BG100476A

BG100476A - Съединения за медицинска употреба

Info

Publication number: BG100476A
Application number: BG100476A
Authority: BG
Inventors: ��Ris �In�Gin
Original assignee: Peptech (Uk) Limited
Priority date: 1993-10-08
Filing date: 1996-04-03
Publication date: 1996-12-31
Also published as: LV11595B; KR100337977B1; EP0722332A1; GB9320820D0; DE69420145T2; ZA947894B; CA2173322A1; JP3954644B2; US5877147A; HUT75530A; AU7789094A; HU9600887D0; ATE183397T1; LV11595A; SK42396A3; IL111198A0; EP0722332B1; JPH09503776A; WO1995010293A1; AU680302B2

Abstract

Изобретението се отнася до използването на мурамилпептиди за профилактика на ракови заболявания, по-специално за лечение на предракови състояния, свързани с рак на слизестата обвивка (мукоза) или на епитела.

Description

Изобретението се отнася до използването на мурамилпептиди в профилактиката на ракови заболявания, включително и за лечение на предракови състояния.

„Рак“ е термин, който се използва, за да се опише разви тието на ненормални клетки, които се развиват бързо и по неконтролируем начин и често са инвазивни. Инвазията на

жизненоважни органи често води до смъртта на пациента.

Ракът е разпространен в изключително голяма степен и в действителност се счита, че около 30% от хората е възможно да заболеят от рак в даден момент от живота им, като ракът е причината за смърт в около 20% от случаите. Традиционните лечения на рака включват хирургична намеса и рентгенотерапия, но напоследък се обръща повече внимание на усъ вършенстването на химиотерапевтични или цитотоксични агенти, които могат да увредят или да убият раковите клетки.

В последните години, повишено внимание предизвиква появата на тъканни изменения, които са показателни за пови шен риск от следващо развитие на определени ракови заболявания в мястото на изменението. Описани са различни такива изменения, включително изменения на чревната стена (чревни полипи), които са свързани с нарастване на възможността за разпространение на рака в колона (дебелото черво) и в ректума (правото черво), изменения на кожата (актинична кератоза), които са свързани с карциноми на кожата и кондиломи на шийката, които са свързани с рак на маточната шийка. За специалиста в областта, тези състояния или тъканни измене ния, склонни да се развият в рак, свързани с развитието на рак

- 2 или носещи значителен риск от заболяване от рак, са известни като предракови състояния или увреждания. В някои случаи, причината за тези предракови състояния е установена, както в случая с актиничните кератози, които се дължат на прекомерно излагане на слънчева светлина или инфектиране с вирус на папилома по човека, в случая на кандиломи на шийката („Cancer in Practice“ от G. J. G. Rees, S. E. Goodman и J. A. Bulli-more. Pub. Butterworth-Heinemann, Oxford, 1993). В други случаи, причината за предраковото състояние не е установена.

Изобретението се отнася до използването на някои мурамилпептиди (MDPs) в профилактиката на рак и по-специ ално при лечението на предракови (състояния) увреждания.

Отдавна е известно, че до неспецифично стимулиране на имунната система може да се стигне чрез въздействие на бактерии или на компоненти, получени от бактериални клетки. Характерни компоненти, притежаващи такава активност, са идентифицирани като пептиди на клетъчната стена, съдържащи захар, а допълнителни биохимични анализи на пептидите ги определят като пептидогликанов компонент на клетъчната стена. Установено е, че най-малката ефективна синтетична молекула е тази на М-ацетил-мурамил-1_-аланил-0-изоглутамин (Merser et al, Biochem. Biophys. Res. Comm, 66. 1316 (1975)), която често се посочва като мурамилдипептиден прототип или прототип MDP.

Впоследствие, са синтезирани различни аналози на мура милдипептидния прототип, някои от които са предложени за използване при възстановяването на имунна функция или при неспецифично стимулиране на имунната система. Тези аналози, както и прототип MDP сам по себе си, са известни като мурамилпептиди (MDPs).

- 3 По-рано е работено върху използването на MDPs за лечение на рак и например, Key et al описват в ,,J. Natl. Cancer Inst.“, 69 (5), 1189-1198 (1982) лечението на метастази на белодробен меланом с помощта на липозоми, съдържащи производно на MDP. По-късно, същата работна група изследва оптималните условия и ограниченията за отстраняване на меланомни метастази с помощта на производно на MDP, МТР-РЕ, капсулирано в липозом (Fidler et al, Cancer Immunol. Immunother., 21(3), 169-173, (1986)). Допълнително е установено, че при орално прилагане на некапсулирано в липозом МТР-РЕ, последното унищожава туморните клетки както в белодробни, така и в перитонеални макрофаги и е ефикасно при инхибиране на белодробни метастази и на метастази на лимфния възел, въп реки че това производно не е ефикасно за отстраняване на установени меланомни метастази. (Fidler et al, J. Immunol., 138(12), 4509-4514 (1987)).

Phillips et al, също описват в ,,J. Biol. Response Modif.“,

6(6), 678-691 изследвания, свързани c лечението на експериментални пулмонални (белодробни) метастази с помощта на липозоми, съдържащи липофилни аналози на MDP. И в друг случай съединенията са използвани за лечение на експериментално предизвикани пулмонални В16- меланомни тумори при мишки. Но, Kleinerman et al в ,,J. Clin. Oncology“, 9(2), 259-267 (1991) стигат до извода, че не е възможно MDP производното, L-МТР-РЕ да служи като единствен начин за лечение на метастатични болести.

Някои MDPs са използвани в клинични опити за лечение на хора. Така например, Kleinerman et al (Kleinerman, ES, Cancer Immunol. Immunother.,34j 211-220, 1992) използват липофилен

- 4 аналог в липозомна формулировка за лечението на белодробни метастази, развити в пациенти с остеосаркома.

Независимо от горните опити за доказване приложимостта на MDPs при лечението на рак и независимо от факта, че MDP е открит преди 20 години, не е регистриран нито един опит със значителен положителен ефект, проявен от MDP при лечение на рак при хора.

