HU204710B

HU204710B - Process for producing pharmaceutical compositions having antiviral and antibacterial effect

Info

Publication number: HU204710B
Application number: HU883981A
Authority: HU
Inventors: Witold Kiczka
Original assignee: Nika Health Products Inc
Priority date: 1988-05-26
Filing date: 1988-05-26
Publication date: 1992-02-28
Also published as: DK16890D0; ATE93143T1; FI900412A0; YU109289A; DK173078B1; JPH03504121A; ZA893382B; AU1940888A; EP0380484B1; IL90092A; HUT54060A; LV10054A; US5200182A; US5466449A; CA1335425C; WO1989011294A1; HK42394A; HU883981D0; EP0380484A1; ES2011577A6

Description

A találmány tárgya eljárás új antívirális és antibakíeriális hatású gyógyászati készítmények előállítására, amelyek hatóanyagként polimerizált enzimeket tartalmaznak, gyógyászatiig elfogadható hordozóanyaggal összekeverve.

Az antibiotikumokra rezisztens baktériumtörzsek és vírusos betegségek egyre növekvő száma szükségessé teszi újfajta gyógyszerek bevezetését, emberek és állatok kezelése céljából. A jelenlegi sokrétű kezelés és gyógyszer között ismert többek között a monomer formában lévő enzimek használata különféle betegségekben szenvedő betegek kezelésére. Az enzimek katalitikus hatású proteinek, amelyek az élő szervezetek majdnem minden fontos életfolyamatában szerepet játszanak. így sok enzimet izoláltak már tisztán, vagy bizonyos kombinációkban fizikai-kémiai, fiziológiai vagy biológiai hatásuk miatt.

A lizozim és a ribonukleáz azok között az enzimek között van, amelyeknek bizonyos gyógyászati hatását már leírták. A lizozim 1922 óta ismert, ebben az évben fedezte fel Fleming. A lizozim enzimatikus funkcióit azonban csak 1950 után fedezték fel. Azóta ezt a vegyületet fizikai-kémiai, fiziológiai és klinikai kutatásokban kiterjedten vizsgálják, azonban biológiai jelentőségét még mindig nem ismerik teljes mértékben. Ismeretes, hogy a lizozim különféle gyógyászati hatásokkal -például antívirális, antibakteriális, gyulladáscsökkentő és antihisztamin tulajdonságokkal - rendelkezik. Antibakteriális hatása valószínűleg az N-acetilmuraminsav és az N-acetil-glükózamin közötti β-1-4glükozidos kötés hidrolízisén alapul, az ilyen kötések a bakteriális sejtfalban fordulnak elő.

A h'zozim jelenlétét fagocita-sejtekben szintén sokan kimutatták. Az e területen végzett kutatások azt mutatják, hogy a lrzozimekben rnttacellulárisan tartalmazott lizozim enzim felelős a fagocrtált baktériumok felemésztéséért. Emberben a lizozim a megfigyelések szerint stimulálja a fagocitőzist, 10-400 mg/ml fiziológiás koncentrációban.

A lizozim egyéb tulajdonságait is leírták. Például · úgy tűnik, hogy a lizozim csökkenti a testhőmérsékletet a fertőzés folyamán, amikor a hőmérséklet a válasz a íoxinok által szabaddá tett endogén pirogénekre. Az is valószínű, hogy a lizozim szerepet játszik az immunológiai folyamatokban a gamma-globulinok, opszonr- ¹nők és egyéb antitestek szintézisének stimulálása útján. Ezenkívül az is valószínű, hogy a lizozim erős gyulladáscsökkentő hatással rendelkezik. A lizozim ismert hasznos tulajdonságai, és a kiterjedt kutatások eredményeként előállított lizozrm-alapú gyógyászati készít- í mények ellenére, a lizozim enzim gyógyászati célokra való alkalmazása rgen korlátozott

A ribonukleázok az enzimek egy másik csoportját képezik, amelyeket különféle biológiai hatásuk szempontjából sokat tanulmányoztak. Az enzimek ezen cső- 5 portja sok állati és növényi szervezetben, valamint baktériumsejtekben is szokásosan előfordul. Tulajdonságaik tanulmányozását és izolálásukra irányuló kutatásokat Schmidt és McDonald kezdték el 1955-ben. A fenti enzimmel kapcsolatos megfigyelések között említhet- 6 jük például, hogy a ribonukleázok aktivitása rákos szövetekben jelentősen csökken. Felfedezték továbbá, hogy a leukémiát előidéző vírusok drasztikusan csökkentik a sav ribonukleáz aktivitását egérben. Ezenkí5 vűl, a virális leukémiás egerekben a sav ribonukleáz aktivitás jelentős csökkenését tapasztalták mitokondríumokban és a beteg állatok lépszövetéből kapott mikroszóma-frakciókban.

A fent említett vizsgálatok azt sugallják, hogy a ribonukleáz aktivitásának csökkenése valahogyan szoros kapcsolatban van a vírus okozta fertőzésekkel. így feltételezték, hogy a ribonukleáz enzim bizonyos antivirális aktivitással rendelkezik. Azonban jelenleg nem ismeretesek olyan készítmények, amelyekben ezt az > enzimet aníivirális széfként használnák.

Annak, hogy az ilyen potenciálisan hatásos enzimeket nem alkalmazzák széles körben gyógyászati készítmények hatóanyagaként az egyik fő oka az, hogy ezek az enzimek és más enzimek is monomer formájukban ¹ ciíotoxikus hatást mutatnak. Tenyésztett fibroblasztokkal végzett vizsgálatok szerint kimutatták, hogy a lizozim és ribonukleáz monomerek már igen alacsony koncentrációkban is citoíoxikusak. Nyilvánvaló, hogy a fenti és más enzimek potenciális gyógyászati hatását csak úgy lehet hasznosítani, ha ezen citotoxikus hatások csökkentésére sikerül eredményes módszert kidolgozni. Célunk tehát olyan gyógyászati készítmények előállítása volt, amelyek hatóanyagként ϋζοζήηεζ ribonukleázt, vagy egyéb hasonló enzimet tartalmaznak, és amelyeket virális vagy bakteriális fertőzések kezelésére alkalmazhatunk anélkül, hogy az enzimek monomer formájában észlelhető citotoxikus hatásokat is mutatnák.

