CS277030B6

CS277030B6 - Antiviral and antibacterial agent

Info

Publication number: CS277030B6
Application number: CS893180A
Authority: CS
Inventors: Witold Dr Kicizka
Original assignee: Nika Health Products Ltd
Priority date: 1988-05-26
Filing date: 1989-05-26
Publication date: 1992-11-18
Also published as: DK16890D0; ATE93143T1; FI900412A0; YU109289A; DK173078B1; JPH03504121A; ZA893382B; AU1940888A; EP0380484B1; IL90092A; HUT54060A; LV10054A; US5200182A; US5466449A; CA1335425C; WO1989011294A1; HK42394A; HU883981D0; EP0380484A1; ES2011577A6

Description

Tento vynález se týká nových protivirových a protibakteriálnich prostředků, vyznačujících se tím, že obsahují polymerované enzymy spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem a způsob jejich použití.

Stále rostoucí počet bakteriálních kmenů a virových onemocnění, která jsou resistentní na antibiotika, vedl k nutnosti zavést nové druhy léčiv pro léčení lidí i zvířat. Je známo, že se mezi mnoha nyní používanými způsoby léčení a léčivy používají monomerní formy enzymů, kterými se dosáhne therapeutických účinků u pacientů zasažených různými onemocněními. Enzymy jsou katalyticky aktivní proteiny (bílkoviny), které zajišťují téměř všechny hlavní životní procesy v organismech. Pro své biochemické, fysiologické nebo biologické účinky byly isolovány mnohé enzymy, a to ať již jako jednotlivé látky nebo v jistých kombinacích.

Mezi různé enzymy, u nichž byly nalezeny jisté therapeutické účinky, patří lysozym a ribonukleasa. Lysozym je znám od roku •1922, kdy byl objeven Flemingem. Enzymatické funkce lysozymu však byly odhaleny teprve po roce 1950. Od té doby byla tato sloučenina předmětem intensivního biochemického, fysiologického a klinického výzkumu. Rozsah biologické významnosti této sloučeniny je však stále ještě teprve třeba určit. Až dosud bylo zjištěno, že lysozym má různé therapeutické vlastnosti, jako jsou například protivirové, protibakteriální, protizánětlivé a protihistaminové vlastnosti. Protibakteriální účinnost je založena na hydrolyse p-l,4-glykosidové vazby mezi N-acetylmuramovou kyselinou a N-acetylglukosaminem; obě tyto sloučeniny jsou obsaženy v bakteriální stěně.

Jě také dokázáno, že lysozym je přítomen ve fagocytech. Výzkum této oblasti ukázal, že intracelulární lysozym obsažený v lysozymech je zodpovědný za štěpení fagocytových bakterií. U člověka bylo zjištěno, že lysozym stimuluje fagocytosu ve fysiologické koncentraci 10 až 400 mg/ml.

Byly nalezeny také další vlastnosti lysozymu. Například bylo zjištěno, že lysozym snižuje tělesnou teplotu v těch infekčních procesech, v nichž jsou za vznik zvýšené teploty odpovědné endogenní pyrogeny uvolňované toxiny. Také bylo zjištěno, že lysozym participuje v imunologických procesech stimulací synthesy gamaglobulinů, opsoninů a dalších protilátek. A dále se předpokládá, že lysozym má silný protizánětlivý účinek. Navzdory těmto známým prospěšným vlastnostem lysozymu, navzdory četným výzkumným projektům a produkci farmaceutických prostředků založených na lysozymu, použití tohoto enzymu pro therapeutické účely je velice omezeno.

Jinou skupinou enzymů, které byly studovány pro své různé biologické účinnosti, jsou ribonukleasy. Ribonukleasy je skupina enzymů obecně sě vyskytující v mnoha živočišných a rostlinných organismech, stejně jako v bakteriálních stěnách. Studium jejich vlastností a výzkum způsobů isolace byl započat v roce 1955 Schmidtem a McDonaldem. Mezi poznatky o těchto enzymech patří například to, že aktivita ribonuklesa v rakoviných tkáních je značně snížena. Bylo například objeveno, že leukemogenní viry drasticky snižují aktivitu kyselinové ribonukleasy u myší. U myší s virovou leukémií bylo také zjištěno, že ve frakcích mitochondrií a mikrosomů (získaných z tkáně sleziny těchto zvířat) dochází ke značnému poklesu aktivity kyselinové ribonukleasy.

Shora uvedené studie poukazují na to, že pokles aktivity ribonukleasy je nějak více spojen s.infekcemi způsobenými viry. Bylo proto navrženo, že ribonukleasové enzymy by mohly mít nějakou protivirovou aktivitu. Avšak až do dnešní doby není známa jediná práce týkající se přípravy sloučenin, které by používaly tento enzym jako protivirové činidlo.

Jeden z hlavních důvodů, proč takové potenciálně prospěšné enzymy díky svým therapeutickým účinkům ještě nejsou široce používány, je pozorovaný cytotoxický efekt monomerních forem těchto a dalších enzymů. V testech s kultivovanými fibroblasty byl pozorován cytotoxický efekt jak u lysozomových, tak u ribonukleasových monomerů dokonce i ve velmi malých množstvích. Je zřejmé, že potenciálně prospěšné účinky těchto a dalších enzymů by mohly být využívány tehdy, kdyby mohl být vyvinut efektivní způsob kontroly těchto cytotoxických účinků. Je tedy žádoucí vyvinout prostředky založené na lysozymu, ribonuklease nebo na jiných podobných enzymech, které by mohly být efektivně použity při léčení virových nebo bakteriálních onemocnění nebo jiných škodlivých stavů, aniž by při tom došlo k cytotoxickým účinkům, které jsou obvykle pozorovány tehdy, když se tyto enzymy používají v monomerní formě.