Но, изобретателите на настоящето изобретение сега установяват, че някои мурамилпептидни производни са особено ефикасни в метод за лечение на предракови увреждания (предракови състояния), който метод включва прилагане на ефективно количество от мурамилпептида към пациента, намиращ се в предраково състояние. Или, този метод е профилактичен подоход при лечението на ракови заболявания.

Не само, че този подход е нов, но той очевидно е поприемлив и за пациента, тъй като винаги е за предпочитане да се предотврати появата на рак, отколкото да се прилага продължителното, опасното, неприятното и много често неуспешното лечение на вече съществуващия рак.

Ето защо, първи аспект на изобретението е използването на мурамилпептид за приготвяне на средство за лечение на предраково увреждане (състояние).

Средството може да се използва за лечението на всеки вид предраково състояние, независимо от това, че то е особено подходящо за лечението на предракови състояния, водещи до мукозни или епителни ракови заболявания.

Обект на изобретението е и използването на мурамилпептид за приготвяне на средство за профилактика на рак.

Средството, също, може да се използва за профилактика на всеки вид рак, независимо от това, че то се използва най

- 5 успешно за профилактика на епителен и мукозен рак. Профилактичното действие на средството се проявява, в някои случаи, при използването му за лечението на предракови състояния, но може да има и такива случаи, в които средството проявява профилактично действие при пациенти, рискови към раково заболяване, но които не се намират в предраково състояние.

Пирогенността е проблем, който създава трудности при прилагането на някои мурамилпептиди. Пирогенността може да се намали чрез подходящи формулировки (например, липозомните формулировки, описани в US-A-4522811 и US-A4684625), но по принцип, съгласно изобретението, се предпочита използването на мурамилпептид с ниска пирогенност.

Много мурамилпептиди,	които се използват съгласно
изобретението, се включват в	обща формула I:
roch₂
Z~°\	Н
\° л	Ч ₅
R²O\\ /	OR

\ NHCOR⁴

R³CHCOR в която R¹ означава водороден атом или СгСггацилна група; R²означава водороден атом или СгС22ацилна група; R³ означава водороден атом или СгСеалкилова група; R⁴ е С^-С^алкилова група или С6-, или С₁₀арилова група; R⁵ означава водороден атом; и R е аминокиселинен остатък или линеен пептид, изграден от 2 до 6 аминокиселинни остатъка, като поне един от остатъците е евентуално заместен с липофилна група.

Предпочитани ацилни групи в значенията на R¹ и R² са С_гС₅ацилни групи, като например ацетилна група; очевидно е, че

- 6 в броя на въглеродните атоми в ацилната група не се включва карбонилната част. Предпочитани алкилови групи в значенията на R³ са С1-С4алкилови групи, като метилова или етилова. Предпочитани алкилови групи в значенията на R⁴ са СтСеалкилови групи и по-специално С1-С₄алкилови групи, като метилова или етилова; за предпочитане ариловата група е фенил.

За предпочитане R представлява моно-, ди- или трипептид. Най-близкият пептиден остатък (или единственият тиден остатък, ако е само един) е за предпочитане такъв аминокиселина. Като примери могат да се посочат:

L-аланил пепна LL-валил

L-триптофанил

L-лизил

L-левцил

L-изолевцил

L-орнитил

L-а-аминобутирил

L-серил

L-треонил

L-метионил

L-аргинил

L-хистидил

L-цистеинил

L-фенилаланил

L-тирозил

L-глутамил L-глутаминил

L-аспартил L-аспарагинил

L-пролил L-хидроксипролил

Предпочитат се L-аланил и L-треонил.

Следващият аминокиселинен остатък от най-близкия край на пептида е за предпочитане с D-конфигурация. Той е за предпочитане киселинен и може да бъде D-глутаминова или D-acпарагинова киселина, или техен моно-, ди- или смесен С_гС₂₂(за предпочитане Ci-Ce) алкилов естер, амид, или С₁-С₄алкиламид. (Изра-зът „смесен“ се илюстрира със случай, в който една кар

- 7 боксилна група е амидирана, а другата е естерифицирана). Предпочитат се D-изоглутамин и D-глутамат.

Третият аминокиселинен остатък от най-близкия край на веригата, ако е един, е за предпочитане с L-конфигурация, както е посочено по-горе за най-близкия аминокиселинен остатък. Предпочитат се L-аланил и L-лизил.

Аминокиселинният остатък или линейният пептид са заместени, евентуално, с поне една липофилна група. Липофилната група може да бъде С₁₀-С₂₂ацилна група, като стеароилова е или ди-(С₁₀-С₂₂ацил)-5П-глицеро-3-хидроксифосферилокси група, в която, например, всяка С₁₀-С₂₂ацилна група може да бъде палмитоилова група. Липофилната група може да бъде алтернативно (или допълнително, когато е налице повече от едно заместване) С-|-С₁₀естерна група, като например С₂-С₆естерна група, като бутилов естер, например.

Примери за мурамилови дипептиди, които се включват в обхвата на обща формула I, са:

муроктазин, известен още като MDP-Lys (L18) (N²-(Nацетилмурамил-1_-аланил-О-изоглутаминил)-М⁶-стеароил-1_-лиФ зин);

МТР-РЕ (М-ацетилмурамил-1_-аланил-О-изоглутаминил-1_аланил-2-(1’,2’-дипалмитоил-8п-глицеро-3 -хидроксифосфорилокси)етиламид, мононатриев);

мурабутид (1\1-ацетилмурамил-1_-аланил-0-глутамин-а-Мбутилов естер); и t-MDP (М-ацетилмурамил-1_-треонил-0-изоглутамин).

