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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Aminocyclitol-Antibiotika der Formel
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worin einer der Reste R l'R 3 und R, eine #-Amino-α-hydroxy-niedrig-alkanoylgruppe der Formel
H2NCH2 (CH2)nCHOHCO- darstellt, worin n den Wert Null oder 1 hat, und die andern Reste R" R 3 und R, Wasserstoff sind, R2 Hydroxy bedeutet,
R5 Hydroxy bedeutet und
R6 und R, jeweils Methyl bedeuten, und von deren Säureadditionssalzen.
Ausgangsverbindungen der Formel (I), worin R, R 3 und R8 Wasserstoff darstellen, werden nach den in der AT-PS Nr. 349138 analog zur US-PS Nr. 3, 669, 838 beschriebenen Verfahren hergestellt. Dieses Verfahren umfasst die Kultivierung eines Nährmediums, das Kohlehydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle Salze und ein zugefügtes Aminocyclitolderivat der Formel
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worin
R1, R2, R3 und R s die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzen und worin Rl und R, zusätzlich eine einfache, je zwei Aminostickstoffatome miteinander ver- bindende Bindung darstellen können,
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in Gegenwart eines geeigneten Mutanten-Mikroorganismus, wobei dieser Mutanten-Mikroorganismus zur Synthese dieses Aminocyclitols selbst nicht befähigt ist, jedoch befähigt ist,
dieses Aminocyclitol in die Verbindung der Formel (I) einzubauen, speziell eine Mutante von Micromonospora purpurea mit der Bezeichnung Micromonospora purpurea ATCC 31119, enthält und Isolieren des Produktes aus dem Kulturmedium. Die Verbindungen der Formel (I), worin sowohl Rl als auch R,
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benen Verfahren ist die Natur der Mutante derart, dass sie nicht befähigt ist zur Synthese der Aminocyclitol-Untereinheit aus einem Nährmedium, um hiedurch das Antibiotikum zu bilden, jedoch befähigt ist, die letztere in ein Antibiotikum einzubauen, wenn zu dem Nährmedium das Aminocyclitol zugeführt wird.
Nach einem nicht zum Stand der Technik gehörenden Verfahren wurde überraschenderweise gefunden, dass Aminocyclitol-Antibiotika vom Typ des Streptamin, Deoxystreptamin oder Dideoxystreptamin, einschliesslich jeder der allgemeinen Struktur der vorstehenden Formel (I) hergestellt werden können, indem man ein Nährmedium kultiviert, das Kohlehydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle Salze und ein Cyclitol der Klasse des 2-R-5-R-5-R-3. 4,6-Trihydroxycyclohexanons oder 2-R-5-R-1, 3,4, 6-Tetrahydroxycyclohexans, dargestellt durch die Formel
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oder der Klasse des 5-R1,-1, 4,6-Trihydroxycyclohex-2-en, dargestellt durch die Formel
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worin jeweils
R Wasserstoff oder Acetyl bedeutet,
Rj Oxo (= 0) oder Hydroxy ist, und
RI und R ! ;
jeweils Wasserstoff, Hydroxy oder OR darstellen, in Gegenwart von Mutanten von Organismen, die nicht zur Biosynthese der Cyclitol-Einheit befähigt sind, jedoch zum Einbau des Cyclitols in das antibiotische Molekül in Form einer AminocyclitolEinheit befähigt sind.
Weiters wurde gemäss einem nicht zum Stand der Technik gehörenden Verfahren gefunden,
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wobei in jedem Fall
R ' und Ri jeweils Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten und in Formel (Ila) Amino oder Hydroxy und in Formel (IIb) Hydroxy oder Benzyli- denamino darstellt, einzubauen.
Das Verfahren, nach dem Verbindungen der Formel (I), worin Re und R7 jeweils Wasserstoff oder Methyl darstellen, R2 und Rs jeweils Wasserstoff oder Hydroxy darstellen und R " R, und R, Wasserstoff bedeuten, hergestellt werden, wird in Gegenwart von M. purpurea ATCC 31164 unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens durchgeführt und umfasst die Kultivierung eines Nährmediums, das Kohlehydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle Salze und ein Aminocyclitol der Formeln (IIa) und (IIb) in Gegenwart von M. purpurea ATCC 31164 enthält.