Nyní bylo podle vynálezu zjištěno, že lze připravit protivirový nebo protibakteriální prostředek, který jako účinnou složku obsahuje lysozym nebo ribonukleasu, přičemž tento prostředek nevykazuje cytotoxické účinky, a to tak, že se používají dimerní formy těchto enzymů.

Předmětem předloženého vynálezu tedy je protivirový a protibakteriální prostředek, který jako účinnou látku obsahuje dimer, vybraný ze skupiny zahrnující dimer lysozymu a dimer ribonukleasy a dále obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič. Uvedené prostředky mohou léčit početná infekční onemocnění bez zřetelných cytotoxických účinků.

Je výhodné, když prostředek podle vynálezu obsahuje dimer pankreatické ribonukleasy A.

Dále je výhodné, když prostředek obsahuje jako nosič hydrofilní basi, přičemž dimer je zde obsažen v koncentraci asi 10 mg na 2 ml uvedené base. Prostředek může být vytvořen například ve formě čípku.

Také je výhodné, když prostředek podle vynálezu obsahuje jako nosič vodu nebo roztok fyziologicky přijatelné soli, obzvláště chloridu sodného o koncentraci 0,5 až 1,5 %. Dimer bývá v roztoku soli v koncentraci asi 0,8 mg/ml.

Dále může být výhodně uvedený nosič ve formě masti, přičemž mast je obzvláště tvořena směsí vody, parafinu a propylenglykolu. Dimer je zde obsažen v koncentraci asi 0,02 mg/ml.

Obecně bývá účinná látka obsažena v prostředku podle vynále3 zu obsažena v koncentraci v rozmezí 0,001 až 20,0 mg/ml, vztaženo na nosič.

Protivirově a protibakteriální prostředky podle vynálezu se mohou připravovat tak, že se nejdříve připraví lysozym nebo ribonukleasa v monomerni formě. Lysozymové monomery /katalogové číslo 28 260/ a ribonukleasové monomery /katalogové číslo 34 388/, používané pro přípravu sloučenin podle tohoto vynálezu, byly získány od firmy Serva Feine Biochemica, Gmbh und Cooperation, D 69-000, Heidelberg, NSR. Tyto enzymové monomery se mohou zpolymerovat na dimery jakýmkoliv vhodným způsobem běžně používaným odborníky. Zvláště výhodná je však polymerace enzymů podle Carlssona a spol.: Biochemistry Journal 173. 723-až 737 (1978). Mohou být používány také jiné způsoby, například způsob popsaný Sorrentinem a spol.: Eur. J. Biochem. 124. 183 až 189 (1982). Bylo také zjištěno, že zvláště výhodným dimerem ribonukleasy, který se může používat v prostředcích podle tohoto vynálezu, je dimer připravený z pankreatické ribonukleasy A, isolované z živočišných pankreatických tkání.

Bylo zjištěno, že prostředky obsahující jako účinnou složku dimer lysozymu nebo dimer ribonukleasy a obsahující dále farmaceuticky přijatelný nosič, jsou účinné při léčení různých bakteriálních a virových onemocnění aniž by existovaly nežádoucí cytotoxické účinky. Tyto potenciálně škodlivé účinky takovýchto enzymů byly testovány ve srovnávacích studiích jak monomerních, tak dimerních forem lysozymu a ribonukleasy. V těchto studiích byly různé koncentrace monomerů a dimerů lysozymu a ribonukleasy podávány kulturám fibroblastů z ledvin zelených opic (GMK). Bylo zjištěno, že monomer lysozymu je cytotoxický na fibroblasty po 24 hodinách při koncentraci 0,1 mg/ml a 1,0 mg/ml. Po třídenní inkubaci byl cytotoxický účinek na fibroblasty pozorován při koncentraci 0,01 mg/ml, která ovlivnila 50 % inkubovaných buněk. Po pěti dnech bylo 75 % kultivovaných buněk ovlivněno cytotoxickou účinností monomeru lysozymu při koncentracích 1,0 a 0,1 mg/ml. Srovnáním s dimerem lysozymu bylo zjištěno, že dimer lysozymu nevykazoval cytotoxickou účinnost při žádné z koncentrací použitých v těchto testech, dokonce ani po sedmidenním období. Tyto studie ukázaly, že dimerní forma lysozymu je přibližně 100 x méně toxická na fibroblasty GMK než monomerni forma.

Studie s ribonukleasou ukázaly, že podobně i zde chybí u dimerní formy cytotoxický účinek. Při této studii byla ribonukleasa cytotoxická na pětidenní kulturu fibroblastů GMK ještě při koncentraci 0,0001 mg/ml. Po sedmi dnech kultivace cytotoxické účinky monomeru ribonukleasy v koncentracích 0,01 mg/ml a vyšších eliminovaly 100 % kultivovaných buněk. Na rozdíl od toho dimer ribonukleasy nevykazoval vůbec žádné cytotoxické účinky na fibroblasty GMK v žádné koncentrační hladině, dokonce ani po sedmi dnech inkubace. Bylo tedy zjištěno, že dimerní forma ribonukleasy je přibližně 1 000 až 10 000 krát méně toxická na fibroblasty než forma monomerni. Tyto testy zřetelně ukázaly, že cytotoxické účinky, které normálně doprovázejí používání monomerních forem enzymů, jako je například lysozym a ribonukleasa, by se mohly účinně eliminovat, kdyby se tyto enzymy používaly ve své dimerní formě. Další výzkum ukázal, že navzdory nepřítomnosti cytotoxických účinků, lysozym a ribonukleasa ve svých dimerních formách mohou být extrémně užitečné a účinné při léčení virových a bakteriálních infekcí. V testech, při kterých se používají oplodněná slepičí vajíčka a virus kmene Sendai, se dimer lysozymu v různých koncentracích intraamnioticky podává do vajíček. Do každého vajíčka se injekčně podají dvě jednotky viru Sendai. Po inkubaci se amniotová a allantoidní tekutina isoluje z infektovaných a z kontrolních vajíček a výsledky se srovnají. Tyto testy ukázaly, že dimer lysozymu je schopný inhibovat replikaci viru Sendai, který je kultivován v deset dnů starých oplodněných slepičích vajíčkách, a to dokonce v koncentraci 0,01 mg/ml. Podobné testy s dimery lysozymu a ribonukleasy ukazují, že tyto dimerní enzymy mají bakteriostatickou účinnost na kmeny Streptococcus bacteria.