Получаването на муроктазин е описано в ЕР-А-0021367 и US-A-4317771. Получаването на МТР-РЕ е описано в ЕР-А0025495. Получаването на мурабутид е описано от Lefrancier et al ,,J. Med. Chem.“, 25, 87 (1982). t-MDP може да се получи по

- 8 известни методи. Патентни публикации, които дават подробности относно получаването на мурамилпептиди са: ВЕА-0834753, ВЕ-А-0834754, ВЕ-А-0847103, ВЕ-А-0849214, DE-A2710455, DE-A-2922533, DE-A-2747379, DE-A-2912865, FR-A2355505, FR-A-2358159, FR-A-2375249, ЕР-А-0004512, ЕР-А0002677, JP-A-54063016, JP-A-54073729, JP-A-55019236, US-A4082735 и US-A-4082736. (Получаването на мурамилдипептиден прототип е описано в DE-A-2450355 и US-A-4235771). Всички споменати документи в това описание са включени тук със съответните отпратки.

Не всички мурамилдипептиди, които се използват за целите на изобретението, са обхванати с обща формула I. Много от тях се включват в обща формула II, която представлява една особено предпочитана група от съединения, използвани съгласно изобретението.

в която R означава аминокиселинен остатък или линеен пептид, изграден от 2 до 6 аминокиселинни остатъка, като поне един от остатъците е евентуално заместен с липофилна група; и η е 1 или 2.

Съединението може да бъде и аномер с обща формула II. Предпочитани значения за R са тези, изброени по-горе при об- 9 ща формула I. Особено предпочитан е случаят, в който пептидьт R съответства на пептида в прототип MDP (L-Ala-D-isoGIn). Алтернативно, в друго предпочитано изпълнение, R може да означава L-Ala-D-Glu. Предпочитаната стойност за η е 1.

Съединения с обща формула II са описани в US-A-4395399 и преимуществата, изложени в този документ, са валидни и за настоящето изобретение. Освен това, съгласно изобретението групата R може да бъде заместена липофилно, както е описано по-горе.

Едно от най-предпочитаните съединения, което се използва, съгласно изобретението, се включва в обща формула II и е М-ацетил-О-глюкозаминил-(31-4)-М-ацетилмурамил-1_-аланил-Оизоглутамин (GMDP), чиято структурна формула е:

Това съединение (съединение II в US-A-4395399), известно също като гликопин, вече е преминало предклинични изпитания за токсичност, както и фармакокинетични изследвания, необходими за клинично приложение, в СССР (както се наричаше тогава). Острата токсичност при мишки, установена чрез опит за определяне на ЛД₅₀ е 7 g/kg. Тази цифра показва, че съединението е по-малко токсично от муроктасина от порядъка на няколко пъти, тъй като ЛД₅₀ на муроктасина за мишки е 625

- 10 mg/kg и освен това, терапевтичната му употреба е свързана с неприятни странични ефекти като треска.

Тъй като пирогенността на GMDP е около 50% от тази на MDP и не пречи на клиничните му изпитания, то може при някои обстоятелства да се предпочита използването на по-малко пирогенен аналог. Такъв аналог съществува и това е N-ацетил0-глюкозаминил-(Р1-4)-М-ацетилмурамил-1_-аланил-0-глутаминова киселина (GMDP-А), която е съединение III в US-A-4395399 и чиято структура е следната:

Други предпочитани съединения, които се включват във формула II, са:

М-ацетил-0-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-1_-аланил-Ь-изоглутамин (GMDP-LL), който има структурна формула:

NHAc

GMDP-LL

- 11 n-бутилов естер на 1Ч-ацетил-О-ГАюкозаминил-(Р1-4)-М-ацетилмурамил-1_-аланил-0-глутамин (GMDP-OBu), който има структурна формула:

М-ацетил-0-глюкозаминил-^1-4)-М-ацетилмурамил-1_-аланил-О-изоглутаминил-1_-лизин (GMDP-Lys), който има структурна формула:

N“-[ М-ацетил-О-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-1_аланил-О-изоглутаминил]-№-стеароил-1_-лизин (GMDP-Lys(St)), който има структурна формула:

HOCH₂

НОСН₂ /-° OH w

\NHAc

CHCO-L-Ala-D-isoGln-L-Lys-COC₁₇H₃₅Na⁺

CH₃

NHAc

GMDP-Lys(St)

Други полезни съединения са:

М^а-[М-ацетил-О-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-1_аланил-у-0-глутамил]-№-стеароил-1_-лизин, който има структурна формула:

НОСИ

NHAc

CHCO-L-Ala-D-Glu-L-Lys-COC₁₇H₃₅Na ⁺

НОСН₂

СН₃

NHAc

GMDPA-Lys(St)

Дибензилов естер на М-ацетил-О-глюкозаминил-(31-4)-Мацетилмурамил-1_-аланил-О-глутаминова киселина, който има структурна формула:

NHAc

GMDPA(OBzl)₂

1М-ацетил-0-глюкозаминил-(Р1-4)-М-ацетилмурамил-М-метил-Ь-аланил-О-изоглутамин, който има структурна формула:

М-ацетил-О-глюкозаминил-(Р1-4)-М-ацетилмурамил-(р1-4)М-ацетил-0-глюкозаминил-(31-4)-М-ацетилмурамил-бис-(1_-аланил-О-изоглутамин), който има структурна формула:

М-ацетил-О-глюкозаминил-(₽1-4)-М-ацетилмурамил-(р1-4)М-ацетил-О-глюкозаминил-(31-4)-М-ацетилмурамил-бис-(1_-аланил-О-глутаминова киселина), която има структурна формула:

NHAc (GMDPA)₂

М-ацетил-0-глюкозаминил-(31-4)-М-ацетилмурамил-(Р1-4)М-ацетил-О-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-бис-(1_-аланил-О-изогдутаминил-!_-лизин), който има структурна формула:

NHAc (GMDP-Lys)₂

М-ацетил-О-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-(р1-4)М-ацетил-0-глюкозаминил-(31-4)-М-ацетилмурамил-бис-[ L-аланил-О-изоглутаминил-М⁶-стеароил-1_-лизин], който има структурна формула:

