BG60544B1

BG60544B1 - Antiviral and antibacterial preparation and method for its usage

Info

Publication number: BG60544B1
Application number: BG91270A
Authority: BG
Inventors: Witold Kiczka
Original assignee: Nika Health Products Ltd
Priority date: 1988-05-26
Filing date: 1990-02-22
Publication date: 1995-08-28
Also published as: DK16890D0; ATE93143T1; FI900412A0; YU109289A; DK173078B1; JPH03504121A; ZA893382B; AU1940888A; EP0380484B1; IL90092A; HUT54060A; LV10054A; US5200182A; US5466449A; CA1335425C; WO1989011294A1; HK42394A; HU883981D0; EP0380484A1; ES2011577A6

Description

Област на техниката

Настоящото изобретение се отнася до нов антивирусен и антибактериален състав, включващ полимеризирани ензими, заедно с фармацевтично приемлив носител, и метод за използването му.

Предшестващо състояние на техниката

Нарастващият брой бактериални щамове и вирусни заболявания, резистентни на антибиотици, изискват въвеждането на нови видове лекарства за лечение на хора и животни. Известно е използването на ензими в мономерна форма за лечение на пациенти, болни от различни заболявания. Ензимите са каталитично активни протеини, които осигуряват болшинството жизнени процеси в организма. Повечето от тях, поотделно или в комбинация, са изолирани поради техния физико-химичен, физиологичен или биохимичен ефект.

От различните ензими, с изразен терапевтичен ефект, са известни лизозимът и рибонуклеазата. Лизозимът е открит през 1922 г, от Флеминг. Едва след 1950 г обаче са установени ензимните му функции. Оттогава това вещество е обект на интензивни физикохимични, физиологични, и клинични изследвания, но степента на неговата биологична значимост ще бъде определена за в бъдеще. Лизозимът е изследван за различни терапевтични свойства, като антивирусно, антибактериално, противовъзпалително и антихистаминно. Проявеният антибактериален ефект се основава на хидролизата на β -1-4-гликозидната връзка между N-ацетилмураминовата киселина и N-ацетилглюкозамин, и двете съдържащи се в бактериалната стена.

Наличието на лизозим във фагоцитите е също описано. Изследванията в тази област сочат, че вътреклетъчният лизозим, съдържащ се в лизозимите, предизвиква смилане на фагоцитната бактерия. У хората се наблюдава стимулиращо действие на лизозима върху фагоцитозата, при физиологична концентрация от 10 до 400 mg/ml.

Установени са и други свойства на лизозима, например, намаляването на телесната температура при инфекциозен процес, където температурата се явява отговор на ендо генните пирогени, отделени от токсините. Установено е също, че лизозимът взима участие в имунологичните процеси чрез стимулиране синтезата на γ -глобулините, опсонините и др. антитела. Предполага се, че лизозимът има силно антивъзпалителен ефект.

Независимо от тези известни полезни свойства на лизозима, независимо от многото изследователски проекти и производството на фармацевтични продукти, на базата на лизозима, използването на този ензим за терапевтични цели е твърде ограничено.

Друга група ензими, изследвани за биологичните им свойства, са рибонуклеазите, които са намерени в много растителни, животински и бактериални клетки. Изучаването на техните свойства и изследването на методите за изолирането им започва през 1955 г от Шмид и Мак Доналд. В данните за този ензим се установява, че в туморните тъкани активността на рибонуклеазите е значително редуцирано. Открито е, че левкеизогенните вируси драстично намаляват активността на киселата рибонуклеаза у мишки. Също така, при мишки с вирусна левкемия, е установено значително намаление в активността на киселата рибонуклеаза в митохондриите и в микрозомните фракции, добити от далачната тъкан на същите животни.

Цитираните по-горе изследвания сочат, че намаляването на активността на рибонуклеазите е тясно свързано с инфекциите, причинени от вируса. Предполага се, че рибонуклеазните ензими да проявяват известна антивирусна активност. Не са известни средства, използващи ензими като антивирусен агент.

Една от главните причини потенциално полезните ензими да нямат конкретно терапевтично приложение, е наблюдаваният цитотоксичен ефект на мономерната им форма. В тестовете с култивирани фибробласти се наблюдава цитотоксичен ефект за лизозимните и рибонуклеазни мономери дори и в малки количества. Потенциалните полезни ефекти от посочените ензими, могат да се постигнат, ако се създаде ефективен път за контролиране на цитотоксичния ефект. Поради това е необходимо да се създаде средство на базата на лизозим, рибонуклеаза или други подобни ензими, което ефективно да се използва за лечение на вирусни или бактериални заболявания без цитотоксични ефекти, нормално наб2 людавани при ензимите в мономерна форма.

Техническа същност на изобретението

Съгласно настоящото изобретение се установява, че антивирусен или антибактериален състав, съдържащ като активен ингредиент лизозим, рибонуклеаза, както и други ензими, които не проявяват цитотоксични ефекти, може да бъде получен чрез използване на димерна форма на ензимите. Чрез изготвяне на средства, съдържащи като активен ингредиент лизозим или рибонуклеаза в димерна форма и фармацевтично подходящ носител, повечето от инфекциозните заболявания могат да бъдат задоволително лекувани без забележим цитотоксичен ефект.