Prostředky připravené z dimerů lysozymu nebo z dimeru ribonukleasy podle tohoto vynálezu se tedy mohou používat při léčení rozmanitých virových a bakteriálních infekcí. Prostředky se mohou připravovat v různýh formách. Tyto prostředky obsahující enzym a nosič, se člověku nebo zvířeti podávají vnitřně nebo vnějšně podle nemoci, která má být léčena. Pro onemocnění vnitřní, jako je například infekce ucha, mastitida, žaludeční infekce nebo infekce vaginálního traktu, se dimerní prostředky podle tohoto vynálezu mohou s výhodou připravovat a podávat orálně, intravenosně, parenterálně, jako čípky nebo jakýmkoliv jiným způsobem, který umožňuje, aby dimerní roztok dosáhl oblast zasaženou infekcí; při stavech, které vyžadují vnější podávání, jako jsou například virová nebo bakteriální onemocnění kožní, infekcí zasažené rány, herpes (opar) nebo jiné choroby pohlavního ústrojí s vnějšími příznaky, se prostředky podle vynálezu mohou podávat pacientovi povrchově v jakékoliv vhodné formě.

Příslušná forma prostředku podle tohoto vynálezu je tedy dána povahou léčení infekce nebo nemoci. Při vnějším léčení se prostředky mohou podávat v různých formách, jako jsou například masti, omývadla, roztoky, oleje atd. Pokud je nutná vnitřní aplikace, potom lze použít četné vhodné formy, jako jsou například kapičky, tablety, roztoky, tobolky, prostředky pro léčení zubů (prášky na zuby) atd. Ta která zvláštní forma prostředku, která se aplikuje na pacienta, také určuje povahu farmaceuticky přijatelného nosiče použitého v prostředku s dimerním enzymem. Mezi mnoho vhodných nosičů, které lze použít, patří hydrofilní base, fysiologicky přijatelné solné roztoky, voda, masti, prášky atd.

Enzymatického léčení virových nebo bakteriálních infekcí bez cytotoxických účinků se tedy dosahuje podle tohoto vynálezu tak, že se lidskému nebo zvířecímu pacientovi podá efektivní množství shora uvedených prostředků ve formě dimerů. Efektivním množstvím se rozumí takové množství, kterého je potřeba pro získání protivirových nebo protibakteriálních účinků. Množství, kterého je potřeba pro efektivní léčení, je pro každý případ jiné a závisí na povaze léčené nemoci a formě poskytovaného dimerního prostředku. Obecně se prostředek podle tohoto vynálezu podává v dávkové hladině od 0,1 do 5,0 mg/kg tělesné hmotnosti, zvláště výhodně v rozmezí od 1,0 do 2,0 mg/kg tělesné hmotnosti. V případě povrchového léčení je léčení účinné, jestliže se masti připravené ze 4 až 20 mg dimeru v přibližně 200 ml roztoku vody, parafinu a propylenglykolu aplikují čtyřikrát až pětkrát denně. Dávkování v těchto rozmezích by mělo být takové, aby postačovalo k léčení četných virových nebo bakteriálních onemocnění bez škodlivých cy~ totoxických účinků, které by doprovázely léčení monomery enzymů.

Následující příklady jsou uvedeny pouze jako ilustrace tohoto vynálezu a nejsou zamýšleny tak, aby omezovaly jakýmkoliv způsobem rozsah tohoto vynálezu.

Příklad 1

Byl proveden srovnávací výzkum týkající se cytotoxického účinku monomerů a dimerů lysozymu a pankreatické ribonukleasy A na kulturu fibroblastů z ledvin zelených opic (GMK). Tyto testy byly prováděny tak, že se monomery a dimery aplikují na kulturu fibroblastů v koncentracích 0,0001 až 1,0 mg/ml. Kultury se potom inkubují sedm hodin, potom se zkouší na cytotoxicitu. Výsledky těchto testů jsou uvedeny v tabulkách I a II.

Tabulka I

Testy cytotoxicity monomeru lysozymu a dimerů lysozymu

typ	konc.	po	po	po	PO
prostředku	(mg/ml)	24 h	3 dnech	5 dnech	7 i
kontrola			0	0	0
monomer
lysozymu	1,0	2	2	3	3
	0,1	1	2	3	3
	0,01	0	2	2	2
	0,001	0	0	0	0
	0,0001	0	0	0	0
dimer
lysozymu	1,0	0	0	0 .	0
	0,1	0	0	0	0
	0,01	0	0	0	0
	0,001	0	0	0	0
	0,0001	0	0	0	0

Testy byly prováděny třikrát na kultuře GMK fibroblastů.

znamená cytotoxicitu 0%, znamená cytotoxicitu .25%, znamená cytotoxicitu 50%, znamená cytotoxicitu 75%, znamená cytotoxicitu 100%.

Jak lze vidět z tabulky I, bylo prokázáno, že monomer lysozymu je cytotoxický pro fibroblasty po dvacetičtyřech hodinách při koncentracích 0,1 mg/ml a 1,0 mg/ml. Po třídenní inkubaci vykazoval monomer cytotoxické účinky na fibroblasty dokonce při koncentraci 0,01 mg/ml, kdy bylo ovlivněno 50 % inkubovaných buněk. Po pěti dnech bylo cytotoxickou aktivitou monomeru lysozymu při koncentracích 1,0 mg/ml a 0,1 mg/ml ovlivněno 75 % kultivovaných buněk.