Die Verbindungen der Formel (I), worin einer der Reste R t, R, und R, eine w-Amino-a-hy- droxy-niedrig-alkanoylgruppe darstellt, werden gemäss der Erfindung analog zu dem in der US-PS Nr. 3, 780, 018 beschriebenen Verfahren hergestellt durch Umsetzung einer der Formel (I) entsprechenden Verbindung, worin jeweils R ;, Rg und R, Wasserstoff bedeuten, mit einem N-Hydroxysuccinimidester der Formel
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worin n die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt.
Die erhaltene Mischung der Verbindungen der Formel (I), worin einer der Reste R,, R, und R. die-w- (N-Benzyloxycarbonyl)-amino-a-hydroxy-niedrig-alkanoylgruppe
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bedeutet und die andern verbliebenen Reste Wasserstoff bedeuten, wird dann einer Hydrogenolyse der Benzyloxycarbonylgruppe mit Wasserstoff über einem Katalysator unterworfen.
Wie vorstehend angegeben wird, wenn eine Verbindung der Formel (I), worin jeweils R, R, und R, Wasserstoff darstellen, als Ausgangsmaterial in der Acylierungsreaktion verwendet wird, eine Mischung der drei möglichen isomeren Mono-amide erhalten, worin eines der R,-, roder R,-Aminwasserstoffatome durch die m- (N-Benzyloxycarbonyl)-amino-a-hydroxy-niedrig-alkanoylgruppe ersetzt ist. Ist eine individuelle Charakterisierung und Untersuchung dieser Produkte erwünscht, so müssen sie selbstverständlich voneinander getrennt werden.
Die Acylierungsreaktion wird durch Umsetzung molaräquivalenter Mengen der Verbindung der Formel (I) und des N-Hydroxysuccinimidesters vorzugsweise bei einer Temperatur von-10 bis zirka 10 C und in einer wässerigen Lösung eines inerten organischen Lösungsmittels, z. B. Tetrahydrofuran, Dioxan, Äthylenglykol-dimethyl- äther, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, Propylenglykol-dimethyläther u. dgl. durchgeführt.
Die Hydrogenolyse der Benzyloxycarbonylgruppe wird über einem Palladium-Aktivkohle-Katalysator in einem inerten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Methanol, Äthanol, Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykoldimethyläther, Propylenglykol-dimethyläther u. dgl. durchgeführt.
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klasse.
Die Verbindungen der Formel (I) wurden in einem antibakteriellen Standard-Reihenverdünnungstest untersucht, und es wurde gefunden, dass sie eine antibakterielle Aktivität, insbesondere gegenüber Gentamicin resistenten Organismen besitzen. Die Verbindungen sind somit als antibakte-
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rielle Wirkstoffe verwendbar.
Die Verbindungen der Formel (I) sind insbesondere für die orale, topische oder parenterale
Verabreichung bestimmt und können zu ihrer Verwendung mit einem pharmazeutischen Träger durch
Suspension entweder in Form ihrer freien Basen oder als pharmazeutisch annehmbare, nichttoxische
Säureadditionsalze in einem inerten Träger, wie Polyäthylenglykol, oder durch Tablettieren oder
Einkapselung für die orale Verabreichung entweder allein oder mit geeigneten Adjuvantien herge- stellt werden, oder sie können alternativ mit herkömmlichen Cremes der Gallerten bzw. Gelees für die topische Verabreichung formuliert werden.
Die molekularen Strukturen der erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen wurden ermittelt unter Zugrundelegung eines Studiums ihrer chromatographischen Eigenschaften, bestimmt durch
Dünnschicht-Chromatographie (TLC)-Analyse, ihrer Kernresonanz (NMR)-und Massenspektren, durch
Abbau zu bekannten Verbindungen, durch Vergleich der Produkte, hergestellt durch Fermentation mit der Mutante M. purpurea ATCC 31119 unter Verwendung von Aminocyclitolen der Formel (II), als Substrate mit Produkten, hergestellt durch Fermentation mit der Mutante M. purpurea ATCC 31164, unter Verwendung von Cyclitolen der Formeln (lila) oder (IIIb) und durch die Übereinstimmung zwischen berechneten und gefundenen Werten für die Elementaranalyse der einzelnen Elemente.