Антивирусното и антибактериално средство, съгласно изобретението, може да бъде изготвено, като първо се получат лизозим и рибонуклеаза в техните мономерни форми. Лизозимните /Каталог № 28260/ и рибонуклеазните мономери/Каталог № 34388/, използвани при изготвянето на състави съгласно настоящото изобретение, са получени от Serva Feine Biochemica, Gmbh und Cooperation, D 69000, Heidelberg. Тези ензимни мономери могат да бъдат полимеризирани в димери по който и да е обичаен метод, известен от нивото на техниката. В частност, предпочитана е ензимната полимеризация, провеждана по Carlsson et al, Biochem. Journal, 173:723-737 (1978). Могат да бъдат използвани също други методи, като описаните от Sorrento et al, Eur. J.Bioch., 124:183-9 (1982). Установено бе също, че един изключително полезен рибонуклеазен димер, който може да бъде използван в състави съгласно изобретението, е димерът, получен от панкреатична рибонуклеаза А, изолирана от животинска панкреатична тъкан.

Средствата, съдържащи като активен компонент лизозим или рибонуклеаза в димерна форма и фармацевтично подходящ носител, са ефективни при лечение на различни бактериални и вирусни заболявания без забележим цитотоксичен ефект. Този потенциален вреден ефект на ензимите е изследван в паралелни изпитания, при прилагане и на двете форми -мономерна и димерна на лизозима и рибонуклеазата. В изследванията, различни концентрации от мономери и димери на лизозима и рибонуклеазата се използват за третиране на фибробластни култури от GMK /green monkey kidney/. Установено е, че лизозимът в мономерна форма предизвиква цитотоксичен ефект у фибробластите след 24 часа при концентрация 0,1 и 1,0 mg/ml. След тридневно инкубиране се наблюдава цитотоксичен ефект у фибробластите дори при концентрация 0,01 mg/ml, който засяга 50 % от инкубираните клетки. След пет дни 75 % от култивираните клетки са засегнати от цитотоксичната активност на лизозимния мономер при концентрация от 1,0 и 0,1 mg/ml. Същевременно, лизозимният димер не проявява цитотоксичен ефект при каквато и да е концентрация, използвана в този тест на изследване, дори след седемдневен период. Тези изследвания показват, че димерната форма на лизозима е приблизително 100 пъти по-малко токсична за GMK фибробластите в сравнение с мономерната форма.

Изследването на рибонуклеазата доказва аналогично отсъствие на цитотоксичен ефект на димерната форма. Рибонуклеазата проявява цитотоксичност спрямо GMK фибробластите на петия ден от култивирането при ниски концентрации, стигащи до 0,0001 mg/ml. След седемдневно култивиране, цитотоксичният ефект на рибонуклеазните мономери при концентрация от 0,01 mg/ml и повече елиминира 100 % от култивираните клетки. Рибонуклеазните димери обаче не показват цитотоксичен ефект при каквато и да е концентрация на GMK фибробластите, дори и при седемдневно инкубиране. Така бе установено, че рибонуклеазната димерна форма е 1000-10 000 пъти помалко токсична за фибробластите от мономерната форма. Тези изпитвания показват, че цитотоксичният ефект съпровожда нормално използването на мономерната форма на ензимите лизозими и рибонуклеаза и може да се елиминира, ако ензимите се прилагат в димерната им форма.

По-нататъшните изследвания показват, че независимо от отсъствието на забележим цитотоксичен ефект, лизозимите и рибонуклеазата в тяхната димерна форма могат да са ефективни при лечение на вирусни и бактериални инфекции. В теста, включващ оплодени кокоши яйца и щам на Sendai вирус, лизозимните димери се инжектират интраамниотично в яйцата в различни концентрации. Във всяко яйце се инжектира също и две единици от Sendai вируса. След инкубиране, амниотична3 та и алантоичната течност се събират от инфектираните и контролните яйца и се сравняват. Тези тестове показват, че лизозимните димери са способни да инхибират репликацията на Sendai вируса у култивирани в продължение на 10 дни оплодени яйца, дори при концентрация по-ниска от 0,01 mg/ml. Подобни тестове, използващи лизозима и рибонуклеазата в димерните им форми имат бактериостатичен ефект на тези димерни ензими спрямо бактериални щамове Streptococcus.

Средствата, съставени от лизозим и рибонуклеаза в димерна форма в съответствие с изобретението, поради това могат да бъдат използвани за лечение на различни вирусни и бактериални инфекции. Те могат да се изготвят в различни форми и приложението им е вътрешно или външно, в зависимост от заболяванията на пациентите, хора или животни.

За вътрешни заболявания, например ушни инфекции, мастити, стоматити, инфекции на стомашния и вагиналния тракт, димерната композиция съгласно изобретението може да бъде приготвена и приложена орално, интравенозно, парентерално във вид на супозитории или по всеки друг начин, позволяващ димерният разтвор да достигне инфектираната област. За външни приложения като вирусни или бактериални кожни заболявания, инфектирани рани, или херпес или други венерически заболявания с външни прояви, средството, съгласно изобретението, може да бъде приложено локално върху пациента в която и да е подходяща форма.