HOCH₂

NHAc

CHCO-L-Ala-D-isoGln-L-LysCOC₁₇H₃₅Na⁺

HOCH₂

NHAc

CH₃

HOCH₂

NHAc

CHCO-L-Ala-D-isoGln-L-LysCOC₁₇H₃₅Na⁺

HOCH₂

CH₃

NHAc [GMDP-Lys(St)]₂

1-адамантилов естер на И-ацетил-О-глюкозаминил-(р1-4)М-ацетилмурамил-1_-аланил-О-изоглутамин, който има структурна формула:

NHAc

GMDP-Ad

- 18 1_-треонил-№-[М-ацетил-О-глюкозаминил-(31-4)-М-ацетилмурамил-1_-аланил-у-0-изоглутаминил]-1_-лизил-1_-пролил-1_-аргинин, който има структурна формула:

НОСН₂ °он

NHAc

С Н CO-L-A la-D-isoGIn-Lys (Thr)-Pro-Arg

CH₃

GMDP-туфтсин Е

HOCH₂

OH

NHAc

М-ацетил-О-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-1_аланил-у-0-изоглутаминил-1_-треонил-1_-лизил-1_-п родил-L-аргинин, който има структурна формула:

NHAc

GMDP-туфтсин А

М-ацетил-О-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-1_аланил-а-0-глутамил-1_-лизил-1_-треонил-М^е-стеароил-1_-лизил-1_пролил-Ь-аргинин, който има структурна формула:

- 19 HOCH₂

NHAc

CHCO-L-Ala-D-Glu-Thr-Lys(COC₁₇H₃₅)-Pro-Arg

HOCH₂

CH₃

NHAc липофилен GMDPA-туфтсин

М⁶-[М-ацетил-О-глюкоза1\линил-(31-4)-М-ацетилмурамил-каланил-7-0-изоглутаминил]-1_-лизил-1_-хистидил-1_-глицинамид, който има структурна формула:

НОСН₂

носн₂

CHCO-L-Ala-D-isoGln-Lys-His-NH₂

СН₃

NHAc

GMDPA-бурсин

М-ацетил-О-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-Ь-аланил-0-изоглутаминил-1_-глутамил-1_-триптофан, който има струк турна формула:

NHAc

GMDP-тимоген I

М-ацетил-О-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-1_-аланил-0-изоглутаминил-е -аминохексаноил-1_-глутамил-1_-триптофан, който има структурна формула:

НОСН

NHAc

CHCO-L-Ala-D-isoGIn-Ahx-Glu-Trp

HOCH₂

OH

CH₃

NHAc

GMDP-тимоген II

Ν^α-[ М-ацетил-0-глюкозаминил-(31-4)-М-ацетилмурамил-1_аланил-0-изоглутаминил]-М^е-стеароил-1_-лизил-1_-глутамил-1_триптофан, който има структурна формула:

NHAc

GMDP-тимоген III

М-ацетилмурамил-Ь-треонил-О-изоглутамин, който има структурна формула:

CHCO-L-Thr-D-isoGIn

СН₃

Thr-MDP n-бутилов естер на И-ацетилмурамил-Ь-аланил-О-глутамин, който има структурна формула:

CHCO-L-Ala-D-Gln-OC₄H₉

СН₃ мурабутид

- 22 В горните структурни формули са използвани следните съкращения:

Bzl - бензил;

Ме - метил;

Ahx - е-аминохексаноил.

Най-предпочитаното съединение е GMDP, следвано от GMDP-A и мурабутид.

Глюкозаминил-мурамилови дипептиди, които се включват в обща формула II, могат да се получат сравнително евтино и с умерено високи добиви по метода, описан в US-A-4395399. Описаният метод се основава на екстрахиране и пречистване на дизахаридния компонент от бактерията Micrococcus lysodecticus и следващото му химично свързване с дипептид, синтезиран, например, по традиционните методи на пептидната химия. Но, дизахаридът може, също, да се синтезира по химичен път като се приложат стандартните методи на химията на захарите.

Друго предимство на предпочитаните съединения с общи

формули I и II, споменати по-горе, е, че те са водоразтворими, което улеснява тяхното прилагане към пациентите.

Профилактичното използване на MDPs може да следва от ефективността на съединенията при лечението на предракови състояния.

Пример за такова предраково състояние се среща при рак на шийката, където ракът може да бъде причинен от образуването на папиломи, които са свързани със заразяване от щам на вирус на папилома по човека. Папиломите могат да бъдат установени лесно и по принцип се лекуват чрез каутеризация (обгаряне) или с течен азот и следващо отстраняване по хирургичен път. Но, ако папиломите останат нелекувани, е възможно

- 23 да се развият до неоплазия и да се стигне до образуването на рак на шийката, който се лекува изключително трудно. Тъй като смъртността при жени с рак на шийката е твърде висока, то необходимостта от предпазване от неоплазия е очевидна. Профилактичното лечение на папиломите има известен успех, но хирургичната намеса не предпазва напълно от рецидив. Има ясно доказателство, че колоректален рак и главно, аденокарциноми, възникващи от повърхностния епител, са друг вид рак, който може да възникне от доброкачествени предракови състо-

яния, в случая, чревни полипи.

Примери за други предракови състояния (и между другото, характерни с потенциални следващи злокачествени заболя вания), които могат да бъдат лекувани, съгласно изобрете нието, са генитални брадавици (рак на маточната шийка);

анални брадавици (рак на ануса); чревни полипи (колоректален рак); актинични кератози (карциноми и меланоми на сквамозни и базални клетки); еритроплазия на Queyrat (сквамозен карцином на пениса); болест на Bowens (сквамозен карцином на пениса); пенисни брадавици (рак на пениса); левкоплакия (рак на вулвата); лихен планус (рак на устната лигавица); аденоматични стомашни полипи (рак на стомаха); папиломи на епитела на пикочния мехур (карцином на пикочния мехур); и езофегални папиломи (карцином на езофегални сквамозни клетки).

Този списък, разбира се, е само примерен и е разбираемо, че настоящето изобретение е приложимо за лечението на предраково състояние, което е възможно да премине в епителен или мукозен рак.

- 24 При всички тези видове рак, по принцип, е по-ефикасно да се лекува предраковия етап преди неоплазия, отколкото да се правят опити за лечение на рака след като е налице неоплазия.