Biosynthese von Ausgangsverbindungen mit M. purpurea ATCC 31119
Vorschrift :
Der Mutantenorganismus wurde auf N-Z-Amin-Agar-Schrägen (Medium 1) belassen, von denen Übertragungen in Flaschen, die 500 ml Keimbildungsmedium 2 enthielten, vorgenommen wurden.
Die Flaschen wurden bei 28 C 4 Tage auf einem Rotationsschüttler (2 s-Takt) bei 225 Umdr/min inkubiert.
Man überführte einen 10% igen (Vol./Vol.) Impfstoff von der Keimbildungsstufe aseptisch in 14 l-Fermentationsgefässe, die 9 1 steriles Keimbildungsmedium 2 enthielten. Diese wurden bei 450 Umdr/min bei 28 bis 29 C gerührt und es wurden 5 1/min an gefilterter Luft zugeführt. Zum Zeitpunkt des Impfens wurden 200 mg/l Streptaminsulfat in Form einer Suspension in sterilem destilliertem Wasser zugegeben. Die Fermentation wurde 8 Tage fortgesetzt.
Alle 24 h wurden 10 1 Impfstoff, der wie vorstehend aseptisch hergestellt worden war, in 130 l-Fermentationsgefässe übergeführt, die 70 l steriles Keimbildungsmedium 2 enthielten, und es wurden 0,31 g/l Streptaminsulfat, suspendiert in sterilem destilliertem Wasser, zugegeben. Es wurde 7 Tage bei 29 C eine aerobe Fermentation durchgeführt.
Die Fermentationen wurden durch Zugabe von ION Schwefelsäure bis auf ein PH von 2,0 und Filtration unter Verwendung einer Filterhilfe zur Entfernung von Mycelien beendet. Die filtrierte Brühe wurde auf PH 7, 0 eingestellt, und es wurden 1, 56 g Oxalsäure je Gramm Calciumcarbonat, das in dem Medium vorlag, zur Entfernung des Calciums zugegeben. Dieses liess man über Nacht stehen und die geklärte Brühe wurde dekantiert und über Bio-Rex 70 (schwaches Kationenaustauscher)-Harz in der Natrium-Form unter Verwendung von zirka 14 g Harz je Liter Brühe geleitet.
Die Säule wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und mit 2N Schwefelsäure eluiert. Sämtliche Fraktionen, die eine antibiotische Aktivität zeigten, wurden vereinigt, neutralisiert und unter Vakuum unterhalb 50 C bis zu dem Punkt konzentriert, an dem die Salzkristallisation sichtbar wurde (zirka 1/3 des Volumens). Das PH wurde dann auf 10, 5 eingestellt, und es wurden vier Volumina Aceton zur Ausfällung anorganischer Bestandteile, die dann durch Filtration entfernt wurden, zugegeben. Das Filtrat wurde mit 6N Schwefelsäure auf ein PH von 5,0 eingestellt und unter Vakuum auf annähernd 1/20 des ursprünglichen Volumens konzentriert und abgekühlt.
Man sammelte durch Filtration eine weisse kristalline Fraktion, die über 300 C schmolz und die sich
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führt wurden, wurden insgesamt 0,7 g Streptaminsulfat erhalten, und aus zwei 80 l-Fermentationen wurden bei dieser Stufe insgesamt 21 g Streptaminsulfat gewonnen.
Das Filtrat wurde weiter konzentriert, und es wurden 10 Volumina Methanol hinzugegeben, wobei der erste rohe antibiotische Feststoff erhalten wurde. Aus zwei 10 l-Fermentationen wurden 7 g und aus zwei 80 1-Fermentationen 24 g erhalten.
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Zur Identifizierung der antibiotischen Komponenten während der Reinigungsverfahren wurden Werte für die chromatographische Mobilität, die bei der Papierchromatographie und bei der Dünnschichtchromatographie erhalten wurden, für die Gentamicine Cl'C2 und C1a und für jede der entsprechenden Aminocyclitol-Analogen, die wie vorstehend hergestellt wurden, bestimmt, wobei die chromatographische Mobilität (nachfolgend als C. M. bezeichnet) ausgedrückt wird durch :
Abstand der Komponente vom Ausgangspunkt C. M.