Bartholeyns és Zenebergh [Europ. J. Cancer 15 (4), 85-91 (1979)] ismertették, hogy a ribonukleáz dimer gátolja a patkány ráksejtek replikációját Azonban nem utaltak arra, hogy a fenti vegyület aníivirális vagy antibakteriális hatással is rendelkezne.

Tamowski és munkatársai [Cancer Research 36 (11), 4074-4078 (1976)] hasonlóképpen a ribonukleáz dimemek csak antitumor aktivitását ismertették egérben, antibakteriális - vagy antívirális hatására nem utaltak.

Bartholeyns és Baudhuin [Arch. Int. Phys. Biochim. 84 (1), 139-140 (1976)] szintén csak a ribonukleáz dimer paíkányráksejtek elleni aktivitását ismertették.

D’Alessio és munkatársai [Biochim. J. 141 (1), 317— 320 (1974)] leírták, hogy a dimer ribonukleáz A mindkét aktív helyének egyidejűleg csak akkor kell hozzáférhetőnek lennie, ha az enzim kettős szálú RNS-t bont le. A cikkben azonban semmiféle gyógyászati hatást nem említenek a dimerrel kapcsolatban.

Studebaker és munkatársai [J. Am. Chem. Soc. 93(18), 4579-4585 (1971)] egy aktív hellyel rendelkező lizozim alkalmazása esetén NMR-vizsgálatokat végeztek az enzimreakció termékén. Nem említették azonban a lizozim dimer semmiféle terápiás aktivitását

Megállapítható tehát, hogy egyetlen irodalmi hivatkozásban sem ismertetik a lizozim és ribonukleáz dimerek antívirális vagy antibakteriális hatású gyógyászati készítmények hatóanyagaként való alkalmazását.

HU 204 710 Β

Találmányunk azon a felismerésen alapul, hogy hatóanyagként lizozimet vagy ribonukleázt tartalmazó antivirális vagy antibakteriális hatású, azonban citotoxikus hatás nélküli gyógyászati készítményeket úgy állíthatunk elő, ha az enzimeket dimer formájukban használjuk. A hatóanyagként dimer formában lévő lizozimet vagy ribonukleázt és győgyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmazó gyógyászati készítményekkel számos fertőző betegség eredményesen kezelhető, jelentős toxikus hatás nélkül.

A találmány szerinti eljárás értelmében a hatóanyagként ribonukleáz dimert vagy lizozim dimert tartalmazó gyógyászati készítményeket úgy állítjuk elő, hogy az ismert módon előállított hatóanyagot a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük és antivirális vagy antibakteriális hatású gyógyászati készítménnyé alakítjuk.

Az „ismert módon előállított” kifejezés a találmány elsőbbségi napja előtt publikált, a technika állásából ismert eljárásokat öleli fel.

A találmány szerinti eljárással előállított, antibakteriális és antivirális hatású gyógyászati készítményekhez először be kell szerezni a monomer formában lévő lizozimet és ribonukleázt. A monomer lizozimet (Serva katalógusszáma 28260) és a monomer ribonukleázt (Serva katalógusszáma 34 388), amelyet a találmány szerinti hatóanyagok előállítására használunk, a Serva Feine Biochimica, GmbH und Cooperation, D69-000, Heidelberg cégtől szereztük be. A fenti monomer enzimeket bármely ismert eljárással dimerré polimerizálhatjuk. Előnyös azonban, ha a polimerizálást Carlsson és munkatársai [Biochemistry Journal, 173, 723-737 (1978)] módszere szerint végezzük. Más eljárások, például Sorrentino és munkatársai [Eur. J. Biochem. 124, 183-189 (1982)] eljárása is alkalmazható. Azt is felismertük, hogy a találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítményekben ribonukleáz dimerként különösen előnyösen használható az állati pankreász szövetekből izolált pankreász ribonukleáz A-ból előállított dimer.

Azt tapasztaltuk, hogy a hatóanyagként lizozim vagy ribonukleáz dimer és győgyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények számos bakteriális és vírusos betegség kezelésére alkalmasak, nemkívánatos mellékhatások nélkül. Az enzimek említett káros mellékhatásait összehasonlító vizsgálatokban tanulmányoztuk, amelyekben mind monomer, mind dimer formájú lizozimet és ribonukleázt használtunk. A fenti kísérletekben kabócamajomvese (GMK) fibroblaszt-tenyészetekhez különböző koncentrációkban adtuk a monomer és dimer formában lévő lizozimet és ribonukleázt. Azt tapasztaltuk, hogy a monomer lizozim a fibroblasztokra nézve citotoxikus hatást fejt ki 24 óra alatt, 0,1 mg/ml és 1,0 mg/ml koncentrációkban. Három napon keresztüli inkubálás után a citotoxikus hatást már 0,01 mg/ml koncentrációban is észleltük a fibroblasztokon, amikor is az inkubált sejtek 50%-a elpusztult Ötnapos inkubálás után a tenyésztett sejtek 75%-át elpusztította a monomer lizozim, 1,0 és 0,1 mg/ml koncentrációban. Ezzel szemben, a lizozim dimer nem mutatott citotoxikus hatást a fenti vizsgálatokban használt egyetlen koncentrációban sem, még hétnapos inkubálás után sem. A fenti vizsgálatok szerint a lizozim dimer formája közelítőleg 100szor kevésbé toxikus GMK fibroblasztokkal szemben, mint a monomer forma.

A ribonukleázzal végzett vizsgálat hasonlóan bizonyította a dimer forma citotoxicitásának hiányát A fenti vizsgálatokban a ribonukleáz ötnapos tenyészetben már 0,0001 mg/ml koncentrációban is citotoxikusnak bizonyult GMK fibroblasztok ellen. Hétnapos tenyészetben a ribonukleáz monomerek citotoxikus hatása 0,01 mg/ml koncentrációban és e felett 100%-ban megölte a tenyésztett sejteket Ezzel szemben, a ribonukleáz dimer egyáltalán nem volt citotoxikus GMK fibroblasztok ellen egyeüen vizsgált koncentrációban sem, még hétnapos inkubálás alatt sem. A ribonukleáz dimer formája vizsgálataink szerint közelítőleg 100010 000-szer kevésbé toxikus fibroblasztokkal szemben, mint a monomer forma. Ezek a vizsgálatok világosan mutatják, hogy az enzimek, mint lizozim és ribonukleáz monomer formájának alkalmazásával járó citotoxikus hatások láthatólag eltűnnek, ha ezeket az enzimeket dimeq'eik formájában használjuk.