Специфичната природа на заболяването или инфекцията ще определи подходящата форма на средството съгласно изобретението. За външно третиране то трябва да се прилага в различни форми като мехлеми, лосиони, мазила и др. Там, където е необходимо вътрешно приложение могат да се използват различни подходящи форми като хапчета, таблетки, разтвори, капсули, прахчета и др. Специфичната форма на средството се определя също и от природата на фармацевтично подходящия носител, използван в димерната ензимна композиция. Подходящи носители са хидрофилните бази, физиологично подходящи разтвори на соли, вода, мехлеми, прахове и др.

Ензимното третиране на бактериални или вирусни инфекции без цитотоксичен ефект в настоящото изобретение, се осигурява чрез при лагане на ефективно количество димерна форма, при лечение на хора или животни, е описано по-горе. Ефективно е това количество, което е необходимо да осигури антивирусен или антибактериален ефект. Количеството, необходимо да осигури лечение, ще варира при всеки случай в зависимост от природата на лекуваното заболяване и димерната форма ензим, която го осигурява. Средството съгласно изобретението, се използва в дози 0,01-50,0 mg/kg телесно тегло, за предпочитане в интервала 1,0-2,0 mg/kg телесно тегло. В случаите на локално приложение, в мехлемите се използват около 4,0 mg от димера, разтворен в приблизително 200 ml във вода, парафин и полиетиленгликол, като те са ефикасни, ако се прилагат 4-5 пъти на ден. Дозата в този интервал е ефективна при лечение на вирусни и бактериални заболявания без болезнени цитотоксични ефекти, които съпровождат лечението с мономерите на ензимите.

Примери за изпълнение на изобретението.

Следващите примери илюстрират настоящото изобретение, без да го ограничават.

Пример 1. Проведено е сравнително изследване на цитотоксичния ефект на мономери и димери на лизозима и панкреатичната рибонуклеаза А върху култура от фибробласти от бъбрек на зелена морска котка-GMK. Тези тестове се провеждат чрез прилагане на мономерни и димери върху фибробластната култура, при концентрация от 0,0001 до 1,0 mg/ml. След това културите се инкубират за 7 дни, след което културите се изследват за цитотоксичност. Резултатите от тези изпитания са представени в таблици 1 и 2. Мономерната форма на лизозима доказва своята цитотоксичност към фибробластите след 24 ч, при концентрация 0,1 mg/ml и 1,0 mg/ml (табл.1). След тридневна инкубация, мономерът проявява цитотоксичност спрямо фибробластите дори при концентрация от 0,01 mg/ ml, засягайки 50 % от инкубираните клетки. След 5 дни, 75 % от култивираните клетки са засегнати от цитотоксичната активност на лизозимният мономер при концентрации от 1,0 и 0,1 mg/ml.

Противно на това, димерната форма на лизозима не проявява цитотоксичен ефект в каквато и да е от използваните концентрации, дори след завършване на седемдневното инкубиране. Изследването показва, че лизозимният димер осигурява около 100 пъти пониска токсичност към GMK фибробласти, отколкото лизозимният мономер.

Мономерът от панкреатична рибонукле- 5 аза проявява цитотоксичност спрямо GMK фибробластите в петдневна култура дори при концентрация по-ниска от 0,0001 mg/ml (табл.2). След седемдневно култивиране, цитотоксичният ефект на панкреатичната рибонуклеаза А при концентрация от 0,01 mg/ml и повече, е в състояние да елиминира 100 % от култивираните клетки.

Сходно на димера на лизозима, димерната форма на панкреатичната рибонуклеаза А не показва цитотоксичен ефект спрямо GMK фибробластите при каквато и да е концентрация, използвана в теста в продължение на седемдневен период. Резултатите сочат, че димерът на панкреатичната рибонуклеаза А е от 1000 до 10000 пъти по-малко токсичен спрямо GMK фибробластите от мономера на панкреатична рибонуклеаза А.

Таблица 1

Изпитвания за цитотоксичност на мономер на лизозим и димер на лизозим

Тип на препарата	Концентрация mg/ml	След 24 часа	След 3 дни	След 5 дни	След 7 дни
Контрола			0	0	0
Мономер на
лизозима	1,0	2	2	3	3
	0,1	1	2	3	3
	0,01	0	2	2	2
	0,001	0	0	0	0
	0,0001	0	0	0	0
Димер на
лизозима	1,0	0	0	0	0
	0,1	0	0	0	0
	0,01	0	0	0	0
	0,001	0	0	0	0
	0,0001	0	0	0	0

Тестът е проведен трикратно върху култура от GMK / бъбрек от зелена маймуна/ фибробласти.