Abstand des Gentamicins C. vom Ausgangspunkt
Die verwendeten chromatographischen Systeme waren die folgenden :
System 1 - Whatman No. 1 Papier, das mit O, 95M Sulfat-Bisulfat gesättigt war und in abstei- gender Weise in 80% igem wässerigem Äthanol + 1,5% NaCl und anschliessend bio- autographisch unter Verwendung von B. subtilis als Testorganismus entwickelt wurde ;
System 2 - Siliciumdioxydgel F 254 Platte, die in einer niedrigen Phase von Chloro- form (l) : Methanol (l) : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (1) entwickelt wurde. Die Komponenten wurden mit einem Ninhydrin-Spray unter Erhitzen lokali- siert.
Die C. M.-Werte des überwiegenden Anteils der antibiotischen Komponenten der Erfindung sind im Vergleich zu einem Vergleichs-Gentamicinkomplex sämtlich in bezug auf Gentamicin C. in Tabelle I angegeben, in der unter den mit Komponente 1, Komponente 2 bzw. Komponente 3 bezeichneten Verbindungen die folgenden Verbindungen zu verstehen sind :
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Tabelle I
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<tb>
<tb> C. <SEP> M. <SEP> System <SEP> l <SEP> C. <SEP> M. <SEP> System <SEP> 2
<tb> Gentamicin <SEP> C <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Gentamicin <SEP> C2 <SEP> 0, <SEP> 89 <SEP> 0,83
<tb> Gentamicin <SEP> C <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> 0,67
<tb> Komponente <SEP> l
<tb> (bedeutender <SEP> Hauptanteil) <SEP> 0, <SEP> 96 <SEP> 0, <SEP> 92
<tb> Komponente <SEP> 2
<tb> (kleinerer <SEP> Anteil) <SEP> 0,76 <SEP> 0,75
<tb> Komponente <SEP> 3
<tb> (kleinerer <SEP> Anteil) <SEP> 0,50 <SEP> 0,61
<tb>
Aus 10 1-Fermentationsgefässen wurden 7 g roher Feststoff, der eine antibakterielle Aktivität zeigte, in 200 ml Methanol und 10 ml konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd suspendiert, und die Mischung wurde 30 min gerührt und filtriert.
Dieser Vorgang wurde weitere zwei Male wiederholt und die Filtrate wurden vereinigt und unter Vakuum unter Erzielung eines blassgelben Öls mit einem Gewicht von 0, 9 g konzentriert. Die "ausgelaugten Salze" waren im wesentlichen frei von antibiotischer Aktivität.
Die ölige Base wurde mit 4 g Siliciumdioxydgel (Davison Grad 923, Korngrösse 0, 147 bis 0, 044 mm) gemischt und auf eine Siliciumdioxydsäule von 1, 8 x 28 cm gegeben. Die Säule wurde
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als Aufschlämmung unter Verwendung einer niedrigeren Phase von Isopropylalkohol (l) : Chloroform (2) : 17% iges wässeriges Ammoniumhydroxyd (1) hergestellt. Die Säule wurde mit diesem Lösungsmittel entwickelt, und es wurden 50 ml-Fraktionen gesammelt.
Die Fraktionen 8 und 9 enthielten eine einzige Ninhydrin-positive Komponente, die 20 mg in Form eines blassgelben Öls beim Entfernen des Lösungsmittels ergab. Das Massenspektrum dieses Materials, das als Komponente 1 bezeichnet wurde, zeigte ein Molekülion und bedeutendere Fragmente mit jeweils 16 Masseneinheiten (d. h. ein Sauerstoffatom), die grösser waren als diejenigen von Gentamicin C, erhaltenen, wie aus dem folgenden hervorgeht :
Bezugs-Gentamicin Cl : M+ 477, 420,360, 350,347, 322,319, 304
Komponente 1 : Il'493, 436, 376,366, 363, 338, 335,320.
Dieses Material wurde in sein Sulfatsalz durch Auflösen in Äthanol und Zugabe von wenigen Tropfen Äthanol enthaltender Schwefelsäure übergeführt. Der erhaltene weisse Feststoff wurde gesam-
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(1-6) -0- [2-amino-6-methyl-amino-6-C-methyl-2, 3, 4, 6-tetradeoxy-a -D-erythroglucopyra-nosyl-d-*'4)]-D-streptamin in Form der di-Base. Heptasulfat. Decahydrat, mit einem Fp. von > 300 C getrocknet.