További kutatásaink azt mutatták, hogy annak ellenére, hogy a lizozim és ribonukleáz dimer formájukban nem fejtenek ki citotoxikus hatást, rendkívül hatásosak virális és bakteriális fertőzések ellen. Megtermékenyített tyúktojással és Sendai vírus törzzsel végzett vizsgálatokban a lizozim dimert intraamnionálisan injektáltuk a tojásokba, különböző koncentrációkban. Minden egyes tojásba két egység Sendai vírust is injektáltunk. Inkubálás után összegyűjtöttük az amnionhoz tartozó és az allantoiszhoz tartozó folyadékot a fertőzött és a kontroll tojásokból, és összehasonlítottuk azokat. A fenti vizsgálat szerint a lizozim dimer már 0,01 mg/ml koncentrációban gátolta a 10 napos megtermékenyített tyúktojásban tenyésztett Sendai vírus replikációjáf Hasonló vizsgálatokkal kimutattuk a lizozim és ribonukleáz dimerek bakteriosztatikus hatását is Streptococcus baktériumokkal szemben.

A lizozim és ribonukleáz dimerekból készített gyógyászati készítmények a fentiek szerint különféle vírusos és bakteriális fertőzések kezelésére használhatók. A gyógyászati készítmények formája különféle lehet, és a találmány szerinti eljárással előállított enzim-hordozóanyag készítményeket belsőleg és külsőleg alkalmazhatjuk ember vagy állatok kezelésére, a kezelendő betegségtől függően. Belső fertőzések - például fülgyulladás, masztitisz, gyomor- vagy vaginális fertőzés kezelésére a dimer enzimet tartalmazó gyógyászati készítményeket megfelelő formában orálisan, intravénásán, parenterálisan, kúp formában vagy bármely egyéb módon adagolhatjuk, amely lehetővé teszi a hatóanyag eljuttatását a fertőzött területre. Külső fertőzések például bakteriális és vírusos bőrbetegségek, fertőzött sebek, herpeszek vagy egyéb, külsőleges szexuális betegségek - kezelésére a találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítményeket bármely arra al3

HU 204 710 Β kalmas formában helyileg adgolhatjuk a kezelendő betegnek.

A kezelendő betegség vagy fertőzés természete megszabja a találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítmény megfelelő formáját Külsőle- 5 ges kezelésre a készítményeket különböző formákban, például kenőcsök, lemosók, oldatok, olajok, stb. formájában alkalmazhatjuk. Ha belsőleges kezelés szükséges, a készítmény formája például csepp, tabletta, oldat kapszula, fogkrém, stb. lehet Akezelendő alany- 10 nak adagolandó készítmény speciális formája így a gyógyászati készítmény előállítására használt gyógyászatiig elfogadható hordozóanyag természetét is meghatározza. Hordozóanyagként többek között hidrofil bázisokat, fiziológiásán elfogadható sóoldatokat, vizet 15 kenőcs-bázisokat porokat stb. használhatunk.

A virális és bakteriális fertőzéseket így enzimatikusan, cítotoxikns mellékhatások nélkül kezelhetjük, ha a kezelendő embernek vagy állatnak a hatóanyagként dimer enzimet tartalmazó gyógyászati készítményből 20 hatásos mennyiséget adagolunk. Hatásos mennyiség alatt itt az antivirális vagy antibakteriális hatás kiváltásához szükséges mennyiséget értjük. A hatásos kezeléshez szükséges mennyiség minden esetben a kezelendő betegség természetétől és a dimer kompozíció fór- 25 májától függ. Általában a találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítményt 0,01-50,0 mg/testtömeg kg, különösen előnyösen 1,0-2,0 mg/testtömeg kg dózisban adjuk a kezelendő betegnek. Helyi kezelés' esetén kb. 4,0 mg dimert kb. 200 ml víz, propilénglikol 30 és paraffin oldatában tartalmazó kenőcsökkel megfelelő hatást érünk el, ha naponta 4-5 alkalommal végezzük a kezelést A fenti dőzistartományba eső dózisok elegendőek számos virális vagy bakteriális betegség kezelésére, káros citotoxikus hatások nélkül, amelyek 35 az enzim monomerekkel végzett kezelés esetén észlelhetőklennének.

A találmány szerinti eljárást a korlátozás szándéka nélkül az alábbi példákkalkívánjukközelebbről ismertetni.

1. példa

Lizozim és pankreász ribonukleáz A monomerek és dimerek citotoxikus hatását hasonlítjuk össze kabőcamajom-vese (GMK) fihroblaszt tenyészetben.

A vizsgálatokban a monomer és dimer enzimeket 45 0,0001-1,0 mg/ml koncentrációban adjuk a fibroblaszt-tenyészethez. A tenyészeteket ezután hét napon keresztül inkubáljuk, majd megvizsgáljuk citotoxicitás szempontjából. A fenti vizsgálatok eredményeit az 1. és 2. táblázatban ismertetjük. 50

1. táblázat

Lizozrm monomer és dimer formájának citoíoxícitása

Készítmény típusa	Konc. (mg/ml)	Citotoxicitás mértéke
24 óra múlva	3 nap múlva	5 nap múlva	7 nap múlva
kontroll			0	O	0
lizozim	1,0	2	2	2	3

Készítmény típusa	Konc. (mg/ml)	Citotoxicitás mértéke
24 óra múlva	3 nap múlva	5 nap múlva	7 nap múlva
monomer	0,1	1	2	3	3
	0,01	0	2	2	2
	0,001	0	0	0	0
	0,0001	0	0	0	0
lizozim	1,0	0	0	0	0
monomer	0,1	0	0	0	0
	0,01	0	0	0	0
	0,001	0	O	0	0
	0,0001	0	O	O	0

A vizsgálatokat háromszor végeztük el, GMK fibroblaszt-tenyészeteken. A kiértékelés az alábbi skála szerint történik:

0: citotoxicitás 0%

1: citotoxicitás 25%

2: citotoxicitás 50%

3: citotoxicitás 75%

4: citotoxicitás 100%

Az 1. táblázat eredményeiből látható, hogy a lizozim monomer 24 órás inkubálás alatt 0,1 és 1,0 mg/ml koncentrációban citotoxikus a fibroblasztokra nézve. Háromnapos inkubálás után a monomer már 0,01 mg/ml koncentrációban is citotoxikus hatást fejt ki az rnkubált sejtek 50%-ára. Ötnapos inkubálás után a tenyésztett sejtek 75%-át érinti a lizozim monomer citotoxikus aktivitása 1,0 mg/ml és 0,1 mg/ml koncentrációkban.

