация със 17 β-естрадиол, 17βестрадиолът не намалява забележимо ефективността на ралоксифена върху серумния холестерол. Резултатите са показани в таблица 3.

Таблица 3

Експеримент А	Серумен холестерол (mg/dl)	Стомашно тегло (mg стомах/g телесно тегло)	ЕРО активност (m OD/min)
Овариеоктомиен контрол (0.3 ml СМС)	47.8 ± 8.2	0.62 ± 0.04	8 ± 2
Пълен контрол (0.3 ml СМС)	48.6 ± 7.3	2.25 + 0.14	245 ± 27
17 β-естрадиол 0.1 mg/kg	39.6 ± 4.6	1.41 ± 0.04	403 ± 55
17 β-естрадиол 0.1 mg/kg + Ралоксифен 10 mg/kg	19.3 ± 4.3	0.99 ± 0.04	83 ± 31
Ралоксифен 10 mg/kg	25.6 ± 7.1	0.68 ± 0.04	2 ± 1

Способността на ралоксифена да намалява серумния холестерол е сравнена с тази на тамоксифена (SIGMA, St. Louis, Mo). Тамоксифенът, добре известен антиестроген, понастоящем използван при лечението на определени туморни заболявания, е показал, че намалява серумния холестерол (3) .Прилагат се орално поредица от дози ралоксифен и тамоксифен при оваректомиини плъхове, както при предишното изследване.

Въпреки че двата агента показват способност да намаляват серумния холестерол, предизвиквайки само умерена утеротропна активност, установена чрез нарастване на стомашното тегло, сравнението на няколко хистологични параметъра демонстрира определено различие между плъховете, третирани с тези агенти. Данните са показани в таблица 4 и 5 по-долу.

Увеличаването дебелината на епитела е признак на естрогенността на терапевтичните агенти и може да бъде свързано с увеличаване разпространението на рак на стомаха. Когато ралоксифенът се прилага както е описано погоре, не е установено статистически увеличение дебелината на епитела при овариектомиините контроли. Този резултат констатира с резултатите, наблюдавани при тамоксифен и естроген. При всички приложени дози тамоксифенът увеличава дебелината на епитела толкова, колкото при незаразен плъх. Лечението с естрадиол увеличава дебелината на епитела до дебелина, по-голяма от тази при незаразен плъх.

Естрогенността също се оценява по ответната реакция на еозинофиловата инфилтрация в матката. Ралоксифенът не предизвиква каквото и да е увеличаване на броя еозинофили в съединителната тъкан на овариектомиините плъхове, докато тамоксифенът предизвиква значително увеличаване. Както се очаква, естрадиолът предизвиква голямо увеличаване на еозинофилната инфилтрация.

Забелязва се малка разлика или липса на такава между ефектите от ралоксифена и тамоксифена върху дебелината на съединителната тъкан и миометрията. И двата агента предизвикват увеличаване на тези измервания, много по-малко от ефекта от естроген. Обобщението за естрогенност, което се изразява от всичките четири параметъра, показва, че ралоксифенът е значително по-малко естрогенен от тамоксифена.

Таблица 4

	Серумен холестерол (mg/dl)	Стомашно тегло (mg стомах/g телесно тегло)	ЕРО активност (m OD/min)
Овариеоктомиен контрол (0.3 ml СМС) ЕЕ₂ 100 pg/kg Ралоксифен 1 mg/kg Тамоксифен 1 mg/kg	61.4 ± 3.6 9.1 ± 2.0 35.8 ± 4.1 36.5 ± 2.8	0.42 ± 0.05 0.93 ± 0.08 0.54 ± 0.03 0.76 ± 0.04	4.3 ± 0.2 155.6 ± 45.4 5.0 ± 0.6 130.4 ± 31.4

Таблица 5

	Дебелина на епитела	Еозинофили в съедин.тькан	Миометрийна дебелина	Разширяване на съедин.тькан
Овариеоктомиен контрол (0.3 ml СМС)	1.24	1.00	4.42	10.83
Пълен контрол (0.3 ml СМС)	2.71	4.17	8.67	20.67
ЕЕ₂100 pg/kg	3.42	5.17	8.92	21.17
Ралоксифен 1 mg/kg	1.67	1.17	5.42	14.00
(подкожно) Тамоксифен 1 mg/kg (подкожно)	2.58	2.83	5.50	14.17

Други съединения с формула I се прила- маление на серумния холестерол, процентно гат орално на експерименталния плъх, описано 35 увеличение на стомашното тегло и ЕРО активпо-горе. Таблица 6 показва ефектът от 1 mg/kg ност, а таблица 7 показва ефектите от варирадоза от няколко съединения, в процентно на- щи дози от съединения 32 и 33 в тези проби.