Analyse (CH,,3Ns0.),. 7 H2SO,. 10 H20 ber. : C 27, 22 H 6, 53 N 7, 55 S 12, 09 gef. : C 27, 15 H 6, 67 N 7, 79 S 12, 76.
Die Fraktionen 10 bis 13 ergaben eine polare Ninhydrinkomponente, die als 0-3-Deoxy-4-C-
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zeigte, bestimmt wurde.
Die Fraktionen 15 bis 26 ergaben eine dritte polarere Komponente, die eine antibiotische Aktivität zeigte. Das Massenspektrum dieser Komponente zeigte charakteristische Zucker-Maxima, die Gentamicin C1a bei 129 (Purpurosamin) und 160 (Garosamin) entsprachen, und wurde 0-3-Deoxy-
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Alternativ wurde die neue Komponente 1 wie folgt isoliert :
Man löste 0, 9 g einer Mischung roher antibiotischer Base, die wie vorstehend erhalten wurde, in 7 ml Wasser und stellte das PH mit IN Schwefelsäure auf 4, 5 ein. Man leitete das Lösungsmittel über ein starkes Anionenaustauscherharz (IRA 401) in der OH -Form (Masse des Bettes : 0, 7 x 10 cm). Die Säule wurde mit Wasser eluiert und das Eluat im Vakuum bei 350C eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wurde mit 50 ml der niedrigeren Phase eines Lösungsmittels aus 17% wässerigem Ammoniumhydroxyd : Isopropanol : Chloroform (1 : 1 : 2) behandelt. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und unter Vakuum unter Hinterlassen eines öligen Rückstandes mit einem Gewicht von 140 mg konzentriert. Das Massenspektrum dieses Materials entspricht demjenigen der vorstehenden Fraktionen 8 und 9, d. h. M+ 493, 436,376, 366,363, 338,335, 320.
Das Kernresonanzspektrum für die Komponente 1 stimmte ebenfalls mit der vorgeschlagenen
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[2-amino-Tabelle II
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<tb>
<tb> Integration <SEP> Zuordnung
<tb> 5,87, <SEP> 5,60 <SEP> 2 <SEP> isomere <SEP> OCHO-Gruppen
<tb> 5,22 <SEP> 12 <SEP> austauschbares <SEP> H
<tb> 3, <SEP> 09, <SEP> 3, <SEP> 15 <SEP> 6 <SEP> MCH3 <SEP> x <SEP> 2
<tb> 2, <SEP> 9-4, <SEP> 8 <SEP> 13-CHO <SEP> x <SEP> 6, <SEP> -CHN <SEP> x <SEP> 5, <SEP> -CH2O <SEP>
<tb> 1, <SEP> 9 <SEP> - <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP> 4 <SEP> -CH. <SEP> CH. <SEP> - <SEP>
<tb> 1, <SEP> 72 <SEP> 6 <SEP> CH <SEP> 3 <SEP> C-, <SEP> CH3CH- <SEP>
<tb>
Alternativ löst man 4 g einer Probe an rohem antibiotischem Salz in 50 ml Wasser und leitet es über ein Anionenaustauscherharz AG1X8 (Harzbett 1 x 27 cm). Das Antibiotikum wurde mit Wasser eluiert und sämtliche Fraktionen wurden vereinigt und unter Vakuum eingedampft.
Man führte ein weiteres Entsalzen des Rückstandes durch Extraktion mit methanolischem Natriumhydroxyd durch. Die freigesetzte Base wurde mit 7 g Siliciumdioxydgel gemischt und auf eine Säule von 50 g Siliciumdioxydgel gegeben. Die Säule wurde mit Chloroform : Methanol : konzentriertem (28%)
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polaren Verunreinigungen, wie es aus der Dünnschicht-Chromatographie hervorging, vermischt waren. Diese Fraktionen wurden vereint und das Konzentrat auf eine Säule von 50 g Siliciumdioxydgel wie vorstehend gegeben. Diese Säule wurde mit Chloroform : Methanol : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (5 : 3 : I) entwickelt, und es wurden 25 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 6 bis 12 enthielten die gewünschte Komponente, die frei war von offensichtlichen Verunreinigungen.