Ezzel szemben, a lizozim dimer formája egyetlen vizsgált koncentrációban sem fejt ki citotoxikus hatást még a hétnapos inkubálás befejeztével sem. A fenti eredmények azt mutatják, hogy a lizozim dimer formája kb. 100-szor kevésbé toxikus GMKfibroblasztokkal szemben, mint a lizozim monomer formája.

2. táblázat

Pankreász ribonukleáz A monomer és dimer formájának citoíoxícitása

Készítmény típusa	Konc. (mg/ml)	Citotoxicitás mértéke
24 óra múlva	3 nap múlva	5 nap múlva	7 nap múlva
kontroll		0	0	0	0
pankreász ribonukleáz	1,0	1	2	4	4
A monomer	0,1	0	1	3	4
	0,01	0	0	3	4
	0,001	0	0	2	3
	0,0001	0	1	1	2
pankreász ribonukleáz	1,0	0	0	0	0
monomer	0,1	0	0	0	0
	0,01	0	0	0	0
	0,001	0	0	0	0

HU 204 710 B

0: citotoxicitás 0%

1: citotoxicitás 25%

2: citotoxicitás 50%

3: citotoxicitás 75%

4: citotoxicitás 100%

A 2. táblázatban közölt eredmények azt mutatják, hogy a pankreász ribonukleáz A monomer ötnapos tenyészetben már 0,0001 mg/ml koncentrációban is citotoxikusnak bizonyult GMK fibroblasztokra. Hétnapos tenyészetben a pankreász ribonukleáz A 0,01 mg/ml és ennél nagyobb koncentrációban 100%-os pusztulást okozott a tenyésztett sejtekben.

A lizozim dimeihez hasonlóan, a pankreász ribonukleáz A diroer formája nem mutatott citotoxikus hatást GMK fibroblasztokra egyetlen vizsgált koncentrációban sem, a hétnapos vizsgálat során. Az eredmények így azt mutatják, hogy a pankreász ribonukleáz A dimer formája kb. 1000-10 000-szer kevésbé toxikus GMK fibroblasztokra, mint a pankreász ribonukleáz A monomer formája.

2. példa

A lizozim dimer formájának antivirális hatását az alábbiak szerint tanulmányozzuk.

A lizozim dimert tíznapos megtermékenyített tyúktojásba injektáljuk, 10,0 mg/ml, 1,0 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml és 0,001 mg/ml koncentrációban. Minden egyes dimer-koncentráció esetén egy Sendai vírus törzset (hemagglutinációs titer = 1:128 HA) injektálunk a tojásba, kb. 2 hemagglutinációs egység mennyiségben. A lizozim dimer és a vírus beadása után a tojásokat 37 °C-on 72 órán keresztül inkubáljuk. Az inkubálási idő letelte után összegyűjtjük a fertőzött tojások amnionos és allantoiszos folyadékait, és Takátsy-féle készletet és tyúk vörösvértestet használva mikromódszerrel meghatározzuk a hemagglutináció mértékét Az eredményeket a 3. táblázatban ismertetjük.

A 3. táblázat eredményeiből látható, hogy a lizozim dimer már 0,01 mg/ml koncentrációban is gátolja a Sendai vírus ieplikációját tíznapos megtermékenyített tyúktojásban.

3. táblázat

Lizozim dimer hatása Sendai vírustörzs ellen

Lizozim dimer koncentrációja (mg/ml)	Hemagglutináció gátlás (hemagglutinációs teszt tyűk-vörösvértesteken Takátsy módszere szerint)
1987 szeptember	1987 november
10,0	+++	nem vizsgált
1,0	+++	+++
0,1	+++	+++
0,01	+++	+++
0,001	++	nincs gátlás

+++ : teljes gátlás, 1:256 ++ : nem teljes gátlás, 1:32

1. A vizsgálatokat Sendai vírus törzsön végezzük, a virális hemagglutinációs titer 1:128.

2. Kísérleti modellként tíznapos megtermékenyített tyúktojást használunk.

3. A lizozim-dimer minden egyes koncentrációjához azonos mennyiségű Sendai vírus-2 hemagglutinációs egységet adunk. Ezzel egyidejűleg a lizozim dimert kontroli-tesztben is vizsgáljuk, annak megállapítására, hogy van-e hemagglutinációs tulajdonsága - a vizsgálat eredménye negatív. A lizozim dimert nagyobb koncentrációkban 22 HA egység vírussal együtt is vizsgáltuk, 4 tyúktojáson. A tojásokat 37 °C-on 72 órán keresztül inkubáltnk.

4. Az inkubálás befejeztével a fertőzött tojásokból összegyűjtöttük az amnionos és az allantoiszos folyadékokat, és Takátsy-féle készletet és tyúkvörösvértestet használva elvégeztük a hemagglutinációs tesztet (hemagglutinációs mikromódszer).

3. példa

A lizozim és pankreász ribonukleáz A dimer formáinak baktériumellenes hatását masztitiszes tehenekből izolált patogén baktériumtörzseken vizsgáltuk.

A lizozim dimer hatását három törzs (Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae és S. liberis) ellen különböző koncentrációk esetén vizsgáljuk, az eredményeket a

4. táblázat tartalmazza.