Прави впечатление, че всичките, дадени по-горе, примери се отнасят за рак на епителна или мукозна тъкан. В действителност, се предполага, че ефективността на MDPs при лечението на ракови заболявания с мукозен и епителен произход може да се повиши, поне частично, поради действието им като

стимулатори на мукозен имунитет. По-специално, се установи, че нивата на IgA (имуноглобин А) са особено високи при пациенти, лекувани с GMDP и GMDP-A, въпреки че следва да се подчертае, че ефективността на настоящето изобретение не зависи от прецизността на тази теория.

Очаква се, че мурамилпептидите (MDPs) ще бъдат особено полезни за получаване на средства за лечението на папиломи на шийката, на ануса или на колоректалната област, както и за лечение на предракови състояния на кожата или на устната лигавица. Тези средства, следователно, ще бъдат приложими за профилактика на по-горе споменатите ракови заболявания.

В някои случаи, лечението на предраковото състояние с MDPs води до изчезване на предраковото състояние, но това може да се дължи на факта, че лечението просто предотвра тява неоплазията.

В някои случаи, лечението на предраковото състояние се провежда само с мурамилдипептиден (MDP) аналог. Но, в други случаи, лечението с аналог на MDP е само допълнително и се провежда заедно с хирургическа намеса, криохирургия, лазерно изпаряване, химиотерапия, имунотерапия или лечение чрез облъчване.

- 25 фактът, че MDPs са ефикасни при лечението на предракови състояния е особено неочакван от гледна точка на големия брой изследвания, които са проведени, върху използването на MDPs при ракови заболявания и при които този факт не е станал очевиден.

Видовете рак, към които този аспект на изобретението се прилага по-специално, са споменати по-горе.

При дадени обстоятелства, раковите заболявания може и да не са свързани с откриваеми предракови състояния като

такива. Но, в медицината се приема, че съществуват различни ендогенни маркери, повечето от които са генетични маркери, които показват предразположение на техните носители към определени видове рак.

Следователно, MDPs могат да се прилагат към носителите на такива маркери и също към други пациенти, за които е известно че са в голяма степен рискови да заболеят от рак, като профилактично лечение за предотвратяване развитието на рака. Примери за пациенти, за които се счита, че са в голяма

степен рискови да заболеят от рак, са такива пациенти, носещи генетичен маркер, пациенти, които са наследствено обременени с болестта или такива, които работят в рискова среда, като например, в област с висока степен на радиация.

Ето защо, друг аспект на изобретението е използването на мурамилпептид за получаване на средство за профилактика на рак при пациенти, носители на ендогенен маркер за рак или иначе казано, идентифицирани като рискови да заболеят от рак.

Този вид профилактично прилагане е неочаквано като се имат пред вид конвенционалните лечения на рака. Лечението чрез облъчване (лъчевата терапия), както и химиотерапията,

- 26 дават странични ефекти, които са твърде сериозни, за да се понасят от здрав човек, който само е подложен на риск да заболее.

Начинът на прилагане на съединенията, разбира се, ще зависи от вида на предраковото състояние или на рака, който трябва да се лекува. Но, обичаен начин на прилагане е оралният (подходящ за всяко предраково състояние или всяко раково заболяване, но особено подходящ е за предраковите състояния и раковите заболявания на устата и на гастроин-

тестиналния (GI) тракт); вагиналният (за рак на шийката и свързаните с него предракови състояния); ректалният (за раковите заболявания и свързаните с тях предракови състоя ния на долния GI тракт, по-специално за колоректалния рак и за рак на ануса); и местно или трансдермално (за ракови забо лявания и свързаните с тях предракови състояния на кожата и на устната лигавица). Въпреки, че изброените начини за прила гане са предпочитани, възможно е съединенията да се прилагат и парентерално, например, чрез интравенозно или интрамускулно инжектиране. Освен това, съединенията могат да се вкарат чрез катетър или чрез друг инструмент в местоположението на тумора, като например, при папиломи на пикочния мехур или във влагалището и матката при рак на шийката.

Оралните лекарствени форми могат да бъдат във вид на таблетки, капсули или емулсии в зависимост от мястото на рака, подлежащ на лечение. В някои случаи, може да се налага използването на форми със забавено освобождаване, за да е сигурно, че активното съединение няма да се освободи преди формата да достигне до предназначеното място. Лекарствените форми могат да съдържат допълнително други ингредиенти и в таблетките, по принцип, се включват един или по

- 27 вече подходящи носители. Типични носители са лактоза, захароза, картофено нишесте, калциев стеарат и метилцелулоза.

Препаратите за инжектиране могат да съдържат разтвор на GMDP или на GMDP-A, или алтернативно, съединенията могат да бъдат капсулирани в липозоми, за да образуват инжекционен препарат.

Вагинални и ректални форми могат да се приготвят във вид на песари и супозитори, съответно. Възможно е, тези форми да съдържат и други пълнители и подходящи носители, които са добре известни на специалиста в тази област.

Тези форми, които се прилагат трансдермално или местно, могат да бъдат във вид на мехлеми, кремове или лосиони и отново могат да съдържат добре известните на специалиста подходящи носители и пълнители. Освен това, за да се подобри проникването на съединението в кожата, се предпочита използването на определени липофилни аналози. Алтернативно, във формите могат да се включат модифицирани съединения, които проникват по-добре в кожата или може да се приложи електрически потенциал за вкарване на заредените аналози в кожата. Трансдермалните форми могат да бъдат включени в трансдермални пластири или подобни приспособления.

Вагиналните, ректалните, трансдермалните и формите за местно приложение са нови и представляват от само себе си друг аспект на изобретението. Съгласно този аспект, се осигурява състав, съдържащ мурамилпептид и фармацевтично приемлив пълнител или носител, който състав се характеризира с това ,че е пригоден за местно, трансдермално, ректално и вагинално прилагане.