Na rozdíl od předchozího, nevykazovala dimerní forma lysozyCS 277030 B6 mu žádné cytotoxické účinky v kterékoliv.z koncentrací použitých v testu ani po sedmi dnech inkubace. Tyto studie tedy prokázaly, že dimer lysozymu je asi 100 krát méně toxický na GMK fibroblasty než monomer lysozymu.

Jak je vidět z tabulky II, bylo prokázáno, že monomer pankreatické ribonukleasy A je cytotoxický pro GMK fibroblasty v pětidenní kultuře dokonce při tak nízkých koncentracích jako je 0,0001 mg/ml. Po sedmidenní kultivaci byl cytotoxický účinek pankreatické ribonukleasy A při koncentracích 0,01 mg/ml a vyšších dostatečně silný pro to, aby eliminoval 100 % kultivovaných buněk .

Podobně jako tomu bylo v případě dimeru lysozymu, dimerní forma pankreatické ribonukleasy A nevykazovala žádný cytotoxický účinek na GMK fibroblasty v kterékoliv z koncentrací použitých v trvání testu. Tyto výsledky tedy prokázaly, že dimer pankreatické ribonukleasy A byl asi 1 000 krát až 10 000 krát méně toxický na GMK fibroblasty než monomer pankreatické ribonukleasy A.

Tabulka II

Testy cytotoxicity monomeru pankreatické ribonukleasy A a dimeru pankreatické ribonukleasy A

typ konc.	Ρθ	PO	PO	Po
prostředku (mg/ml)	24	h 3 dnech	5 dnech	7 dnech
kontrola	0	0	0	0
monomer pankre-
atické ribonuk-
leasy A 1,0	1	2	4	4
0,1	0	1	3	4
0,01	0	0	3	4
0,001	0	0	2	3
0,0001	0	1	1	2
dimer pankrea-
tické ribonuk-
leasy A 1,0	0	0	0	0
0,1	0	0	0	0
0,01	0	0	0	0
0,001	0	0	0	0
Testy byly prováděny třikrát	na	kultuře GMK	fibroblastů.

znamená cytotoxicitu 0%, znamená cytotoxicitu 25%, znamená cytotoxicitu 50%, znamená cytotoxicitu 75% a znamená cytotoxicitu 100%.

Příklad 2

Byly studovány protivirové účinky dimeru lysozymu. V těchto pokusech byl dimer lysozymu injekčně podán oplodněným slepičím vejcím starým 10 dnů v koncentracích 10,0 mg/ml, 1,0 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml a 0,001 mg/ml. Ke každé z uvedených končen7 trací dimeru byl přidán virus kmene Sendai (hemaglutinační titr 1 i 128 HA) v množství dvou hemaglutinačních jednotek. Po podání dimeru lysozymu a viru se vajíčka inkubují 72 hodiny při teplotě °C. Po inkubační periodě se z inkubovaných vajec isoluje amniotická a allantoidní kapalina. Tyto kapaliny se podrobí hernaglutinačnímu testu pomocí mikromethod s použitím Takatsay setu a slepičích krevních elementů. Pokusy se potom zopakují. Výsledky, které byly získány v těchto experimentálních zkouškách jsou uvedeny v tabulce III. Jak lze vidět z tabulky III, dimer lysozymu inhibuje replikaci viru Sendai kultivovaného v deset dnů starých oplodněných slepičích vajíčkách, dokonce i při tak nízkých koncentracích, jako je 0,01 mg/ml.

Tabulka III

Efekt dimeru lysozymu na virus kmene Sendai

Koncentrace dimeru inhibice hemaglutinace/hemaglutinační test lysozymu (mg/ml) na slepičích krevních krvinkách methodou podle Takatsyho září 1987 listopad 1987

10,0	+ + +	nesledováno
1,0	+ + +	+ + +
0,1	+ + +	+ + +
0,01	+ + +	+ + +
0,001	+ +	žádná inhibice

V předcházející tabulce II + + + znamená úplnou inhibici (1 : 256), + + znamená omezenou inhibici (1 : 32).

1. Testy se provádějí s virem kmene Sendai. Virový hemaglutinační titr byl 1 : 128 HA.

2. Jako experimentální model sloužila deset dnů stará oplodněná slepičí vejce.

3. Ke každé koncentraci dimeru lysozymu bylo přidáno stejné množství viru Sendai - po dvou hemaglutinačních jednotkách. Ve stejnou dobu byl proveden kontrolní test pro dimer lysozymu, aby se zjistilo, jestli má hemaglutinační vlastnosti - výsledek byl negativní. Pro intraamniotické infektování čtyř slepičích vajíček byly potom použity postupné koncentrace dimeru lysozymu plus 22 jednotek HA viru. Vajíčka byla inkubována sedmdesát dvě hodiny při teplotě 37 °C.

4. Po inkubační době byla z infektovaných vajíček isolována amniotická a allantoidní tekutina. Hemaglutinační test byl proveden (hemaglutinační mikromethodou) s použitím testovacího setu podle Takatsyho a slepičích červených krvinek.

Příklad 3

Účinky dimerních forem lysozymu a pankreatické ribonukleasy

A na bakterie se testují na několika pathogenních kmenech získaných z krav s mastitidou. Vliv různých koncentrací dimeru lysozymu na tři kmeny (Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae a S.

liberis) je uveden v tabulce IV. Výsledky tohoto testu ukazují, že všechny tři kmeny Streptococcus jsou citlivé na dimer lysozymu. To bylo nejřetelnější v případě S. liberis, který byl ovlivňován aktivitou dimeru v tak nízké koncentraci, jako je 1,25 mg/ml. Bakteriostatické účinky na jiné kmeny Streptococcus byly pozorovány při koncentracích počínaje od asi 10 mg/ml.