4. táblázat

Lizozim dimer minimális gátló koncentrációja (mg/ml)

A baktériumtörzseket masztitiszes tehenekből nyert mintákból tenyésztettük ki

Baktériumtörzs	Lizozim dimer (mg/ml)
1,25	2,5	5,0	10,0	20,0
Streptococcus agalactiae	+		+	-	- -
Streptococcus dysgalactiae	+	+	+	-	-
Streptococcus liberis	-	-	-	-	-

-: nincs baktériumszaporodás + : baktérium szaporodik

Az érzékenységi vizsgálatokat a WHO által ajánlott, általánosan elfogadott tesztekkel végezzük.

A 4. táblázatban ismertetett eredmények azt mutatják, hogy mind a három vizsgált Streptococcus törzs érzékeny a lizozim dimerre. Ezt a legvilágosabban a S. liberis esetén mutattuk ki, amelynek szaporodását a lizozim dimer már 1,25 mg/ml koncentrációban gátolta. A másik két Streptococcus törzs esetén a bakteriosztatikus hatást 1,25 mg/ml koncentrációtól kezdve észleltük.

5. táblázat

Pankreász ribonukleáz A és lizozim dimer minimális gáűő koncentrációja (mg/ml) betegekből kitenyésztett baktériumtörzseken

Lizozim dimer hatása K-562 eiythrokémia sejtvonal proliferációjára. A K-562 sejteket lOVml koncentrációban használjuk. A hatást a tenyészet 24 órás inkubálása után értékeljük (37 °C, 5% COt)

Baktériumtörzs	Pankreász ribonukleáz A dimer (mgtol)	Lizozim dimer (mgtal)
2,5	5,0	10,0	20,0	2,5	5,0	10,0	20,0
Pseudomonomas aeruginosa	+	-	-	-	4-	4-	-F	4-
Escherichia coli	+	4·	-	-	4-	4-	4-	4-
Proteus vulgáris	4-	4-	-	-	4-	4-	-F	4-
Staph. auerus 209 (standard törzs)	4-	4-	4-		-F	-	-	-
Staph. auerus (patogén törzs betegekből)	+	4-	4-	4-	4-	-	-	-
Staph. aureus 11704 MRSA'	4-	+	4-	4-	-F	4-	-	-
Staph. aureus 11708 MRSA’	4-	4-	4-	4-	4-	-F	-	-
Streptpyogenes (patogén törzs betegből)	4-	4-	-F	4-	•F	-	-	-

*: MRSA: meticillin-rezisztens Staphylococcus aureus törzs -: nincs bafctériumszaporodás +: baktérium szaporodik

6. táblázat

Az 5. táblázatban pankreász ribonukleáz A dimer és lizozim dimer hatását ismertetjük humán betegekből kitenyésztett patogén baktériumtörzsek ellen. A táblázat eredményeiből látható, hogy a pankreász ribonukleáz A dimer Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli és Proteus vulgáris törzsek ellen a leghatásosabb, 510 mg/ml koncentrációban. A Staphylococcus és Streptococcus törzsek vizsgálataink szerint a lizozim dimerrel szemben érzékenyek, szintén 5-10 mg/ml koncentrációban.

4.példa

A lizozim dimer és pankreász ribonukleáz A dimer K-562 eiythroleukémxa sejtvonalra kifejtett hatását úgy vizsgáljuk, hogy a fenti sejtvonalból származó sejteket a dimerek különböző koncentrációi jelenlétében tenyésztjük. Az eredményeket a 6. és 7. táblázatban ismertetjük.

Összefoglalóan megállapíthatjuk, hogy a lizozim dxmer az összes vizsgált koncentrációban erős cítopatogén hatást fejt ki K-562 sejtekkel szemben. A 7. táblázat adataiból az is megállapítható, hogy a pankreász ribonukleáz A dimer hasonló hatást fejt ki az erythroleukémia sejtvonal ellen, de csak 1,0 mg/ml koncentrációban.

Lizozim dimer koncentrációja (mgtal)	K-562 sejtek proliferáciőja in vitro 24 órás tenyészetben
Sejtek száma	Elpusztult sejtek (%)
kontroll	190000	2-3
1,0	sejtek lízise	100
0,1	107000	95
0,05	98000	99

7. táblázat

Pankreász ribonukleáz A dimer hatása K-562 erythrokémia sejtvonal proliferációjára. A K-562 sejteket lOVml koncentrációban használjuk. A hatást 37 °C-on 5% C0₂ mellett 24 órán keresztül tartó tenyésztés után értékeljük

Pankreász ribonukleáz dimer koncentrációja (mgtol)	K-562 sejtek prolhérációja in vitro 24 órás tenyészetben
Sejtek száma	Elpusztult sejtek (%)
kontroll	207000	2-5
1,0	68000	74
0,1	140000	14
0,05	150000	7

5. példa

A. lizozim dimer hatását gennyes otitiszes közegre kutyában az alábbiak szerint vizsgáltuk.

A vizsgálatokat 19 különböző fajtájú kutyán végeztük, amelyek a betegség különböző formáiban szenvedtek. A betegség jellemzője egy gyulladásos folyamat, amely átlagosan 7-14 napon keresztül tart, egy esetben azonban 9 hónapon keresztül tartott. A kísérleti állatok közül hét kutyánál megvizsgáltuk a gyulladt fülből származó gennyes váladékot a kezelés megkezdése előtt, és azonosítottuk a baktériumokat Ezek szerint a tenyésztési vizsgálatok szerint kimutattuk a Staphylococcusok, kék gennybacillusok, Pseudomonas aeruginosa, Coccidium speciesek és különféle bacillus speciesek jelenlétét

A beteg állatok a fájdalom különféle jelét adták, például fejüket rázták és megpróbálták mancsukkal elérni fertőzött fülüket. Az állatoknak általában csökkent az étvágyuk, és hőmérsékletük megemelkedett (39,2-41,2 °C). A vizsgálatban felhasznált állatok közül 19 nem kapott korábban semmilyen gyógyászati kezelést Egy állatot, amelyben a fertőzés 9 hónapon keresztül tartott, többféle antibiotikummal is kezeltek, de ezek közül egy sem volt hatásos a betegség ellen.