Възможно е, лекарствените форми за местно и трансдермално прилагане, както бе споменато по-горе, да са осо

- 28 бено подходящи за профилактика на рак на кожата и мурамилпептиди могат да се включат в местни слънчеви филтри като допълнителна защита срещу рак на кожата.

Точната дозировка за прилагане на лекарството се преценява от клиничния или лекуващия лекар. Но, по принцип, средната дневна доза ще бъде в границите от 0.1 до 100 mg дневно ( или за 1 таблетка, или за друга единична доза). Възможно е предпочитаната доза да бъде от 0.5 mg до 50 mg за 1 ден ( или за 1 таблетка, или за друга единична доза), като дневна доза от около 1.0 mg до 10 mg се счита оптимална.

Изобретението се илюстрира със следващите примери, които не го ограничават и следващите фигури:

Фигура 1 е хистограма, която показва влиянието на GMDP върху съдържанието на имуногло(Жн (lg) в цервикален мукус при пациенти със заразена маточна шийка с HPV (вирус на папилома по човека);

фигура 2 е хистограма, която показва влиянието на GMDP върху нивата на имуногло^йнов серум в пациенти със заразена маточна шийка с HPV; и

Фигура 3 е хистограма, която показва влиянието на GMDP върху лимфоцитни субпопулации в пациенти със заразена маточна шийка с HPV.

Пример 1

Приложение на GMDP при лечението на предракови инфекции на маточната шийка с вирус на папилома по човека (HPV).

Метод:

Изследваната група се състои от 50 жени на възраст между 20 и 30 години (средно 26.7) с HPV на шийката. Продължи

- 29 телността на заболяването варира от 1 до 3.5 години. Тридесет от жените получават GMDP като част от комбинирано лечение, а другите 20 получават пласебо при комбинираното им лечение. За да се проследи изменението в съдържанието на lg в цервикалните секрети по време на менструалния цикъл, започва лечение 8-10 дни след началото на цикъла.

Редица имунологични параметри се отчитат преди началото на лечението: имуногло£$ин (lg) в серум (радиална имунодифузия), lg в слюнка и в секрети на половия път (ELISA), субпопулации на имунни клетки (имуноцитофлуориметрия).

Пациентите след това се подлагат на традиционното лечение с антибиотици на съпътствуващата бактериална инфекция; деструкция на инфектирания с НРВ цервикален епител (кондиломи) с лазер и криотерапия и имунотерапия, включваща орално приемане на 1 mg GMDP всеки ден в продължение на 10 дни. Контролни пациенти получават пласебо вместо GMDP.

Три дни след последния прием на GMDP (или пласебо), пациентите се подлагат на същите имунологични изследвания. Провеждат се проследяващи наблюдения върху клиничното развитие на инфекцията с HPV.

Снемат се контролни стойности на имунологични параметри на група жени, които не са заразени с HPV. Те са на възраст между 20 и 30 години, средно 25.6 години.

Резултати:

Клиничен резултат:

По време на периода на проследяващите наблюдения резултатите от лечението се отчитат чрез колпоскопия и изследване на клетъчния състав. Както е показано на таблица 1, по-голям брой излекувани се наблюдава в групата от пациенти,

- 30 които са получили GMDP в допълнение към лазерна терапия и криотерапия.

Таблица 1: Влиянието на GMDP върху лечението и рецидива при група пациенти с HPV инфекция на маточната шийка

лекувана група
	GMDP	пласебо
брой в група	30	20
клиничен резултат
напълно излекувани	27 (90%)	13 (65%)
рецидив на HPV	3 (10%)	7 (35%)

Имунологични изводи:

Нормални контроли показват редица изменения в състоянието на пациентите преди и след лечението (таблица 2). Лечението с пласебо (лазерна или криотерапия, но не и имунотерапия) не дава никакви разлики в състоянието на пациентите преди и след прилагането му. Но, в групата, лекувана с GMDP, се откриват редица значими изменения, дължащи се на лечението. Интересно е, че ниското ниво на IgA и slgA в цервикален мукус се повишава и във втория случай превишава това, установено в нормални контроли.

Наблюдават се, също, редица изменения, свързани с прилагането на GMDP, в много кръвни клетки и разпределението на подтипове. Заразените пациенти имат значително помалък брой левкоцити в сравнение с незаразените контроли.

- 31 Този брой нараства при лечението с GMDP, но не и при групата пациенти, лекувана с пласебо. Общият брой на лимфоцити, също, се повишава при лечението с GMDP, което се дължи главно на повишаване броят на Т-клетки (CD3 + ve), по-специално на CD4 + ve.

Заключения:

Прилагането на GMDP при пациенти с HPV инфекция на маточната шийка, предизвиква значителни изменения в много имунологични параметри. Вероятно, това е свързано с тенденцията към повишаване на показателя на ефективността от лечението, провеждано допълнително с GMDP.

Таблица 2 инфекция	Имуноглобулинови нива (mg/dl)	при пациенти с Н
на маточната	шийка
	незаразени	GMDP		пласебо
	контроли	преди	след	преди	след
Серум
IgA	169.3	216.0*	228.7	221.0’	217.0
	±11.0	±16.8	±18.2	+15.3	±20.0
IgM	112.7	123.8	160.8”	133.2	129.8
	±16.2	±10.4	±11.2	±12.1	+10.2
igG	1375	1424	1258”	1442	1386
	±88	±48	±51	+52	±45
Мукус на
IgA	6.08	3.15’	5.96”	3.28’	3.08
	±0.86	±1.08	±1.05	±0.68	±1.23
IgM	0	3.18	1.8	3.25	3.31
		±2.21	±1.65	±2.01	±2.34
IgG	15.42	9.57*	12.01	10.01’	8.4
	±1.32	±2.19	±3.01	+2.30	+3.05
slgA	7.19	3.80*	19.4”	4.01*	3.75
	±0.62	±0.84	±3.11	±0.76	+0.81
IgD	0.26	0.326	0.315	0.341	0.29
	±0.11	±0.16	+0.17	±0.19	±0.21