- цитотоксичност = 0 %

- цитотоксичност = 25 %

- цитотоксичност = 50 %

- цитотоксичност = 75 %

4 - цитотоксичност =100 % Тестът е проведен трикратно на култура от GMK /бъбрек

Таблица 2

Изпитвания за цитотоксичност на мономер на панкреатична рибонуклеаза А и димер на панкреатична рибонуклеаза А

Тип на препарата	Концентрация mg/ml	След 24 часа	След 2 дни	След 5 дни	След 7 дни
Контрола		0	0	0	0
Мономер	1,0	1	2	4	4
на панкре	0,1	0	1	3	4
атична	0,01	0	0	3	4
рибонук-	0,001	0	0	2	3
леаза А	0,0001	0	1	1	2
Димер на	1,0	0	0	0	0
панкреа-	0,1	0	0	0	0
тична	0,01	0	0	0	0
рибонук-	0,001	0	0	0	0
леаза А

от зелена маймуна/ фибробласти

- цитотоксичност = 0 %

- цитотоксичност = 25 %

- цитотоксичност = 50 %

- цитотоксичност = 75 %

- цитотоксичност =100%

Пример 2. Димерната форма на лизозима се изследва за нейния антивирусен ефект. В експериментите димерът на лизозима се инжектира в десетдневни оплодени кокоши яйца в концентрация от 10,0 mg/ml; 1,0 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,01 mg/ml u 0,001 mg/ml. Добавя се щам Sendai вирус c хемаглутинационен титър = 1:128 НА /към всяка концентрация от димера, в количество от 2 хемаглутинационни единици. След прилагане на димера на лизозима и вируса, яйцата се инкубират за 72 ч при 37°С. След инкубационния период, амниотичната и алантоичната течност се събират от инфектираните яйца и се подлагат на хемаглутинационен тест чрез микрометоди с използването на установката на Такаши и кокоши кръвни телца. Резултатите, получени при тези изпитвания, са представени на таблица 3, където лизозимният димер инхибира репликацията на Sendai вирус, култивиран в десетдневни оплодени кокоши яйца, дори при концентрация по-ниска от 0,01 mg/ml.

Таблица 3

Ефект на димера на лизозима върху щам Sendai вирус

Концентрация на димера на лизозима в mg/ml

Хемаглутационно инхибиране /хемаглутинационен тест върху кокоши червени кръвни клетки по метода на Такаши

IX.1987 XI.1987

10,0

1,0

0,1

0,01

0,001 +++ - пълна инхибиция, 1:256 ++ - ограничена инхибиция, 1:32

не е изследван +++ +++ +++ няма инхибиция

1. Тестът е проведен на щам Sendai вирус. Хемаглутинационният титър е 1:128 НА.

2. Десетдневни оплодени кокоши яйца служат като експериментален модел.

3. Идентично количество хемаглутинационни единици от вируса се добавя към всяка концентрация на димера на лизозима. Същевременно, се стартира контролен тест за лизозимен димер с цел да се види дали има хемаглутинационни свойства-резултатите са негативни. Последователни концентрации от лизозимния димер плюс 22 ХА единици от вируса след това се използват за инфектиране интраамниотично 4 кокоши яйца. След това яйцата се инкубират за 72 ч при 37°С.

4. След инкубационния период, амниотичната и алантои’ната течност се събират от инфектираните яйца. Хемаглутинационният метод се провежда /хемаглутинационен микрометод/ с прилагането на теста на Такаши и кокоши червени кръвни телца.

Пример 3. Ефектът на димерната форма на лизозима и панкреатичната рибонуклеаза А върху бактериите се изпитват върху няколко патогенни щамове, изолирани от маститни крави. Ефектите от различни концентрации от лизозимния димер за три щама /Strepto20 coccus agalactiae, S.dysgalactiae u S. liberis/ ca представени на таблица 4. Тези тестове показват, че всичките три стрептококови щамове доказват чувствителност към активност5 та на лизозимния димер. Най-добре се забелязва това в случая на S. liberis, който е засегнат от активността на димера при концентрация по-ниска от 1,25 mg/ml. Бактериостатичният ефект при другите щамове Streptococcus 10 се наблюдава при концентрация, започваща от около 10 mg/ml.

На таблица 5 са представени ефектите от панкреатичната рибонуклеаза А, димерна форма и лизозимните димери върху култиви15 рани патогенни бактериални щамове, изолирани от болни хора. Вижда се, че панкреатичната рибонуклеаза А-димер е по-ефективна спрямо бактериални щамове от Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli u Proteus vulgarus, по-специално при концентрация в интервал от около 5 до 10 mg/ml. Установено е, че бактериалните щамове на Staphylococcus и Streptococcus са чувствителни към димерната форма на лизозима също при концентрация от около 5 до 10 mg/ml. Тестът за чувствителност е проведен в съответствие с основни международни постановки, препоръчани от WHO (Международна здравна организация).

Таблица 4

Минималната инхибиторна концентрация /МИК/ на лизозимният димер в mg/ml - Бактериалните щамове са изолирани от маститни крави

Лизозимен димер в mg/ml

Бактериални щамове	1,25	2,5	5,0 10,0 20
Streptococcus agalactiae	+	+	+ --
Streptococcus dysgalactiae	+	+	+ --
Streptococcus liberis	-	-

- = липса на пролиферация + = наличие на пролиферация

Тестът за чувствителност е проведен в съответствие с основните принципи, препоръчани от WHO (Международна здравна организация).

МИК-Минимална инхибиторна концентрация на панкреатична рибонуклеаза

А-димер в mg/ml. Бактериалният щам е изолиран от проби, събрани от пациенти.

