AT259144B

AT259144B - Verfahren zur Herstellung eines Hexapeptidderivates

Info

Publication number: AT259144B
Application number: AT144764A
Authority: AT
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1963-02-21
Filing date: 1964-02-20
Publication date: 1967-12-27
Also published as: BE644129A; SE332992B

Description

Verfahren zur Herstellung eines Hexapeptidderivates
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Fig. l
DieErfindung wird im nachfolgenden Beispiel beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Für die Papierchromatographie wurden die folgenden Systeme benützt :
System 52 : n-Butanol-Essigsäure-Wasser 100 : 10 : 30.

System 54 : sek.-Butanol-Isopropanol-Monochloressigsäure-
Wasser 70 : 10 : : 3 g : 40.
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40 g (0, 128 Mol) L- Tryptophyl-glycin-methylester-hydrochlorid und 41, 5 g (0, 135 Mol) Carbo- benzoxy-L-arginin werden in 650 ml abs. Pyridin bei 400 gerührt bis eine schwach getrübte Lösung erhalten wird. Diese wird auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 39,6 g Dicyclohexylcarbodiimid (0, 192 Mol) versetzt. Nach 1stündigem Rühren wird über Nacht bei Raumtemperatur aufbewahrt. Am nächsten Tag wird auf 00 gekühlt und der Dicyclohexylharnstoff abgesogen. Man engt das Filtrat im Vakuum stark ein, löst das dicke Öl in Chloroform und tropft die Lösung unter Rühren in viel Äther ein. Dabei erhält man einen amorphen Niederschlag. Man dekantiert den Äther ab und wäscht den Rückstand gut mit Äther.

Nach Trocknen im Vakuum bei 500 erhält man 77,3 g eines schwach röt-

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die nächste Stufe eingesetzt.

2. L-Arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester
77, 2 g (0, 128 Mol) Carbobenzoxy-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester-hydrochlorid wer- den in 800 ml In-Essigsäure gelöst und mit 5 g Norit gerührt. Nach zirka 10 min erstarrt die Mischung gelatineartig. Durch Zugabe von 40 ml Eisessig und Erwärmen auf 400 wird die Substanz wieder in Lösung gebracht und die Aktivkohle über Celite abgesaugt. Das Filtrat wird nach Zusatz von 5 g Palladiumkohle 10% ig hydriert, bis nach zirka 6 h die theoretische Menge Wasserstoff aufgenommen ist (2, 9 I). Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat mit Amberlite IRA -400, Acetatform, versetzt und gerührt, bis sich keine Chloridionen mehr nachweisen lassen.

Der Ionenaustauscher wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und das Filtrat im Vakuum zur Trockene verdampft. Es hinterbleiben 74, 5g L-Arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester-diacetat in Form eines gelblichen Schaumes.

34,5 g (0, 0625 Mol) L-Arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester-diacetat werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 23, 8 g p-Toluolsulfonsäure. 1 H 0 (0, 125 Mol) versetzt. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockene verdampft, der Rückstand mit Äthanol vollständig entwässert und im Vakuum getrocknet. Das Ditosylat wird als beiger Schaum (48 g) erhalten.

3. Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester-acetat
45 g (58 mMol) L-Arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester-ditosylat, 26 g (87 mMol) Carbobenzoxy-L-phenyl-alanin und 8, 1 (58 mMol) Triäthylamin werden in 450 ml Acetonitril bei Raumtemperatur gelöst. Darauf gibt man 19, 3 g (94 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt noch 11/2 h bei Raumtemperatur. Nach Stehen über Nacht im Eisschrank wird der Dicyclohexylharnstoff abgesaugt. Das Filtrat wird im Vakuum stark eingeengt, dann die Substanz mit Äther als zähes Produkt gefällt.