A kutyákat 20 mg lizozim dimer 25 ml fiziológiás sóoldattal készült oldatával, mint találmány szerinti eljárással előállított készítménnyel kezeltük. A készít6

HU 204 710 B ményt cseppek formájában adagoltuk, és a cseppeket a gyulladt fölbe csepegtettük, naponta 4-5 alkalommal. Az első napi kezelés után már kifejezett javulást észleltünk; a hőmérséklet csökkent, és a kutyák láthatólag jobban érezték magukat, és jobb étvágyuk volt A gennyes gyulladás tünetei teljesen megszűntek a kezelés 3. és 6. napja között. A korábban 9 hónapon keresztül antibiotikumokkal sikertelenül kezelt kutyánál is elmúlt a betegség tíznapos kezelés után. A lizozim dimer tehát hatásosnak bizonyult gennyes otitisz kezelésében, kutyán.

6. példa

A lizozim dimer hatását masztitiszes teheneken vizsgáltuk.

A vizsgálatot 6 masztitiszben szenvedő tehénen végeztük el. A tehenek a betegség különböző jeleit mutatták, így hőmérsékletük 40,5 °C felett volt, és étvágyuk csökkent. Mind a hat esetben a megbetegedés második napján kezdtük el a kezelést A készítmény beadása előtt bakteriális vizsgálat céljára tejmintákat vettünk. A tenyésztési vizsgálatok szerint a tej mikrobákat így Staphylococcust és Streptococcus agalactiae-t tartalmazott

A lizozim dimert injekciós fecskendő segítségével adagoltuk a fertőzött mellbimbóba, 50 ml fiziológiás sóoldatban 40 mg hatóanyagdózisban, naponta két alkalommal. Azt tapasztaltuk, hogy 24 óra elteltével a testhőmérséklet ismét normális volt, és az étvágy visszatért. Három nap múlva egyetlen kezelt tehén sem mutatta a betegség szimptómáit A kezelést így csak a negyedik napig folytattuk, majd ismét megvizsgáltuk a tejet, és azt tapasztaltuk, hogy a kezelés megkezdése előtt még jelen volt patogén mikrobák eltűntek. Ezenkívül a tej nem mutatott olyan változásokat amelyekből szubklinikai masztitiszre következtethettünk volna. A kezelt tehenek között egy esetben sem csökkent a tejhozam, és a mellbimbók nyílása sem csökkent A lizozim dimerrel végzett kezelés után 24 órával nem találtunk blokkoló anyagot a kezelt tehenek tejében. A betegség tüneteinek gyors megszűnése és a tejelőképesség teljes helyreállása azt jelzi, hogy a találmány szerinti eljárással előállított, lizozim dimert tartalmazó készítmények tehéu-masztitisz kezelésére is használhatók.

Ez a kezelés rendkívüli gazdasági jelentőségű a Staphylococcus és Streptococcus baktériumtörzsek által okozott masztitiszes fertőzés megelőzésében, amely a tejiparban jelenleg közel 5,4 milliárd dollárba kerül évente.

7. példa

Kutyák parvovírus fertőzését (CPV) kezeltük orálisan adagolt lizozim dimerrel.

A kezelést 27 különféle fajtájú és testtömegű, 3 hónapostól 6 éves kutyán végeztük, amelyekben az állatorvosok parvovírus fertőzésre utaló komplex tüneteket diagnosztizáltak. Az összes kísérleti állatnak magas volt a testhőmérséklete (40-41,6 °C), gyakran heves hányási rohamuk volt, többször volt jellegzetesen büdös székletük, valamint a kiszáradás és apátia tüneteit mutatták. Az állatokon látszott, hogy erős fájdalmaik vannak. A kezelést átlagosan a fertőzés utáni harmadik-ötödik napon kezdtük el, attól függően, hogy az állat gazdája mikor hozta el kedvencét az állatorvosi rendelőbe. A fertőzött állatoknak 1-2 mg/testtömeg kg dózisban adtuk a lizozim dimert, naponta kétszer. Azoknak az állatoknak, amelyek még képesek voltak inni, a lizozim dimert az ivóvizükben adtuk be. Azoknak, amelyek nem tudtak inni, szondán keresztül adtuk a lizozim dimert fiziológiás sóoldatban oldva.

A 27 kezelt állat közül 25 kutya fizikai állapota teljesen helyreállt 3-5 napos kezelés után. Rendszerint már a kezelés első napján jelentősen csökkent a székelések és hányási rohamok száma, és a kutyák többségében ezek a tünetek teljesen eltűntek kétnapos kezelés után. Néhány kutya esetében a tünetek már a készítmény első dózisának beadása után megszűntek. Az állatokban nem észleltünk a lizozim dimer beadásával összefüggő egyetlen mellékhatást sem. Ezek a klinikai vizsgálatok azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított hatóanyagként lizozim dimert tartalmazó gyógyászati készítmények kutyák parvovírus fertőzés elleni kezelésére is használhatók.

8. példa

A találmány szerinti eljárással előállított hatóanyagként lizozim dimert tartalmazó készítmények bizonyos bőrbetegségekre kifejtett hatását emberen az alábbiak szerint vizsgáltuk.

A vizsgálatokat több tucat, különféle, korábban sikertelenül kezelt bőrbetegségben szenvedő páciensen végeztük, koruk 15-35 év volt. A következő betegségeket diagnosztizáltuk ebben a csoportban:

krónikus furunkulus (forunculosis chronica) 2 eset szőrtüszőgyulladás (sycosis barbae) 1 eset ótvar (impetigo coutagiosa) 11 eset faggyúmirigy-gyulladás (acne vulgáris) 22 eset resacea 6 eset visszér-fekély (varicose ulcer) 12 eset

A csoportba tartozó néhány beteg esetében a kezelést megelőzően bakteriológiai vizsgálatot is végeztünk. A legtöbb esetben Staphylococcus aureust tenyésztettünk ki a vizsgálati anyagból. A kezelést naponta négy alkalommal végeztük, 4 mg lizozim dimert tartalmazó kenőccsel. Különösen előnyös az alábbi Összetételű kenőcs:

lizozim dimer	4,0 mg
acetil- sztearoil-oxi-alkohol	25,0 mg
cseppfolyós paraffin	10,0 mg
Span 60	5,0 mg
Tween 60	8,0 mg
propilénglikol	10,0 mg
Aseptina M	0,3 mg
Aseptina P	0,16 mg
desztillált víz	200,0 ml-re
Az összes beteg esetében megszűntek	a különféle

bőrbántalmak 10-12 napon belül, és bizonyos esetek7

HU 204710 Β 2 ben már 3 nap múlva mutatkozott a gyógyulás. A krónikus furunkulusos betegek esetében a kezelés 4-5 héten keresztül tartott, és a visszér-fekélyes betegek esetében általában 2-12 hetet vett igénybe a gyógyulás, attól függően, hogy milyen súlyos volt a betegség, és mennyi ideig tartott a betegség kifejlődése a kezelés megkezdése előtt.