от боледуването. Преди да бъде изпитано

Таблица 5

Бактериални Панкреатична рибонуклеаза А Лизозим димер щамове димер в mg/ml в mg/ml

	2,5	5,0	10,1	20,0	2,5	5,0	10,0	20,0
Pseudomonas aeruginosa	+				+	+	+	+
Escherichia coli	+	+	-	-	+	+	+	+
Proteus Vulgaris	+	+	-	-	+	+	+	+
Staph, aureus	+	+	+	+	+	-	-	-
/стандартен щам 209/ Staph, aureus /патогенен щам/	+	+	+	+	+
Staph.aureus MRSA щам №11704	+	+	+	+	+	+
Staph, aureus MRSA щам №11708	+	+	+	+	+	+
Strept.pyogenes патогенен щам	+	+	+	+	+

- = липса на пролиферация на бактериите + = наличие на пролиферация

MRSA - устойчиви на метицилин Staphylococcus aureus

Щамовете са получени от пациенти. Тестът за чувствителност е проведен в съответствие с основните международни принципи, препоръчани от WHO (Международна здравна организация).

Таблица 6 Ефективност на лизозимния димер към пролиферацията на еритроцитна левкимийна клетъчна линия К-562. Клетките от линия К-562 са използвани при концентрация от 10⁵ ml. Ефектът е отчетен след 24 ч на култура при 37°С при 5 %-ен приток на СО₂.

Концентрация на лизозимния димер в mg/ml

Пролиферация на клетките от линия

К-562 за 24 часа в ин витро култура_______

Брой на клетките % на загинали клетки

Контрола	190 000	2-3 %
1,0	лизис на клетките	100 %
0,1	107 000	95 %
0,05	98 000	99 %

Таблица 7

Ефект на димерната форма на панкреатичната рибонуклеаза А върху пролиферацията на еритроцитна левкимийна клетъчна линия К-562.

Клетките от линията К-562 са използвани при концентрация 10^s ml.

Ефектът е установен след 24 часово култивиране при 37°С и приток на СО₂-5 %.

Концентрация на	Пролиферация на К-562 клетки в 24-
панкреатична	часова култура ин витро
рибонуклеаза А
димер	Брой на клетките %	, на умрели клетки
Контрола	207 000	2-5
1,0	68 000	74
0,1	140 000	14
0,05	150 000	7

Пример 4. Ефектът от лизозимния димер и димерната форма на панкреатичната рибонуклеаза А върху пролиферацията на еритролевкимийна клетъчна линия К-562 се определя чрез прилагане на различни концентрации от димерите върху клетки от тази линия. Резултатите от теста са представени на таблици 6 и 7. Всички концентрации от лизозимния димер, използвани в експеримента, показват силен цитопатогенен ефект върху клетките К-562. Димерната форма на панкреатичната рибонуклеаза има аналогичен ефект спрямо еритролевкимийната клетъчна линия, обаче само при концентрация 1,0 mg/ml (табл.7).

Пример 5. Изследва се ефектът от лизозимния димер при гноен отитис медия (отит на средното ухо) у кучета върху 19 кучета от различни породи и с различни форми на заболяването, което се характеризира с възпалителен процес, който средно продължава около 7-14 дни, но в един случай продължи девет месеца. При седем от кучетата гнойта, изтекла от възпаленото ухо, се изследва за идентификация на бактериалните щамове, изолирани преди лечението. Тези култивационни тестове показват присъствието на стафилококови бактерии, Pseudomonas aeruginosa, Coccidia species, и други бацилни видове.

Страдащите кучета показват по различен начин, че изпитват болка, като клатене на главата, опити да достигнат инфектираното ухо с лапите си. Кучетата загубват апетит и пови25 шават температурата си /39,2-41,2°С/. Единадесет от кучетата в изследването не са били лекувани по какъвто и да е фармацевтичен начин. Кучето, при което инфекцията персистира девет месеца, е получавало различни антибиотици, но в крайна сметка те не са се оказвали ефективни.

Кучетата се третират със средството съгласно изобретението, съдържащо 20 mg разтвор на димерна форма на лизозим и 25 ml физиологичен разтвор. Средството се прилага под формата на хапчета, като 10 хапчета се поставят четири-пет пъти на ден в инфектираното ухо. Още след първото третиране /след първия ден/ се забелязват подобрения: температурата спада, кучетата явно се чувстват подобре и имат по-добър апетит. Симптомите на гнойната инфекция изчезват напълно между третия и шестия ден от лечението. У кучето, което преди това е било лекувано с антибиотици безуспешно в продължение на девет месеца, успешно елиминиране на заболяването е постигнато след 10 дни. Така е показана ефективността на димерната форма на лизозима при лечение на гноен отитис медиа у кучета.

Пример 6. Изследва се ефективността на лизозимния димер и при маститни крави. Изследвани са 6 маститни крави, които показват признаци на заболяване като температура над 40,5°С и липса на апетит. При всичките шест случая лечението започва на втория ден средството, се събират проби от мляко за изследване наличието на бактериална контаминация. Културите се изследват за съдържание на микроорганизми като Staphylococcus и Streptococcus agalactiae. 5

Лизозимният димер се прилага инжекционно-впръсква се в инфектираното виме в доза 40 mg в 50 ml физиологичен разтвор два пъти дневно. Установено е, че само след 24 ч телесната температура е вече нормална и апе- 10 титът-възстановен. След три дни всички лекувани крави вече не показват симптоми на заболяване. Лечението продължава само 4 дни, след което в изследваното мляко отсъстват патогенни микроорганизми. По-нататък не са на- 15 мерени изменения, индикиращи субклинични мастити. Нито една от лекуваните крави не намалява продуктивността си, липсва и увреждане на вимето. След 24 ч от третирането с лизозимния димер не се откриват блокиращи 20 субстанции в млякото на третираните крави. Бързото изчезване на симптомите на заболяването, както и пълното възстановяване на млечния капацитет по този начин показва, че лизозимно димерното средство съгласно нас- 25 тоящото изобретение може да бъде успешно използвано за лечение на мастити по говедата. Това лечение е с особена икономическа значимост за предотвратяване на маститни инфекции, причинени от стафилококови и 30 стрептококови бактериални щамове.