Nach Abgiessen des Lösungsmittels trocknet man den Rückstand im Vakuum bei 50 . Das erhaltene Rohprodukt (65 g) wird zur Reinigung in das Acetat übergeführt. Man löst das Rohprodukt bei 500 in 25ss ml tert.-Butanol und versetzt mit 200 ml Wasser. Die schwach trübe Lösung wird durch eine Ionenaustauschersäule Amberlite IRA-400, Acetatform, die mit 50% tert.-Butanol vorgewaschen ist, filtriert. Anschliessend wird mit 50% tert.-Butanol nachgewaschen, bis Tupfproben mit Sakaguchi negativ sind. Man dampft das Filtrat im Vakuum bei 500 zur Trockene ein und erhält als Rückstand 49, 2 g Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester-acetat als hellbraunen Schaum. Der Rf-Wert im System 52 ist 0, 83, im Dünnschichtchromatogramm System 101 : 0, 7.

Das Produkt wird ohne weitere Reinigung zur Hydrierung eingesetzt.

4. L-Phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester
49 g (63, 4 mMol) Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester-ace- tat werden in 600 ml 90% igem Methanol gelöst, mit 4, 9 g 10% figer Palladiumkohle versetzt und hydriert unter Absorption des Kohlendioxyds mit Kaliumhydroxyd. Nach 1 1/4 h sind 1130 ml Wasserstoff aufgenommen und die Hydrierung bleibt stehen. Man filtriert den Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand, 39 g = 961o d.

Th., gibt in der Papierchromatographie folgende Werte :
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<tb>
<tb> System <SEP> : <SEP> 52 <SEP> 54 <SEP> 56 <SEP> 87
<tb> Rf <SEP> : <SEP> 0. <SEP> 45 <SEP> 0, <SEP> 65 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 0. <SEP> 5 <SEP>
<tb>

Bei der Papierelektrophorese in 1 n- Essigsäure, 7 V/cm, 5 h, ist die Laufstrecke 18 cm.

5. Carbobenzoxy (&gamma;-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl- - glycin-methylester 17, 12g (34, 9mMol) Carbobenzoxy- (y-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidin-hydrazid in 106 ml Dimethylformamid werden auf - 50 gekühlt, dann mit 16 ml eiskalter 6 n- Salzsäure versetzt, und bei - 5 bis-100 tropft man 7, 7 ml eiskalter 5 n - Natriumnitritlösung innerhalb 2 - 3 min dazu.

Man lässt 5 min bei - 50 reagieren. Hierauf gibt man unter intensivem Rühren die eiskalte frisch zubereitete Lösung von 16, 3 g L-Phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester-acetat (25, 5 mMol) in 140 ml Dimethylformamid, enthaltend 12, 03 ml N -Triäthylamin dazu. Man rührt noch 2 h im Kältebad und anschliessend 15 h bei 00. Man filtriert vom auskristallisierten Salz ab und gibt zur Dimethylformamidlösung 1 l Essigester. Dabei scheidet sich 1, 9 g mit Triäthylamin-hydrochlorid verunreinigte Substanz aus.

Die filtrierte klare Lösung wird im Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft und dann der rohe noch mit Ausgangsmaterial und Nebenprodukten verunreinigte Hexapeptidester mit viel Essigester ausgefällt. Die Fällung ergibt nach dem Trocknen 28 g Rohprodukt. Zur Mischung werden 27 g dieses

Produktes im Gemisch Methanol-Chloroform 1 : 9 (810 g) auf eine Aluminiumoxydsäule gegeben und mit 20 l des gleichen Lösungsmittelgemisches eluiert. Man isoliert 11 g (41, 5%) amorphen, im Dünnschichtchromatogramm reinen Carbobenzoxyhexapeptidester. Rf 0, 3 im System 100 ; positive Reaktion auf Pauly, Ehrlich und Reindel-Hoppe.

In der Niederspannungselektrophorese PH 2, 4 (In-Essigsäure) bei 300 V zeigt der Carbobenzoxy- - hexapeptidester nach 1 h eine Wanderungsstrecke von 15, 5 cm.