A vizsgálati eredmények azt mutatják, hogy a lizozim dimer különféle bőrbetegségek kezelésére is eredményesen használható.

9. példa

A genítálíák különféle fertőzéseinek kezelésére is alkalmaztuk a találmány szerinti eljárással előállított, lizozim dímert tartalmazó gyógyászati készítményeket

Ezekben a vizsgálatokban kilenc, 25-49 éves női beteget kezeltünk, hét betegnél krónikus hüvelygyulladás (colpitis chroníca), egy betegnél Douglas-tályog és egy betegnél Bartholín-mirigy-gyulladás volt a diagnózis.

A krónikus hüvelygyulladásban szenvedő betegeknek íntravaginálisan adtunk 10 mg lizozim dimert 2 ml hidrofil bázisban, kúp formájában, A kúpokat naponta kétszer adtuk, 7 napon keresztül. Minden betegnél megfigyeltük agenitális területek gyulladásának teljes recesszióját Ezenkívül megszűntek a leucorrhea és az egyéb tünetek is.

ADouglas-tályogban szenvedő betegnek 5 ml 0,9®os náttium-klorid-oldatban 20 mg Ezozim dimert adtunk, naponta két alkalommal, 4 napon keresztül. Az oldatot közvetlenül a Douglas-üregbe adagoltuk. A lizozim dimer minden egyes beadása előtt leszívattuk a Douglas-üreg gennyváladékát A tenyésztési vizsgálatokkal Streptococcus haemolytícus és colibaktéríum jelenlétét mutattuk ki. A lizozim dimer első beadagolása 1 után 24 órán belül a beteg addig kórosan magas testhőmérséklete normális értékre csökkent A fájdalomtünetek is csökkentek ez alatt az idő alatt A negyedik . napon, a lizozim dimer második adagjának beadása után nem találtunk gennyet a Douglas-üregben. Ebben ^zaz esetben három hét múlva a betegség kiújult de a lizozim dimerből újabb két dózist adagolvaa-Douglasüregbe, a betegség lefolyását ellenőrizni tudtuk.

A Bartholin-mirigy-gyulladásos beteget 1 ml 0,9%os nátrium-kloridban 20 mg lizozim dimerrel kezeltük, ^zegy alkalommal, amelyet közvetlenül a gennyedző mirigybe adtunk, a gennytartalom Ieszívatása után. A beteget 4 nap múlva teljesen győgyultnak nyilvánítottuk.

hónapos megfigyelés alatt nem újultki ez a betegség.

A fenti klinikai vizsgálatok azt mutatják, hogy a 5 lizozim dimer rendkívül hasznos gyógyászati hatást fejt ki női genítális területek fertőzéses megbetegedései esetén. Ezenkívül azt tapasztaltuk, hogy a fekélyeket helyileg, a lizozim dimert közvetlenül a gennyes váladékot tartalmazó üregbe adagolva is kezelhetjük. 5 lO.példa

Alizozim dimer hatásátfertőzött sebek kezelésére is tanulmányoztuk.

A vizsgált csoport négy betegből állt, a betegeknek 6 operáció után befertőződött a sebük: két nőbeteg hasműtéten esett át; egy nőbetegnek a lábujját amputálták, cukorbetegséggel járó érszűkület következtében kialakult nekrőzis miatt; és egy férfibetegnek alsó végtagját amputálták Burger-betegség miatt.

Minden esetben nedves alkalmazást és lemosást végeztünk 20 mg lizozim dimert tartalmazó 5 ml 0,9%-os nátríum-klorid-oldattal, naponta négy alkalommal. A hasműtétes betegek gennyedző sebei 4 és 6 napos ke0 zelés után teljesen gyógyultak. A másik két betegnél gyógyulást 21 napon, illetve öt hónapon keresztül tartó kezeléssel értünk el.

A fenti vizsgálatok’ azt mutatják, hogy a lizozim dimer mellékhatások nélkül alkalmazható operáció utáni fertőzött sebekkezelésére is.

11. példa

Klinikai vizsgálatokat végeztünk genítális herpeszben (herpes genítális) szenvedő betegeken, ribonukleáz

A dimert tartalmazó készítménnyel.

A vizsgált csoport öt nőbetegből állt, koruk 23-36 év. Közülük négy először szenvedett ebben a betegségben, míg egy harmadszor kapta meg a betegséget Mindegyik beteg ahőlyagképződés szakaszában volt 5 ami rendszerint a betegség 3. és 5. napja között jelentkezik, és a perineálís területen igen erős fájdalmat éreztek, különösen vizelés közben. Az összes betegnél _: észleltük az ajak duzzadását és fertőzését, valamint számos, zavaros folyadékkal telt hólyagot az ajak-nyál3 kamembránokon és a comb és anális területek külső borén. Alágyéki nyirokcsomók minden betegnél megnagyobbodtak és fájdalmat okoztak.

A kezelést ribonukleáz A dimert tartalmazó kenőcscsel végeztük, naponta 4-5 alkalommal bekentük a ) hólyagokat és a fertőzött nyálkamembránt a kenőccsel.