Tabulka IV

Minimální inhibični koncentrace dimeru lysozymu (v mg/ml). Bakteriální kmeny byly kultivovány na vzorcích isolovaných z krav s mastitidou dimer lysozymu (v mg/ml) bakteriální „kmeny 1,25 2,5 5,0 10,0 20,0

Streptococcus agalactiae + + + Streptococcus dysgalactiae + + + Streptococcus liberis

- znamená žádná proliferace bakterií + znamená proliferaci bakterií

Testy citlivosti byly prováděny podle obecně přijatých mezinárodních zásad doporučených WHO.

V tabulce V jsou uvedeny účinky dimeru pankreatické ribonukleasy A a dimerů lysozymu na kmeny pathogenních bakterií kultivovaných z lidských pacientů.

Tabulka V

Minimální inhibični koncentrace dimeru pankreatické ribonukleasy A (v mg/ml). Bakteriální kmeny byly kultivovány na vzorcích isolovaných z pacientů.

bakteriální kmeny	dimer pankreatické ribonukleasy A (v mg/ml)	dimer lysozymu (v mg/ml)
2,5	5,0	10,1	20,0	2,5	5,0	10,0	20,0
Pseudomonas aeruginosa	+	-	-	-	+	+	+	+
Escherichia coli	+	+	-	-	+	+	+	+
Próteus vulgaris	+	+	-	-	+	+	+	+
Staph. aureus (stand.kmen 209)	+	+	+	+	+	-	-	-
*

bakteriální kmeny	dimer pankreatické ribonukleasy A (v mg/ml)	dimer lysozymu (v mg/ml)
2,5	5,0	10,1	20,0	2,5	5,0 10,0 20,0
Staph. aureus (pathogenní kmen z pac.)	+	. +	+	+	+	—
Staph. aureus kmen MRSA č. 11704	+	+	+	+	+	+
Staph. aureus kmen MSRA č. 11708	+	+	+	+	+	+
Strept. pyogenes pathogenní kmen z pacientů	+	+	+	+	+	«Κ OS

- znamená žádná profilerace bakterií + znamená proliferaci bakterií

MSRA znamená Staphylococcus aureus resistentní na methicilin. Kmeny byly isolovány z pacientů. Testy citlivosti byly prováděny podle obecně přijatých zásad doporučených WHO.

Jak lze z tabulky V vidět, dimer pankreatické ribonukleasy A byl nejúčinnější na bakteriální kmeny Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli a Próteus vulgaris, zvláště v koncentračním rozmezí od 5 do 10 mg/ml. Bylo zjištěno, že bakteriální kmeny Staphylococcus a Streptococcus jsou citlivé na dimer lysozymu také v koncentracích asi 5 až 10 mg/ml. Tyto citlivosti byly prováděny podle obecně přijatých mezinárodních zásad doporučených WHO (Světová zdravotnická organisace).

Příklad 4

Účinek dimeru lysozymu a dimeru pankreatické ribonukleasy A na proliferaci erythroleukemických buněčných linií K-562 byl stanoven tak, že na buňky těchto linií se aplikují různé koncentrace dimerů. Výsledky těchto testů jsou uvedeny v tabulkách VI a VII.

Tabulka VI

Účinek dimeru lysozymu na proliferaci erythroleukemických buněčných líní K-562. Používají se buněčné linie K-562 v koncentraci

10⁵ ml. Účinek byl vyhodnocen po 24 hodinách kultivace při teplotě 37 °C s průtokem 5% oxidu uhličitého.

proliferace buněk K-562 po 24 hodinách kultivace in vitro koncentrace dimeru lysozymu (mg/ml) počet buněk procento mrtvých buněk

kontrola	190 000	2 až 3 %
1,0	lyse buněk	100 %
0,1	107 000	95 %
0,05	98 000	99 %

Tabulka VII

Účinek dimeru pankreatické ribonukleasy A na proliferaci erythroleukemických buněčných linií K-562. Používají se buňky K-562 v koncentraci 10⁵ ml. Účinek byl vyhodnocen po 24 hodinách kultivace při 37 °C s průtokem 5% oxidu uhličitého

koncentrace pankreatické ribonukleasy A ve formě dimeru	proliferace buněk K-562 po 24 hodinách kultivace in vitro
počet buněk	procento mrtvých buněk
kontrola	207 000	2 až 5
1,0	68 000	74
0,1	140 000	14
0,05	150 000	7

Dimery lysozymu ve všech koncentracích použitých v tomto pokusu vykazovaly cytopathogenní účinky na buňky K-562. A dále, jak lze vidět z tabulky VII, dimer pankreatické ribonukleasy A měl na erythroleukemické buněčné linie také podobný účinek, ale pouze při koncentracích 1,0 mg/ml.

Příklad 5

Byl studován účinek dimeru lysozymu na hnisavý zánět ucha (puruientní otitida) psů. Studie byla provedena na 19 psech různých ras s různými formami onemocnění. Onemocnění bylo charakterisováno zánětlivým procesem, který trval v průměru asi sedm až čtrnáct dnů, v jednom případě však trval devět měsíců. Před započetím léčení bylo u sedmi psů zkoumáno hnisavé ložisko ze zaníceného ucha, aby byly identifikovány bakteriální kmeny. Tyto kultivační testy ukázaly přítomnost zárodků Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, Coccidia species a různých druhů bacilů.

Postižení’ psi vykazovali různé projevy bolesti, jako například třepání hlavou a snahu dosáhnout si na infektované místo tlapkami. Psi měli obvykle oslabenou chut a zvýšené teploty (39,2 až 41,2 °C). Osm z těchto psů nebylo předem léčeno žádným farmakologickým prostředkem. Jednomu psu, u něhož infekce přetrvávala devět měsíců, bylo podáváno několik antibiotik. Tato antibiotika však nebyla při léčení tohoto psa účinná.