6. Carbobenzoxy (y-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl- - glycin
9, 6 g (8,7 Mol) Carbobenzoxy-hexapeptid-methylester werden in 150 ml 75% Dioxan mit 18 ml In-Natronlauge während 20 min bei Zimmertemperatur verseift. Während der Verseifung scheidet sich Substanz aus. Das Verseifungsgemisch wird mit 150 ml eiskaltem Wasser versetzt und mit 30 ml 10% Essigsäure angesäuert. Man lässt noch 30 min bei 00 stehen, filtriert das Carbobenzoxy-hexapeptid ab und wäscht gut mit Wasser nach.

Nach dem Trocknen im Hochvakuum Ausbeute : 8 g (90% d. Th.), F. 2040 (Zers.). Aus der Mutterlauge lassen sich noch weitere 780 mg weniger reines Carbobenzoxy-
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hexapeptidnyl-L-tryptophyl-glycin werden in 300 ml Essigsäure (90% ig) in Gegenwart von 1, 5 g 10% Palladiumkohlekatalysator während 5 h bei Normaldruck und Zimmertemperatur hydriert. Die vom Katalysator befreite Lösung dampft man im Vakuum bei 400 zur Trockne ein. Der Rückstand wird aus Methanol/Äther umgefällt. Ausbeute : 6, 9 g Hexapeptid-y-tert.-butylester. Das Produkt ist mit dem im Stammpatent beschriebenen identisch.

Der Hexapeptid-y-tert.-butylester kann nach dem im Stammpatent beschriebenen Verfahren mit
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Kondensation zum Dekapeptid : 330 mg (0, 55 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-hydrazid wer-
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mit 25 ml Eiswasser. Das Azid fällt dabei nicht aus. Durch intensives Kratzen mit einem Glasstab an der Gefässwand scheidet sich das Azid als feiner kristalliner Niederschlag aus. Die Kristallisation ist etwa nach 20 - 30 minütigem Stehen bei 00 beendet. Man filtriert durch eine Glasfilternutsche, wäscht den Filterrückstand zuerst mit eiskalter 0, 5n-Natriumbicarbonatlösung bis zur alkalischen Reaktion und zum Schluss mit Eiswasser neutral. Das Azid wird im Exsikkator während 2 1/2 h lyophyl getrocknet.

Ausbeute : 275 mg (83% d. Th.), F. 98 - 1020 (Zersetzung).

Die 275 mg (0, 45 Mol) Azid trägt man sofort unter Rühren in die auf-100 gekühlte Lösung von
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45 mMol) y-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-- glycin in 15 ml Dimethylformamid, enthaltend 0,50 mMol Triäthylamin, ein.

Man lässt 20 h bei 0 reagieren, versetzt anschliessend die Reaktionslösung mit 0, 2 ml Eisessig und fällt hierauf mit viel Essigester das rohe BOC-Dekapeptid aus. Ausbeute : 580 mg (8p/o), F. 192 bis 1930 (Zers.).

Das rohe Peptidderivat, aus 30 ml 90% Methanol umkristallisiert, ergibt 450 mg reines BOC-Deka- peptid, F. 2030 (Zers. ).

Claims

PATENTANSPRUCH : EMI4.5 dadurch gekennzeichnet,phyl-glycin-methylester kondensiert, aus dem Tripeptidderivat die Carbobenzoxygruppe hydrogenolytisch abspaltet, den freien Tripeptidester mit Carbobenzoxy-L-phenylalanin zum Carbobenzoxy- - L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester kondensiert, aus dem Tetrapeptidester die <Desc/Clms Page number 5> Carbobenzoxygruppe hydrogenolytisch abspaltet, den freien Tetrapeptidester mit Carbobenzoxy- - (γ-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidin-azid zum Carbobenzoxy (y-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histi- dyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester kondensiert, die Methylestergruppe verseift und die Carbobenzoxygruppe durch Hydrierung entfernt.