- 33 Слюнка

IgA	3.07	11.45*	13.16	10.89*	10.1
	±0.62	±3.48	±2.98	±3.91	±3.71
igM	0	3.17	1.65	2.89	3.07
		±1.05	±1.11	±1.49	±2.01
igG	6.07	16.19*	15.05	15.45	13.02
	±0.79	±4.01	±4.88	±4.3	±4.13
slgA	12.4	26.53’	25.46	24.3*	27.05
	±1.46	±5.23	±4.96	±5.11	±6.12

- Сравнение на незаразена контролна група с група заразени пациенти, преди лечение (р<0.01) ** - Сравнение на групи пациенти преди и след лечение (р<0.01)

Таблица 3	Клетъчни	популации	в кръв	на пациенти	с HPV
инфекция на	маточната	шийка
	незаразен	GMDP		пласебо
	и
	контроли	преди	след	преди	след
Левкоцити
абе. брой	5615	4432*	5723*’	4513’	4374
	±200	±310	±304	±270	±265
Лимфоцити %	35.4	34.11	35.77	35.01	34.80
	±2.86	±3.16	±2.68	±2.73	±2.8
абе. Брой	1988	1511’	2046”	1579’	1521
	±161	±140	±153	±123	±122
CD3 + ve %	60.4	55.8	59.12	54.9	55.1
	±3.4	±4.1	±3.6	±3.81	±3.71
абе. брой	1201	843.1’	1210”	886.8’	837.9
	±67.6	±61.9	±73.7	±60.2	+56.4
CD4 + ve %	40.3	34.6	41.8	33.7	32.0
	±3.2	±3.1	±3.8	±3.17	±2.97
абе. брой	801.2	522.8’	855.2”	532.Г	486.6
	±63.6	±46.8	±75.7	±50.1	±45.2
CD8 + ve %	21.8	24.2	20.3	25.1	23.8
	±4.1	±2.87	±3.17	±3.08	±3.2

абе. брой	433.4	365.7	415.3	402.8	361.9
	±81.6	±43.4	±64.9	±49.4	±48.7
В-клетки %	5.14	5.30	5.08	5.28	5.4
	±1.05	±0.8	±1.07	±0.96	±1.1
абе. брой	102.6	80.1	103.8	82.26	82.12
	±20.8	±12.1	±21.7	±15.0	±16.7
CD16 + ve %	12.4	16.3	13.1	15.6	16.1
	±2.2	±2.1	±2.3	±3.1	±2.87
абе. брой	246.5	246.3	268.1	246.3	244.8
	±43.4	±31.7	±47.1	±48.9	±43.6

- Сравнение на незаразена контролна група с група заразени пациенти, преди лечение (р<0.01)

- Сравнение на групи пациенти преди и след лечение (р<0.01)

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Използване на мурамилпептид за получаване на средство за лечение на предраково състояние.
2. Използване на мурамилпептид за получаване на средство за профилактика на рак.
3. Използване, съгласно претенция 1 или 2, при което ракът има епителен или мукозен произход.
4. Използване, съгласно претенция 3, при което ракът е цервикален рак , колоректален рак, рак на ануса, карцином на базални или сквамозни клетки, меланом, сквамозен карцином на пениса, рак на пениса, рак на вулвата, рак на устната лигавица, рак на стомаха, карцином на пикочния мехур или карцином на езофегални сквамозни клетки.
5. Използване на мурамилпептид за получаване на средство за профилактика на ракови заболявания на кожата.
6. Използване, съгласно която и да е претенция от 1 до 5, при което мурамилпептидът се прилага в комбинация с хирургическа намеса, химиотерапия, имунотерапия или лъчева терапия.
7. Използване на мурамилпептид за получаване на средство за профилактика на рак при пациент, носещ ендогенен маркер за рак или идентифициран по друг начин като рисков по отношение на рак.
8. Използване, съгласно която и да е претенция от 1 до 7, при което мурамилпептидът е съединение с обща формула I:

R¹OCH₂

R³CHCOR в която R¹ означава водороден атом или С^-С^ацилна група; R²означава водороден атом или С^-Сггацилна група; R³ означава водороден атом или С^Сдалкилова група; R⁴ е С^Сг^лкилова група или С6^_, или С10арилова група; R⁵ означава водороден атом; и R е аминокиселинен остатък или линеен пептид, изграден от 2 до 6 аминокиселинни остатъка, като поне един от остатъците е евентуално заместен с липофилна група.
9. Използване, съгласно претенция 8, при което в съединението с обща формула I се срещат някои или всички, или всяка съвместима комбинация от следните заместители: всеки от R¹ и R² поотделно означава С^Сдацилна група, като ацетилна; R³ означава С1-С4алкилова група, като метилова или етилова; R⁴ означава С^Сдалкилова група, по-специално С1-С₄алкилова група, като метилова или етилова, или фенилова група; R означава моно-, ди- или три-пептид.
10. Използване, съгласно която и да е претенция от 1 до 7, при което мурумилпептидът е: муроктазин, още известен като MDP-Lys (L18) (М²-(М-ацетилмурамил-1_-аланил-О-изоглутаминил)-М⁶-стеароил-!_-лизин);

МТР-РЕ (М-ацетилмурамил-1_-аланил-О-изоглутаминил-1_аланил-2-(1 ,2’-дипалмитоил-зп-глицеро-3’-хидроксифосфорилокси)етиламид, мононатриев);

мурабутид (М-ацетилмурамил-1_-аланил-О-глутамин-а-М-бутилов естер);