Таблица 6

Съединение от пример No	% Намаление на серумния холестерол *	% Увеличение на стомашното тегло⁶	ЕРО активност (m OD/min) в
8	64.4	49.2	9.1
10	71.9	45.3	4.3
12	75.6	41.6	4.6
13	69.7	35.9	5.5
16	80.2	43.9	3.1
17	55.2	7.1	8.2
22	75.6	38.1	4.6

23	49.5	87.5	16.3
24	73.0	48.9	9.5
25	81.6	10.6	16.4
26	64.1	53.8	5.6
27	32.9	58.0	-
30	15.6	4.5	1.9
31	68.0	38.6	5.2

* Процент намаление на серумния холестерол се равнява на (серумния холестерол на подложени на OVX животни минус серумния холестерол на неподложени на OVX животни) , разделено на (серумния холестерол на OVX животни), умножено по 100%.

⁶Процент увеличение на стомашното тегло се равнява на (стомашно тегло на подложени на OVX животни минус стомашно тегло на неподложени на OVX животни), разделено на (стомашното тегло на OVX животни), умножено по 100%.

* Vmax на еозинофилната пероксидазна активност

Активност на съединение номер 32.

Таблица 7

Съединение от пример №	Доза (mg/kg)	% Намаление на серумния холестерол *	% Увеличение на стомашното тегло^{1 * * * * 6}	ЕРО активност (m OD/min)’
ЕЕ2	0.1	89.7	164.1	144.5
32	0.1	32.3	56.6	8
32	1	69.9	46.3	8.8
32	10	65.0	39.0	6
33	0.1	33.8	10.9	3.5
33	1	46.0	37.7	11.4
33	10	41.3	66.8	8.9

¹ Процент намаление на серумния холестерол се равнява на (серумния холестерол на подложени на OVX животни минус серумния холестерол на неподложени но OVX животни), разделно на (серумния холестерол на

OVX животни), умножено по 100%.

⁶ Процент увеличение на стомашното тегло се равнява на (стомашно тегло на подложени на OVX животни минус стомашно тегло на неподложени на OVX животни), разделено на (стомашното тегло на OVX животни), умножено по 100%.

’ Vmax на еозинофилната пероксидазна активност.

Claims

Патентни претенции

1. Използване на бензотиефени с формула I

II пиши . I в която п е 0,1 или 2, R е хидроксил, метокси С^С, алканоилокси, С₃-С₇ циклоалканоилокси, (С,-С₆ алкоксЮ-С^С, алканоилокси, субституирани или несубституирани ароилокси или субституирани или несубституирани арилоксикарбонилокси, R¹ е водород, хидроксил, халоген, метокси, C_t-C₇ алканоилокси, С₃-С₇ циклоалканоилокси, (С₍-С₆ алкокси) -С,С₇ алканоилокси, субституирани или несубституирани ароилокси или субституирани или несубституирани ароилокси или субституирани или несубституирани арилоксикарбонилокси, R²e хетероцикличен пръстен, избран от групата, състояща се от пиролидино, пиперидино, или хексаметиленимино, или техни фармацевтично приемливи соли или сол вати за намаляване на холестеролните нива в кръвта.
2. Приложение на ралоксифен или съ- ответната фармацевтично приемлива сол за намаляване на холестеролните нива в серума при хора.
3. Приложение на ралоксифен хидрох-

5 лорид за намаляване на холестеролните нива в серума при хора.
4. Фармацевтичен препарат, предназначен за намаляване на холестеролните нива в серума при хора, характеризиращ се с това, че

10 включва съединение с формула I, както е дефинирано във всяка от претенциите от 1 до 3.