Пример 7. Инфекция от кучешки парвовирус се лекува чрез орално приемане на лизозимен димер. У двадесет и седем кучета от различна порода и тегло, с възраст от три ме- 35 сеца до шест години, ветеринарните хирурзи откриват симптоми на парвовироза. Всички тестувани животни имат висока температура /4041,6°С/, чести пристъпи на обилни повръщания, много и характерни зловонни диарии, а така 40 също и симптоми на обезводняване е апатия. Лечението започва средно между третия и петия ден от инфекцията, в зависимост от това кога собственикът е довел животното във ветеринарната станция. На заболялото животно се 45 дава лизозимен димер в доза 1-2 mg/kg телесно тегло два пъти дневно. На животните, които все още са в състояние да пият, лизозимният димер се дава в питейна вода. За животните, неспособни да пият, препаратът се 50 дава под формата на физиологичен разтвор. От двадесет и седем кучета, подложени на лечение, двадесет и пет възстановяват напълно физическите си способности след 3 до 5 дни. Характерно е, че дори още през първия ден, се наблюдава намаляване броя на диариите и пристъпите на повръщане, като у повечето от кучетата тези симптоми тотално намаляват след втория ден от лечението. При няколко кучета тези симптоми изчезват дори след първата доза от препарата. Не се наблюдават странични ефекти, свързани с приложението на лизозимния димер у никое от животните. Този клиничен тест показва, че лизозимният димерен състав, съгласно изобретението, може да бъде успешно използвана при кучета с парвовирозна инфекция.

Пример 8. Средството, съгласно изобретението се изпитва и при определени дерматологични заболявания у хората. Тестът се провежда при различни пациенти на възраст между 15 и 35 години, които преди това са били безуспешно лекувани по конвенционални методи. Заболяванията се групират по след ният начин:

1. Forunculosis chronica

2. Sycosis barbae

3. ImpetigO contagiosa

4. Acne vulgaris

5. Rosacea

6. Varicose ulcer

- 2 случая

- 1 случай

-11 случая

-22 случая

- 6 случая

-12 случая

При някои пациенти от тези групи, лечението се предшества от бактериологично изследване. В повечето случаи се култивира Staphylococcus aunreus от събрания материал. Лечението се състои от прилагане 4 пъти днев но на мехлем, съдържащ 4 mg от лизозимния димер. Мехлемът съдържа в mg:

Лизозим димер4

Ацетилстеароилокси алкохол25

Течен парафин10,0

Span 605,0

Tween 608,0

Пропиленгликол10,0

Aseptina Μ0,3

Aseptina Ρ0,16

Дестилирана вода до 200ml

При всички пациенти различните кожни състояния изчезват в рамките на 10-12 дни, като в някои случаи се наблюдава изчистване след 3 дни. У пациентите с хронична форункулоза, лечението продължава до 4-5 седмици, а за тези с варикозен улцер, са нужни между 2 и 12 седмици за възстановяване в зависи мост от тежестта на кожното заболяване и предисторията му. Резултатите от изследването показват, че лизозимният димер може да се използва за лечение на различни кожни заболявания.

Пример 9. С лизозимния състав съгласно изобретението се лекуват и различни гинекологични заболявания. По този начин се лекуват 7 пациентки на възраст между 25 и 49 години. Седем пациентки имат Colpitis chronica, една- Дъгласов абцес и една с Bartholinitis. На пациентките с Colpitis chonica се прилага интравагинално супозитории, съдържащи 10 mg от лизозимния димер в 2 см³ от хидрофилна база. Супозиториите се прилагат два пъти дневно за период от 7 дни. У всички пациентки се наблюдава напълно елиминиране на възпалителния процес в гениталната област. При това, изчезват и други симптоми като леукореата.

На пациентките с Дъгласов абцес се дава 20 mg лизозимен димер в 5 ml 0,9 % разтвор на натриев хлорид два пъти дневно за краткия период от 4 дни. Разтворът се прилага директно в Дъгласовото пространство. Преди всяко използване на лизозимния димер, гнойното съдържимо се изтегля от Дъгласовото пространство. Тези култури показват присъствието на Streptococcus haemolyticus и на Bacterium coli /чревна бактерия/. Наднормената телесна температура се редуцира до нормална в рамките на 24 ч след първото въвеждане на лизозимния димер. Болковият симптом като правило се редуцира през това време. На четвъртия ден, след второто въвеждане на лизозимния димер, не се открива гной в Дъгласовото пространство. В този случай се възстановява заболяването след три седмици, но други две дози лизозимен димер, въведени в Дъгласовото пространство, са достатъчни да доведат процеса на заболяване до контролирано състояние.