- 38 MDP-OBu (М-ацетилмурамил-1_-алнаил-0-изоглутамин-п-бутилов естер); или t-MDP (М-ацетилмурамил-1_-треонил-0-изоглутамин).
11. Използване, съгласно която и да е претенция от 1 до 7, при което мурамилпептидът е съединение с обща формула II: в която R означава аминокиселинен остатък или линеен пептид, изграден от 2 до 6 аминокиселинни остатъка, като поне един от остатъците е по желание заместен с липофилна група; и η е 1 или 2; или негов аномер.
12. Използване, съгласно претенция 11, при което п е 1.
13. Използване, съгласно претенция 11 или 12, при което най-близкият аминокиселинен остатък е остатък на L-аминокиселина.
14. Използване, съгласно претенция 13, при което найблизкият аминокиселинен остатък (или единственият аминокиселинен остатък, ако той е само един) е остатък на L-аланин.
15. Използване, съгласно която и да е претенция от 11 до 14, при което вторият аминокиселинен остатък от най-близкия край на пептида, ако има такъв, е с D-конфигурация.
16. Използване, съгласно претенция 15, при което вторият аминокиселинен остатък е на D-глутаминова или на D-acnapa гинова киселина или на техен моно-, ди- или смесен С_А-С₂₂ (за предпочитане С^-Се) алкилов естер, амид или С₁-С₄алкиламид.
17. Използване, съгласно претенция 14 или 15, при което вторият аминокиселинен остатък е D-изоглутаминил или D-глутамил.
18. Използване, съгласно която и да е претенция от 11 до

17, при което третият аминокиселинен остатък от най-близкия край на пептида, ако има такъв, е в L-конфигурация.
19. Използване, съгласно претенция 18, при което третият аминокиселинен остатък е L-аланил или L-лизил.
20. Използване, съгласно която и да е претенция от 11 до

19, при което аминокиселинният остатък или линейният пептид, евентуално, е заместен с най-малко една липофилна група.
21. Използване, съгласно претенция 11, при което съединението е М-ацетил-глюкозаминил-М-ацетилмурамил-1_-аланилD-изоглутамин (GMDP).
22. Използване, съгласно претенция 11, при което съеди нението е:

М-ацетил-глюкозаминил-1\1-ацетилмурамил-1_-аланил-0глутаминова киселина (GMDP-A);

n-бутилов естер на М-ацетил-0-глюкозаминил-(31-4)-М-ацетилмурамил-1_-аланил-О-глутамин (GMDP-OBu);

М^а-[М-ацетил-0-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-1аланил-0-изоглутаминил]-№-стеароил-1_-лизин (GMDP-Lys(St));

N^a-[N-aneTHA-D-rAtoKO3aMHHHA-(31-4)-N-aneTHAMypaMHA-Lаланил-у-О-глутамил]-1\Г-стеароил-1_-лизин (GMDPA-Lys(St));

дибензилов естер на М-ацетил-0-глюкозаминил-(р1-4)-Мацетилмурамил-1_-аланил-О-глутаминова киселина (GMDPA(OBzl)₂);

- 40 N-ацетил-О-глюкозаминил-ф 1-4)-N-ацетилмурам ил-N-Meтил-1_-аланил-О-изоглутамин (Me-GMDP);

М-ацетил-О-глюкозаминил-(31-4)-М-ацетилмурамил-^1-4)М-ацетил-0-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-бис-(1_-аланил-0-изоглутамин) ((GMDP)₂);

М-ацетил-0-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-(р1-4)М-ацетил-0-глюкозаминил-(31-4)-М-ацетилмурамил-бис-(1_-аланил-О-глутаминова киселина) ((GMDPA)₂);

М-ацетил-О-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-(31-4)М-ацетил-О-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-бис-(1_-аланил-О-изоглутаминил-Ь-лизин) ((GMDP-Lys)₂);

1\1-ацетил-0-глюкозаминил-(31-4)-М-ацетилмурамил-(р1-4)М-ацетил-0-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-бис-[1_-аланил-0-изоглутаминил-№-стеароил-1_-лизин] ([GMDP-l_ys(St)]₂);

1-адамантилов естер на 1\1-ацетил-0-глюкозаминил-(31-4)1\1-ацетилмурамил-1_-аланил-0-изоглутамин (GMDP-Ad);

1_-треонил-М^е-[М-ацетил-0-глюкозаминил-(р1-4)-1М-ацетилмурамил-1_-аланил-у-О-изоглутаминил]-1_-лизил-1_-пролил-1_-аргинин (GMDP-туфтсин Е);

М-ацетил-О-глюкозаминил-(Р1 -4)-М-ацетилмурамил-!_аланил-у-О-изоглутаминил-1_-треонил-1_-лизил-1_-пролил-1_-аргинин (GMDP-туфтсин А);

М-ацетил-0-глюкозаминил-(31-4)-М-ацетилмурамил-1_аланил-а-О-глутамил-1_-лизил-1_-треонил-М^е-стеароил-1_-лизил-1_пролил-Ьаргинин (GMDPA-липофилен туфтсин);

N^e-[ М-ацетил-0-глюкозаминил-(31 -4)-М-ацетилмурамил-1_аланил-у-0-изоглутаминил]-Ь-лизил-1_-хистидил-1_-глицинамид, (GMDPA-бурсин);

- 41 1Ч-ацетил-О-глюкозаминил-(р1-4)-М-ацетилмурамил-1_-аланил-0-изоглутаминил-1_-глутамил-1_-триптофан (GMDP-тимоген |);

М-ацетил-0-глюкозаминил-(31-4)-1М-ацетилмурамил-1.-аланил-О-изоглутаминил-е -аминохексаноил-1_-глутамил-1_-триптофан (GMDP-тимоген II);

№'-[М-ацетил-О-глюкозаминил-ф1-4)-М-ацетилмурамил-1_аланил-0-изоглутаминил]-М^е-стеароил-1_-лизил-1_-глутамил-1_триптофан (GMDP-тимоген III);

М-ацетилмурамил-1_-треонил-О-изоглутамин (Thr-MDP); или n-бутилов естер на М-ацетилмурамил-1_-аланил-0-глутамин (мурабутид).
23. Използване, съгласно която и да е претенция от 1 до 22, при което мурамилпептидът се прилага орално, вагинално, ректално, местно, трансдермално или парентерално.
24. Средство, съдържащо мурамилпептид и фармацевтично приемлив пълнител или носител, характеризиращо се с това, че е пригодено за местно, трансдермално, ректално или вагинално прилагане.
25. Метод за ^veue+mq на предраково състояние, включващ прилагане на ефективно количество от мурамилпептида към пациент, намиращ се в предраково състояние.