Nach Entfernen des Lösungsmittels wurde das erhaltene Öl in das Sulfatsalz in äthanolischer Schwefelsäure wie vorstehend beschrieben unter Erzielung von 0, 124 g an Komponente 1 in Form des di-Base. Heptasulfat. Decahydrat mit einem Fp. von > 300 C wie vorstehend beschrieben übergeführt.
Synthese von Amino-hydroxy-niedrig-alkanoyl-Derivaten
Beispiel :
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Mol)Nr. 3, 780, 018) und rührte die Mischung 20 h bei 5 C. Die Mischung wurde dann im Vakuum auf 10 ml konzentriert. Man fügte 25 ml n-Butanol und 10 ml Wasser hinzu und trennte die Schichten.
Die wässerige Schicht wurde wieder mit 10 ml n-Butanol gewaschen. Die vereinigten organischen Schichten wurden eingedampft, wobei ein Rückstand von 513 mg eines rohen Produktes, das zur Seite gestellt wurde, hinterblieb.
Die wässerige Schicht wurde zur Trockne eingedampft, wobei 304 mg eines Rückstandes erhalten wurden, der in 25 ml 50% igem wässerigem Tetrahydrofuran gelöst und mit weiteren 208 mg N-Hydroxy-succinimidester der S- (-)-y- (N-Benzyloxycarbonyl)-amino-a-hydroxybuttersäure wie vorstehend behandelt wurde. Die Aufarbeitung der Reaktionsmischung ergab weitere 435 mg Rohprodukt, das mit den zuvor erhaltenen 513 mg vereinigt wurde und auf 7 40 x 20 cm Siliciumdioxydgelplatten mit einer Dicke von 1 mm chromatographiert wurde. Das System wurde mit Chloroform : Methanol : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (3 : 1 : 1) (niedrigere Phase) entwickelt.
Es waren 7 Durchgänge in diesem Lösungsmittelsystem erforderlich, und es wurden nach dem Eluieren der Produktbande, die im Ultravioletten sichtbar war, 229, 5 mg einer rohen Mischung der drei monoacy-
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lierten Produkte erhalten.
Die Mischung der acylierten Produkte wurde auf 3 40 x 20 cm Siliciumdioxydgelplatten mit einer Dicke von 1 mm aufgebracht und die Platten wurden 5mal mit Chloroform : Isopropanol : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (4 : 1 : 1) (niedrigere Phase), zweimal mit Chloroform : Isopropanol : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (3 : 1 : 1) (niedrigere Phase) und neunmal mit Chloroform : Methanol : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (4 : 1 : 1) (niedrigere Phase) entwickelt.
Es wurden 3 individuelle Banden erhalten, die unter Ultraviolettbestrahlung sichtbar waren und getrennt, herausgeschnitten und aus dem Siliciumdioxydgel mit Chloroform : Methanol : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (1 : 1 : 1) (niedrigere Phase) eluiert wurden, wobei 3 Komponenten erhalten wurden :
A 90, 9 mg ; B 59, 1 mg und C 48, 5 mg,
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ren. Die Rf-Werte für die Komponenten A, B und C waren nach dem 5maligen Entwickeln auf Siliciumdioxydgel mit einem System, bestehend aus Chloroform : Methanol : konzentriertem (28%) Ammoniumhydroxyd (4 : 1 : 1) (niedrige Phase) die folgenden :
A 0, 48
B 0, 62
C 0, 70.
56, 1 mg Komponente B (1-Amid), gelöst in 25 ml 50% igem wässerigem Äthanol und 20 mg 10%iges Palladium auf Aktivkohle wurden in einem Parr-Schüttler bei 3, 87 at (55 psi) während 5 1/2 h geschüttelt, wonach der Katalysator durch Filtration durch eine Filterhilfe entfernt wurde.
Die Verdampfung des Lösungsmittels ergab 34, 3 mg eines weissen glasartigen Rückstandes, der in 2, 5 ml Wasser gelöst und mit 11, 4 mg Schwefelsäure in 0, 1 ml Wasser behandelt wurde. Die Zugabe
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(-) -y-Amino-CL-hydroxybutyryl]-0-3-deoxy-4-ber. : C 27, 67 H 5, 57 N 7, 75 gef. : C 27, 50 H 5, 58 N 7, 42.