Tito psi byli léčeni prostředkem podle tohoto vynálezu, který se skládal z roztoku 20 mg dimeru lysozymu a 25 ml fysiologické soli. Prostředek byl aplikován ve formě kapek. Do zaníceného ucha bylo čtyřikrát až pětkrát denně nakapáno 10 kapek. Již po prvém dnu léčení bylo pozorovatelné značné zlepšení stavu: teploty poklesly, psi se zřetelně cítili spokojenější a měli lepší chul: k jídlu. Příznaky hnisavého zánětu plně ustoupily mezi 3. a 6. dnem léčení. U psa, který byl předem neúspěšně léčen antibiotiky, nemoc úspěšně ustoupila po deseti dnech. Dimer lysozymu je tedy účinný při léčení hnisavého zánětu uší u psů.

Příklad 6

Byly studovány účinky dimeru lysozymu na mastitidu krav. Pro toto studium bylo použito šest krav s mastitidou. Tyto krávy vykazovaly příznaky onemocnění, jako jsou například teploty nad

40,5 ®C a snížená chut ke žrádlu. Ve všech šesti případech se s léčením začalo druhý den po onemocnění. Před podáváním prostředků byly odebrány vzorky mléka a zjišťován obsah bakterií v mléce. Bylo ~ zjištěno, že mléko obsahuje mikroby, jako je například Staphylococcus a Streptococcus agalactiace.

Každé krávě byl injekční stříkačkou do postižených struků podáván dimer lysozymu v dávce 40 mg dimeru lysozymu v 50 ml fysiologického solného roztoku dvakrát denně. Bylo zjištěno, že již po pouhých dvaceti čtyř hodinách byla tělesná teplota opět normální a kravám se vrátila chut ke žrádlu. Po třech dnech žádná z léčených krav nevykazovala jakýkoliv příznak onemocnění. V léčení bylo proto pokračováno pouze do čtvrtého dne. Po této době neobsahovalo mléko žádný z pathogenních mikrobů, které byly nalezeny před léčením. Nebyly nalezeny také žádné změny v mléce, které by indikovaly subklinickou mastitidu. U žádné z léčených krav nebylo zjištěno snížení produkce mléka ani snížená průchodnost struků. Po dvaceti čtyř hodinách od léčení krav dimerem lysozymu nebyly v mléce nalezeny žádné blokující látky. Rychlé zmizení příznaků onemocnění a také plné zachování produkce mléka tak ukázaly, že prostředky s dimerem lysozymu podle tohoto vynálezu se mohou s úspěchem používat při léčení mastitidy skotu. Toto léčení bude mít ekonomický význam zvláště při prevenci mastitidových infekcí způsobených bakteriálními kmeny Staphylococcus a Streptococcus, které běžně stojí mlékárenský průmysl přibližně 5,4 miliard US dolarů ročně.

Příklad 7 · .

Infekce způsobená psím parvovirem a (CPV) byla léčena orálním podáváním dimeru lysozymu. U 27 psů různých ras a hmotností ve věku od 3 měsíců do 6 let nalezl veterinář řadu příznaků typických pro infekci parvoviry. Všechna zvířata v tomto testu měla vysoké teploty (40 až 41,6 °C), časté záchvaty hojného zvracení, četné a charakteristicky páchnoucí průjmové stolice a také příznaky dehydratace a apatie. Zvířata dělala dojem, že intensivně trpí. S léčením se započalo v průměru mezi třetím a pátým dnem infekce podle toho, jak brzy přivedl majitel svého miláčka k veterináři. Infektovaným psům byl podáván dimer lysozymu v dávce 1 až 2 mg na kg tělesné hmotnosti dvakrát denně. Zvířatům, která byla ještě schopna pít, byl dimer lysozymu podáván v nápojové vodě. Zvířatům, která nebyla schopna pít, byl prostředek podáván sondou ve fysiologickém roztoku.

Z 27 léčených psů jich 25 opět získalo úplný fysiologický pocit po třech až pěti dnech léčení. Typicky bylo pozorováno, a to dokonce i během prvého dne léčení, značné snížení počtu stolic a ataků zvracení, u většiny psů potom tyto příznaky ustoupily úplně po dvou dnech léčení. U několika psů tyto příznaky zmizely dokonce po prvé dávce prostředku. U žádného zvířete nebyly pozorovány vedlejší účinky ve spojitosti s podáváním prostředku s dimerem lysozymu. Tyto klinické testy ukazují, že prostředek s dimerem lysozymu podle vynálezu se může úspěšně používat u psů při infekci způsobené parvoviry.

Příklad 8

Byly studovány účinky prostředku s dimerem lysozymu podle tohoto vynálezu na jistá dermatologická onemocnění člověka. Testy byly prováděny s několika desítkami pacientů ve věku od 15 do 35 let, kteří měli různá kožní onemocnění, jež byla před tím neúspěšně léčena konvenčními způsoby. V této skupině byly identifikovány následující nemoci:

1. chronická furunkulosa (Furunkulosis chronica) - 2 případy

2. fíkovina (Sycosis barbae) - 1 případ

3. nakažlivé impetigo (I. contegiosa) - 11 případů

4. akné prosté (Acne vulgaris) - 22 případů

5. trudovina růžovitá (Rosacea) - 6 případů

6. varikosní vřed (Varicosa ulcer) - 12 případů

U některých pacientů této skupiny předcházely tomuto léčení testy bakteriální kultury. Ve většině případů byl z isolovaného materiálu kultivován Staphylococcus aureus. Léčení spočívalo v tom, že byla čtyřikrát denně podávána mast, která obsahovala 20 mg dimeru lysozymu. Zvláště výhodný předpis pro mast je následuj ící:

dimer lysozymu	20,0	mg
acetylstearoyloxyalkohol	25,0	mg
kapalný parafin	10,0	mg
Spán 60	5,0	mg
Tween 60	8,0	mg
propylenglykol	10,0	mg
Aseptima M	0,3	mg
Aseptina P	0,16	mg
destilovaná voda	200,0	ml

U všech pacientů chorobné stavy kůže zmizely během 10 až 12 dnů, v některých případech se kůže vyčistila po 3 dnech. Léčení pacientů s chronickou furunkulosou trvalo 4 až 5 týdnů, lqpení pacientů s varikosním vředem od 2 do 12 týdnů podle toho, jaký /

/ /

byl stav kůže a jak dlouho před léčením se nemoc rozvíjela. Výsledky získané v této studii ukazují, že dimer lysozymu se může s úspěchem použít pro různá kožní onemocnění.