Пациентите с Bartholinitis са лекувани с една доза от 20 mg лизозимен димер в 1 см³0,9 NaCl, която се въвежда непосредствено в гноящата жлеза след аспирация на гнойното съдържание. След 4 дни пациентът е изцяло излекуван. Последвалите изследвания в продължение на 4 месеца показват, че заболяването не се възстановява. Тези клинични тестове показват, че лизозимният димер има изключително благоприятно терапевтично въз действие в случаи на инфекциозни заболявания на женските гениталии. Следователно, явно че е възможно лечението на локални абсцеси чрез въвеждане на лизозимен димер непосредствено в кухините с гнойно съдържание.

Пример 10. Изследва се ефектът от разтвор на лизозимния димер върху инфектирани рани. В групата има 4 пациента с възпалени постоперативни рани; 2 жени след лапаротомия, 1 жена след ампутация на палеца вследствие некрозис от диабетична ангиопатия и 1 мъж след ампутация на долните крайници вследствие болестта на Бюргер. Във всички случаи влажните компреси и промиване с разтвор на 20 mg лизозимен димер в 5 ml 0,9 % NaCl се прилагат четири пъти дневно. У пациентите с гнойни рани след лапаротомия ефектът от лечението се проявява след четири-шестдневен период. У другите пациенти лечението е ефективно след 21 дни и 5 месеца респективно. Тези тестове сочат, че лизозимният димер може да се прилага като терапевтик без странични ефекти при лечение на постоперативни рани.

Пример 11. Клинично се изследват пациенти с Herpes genitalis, лекуван с рибонуклеаза А димерен състав. Изследваната група включва пет пациентки на възраст от 23 до 36 години. Четири от тях са развили болестта за първи път, докато една от тях боледува за трети път. Всички пациентки са в периода на образуване на мехурите, което е характерно за третия-петия ден от заболяването и се оплакват от много силни болки в областта на перинеума, по-специално при уриниране. У всички пациентки се наблюдава подуване и инфекция на лабиите, тъй като голям брой мехури, пълни с мътна течност изпълват мукозните лабиални мембрани на кожното покритие на бедрото и аналния регион. У всички пациентки ингвиналните лимфни възли са уголемени и болезнени.

Лечението предвижда прилагане на мехлем, съдържащ димерната форма на рибонуклеаза А четири-пет пъти дневно върху мехурите и инфектираните области на мукозната мембрана. Използваният мехлем включва в mg: рибонуклеазен димер 4; ацетилстеароилокси алкохол 25; течен парафин 10; span 60-5; tween 60-8, пропиленгликол 10; aseptina Μ 0,3; aseptina P 0,16 и дестилирана вода до 200 ml.

Пациентите, лекувани с димерния пре11 парат твърдят, че няколко минути след или наймного в рамките на един час от първото прилагане на мехлема, болката значително намалява и окончателно изчезва през следващите 10-20 часа. Прегледите показват, че у 4 пациентки патологичните изменения изчезват напълно след 3 дни лечение. У други пациенти патологичните изменения се елиминират напълно след 4 дни. Но в никой от тези пациенти не се появяват нови мехури след лечението с мехлема, съдържащ панкреатична рибонуклеаза А димер. Описаното изследване показва, че мехлемите , съдържащи димери съгласно изобретението, могат успешно да се прилагат при лечение на Herpes genitalis.

Пример 12. Повече от 100 пациента на различна възраст и лекуват от лабиален херпес, използвайки средството съгласно изобретението. У всички пациенти симптомите включват отичане в областта на горната устна и образуване на множество мехури, изпълнени с мътна течност. Всички пациенти се оплакват от болки по кожата на засегнатата от заболяването област, съпътствано от усещане за напрегнатост на тъканите. Лечението предвижда локално приложение от 4-5 пъти дневно с мехлем, съдържащ панкреатична рибонуклеаза А-димер.

Всички лекувани пациенти без изключение твърдят,че болката и напрегнатостта на тъканите бързо намаляват Следва напълно изчезване на болката през следващите няколко часа, както при случаите на Herpes genitalae. Прегледите показват, че отичането и мехурите изчезват за 2-3 дни. В индивидуални случаи това отнема до 5 дни до състоянието на пълно изчистване и напълно завършване на процеса на излекуване. По-нататъшните изследвания показват, че при пациентите, при които лечението започва още от първия ден на заболяването, състоянието на кожата като отичане, раздразнение и папулите изчезват след 24 часа. Други изследвания показват, че лицата, които често страдат от това заболяване, имат удължен период между всяко ново заболяване и че симптомите са все по-слабо изразени. В нито един от случаите не се наблюдава страничен ефект.

Пример 13. Клинично се изследват шест пациента с Herpes zoster, които се третират с димерен състав, съгласно изобретението. В пет от случаите заболяването се развива по обик новен начин, но в шест случая има особени усложнения, които се описват по-долу. Тези пациенти се лекуват с панкреатична рибонуклеаза А димер, включена в мехлем, като лечението започва на третия или четвъртия ден от болестта. Мехлемът се прилага 3-4 пъти дневно.