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r - [S- (-) -ber. : C 35, 16 H 7, 20 N 9, 84 gef. : C 35, 38 H 7, 08 N 9, 49.
Die Komponente C ergab 26 mg 3- [S- (-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]-O-3-deoxy-4-c-methyl-3-
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methylamino-ss-L-arabinopyranosyl-d-* 6)-0- [2-amino-6-methylamino-6-C-methyl-2, 3, 4, 6-tetradeoxy-ber. : C 34, 64 H 6, 74 N 9, 67 gef. :
C 34,35 H 6, 38 N 8, 60
Indem man analog zu der im Beispiel beschriebenen Arbeitsweise vorging und die jeweiligen in der AT-PS Nr. 349138 beschriebenen Antibiotika und entweder den N-Hydroxysuccinimidester von S-(-)-γ-(N-Benzyloxycarbonyl)-amino-α-hydroxybuttersäure oder den Pentafluorophenylester von N-(Benzyloxycarbonyl)-(S)-isoserin-[(S)-ss-amino-α-hydroxypropionsäure], beschrieben von Haskell et al., Carbohydrate Research, 28,273-280, 1973, verwendete, wurden die entsprechenden Verbindungen der Formel (I) in analoger Weise hergestellt.
Antibakterielle Testergebnisse
Man stellte Stammlösungen einer jeden Verbindung, die 200 pg/ml Base enthielt, in destilliertem Wasser her, wobei man sterilisierte Filter verwendete. Die Kulturen des Testorganismus liess man 24 h bei 37 C in 10 ml-Rohren von Tryptosephosphat oder einer Mueller-Hinton-Brühe wachsen.
Jede Kultur wurde mit der Brühe auf eine optische Dichte von 0, 1 auf einem Spectronic-20-Gerät (zirka 10. Zellen/mI) eingestellt. Die eingestellten Kulturen wurden l : 500 in der Brühe für die Verwendung als Impfstoff (endgültige Zellen-Konzentration zirka 2 x 105 Zellen/mI) verdünnt. Die Testverbindungen wurden hinsichtlich ihrer antibakteriellen Aktivität in einer einreihigen Röhr- chen-Verdünnungsmethode untersucht. Es wurden zweifache Stammreihenverdünnungen in Brühe aus den Stammlösungen des Mittels durchgeführt, und 0, 2 ml jeder Konzentration des Mittels wurden in 17 13 x 100 mm-Röhrchen gegeben. Sämtliche Röhrchen wurden mit 0, 2 ml der in geeigneter
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Konzentration des Mittels, die kein Wachstum zeigt) bestimmt.
Die 1-, 3- und 2'-[S-(-)-γ-Amino-α-hydroxy-butyryl]-amide der Komponente 1, beschrieben im Beispiel, und nachstehend als Komponente 1 (1-HABA), Komponente 2 (3-HABA) bzw. Komponente 1 (2'-HABA) bezeichnet, wurden im Vergleich mit den entsprechenden l-, 3-und 2'- [S- (-)-r- - Amino-a-hydroxybutyryl]-amiden von Gentamicin C. (sämtlich in der US-PS Nr. 3, 780, 018 beschrieben), die als C. (1-HABA), C. (3-HABA) bzw. Cl (2'-HABA) bezeichnet wurden, untersucht.
Diese Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV angegeben, in der die Testorganismen 1, 2,3, 4,5 und 6 die Organismen B. subtilis ATCC 6633, S. aureus Smith, E. coli JR 76. 2, Ent. cloacae A-20960, K. pneumoniae A-20636 bzw. Ps. aeruginosa A-20B97 darstellen.
Tabelle IV *
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<tb>
<tb> Verbindung <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> G, <SEP> (1-HABA) <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Komponente <SEP> 1
<tb> (1-HABA) <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> > <SEP> 100
<tb> C <SEP> (3-HABA) <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 25 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Komponente <SEP> 1
<tb> (3-HABA) <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> C. <SEP> (2'-HABA) <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Komponente <SEP> 1
<tb> (2'-HABA) <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb>
* Kultivierung in einer Mueller-Hinton-Brühe