. A kenőcs ősszeté tele az alábbi volt:

ribonukleáz dimer	4,0 mg
acetií-szíearoil-oxi-alkohol	25,0 mg
cseppfolyós paraffin	10,0 mg
Span60	5,0 mg
TweenóO	. 8,0 mg
propilénglikol	10,0 mg
Aseptina M	0,3 mg
AseptinaP	0,16 mg
desztillált víz	200,0 ml-re
A ribonukleáz dímeael kezelt betegek néhány perc

múlva, legfeljebb egy órán belül jelezték a kenőcs első alkalmazása után, hogy a fájdalom jelentősen csökkent, és a következő 10-20 óra alatt teljesen megszűnt A fizikai vizsgálatok szerint négy betegnél a kóros elváltozások 3 napos kezelés után teljesen eltűntek. Az ötödik beteg esetén az ötödik napon tűntek el teljesen a kóros tünetek. A pankreász ribonukleáz A dimert tartalmazó kenőccsel kezelt egyetlen betegen sem jelentek meg új hólyagok.

A fenti vizsgálati eredmények azt jelzik, hogy a találmány szerinti eljárással, előállított, dimer enzimeket tartalmazó kenőcsök herpes genítális kezelésére is eredményesen alkalmazhatók.

HU 204 710 Β

12. példa

Több mint 100 különböző korú beteget kezeltünk a találmány szerinti eljárással előállított készítménnyel ajakherpesz ellen.

A betegség tünetei minden betegnél a következők voltak: az alsó ajak környéke megduzzadt, kivörösödött, és számos, zavaros folyadékkal telt hólyag jelent meg. Minden beteg fájdalomról panaszkodott a fertőzött bőrterületen, és emellett a szövetekben nyomást is éreztek. A kezelés abból állt, hogy lokálisan, naponta 4-5 alkalommal pankreász ribonukleáz A dimert tartalmazó kenőccsel kentük be a fertőzött bőrfelületet

Az összes beteg kivétel nélkül azt állította, hogy a szöveti fájdalom és nyomás gyorsan elmúlt. A következő néhány órában a fájdalom teljesen megszűnt, ugyanúgy, mint a genitális herpesz esetén. A fizikai vizsgálatok azt mutatták, hogy a hólyagok és a duzzadás 2-3 nap alatt eltűnt. Egyes esetekben azonban öt napig tartott, míg a betegség tünetei teljesen elmúltak és a gyógyulási folyamat teljesen befejeződött. Megfigyeltük továbbá, hogy azoknál a betegeknél, akiknél a kezelést a betegség első napján megkezdtük, a bőrtünetek, így a duzzadás, bőrizgalom és papulák 24 óra alatt teljesen eltűntek. Azt is megfigyeltük, hogy azoknál a betegeknél, akiknél gyakran előfordult ez a betegség, hosszabb idő telt el két megbetegedés között, és a kiújult tünetek minden egyes alkalommal enyhébbek voltak. Egyetlen esetben sem tapasztaltunk mellékhatást.

13. példa

Heipes zosterben szenvedő hat betegen végeztünk klinikai vizsgálatokat a betegeket találmány szerinti eljárással előállított dimer készítménnyel kezeltük.

Öt esetben a betegség jellegzetes módon fejlődött ki, a hatodik esetben különleges komplikációk léptek fel, amelyeket alább ismertetünk. A betegeket pankreász ribonukleáz A dimert tartalmazó kenőccsel kezeltük, és a kezelést a betegség harmadik vagy negyedik napján kezdtük el. A kenőcsöt naponta 4-5 alkalommal adtuk a betegnek.

Minden esetben 24-48 óra alatt teljesen megszűnt a fájdalom A hólyagok 3-4 nap alatt leszáradtak, ezért ekkor úgy döntöttünk, hogy befejezzük a kezelést Az elkövetkező néhány nap alatt a bőrtünetek teljesen gyógyultak. Egyetlen betegnél sem tartott a fájdalom az első 24-48 óránál tovább, és a tünetek nem jelentkeztek újra három betegnél, akiket több mint egy éven keresztül megfigyelés alatt tartottunk.

Egy betegnél - amint azt fent említettük - a betegség klinikai lefolyása szokatlan volt A 42 éves nőbeteg tüdőrák ellen kobalt-kezelést kapott ami immunrendszerét komolyan károsította. A heipes zoster szokásos tünetein kívül generalizált hólyag-szóródást észleltünk a beteg egész testén. A ribonukleáz dimert tartalmazó készítménnyel végzett kezeléssel teljes sikert értünk el ennél a lecsökkent immunitású betegnél is, és a beteg hólyagjai teljesen eltűntek néhány napos kezelés után.

Az ennél a betegnél - és a csoportba tartozó többi betegnél is - elért sikerek azt mutatják, hogy a pankreász ribonukleáz A dimer különösen hatásos a Varicella vírusok által okozott herpes zoster kezelésére.

Claims

1. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, amelyek hatóanyagként ribonukleáz dimert vagy lizozim dimert tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított hatóanyagot a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük és antivirális és antibakteriális hatású gyógyászati készítménnyé alakítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként Ezozim dimert alkalmazunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként ribonukleáz dimert alkalmazunk.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dimerként pankreász ribonukleáz A dimert alkalmazunk.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dimert 0,001 mg/ml-20,0 mg/ml hordozóanyag koncentrációban alkalmazzuk.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyógyászatiig elfogadható hordozóanyagként hidrofil bázist alkalmazunk.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dimert 10 mg/2 ml hidrofil bázis koncentrációban alkalmazzuk.

8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyógyászatiig elfogadható hordozóanyagként 0,5-1,5%-os nátrium-klorid-oldatot alkalmazunk.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dimert 4 mg/ml nátrium-klorid-oldatkoncentrációban alkalmazzuk.

10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyógyászatiig elfogadható hordozóanyagként vizet alkalmazunk.

11. A10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dimert 0,02 mg/ml víz koncentrációban alkalmazzuk.

12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyógyászatiig elfogadható hordozóanyagként egy keuőcs-bázist alkalmazunk.

13. A12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vízből, paraffinból és propiléuglikolból készült kenőcs-bázist alkalmazunk.

14. A12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dimert 0,02 mg/ml kenőcs-bázis koncentrációban alkalmazzuk.

15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyógyászatiig elfogadható hordozóanyagként gyógyászatiig elfogadható sókat tartalmazó izotóniás oldatot alkalmazunk.

16. A15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dimert 0,8 mg/ml sóoldat koncentrációban alkalmazzuk.