Příklad 9

Prostředkem s dimerem lysozymu podle tohoto vynálezu byla léčena různá infekční onemocnění genitální oblasti. Devět žen ve věku od 25 do 49 s tímto onemocněním bylo podrobeno tomuto léčení . Sedm pacientek mělo chronický zánět pochvy (Colpitis chronica), jedna pacientka měla Douglesův vřed a jedna zánět bartholinské žlázy (Bartholinitis). Pacientkám s chronickým hnisavým zánětem pochvy byly podány intravaginální čípky, které obsahovaly 10 mg dimeru lysozymu ve 2 ml hydrofilní base. Čípky byly podávány dvakrát denně po dobu 7 dnů. U všech pacientek byl pozorován celkový ústup zánětu genitální oblasti. Navíc zmizela také leukorhagie a další příznaky. Pacientce s Douglasovým vředem bylo podáváno 20 mg dimeru lysozymu v 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného dvakrát denně po dobu čtyř dnů. Roztok byl aplikován přímo do Douglasovy kavity. Před každým podáním dimeru lysozymu byl z- Douglasovy kavity odebrán hnisavý obsah. Tyto kultury obsahovaly Streptococcus haemolyticus a bacterium coli. Pacientčiny abnormálně vysoké teploty se snížily na normální hodnoty během 24 hodin po prvním podání dimeru lysozymu. Během této doby ustoupily také příznaky bolesti. Čtvrtý den po druhém podání prostředku s dimerem lysozymu nebyl v Douglasově kavitě nalezen žádný hnis. V tomto případě došlo k opětovnému výskytu onemocnění po třech týdnech. Další dvě dávky dimeru lysozymu podané do Douglasovy kavity však přivedly onemocnění plně pod kontrolu.

Pacientka se zánětem bartholinské žlázy byla léčena jednou dávkou 20 mg dimeru lysozymu v 1 ml 0,9% roztoku chloridu sodného, která byla podána bezprostředně do zhnisané. žlázy. Po čtyřech dnech byla tato pacientka úplně vyléčena. Během dalších čtyř měsíců nedošlo k opětovnému objevení se tohoto onemocnění. Tyto klinické testy ukazují, že dimer lysozymu má mimořádně příznivý therapeutický účinek v případech jistých infekčních onemocnění genitální oblasti žen. A dále se zdá zřejmé, že bude možné léčit lokální vřed podáváním dimeru lysozymu přímo do kavit s hnisavým obsahem.

Příklad 10

Byl studován účinek roztoku s dimerem lysozymu na infektovaná poranění. V této skupině byli 4 pacienti s infektovanými post-operačními ranami: dvě ženy po laparatomii, jedna žena po amputaci prstu (díky nekrose během diabetické angiopathie) a jeden muž po amputaci dolní končetiny (díky Burgerově nemoci). Ve všech případech dostávali pacienti čtyřikrát denně vlhké aplikace a omývání roztokem dimeru lysozymu v 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného. U pacientek se zhnisanými ranami po laparotomii došlo k úplnému vyléčení v období po čtyřech a po šesti dnech. U dalších došlo k vyléčení po 21 dnu a po 5 měsících. Tyto testy ukazují, že dimer lysozymu se může používat jako therapeutický prostředek bez vedlejších efektů při léčení infektovaných post-operačních ran.

Příklad 11

Byla provedena klinická pozorování na pacientech s genitálním oparem (Herpes genitalis) léčených prostředkem obsahujícím dimer ribonukleasy A. Studovaná skupina zahrnovala pět pacientek ve věku od 23 do 36 let. Čtyři z nich měly toto onemocnění po prvé, jedna pacientka onemocněla po třetí. Všechny pacientky trpěly zpuchýřovatěním, které se normálně vyskytuje mezi třetím a pátým dnem onemocnění, a stěžovaly si na velmi silné bolesti v hrázové (perineální) oblasti, zvláště během močení. U všech pacientek jsme zjistili nabobtnání a infekci pysku a také četné puchářky naplněná zakalenou kapalinou na slizovitých pyskových membránách a na vnější kůži stehenní a analání oblasti. Všechny pacienty měly zvětšené a bolestivé tříšlové (inguinální) lymfatické uzlinky.

Léčení spočívalo v tom, že se na puchýřky a na infektované plochy sliznaté membrány čtyřikrát až pětkrát denně aplikuje mast, která obsahuje dimer ribonukleasy A. Aplikovaná mast měla následující složení:

dimer ribonukleasy	20,0	mg
acetylstearoyloxyalkohol	25,0	mg
kapalný parafin	10,0	mg
Spán 60	5,0	mg
Tween 60	8,0	mg
propylenglykol	10,0	mg
Aseptima M	0,3	mg
Aseptina P	0,16	mg
destilovaná voda	200,0	ml

Pacientky udávaly, že po několika minutách a nanejvýše během jedné hodiny od prvé aplikace masti s dimerem bolest podstatně polevila a po dalších 10 až 20 hodinách úplně zmizela. Lékařská prohlídka ukázala, že u čtyř pacientek ustoupily pathologické změny úplně po třech dnech léčení. U další pacientky pathologické stavy úplně zmizely po pěti dnech. Po aplikaci masti s dimerem pankreatické ribonukleasy A se u žádné pacientky nevytvořily nové puchýřky. Shora uvedená studie ukazuje, že masti obsahující dimery podle tohoto vynálezu se mohou používat přo úspěšné léčení Herpes genitalis.