Във всички случаи болката тотално изчезва в периода на първите 24-48 ч. Мехурите засъхват след 3-4 дни и едва тогава се завършва лечението. В рамките на следващите няколко дни състоянието на кожата се възстановява окончателно. У нито един от пациентите няма болка след първите 24-48 ч и болестното състояние не се възстановява при трима от пациентите, които се наблюдават за повече от годишен период. У един от пациентите, както бе посочено по-горе, има необичайно клинично развитие на заболяването. Жена на 42 годишна възраст, лекувана за белодробен рак с кобалтова терапия, има сериозно нарушение на имунната система. Освен обикновените симптоми на Herpes zoster, се установява генерализирано разсейване на мехурите по повърхността на цялото й тяло. Лечението с рибонуклеаза А димер съгласно изобретението е изключително успешно у тази пациентка с нарушен имунитет-жената получава пълно изчистване от мехурите след няколко дни. Успешните резултати у тази пациентка и у другите членове на групата, показва особената ефективност на димера на панкреатичната рибонуклеаза А срещу Herpes zoster, причинен от Varicella virus.

Патентни претенции

Claims

1. Метод за лечение на вирусни и бактериални инфекции, характеризиращ се с това, че на болни хора или животни се прилага ефективно количество от средство, съдържащо димер, избран от групата, състояща се от димер на лизозима и димер на рибонуклеазата, заедно с фармацевтично приемлив носител.

2. Метод за ензимно лечение на вирусни и бактериални инфекции, без цитотоксични ефекти, характеризиращ се с това, че на болни хора или животни се прилага ефективно количество от средство, съдържащо димер, избран от групата, състояща се от димер на лизозима и димер на рибонуклеазата, заедно с фармацевтично приемлив носител.

3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че средството се прилага в количество от 0,1 до 50 mg на kg телесно тегло.

4. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че средството се прилага орално.

5. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че средството се прилага локално.

6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че средството се прилага интравенозно.

7. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че средството се прилага във вид на мехлем.

8. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че средството се прилага като физиологично приемлив разтвор на сол.

9. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че разтворът съдържа 0,5 до 1,5 % сол във вода.

10. Метод за лечение на херпес, характеризиращ се с това, че върху инфектираната област локално се нанася средство, съдържащо ефективно количество от димер, избран от групата, състояща се от димер на лизозима и димер на рибонуклеазата във фармацевтично приемлив носител.

11. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че херпесът е херпес симплекс.

12. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че херпесът е генитален херпес.

13. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че херпесът е херпес зостер.

14. Метод за лечение на рани, характеризиращ се с това, че върху инфектираната област локално се нанася средство, съдържащо ефективно количество от димер, избран от групата, състояща се от димер на лизозима и димер на рибонуклеазата във фармацевтично приемлив носител.

15. Метод за лечение на вагинални инфекции, характеризиращ се с това, че локално се прилага средство, съдържащо ефективно количество от димер, избран от групата, състояща се от димер на лизозима и димер на рибонуклеазата, във фармацевтично приемлив носител.

16. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че средството се прилага под формата на супозитории.

17. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че средството се прилага под формата на мехлем.

18. Метод за лечение на болести на кожата, причинени от бактериални или вирусни инфекции, характеризиращ се с това, че включва локално приложение на средство, съдържащо ефективно количество от димер, избран от групата, състояща се от димер на лизозима и димер на рибонуклеазата във фармацевтично приемлив носител за локално приложение.

19. Метод за лечение на отити, характеризиращ се с това, че включва прилагане върху инфектираната област на средство, съдържащо ефективно количество от димер, избран от групата, състояща се от димер на лизозима и димер на рибонуклеазата във фармацевтично приемлив носител.

20. Метод съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че носителят е течен и средството се прилага чрез поставяне на капки в ухото.

21. Метод за лечение на кучешки парвовирус, характеризиращ се с това, че на болни кучета се прилага ефективно количество от средство, съдържащо димер, избран от групата, състояща се от димер на лизозима и димер на рибонуклеазата във фармацевтично приемлив носител.

22. Метод за лечение на мастити, характеризиращ се с това, че включва приложение върху болното животно на средство, съдържащо ефективно количество от димер, избран от групата състояща се от димер на лизозима и димер на рибонуклеазата във фармацевтично приемлив носител.

23. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че носителят е течен и приложението е интравенозно.

24. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че димерът е в концентрация от около 4 mg/ml в солевия разтвор.

25. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че носителят е хидрофилна база.

26. Метод съгласно претенция 25, характеризиращ се с това, че димерът е в концентрация от около 10 mg/2 см² до около 20 mg/ml спрямо посочения носител.

27. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че концентрацията на димера в носителя е от около 0,001 mg/ml до около 20 mg/ml.

28. Антивирусно и антибактериално сред- 5 ство за локално приложение, характеризиращо се с това, че съдържа ефективно количество от димер на лизозима и димер на рибонуклеазата, заедно с фармацевтично приемлив носител. 10

29. Средство съгласно претенция 28, характеризиращо се с това, че носителят е под формата на мехлем.

30. Средство съгласно претенция 28, характеризиращо се с това, че носителят е под формата на супозитории.

31. Средство съгласно претенция 28, характеризиращо се с това, че димерът е в концентрация от около 0,001 mg/ml до около 20 mg/ml.

32. Средство съгласно претенция 28, характеризиращо се с това, че концентрацията на димера е около 0,02 mg/ml.