Příklad 12

Více než sto pacientů různého věku s oparem na rtu bylo léčeno prostředky podle tohoto vynálezu. Všichni tito pacienti mají následující příznaky: otok oblasti horního rtu, zčervenání a početné puchýřky naplněné zakalenou kapalinou. Všichni pacienti si stěžovali na bolest na kůži v oblastech zasažených onemocněním, vedle toho pociťovali i tlak v těchto tkáních. Léčení spočívalo v lokální aplikaci čtyřikrát až pětkrát denně masti obsahující dimer pankreatické ribonukleasy A.

Všichni léčení pacienti bez výjimky konstatovali, že bolest a tlak ve tkáních rychle ustoupily. Bolest ustoupila úplně během několika hodin po aplikaci, podobně jako shora uvedeno v případech genitálního oparu. Lékařské prohlídky ukázaly, že otok i puchářky zmizely během dvou až tří dnů. V jednotlivých případech to podle stavu onemocnění trvalo až pět dnů než došlo k úplnému vyčištění kůže a celkovému zahojení. Dále bylo zjištěno, že u pacientů, jejichž léčení započalo v prvý den onemocnění, příznaky onemocnění na kůži, jako je například otok, dráždivost a papuly, úplně zmizely po dvaceti čtyř hodinách. Dále bylo zjištěno, že osoby, které trpěly častým opětovným výskytem tohoto onemocnění, měly prodloužená období mezi opětovným výskytem onemocnění a dále, že příznaky opětovného onemocnění byly pokaždé mírnější. V žádném případě nebyly pozorovány žádné vedlejší účinky.

Příklad 13

Byl prováděn klinický význam na šesti pacientech s pásovým oparem (herpes zoster), kteří byli léčeni prostředkem s dimerem podle tohoto vynálezu. V pěti případech se onemocnění vyvíjelo typickým způsobem, v šestém případě došlo ke zvláštním komplikacím, které budou diskutovány níže. Tito pacienti byli léčeni mastí obsahující dimer pankreatické ribonukleasy A. S léčením se započalo třetí nebo čtvrtý den onemocnění. Mast byla aplikována čtyřikrát až pětkrát denně.

Ve všech případech bolesti úplně ustoupily během prvních 24 až 48 hodin. Po třech až čtyřech dnech došlo k vysušení puchýřků a tak bylo rozhodnuto po této době skončit s léčením. Během několika dalších dnů se příznaky na kůži úplně zahojily. U žádného z pacientů bolest nepřetrvávala déle než asi prvních 24 až 48 hodin. U žádného ze tří pacientů, kteří byli pozorováni ještě déle než jeden rok, se příznaky nemoci znovu neobjevily. Jak bylo shora uvedeno, u jednoho pacienta došlo k neobvyklému klinickému vývoji onemocnění. Žena ve věku 42 let byla léčena na plicní rakovinu kobaltovou therapií, která však vážně poškodila její imunitní systém. Vedle obvyklých příznaků pásového oparu bylo zjištěno obecné rozšíření puchýřků po celém jejím těle. Léčení této pacientky s poškozenou imunitou prostředkem s dimerem ribonukleasy podle tohoto vynálezu bylo naprosto úspěšné. Ke kompletnímu ústupu puchýřků došlo po několika dnech; úspěšné výsledky u této pacientky· i ú dalších členů této skupiny ukazují na zvláštní účinnost dimeru pankreatické ribonukleasy A na pásový opar, který způsobují viry Varicella.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Protivirový a protibakteriální prostředek, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje dimer, vybraný ze skupiny zahrnující dimer lysozymu a dimer ribonukleasy a dále obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič.
2. Prostředek podle bodu 1, vyznačující se tím, že jako dimer obsahuje dimer lysozymu.
3. Prostředek podle bodu 1, vyznačující se tím, že jako dimer obsahuje dimer ribonukleasy.

Prostředek podle bodu 3, vyznačující se tím, sáhuje dimer pankreatické ribonukleasy A.

Prostředek podle bodu 1, vyznačující se tím, že jako dimer obže jako nosič obCS 277030 B6 sáhuje hydrofilni basi.
6. Prostředek podle bodu 5, vyznačující se tím, že dimer je obsažen v hydrofilni basi v koncentraci asi 10 mg na 2 ml uvedené base.
7. Prostředek podle bodů 5 nebo 6, vyznačující se tím, že je vytvořen ve formě čípku.
8. Prostředek podle bodu 1, vyznačující se tím, že jako nosič obsahuje vodu.
9. Prostředek podle bodu 1, vyznačující se tím, že jako nosič obsahuje fyziologicky přijatelný roztok soli.
10. Prostředek podle bodu 9, vyznačující se tím, že dimer je obsažen v roztoku soli v koncentraci asi 0,8 mg/ml.
11. Prostředek podle bodu 9, vyznačující se tím, že jako nosič obsahuje roztok chloridu sodného ve vodě o koncentraci 0,5 až

1,5 %.
12. Prostředek podle bodu 1, vyznačující se tím, že uvedený nosič je ve formě masti.
13. Prostředek podle bodu 12, vyznačující se tím, že mast je tvořena směsí vody, parafinu a propylenglykolu.
14. Prostředek podle bodu 12, vyznačující se tím, že dimer je v uvedené masti obsažen v koncentraci asi 0,02 mg/ml.
15. Prostředek podle bodu 12, vyznačující se tím, že jako dimer •obsahuje dimer lysozymu.
16. Prostředek podle bodu 12, vyznačující se tím, že jako dimer obsahuje dimer ribonukleasy.
17. Prostředek podle bodu 1, vyznačující se tím, že dimer je obsažen v koncentraci od asi 0,001 mg/ml do asi 20,0 mg/ml, vztaženo na nosič.
18. Použití prostředku podle bodů 1 až 17, obsahujícího dimer, který je vybrán ze skupiny zahrnující dimer lysosymu a dimer ribonukleasy, a farmaceuticky přijatelný nosič, jako léčiva.

Konec dokumentu